CN1644585A - 共价结合的寡核苷酸和小沟结合剂的轭合物 - Google Patents

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Abstract

小沟结合剂与寡核苷酸通过共价键结合，寡核苷酸的碱基序列与单链或双链DNA、RNA或杂合体的靶序列互补。共价结合的寡核苷酸－小沟结合剂共轭物能增强与互补链靶序列的结合力。

Description

共价结合的寡核苷酸和小沟结合剂的轭合物
1.发明领域
本发明涉及新的寡核苷酸衍生物。具体地讲，本发明涉及一个或多个小沟结合剂与寡核苷酸共价结合的寡核苷酸衍生物。这种寡核苷酸-小沟结合剂共轭物(以后称ODN-MGB)有较强的杂交能力，与单链或双链核酸的互补序列的结合力也较强。因此可用作序列特异的探针，并作为反义核酸和反义基因(anti-gene)治疗药物。
2.现有技术的简述
与双链DNA的小沟通过非共价键结合的小沟结合剂在本领域是已知的。能与双链DNA或RNA以非共价键结合的嵌入剂也是熟知的。这些嵌入剂一般属于平面芳香族化合物，它们嵌入(置身于)双链DNA或RNA的嘌呤和嘧啶碱基对之间。美国专利US 4835263描述了一种与嵌入基共价结合的寡核苷酸。这种携带有嵌入基的寡核苷酸可用作杂交探针。
本发明概述
本发明涉及寡核苷酸与小沟结合基共价结合的结合物。该结合物包括具有多个核苷酸单位、一个3′端、一个5′端的寡核苷酸和与至少一个所述的核苷酸共价结合的小沟结合基。小沟结合剂一般通过一条含有不超过15个原子的链即连接基与寡核苷酸相结合。小沟结合基是分子量为约150-2000道尔顿的分子基团，与双链DNA、RNA或杂合体的小沟以非嵌入方式连接，其缔合常数大于103M-1。
另一方面，本发明还涉及某些共价结合的寡核苷酸-小沟结合剂结合物的合成方法，以及该结合物用作核酸探针的方式及为有关分析和诊断以及治疗目的(作为反义核酸和反义基因)用的方式。
附图的简要描述
图1所示的是狭缝印迹杂交分析的结果
本发明的详细描述
总的实施方案
本发明新结合物的显著特征是小沟结合剂与寡核苷酸共价结合，本专利申请的引言部分已经指出小沟结合剂是结合在双链DNA的小沟内的分子。但由于这类化合物的结构变化大，不能用一般通式来表示所有已知小沟结合剂的化学结构。能与DNA小沟结合的化合物一般都有月牙形的三维结构。现有技术中的大多数小沟结合剂都优先与B型双链DNA的A-T富含区结合。小沟结合剂或更准确地说本发明寡核苷酸-小沟结合剂轭合物的基团当然也优先与双链DNA的A-T富含区结合(本发明的寡核苷酸-小沟结合剂轭合物在下文中存时也称为ODN-MGB)。然而，优先与C-G(胞嘧啶和鸟嘌呤)富含区结合的在理论上也是可能存在的。因此含有这样的优先与C-G富含区结合的小沟结合基的ODN-MBG亦属本发明的范畴。已有的小沟结合剂优先与A-T区结合，可解释为鸟嘌呤(G)的2-位氨基与某些已知的小沟结合剂之间存在立体位阻。从下文的详述中可明显看出，在本发明的ODN-MBG中鸟嘌呤(G)被6-羟基嘌呤取代后，上述不利的立体位阻不复存在，ODN-MGB与互补链的结合力可能增强。
一般地讲，现有技术中已知的小沟结合剂一般不与双链RNA或DNA和RNA的双链杂合体结合。然而本发明的ODN-MGB却能够与单链RNA结合，上述性质是本发明的另一有趣的新方面。
根据本发明，能与ODN共价结合形成ODN-MGB轭合物的现有的小沟结合剂是一些天然产物如纺锤菌素、偏端霉素和lexitropsin、光辉霉素、色霉素A3、橄榄霉素、氨菌霉素、西伯利亚霉素和有关抗生素与合成衍生物。另一些双季铵杂环化合物、二芳基脒如戊烷脒、芪脒和berenil、cc-1065与有的吡咯并吲哚和吲哚多肽、Hoechst 33258、4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及许多由天然氨基酸或合成氨基酸构成的寡肽也是小沟结合剂。下列化合物的结构如下：
Figure A20041005589700131
偏端霉素
Figure A20041005589700151
芪脒
Figure A20041005589700161
甲基绿
就本发明目的而言，如果一个分子能与双链DNA的小沟结合，其间的缔合常数为103M-1或更高，则该化合物就是小沟结合剂。这种结合可通过现有的光谱分析法如紫外光谱(U.V.)、核磁共振光谱(nmr)进行检测，还可利用凝胶电泳法。紫外光谱在有小沟结合剂连接时吸收峰移动，以及利用“奥佛赫塞”(NOSEY)效应的核磁共振光谱均是实现此目的有用技术。凝胶电泳则检测小沟结合剂与双链DNA或其片段的结合，因为该结合使双链DNA的迁移率发生了变化。
嵌入分子或嵌入剂易于与小沟结合剂区别开，嵌入剂为平面芳香族(优选多环)分子，而小沟结合剂(MGB)则为月牙形或类似几何结构的分子。此外二者还可通过核磁共振光谱(nmr)中的“奥佛赫塞”(NOSEY)效应进行实验区别。
如上所述，就本发明目的而言，如果一个分子与双链DNA的小沟相结合的缔合常数等于或大于103M-1，则该分子就是小沟结合剂。然而，某些小沟结合剂与双链DNA的高亲和部位相结合，缔合常数可高达107-109M-1。
根据本发明，小沟结合剂经修饰则本质上成为小沟结合基，与适当的共价结构或原子链连接，小沟结合剂通过所述共价结构或原子链与寡核苷酸(ODN)相连。在某种意义上这种原子链可作为并有时被认为是小沟结合剂的一部分，因为这种连接并不影响ODN-MGB分子的小沟结合性能。然而，从概念上将小沟结合剂与将它与ODN共价连接的基团区别开更适于本发明的描述。这个由小沟结合剂衍生形成的基团在下文称为“小沟结合基”。而连接小沟结合基与ODN的共价结构(不超过15个原子)则称为“连接基”。这里先描述本发明的ODN-MGB轭合物的寡核苷酸部分，然后再详细描述根据本发明的小沟结合基的优选实施方案。
从广义上讲，本发明的ODN-MGB轭合物的寡核苷酸含有约3-100个核苷酸单位。根据本发明，这些可形成ODN的核苷酸单位包括天然核酸中存在的主要杂环碱基(U、C、T、A、G)、这些碱基的天然与化学修饰物和这些碱基的类似物如6-羟基嘌呤、2-氨基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-N4亚乙烯基胞嘧啶、4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶和6-氨基-4-羟基-[3，4-d]嘧啶。5-N4亚乙烯基胞嘧啶、4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶和6-氨基-4-羟基[3，4-d]嘧啶的2-脱氧核苷的各自结构如下：
Figure A20041005589700181
2-脱氧5-N4-亚乙烯基胞苷             2-脱氧4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶核苷
           
