JPH11504626A - 共有結合したオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 小溝結合分子が、塩基配列において一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらのハイブリッドの標的配列に相補的であるオリゴヌクレオチドに共有結合している。共有結合オリゴヌクレオチド小溝結合複合体は、相補鎖の標的配列に強く結合する。

Description

【発明の詳細な説明】 共有結合したオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体 1. 発明の分野 本発明はオリゴヌクレオチドの新規誘導体に関する。より具体的には、本発明 は1又はそれ以上の小溝結合分子がオリゴヌクレオチドに共有結合しているオリ ゴヌクレオチド誘導体に関する。本オリゴヌクレオチド小溝結合部分複合体は、 一本鎖又は二本鎖核酸の相補鎖にハイブリッド形成し、それに強固に結合する強 い親和性を示すので、配列特異的プローブとして、またアンチセンス及びアンチ ジーン治療剤として有効である。 2. 先行技術の簡単な説明 当該技術分野では、二本鎖DNAの小溝に非共有結合する小溝結合剤が知られて いる。また、二本鎖DNA又はRNAに結合する挿入剤も、当該技術分野ではよく知ら れている。挿入剤は、概して言えば、二本鎖DNA又はRNAの2本の鎖の界面を成す プリン塩基とピリミジン塩基の間に自身を置く（挿入する）ことによって二本鎖 DNA又はRNAに非共有結合する平板な芳香族分子である。米国特許第4,835,263号 は、挿入基に共有結合したオリゴヌクレオチドを記述している。挿入基を持つこ のようなオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成プローブとして有用である。 発明の要約 本発明は、複数のヌクレオチド単位、3'-末端及び5'-末端を持つオリゴヌクレ オチドと、該ヌクレオチドの少なくとも1つに共有結合した小溝結合物質部分と を含む、共有結合したオリゴヌクレオチドと小溝結合物質の複合体に関する。こ の小溝結合物質は、典型的には、15原子を超えない鎖からなる連結基を介してオ リゴヌクレオチドに取り付けられる。小溝結合物質部分は、二本鎖DNA、RNA又は それらのハイブリッドの小溝に約10³M^-1を超える会合定数で非挿入的に結合する 分子量約150〜約2000ダルトンの分子のラジカルである。 もう1つの側面として、本発明は、ある種の共有結合オリゴヌクレオチド小溝 結合物質複合体を合成する方法と、そのような複合体をハイブリッド形成プロー ブ及び関連する分析、診断用途、並びに治療（アンチセンス及びアンチジーン） 用途に使用する方法に関する。 図面の簡単な説明 図1は、スロットブロットハイブリッド形成検定の結果を示すグラフである。 発明の詳細な説明 一般的態様 本発明の新規組成物の顕著な特徴は、小溝結合分子がオリゴヌクレオチドに共 有結合していることである。本願の序文で述べたように、小溝結合物質とは、二 本鎖デオキシリボ核酸（DNA）の小溝内に結合する分子をいう。既知の小溝結合 化合物は極めて多様な化学構造を持つので、それらの全てを表す一般化学式を示 すことはできないが、DNAの小溝に結合することができる化合物は、概して、三 日月型の三次元構造を持つ。先行技術の小溝結合化合物のほとんどは、B型二本 鎖DNAの高A-T（アデニン及びチミジン）含有領域に強い選択性を持つ。本発明の 小溝結合化合物、より正確に述べると、本発明のオリゴヌクレオチド-小溝結合 複合体の小溝結合化合物部分も、同じ選択性を持つ。（以下、本発明のオリゴヌ クレオチド-小溝結合複合体をODN-MGBともいう。）しかし、高C-G（シトシン及 びグアニン）含有領域に対する選択性を示す小溝結合化合物も理論的にも考えら れる。したがって、C-G領域に対する選択性を持つ小溝結合物質分子から誘導さ れる基又は部分を組込んだODN-MGB化合物も、本発明の範囲に含まれる。既知の 小溝結合物質のA-T領域に対する選択性は、現在のところ、グアニンの2-アミノ 基といくつかの周知の小溝結合物質の間の不利な立体障害の存在によって説明さ れている。しかし、後述の説明から明らかになるように、本発明のODN-MGBにお いてグアニンをヒポキサンチンに置換すると、上記の不利な立体障害の可能性が 存在しなくなり、そのODN-MGBの相補鎖に対する強固な結合が起こり得る。 概して、先行技術で知られている小溝結合化合物は、二本鎖RNAや、DNAとRNA の二本鎖ハイブリッドには結合しない。しかし、本発明のODN-MGB化合物は一本 鎖RNAに結合する潜在能力を示し、上述の特徴は、本発明のもう1つの興味深く新 規な側面を形成する。 本発明に従ってODNに共有結合することにより新規ODM-MGB複合体を形成するこ とができる先行技術の既知小溝結合化合物の例は、ある種の天然化合物、例えば ネトロプシン（netropsin）、ジスタマイシン（distamycin）及びレキシトロプ シン（lexitropsin）、ミトラマイシン、クロモマイシン（chromomycin）A₃、オ リボマイシン（olivomycin）、アントラマイシン（anthramycin）、シビロマイ シン（sibiromycin）その他の関連抗生物質及び合成誘導体である。ある種のビ ス四級アンモニウム複素環式化合物、ペンタミジン、スチルバミジン（stilbami dine）及びベレニル（berenil）などのジアリールアミジン類、CC-1065及び関連 するピロロインドール及びインドールポリペプチド、Hoechst 33258、4'-6-ジア ミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、並びに天然アミノ酸又は合成アミノ酸 からなるいくつかのオリゴペプチドは、小溝結合化合物である。次の例の化学構 造を以下に示す。 本発明の目的にとっては、ある分子が10³M^-1又はそれ以上の会合定数で二本鎖 DNAの小溝内に結合できるならば、その分子は小溝結合物質である。このタイプ の結合は、十分に確立された分光光度測定法、例えば紫外（u.v.）及び核磁気共 鳴（nmr）分光法や、ゲル電気泳動によって検出できる。小溝結合物質分子が結 合した時のu.v.スペクトルの変化と、「核オーバーハウザー」（NOSEY）効果を 利用するnmr分光法はとりわけよく知られており、この目的にとって有用な技術 である。ゲル電気泳動は、二本鎖DNA又はその断片に対する小溝結合物質の結合 を検出する。そのような結合が起こると、二本鎖DNAの移動度が変化するからで ある。 挿入分子又は挿入剤は、小溝結合物質が「三日月型」又は類似の外形を持つの に対して、挿入剤は平板な芳香族（好ましくは多環式）分子であるということに 基づいて、小溝結合物質とは容易に区別される。核オーバーハウザー効果を利用 するnmr分光法によって、実験的に区別することもできる。 上述のように、本発明の目的にとっては、二本鎖DNAの小溝内におけるあるの 分子の会合定数が10³M^-1又はそれ以上ならば、その分子は小溝結合物質である。 しかし、いくつかの小溝結合物質は、10⁷〜10⁹M^-1程度の会合定数で二本鎖DNAの 高親和性部位に結合する。 本発明では、小溝結合物質分子を誘導体化して本質的に「ラジカル」として、 それを、ODNにその小溝結合物質を結合する適当な共有構造又は原子鎖に連結す る。ある意味で、その連結「鎖」は小溝結合物質の一部と見なすことができ、ま たそのようにみなす場合がある。その結合は、そのODN-MGB分子の小溝結合性に 悪影響を与えないような性質を持つからである。しかし、小溝結合物質と、それ をODNに共有結合させる基とを概念的に区別した方が、本発明にとっては好都合 である。小溝結合物質分子から「生成した」ラジカルを、以下、「小溝結合物質 部分」といい、その小溝結合物質部分をオリゴヌクレオチドに結び付ける共有結 合（これは約15原子までの鎖であってもよい）を「連結基」と呼ぶ。本発明によ る小溝部分の好ましい態様については、本発明のODN-MGB複合体化合物のオリゴ ヌクレオチドを説明した後に、詳細に説明する。 本発明のODN-MGB複合体のオリゴヌクレオチド部分は、概して、約3〜100ヌク レオチド単位を含む。本発明に従ってODNに組込むことができるヌクレオチド単 位には、自然界で核酸中に認められる主要な複素環式塩基（ウラシル、シトシン 、チミン、アデニン及びグアニン）と、これら塩基の天然及び合成修飾体及び類 似物、例えばヒポキサンチン、2-アミノアデニン、2-チオウラシル、2-チオチミ ン、5-N⁴エテノシトシン、4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン及び6-アミノ-4- ヒドロキシ-[3,4-d]ピリミジンなどが含まれる。5-N⁴エテノシトシン、4-アミノ ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン及び6-アミノ-4-ヒドロキシ-[3,4-d]ピリミジンの2- デオキシリボシドの各構造を下に示す。 さらに、本発明のODN-MGB複合体のODNに組込まれるヌクレオチド単位は、その 塩基の1又はそれ以上に連結アームを介して共有結合した架橋官能基（アルキル 化剤）を持ってもよい。結合した架橋剤を持つODN-MGB複合体は本発明の好まし い態様の重要な一群を成すので、これらの構造について以下により詳しく説明す る。 本発明のODN-MGBの「糖」又はグリコシド部分は、デオキシリボース、リボー ス、2-フルオロリボース、2-O-アルキル又はアルケニルリボース（ここにアルキ ル基は1〜6個の炭素を持つことができ、アルケニル基は2〜6個の炭素を持つこと ができる）を含みうる。天然ヌクレオチドと本明細書に記載するその修飾体及び 類似物において、そのデオキシリボース又はリボース部分はフラノース環を形成 し、そのグリコシド結合（glycosydic linkage）はβ立体配置を持ち、プリン塩 基はその9位で、ピリミジン類はその1位で、ピラゾロピリミジン類はその1位で 糖部分に結合している。現在のところ、本発明ではオリゴデオキシリボヌクレオ チドが好ましいので、好ましい糖は2-デオキシリボースである。ODNのヌクレオ チド単位は、当該技術分野で良く知られているように、「リン酸」骨格によって 相互に連結される。本発明のODN-MGB複合体のODNは、「天然の」リン酸ジエステ ル結合に加えて、チオリン酸エステル（phosphorothiotes）及びメチルホスホン 酸エステルを含んでもよい。 本発明のODN-MGB複合体のODNは、その3'-又は5'-末端のいずれかに結合した比 較的低分子量の「テール部分」を持ってもよい。この文脈における「テール部分 」は、やはり3'-又は5'-末端若しくはその両方に結合していることが好ましい小 溝結合部分とは区別されるべきものである。したがって、この文脈における「テ ール部分」が存在するとすれば、それは小溝結合物質部分を保持しないODNの末 端に結合している。例えば、テール分子はリン酸、リン酸エステル、アルキル基 及びアミノアルキル基又は親油性基などでありうる。 本発明ODN-MGB複合体のODNのヌクレオチド単位、「リン酸骨格」及び「テール 」の考えうる異型については、次に挙げることに留意すべきである。本発明のOD N-MGBの主たる有用な作用は、その分子のODN部分が一本鎖DNA、RNA、二本鎖DNA 及びDNA-RNAハイブリッド中の相補配列に、小溝結合部分が新たに形成された「 二重らせん」に組込まれて、その結合を強くするように、すなわち、新たに形成 された二重らせんの溶解温度（及び会合定数）を増大させるように、結合できる ということにある。さらに、架橋剤を含む本発明ODN-MGB複合体の好ましい態様 は、その相補DNA又はRNA鎖に対する本ODN-MGB分子の恒久的な共有結合をもたら し、恒久結合型となる。上述の説明から、当業者は、本発明ODN-MGB複合体のODN 部分の様々な構成部分の一次構造上の制限は、そのODN部分が特定の標的配列に 相補的な鎖を形成できるということにのみあること、及び、それ自体は当該技術 分野 で知られている多数の構造修飾体が、これらの範囲に含まれうることを、容易に 理解するだろう。さらに、本発明のODN-MGB複合体のODN部分を形成しうる種々の 複素環式塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、概して 、当該技術分野で十分に開発され、よく知られている。N₄,N₄-エタノ-5-メチル デオキシシチジン、そのヌクレオシド、ヌクレオチド及び/又はこの塩基を組込 んだオリゴヌクレオチドは、Webb，T.R.；Matteucci，M.D．Nucleic Acids Res. ，1986，14，7661-7674，Webb，T.R.；Matteucci，M.D.，J．Am．Chem．Soc.，1 986，108，2764の教示に従って、製造することができる。4-アミノピラゾロ[3,4 -d]ピリミジン、6-アミノ-4-ヒドロキシピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、それらの ヌクレオシド、ヌクレオチド及びこの塩基を組込んだオリゴヌクレオチドは、Ka zimierczukら，J．Am．Chem．Soc.，1984，106，6479-6382の教示に従って、製 造することができる。標的配列に対して相補的になるように予め決定した特定の 配列のONDを製造するには、オリゴヌクレオチド合成を当該分野の技術水準に従 って行なうことができるのであるが、好ましい方法を以下に記述する。好ましい 方法は、既に特許され特許料が納付された出願番号08/090,408号（1993年7月12 日出願）の教示を具体化するものである。出願番号08/090,408の明細書は、特に 、参考文献として本明細書の一部を構成するものとする。 連結基とは、本複合体のODN部分を小溝結合物質部分に共有結合させる部分を いう。連結基は、その結合が15原子を超えない鎖を介して起こるような基である ことが好ましい。また、本発明では、小溝結合物質部分をオリゴヌクレオチドの 3'又は5'末端のいずれかに共有結合することが好ましい。しかし、中間位置にあ るヌクレオチドへの結合、具体的には中間位置にあるヌクレオチドの複素環式塩 基への結合も、本発明の範囲に含まれる。概して、連結基は、アミン官能基のよ うな一方の官能基を例えばODNの5'末端に結合し、カルボニル基（CO）のような 他方の官能基を小溝結合物質部分のアミノ基に結合するべく、二官能性分子から 誘導される。別法として、アルコール官能基を例えばODNの3'-リン酸末端に結合 し、アミノ官能基を小溝結合物質のカルボニル基に結合するべく、連結基をアミ ノアルコールから誘導してもよい。連結基のさらなる選択肢には、小溝結合物質 のカルボニル基にペプチド結合として連結されるアミノカルボン酸に結合したア ミノアルコール（3'-リン酸にエステル結合で結合する）が含まれる。したがっ て、連結基の好ましい態様は、-HN(CH₂)_mCO、O(CH₂)_mCO、及び (CH₂)_mCH(OH)(CH₂)_mNHCO(CH₂)_mNHという式を持つ（ここにmに対する制限は、小 溝結合物質部分がODNから約15原子分より遠く離れるべきでないということであ る）。連結基の好ましい態様は、-O(CH₂)₆NH、-OCH₂CH(OH)CH₂NHCOCH₂CH₂NH、及 び-HN(CH₂)₅COである。上述のように、連結基を小溝結合物質部分の一部として 概念化することもできる。その場合、その小溝結合物質部分はODNに直接結合し ていると見なされる。 小溝結合物質部分に関する基本的な制限については上述したとおりであり、特 定の化学構造で定義づけることはできない。小溝結合を引き起こす分子構造に加 えて、小溝結合物質部分は、それらの機能が小溝結合能を妨害しない限り、付加 的な機能を持ってもよい。例えば、色、uvスペクトルその他の容易に認識できる 物理的又は化学的特徴によってその小溝結合物質を容易に検出できるようにする リポーター基を、小溝結合物質部分に共有結合してもよい。そのようなリポータ ー基の例は、好ましい態様として-HN(CH₂)_mCOO(CH₂)_mS(CH₂)_m-橋を介して小溝結 合物質のカルボニル官能基に結合されるジアゾベンゼン官能基である。ここでも 、小溝結合物質が保持するリポーター基その他の官能基を、小溝結合物質部分自 体の一部として概念化することができる。 ODN-MGBの好ましい態様は、次の化学式1によって定義される。この定義は、本 発明に従って小溝結合物質部分の好ましい態様を含み、それは上述のように連結 基の一部又は全部及びその他の付随基（リポーター基など）を含んでもよい。 ［式中、 XはO又はSである。 qは3から100までの整数である。 R₈はH、OH、1〜6個の炭素を持つアルコキシ、O-C₂-C₆アルケニル又はFである 。 Bは、自然界で核酸中に認められる複素環式塩基、ヒポキサンチン、2-アミノ アデニン、2-チオウラシル、2-チオチミン、5-N⁴-エテノシトシン、4-アミノピ ラゾロ[3,4-d]ピリミジン、6-アミノ-4-ヒドロキシ-[3,4-d]ピリミジンからなる 群より選択されるアグリコンである。 W₁はH、PO(OH)₂又はその塩、又は該オリゴヌクレオチドの3'又は5'末端に結合 した小溝結合物質部分（このW₁基は、小溝結合物質部分をオリゴヌクレオチドに 15個以下の原子を介して共有結合させる連結基を含む）である。 W₂は存在しないか、アグリコンBの1つに結合した小溝結合物質部分（このW₂基 は、小溝結合物質部分を該アグリコンに共有結合させる連結基を含む）であるか 、若しくはW₂は、架橋官能基を該アグリコンに共有結合させるリンカーアームを 含む架橋官能基である。 ここに、小溝結合物質部分とは、二本鎖DNA、RNA又はそれらのハイブリッドの 小溝に約10³以上の会合定数で非挿入的に結合する分子量約150〜約2000ダルトン の分子のラジカルをいい、該W₁基とW₂基の少なくとも一つは小溝結合物質部分で あるものとする。 また、連結基を含む小溝結合物質部分は、次に挙げる(a)、(b)、(c)、(d)及び (e)群からなる群より選択される式を持つ。 （Y₁は、2つの二重結合とN、S及びOからなる群より選択される0〜3個のヘテロ原 子を持つ5員環を表し、NH基とCO基は、互いに1環原子によって隔てられた2つの 環炭素にそれぞれ結合しており、該2つの環炭素間に位置する環原子はHでのみ置 換されているか、非置換であり、残りの各環原子は1、2又は3個のR₃基で置換さ れていてもよい。） （Y₂は、1つの二重結合を持つ5員環と縮合した6員芳香環からなる環系であって 、その縮合環系はN、S及びOからなる群より選択される0〜3個のヘテロ原子を持 つ。R₆N基とCO基のそれぞれは、その縮合環系の異なる環中にあって、かつ、1つ の共通する橋頭環原子からそれぞれ2番目の環原子である環炭素に結合しており 、その結果、CO基とNR₆基はその縮合環系の一方の側でそれら自身の間に2つの非 橋頭環原子を配し、その縮合環系の他方の側に3つの非橋頭環原子を配している 。また、その一方の側にある2つの非橋頭環原子はR₇基で置換されていてもよく 、その縮合環系の他方の側にある3つの非橋頭環原子はR₃基で置換されていても よい。） （Y₃は、0〜3個のNヘテロ原子を持つ6員芳香環であり、CO基とNH基のそれぞれは 、環炭素に結合している。また、該環炭素は互いに1,4位にあり、その6員環の2 つの側のどちらか一方にあってCO基又はNH基で占有されていない2つの環原子はR₃ 基で置換されいてもよく、その6員環の他方の側にあって占有されていない2つ の環原子はR₇基で置換されていてもよい。） （Y₄は、0〜3個のNヘテロ原子を持つ6員芳香環であり、CO基とNH基のそれぞれは 、 環炭素に結合している。