CN114672482B - 核酸探针制备方法 - Google Patents

核酸探针制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种核酸探针制备方法，所述制备方法中带有氨基活性基团的核酸固体与可与氨基基团反应的活化酯修饰染料固体两者混合研磨进行一步反应得到核酸探针，所述核酸固体和所述染料固体通过机械混合研磨直至成为胶状物，在此过程中不加入反应溶剂和其它反应试剂。本发明的核酸探针制备方法为无溶剂反应，不需要有毒有机溶剂的参与，更加的绿色无污染；生产过程大幅度简化，结合球磨机的使用，可以放大生产。

Description

核酸探针制备方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种核酸探针制备方法。
背景技术
单链DNA与RNA是由一定数量的脱氧核苷酸或者核苷酸组合而成。而对DNA或者RNA的结构进行一些改造，就形成了DNA修饰探针以及RNA修饰探针。DNA修饰探针与RNA修饰探针广泛应用在分子诊断QPCR（实时荧光定量）、STR（短串联重复序列）、以及FISH（荧光原位杂交技术）等领域。
一般地，有两种常见的方法可用于单链DNA与RNA的改造。一种为固相亚磷酰胺三酯法，另一种为液相氨基活化酯加成法。传统的液相氨基活化酯加成法是把含有氨基活性基团的DNA或RNA溶解在碱性的缓冲液中，然后加入3倍摩尔量的有机溶剂溶解的修饰染料活化酯，在常温反应4-12小时，然后加入酒精进行沉淀，同时用酒精对沉淀物进行反复洗涤，拿到沉淀固体，然后用水溶解，最后经高效液相色谱仪纯化得到纯的DNA修饰探针或RNA修饰探针。
液相氨基活化酯加成法，需要在DNA或者RNA上合成氨基结构（NH2），同时需要修饰染料为琥珀酰亚胺活化酯结构，见下反应式中化合物（1），这种活化酯结构，相比较亚磷酰胺结构，容易合成。
Figure 315774DEST_PATH_IMAGE001
液相氨基活化酯加成法的具体操作的方案如下：
（1）将20umol含有氨基结构的DNA/RNA溶解于20mlpH为8.5的0.5M Na2CO3/NaHCO3 缓冲液中，充分震荡混匀。
（2）用7.5mlDMF溶剂去溶解60umol琥珀酰亚胺活化酯修饰染料固体，并加入至上述缓冲液中，室温震荡混匀。
（3）将上述溶液放入摇床，室温震荡4-12小时。
（4）在上述溶液中加入72ml-20℃冷冻酒精沉淀，-20℃冷冻30分钟出现絮状，8000rpm高速离心，去除上清液，取沉淀。
（5）分别用72ml -20℃冷冻酒精清洗沉淀3遍，并将沉淀烘干，得DNA/RNA修饰探针粗品。
（6）用9ml超纯水将干燥后的DNA/RNA修饰探针粗品溶解，装载至高效液相色谱仪上纯化，拿到纯的产品。
液相氨基活化酯加成法具有以下不足：
（1）因为DNA/RNA都易溶于水，而修饰染料固体绝大多数都是不溶于水的，所以修饰染料固体都需要有机溶剂进行溶解。且为了反应体系偏向于均相反应，需要使用与水互溶性较高的有机溶剂，而这些有机溶剂都具有较高的毒性。
（2）因反应过程使用了有机溶剂以及缓冲盐，这些都必须在后续生产中提前去除，故在反应后处理中，会大量使用乙醇进行沉淀洗涤后处理。产生较多的有机溶剂浪费。
（3）修饰染料与DNA/RNA底物的比例约为3:1，但是因为反应为含水的反应，虽然琥珀酰亚胺活化酯修饰染料能优先与带有氨基结构的DNA/RNA反应，琥珀酰亚胺活化酯修饰染料也能与水较快发生副反应，液相氨基活化酯加成法的最终摩尔收率仍然不高，大多数都在20-30%之间，即以修饰染料利用率来看，仅为7-10%。材料成本仍然太高。
（4）因DNA/RNA的内部结构复杂包裹，当DNA含有50个以上脱氧核苷酸、RNA含有40个以上核苷酸时，其带有的氨基结构难以与琥珀酰亚胺活化酯修饰染料接触反应，液相氨基活化酯加成法收率极低。
固相亚磷酰胺三酯法的合成过程主要有脱保护、偶联、盖帽、氧化4个步骤。每完成4个步骤就连接上一个脱氧核苷酸或核苷酸，通过重复这4个步骤，就把一个个的脱氧核苷酸或核苷酸连接起来就形成了DNA或RNA。