また、該環炭素は互いに1,4位にあり、その6員環の2つ の側のどちらか一方にあってCO基又はNH基で占有されていない2つの環原子はR₃ 基で置換されていてもよく、その6員環の他方の側にあって占有されていない2つ の環原子はR₇基で置換されていてもよい。） （Y₅は、1つの二重結合を持つ5員環と縮合した6員芳香族環からなる環系であっ て、その縮合環系はN、S及びOからなる群より選択される0〜3個のヘテロ原子を 持つ。R₁基とR₂基のそれぞれは、その縮合環系の異なる環中にあって、かつ、1 つの共通する橋頭環原子からそれぞれ2番目の環原子である環炭素に結合してお り、その結果、R₁基とR₂基はその縮合環系の一方の側でそれら自身の間に2つの 非橋頭環原子を配し、その縮合環系の他方の側に3つの非橋頭環原子を配してい る。また、その一方の側にある2つの非橋頭環原子はR₇基で置換されていてもよ く、その縮合環系の他方の側にある3つの非橋頭環原子はR₃基で置換されていて もよい。） ここに、R₁とR₂は独立して、H、F、Cl、Br、I、NH₂、NHR₄、N(R₄)₂、N(R₄)₃ ⁺ 、OH、-O-、-S-、OR₄、SH、SR₄、COR₄、CONHR₄、CON(R₄)₂、R₄、H₂N(CH₂)_mCO、C ONH₂、CONHR₄、H₂N(CH₂)_mCOO(CH₂)_mS(CH₂)_mC₆H₄NNC₆H₄、-HN(CH₂)_mCO、-CONH-、 -CONR₄、-HN(CH₂)_mCOO(CH₂)_mS(CH₂)_mC₆H₄NNC₆H₄、及び、-(CH₂)_mCH(OH)(CH₂)_mNH CO(CH₂)_mNH-であるか、若しくはR₁基とR₂基の一方が存在しない。 R₃は、F、Cl、Br、I、NH₂、NHR₄、N(R₄)₂、N(R₄)₃ ⁺、OH、OR₄、SH、SR₄、COR₄ 、CONHR₄、CON(R₄)₂及びR₄からなる群より選択されるか、若しくはR₃基はY₁環に 縮合した3、4、5又は6員環を形成してもよい。 R₄は、1〜20個の炭素を持つアルキル又はシクロアルキル基、1〜20個の炭素と 1〜3個の二重結合を持つアルケニル又はシクロアルケニル基、炭素25個以下の炭 素環式芳香族基、炭素25個以下の複素環式芳香族基、炭素25個以下の炭素環式又 は複素環式アリールアルキル基であり、R₄は1、2又は3個のF、Cl、Br、I、NH₂、 NHR₅、N(R₅)₂、N(R₅)₃ ⁺、OH、OR₅、SH、SR₅、COR₅、CONHR₅、CON(R₅)₂又はR₅基 で置換されていてもよい。 R₅は、1〜6炭素のアルキルである。 R₆はH、1〜5炭素のアルキルであるか、又はR₆とR₇が一体となって、4、5又は6 員環を形成する。この場合、-O-、-S-、-NH-、-NCH₃-又はN-低級アルキル基が該 環の一部であってもよい。 R₇は、F、メチル又はエチル、-CH₂-又は-CH₂-CH₂-である。 mは、1から10までの整数である。 nは、1から10までの整数である。 pは、1から5までの整数である。］ 本発明のODN-MBG複合体のさらに好ましい態様は、その小溝結合物質部分が次 のように定義されるものである： （1）小溝結合部分が上記式（a）によって表され、その5員環が次式の構造を 持つ： （2）小溝結合部分が上記式（a）によって表され、その5員環が次式の構造を 持つ： （3）小溝結合部分が式（b）によって表され、その縮合環系が次式の構造を持 つ： 架橋官能基を含有する態様 本発明のODN-MGB複合体の好ましい態様の一種は、1又はそれ以上の架橋官能基 をも含み、それによって、ODN-MGB複合体がDNA、RNA又はそれらの断片の相補的 標的配列に結合した後に、その架橋官能基がその標的と不可逆的に反応して、そ れとの共有結合を形成する。標的配列に対するこのような共有結合は、ハイブリ ッド形成プローブの場合は分析、診断用途に有利であり、また治療的（アンチセ ンス及びアンチジーン）応用にも有利である。標的配列を相補するODNにも共有 結合しているこの小溝結合物質部分は、標的配列に対するODN-MGB複合体の初期 の非共有結合を高めるので、その架橋官能基による以降の共有結合化が促進され る。次に述べる考察は、この種のODN-MGB複合体に組込まれた架橋官能基又は架 橋剤に関する限り、妥当である。 本発明に組込まれる架橋剤は、ODN-MGB上のある部位に共有結合される。その 長さと立体的配向は、そのODN-MGBが標的とハイブリッド形成した後に、その標 的DNA又はRNA配列中の適当な反応部位に、それが届きうるようにすべきである。 定義上、架橋官能基又は架橋剤は、標的DNA又はRNA配列の反応性基と反応する反 応性基を持つ。この（又はこれらの）架橋剤は、ODN-MGB複合体の1又はそれ以上 の複素環式塩基、糖又は修飾糖残基、リン酸又は修飾リン酸官能基に共有結合さ せることができる。共有結合剤は、それがその小溝結合能を妨害しない限り、小 溝結合物質部分に結合させてもよい。好ましくは、架橋剤又は架橋官能基を複素 環式塩基の1つに結合する。 簡単に述べると、架橋剤自体は、概念的に2つの基又は部分、すなわち典型的 には（そして好ましくは）求電子脱離基（L）である反応性基と、その脱離基Lを ODN-MGBの各部位に結合する「アーム」（A）とに分割することができる。脱離基 Lは、例えばクロロ、ブロモ、ヨード、SO₂R'''又はS⁺R'''R''''（ここに、R''' とR''''はそれぞれ独立にC_1-6アルキル又はアリールであるか、若しくはR'''とR ''''が全体としてC_1-6アルキレン橋を形成する）などの基から選択することがで きる。クロロ、ブロモ及びヨードが好ましい。これらの基の中では、-COCH₂Iな どのハロアセチル基と、-N-[(CH₂)₂-Cl]₂などの二官能性「窒素マスタード」が 好ましい。脱離基はその脱離能によって変更されるだろう。不可逆的に結合する プローブに所望の特異性を与えるために、特定の脱離基の性質と反応性によって 、個々のケース毎に使用すべき基を選択する。 上述のように、「アーム」（又はリンカーアーム）Aは、概念的には、ODN-MGB を脱離基Lに共有結合し、かつ、その脱離基LをODN-MGBに対して所望の距離と立 体的配向に保つ単一物と見なされるが、実際問題としては、二官能性分子を、そ の第1官能基を介してODN-MGBに、又は小溝結合物質部分を結合する前のODNに（ 例えばリン酸エステル結合によって3'又は5'末端に、炭素-炭素結合によって複 素環式塩基に、又は炭素-窒素結合によってアミノ置換複素環式塩基に）共有結 合させると共に、その第2官能基（例えばアミン）を介して、今度は脱離基Lを保 持する「ヒドロカルビル橋」（アルキル橋、アルキルアリール橋又はアリール橋 など）に共有結合させる合成反応で構築することができる。 したがって、架橋官能基の一般式は、-A-L又は-A-L₂（ここに、Lは上に定義し た脱離基であり、AはODN-MGBに共有結合した部分である）となる。このA「アー ム」自体は、ODN-MGBと標的配列のハイブリッド形成条件下に、非反応性（脱離 基Lによる他は）であるべきで、脱離基Lを所望の立体位置と、所望の反応部位（ 例えば標的配列中のグアノシン残基のN-7位）から望ましい距離に保つべきであ る。概して、A基の長さは約2〜20炭素の直鎖アルキル鎖の長さに等しくすべきで ある。 架橋官能基の好ましい態様の一種に関する典型的でより具体的な式は、 -(CH₂)_q-Y-(CH₂)_m-L （Yは、上に定義した脱離基である。mとqはそれぞれ独立に0から8まで（両端を 含む）である。Yは「機能性連結基」と定義される） である。ここに記載する架橋剤結合用の機能性連結基は、小溝結合物質部分をON Dのどちらかの末端に、或いはODNの中間部分にあるヌクレオチドに結合するため にも使用できるが、記述を明解にするには、この「機能性連結基」は、小溝結合 物質部分をODNに結合する「連結基」とは区別すべきものである。「機能性連結 基」は、(CH₂)_q橋と(CH₂)_m橋を連結することができる2つの官能基、例えば-NH₂ と-OH、又は-COOHと-OH、又は-COOHと-NH₂を持つ基である。アセチレン末端（HC ≡C-）は後述のようにある種の複素環にカップリングできるので、これもYにと って好適な官能基である。 架橋官能基の好ましい態様の一種に関する他の典型的でより具体的な式は、 -(CH₂)_q-NH-CO-(CH₂)_m-(X)_n-N(R₁)-(CH₂)_p-L と、 -(CH₂)_q,-O-(CH₂)_q"-NH-CO-(CH₂)_m-(X)_n-N(R₁)-(CH₂)_p-L （q、m及びLは、架橋官能基の説明に関して上述したように定義される。q'は3か ら7まで（両端を含む）であり、q''は1から7まで（両端を含む）である。Xはフ ェニル又は単純な置換フェニル（クロロ、ブロモ、低級アルキル又は低級アルコ キシ置換フェニルなど）である。nは0から1までであり、pは1から6までの整数で ある。R₁はH、低級アルキル又は(CH₂)_p-Lである。） である。pは2であることが好ましい。-N(R₁)-(CH₂)₂-Lという構造が一群の強力 なアルキル化剤である「窒素マスタード」を表すことは、当業者にはわかるだろ う。この種類のODN-MGB複合体の中で特に好ましいものは、架橋剤が-N(R₁)-(CH₂ )₂-L（ここにLはハロゲン、好ましくは塩素である）という官能基を含むもので ある。さらに好ましいものは、架橋剤が-N[(CH₂)2-L]₂（「二官能性」N-マスタ ード）という基を含むODN-MGB複合体である。 架橋剤の特に好ましい部分構造は、 -CO-(CH₂)₃-C₆H₄-N-[(CH₂)₂Cl]₂ という基を含む。好ましい態様として、この架橋基を、ODNの5_'及び3_'末端にあ るn-ヘキシルアミン保持テールに、次の構造式に従って結合する： R'-O-(CH₂)₆-NH-CO-(CH₂)₃-C₆H₄-N-[(CH₂)₂Cl]₂ （R'は、ODNの末端5'又は3'リン酸基を表す）。 他の末端、又は中間位置にあるヌクレオチドは、小溝結合物質部分を保持する。 他の好ましい態様では、架橋官能基を複素環式塩基（例えばODN-MGB複合体の2 '-デオキシウリジル酸構成単位のウラシル部分）に共有結合する。この結合はア ミノ基の仲介によって起こりうる。つまり、「アーム-脱離基複合体」（A-L）を 、ODNの5-アミノ-2-デオキシウリジル酸構成単位に結合することができる。さら なる好ましい態様では、「アーム-脱離基複合体」（A-L）を、ODNの2'-デオキシ ウリジン酸構成単位の5位に、炭素-炭素結合によって結合する。5-置換-2'-デオ キシウリジン類は、概して、Robinら（Can．J．Chem.，60:554（1982）；J．Org ．Chem.，48:1854（1983））の一般法を適用することによって得られる。この適 用により、置換1-アルキンの5-ヨード-2'-デオキシウリジンに対するパラジウム 媒介カップリングで、アセチレン結合生成物が得られる。このアセチレンdUrd類 似物を、例えばラネーニッケルで還元して飽和化合物を得た後、それを、自動DN A合成装置で使用するための試薬に直接変換する。この方法で5-ヨード-2'-デオ キシウリジンとカップリングすることができる試薬の例は、HC≡CCH₂OCH₂CH₂N(C O)₂C₆H₄（フタルイミドエトキシプロピン；phtalimidoethoxypropyne）とHC≡CC H₂OCH₂CH₂NHCOCF₃（トリフルオロアセタミドエトキシプロピン）である。 これらの例では、この方法で得られるヌクレオシドを所望のODNに組込み、各 フタル酸（phtalic）又はトリフルオロアセチル遮断基の除去後に、架橋剤のア ルキル化部分をその末端アミノ基に結合する。複素環式塩基に架橋剤が結合され る他のヌクレオチドの例は、2'-デオキシ-4-アミノピラゾロ[3,4-d]ピリミジン 誘導体である。これらの化合物は、公開されたPCT出願WO:90/03370（公開日4/05 /90）の教示に従って製造できる。 さらに本発明の修飾ODNの構造を概括的に述べるが、球-棒モデル（ball-and-s tick models）と高分解能コンピューターグラフィックスで二本鎖DNAを調べると 、プリンの7位とピリミジンの5位が、二本鎖核酸のB型二重らせんの主溝にある ことが示される。これらの位置は、かなり大きな側鎖で、それら塩基のハイブリ ッド形成特性を妨害することなく、置換することができる。これらの側鎖は、 dThd又はdCydの誘導体化によって、或いはその複素環式塩基の直接的な全合成と それに続くグリコシル化によって、導入することができる。これらの修飾ヌクレ オシドは、自動DNA合成装置でオリゴヌクレオチドに組込むための適当な活性化 ヌクレオチドに変換できる。アデニンの類似物であるピラゾロ[3,4-d]ピリミジ ン類の場合は、プリンの7位と等価なその3位に、架橋アームを結合する。 架橋側鎖（アーム＝A）は、プリン7位又は8位、ピリミジン5位、ピロロピリミ ジン5位又はピラゾロピリミジン3位から主溝を横切って届き、その修飾類似物を 含有する塩基対の上（オリゴマー3'側）に位置するプリン（好ましくはグアニン ）のN-7と反応するに足る長さを持つべきである。架橋側鎖（アーム＝A）は、そ の塩基が二本鎖錯体内のもう1つの塩基と対を成している時は、その官能基をそ の塩基から離れた状態に保つ。上述のように、概してアームAは2〜20炭素の直鎖 アルキル鎖に等しい長さを持つべきである。このアームは、好ましくは、1〜12 炭素原子のアルキレン基、1又は2個のオレフィン結合と2〜12炭素原子のアルケ ニレン基、1又は2個のアセチレン結合と2〜12炭素原子のアルキニレン基、若し くは末端がオキシ、チオ、アミノなどの求核基又は化学的に遮断されたそれらの 誘導体（トリフルオロアセタミド、フタルイミド、CONR'、NR'CO及びSO₂NR'など ；ここにR'＝H又はC_1-6アルキル）で置換された上記の基を含む。脂肪族又は芳 香族アミンを含むこれらの官能基は求核性を示し、典型的架橋官能基の成分とし て上述した-(CH₂)_m-Lや-CO-(CH₂)_m-(X)_n-N(R₁)-(CH₂)_p-Lなどといった基への結 合点として機能することができる。 架橋官能基A-L又はその適当な前駆体（-(CH₂)_q-NH₂又は-(CH₂)_q-Y基など；Yは NH₂などの求核基で終わる）を保持するヌクレオシド又はヌクレオチドを製造し た後、さらに、当該分野の技術水準に従って、本発明の修飾オリゴヌクレオチド の製造を進めることができる。したがって、オリゴヌクレオチドを製造するには 、そのヌクレオシド又はヌクレオチド上に保護基を導入し、オリゴヌクレオチド 合成で使用するためにその化合物を活性化する。保護活性型への変換は、いくつ かの総説で2'-デオキシヌクレオシドについて詳細に記述されている手法に従っ て行なうことができる。Sonveaux，Bioorganic Chemistry，14:274-325（1986） ； Jones，「Oligonucleotide Synthesis，a Practical Approach」M.J．Gait編，I RL Press，23-34頁（1984）を参照のこと。 この活性化ヌクレオチドは、DNAヌクレオチド及びRNAヌクレオチドの場合と類 似の方法でオリゴヌクレオチドに組込まれ、正しいヌクレオチドが順番に連結さ れて標的DNA又はRNA中のヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチドを鎖を形成 する。ヌクレオチドは酵素的に組込んでもよいし、化学合成によって組込んでも よい。「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」（上記）に記載 の手法に従って、ヌクレオチドを、その5'-O-ジメトキシトリチル-3-(N,N-ジイ ソプロピル)ホスホルアミダイトシアノエチルエステル誘導体に変換し、合成オ リゴヌクレオチドに組込んでもよい。次に、そのN-保護基を他のオリゴヌクレオ チド遮断基と共に、合成後アミノリシスによって、当該技術分野で広く知られる 手法で除去する。 好ましい態様として、本活性化ヌクレオチドを自動DNA合成装置で、使用する 合成装置の手法と指示に従って直接使用してもよい。本オリゴヌクレオチドは、 標準的な市販のホスホルアミダイト又はH-ホスホン酸化学を用いる合成装置で製 造できる。 ハロアシル基や-CO-(CH₂)_m-(X)_n-N(R₁)-(CH₂)_p-L基（さらに好ましくはCO-(CH₂ )₃-C₆H₄-N[CH₂CH₂Cl]₂）のような脱離基を含有する部分は、オリゴヌクレオチ ドへの組込みと遮断基の除去後に、アミノアルキルなどのテール(-CH₂)_q-Y）に 付加することができる。 架橋剤（A-L部分）を、例えば式-(CH₂)_q-Y（Yはアミンで終わる）のアルキル アミン結合によって、オリゴヌクレオチドの3'又は5'末端に結合する場合は、オ リゴヌクレオチド合成を行なって先ず該アミノアルキルテールを持つオリゴヌク レオチドを得た後、それに上記ハロアシル基や-CO-(CH₂)_m-(X)_n-N(R₁)-(CH₂)_p-L などのアルキル化部分を導入することができる。 ヌクレオチド塩基の1つに結合した架橋剤を持つODN-MGB複合体の典型的な好ま しい態様は、次式によって示される： （下線を付した記号「U」（この50マー中26番目のヌクレオチド単位）は、アミ ノ基に結合したクロラムブシル残基を持つ5-(3-アミノプロピル)-2'-デオキシウ リジンを表す）。記号「CDPI3」は、反応式1に関して後述する小溝結合物質部分 を表す。この5-(3-アミノプロピル)-2'-デオキシウリジン成分は、Gibson，K.J. 及びBenkovic，S.J.（1987）Nucleic Acids Res．15，6455の手法に従い、5'-O- トリチル-5-トリフルオロアセタミドプロピル-2'−デオキシウリジン3'-(N,N-ジ イソプロピル-シアノエチル-ホスホルアミダイトを用いて、ODNに組込まれる。 クロラムブシル残基と小溝結合物質部分は、下記実験項に記述するようにODNに 導入される。小溝結合物質部分とODN-MGB複合体の合成 本発明の小溝結合物質部分の現在最も好ましい態様は、1,2-ジヒドロ-3H-ピロ ロ[3,2-e]インドール-7-カルボン酸（CDPI）から、並びに4-アミノ-N-メチルピ ロール-2-カルボン酸から誘導される「オリゴペプチド」である。これらは、そ れぞれ式2及び式4に示す構造の繰り返し単位を持つ合成ペプチドであり、そのペ プチドの重合度（m）は好ましくは3から5まで、最も好ましくは式2のペプチドに ついて5、式4のペプチドについて3である。反応式1は、「CDPI₃」と略記される 特殊なトリペプチドの製造法を開示している。次いで、このトリペプチドを、わ ずかな修飾を加えて若しくは修飾することなく、ODNにカップリングすることに より、本発明ODN-MGBの好ましい態様を得ることができる。 従って、反応式１を参照すると、この合成反応式における出発物質は、化学文 献（D.L.Boger,R.S.Coleman、およびB.J.Invergo.J.Org.Chem.,1987,Vol.52,152 1-1530）によって製造することができる３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ− ３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボン酸または３−ｔ−ブチル オキシカルボニル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール− ７−カルボン酸である。出発化合物は、トリフルオロ酢酸のテトラフルオロフェ ニルエステルで処理することによって、活性エステルに変換される（ＴＦＰ−Ｔ ＦＡ）。反応式に示される化合物１ａにおいては、Ｒ基はＣＯＮＨ₂であり、１ ｂにおいては、Ｒはｔ−ブチルオキシカルボニル（^tＢｏｃ）である。ｔ−ブチ ルオキシカルボニル（^tＢｏｃ）基は、酸によって除去することができるアミノ 官能基の既知の保護基である。得られる活性エステル１ａおよび１ｂを、メチル １,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロインドール−７−カルボキシレート（これも 化学文献によって得られる。D.L.Boger,R.S.Coleman、およびB.J.Invergo.J.Org .Chem.,1987,Vol.52,1521-1530を参照）と反応させて、「ダイマー」ペプチド化 合物２ａおよび２ｃを得る。カルボキシル官能基のメチル基を、塩基で処理する ことによって除去して、カルボン酸基が遊離している「ダイマー」ペプチドを得 る。このダイマーを再び活性化して、テトラフルオロフェノールで活性エステル を形成する（Ｒ＝ＣＯＮＨ₂、ＴＦＰ−ＣＤＰＩ₂のとき２ｅ；および、Ｒ＝^tＢ ｏｃ、ＴＦＰ−^tＢｏｃ−ＣＤＰＩ₂のとき２ｆ）。ＴＦＰ−ＴＦＡで活性化した 後に、ダイマーの活性エステルを、対応するトリマーに関して下記に記載するよ うに、ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体を形成するのに使用することができる。ダイマーペ プチドの活性エステルは、メチル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロインドール −７−カルボキシレートのさらに別の分子と反応して、そのカルボン酸官能基が メチルエステルとして保護されている「トリマーペプチド」、３ａ（メチル３− カルバモイル−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７ −カルボキシレートトリマー）を形成することもできる。塩基で処理することに よってメチル基を除去し、得られる「トリマーペプチド」３ｂを、活性テトラフ ルオロフェニルエステル３ｃ、（２,３,５,６−テトラフルオロフェニル ３− カル バモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カル ボキシレートトリマー、ＴＦＰ−ＣＤＰＩ₃）に再び変換する。活性テトラフル オロフェニルエステル３ｃを用いて、メチル １,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ インドール−７−カルボキシレートとの反応の段階を繰り返し、得られるメチル エステルを鹸化し、および所望であれば、ＴＦＰ−ＴＦＡと再び反応させて、４ ＣＤＰＩ成分を組み込むペプチドの活性テトラフルオロフェニルエステルを形成 することによって、ペプチド鎖をさらに長くすることができる。容易に理解され るように、これらの段階は、所望の数のＣＤＰＩ成分がペプチドに含まれるまで 、さらに繰り返すことができる。本明細書に記載の好ましい具体例においては、 ＯＤＮと結合してＯＤＮ−ＭＧＢを形成するために、または反応式４および５に 関して下記に記載のように、適切な改質制御孔ガラス（ＣＰＧ）固体サポート（ asuitable modified controlled pore glass（CPG）solid suport）においてＯ ＤＮ−ＭＧＢを合成するために、トリペプチド３ｃの活性テトラフルオロフェニ ルエステル（ＴＦＰ−ＣＤＰＩ₃）が使用される。反応式１は、その最後の段階 として、トリペプチド３ｃの活性テトラフルオロフェニルエステル（ＴＦＰ−Ｃ ＤＰＩ₃）からの、ヒドロキシプロピルアミド誘導体の製造を示している。トリ ペプチド３ｄのヒドロキシルプロピルアミド誘導体（３−カルバモイル−１,２ −ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシ］−１− アミド−３−プロパノールトリマー、ＣＤＰＩ₃−３−ヒドロキシプロピルアミ ド）を、ＯＤＮとの結合に用いて、本発明のＯＤＮ−ＭＧＢを得ることができる 。しかし、トリペプチド３ｄは、下記に記載される結合試験において、対照標準 として、「フリースタンディング」小溝結合物質分子（"free standing" minor groove binder molecule）としても用いられた。 反応式２を参照すると、小溝結合物質ペプチドの他の好ましい具体例の合成が 示されており、ここで、「モノマー」は４−アミノ−Ｎ−メチルピロール−２− カルボン酸の残基であり、この具体例はジアゾベンゼン成分を含有するリポータ ー基も担持している。従って、この反応式によって、６−［（ｔ−ブチルオキシ ）カルボキシアミド］ヘキサン酸が、Ｎ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド の存在下に、２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エタノールと縮合して 、（２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エチル５−［（ｔ−ブチルオキ シ）カルボキシアミド］ペンチルカルボキシレート、１１）を形成する。^tＢｏ ｃ保護基を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理することによって化合物１１か ら除去し、結果として得られる遊離アミノ官能基を有する化合物を、^tＢｏｃ保 護４−アミノ−Ｎ−メチルピロール−２−カルボン酸の活性エステルと反応させ る。 前記活性エステル化合物（１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル １−メチ ル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド−ピロール−２−カルボキシレ ート）は、L.Grehn,V.Ragnarsson,J.Org.Chem.,1981,46,3492-3497に記載の方法 によって得られる１−メチル−４−［ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド］ピ ロール−２−カルボン酸から形成される。得られる２−［４−（フェニルアゾ） ベンジルチオ］エチル ５−［１−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキ シアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ペンチルカルボキシレート、１２ は、ジアゾベンゼン成分を担持するリポーター基に結合した「２−アミノ−Ｎ− メチルピロールカルボン酸」残基のモノマーの１単位を有する。トリフルオロ酢 酸を用いて^tＢｏｃ保護基を除去した後、所望の数のモノマー残基を含有するペ プチドが得られるまで、１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル １−メチル −４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド−ピロール−２−カルボキシレー トの１分子またはそれ以上との結合を行うことができる。ｎ個のモノマーおよび 遊離アミノ基を有するそのような化合物が、反応式２に１６ａとして示されてい る。化合物１６ａを、^tＢｏｃ保護６−アミノヘキサン酸の活性エステル（例え ば、１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル活性エステル）と反応させて、反 応式２において化合物１６ｂとして示されるオリゴペプチドを得ることができる 。^tＢｏｃ保護基は、酸性条件下において前記化合物から除去することができ、 結果として得られる遊離アミノ官能基を有する誘導体を、従来の合成法によって 、ＯＤＮの３'−ホスフェートまたは５'−ホスフェート末端のどちらかに結合さ せることができる。または、下記に示すような種々の二官能価の結合基を用いて 、遊離アミノ官能基を有する誘導体を、オリゴヌクレオチドの３'または５'−Ｏ Ｈ末端に結合させることもできる。 反応式３を参照すると、３'−アミノ末端または５'−アミノ末端ＯＤＮと、テ トラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステルで活性化された例示的小溝結合オリゴ ペプチドとを結合させる一般的方法が示されている。この反応式は、反応式１に よって得られるＴＦＰで活性化された例示的小溝結合化合物の使用を示している が、この一般的方法は、他のＴＦＰ活性化小溝結合化合物とＯＤＮとの結合にも 適している。反応式３における１ａ〜３ｃの符号は、反応式１によって得られる 例示的化合物を意味している。 ３'−または５'−アミノ末端ＯＤＮは、従来法によって合成することができ、 例えば、商業的入手可能なＮ−モノメトキシトリチルアミノヘキシルホスホロア ミダイト（N-monomethoxytritylaminohexyl phosphoramidite）を用いることに よって、ＯＤＮのどちらかの末端にアミノヘキシル残基を結合させることができ る。または、すでに許可され登録料が支払われた１９９３年７月１２日出願の出 願第０８/０９０４０８号に記載の方法によって、アミノ末端ＯＤＮを合成する こともできる。出願第０８/０９０４０８号に記載の内容は、本発明の開示の一 部を構成するものとする。この反応式によればアミノ末端ＯＤＮがセチルトリメ チルアンモニウム塩に変換されて、それを有機溶媒中において可溶性にし、テト ラフルオロフェニルエステル活性小溝結合物質分子が、好ましくは溶媒としての ＤＭＳＯ中で、それと縮合する。 反応式４は、小溝結合物質分子の活性エステルを、５'−アミノ末端ＯＤＮに 結合させる他の方法を開示している。この反応式に示されている例は、３−カル バモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カル ボン酸残基から誘導されるトリペプチドのＴＦＰエステル（ＴＦＰ−ＣＤＰＩ₃ ）の例であるが、本反応式に関して開示されている一般原理は、他の小溝結合物 質分子にも用いることができると理解すべきである。この方法においては、ＯＤ ＮがなおＣＰＧサポートに結合しており、その「アミノ末端」に遊離アミノ基を 有している。これは、前記のＮ−モノメトキシトリチルアミノヘキシルホスホロ アミダイトを用いることによって得られる。モノメトキシトリチル基が、ホスホ ロアミダイトが結合した後に除去されて、所望のＣＰＧ担持「アミノ末端ＯＤＮ 」を得る。または、そのようなＣＰＧ−は、前記出願第０８/０９０４０８号の 開示およびその中の引用文献に従って得ることができる。簡単に言えば、ＯＤＮ が、段階的に合成されてＣＰＧに結合され、９−フルオレニルメトキシカルボニ ル（Ｆｍｏｃ）基で保護されたアミノ基を有する末端を有する。ヌクレオチドの 所望の配列が形成された後に、ＯＤＮはなおＣＰＧサポートに結合しているまま にして、Ｆｍｏｃ基をアミノ基から除去する。本発明の反応式４によって、遊離 アミノ基を有するこの「ＣＰＧ担持アミノ末端ＯＤＮ」を、活性エステル（ＴＦ Ｐ−ＣＤＰＩ₃、３ｃ）、または小溝結合物質の同様の活性形と、縮合させる。 その後、ＯＤＢ−ＭＧＢ複合体を、従来法によって、最も好ましくはアンモニア での処理によって、ＣＰＧサポートから除去する。 反応式５は、本発明のＯＤＮ−ＭＧＢを製造する他の好ましい方法を示してい る。特に、反応式５は、初めに結合分子をＣＰＧサポートに結合させ、その後に 小溝結合物質の活性形態を結合分子に結合させ、その後に前記改質ＣＰＧサポー トを用いて、自動ＯＤＮ合成装置中で所望配列のＯＤＮを段階的に形成すること によって、ＯＤＮ−ＭＧＢを製造する好ましい合成方法を示している。ＯＤＮ− ＭＧＢ複合体は、所望の配列のＯＤＮ成分が形成された後にのみ、ＣＰＧサポー トから除去される。この場合の結合分子は、各官能基が異なる反応性を有する三 官能価分子であり、これによって、結合分子の異なる官能価をそれぞれ用いる、 ＣＰＧへの結合、小溝結合物質成分の活性形態との反応、およびＯＤＮ部分の形 成が可能となる。この合成方法およびこの方法において用いられる三官能価結合 分子についてのより一般的および詳細な説明が、出願第０８/０９０４０８号に 開示されているが、小溝結合物質に関しては何らの記載もされていない。反応式 ５は、三官能価結合分子としてのβ−アラニリル−３−アミノ−１,２−プロパ ンジオール、および小溝結合物質の活性形態としてのＴＦＰ−ＣＤＰＩ₃（化合 物３ｃ）の例を用いて、この合成法を例示している。 従って、反応式５によれば、Ｆｍｏｃ保護β−アラニンが、テトラフルオロフ ェニルトリフルオロアセテート（ＴＦＰ−ＴＦＡ）と反応して、２,３,５,６− テトラフルオロフェニル ３−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル） ］アミノプロピオネート（４）を得る。活性エステル４が、３−アミノ−１,２ −プロパンジオールと反応して、１−［３−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシ カルボニル）アミノ］−１−オキソプロピル］アミノ−（Ｒ,Ｓ）−２,３−プロ パンジオール（５）を得る。その後に５の第一ヒドロキシル基が、ジメトキシト リチル基で保護されて、１−［３−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニ ル）アミノ］−１−オキソプロピル］アミノ−（Ｒ,Ｓ）−２−［［ビス（メト キシフェニル）フェニルメトキシ］メチル］−２−エタノール（６）が得られる 。化合物６の第二ヒドロキシル基が無水琥珀酸と反応し、その後、得られる化合 物のカルボキシル基が、活性エステル、２,３,５,６−テトロフルオロフェニル １−［３−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］−１−オ キソ プロピル］アミノ−（Ｒ，Ｓ）−２−［［ビス（メトキシフェニル）フェニルメ トキシ］メチル］−２−エチルブタンジオエート（７）に変換される。化合物７ を次に、商業的入手可能であり、前記出願第０８/０９０４０８号に記載の、長 鎖アミノアルキル制御孔ガラスサポート（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ、またはアルキルア ミンＣＰＧ）に結合させる。得られる「改質ＣＰＧ」は、反応式５において化合 物８として示されている。緩塩基（ジメチルホルムアミド中のピペリジン）で処 理することによって、Ｆｍｏｃ保護基を８から除去して、結合分子の一部として 遊離第一級アミン官能基を有する「改質ＣＰＧ」９を得る。次の段階において、 活性小溝結合物質分子、この場合はＴＦＰ−ＣＤＰＩ₃（化合物３ｃ）を、９の 第一級アミン官能基と反応させて、小溝結合物質成分を含み、ジメトキシトリチ ル基で保護された結合基の第一ヒドロキシル基をなお有している改質ＣＰＧ１０ を得る。反応式５には示されていないが、次の段階で、ジメトキシトリチル基を 除去し、現在この分野において慣習的であると考えられている段階によって、Ｏ ＤＮ合成を自動合成装置中で行う。合成が終了したら、ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体を 、アンモニアでの処理によって、ＣＰＧサポートから除去する。前記段階は、３ −アミノ−１,２−プロパンジオール成分の第二ヒドロキシル基をＣＰＧサポー トに結合させている結合を開裂させる。生物学的試験および考察 ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体が、一本鎖ＤＮＡに結合する。それらはリコンビナーゼ 酵素（recombinaze enzyme）の存在下に二本鎖ＤＮＡにも結合し、ある場合には 、一本鎖ＲＮＡならびにＤＮＡおよびＲＮＡハイブリッドにも結合する。しかし 、ＯＤＮ成分が、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの標的配列に対して、相補的である、 またはWatson-Crick意義において実質的に相補的である場合にのみ、結合が起こ る。この条件が満たされるとき、ＯＤＮ−ＭＧＢの標的配列への結合は、同じＯ ＤＮの小溝結合物質なしの結合よりも、かなり強い。前述のことは、下記に記載 の試験によって明らかにされ、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列のための分析的およ び診断的ハイブリッド形成ブローブとしての、および治療的アンチセンス（anti sense）およびアンチジーン（anchi-gene）用途においての、本発明のＯＤＮ− ＭＧ Ｂ複合体の有用性を与えるものである。 表１は、４−アミノ−Ｎ−メチルピロール−２−カルボン酸残基から誘導され る小溝結合物質成分を有する相補的オリゴヌクレオチドから形成されるいくつか の複合体の溶融温度を示す。小溝結合物質成分は特に、表１の下の式によってラ ジカルＸとして示されている。ラジカルＸが、６−アミノヘキサン酸から誘導さ れる結合成分をも含むことに注意すべきである。ここで使用されるオリゴヌクレ オチドは、２'−デオキシアデニル酸の８−マー、およびチミジル酸の８−マー である。小溝結合物質Ｘを、３'−ホスフェート末端においてＯＤＮに結合させ 、これらのＯＤＮの５'−末端はホスフェートを有していない。これに関して、 ＯＤＮが、これらおよび他の表において、この分野において慣習的な方法で、略 されていることに注意すべきである。基Ｙは、「β−アラニン」結合成分を介し て、３’−ホスフェートに結合したエチジウムブロミド成分を表す。Ｙ基は、挿 入基（intercalating group）を表し、小溝結合基との比較のための対照標準と しての役割を持つ。記号ｍは、表の各ＯＤＮ−ＭＧＢ中に存在する４−アミノ−Ｎ −メチル−ピロール−２−カルボン酸残基の数を表す。 この分野において既知であるように、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオ チド二本鎖の溶融温度（Ｔ_m）は、それぞれのオリゴヌクレオチドまたはポリヌ クレオチドの５０％がその二本鎖、Watson Crick水素結合形から解離する温度で あると意義される。溶融温度（Ｔ_m）が高ければ高いほど、より安定な二本鎖を 意味する。既知であるように、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの溶 融温度は、溶融温度が測定される溶液中のヌクレオチドの濃度に依存し、より高 い濃度は、より高い測定溶融温度となる。これらの表に示されている溶融温度は 、表および試験部門に示されている条件下で測定された。△Ｔ_mは、小溝結合物 質成分を有さない（ｄＡｐ）₈・（ｄＴｐ）₈複合体の溶融温度に対する、改質二 本鎖の溶融温度の変化を表す。 表１から分かるように、共有結合小溝結合物質成分は、基Ｘ（小溝結合物質成 分）が（ｄＴｐ）₈または（ｄＡｐ）₈オリゴヌクレオチドのどちらに結合してい ても、複合体の安定性（溶融温度Ｔ_m）を顕著に増加させる。この場合、最大安 定性（最高溶融温度）は、小溝結合物質成分が、５−マーオリゴペプチドである ときに得られる。挿入基Ｙが（ｄＡｐ）₈オリゴマーに結合される比較試験にお いては、比較的かなり低い程度の安定性が得られる。この試験において、挿入基 Ｙをオリゴマーの２本の鎖のそれぞれに結合させても、５個の４−アミノ−Ｎ− メチルピロール−２−カルボン酸残基を有する小溝結合物質成分よりも少なく溶 融温度を上昇させる。 表２は、表１と同様の情報を示している。この表に示されている試験において は、Ｘ（Ｘは表１と同様である）によって表される小溝結合物質成分を有するチ ミジル酸の１６−マーＯＤＮが、ポリデオキシリボアデニル酸と複合された。