利用固相亚磷酰胺三酯法也可以在合成DNA/RNA过程中，把修饰染料也合成到DNA或RNA的链上。
Figure 186647DEST_PATH_IMAGE002
固相亚磷酰胺三酯法
（1）固相亚磷酰胺三酯法为固液两相反应，所需要的修饰染料与DNA/RNA底物的比例为20:1以上，其摩尔收率约为30-40%，即以修饰染料利用率来看，仅为1.5-2%，材料成本浪费巨大。
（2）反应过程经过四步法化学合成，大量使用有机溶剂，并产生有害废液。
（3）利用固相亚磷酰胺三酯法合成修饰探针，需要修饰染料的活性化学结构为亚磷酰胺单体结构，见上反应式中化合物（8）。针对有些结构复杂的修饰探针（譬如CY5、ROX等），难于合成活性亚磷酰胺单体，或者受限于随后的工艺处理过程，限制了固相亚磷酰胺三酯法合成修饰探针的应用。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种新的核酸探针制备方法。在一种实施方式中，本发明提供一种核酸探针制备方法，所述述制备方法中带有氨基活性基团的核酸固体与可与氨基基团反应的活化酯修饰染料固体两者混合研磨进行一步反应直接得到核酸探针，所述核酸固体和所述修饰染料固体通过机械混合研磨直至成为胶状物，在此过程中不加入反应溶剂和其它反应试剂。
在一种实施方式中，所述核酸固体为无定型片状固体，所述修饰染料固体为晶体状固体。
在一种实施方式中，所述核酸为DNA或RNA，优选的所述核酸为碱基长度在46个碱基以上的DNA，或者核酸为碱基长度在37个碱基以上的RNA。
在一种实施方式中，所述方法还包括：将所述胶状物用水直接溶解，转移至高效液相色谱仪上纯化，得到纯化的核酸探针。
在一种实施方式中，所述核酸固体与所述修饰染料固体摩尔比例为1:1-1:4，优选地所述核酸固体与所述修饰染料固体摩尔比例为1:2。
在一种实施方式中，所述制备方法中带有氨基活性基团的核酸固体与可与氨基基团反应的活化酯修饰染料固体两者混合研磨时间为5-20分钟。
在一种实施方式中，所述反应活性酯是琥珀酰亚胺活化酯或异硫氰酸活化酯。
在一种实施方式中，所述核酸中碱基数不少于22个。
在一种实施方式中，所述混合研磨使用球磨机进行研磨。
本发明带有氨基基团的DNA/RNA是指所有3端、5端及中间位置带有氨基的DNA/RNA。
本发明所述修饰染料的活化酯包括但不限于CY5.5,SE (花菁素5.5琥珀酰亚胺活化酯)、HEX,SE (六氯荧光素琥珀酰亚胺活化酯)、CY3(花菁素3琥珀酰亚胺活化酯)、JOE,SE(4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺活化酯)、TET,SE (四氯荧光素琥珀酰亚胺活化酯)、TAMRA,SE (羟基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺活化酯)、ROX,SE (6-羟基-X-罗丹明琥珀酰亚胺活化酯)、FAM,SE (荧光素琥珀酰亚胺活化酯)、FITC (荧光素异硫氰酸活化酯)、Texas Red ，SE (德克萨斯红琥珀酰亚胺活化酯)、CY5 (花菁素5 琥珀酰亚胺活化酯)、DIG (地高辛琥珀酰亚胺活化酯)、Dylight dyes SE seris(Dylight系列染料)、Alexadye SE seris,(Alexa 染料系列)、AMCA-X SE、ATTO dye SE seris. (ATTO 染料系列)。
在本发明的核酸探针制备方法中带有氨基活性基团的核酸固体与可与氨基基团反应的活化酯修饰染料固体两者混合研磨进行一步反应得到核酸探针，在此过程中不加入反应溶剂和其它反应试剂。
本发明方法克服了目前核酸探针化学反应方法固有的技术偏见，在现有技术中一般认为固体与固体之间接触面积小，反应速率低，耗时耗力；固体分子之间反应效率低，反应不充分，原料利用率低。因此在现有的核酸探针制备方法中都采用的是溶剂体系，认为在液相体系中反应分子之间反应速度高，反应充分，原料利用率高。