比 較対照標準として、その３'−ホスフェート末端において６−アミノヘキサン酸 に結合したチミジル酸の１６マーＯＤＮ（ｄＴｐ）₁₆も試験した。さらに、チミ ジル酸の８−マー（ｄＴｐ）８、および種々のペプチド長さの小溝結合物質とそ れとの複合体も試験した。これらの試験においても、ＯＤＮに結合した小溝結合 物質が、ＯＤＮ−ＭＧＢと相補ＤＮＡ鎖との間の複合の有意な安定を生じさせる 。最大の安定化は、小溝結合物質成分中の４−アミノ−Ｎ−メチルピロール−２ −カルボン酸残基の数が５である場合に生じる。これと対照的に、１６−マーＯ ＤＮ上のアミノヘキサン酸末端は、事実上、複合体の安定化を生じさせない。 表３は、オリゴヌクレオチドが、表に示されているように、５'−ホスフェー トまたは３'−ホスフェート末端のどちらかにおいて、それに結合している小溝 結合物質成分を有するチミジル酸の８−マーである試験における、溶融温度（Ｔ_m ）および溶融温度の変化（△Ｔ_m）のデータを示している。この表においてＸお よびＹで表されている小溝結合物質成分は、１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［ ３,２−ｅ］インドール−７−カルボン酸の残基に基づく「オリゴペプチド」で あり（ＣＤＰＩまたはＢｏｃＤＰＩ）、それらの構造が表に示されている。これ らの小溝結合オリゴペプチドは、結合成分「ＬＩまたはＬ２」を介してＯＤＮに 結合し、それらの構造も表の下に示されている。ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体を、相補 的リボまたはデオキシリボホモポリマーで培養した。従って、チミジル酸のＯＤ Ｎを含んで成るＯＤＮ−ＭＧＢ複合体に関しては、ポリＡまたはポリ−ｄＡが使 用された。溶融温度の変化（△Ｔ_m）が、ＯＤＮの対応する末端において対応す る結合基Ｌ１またはＬ２を担持するが、小溝結合成分は担持していないＯＤＮと の複合体に比較して、示されている。表３から分かるように、これらのＯＤＮ− ＭＧＢ複合体もまた、相補的デオキシリボホモポリマーとの複合体の顕著な安定 化を示し、最大安定化は、小溝結合成分が３ＣＤＰＩ単位を有する試験において 生じる。驚くべきことに、複合体の安定化は、ＯＤＮ−ＭＧＢが相補的リボホモ ポリマーで培養される場合でさえも生じる。先行技術において、フリースタンデ ィング（free standing）小溝結合分子がＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに結合し ないことが一般に観察されているので、このことは驚くべきことである。 表４は、２つの相補的オクタマー：ＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＴおよびＡ ｐＧｐＣｐＧｐＧｐＡｐＴｐＧの誘導体間の二本鎖形成の試験結果を示す。各オ クタマーを表に示すように改質し、それによって、対応するオリゴデオキシリボ ヌクレオチドおよびホスホロチオエート主鎖を有するオリゴデオキシリボヌクレ オチドの、ハイブリッド形成について試験した。ＯＤＮは、構造Ｌ１またはＬ２ （Ｘ、Ｌ１およびＬ２は表３と同様）の結合基を介して、３'または５'末端（示 されている）のどちらかに結合した１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ ］インドール−７−カルボン酸（ＣＤＰＩ）の残基に基づくトリペプチドも有し ていた。対照標準として、ＯＤＮが結合基のみを担持している二本鎖に関しても 溶融温度求めた。表から分かるように、二本鎖は、小溝結合物質成分の存在によ って顕著に安定化され、二本鎖の各鎖が共有結合した小溝結合物質を有する場合 に、より高い安定性が生じる。 表５は、相補的または「準相補的（quasi complementary）」ＯＤＮ−ＭＧＢ を培養して、二本鎖形成に関して試験した場合に得られた溶融温度を示している 。予想されるように、鎖中でグアニンがイノシン（Ｉ）と置き換えられる場合に 、小溝結合成分が存在しなければ、二本鎖の結合は非常に弱い（Ｔ_mが約０℃で ある）。しかし、オリゴヌクレオチド中で、グアニンがイノシンで置き換えられ る場合に、１つの共有結合小溝結合物質Ｘがハイブリッドをほぼ５０℃安定化さ せ、 逆平行配向の２つのそのような小溝結合物質の存在は、６３℃の安定化を与えた 。同じ鎖がグアニンを含む場合、１つの小溝結合物質はＴ_mを１５℃増加させ、 一方、２つの場合にはほぼ４５℃増加させる。本発明の発明者らの知識によれば 、８−マーに関して８１℃のＴ_mは、先行技術においては前例のないものである 。プライマー延長実験 ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体のＯＤＮ部分の、Watson-Crick意義における配列特異性 が、ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体を標的配列に複合させるのに必要であることが、プラ イマー延長実験において示された。この実験において、鋳型鎖の５'末端から作 用する酵素Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、プライマー延長が生じる。Watso n Crick意義において鋳型ストランド上の標的配列に相補的な１６−マーＯＤＮ −ＭＧＢを、長い一本鎖ＤＮＡ鋳型およびＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ酵素で培養 した。プライマー延長の封鎖は、小溝結合成分が１６−マーＯＤＮの５'末端上 にあった場合に、ＯＤＮ−ＭＧＢとの結合部位において、確認された。小溝結合 物質は、本明細書の表５に示されるピロロインドールトリペプチドであった。１ ６−マーの配列特異性において、標的への単一不適正があった場合、プライマー 延長は封鎖されなかった。小溝結合物質成分が１６−マーの３’末端に結合され た場合にも、プライマー延長は封鎖されなかった。配列特異的１６−マーおよび 遊離小溝結合物質分子（化合物３ｄ、ＯＤＮに共有結合していない）が、鋳型お よび酵素を用いて培養された場合にも、プライマー延長は封鎖されなかった。こ れらの実験は、ＯＤＮ−ＭＧＢの配列特異性が複合体形成に重要であること、お よび小溝結合成分が、付随（appended）ＯＤＮを他の鎖に非特異的に結合させる 「アンカー」として単に作用するだけではないということを示している。プライ マー延長を阻止するＯＤＮ−ＭＧＢ複合体の性能は、これらの複合体を、ポリメ ラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）クランピング剤として診断的に使用できることを示して いる（Nucleic Acid Research（1993）21:5332-5336を参照）。スロット−ブロット（Slot-blot）ハイブリッド形成分析 本発明のＯＤＮ−ＭＧＢ複合体は、ハイブリッド形成ブローブとして有用であ る。このことは、³²ｐ−標識ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体を診断プローブとして使用す る下記実験の記載によって示される。共有結合小溝結合物質（ＭＧＢ）成分を有 さない同じＯＤＮと比較した場合、この複合体は、より優れた、強さ、効率、お よび特異性をもって、その補体にハイブリッド形成する。スロット−ブロットハ イブリッド形成分析は、幅広く用いられているＤＮＡブローブ診断分析であり、 これらのＭＧＢ−ＯＤＮ複合体の特性が、分析の性能を向上させる。 特に、本明細書に記載されている実験においては、Protocols for Nucleic Ac id Blotting and Hybridization,1988,Amersham,United Kingdomに記載のように 、標準プロトコールを後に続げた。固体化プラスミドにハイブリッド形成した標 識試験ＯＤＮを、１分当たりの計数（cpm）として定量し、ハイブリッド形成の 温度に対してプロットした。Ｍ１３ｍｐ１９ ＤＮＡ（ファージＤＮＡ）に対し て相補的な４つの１６−マーブローブを評価した。これらのプローブのうちの２ つは、ファージＤＮＡにおける部位に対して完全に相補的であり；これらのうち の１つは、３'−結合ＣＤＰＩ₃成分を含有し、他の１つは未改質であった。プロ ーブの第二の組は、Ｍ１３ｍｐ１９ ＤＮＡにおける同じ部位に対して標的とさ れたが、それぞれが単一不適正を含んでいた（図１において下線が付されている ）。ここでもまた、１つのＯＤＮは、ＣＤＰＩ₃に３'−結合であったが、他方は 未改質であった。 スロットハイブリッド形成試験の結果を図１に示す。未改質であるがそれ以外 は同一である１６−マーと比較して、ＣＤＰＩ₃含有プローブは、３３℃のみに 対して５０℃の溶融温度（Ｔ_m）でハイブリッドを形成した。このより高い溶融 温度は、完全な適正のハイブリッドの収量を２倍以上にした。不適正がどちらか のプローブに導入されると、それぞれのハイブリッドの安定性が低下した。ＣＤ ＰＩ₃−改質ブローブは、３７℃〜５０℃の間の良好な配列識別を示した。さら に、ここで使用したバイブリッド形成条件下において、Ｍ１３ｍｐ１９ ＤＮＡ 標的における先存する二本鎖領域への、ＣＤＰＩ₃成分の結合の形跡はなく、こ のことは、これらの複合体の完全に非特異的な結合が存在しないことを示すもの である。培養ヒト細胞中の遺伝子の配列特異的アルキル化 共有結合アルキル化剤をも担持する本発明のＯＤＮ−ＭＧＢ複合体は、ＯＤＮ −ＭＧＢ複合体が標的遺伝子中の標的配列に相補的であることを条件として、望 ましくない（疾患を引き起こす）遺伝子の発現の抑制のための「抗遺伝子」剤と して使用することができる。そのような場合に、ＭＧＢ成分が二本鎖遺伝子への 結合を向上させ（リコンビナーゼ酵素の存在下）、アルキル化成分が、ＯＤＮ− ＭＧＢ複合体の標的配列への永久的な共有結合を生じるさせる。 例示的実験として、ＣＤＰＩ₃基で３'−末端改質され、ナイトロジェンマスタ ード基（chlorambucil）で内部的に改質された前記５０−マーＯＤＮを、生体ヒ トＢＳＭ細胞（ヒトＢ−リンパ球細胞系）に存在する標的遺伝子（ＨＬＡ ＤＱ β１ ０３０２ 対立遺伝子）中の期待部位に、配列特異的に架橋した。ＯＤＮ− ＭＧＢ複合体を、最終濃度１−５０μＭでＢＳＭ細胞の懸濁液に加えた。３.５ 時間後、ゲノムＤＮＡを抽出し、熱ピロリジンで処理して、アルキル化事象（al kylation events）をニックに変換した。次に、０３０２対立遺伝子の標的領域 を、単一塩基分解（single-base resolution）において開裂事象を検出するため に使用できる方法であるＬＭ−ＰＣＲ（連結反応媒介ポリメラーゼ鎖反応(ligat ion mediated polymerase chain reaction)）によっで増幅した。配列ゲル上の 生成物の分析は、改質ＯＤＮが、標的部位に結合し、標的部位をアルキル化した ことを示した。ＣＤＰＩ₃基を欠いた同様のＯＤＮは、標的のアルキル化効率が かなり劣っていた。 前記実験において、ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体の認識および相同的二本鎖ＤＮＡへ の結合を、核リコンビナーゼの助けによって起こすことも可能である。同様の実 験および用途において、内因性リコンビナーゼ酵素（endogenous recombinaze e nzymes）が、他の生体細胞中における、ＯＤＮ−ＣＤＰＩ₃複合体による２本鎖 ゲノムＤＮＡの配列特異的ターゲッティングを、触媒することができる。これら のＯＤＮは付随する（appended）架橋剤を有し、それらは標的ＤＮＡをアルキル 化することができる。リコンビナーゼの存在下に形成されるＤ−ループを安定化 することによって、ＣＤＰＩ₃が架橋反応を促進する。この架橋事象は、標的遺 伝子の発現の強力なインヒビターである。従って、架橋ＯＤＮ−ＣＤＰＩ₃複合 体を、抗遺伝子剤として使用することができる。特定の具体例、実験部門 一般的実験 全ての空気および水感受性反応をアルゴンの微量正圧下で行った。無水溶媒を Aldrich（Milwaukee，WI）から入手した。フラッシュクロマトグラフィーは、２ ３０−４００メッシュシリカゲル上で行った。融点は、開放毛管中のMel-Temp融 点装置で測定し、修正されてない。元素分析はQuantitative Technologies Inc. （Boundbrook，NJ）によって行った。ＵＶ可視吸収スペクトルは、２００〜４０ ０ｎｍの範囲において、UV-2100（Shimadzu）またはLambda 2（Perkin Elmer） 分光光度計によって記録した。¹Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Bruker WP-200またはV arian XL-200分光光度計で２０℃で行った；化学シフトはＭｅ₄Ｓｉからのppmダ ウンフィールドで示す。２,３,５,６−テトラフルオロフェニル ３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ− ３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシレート （１ａ）。 ２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（２.６ｇ、１ ０mmol、H.B.Gamper,N.W.Reed,T.Cox,J.S.Virosco,A.D.Adams,A.A.Gall,J.K.Sch ollerおよびR.B.Meyer,Jr.Nucleic Acids Res.,1993,Vol.21,No.1,145-150）を 、無水ＤＭＦ１５ｍＬ中の３−カルバモイル−１，２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボン酸（１.４ｇ、６.１mmol、D.L.Boger,R .S.Coleman,およびB.J.Invergo.J.Org.Chem.,1987,Vol.52,1521-1530）およびト リエチルアミン（１.４ｍＬ、１０mmol）の溶液に滴下した。１時間後、反応混 合物を真空下に濃縮した（０.２mm）。残留物を乾燥ジクロロメタン２ｍＬです り砕いた。エチルエーテル（５０ｍＬ）を加え、混合物を０℃で一夜置いた。沈 殿物を、焼結ガラス漏斗で濾過することによって集め、初めに５０％エーテル/ ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍＬ）、次にエーテル（５０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥した。 生成物を黄色固形物として得た（１.８ｇ、７５％）。¹ Ｈ ＮＭＲ（Ｍｅ₂ＳＯ−ｄ ₆２００ＭＨｚ,ppm）１２.３２（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、 ８.１３（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ）、８.０１（ｍ,１Ｈ,Ｃ₆Ｆ₄Ｈ）、７. ４１（ｓ,１Ｈ,Ｃ８−Ｈ）、７.２６（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈz,Ｃ５−Ｈ）、６.１７ （ｓ,２Ｈ,ＣＯＮＨ₂）、３.９９（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝９Ｈz,ＮＣＨ₂ＣＨ₂）、３.３ ０（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,ＮＣＨ₂ＣＨ₂）。 分析、Ｃ₁₈Ｈ₁₁Ｎ₃Ｏ₃Ｆ₄ｘ２Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ、５０.３；Ｈ、３.５２；Ｎ、 ９.７。実測値：Ｃ、５０.８１；Ｈ、３.６０；Ｎ、９.９５。２,３,５,６−テトラフルオロフェニル ３−（ｔ−ブチルオキシカルボニル） −１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシレ ート （１ｂ）。 ２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（２.６ｇ、１ ０mmol）を、無水ＣＨ₂Ｃｌ₂１０ｍＬ中の３−（ｔ−ブチルオキシカルボニル） −１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボン酸（ １.０ｇ、３.７mmol、D.L.Boger,R.S.Coleman,およびB.J.Invergo.J.Org.Chem., 1987,Vol.52,1521-1530）およびトリエチルアミン（１.５ｍＬ、１０mmol）の溶 液に滴下した。４時間後、ＣＨ₂Ｃｌ₂を減圧下に留去した。フラッシュクロマト グラフィー（４ｘ２０ｃｍ、ヘキサン−酢酸エチル、１：２）にかけて、１ｂを 黄色結晶質固形物として得た（１.２５ｇ、７５％）。¹ Ｈ ＮＭＲ（Ｍｅ₂ＳＯ−ｄ ₆２００ＭＨｚ,ppm）１２.３９（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１. ４Ｈｚ,ＮＨ）、８.０２（ｍ,１Ｈ,Ｃ₆Ｆ₄Ｈ）、７.９（ｂｒ ｓ,１Ｈ,Ｃ４−Ｈ ）、７.４５（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.４Ｈｚ,Ｃ８−Ｈ）、７.３３（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈ ｚ,Ｃ５−Ｈ）、４.０２（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,ＮＣＨ₂ＣＨ₂）、３.２６（ｔ, ２Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,ＮＣＨ₂ＣＨ₂）、１.５１（ｓ,９Ｈ,Ｃ（ＣＨ₃）₃）。 分析、Ｃ₂₂Ｈ₁₈Ｎ₂Ｏ₄Ｆ₄の計算値：Ｃ、５８.６７；Ｈ、４.０３；Ｎ、６.２２ 。実測値：Ｃ、５８.４５；Ｈ、４.０９；Ｎ、６.１３。３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール− ７−カルボン酸ダイマーメチルエステル （２ａ）。 無水ＤＭＦ１０ｍＬ中の、メチル １,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロインドー ル−７−カルボキシレート（０.６ｇ、１.５mmol）、１ａ（０.４５ｇ、２.２５ mmol）、およびトリエチルアミン（０.２ｍＬ、１.４mmol）の溶液を、室温で２ ４時間、次に０℃で１２時間で培養した。得られる不溶性固形物を濾過によって 集め、ＤＭＦ（１０ｍＬ）およびエーテル（２０ｍＬ）で洗浄した。真空乾燥に よって２ａ（０.６１ｇ、９１％）を淡黄色固形物として得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（Ｍｅ₂ＳＯ−ｄ ₆、２００ＭＨｚ、ppm）１２.００（ｓ,１Ｈ,Ｊ＝ １.８Ｈｚ,ＮＨ'）、１１.５４（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、８.２８（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈ ｚ,Ｃ４'−Ｈ）、７.９７（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ）、７.３３（ｄ,１Ｈ ，Ｊ＝９ｚ,Ｃ５'−Ｈ）、７.２２（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９ｚ,Ｃ５−Ｈ）、７.１３（ ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.４Ｈｚ,Ｃ８'−Ｈ）、６.９４（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.１Ｈｚ,Ｃ８− Ｈ）、６.０１（ｓ,２Ｈ,ＣＯＮＨ₂）、４.６２（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ、（ＮＨ₂ ＣＨ₂）'）、３.９８（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,ＮＣＨ₂ＣＨ₂）、３.８８（ｓ,３Ｈ ,ＣＨ₃）、３.４１（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,（ＮＣＨ₂ＣＨ₂）'）、３.２９（ｔ, ２Ｈ,ＮＣＨ₂ＣＨ₂,部分的に水によって曇っている）。 分析、Ｃ₂₄Ｈ₂₁Ｎ₅Ｏ₅ｘ１Ｈ₂Ｏｘ１ＤＭＦの計算値：Ｃ、５８.６９；Ｈ、５. ８４；Ｎ、１５.２１。実測値：Ｃ、５８.９３；Ｈ、５.７５；Ｎ、１５.８２。３−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２ −ｅ］インドール−７−カルボン酸ダイマーメチルエステル （２ｃ）。 無水ＤＭＦ１０ｍＬ中の、メチル １,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロインドー ル−７−カルボキシレート（０.５ｇ、２.５mmol）、１ｂ（１.０ｇ、２.２mmol )、およびトリエチルアミン（０.１ｍＬ、０.７mmol）の溶液を、室温で１０時 間、および０℃で１２時間培養した。得られる不溶性固形物を濾過によって集め 、ＤＭＦ（５ｍＬ）およびエーテル（４０ｍＬ）で洗浄した。真空乾燥によって ２ｃ（０.８１ｇ、７４％）を灰色がかった白色の固形物として得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（Ｍｅ₂ＳＯ−ｄ ₆、２００ＭＨｚ、ppm）１２.０１（ｓ,１Ｈ,ＮＨ' ）、１１.６４（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、８.２８（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ４'−Ｈ）、 ７.８（ｂｒ ｓ,１Ｈ,Ｃ４−Ｈ）、７.３２（明白なｔ,２Ｈ,Ｃ５'−Ｈ＋Ｃ５− Ｈ）、７.１３（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.１Ｊｚ、Ｃ８'−Ｈ）、６.９８（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝ １.１Ｈｚ,Ｃ８−Ｈ）、４.６２（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,（ＮＨ₂ＣＨ₂）'）、４. ０ ２（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,ＮＣＨ₂ＣＨ₂）、３.８８（ｓ,３Ｈ,ＣＨ₃）、３.４１ （ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,（ＮＣＨ₂ＣＨ₂）'）、３.２５（ｔ,２Ｈ,ＮＣＨ₂ＣＨ₂ ）、１.５２（ｓ,９Ｈ,Ｃ（ＣＨ₃））。 分析、Ｃ₂₈Ｈ₂₈Ｎ₄Ｏ₅の計算値：Ｃ、６７.１９；Ｈ、５.６４；Ｎ、１１.１９ 。実測値：Ｃ、６６.７２；Ｈ、５.６９；Ｎ、１１.３１。２,３,５,６−テトラフルオロフェニル ３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ− ３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートダイマー （２ｅ ）。 ２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（２.６ｇ、１ ０mmol）を、無水ＤＭＦ１５ｍＬ中の２ｂの懸濁液（１.２ｇ、２.８mmol、D.L. Boger,R.S.Coleman,およびB.J.Invergo.J.Org.Chem.,1987,Vol.52,1521-1530） に滴下した。トリエチルアミン（１.４ｍＬ、１０mmol）を加え、混合物を３時 間攪拌した。回転蒸発器を用いて、混合物を真空濃縮した（０.２ｍｍ）。残留 物を、乾燥ジクロロメタン２０ｍＬを用いてすり砕いた。得られる生成物を濾過 し、ジクロロメタン（１０ｍＬ）、エーテル（２０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥し て、２ｅを黄色固形物として得た（１.５ｇ、９３％）。¹ Ｈ ＮＭＲ（Ｍｅ₂ＳＯ−ｄ ₆２００ＭＨｚ,ppm）１２.５１（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１. ８Ｈｚ,ＮＨ'）、１１.５８（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、８.３９（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝８.９Ｈ ｚ,Ｃ４'−Ｈ）、８.０４（ｍ,１Ｈ,Ｃ₆Ｆ₄Ｈ）、７.９８（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝８.８ Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ）、７.５８（ｓ,１Ｈ,Ｃ８'）、７.４２（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ, Ｃ５'−Ｈ）、７.２２（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ５−Ｈ）、６.９８（ｓ,１Ｈ,Ｃ ８−Ｈ）、６.１１（ｓ,２Ｈ,ＣＯＮＨ₂）、４.６６（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝７.８Ｈｚ, （ＮＣＨ₂ＣＨ₂）'）、３.９４（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝９.１Ｈｚ,ＮＣＨ₂ＣＨ₂）、３. ４７（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,（ＮＣＨ₂ＣＨ₂）'）、３.２９（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝９.１ Ｈｚ,ＮＣＨ₂ＣＨ₂）。 分析、Ｃ₂₉Ｈ₁₉Ｎ₅Ｏ₄Ｆ₄ｘ１.５Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ、５７.６２；Ｈ、３.６７ ；Ｎ、１１.５９。実測値：Ｃ、５７.１８；Ｈ、３.３１；Ｎ、１１.５４。２,３,５,６−テトラフルオロフェニル ３−（ｔ−ブチルオキシカルボニル） −１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシレ ートダイマー （２ｆ）。 ２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（０.７５ｇ、 ２.９mmol）を、無水ＣＨ₂Ｃｌ₂（８ｍＬ）とＤＭＦ（２ｍＬ）との混合物中の 、２ｄ（０.２５ｇ、０.５mmol、D.L.Boger,R.S.Coleman,およびB.J.Invergo.J. Org.Chem.,1987,Vol.52,1521-1530）およびトリエチルアミン（０.５ｍＬ、３. ５mmol）の懸濁液に滴下した。この混合物を２０時間攪拌した。得られる清澄な 溶液を真空濃縮し、１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７.５）４０ｍＬに滴下した。沈 殿物を遠心分離にかけ、水（２ｘ４０ｍＬ）、エーテル中の１０％ＭｅＯＨ（２ ｘ４０ｍＬ）、エーテル（４０ｍＬ）、およびヘキサン（４０ｍＬ）で洗浄した 。最終的に、真空乾燥して２ｆを淡黄色固形物として得た（０.２９ｇ、９１％ ）。¹ Ｈ ＮＭＲ（Ｍｅ₂ＳＯ−ｄ ₆２００ＭＨｚ,ppm）１２.５１（ｓ,１Ｈ,ＮＨ'） 、１１.６６（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、８.３７（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝８.８Ｈｚ,Ｃ４'−Ｈ） 、８.０３（ｍ,１Ｈ,Ｃ₆Ｆ₄Ｈ）、７.８（ｂｒ ｓ,１Ｈ,Ｃ４−Ｈ）、７.５８（ ｓ,１Ｈ,Ｃ８'−Ｈ）、７.４０（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９.１Ｈｚ,Ｃ５'−Ｈ）、７.２７ （ｄ,１Ｈ,Ｊ＝８.６Ｈｚ,Ｃ５−Ｈ）、７.１（ｓ,１Ｈ,Ｃ８−Ｈ）、４.６５（ ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,（ＮＣＨ₂ＣＨ₂）'）、４.０２（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,ＮＣ Ｈ₂ＣＨ₂）、３.４６（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８Ｈｚ,（ＮＣＨ₂ＣＨ₂）'）、３.２５（ｔ ,２Ｈ,Ｊ＝８.９Ｈｚ,ＮＣＨ₂ＣＨ₂）、１.５１（ｓ,９Ｈ,Ｃ（ＣＨ₃）₃）。 分析、Ｃ₃₃Ｈ₂₆Ｎ₄Ｏ₅Ｆ₄ｘ０.５Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ、６１.５９；Ｈ、４.２３ ；Ｎ、８.７１。実測値：Ｃ、６１.７３；Ｈ、４.１２；Ｎ,８.６１。３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール− ７−カルボキシレートトリマーメチルエステル （３ａ）。 無水ＤＭＦ１５ｍＬ中の、メチル １,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロインドー ル−７−カルボキシレート（１.０ｇ、５mmol）、２ｅ（１.２ｇ、２.１mmol） 、およびトリエチルアミン（０.１ｍＬ、 mmol）の溶液を、室温で２４時間、 および０℃で１２時間培養した。得られる不溶性固形物を濾過によって集め、Ｄ ＭＦ（１０ｍＬ）、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２０ｍＬ）、およびエーテル（２０ｍＬ）で洗 浄した。真空乾燥によって３ａ（１.１ｇ、８３％）を淡黄色固形物として得た 。¹ Ｈ ＮＭＲ（Ｍｅ₂ＳＯ−ｄ ₆、２００ＭＨｚ、ppm）１２.０２（ｓ,１Ｈ,ＮＨ" ）、１１.７５（ｓ,１Ｈ,ＮＨ'）、１１.５６（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、８.２８（明白 なｔ,２Ｈ,Ｊ＝８.３Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ"＋Ｃ４'−Ｈ）、７.９８（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９. ４Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ）、７.９８（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ）、７.３９−７. ３３（２ｄ,２Ｈ,Ｃ５"−Ｈ＋Ｃ５'−Ｈ）、７.２３（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝８.７Ｈｚ, Ｃ５−Ｈ）、７.１４（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.６Ｈｚ,Ｃ８"−Ｈ）、７.１０（ｄ,１Ｈ ，Ｊ＝１Ｈｚ,Ｃ８'−Ｈ）、６.９７（ｓ,１Ｈ,Ｃ８−Ｈ）、６.１１（ｓ,２Ｈ, ＣＯＮＨ₂）、４.６５（ｔ,４Ｈ,（ＮＣＨ₂ＣＨ₂）”＋（ＮＣＨ₂ＣＨ₂）'）、 ３.９８（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８.７Ｈｚ,ＮＣＨ₂ＣＨ₂）、３.８８（ｓ,３Ｈ,ＣＨ₃） 、３.４８−３.２５（ｍ,６Ｈ,（ＮＣＨ₂ＣＨ₂）”＋（ＮＣＨ₂ＣＨ₂）'＋ＮＣ Ｈ₂ＣＨ₂部分的にＨ₂Ｏによって曇っている）。 分析、Ｃ₃₅Ｈ₂₉Ｎ₇Ｏ₅ｘ４.５Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ、５９.３２；Ｈ、５.０；Ｎ、 １３.０３。実測値：Ｃ、５８.９；Ｎ、５.０６；Ｎ、１３.７７。２,３,５,６−テトラフルオロフェニル ３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ− ３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートトリマー （３ｃ ）。 ２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（２.６ｇ、１ ０mmol）を、無水ＤＭＦ１５ｍＬおよびトリエチルアミン（１.４ｍＬ、１０mmo l）中の３ｂ（１.１ｇ、１.８mmol）の懸濁液に滴下した。この混合物を３時間 攪拌した。混合物を真空濃縮した（０.２ｍｍ）。残留物を、乾燥ジクロロメタ ン（２０ｍＬ）とメタノール（２ｍＬ）との混合物ですり砕いた。得られる生成 物を濾過によって集め、ジクロロメタン（２０ｍＬ）、エーテル（２０ｍＬ）で 洗浄し、真空乾燥して、黄緑色固形物１.３ｇ（９５％）を得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（Ｍｅ₂ＳＯ−ｄ ₆２００ＭＨｚ,ppm）１２.５４（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１Ｈ ｚ,ＮＨ"）、１１.７９（ｓ,１Ｈ,ＮＨ'）、１１.５６（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、８.４ １（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９.３Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ"）、８.２７（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９.４Ｈｚ,Ｃ ４'−Ｈ）、８.０３（ｍ,１Ｈ,Ｃ₆Ｆ₄Ｈ）、７.９８（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９Ｈｚ,Ｃ４ −Ｈ）、７.５６（ｓ,１Ｈ,Ｃ８"−Ｈ）、７.４５−７.３５（ｍ,２Ｈ,Ｃ５"− Ｈ＋Ｃ５'−Ｈ）、７.２３（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝９.２Ｈｚ,Ｃ５−Ｈ）、７.１３（ｓ ,１Ｈ,Ｃ８'−Ｈ）、６.９７（ｓ,１Ｈ,Ｃ８−Ｈ）、６.１１（ｓ，２Ｈ,ＣＯＮ Ｈ₂）、４.６５（ｍ,４Ｈ,（ＮＣＨ₂ＣＨ₂）"＋（ＮＣＨ₂ＣＨ₂）'）、３.９８ （ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８.７Ｈｚ,ＮＣＨ₂ＣＨ₂）、３.４５（ｍ,４Ｈ,（ＮＣＨ₂ＣＨ₂ ）"＋（ＮＣＨ₂ＣＨ₂）'）、３.２５（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８.７Ｈｚ,ＮＣＨ₂ＣＨ₂） 。 分析、Ｃ₄₀Ｈ₂₇Ｎ₇Ｏ₅Ｆ₄ｘ２Ｈ₂Ｏの計算値：Ｃ、６１.５９；Ｈ、４.２３；Ｎ 、８.７１。実測値：Ｃ、６１.７３；Ｈ、４.１２；Ｎ、８.６１。［３−カルバモイル−１,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール −７−カルボキシ］−１−アミド−３−プロパノールトリマー （３ｄ）。 無水ＤＭＦ２.５ｍＬ中の、３−アミノ−１−プロパノール（７０μＬ、１.４ mmol）、３ｃ（７５ｍｇ、０.１mmol）、およびトリエチルアミン（０.１ｍＬ、 mmol）の溶液を、室温で１０時間攪拌した。得られる不溶性固形物を濾過によっ て集め、ＤＭＦ（２ｍＬ）、ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍＬ）およびエーテル（２０ｍＬ ）で洗浄した。真空乾燥して３ｄ（５５ｍｇ、８９％）を淡黄色固形物として得 た。¹ Ｈ ＮＭＲ（Ｍｅ₂ＳＯ−ｄ ₆２００ＭＨｚ,ppm）１１.７６（ｓ,１Ｈ,ＮＨ"） 、１１.６５（ｓ,１Ｈ,ＮＨ'）、１１.５７（ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、８.４７（ｍ,１ Ｈ，Ｃ４−Ｈ）、８.２４（ｍ,１Ｈ,Ｃ４−Ｈ）、７.９９（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝８.４ Ｈｚ,Ｃ４−Ｈ）、７.４０−７.３２（２ｄ,２Ｈ,Ｃ５"−Ｈ＋Ｃ５'−Ｈ）、７. ２３（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝８.９Ｈｚ,Ｃ５−Ｈ）、７.１２（ｓ,１Ｈ,Ｃ８"−Ｈ）、７ .１０（ｓ,１Ｈ,Ｃ８'−Ｈ）、６.９９（ｓ,１Ｈ,Ｃ８−Ｈ）、６.１２（ｓ,３ Ｈ,ＣＯＮＨ₂＋ＮＨＣＯ）、４.６６（ｔ,４Ｈ,（ＮＣＨ₂ＣＨ₂）"＋（ＮＣＨ₂ ＣＨ₂）'）、３.９８（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝８.７Ｈｚ,ＮＣＨ₂ＣＨ₂）、３.５１−３. ２５（ｍ,１０Ｈ,（ＮＣＨ₂ＣＨ₂）"＋（ＮＣＨ₂ＣＨ₂）'＋ＮＣＨ₂ＣＨ₂＋ＮＨ ＣＨ ₂＋ＣＨ ₂ＯＨ 部分的にＨ₂Ｏによって曇っている）、１.７０（ｐ,２Ｈ,Ｊ ＝６.６Ｈｚ,ＣＨ₂ＣＨ ₂ＣＨ₂）。２,３,５,６−テトラフルオロフェニル ３−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキ シカルボニル）］アミノプロピオネート （４）。 ２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（１.７ｇ、６ .５mmol）を、無水ＣＨ₂Ｃｌ₂２０ｍＬ中の、ＦＭＯＣ−アラニン（２.０ｇ、６ .４mmol）およびトリエチルアミン（１.０ｍＬ、７mmol）の溶液に滴下した。１ 時間後、ＣＨ₂Ｃｌ₂を、回転蒸発器を用いて減圧下に蒸発によって除去し、３０ ｍＬエチルアセテート/ヘキサン（１：１）中に再度溶解した。フラッシュクロ マトグラフィー（４ｘ２０ｃｍ、ヘキサン/酢酸エチル、３：１）によって、４ を白色固形物として得た。ヘキサン/酢酸エチルから再結晶して、４を白色結晶 質固形物として得た（２.３ｇ、７８％）。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃,２００ＭＨｚ,ppm）７.７３（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７.１Ｈｚ, 芳香族プロトン）、７.７５（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７.７Ｈｚ,芳香族プロトン）、７.２ ４−７.４２（ｍ,４Ｈ,芳香族プロトン）、７.０１（ｍ,１Ｈ,Ｃ₆Ｆ₄Ｈ）、５. ２１（ｂｒ ｓ,１Ｈ,−ＣＯＮＨ−）、４.３８（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７.１Ｈｚ,−ＣＨ₂ ＯＣＯ−）、４.２０（ｍ,１Ｈ,ベンジルプロトン）、３.