本发明的核酸探针制备方法为无溶剂反应，不需要有毒有机溶剂的参与，更加的绿色无污染；生产过程大幅度简化，结合球磨机的使用，可以放大生产。在本发明中，通过固相研磨，修饰染料的使用效率有所改善，其与DNA/RNA底物的比例为2:1，常规反应的摩尔收率在30-45%之间，以修饰染料利用率来看，达到了15-20%，材料利用率得到明显改善。更重要的是突破了较长碱基DNA/RNA修饰探针的合成难点，本发明方法中对于长度46个碱基以上长度DNA和/或37个碱基以上长度RNA反应收率和原料利用率，比目前通用的液相氨基活化酯加成法具有显著和突出的提高。
本发明方法中反应底物在无水反应过程中不变质，通过研磨的方法混合两种固体，并给体系带来足够热量促使反应顺利进行。研磨形成均质胶状固体，反应不可逆的快速完成。长链的DNA/RNA与带有活化酯的修饰染料固体接触充分，浓度效应明显。
本发明方法在5-20分钟短的时间实现了核酸探针最佳的反应结果；相比于现有的液相氨基活化酯加成法反应时间大大缩短，反应收率大大提高，提高了核酸探针的制备效率，降低了核酸探针制备的成本。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
实施例一本发明方法的基本原理
将带有氨基基团的DNA/RNA的无定型片状固体和晶体状固体的琥珀酰亚胺活化酯修饰染料两者通过固体混合研磨，可以使两种化学物充分接触并在研磨过程中提供足够的热量；因为没有溶剂参与，反应具有最佳的浓度效应；同时因为反应中没有使用水相，琥珀酰亚胺活化酯修饰染料不会降解，副反应大大减少，从而可以保证反应充分进行。
本发明的反应化学方程式如下：
Figure 839607DEST_PATH_IMAGE003
具体的实施方案如下：
步骤一，将20umol带有氨基活性基团的DNA/RNA与60umol琥珀酰亚胺活化酯修饰染料固体混合，在室温下进行机械研磨，将两种固体充分研磨20分钟，过程中固体变成胶状物。
步骤二，直接将上述胶状物用9ml超纯水溶解，转移至高效液相色谱仪上，采用0.1M 三乙胺醋酸盐与乙腈进行HPLC纯化，得到纯的产品。
本发明的原理在于：
(1) 研磨过程中摩擦生热，使得物质在分子层面的布朗运动更加激烈，有助于反应正向进行。
(2)同时研磨过程中固体的晶型被破坏，反应过程中逐渐形成均一的胶状物，加速了两种化合物的充分接触，使得反应在无溶剂高浓度条件下快速进行。
实施例二.带有氨基活性基团的DNA/RNA的固体和琥珀酰亚胺活化酯修饰染料固体混合研磨比例实验
本发明对固相氨基活化酯研磨加成法反应底物的相对比例也进行了筛选，具体实施方案如下：
1.取10umol量的DNA/RNA固体放入4cm内径的研钵中；
2. 在上述研钵中加入10-40umol不同量的琥珀酰亚胺活化酯修饰染料固体；
3. 在室温下，用直径1.8cm的研钵棒研磨20分钟，过程中固体形成粘稠胶状物；
4. 在研钵上分批加入9ml超纯水，溶解转移上述胶状物至10ml离心管中；
5. 将溶解后的胶状物直接装载至高效液相色谱纯化仪上，采用0.1M 三乙胺醋酸盐与乙腈进行HPLC纯化得到纯品。
实验数据如表1，核酸样品序列如表2。
表1
Figure 696705DEST_PATH_IMAGE004
表2
Figure 515625DEST_PATH_IMAGE005
通过底物浓度筛选，带有氨基活性基团的DNA/RNA与琥珀酰亚胺活化酯修饰染料的比例从1:1增加到1:2时，产物的摩尔收率会同步增加，但是在1:2后继续增加琥珀酰亚胺活化酯的量，产物的摩尔收率变化不明显，因此带有氨基活性基团的DNA/RNA与琥珀酰亚胺活化酯修饰染料的比例为1:2为最佳比例。
从上表中数据可以看出随着琥珀酰亚胺活化酯修饰染料在1:2以后比例继续的提高，产物的摩尔收率基本没有变化，也就是在带有氨基活性基团的DNA/RNA与琥珀酰亚胺活化酯修饰染料的比例为1:2后继续增加琥珀酰亚胺活化酯修饰染料的量对于产物的摩尔收率基本没有影响，而继续增加琥珀酰亚胺活化酯修饰染料的量会显著增加原料的成本，从反应效率和成本考虑，带有氨基活性基团的DNA/RNA与琥珀酰亚胺活化酯修饰染料的比例为1:2为最佳比例。