５８（ｍ,２Ｈ,ＮＣ Ｈ₂）、２.９３（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝５.４Ｈｚ,−ＣＨ₂ＣＯ−）。 分析、Ｃ₂₄Ｈ₁₇ＮＯ₄Ｆ₄の計算値：Ｃ、６２.７５；Ｈ、３.７３；Ｎ、３.０５ 。実測値：Ｃ、６２.５２；Ｈ、３.５９；Ｎ、３.０１。１−［３−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）］アミノ］−１−オ キソプロピル］アミノ−（Ｒ,Ｓ）−２，３−プロパンジオール （５）。 無水ＣＨ₂Ｃｌ₂２０ｍＬ中の４（２.０ｇ、４.３５mmoｌ）の溶液を、１０ｍ ＬＭｅＯＨ中の３−アミノ−１,２−プロパンジオール（０.６、 mmol）の攪拌 溶液に加えた。１０分後、酢酸（３ｍＬ）を加え、混合物を蒸発乾燥した。残留 物を水１００ｍＬですり砕いた。得られる固形物を濾過し、水で洗浄し、減圧下 にトルエン（２ｘ５０ｍＬ）と共に同時蒸発させることによって乾燥した。酢酸 エチル５０ｍＬで洗浄し、続いて、一夜真空乾燥して、５を白色結晶質固形物と して得た（１.６５ｇ、９９％）。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃＋ＭｅＯＤ−ｄ４,２００ＭＨｚ,ppm,Ｍｅ₄Ｓｉ）７.７ ７（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７.７Ｈｚ,芳香族プロトン）、７.６１（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７.３Ｈ ｚ,芳香族プロトン）、７.４５−７.２９（ｍ,４Ｈ,芳香族プロトン）、４.３５ （ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７.１Ｈｚ,−ＣＨ₂ＯＣＯ−）、４.２２（ｍ,１Ｈ,ベンジルプロ トン）、３.７２（ｍ,１Ｈ,ＮＨＣＨ₂ＣＨＯＨＣＨ₂ＯＨからの−１Ｈ−）、３. ５２−３.２７（ｍ,６Ｈ,ＯＣＯＮＨＣＨ ₂＋ＣＨ ₂ＣＨＯＨＣＨ ₂ＯＨ）、２.４ ４（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６.６Ｈｚ,−ＣＨ₂ＣＯ−）。 分析、Ｃ₂₁Ｈ₂₄Ｎ₂Ｏ₅の計算値：Ｃ、５.６１；Ｈ、６.２９；Ｎ、７.２９％。 実測値：Ｃ、６５.４３；Ｈ、６.２８；Ｎ、７.２１。１−［３−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］−１−オキ ソプロピル］アミノ−（Ｒ,Ｓ）−２−［［ビス（メトキシフェニル）フェニル メトキシ］メチル］−２−エタノール （６）。 無水ピリジン３０ｍＬ中の５（１.６ｇ、４.２mmol）の攪拌溶液に、ＤＭＴｒ Ｃｌ（１.６ｇ、４.７mmol）を加えた。アルゴン下に３時間攪拌後、混合物を蒸 発乾燥した。残留ピリジンを、トルエンと共に同時蒸発させることよって除去し た。残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂１００ｍＬに溶解し、水２ｘ１００ｍＬで洗浄し、硫酸 ナトリウム上で乾燥し、蒸発乾燥した。残留物を、溶離剤として酢酸エチルを用 いるフラッシュクロマトグラフィー（４ｘ２０ｃｍ、シリカ）で精製した。純生 成物を含有する画分を集め、蒸発乾燥して、１.９ｇ（６６％）の６を無色泡状 物として得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃,２００ＭＨｚ,ppm,Ｍｅ₄Ｓｉ）７.７２（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝ ７.２Ｈｚ,芳香族プロトン）、７.５６（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７Ｈｚ,芳香族プロトン） 、７.４０−７.２０（ｍ,１３Ｈ,芳香族プロトン）、６.８０（ｄ,４Ｈ,Ｊ＝９ Ｈｚ,ＤＭＴｒプロトン）、５.７６（ｂｒ ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、５.４２（ｂｒ ｓ, １Ｈ,ＮＨ）、４.３５（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝６.６Ｈｚ,−ＣＨ₂ＯＣＯ−）、４.１７（ ｍ,１Ｈ,ベンジルプロトン）、３.８３（ｍ,１Ｈ,ＮＨＣＨ₂ＣＨＯＨＣＨ₂ＯＨ からの−ＣＨ−）、３.７５（ｓ,６Ｈ,ＯＣＨ₃）、３.６０−３.３０（ｍ,４Ｈ, ＯＣＯＮＨＣＨ ₂＋ＣＨ ₂ＣＨＯＨＣＨ₂ＯＨ）、３.１３（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝５.４Ｈ ｚ,ＣＨ₂ＯＤＭＴｒ）、２.３０（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝５.４Ｈｚ,−ＣＨ₂ＣＯ−）。 分析、Ｃ₄₂Ｈ₄₂Ｎ₂Ｏ₇の計算値：Ｃ、７３.４５；Ｈ、６.１６；Ｎ、４.０８。 実測値：Ｃ、６５.４３；Ｈ、６.２８；Ｎ、７.２１。２,３,５,６−テトラフルオロフェニル １−［３−［Ｎ−（９−フルオレニル メトキシカルボニル）アミノ］−１−オキソプロピル］アミノ−（Ｒ,Ｓ）−２ −［［ビス（メトキシフェニル）フェニルメトキシ］メチル］−２−エチルブタ ンジオエート （７）。 無水ＣＨ₂Ｃｌ₂１０ｍＬ中の、６（１.２ｇ、１.７５mmol）、トリエチルアミ ン（０.２ｇ、２mmol）、１−メチルイミダゾール（２０μＬ）の溶液に、無水 琥珀酸０.２ｇ（２mmol）を加えた。この溶液を２０時間攪拌した。トリエチル アミン（６０μＬ）を溶液に加え、続いて、０.６ｇ（２.２mmol）の２,３,５, ６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテートを加えた。１時間後、回転 蒸発器を用いてＣＨ₂Ｃｌ₂を減圧下に蒸発によって除去し、残留物を１５ｍＬエ チルアセテート/ヘキサン（１：２）に溶解した。フラッシュクロマトグラフィ ー（４ｘ２０ｃｍ、ヘキサン/酢酸エチル、２：１）によって、１ｂを淡黄色泡 状物（１.２ｇ、７３％）として得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃,２００ＭＨｚ,ppm,Ｍｅ₄Ｓｉ）７.７１（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝ ７.２Ｈｚ,芳香族プロトン）、７.５４（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝７Ｈｚ,芳香族プロトン） 、７.４０−７.２０（ｍ,１３Ｈ,芳香族プロトン）、７.００（ｍ,１Ｈ,Ｃ₆Ｆ₄ Ｈ）、６.７８（ｄ,４Ｈ,Ｊ＝７ Ｈｚ,ＤＭＴｒプロトン）、５.７１（ｂｒ ｓ ,１Ｈ,ＮＨ）、５.４２（ｂｒ ｓ,１Ｈ,ＮＨ）、５.１５（ｍ,１Ｈ,ＮＨＣＨ₂ＣＨ ＯＨＣＨ₂ＯＨからの−ＣＨ−）、４.３１（ｄ,２Ｈ,Ｊ＝６.２Ｈz,−ＣＨ₂Ｏ ＣＯ−）、４.１６（ｄ,５.５Ｈｚ,１Ｈ,ベンジルプロトン）、３.７４（ｓ,６ Ｈ,ＯＣＨ₃）、３.６０−３.３０（ｍ,４Ｈ,ＯＣＯＮＨＣＨ ₂＋ＣＨ ₂ＣＨＯＨＣ Ｈ₂ＯＨ）、３.２０（ｂｒ ｓ,２Ｈ,ＣＨ₂ＯＤＭＴｒ）、２.９８（ｂｒ ｓ,２ Ｈ,ＣＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ）、２.７２（ｂｒ ｓ,２Ｈ,ＣＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ）、２. ２０（ｂｒ ｓ,２Ｈ,−ＣＨ₂ＣＯ−）。 分析、Ｃ₄₂Ｈ₄₂Ｎ₂Ｏ₇の計算値：Ｃ、６６.８０；Ｈ、４.９６；Ｎ、３.００。 実測値：Ｃ、６６.１８；Ｈ、４.９８；Ｎ、２.８６。ＣＰＧ誘導体の製造 ８。 無水ピリジン２０ｍＬ中の、長鎖アミノアルキル制御孔ガラス（ＬＣＡＡ−Ｃ ＰＧ）５.０ｇ、１−メチルイミダゾール０.５ｍＬ、および０.４５ｇ（０.５mm ol）の７の混合物を、１００ｍＬフラスコ（オービタルミキサー、１５０rpm） 中で渦を巻かせた。３時間後、ＣＰＧを焼結ガラス漏斗で濾過し、それぞれ１０ ０ｍＬのＤＭＦ、アセトン、およびジエチルエーテルで洗浄した。ＣＰＧを真空 乾燥し、ピリジン（２０ｍＬ）、無水酢酸（２ｍＬ）、および１−メチルイミダ ゾール（２ｍＬ）の混合物で処理した。３０分間渦を巻かせた後に、ＣＰＧをピ リジン、メタノール、およびジエチルエーテルで洗浄し、次に真空乾燥した。文 献に記載の方法(T.AtkinsonおよびM.Smithによる,M.Gait(ed.),Oligonucleotide Synthesis,A Practical Approach,IRL Press,1984,Oxford,UK,pp.35-81)によっ てジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）含有量を分析し、２８μmol/ｇの荷重を有す ることを見い出した。ＣＰＧ誘導体の製造 ９。 ＣＰＧ誘導体８（３.０ｇ）を、乾燥ＤＭＦ中の２０％ピペリジン２０ｍＬで ２回、各回ごとに５分間で処理した。ＣＰＧを、それそれ１００ｍＬのＤＭＦ、 メタノール、およびジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥した。ＣＰＧ誘導体の製造 １０。 無水ＤＭＳＯ７.５ｍＬ中の、２.５ｇの９、７.５ｍＬのトリエチルアミン、 および０.３８ｇ（０.５mmol）の３ｃの混合物を、５０ｍＬフラスコ（オービタ ルミキサー、１５０漏斗rpm）中で渦を巻かせた。２日後、ＣＰＧを焼結ガラス 漏斗で濾過し、それぞれ１００ｍＬのＤＭＳＯ、アセトン、およびジエチルエー テルで洗浄した。ＣＰＧを真空乾燥し、ピリジン（１０ｍＬ）、無水酢酸（１ｍ Ｌ）、および１−メチルイミダゾール（１ｍＬ）の混合物で処理した。３０分間 渦を巻かせた後に、ＣＰＧをＤＭＳＯ、ピリジン、メタノール、およびジエチル エーテルで洗浄し、次に真空乾燥した。２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エチル ５−［（ｔ−ブチルオキシ ）カルボキシアミド］ペンチルカルボキシレート （１１）。 ６−［（ｔ−ブチルオキシカルボキシアミド］ヘキサン酸（４.１６ｇ、１８m mol）を、乾燥ＤＭＦと共に、同時蒸発させることによって乾燥した（７０℃） 。残留物を乾燥ＤＭＦ（２５ｍＬ）中に再度溶解し、２−［４−（フェニルアゾ ）−ベンジルチオ］−エタノール（４.０ｇ、１５mmol）、Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘ キシルカルボジイミド（３.７１ｇ、１８mmol）、４−ジメチルアミノピリジン （１.８３ｇ、１５mmol）を０℃で加えた。０℃で２時間、２０℃で１２時間攪 拌後、反応混合物を、酢酸ブチルと共に同時蒸発させることによって蒸発乾燥し 、追加の酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加えた。この溶液を、０.７Ｍ ＨＣｌ（１ ｘ３０ｍＬ）、５％ＮａＨＣＯ₃、およびＨ₂Ｏ（２ｘ５０ｍＬ）で抽出した。有 機層をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、回転蒸発器で濃縮した。エーテル２０ｍＬで洗浄 し、濾過して、化合物１１（６.９１ｇ、８９％）を得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃,２００ＭＨｚ,ppm）７.９１（ｍ,４Ｈ）、７.５２（ｍ ,５Ｈ）、４.４８（ｔ,２Ｈ）、４.３４（ｓ,２Ｈ）、３.２０（ｔ,２Ｈ）、３. ０８（ｍ,２Ｈ）、２.３５（ｔ,２Ｈ）、１.６４−１.２（ｍ,７Ｈ）、１.４１ （ｓ,９Ｈ）。１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル １−メチル−４−（ｔ−ブチルオキ シ）カルボキシアミド−ピロール−２−カルボキシレート。 Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１.１ｇ、５.３mmol）を、１−メ チル−４−［ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド］ピロール−２−カルボン酸⁴ （１.２ｇ、５.２mmol）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０.６３ｇ 、４.７mmol）の溶液に加えた。１時間攪拌後、混合物を焼結ガラスフィルター で濾過して、沈降Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミドを分離した。濾液を 蒸発乾燥し、ＣＨＣｌ₃およびペンタン（１：１）の混合物に溶解し、シリカゲ ルカラムに装填した。純生成物を含有する画分を集め、蒸発乾燥して、所望生成 物１.４５ｇ（８０％）を白色固形物として得た。 ｍ.ｐ.＝１３８℃〜１３８.５℃。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃,２００ＭＨｚ）８.０４（ｄ,１Ｈ）、７.４９−７.４ ０（ｍ,４Ｈ）、７.０９（ｄ,１Ｈ）、３.８７（ｓ,３Ｈ）、１.５０(ｓ,９Ｈ) 。２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エチル ５−［１−メチル−４−（ ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ペン チルカルボキシレート （１２）。 トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を、０℃で、１１（０.７３ｇ、１.５mmol）に加 えた。０℃で２０分間攪拌後、反応混合物を、ＣＨＣｌ₃と共に同時蒸発させる ことによって蒸発乾燥した。残留物を、乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（１５ｍＬ）中に溶解し 、１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル １−メチル−４−（ｔ−ブチルオ キシ）カルボキシアミド−ピロール−２−カルボキシレート（０.５９ｇ、１.６ ５mmol）、乾燥トリエチルアミン（０.２３ｇ、２.３mmol）を加えた。周囲温度 で１５分間攪拌後、ＣＨＣｌ₃を加えた（１００ｍＬ）。反応混合物を、５％Ｎ ａＨＣＯ₃（２ｘ２０ｍＬ）、Ｈ₂Ｏ（２ｘ２０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ₂ ＳＯ₄上で乾燥し、回転蒸発器で濃縮した。ＣＨＣｌ₃を用いてシリカゲル（１ ００ｇ）でクロマトグラフィーにかけて、０.８８ｇ（９１.８％）の１２を得た 。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃,２００ＭＨｚ,ppm）７.８８（ｍ,４Ｈ）、７.４６（ｍ ,５Ｈ）、６.７４（ｓ,１Ｈ）、６.３８（ｓ,１Ｈ）、６.２６（ｓ,１Ｈ），５. ８７（ｔ,１Ｈ）、４.１８（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、３.８２（ｓ,３Ｈ）、３. ７９（ｓ,２Ｈ）、３.３（ｍ,２Ｈ）、２.６３（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、２.３ ０（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、１.６４−１.２（ｍ,６Ｈ）、１.４６（ｓ,９Ｈ） 。２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エチル ５−［１−メチル−４−（ １−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミドピロール−２−カルボ キシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ペンチルカルボキシレート （１ ３）。 乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（８ｍＬ）中の１２（２.４３ｇ、４mmol）の溶液を、トリフ ルオロ酢酸（４ｍＬ）で０℃で処理した。得られる溶液を、栓をしたフラスコ中 、周囲温度で１時間置き、次に３０％水性Ｋ₂ＣＯ₃（３０ｍＬ）とＣＨ₂Ｃｌ₂（ ３０ｍＬ）との間に分配した。下部層を集めた。水性相を、ジクロロメタン（２ ｘ２０ｍＬ）で抽出し、集めた有機抽出物を、Ｈ₂Ｏ（１ｘ２０ｍＬ）で洗浄し た後に、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、蒸発させた。残留物を、ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍＬ ）中に溶解し、１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル １−メチル−４−（ ｔ −ブチルオキシ）カルボキシアミドピロール−２−カルボキシレート（１.４３ ｇ、４mmol）、乾燥トリエチルアミン（０.８ｇ、８mmol）を加えた。周囲温度 で３０分間攪拌した後、ＣＨＣｌ₃（１００ｍＬ）を加えた。反応混合物を５％ ＮａＨＣＯ₃（２ｘ２０ｍＬ）、Ｈ₂Ｏ（２ｘ２０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮ ａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、回転蒸発器で濃縮した。ＣＨＣｌ₃を用いてシリカゲル（ １００ｇ）でクロマトグラフィーにかけて、１.９５ｇ（６６.８％）の１３を得 た。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃,２００ＭＨｚ,ppm）７.８７（ｍ,４Ｈ）、７.４６（ｍ ,５Ｈ）、７.０４（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.５Ｈｚ）、６.７７（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、６. ５２（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、６.５０（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.５Ｈｚ）、６.３１（ｂｒ ｓ ,１Ｈ）、５.９５（ｔ,１Ｈ）、４.１９（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、３.８５（ｓ, ６Ｈ）、３.７８（ｓ,２Ｈ）、３.３２（ｍ,２Ｈ）、２.６４（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６ Ｈｚ）、２.３１（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、１.６４−１.２（ｍ,６Ｈ）、１.４ ８（ｓ,９Ｈ）。２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エチル ５−［１−メチル−４−（ １−メチル−４−［１−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミドピ ロール−２−カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ピロール− ２−カルボキシアミド］ペンチルカルボキシレート （１４）。 乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（６ｍＬ）中の１３（１.９０ｇ、２.６mmol）の溶液を、トリ フルオロ酢酸（３ｍＬ）で０℃で処理した。得られる溶液を、栓をしたフラスコ 中、周囲温度で１時間置き、次に３０％水性Ｋ₂ＣＯ₃（３０ｍＬ）とＣＨ₂Ｃｌ₂ （３０ｍＬ）との間に分配した。下部層を集めた。水性相を、ジクロロメタン（ ２ｘ２０ｍＬ）で抽出し、集めた有機抽出物を、Ｈ₂Ｏ（１ｘ２０ｍＬ）で洗浄 した後に、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、蒸発させた。残留物を、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２.５ ｍＬ）中に溶解し、１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル １−メチル−４ −（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミドピロール−２−カルボキシレート（１ .４ｇ、３.９mmol）、乾燥トリエチルアミン（０.８ｇ、８mmol）を加えた。周 囲温度で１時間攪拌した後、ＣＨＣｌ₃（１００ｍＬ）を加えた。反応混合物を ５％ＮａＨＣＯ₃（２ｘ２０ｍＬ）、Ｈ₂Ｏ（２ｘ２０ｍＬ）で抽出した。有機層 を Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、回転蒸発器で濃縮した。ＣＨＣｌ₃中の０％〜１．５％ メタノールを用いてシリカゲル（１００ｇ）でクロマトグラフィーにかけて、１ .５６ｇ（７０.５％）の１４を得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃,２００ＭＨｚ,ppm）７.８７（ｍ,４Ｈ）、７.６８（ｂ ｒ ｓ,１Ｈ）、７.６０（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、７.４６（ｍ,５Ｈ）、７.０８（ｂｒ ｓ,２Ｈ）、６.７８（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、６.５６（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.５Ｈｚ）、 ６.６０（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、６.５５（ｄ,１Ｈ,Ｊ＝１.５Ｈｚ）、６.０３（ｔ, １Ｈ）、４.１８（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、３.８６（ｍ,９Ｈ）、３.７８（ｓ, ２Ｈ）、３.３２（ｍ,２Ｈ）、２.６３（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、２.３０（ｔ, ２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、１.６４−１.２（ｍ,６Ｈ）、１.４８（ｓ,９Ｈ）。２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エチル−５−［１−メチル−４−［ １−メチル−４−[１−メチル−４−［１−メチル−４−（ｔ−ブチルオキシ） カルボキシアミドピロール−２−カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシ アミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド] ペンチルカルボキシレート （１５）。 乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（５ｍＬ）中の１４（０.３２ｇ、０.３２mmol）の溶液を、ト リフルオロ酢酸（２.５ｍＬ）で０℃で処理した。得られる溶液を、栓をしたフ ラスコ中、周囲温度で１時間置き、次に３０％水性Ｋ₂ＣＯ₃（３０ｍＬ）とＣＨ₂ Ｃｌ₂（３０ｍＬ）との間に分配した。下部層を集めた。水性相を、ジクロロメ タン（２ｘ２０ｍＬ）で抽出し、集めた有機抽出物を、Ｈ₂Ｏ（１ｘ２０ｍＬ） で洗浄した後に、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、蒸発させた。残留物を、ＣＨ₂Ｃｌ₂（ １ｍＬ）中に溶解し、１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル １−メチル− ４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミドピロール−２−カルボキシレート（ ０.１１ｇ、０.３２mmol）、乾燥トリエチルアミン（０.０６ｇ、０.０３mmol） を加えた。周囲温度で１.５時間攪拌した後、ＣＨＣｌ₃（１００ｍＬ）を加えた 。この懸濁液を濾過し、濾液を５％ＮａＨＣＯ₃（２ｘ２０ｍＬ）、Ｈ₂Ｏ（２ｘ ２０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、蒸発乾燥した。１５の 収量は０.２５ｇ（８０％）であった。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃,２００ＭＨｚ,ppm）８.１７（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、７.９ ８（ｂｒ ｓ,）、７.９６（ｂｒ ｓ,）、１Ｈ ７.８５（ｍ,４Ｈ）、７.４４（ ｍ,５Ｈ）、７.０９（ｂｒ ｓ,２Ｈ）、７.０２（ｓ,１Ｈ）、６.７８（ｂｒ ｓ ,１Ｈ）、６.７４（ｂｒ ｓ,１Ｈ）、６.６６（ｓ,１Ｈ）、６.５８（ｓ,３Ｈ） 、６.２９（ｔ,１Ｈ）、４.１８（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝６Ｈｚ）、３.７８（ｍ,１４Ｈ ）、３.２８（ｍ,２Ｈ）、２.６０（ｔ,２Ｈ,Ｊ＝Ｈｚ）、２.２６（ｔ,２Ｈ,Ｊ ＝６Ｈｚ）、１.６４−１.２（ｍ,６Ｈ）、１.４８（ｓ,９Ｈ）。２−［４−（フェニルアゾ）ベンジルチオ］エチル ５−［１−メチル−４−[ １−メチル−４−［１−メチル−４−［１−メチル−４−［１−メチル−４−（ ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミドピロール−２−カルボキシアミド］ピロー ル−２−カルボキシアミド］ピロール−２−カルボキシアミド］ピロール−２− カルボキシアミド]ピロール−２−カルボキシアミド］ペンチルカルボキシレー ト （１６）。 乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍＬ）中の１５（０.６５ｇ、０.６７mmol）の溶液を、 トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）で０℃で処理した。得られる黄色がかった溶液を、 栓をしたフラスコ中、周囲温度で１時間置き、次に３０％水性Ｋ₂ＣＯ₃（３０ｍ Ｌ）とＣＨ₂Ｃｌ₂（３０ｍＬ）との間に分配した。下部層を集めた。水性相を、 ジクロロメタン（２ｘ２０ｍＬ）で抽出し、集めた有機抽出物を、Ｈ₂Ｏ（１ｘ ２０ｍＬ）で洗浄した後に、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、蒸発させた。残留物をＤＭ Ｆ（１ｍＬ）中に溶解し、１,２,３−ベンゾトリアゾール−１−イル １−メチ ル−４−（ｔ−ブチルオキシ）カルボキシアミドピロール−２−カルボキシレー ト（０.２４ｇ、０.６７mmol）、乾燥トリエチルアミン（０.１３ｇ、０.６７mm ol）を加えた。周囲温度で３時間攪拌した後、反応混合物を酢酸ブチルと共に同 時蒸発して蒸発乾燥した。残留物を、ＣＨＣｌ₃中の２.５％ＤＭＦ３ｍＬに溶解 した。ＣＨＣｌ₃（２.５％ＤＭＦ）中０％〜２.５％メタノールを用いてシリカ ゲル（１００ｇ）でクロマトグラフィーにかけて、０.６７ｇ（４５％）の１６ を得た。２,３,５,６−テトラフルオロフェニル−４'−［ビス（２−クロロエチル）アミ ノ］フェニルブチレート （Chlorambucil ２,３,５,６−テトラフルオロフェニ ルエステル）。 乾燥ジクロロメタン５ｍＬ中の、chlorambucil（Fluka A.G.によって供給）０ .２５ｇ（０.８２mmol）、２,３,５,６−テトラフルオロフェニルトリフルオロ アセテート０.３ｇ（１.１mmol）の溶液に、乾燥トリエチルアミン０.２ｍＬを 加えた。混合物をアルゴン下、室温で０.５時間攪拌し、蒸発させた。残留油を 、溶離剤としてヘキサン/クロロホルム（２：１）を用いてシリカゲルでカラム クロマトグラフィーにかけて精製し、エステルを油状物として得た（０.２８ｇ （７５％））。 シリカゲル上のＴＬＣ（ＣＨＣｌ₃）Ｒ_f ０.６；ＩＲ（ＣＨＣｌ₃中）３０１０ 、１７８０、１６１３、１５２１、１４８５ｃｍ^-1。オリゴヌクレオチドの第一アミノ基への、chlorambucil残基の導入 オリゴヌクレオチドのセチルトリメチルアンモニウム塩の製造： 一般にトリエチルアンモニウム塩のオリゴヌクレオチド（５０μｇ〜５００μ ｇ）の水溶液１００μＬを、セチルトリメチルアンモニウム形態のDowex 50wx8 を装填され、水中の５０％のアルコールで予備洗浄されたカラムに注入した。カ ラムを５０％水性エタノールで溶離した（０.１ｍＬ/分）。オリゴヌクレオチド を含有する画分を、Speedvacで２時間かけて乾燥し、続く反応に使用した。 オリゴヌクレオチドのセチルトリメチルアンモニウム塩（５０μｇ〜１００μ ｇ）のエタノール溶液（５０μＬ）を、アセトニトリル（５０μＬ）およびジイ ソプロピルエチルアミン（３μＬ）中の、２,３,５,６−テトラフルオロフェニ ル−４'−［ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルブチレート（chlorambu cilのテトラフルオロフェニルエステル）の０.０８Ｍ溶液と混合した。室温で３ 時間攪拌した後、アセトン中２％ＬｉＣｌＯ₄（１.５ｍＬ）を用いて、生成物を 沈殿させた。生成物をアセトン中２％ＬｉＣｌＯ₄を用いて、水（６０μＬ）か ら３回再度沈殿させた。最終的に、オリゴヌクレオチドのchlorambucil誘導体を 、逆相クロマトグラフィーにかけて約５０％〜８０％の収率で精製した。生成物 を含有する画分を概ねブタノールによって濃縮した。分離したオリゴ ヌクレオチドのchlorambucil誘導体を、ＬｉＣｌＯ₄のアセトン溶液中で沈殿さ せ、アセトンで洗浄し、油ポンプの真空下に乾燥した。集めたクラマトグラフィ ー画分以降は、生成物を氷冷溶液に入れて、反応性オリゴヌクレオチドの全ての 操作を可能な限り素早く行った。オリゴヌクレオチド合成 全てのオリゴヌクレオチドは、製造業者から供給されるプロトコールを用いて 、ABM 394上の適切なＣＰＧサポート１μmolから製造した。−シアノエチルホス ホロアミダイト結合化学の標準試薬は、Glen Researchから購入した。５'−アミ ノヘキシル改質は、Ｎ−ＭＭＴ−ヘキサノールアミンホスホロアミダイトリンカ ー（Glen Research）を用いて導入した。３'−アミノヘキシル改質は、C.R.Petr ie,M.W.Reed,A.D.Adams,およびR.B.Meyer,Jr.Bioconjugate Chemistry,1992,3,8 5-87に記載のように製造されるＣＰＧを用いて導入した。複合体の製造 （反応式３） ４０μＬの乾燥ＤＭＳＯ中の、アミノヘキシル改質オリゴヌクレオチドのセチ ルトリメチルアンモニウム塩（３０nmol〜５０nmol、Jost,J.-P.,Jiricny,J.,お よびSaluz,H.(1989)Quantitative precipitation of short oligonuclrotides w ith low concentrations of cetyltrimethylammonium bromide.Nuceic Acids Re s.17,2143）およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン１.５μＬの溶液を、Ｔ ＦＰエステル（１ａ、１ｂ、２ｅ、２ｆ、または３ｃ）の４ｍＭ溶液４０μＬに 加えた。反応混合物を室温で１２時間置いた。オリゴヌクレオチド関連物質が、 アセトン中２％ＬｉＣｌＯ₄（１.５ｍＬ）を加えることによって、沈殿した。ペ レットをアセトンで洗浄し、真空乾燥した。ペレットをＨ₂Ｏ中５０％ＤＭＦ（ ６０μＬ）中に再度溶解し、アセトン中ＬｉＣｌＯ₄の２％溶液を用いて、前記 と同様に再度沈殿させた。この手順を２回繰り返した。残留物を、５０ｍＭ Ｌ ｉＣｌＯ₄の存在下の２０％〜７５％のアセトニトリルの勾配を用いてＨＰＬＣ （４.６ｘ２５０ｍｍ、Ｃ−１８、Dynamax-300A、Rainin）にかけて精製した。 純生成物を含有する画分を、Speedvacを用いて真空乾燥した。残留物を、６０μ Ｌ〜８０μＬのＨ₂Ｏ中に溶解し、アセトン中２％ＬｉＣｌＯ₄（１.５ｍＬ）を 用い て沈殿させた。アセトン（２ｘ１.５ｍＬ）での洗浄および真空乾燥の後、ペレ ットを１００μＬのＨ₂Ｏに溶解した。最終生成物の収率は２０％〜５０％であ った。 ４−アミノ−Ｎ−メチルピロール−２−カルボン酸残基を担持するオリゴヌク レオチド複合体の製造に、Godovikovaらの改良法(T.S.Godovikova,V.F.Zarytova ,T.V.Maltzeva,L.M.Khalimskaya.Bioorgan.Khim.,1989,15,1246-1259)を用いた 。１００μＬの乾燥ＤＭＦ中の、３'−ホスフェート含有オリゴヌクレオチドの セチルトリメチルアンモニウム塩（５０nmol〜１００nmol）、トリフェニルホス ピン（１０ｍｇ）、２,２'−ジピリジルジスルフィド（１０ｍｇ）、Ｎ,Ｎ−ジ メチルアミノピリジン（１０ｍｇ）、および化合物１１〜１６から選択される類 似体のうちの１つの溶液を、室温で２０分間培養した。アセトン中２％ＬｉＣｌ Ｏ₄（１.５ｍＬ）を加えることによって、オリゴヌクレオチド関連物質を沈殿さ せた。ペレットをアセトンで洗浄し、真空乾燥した。残留物を、５０ｍＭ Ｌｉ ＣｌＯ₄の存在下の２０％〜７５％のアセトニトリルの勾配を用いてＨＰＬＣに よって精製した。純生成物を含有する画分を、Speedvacを用いて真空乾燥した。 残留物を６０μＬ〜８０μＬのＨ₂Ｏに溶解し、アセトン中２％ＬｉＣｌＯ₄（１ .５ｍＬ）で沈殿させた。アセトン（２ｘ１.５ｍＬ）での洗浄および真空乾燥の 後に、ペレットを１００μＬのＨ₂Ｏに溶解した。最終生成物の収率は、３０％ 〜５０％であった。複合体の製造 （反応式４） １μmol規模での合成において得られたＣＰＧ含有５'−アミノヘキシル誘導オ リゴヌクレオチドを、ＣＨ₂Ｃｌ₂中の２％ジクロロ酢酸で処理して、アミノ基か ら９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基を除去し、続いて、 アセトニトリルで洗浄し、アルゴンでのフラッシングよって乾燥した。ＣＰＧを １.５ｍＬプラスチック管に移し、無水ＤＭＳＯ中のＴＦＰエステルの５０ｍＭ 溶液１００μＬを加えた。プラスチック管を２４時間シェークし、次に３ｘ１. ５ｍＬ ＤＭＳＯ、２ｘ１.５ｍＬ アセトンで洗浄し、真空乾燥した。ＣＰＧを 、濃アンモニアで処理して、標準条件を用いてオリゴヌクレオチドを脱保護した 。 得られる反応混合物を、前記と同様に逆相ＨＰＬＣによって分離した。典型的な 収率は約５０％であった。熱変性試験 ４−アミノ−Ｎ−メチルピロール−２−カルボン酸残基を担持するオリゴヌク レオチド複合体の光学溶融曲線を、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰ ０₄、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７.０）において、この目的のために特別にデザ インされた温度調節セル中のMilichrom液体クロマトグラフのＵＶ検出器で得た 。データを集め、S.G.Lokhovらによって記載のように（S.G.Lokhov,M.A.Podymin ogin,D.S.Sergeev,V.N.Slnikov,I.V.Kutyavin,G.V.Shishkin,V.F.Zarytova.Bioc onjugate Chem.1992,3,414）、パソコンで処理した。 １,２−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［３,２−ｅ］インドール−７−カルボン酸（ ＣＤＰＩ）残基を担持するオリゴヌクレオチド複合体を、１４０ｍＭ ＫＣｌ、 １０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＨＣｌ（ｐＨ７.２）において、Ｐ ＴＰ−６自動マルチセル温度プログラマーを有するLambda 2（Perkin Elmer）分 光光度計上で、溶融させた。複合体の溶融温度（Ｔ_m）を、最大誘導体（derivat ive maxima）から求めた。プライマー延長反応 プライマー延長反応を、LeeらによってBiochemistry（1994）33:6024-6030に 以前に記載されているように行った。鋳型、プライマー、および封鎖ＯＤＮの最 終濃度は、それぞれ、５ｘ１０^-10Ｍ、４ｘ１０^-8Ｍおよび１０^-9Ｍであった。 プライマー延長を、４５℃で１５分間で行い、前記文献に記載のように、変性ゲ ル電気泳動によって、生成物を分析した。 封鎖ＯＤＮの不存在下においては、プライマー延長反応が、配列ゲル中で未分 解バンドとして移動する高分子量生成物を発生させた。休止部位（pause sites ）または自発的終止事象（spontaneous termination events）に対応する弱いバ ンドは、全ての反応混合物中において再現的に観察された。標的に対して充分に 相補的な、未改質の１６−マーおよび３２−マーＯＤＮは、プライマー延長を封 鎖できなかった。また、それぞれＣＤＰＩ₃基に３'−結合された相補的８−マー お よび１６−マーＯＤＮも活性がなかった。５'−結合ＣＤＰＩ₃を有する充分に相 補的な１６−マーＯＤＮだけが、プライマー延長をＴ７ ＤＮＡポリメラーゼに よって抑止した。同様の５'改質を有する相補的８−マーＯＤＮは、極微量の封 鎖生成物を発生させたたけであった。対照標準ＯＤＮは、プライマー延長の阻止 に、相補的ＯＤＮおよび共有結合ＭＧＢの両方が必要であることを確認した。そ れぞれ５'−結合ＣＤＰＩ₃ペプチドを有する２つの単一不適正１６−マーＯＤＮ は、完全に適正のＯＤＮ−ＭＧＢ複合体よりもかなり低い程度に抑止的であった 。当モル量の遊離ＣＤＰＩ₃と一緒に未改質１６−マーＯＤＮを加えても、プラ イマー延長に何の効果もなく、このことはＭＧＢとＯＤＮの結合の重要性を強調 するものである。５'アクリジン成分が、ＭＧＢの代わりに、充分に相補的な１ ６−マーＯＤＮに結合したとき、抑止活性の損失が見られた。細胞培養架橋実験 ＯＤＮ−ＭＧＢ複合体は、ＤＱβ１対立遺伝子の鋳型鎖のヌクレオチド８１５ −８６４に相補的であった（Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:7313-7317）。こ の実験で用いられたヒトBSM B−細胞は、この対立遺伝子にホモ接合であり、そ れを構造的に発現する。ＯＤＮを加える前に、ＢＳＭ細胞を、２５ｍＬフラスコ 中で、培地１ｍＬにつき細胞４.５ｘ１０⁶個の密度に成長させた。各処理のため に、培養基の２ｍＬアリコートからの細胞を、ペレット化にし、０、１、１０、 または５０μＭの５０−マーchlorambucil結合ＯＤＮ（３'結合ＣＤＰＩ₃基を有 するか有さないかのいずれか）を含有する無血清培地２００μＬに懸濁させた。 