实施例三. 本发明方法和传统液相氨基活化酯加成法的比较实验
采用相同的序列，按照DNA/RNA与活化酯的比例为1:2进行固相氨基活化酯研磨加成实验，平行比较DNA/RNA与活化酯的比例为1:3的传统液相氨基活化酯加成实验。
1. 本发明的固相氨基活化酯研磨法具体操作方案如下：
（1）取10umol量的DNA/RNA固体至4cm内径的研钵上；
（2）在上述研钵中加入20umol量的琥珀酰亚胺活化酯修饰染料固体；
（3）在室温下，用直径1.8cm的研钵棒研磨20分钟，过程中固体形成粘稠胶状物；
（4）在研钵上分批加入9ml超纯水溶解转移上述胶状物至10ml离心管中；
（5）采用0.1M 三乙胺醋酸盐与乙腈在高效液相色谱纯化仪纯化得到纯品。
2. 传统的液相氨基活化酯加成实验操作方案如下：
（1）将10umol含有氨基结构的DNA/RNA溶解于10ml pH为8.5的0.5M Na2CO3/NaHCO3 缓冲液中，充分震荡混匀；
（2）用3.75ml DMF溶剂去溶解30umol琥珀酰亚胺活化酯修饰染料固体，并加入至上述缓冲液中，室温震荡混匀；
（3）将上述溶液放入摇床，室温震荡12小时；
（4）在上述溶液中加入36ml -20℃冷冻酒精，-20℃冷冻30分钟出现絮状沉淀，8000转高速离心，去除上清液，取沉淀；
（5）分别用36ml -20℃冷冻酒精清洗沉淀3遍，并烘干沉淀，得DNA/RNA修饰探针粗品；
（6）用9ml超纯水将干燥后的DNA/RNA修饰探针粗品溶解，装载至高效液相色谱仪上，采用0.1M 三乙胺醋酸盐与乙腈进行纯化，拿到纯的产品。
本发明的固相氨基活化酯研磨法和传统的液相氨基活化酯加成其对比数据如表3，相应样品序列如表4，两者比较结果见表5：
表3
Figure 793285DEST_PATH_IMAGE006
表中碱基数即指DNA/RNA中脱氧核苷酸或核苷酸的个数。
表4
Figure 838601DEST_PATH_IMAGE007
表5
Figure 358444DEST_PATH_IMAGE008
从以上可以看出，对于长度为22个碱基而言，按照本发明方法的DNA/RNA与活化酯的比例为1:2进行固相氨基活化酯研磨加成实验，平行比较目前常用的DNA/RNA与活化酯的比例为1:3的液相氨基活化酯加成实验，产物摩尔收率增加倍数1.3-2.2倍，单位修饰染料的利用率增加倍数为1.6-3.3倍；对于长度为57个碱基的DNA-ROX-2产物摩尔收率增加倍数50.6倍，单位修饰染料的利用率增加倍数为74.4倍；对于长度为57个碱基的DNA-CY5-2产物摩尔收率增加倍数31.9倍，单位修饰染料的利用率增加倍数为47.2倍；对于长度为46个碱基的RNA-CY5-2产物摩尔收率增加倍数66.7倍，单位修饰染料的利用率增加倍数为100倍；对于对于长度为47个碱基的RNA-ROX-2产物，现有技术液相氨基活化酯加成法没有反应成功，而本发明方法的产物摩尔收率为19.00%，单位修饰染料的利用率为9.50%。
从以上可以看出，无论是DNA还是RNA，本发明固相氨基活化酯研磨加成法比现有的液相氨基活化酯加成法的产物摩尔收率和单位修饰染料的利用率显著增加，特别是对于长度越长的核酸，本发明方法的优势更明显。因此本发明方法相对于都较大幅度的提高了收率，且生产过程大幅简化，为大批量工业化生产提供了新的可靠工艺。
3. 采用固相氨基活化酯研磨加成法和传统液相氨基活化酯加成法分别对不同碱基长度的DNA/RNA进行验证。具体实施方案与本实施例中上述固相氨基活化酯研磨法具体操作方案一致，数据如表6，样品序列如表7：
表6
Figure 907237DEST_PATH_IMAGE009
表中碱基数即指DNA/RNA中脱氧核苷酸或核苷酸的个数。
表7
Figure 886957DEST_PATH_IMAGE010