各サンプルを、４８穴のマイクロタイタープレート中で、５％ＣＯ₂で、３７℃ で３.５時間で培養した。次に細胞をEppendorf０.５ｍＬ遠心分離管に移し、２ ０００rpmで５分間でペレット化し、５００μＬ燐酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で２回 洗浄し、プロテイナーゼK/SDSを用いて３７℃で一夜、除タンパク質化した。フ ェノール/クロロホルム抽出、およびRnase A消化の後に、ＤＮＡを１Ｍピロリジ ンを用いて９０℃で３０分間で処理した。ピロリジンをエタノール沈殿によって 除去し、連結反応媒介ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（ligation-mediated poly meraze chain reaction（PCR））を、Leeら（Biochemistry(1994)33:6024-6 030）によって記載されているように行った。増幅されたＤＮＡを配列ゲルで分 析し、chlorombucil含有ＯＤＮによる標的のアルキル化から生じたと考えられる 配列特異的ニックを視覚化した。結果は、ＯＤＮ上のクロスリンカーに近接する 標的上のヌクレオチドにおいて開裂を示し、ＣＤＰＩ₃含有５０−マーが、配列 中に0302対立遺伝子を特異的にアルキル化するＭＧＢを持たない同一のＯＤＮよ りも１０倍有効であることを示した。 完全培地は下記の成分から調製された（HI-FCSが不足している無血清培地）： Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）を含む５００ｍＬのRPMI 1640（Gibco BRL Cat.No. 11875-036）。 ５０ｍＬのHI-FCS(Gibco BRL Cat.No.26140,５５℃で３０分間の熱不活性化) 。 ５ｍＬの100X Penn/Strep（Gibco BRL Cat.No.15070-022）。 ５ｍＬの２００ｍＭ Ｌ-グルタミン（Gibco BRL Cat.No.25030-024）。 ５ｍＬの100X ピルビン酸ナトリウム（１１ｍｇ/ｍＬ；Gibco BRL Cat.No.118 40-030から製造）。 ５ｍＬの１Ｍ HEPES、ｐＨ７.３（Gibco BRL Cat.No.15630-023）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ， ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ルクタノフ，ユージェニー・エイ アメリカ合衆国98012ワシントン州 ボゼ ル、ノース・ロード16520番 アパートメ ント・ナンバー・イー−206 (72)発明者 ガンパー，ハワード・ビー アメリカ合衆国98078ワシントン州 ウッ ディンビル、トゥハンドレッドトゥエルフ ス・ドライブ・ノース・イースト14048番 (72)発明者 メイヤー，リッチ・ビー・ジュニア アメリカ合衆国98011ワシントン州 ボゼ ル、シックスティファースト・アベニュ ー・ノース・イースト15533番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．複数のヌクレオチド単位、3'末端及び5'末端を持つオリゴヌクレオチドと 、小溝結合物質部分をそのオリゴヌクレオチドに15個以下の原子を介して共有結 合させる連結基によって該ヌクレオチドの少なくとも1つに結合した小溝結合物 質部分（ここに小溝結合物質部分とは、二本鎖DNA、RNA又はそれらのハイブリッ ドの小溝に約10³以上の会合定数で非挿入的に結合する分子量約150〜約2000ダル トンの分子のラジカルをいう）とを含むオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体 。 ２．連結基を含む小溝結合物質部分が次に挙げる(a)、(b)、(c)、(d)及び(e) 群からなる群より選択される式を持つ請求項1のオリゴヌクレオチド小溝結合物 質複合体： （Y₁は、2つの二重結合とN、S及びOからなる群より選択される0〜3個のヘテロ原 子とを持つ5員環を表し、NH基とCO基は、互いに1環原子によって隔てられた2つ の環炭素にそれぞれ結合しており、該2つの環炭素間に位置する環原子はHでのみ 置換されているか、非置換であり、残りの各環原子は1、2又は3個のR₃基で置換 されていてもよい。） （Y₂は、1つの二重結合を持つ5員環と縮合した6員芳香環からなる環系であって 、その縮合環系はN、S及びOからなる群より選択される0〜3個のヘテロ原子を持 つ。R₆N基とCO基のそれぞれは、その縮合環系の異なる環中にあって、かつ、1つ の共通する橋頭環原子からそれぞれ2番目の環原子である環炭素に結合しており 、その結果、CO基とNR₆基はその縮合環系の一方の側でそれら自身の間に2つの非 橋頭環原子を配し、その縮合環系の他方の側に3つの非橋頭環原子を配している 。また、その一方の側にある2つの非橋頭環原子はR₇基で置換されていてもよく 、その縮合環系の他方の側にある3つの非橋頭環原子はR₃基で置換されていても よい。） （Y₃は、0〜3個のNヘテロ原子を持つ6員芳香環であり、CO基とNH基のそれぞれは 、環炭素に結合している。また、該環炭素は互いに1,4位にあり、その6員環の2 つの側のどちらか一方にあってCO基又はNH基で占有されていない2つの環原子はR₃ 基で置換されいてもよく、その6員環の他方の側にあって占有されていない2つ の環原子はR₇基で置換されていてもよい。） （Y₄は、0〜3個のNヘテロ原子を持つ6員芳香環であり、CO基とNH基のそれぞれは 、環炭素に結合している。また、該環炭素は互いに1,4位にあり、その6員環の2 つの側のどちらか一方にあってCO基又はNH基で占有されていない2つの環原子はR₃ 基で置換されていてもよく、その6員環の他方の側にあって占有されていない2 つの環原子はR₇基で置換されていてもよい。） （Y₅は、1つの二重結合を持つ5員環と縮合した6員芳香族環からなる環系であっ て、その縮合環系はN、S及びOからなる群より選択される0〜3個のヘテロ原子を 持つ。R₁基とR₂基のそれぞれは、その縮合環系の異なる環中にあって、かつ、1 つの共通する橋頭環原子からそれぞれ2番目の環原子である環炭素に結合してお り、その結果、R₁基とR₂基はその縮合環系の一方の側でそれら自身の間に2つの 非橋頭環原子を配し、その縮合環系の他方の側に3つの非橋頭環原子を配してい る。また、その一方の側にある2つの非橋頭環原子はR₇基で置換されていてもよ く、その縮合環系の他方の側にある3つの非橋頭環原子はR₃基で置換されていて もよい。） ここに、R₁とR₂は独立して、H、F、Cl、Br、I、NH₂、NHR₄、N(R₄)₂、N(R₄)₃ ⁺ 、OH、OR₄、SH、SR₄、COR₄、CONHR₄、CON(R₄)₂、R₄、H₂N(CH₂)_mCO、CONH₂、CONH R₄及びH₂N(CH₂)_mCOO(CH₂)_mS(CH₂)_mC₆H₄NNC₆H₄、O(CH₂)_mCO、 O(CH₂)_mCH(OH)(CH₂)_mNHCO(CH₂)_mNH、-O-、-S-、-HN(CH₂)_mCO、-CONH-、-CONR₄、 -HN(CH₂)_mCOO(CH₂)_mS(CH₂)_mC₆H₄NNC₆H₄、及び-(CH₂)_mCH(OH)(CH₂)_mNHCO(CH₂)_mNH -であるか、若しくはR₁基とR₂基の一方が存在しない； R₃は、F、Cl、Br、I、NH₂、NHR₄、N(R₄)₂、N(R₄)₃ ⁺、OH、OR₄、SH、SR₄、COR₄ 、CONHR₄、CON(R₄)₂及びR₄からなる群より選択されるか、若しくはR₃基は、1、2 又は3個のR₄で置換された、Y₁環に縮合した3、4、5又は6員環を形成してもよい ； R₄は、1〜20個の炭素を持つアルキル又はシクロアルキル基、1〜20個の炭素と 1〜3個の二重結合を持つアルケニル又はシクロアルケニル基、炭素25個以下の炭 素環式芳香族基、炭素25個以下の複素環式芳香族基、炭素25個以下の炭素環式又 は複素環式アリールアルキル基であり、R₄は1、2又は3個のF、Cl、Br、I、NH₂、 NHR₅、N(R₅)₂、N(R₅)₃ ⁺、OH、OR₅、SH、SR₅、COR₅、CONHR₅、CON(R₅)₂又はR₅基 で置換されていてもよい； R₅は、1〜6炭素のアルキルである； R₆はH、1〜5炭素のアルキルであるか、又はR₆とR₇が一体となって、4、5又は6 員環を形成する。この場合、-O-、-S-、-NH-、-NCH₃-又はN-低級アルキル基が該 環の一部であってもよい； R₇は、F、メチル又はエチル；-CH₂-又は-CH₂-CH₂-である； mは、1から10までの整数である； nは、1から10までの整数である； pは、1から5までの整数である。 ３．連結基を含む小溝結合部分が式（a）によって表される請求項2のオリゴヌ クレオチド小溝結合物質複合体。 ４．連結基を含む小溝結合部分が式（b）によって表される請求項2のオリゴヌ クレオチド小溝結合物質複合体。 ５．連結基を含む小溝結合部分が式（c）によって表される請求項2のオリゴヌ クレオチド小溝結合物質複合体。 ６．連結基を含む小溝結合部分が式（d）によって表される請求項2のオリゴヌ クレオチド小溝結合物質複合体。 ７．連結基を含む小溝結合部分が式（e）によって表される請求項2のオリゴヌ クレオチド小溝結合物質複合体。 ８．小溝結合部分がオリゴヌクレオチドの5'末端に結合している請求項1のオ リゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 ９．小溝結合部分がオリゴヌクレオチドの3'末端に結合している請求項1のオ リゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 10．小溝結合物質部分が、オリゴヌクレオチドの3'末端でも5'末端でもないヌ クレオチド単位に結合している請求項1のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合 体。 11．小溝結合物質部分がヌクレオチド単位の複素環式塩基部分に結合している 請求項1のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 12，小溝結合物質部分がヌクレオチド単位の複素環式塩基部分に結合している 請求項10のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 13．連結基を含む小溝結合部分が式： （nは2から5までを表す） を持つ請求項2のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 14．小溝結合部分がオリゴヌクレオチドの3'末端に結合している請求項13のオ リゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 15．連結基を含む小溝結合部分が式： （n＝2〜5） を持つ請求項2のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 16．連結基を含む小溝結合部分が式： （n＝2〜5） を持つ請求項2のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 17．小溝結合部分がオリゴヌクレオチドの3'末端に結合している請求項16のオ リゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 18．小溝結合部分が式（a）で表され、その5員環が次の構造を持つ請求項2の オリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 19．小溝結合部分が式（a）で表され、その5員環が次の構造を持つ請求項2の オリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 20．小溝結合部分が式（b）で表され、その縮合環系が次の構造を持つ請求項2 のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 21．さらに、該ヌクレオチド単位の少なくとも1つに共有結合した架橋官能基 を含む請求項1のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 22．複数のヌクレオチド単位、3'末端及び5'末端を持つオリゴヌクレオチドと 、小溝結合物質部分をそのオリゴヌクレオチドに15個以下の原子を介して共有結 合させる連結基によって該ヌクレオチドの少なくとも1つに結合した小溝結合物 質部分とを含むオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体であって、次の式を持つ 複合体： ［式中、 xはO又はSである。 qは3から100までの整数である。 R₈はH、OH、1〜6個の炭素を持つアルコキシ、O-C₂-C₆アルケニル又はFである 。 Bは、自然界で核酸中に認められる複素環式塩基、ヒポキサンチン、2-アミノ アデニン、2-チオウラシル、2-チオチミン、5-N⁴-エテノシトシン、4-アミノピ ラゾロ[3,4-d]ピリミジン、6-アミノ-4-ヒドロキシ-[3,4-d]ピリミジンからなる 群より選択されるアグリコンである。 W₁はH、PO(OH)₂又はその塩、又は該オリゴヌクレオチドの3'又は5'末端に結合 した小溝結合物質部分（その小溝結合物質部分をオリゴヌクレオチドに15個以下 の原子を介して共有結合させる連結基を含む）である。 W₂は存在しないか、アグリコンBの1つに結合した小溝結合物質部分（その小溝 結合物質部分を該アグリコンに共有結合させる連結基を含む）であるか、若しく はW₂は、架橋官能基を該アグリコンに共有結合させるリンカーアームを含む架橋 官能基である。 ここに、小溝結合物質部分とは、二本鎖DNA、RNA又はそれらのハイブリッドの 小溝に約10³以上の会合定数で非挿入的に結合する分子量約150〜約2000ダルトン の分子のラジカルをいい、該W₁基とW₂基の少なくとも一つは小溝結合物質部分で あるものとする。］。 23．連結基を含む小溝結合物質部分が次に挙げる(a)、(b)、(c)、(d)及び(e) 群からなる群より選択される式を持つ請求項21のオリゴヌクレオチド小溝結合物 質複合体： （Y₁は、2つの二重結合とN、S及びOからなる群より選択される0〜3個のヘテロ原 子とを持つ5員環を表し、NH基とCO基は、互いに1環原子によって隔てられた2つ の環炭素にそれぞれ結合しており、該2つの環炭素間に位置する環原子はHでのみ 置換されているか、非置換であり、残りの各環原子は1、2又は3個のR₃基で置換 されていてもよい。） （Y₂は、1つの二重結合を持つ5員環と縮合した6員芳香環からなる環系であって 、その縮合環系はN、S及びOからなる群より選択される0〜3個のヘテロ原子を持 つ。R₆N基とCO基のそれぞれは、その縮合環系の異なる環中にあって、かつ、1つ の共通する橋頭環原子からそれぞれ2番目の環原子である環炭素に結合しており 、その結果、CO基とNR₆基はその縮合環系の一方の側でそれら自身の間に2つの非 橋頭環原子を配し、その縮合環系の他方の側に3つの非橋頭環原子を配している 。また、その一方の側にある2つの非橋頭環原子はR₇基で置換されていてもよく 、その縮合環系の他方の側にある3つの非橋頭環原子はR₃基で置換されていても よい。） （Y₃は、0〜3個のNヘテロ原子を持つ6員芳香環であり、CO基とNH基のそれぞれは 、環炭素に結合している。また、該環炭素は互いに1,4位にあり、その6員環の2 つの側のどちらか一方にあってCO基又はNH基で占有されていない2つの環原子はR₃ 基で置換されいてもよく、その6員環の他方の側にあって占有されていない2つ の環原子はR₇基で置換されていてもよい。） （Y₄は、0〜3個のNヘテロ原子を持つ6員芳香環であり、CO基とNH基のそれぞれは 、環炭素に結合している。また、該環炭素は互いに1,4位にあり、その6員環の2 つの側のどちらか一方にあってCO基又はNH基で占有されていない2つの環原子はR₃ 基で置換されていてもよく、その6員環の他方の側にあって占有されていない2 つの環原子はR₇基で置換されていてもよい。） （Y₅は、1つの二重結合を持つ5員環と縮合した6員芳香族環からなる環系であっ て、その縮合環系はN、S及びOからなる群より選択される0〜3個のヘテロ原子を 持つ。R₁基とR₂基のそれぞれは、その縮合環系の異なる環中にあって、かつ、1 つの共通する橋頭環原子からそれぞれ2番目の環原子である環炭素に結合してお り、その結果、R₁基とR₂基はその縮合環系の一方の側でそれら自身の間に2つの 非橋頭環原子を配し、その縮合環系の他方の側に3つの非橋頭環原子を配してい る。また、その一方の側にある2つの非橋頭環原子はR₇基で置換されていてもよ く、その縮合環系の他方の側にある3つの非橋頭環原子はR₃基で置換されていて もよい。） ここに、R₁とR₂は独立して、H、F、Cl、Br、I、NH₂、NHR₄、N(R₄)₂、N(R₄)₃ ⁺ 、OH、OR₄、SH、SR₄、COR₄、CONHR₄、CON(R₄)₂、R₄、H₂N(CH₂)_mCO、CONH₂、CONH R₄及びH₂N(CH₂)_mCOO(CH₂)_mS(CH₂)_mC₆H₄NNC₆H₄、-O-、-S-、-HN(CH₂)_mCO、-CONH- 、-CONR₄、-HN(CH₂)_mCOO(CH₂)_mS(CH₂)_mC₆H₄NNC₆H₄、及び-(CH₂)_mCH(OH)(CH₂)_mNH CO(CH₂)_mNH-であるか、若しくはR₁基とR₂基の一方が存在しない； R₃は、F、Cl、Br、I、NH₂、NHR₄、N(R₄)₂、N(R₄)₃ ⁺、OH、OR₄、SH、SR₄、COR₄ 、CONHR₄、CON(R₄)₂及びR₄からなる群より選択されるか、若しくはR₃基は、Y₁環 に縮合した3、4、5又は6員環を形成してもよい； R₄は、1〜20個の炭素を持つアルキル又はシクロアルキル基、1〜20個の炭素と 1〜3個の二重結合を持つアルケニル又はシクロアルケニル基、炭素25個以下の炭 素環式芳香族基、炭素25個以下の複素環式芳香族基、炭素25個以下の炭素環式又 は複素環式アリールアルキル基であり、R₄は1、2又は3個のF、Cl、Br、I、NH₂、 NHR₅、N(R₅)₂、N(R₅)₃ ⁺、OH、OR₅、SH、SR₅、COR₅、CONHR₅、CON(R₅)₂又はR₅基 で置換されていてもよい； R₅は、1〜6炭素のアルキルである； R₆はH、1〜5炭素のアルキルであるか、又はR₆とR₇が一体となって、4、5又は6 員環を形成する。この場合、-O-、-S-、-NH-、-NCH₃-又はN-低級アルキル基が該 環の一部であってもよい； R₇は、F、メチル又はエチル；-CH₂-又は-CH₂-CH₂-である； mは、1から10までの整数である； nは、1から10までの整数である； pは、1から5までの整数である。 24．W₁基の少なくとも1つが小溝結合物質部分と連結基であり、W₂が存在しな い請求項23のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 25．W₂が小溝結合物質部分と連結基である請求項23のオリゴヌクレオチド小溝 結合物質複合体。 26．連結基を含む小溝結合部分が式（a）で表され、その5員環が次の構造を持 つ請求項24のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 27．小溝結合部分が式（a）で表され、その5員環が次の構造を持つ請求項24の オリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。 28．小溝結合部分が式（b）で表され、その縮合環系が次の構造を持つ請求項2 4のオリゴヌクレオチド小溝結合物質複合体。