从以上可以看出，对于DNA，本发明固相氨基活化酯研磨加成法比现有的液相氨基活化酯加成法的产物摩尔收率和单位修饰染料的利用率显著增加，特别是对于长度在46个以上碱基的DNA核酸，本发明方法的优势更明显；而对于RNA，发明固相氨基活化酯研磨加成法比现有的液相氨基活化酯加成法的产物摩尔收率和单位修饰染料的利用率显著增加，特别是对于长度在37个以上碱基的RNA核酸，本发明方法的优势更明显。
实施例四. 异硫氰酸活化酯修饰染料加成法实验
为了拓展本实验的普遍适用性，本专利平行同时研究了DNA还是RNA与异硫氰酸活化酯修饰染料的固相研磨反应，发现本发明对异硫氰酸酯修饰染料也具有良好的反应效果。其反应式如下：
Figure 13045DEST_PATH_IMAGE011
具体实施方案如下：
（1）取10umol量的DNA/RNA固体至4cm内径的研钵上；
（2）在上述研钵中加入10-40umol不同量的异硫氰酸活化酯修饰染料固体；
（3）在室温下，用直径1.8cm的研钵棒研磨20分钟，过程中形成粘稠胶状物；
（4）在研钵上分批加入9ml超纯水溶解转移上述胶状物至10ml离心管中；
（5）直接在高效液相色谱纯化仪上采用0.1M 三乙胺醋酸盐与乙腈进行纯化得到纯品。
具体数据见下表8和样品序列见下表9：
表8
Figure 211945DEST_PATH_IMAGE012
表中碱基数即指DNA/RNA中脱氧核苷酸或核苷酸的个数。
表9
Figure 241343DEST_PATH_IMAGE013
从以上可以看出，异硫氰酸活化酯修饰染料与琥珀酰亚胺活化酯修饰染料的反应物实验结果类似，结合异硫氰酸活化酯修饰染料的利用效率，带有氨基活性基团的DNA/RNA与异硫氰酸活化酯修饰染料的反应的最佳摩尔比例为1:2。
实施例五. 不同研磨时间的实验
本实验以带有氨基活性基团的DNA/RNA与琥珀酰亚胺活化酯修饰染料的摩尔比例为1:2时，对研磨时间进行验证，具体实验方案如下：
（1）取10umol量的DNA/RNA固体加入4cm内径的研钵上；
（2）在上述研钵中加入20umol量的琥珀酰亚胺活化酯修饰染料固体；
（3）在室温下，用直径1.8cm的研钵棒研磨3-30分钟，过程中不以是否形成胶状物作为判断标准；
（4）在研钵上分批加入9ml超纯水溶解转移上述固体至10ml离心管中；
（5）直接在高效液相色谱纯化仪上采用0.1M 三乙胺醋酸盐与乙腈进行纯化得到纯品。
结果如下表10，样品序列如下表11。
表10
Figure 500286DEST_PATH_IMAGE014
表11
Figure 644829DEST_PATH_IMAGE015
从结果上看，在20分钟内反应基本都可以结束，研磨时间在5-20分钟实现了最佳的反应结果；液相氨基活化酯加成法一般是4-12小时的反应时间，相比于现有的液相氨基活化酯加成法反应时间大大缩短，反应收率大大提高，提高了核酸探针的制备效率，降低了核酸探针制备的成本。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims (6)

1.一种核酸探针制备方法，其特征在于，所述制备方法中带有氨基活性基团的核酸固体与可与氨基基团反应的活化酯修饰染料固体两者混合研磨进行一步反应直接得到核酸探针，所述核酸固体和所述修饰染料固体通过机械混合研磨直至成为胶状物，在此过程中不加入反应溶剂和其它反应试剂；
所述核酸固体为无定型片状固体，所述修饰染料固体为晶体状固体；
所述方法还包括：将所述胶状物用水直接溶解，转移至高效液相色谱仪上纯化，得到纯化的核酸探针；
所述核酸固体与所述修饰染料固体摩尔比例为1:1-1:4；
所述制备方法中带有氨基活性基团的核酸固体与可与氨基基团反应的活化酯修饰染料固体两者混合研磨时间为5-20分钟；和
所述反应活性酯是琥珀酰亚胺活化酯或异硫氰酸活化酯。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核酸为DNA或RNA。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述核酸为碱基长度在46个碱基以上的DNA，或者核酸为碱基长度在37个碱基以上的RNA。
4.根据权利要求1所述的制备方法，所述核酸固体与所述修饰染料固体摩尔比例为1:2。
5.根据权利要求1所述的制备方法，所述核酸中碱基数不少于22个。
6.根据权利要求1所述的制备方法，所述混合研磨使用研钵或球磨机进行研磨。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115414703B (zh) * 2022-11-03 2023-01-17 百力格生物科技(上海)股份有限公司 染料修饰后的核酸探针纯化方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996030377A1 (en) * 1995-03-27 1996-10-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nitrogenous macrocyclic compounds
CN101914099A (zh) * 1995-04-03 2010-12-15 埃利泰克控股有限公司 共价结合的寡核苷酸和小沟结合剂的轭合物
CN104593355A (zh) * 2015-01-15 2015-05-06 厦门多维生物医药科技有限公司 特异性的核酸配对交联方法
CN110196322A (zh) * 2018-02-27 2019-09-03 广东志道医药科技有限公司 有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测方法及其试纸条和制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI361066B (en) * 2004-07-26 2012-04-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 5-substituted-2-phenylamino benzamides as mek inhibitors
CN113056291B (zh) * 2018-08-17 2023-05-30 塞弗德公司 核酸去污方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996030377A1 (en) * 1995-03-27 1996-10-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nitrogenous macrocyclic compounds
CN101914099A (zh) * 1995-04-03 2010-12-15 埃利泰克控股有限公司 共价结合的寡核苷酸和小沟结合剂的轭合物
CN104593355A (zh) * 2015-01-15 2015-05-06 厦门多维生物医药科技有限公司 特异性的核酸配对交联方法
CN110196322A (zh) * 2018-02-27 2019-09-03 广东志道医药科技有限公司 有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留检测方法及其试纸条和制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DNA分子识别及传感技术;林 琳等;《化学通报》;20011231(第5期);第261-267页 *
Preactivated carboxyl linker for the rapid conjugation of alkylamines to oligonucleotides on solid support;Alexandre V Lebedev et al.,;《Bioconjug Chem》;20070919;第18卷;第1530-1536页 *

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