Figure A20041005589700182
      2-脱氧6-氨基-4-羟基吡唑-[3，4-d]嘧啶核苷
               R＝2-脱氧-β-D-呋喃糖基
此外，掺入本发明ODN-MGB轭合物中的ODN中的核苷酸单位可以具有交联官能团(烷化剂)，它通过连接臂与一个或多个碱基共价结合。因这类结合有交联剂的ODN-MGB轭合物构成了本发明优选实施方案中的重要一类，在下文下面将对这些结构进行更详细的描述。
本发明ODN-MGB中的糖基或糖苷部分可以是脱氧核糖、核糖、2-氟核糖、2-O-烷基或链烯基核糖，其中所述的烷基可有1-6个碳原子，链烯基可有2-6个碳原子。在天然核苷酸及本文所述的修饰物和其类似物中，脱氧核糖和核糖部分形成呋喃糖环，糖苷键为β-构型，且嘌呤碱基通过9-位、嘧啶通过1-位以及吡唑并嘧啶通过1-位分别与糖环相连。根据本发明，寡脱氧核糖核酸为优选的，因此2-脱氧核糖为优选的糖。ODN的核苷酸单位通过磷酸酯骨架相互连接，这一点是本领域人员所熟知的。本发明ODN-MGB轭合物的ODN中除了可包含天然磷酸二酯键外，此外还可包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯连接。
本发明的ODN-MGB轭合物的寡核苷酸部分还可含有与寡核苷酸的3′-端或5′-端相连的较小分子量的“末端基”。在本文的上下文中应将末端基与小沟结合基加以区别，小沟结合基也同样优选与ODN的3′-端或5′-端或两者连接。这样，末端基如果存在的话，则与不带有小沟结合基的寡核苷酸的末端相连。例如，末端分子可以是磷酸盐、磷酸酯、烷基、氨基烷基或亲脂基。
关于本发明ODN-MGB的ODN中的核苷酸单位、磷酸酯骨架和末端的可能变化，请记住下文。本发明的ODN-MGB轭合物的主要用途在于该轭合物中的ODN能与单链DNA、RNA、双链DNA及DNA-RNA杂合体的互补序列结合，小沟结合基掺入新形成的“双链螺旋体”中，由此则增强了该“双链螺旋体”的结合力，也就是增高了新形成的双链螺旋体的熔化温度(增大了缔合常数)。此外，本发明优选的带有“交联剂”的ODN-MGB轭合物还使ODN-MGB与互补DNA或RNA链永久地共价结合，形成永久键合形式。根据上文所述，本领域的熟练技术人员容易理解，本发明ODN-MGB轭合物中的ODN的各部分的一级结构限制仅在于ODN部分与任何特异的靶序列形成互补链的能力；而且就其本身而论，本领域已知的大量的结构修饰有可能存在于这些结构中。而且一般说来，制备各种杂环碱基、核苷、核苷酸和构成本发明ODN-MGB轭合物的ODN部分的寡核苷酸的方法已经建立起来，并为本领域所熟悉。N4，N4-亚乙基-5-甲基脱氧胞嘧啶及其核苷、核苷酸或含有该碱基的寡核苷酸可按文献的教导进行合成(Webb，T.R.；Matteucci，M.D.核酸研究(Nucleic Acids Res.)，1986，14，7661-7674，Webb，T.R.；Mattencci，M.D.美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)，1986，108：2764)。4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶、6-氨基-4-羟基吡唑并[3，4-d]嘧啶、及其核苷、核苷酸和含有该碱基的寡核苷酸则可按有关文献教导进行合成(Kazimierczuk et al.J.Am.Chem.Soc.，1984，106，6379-6382)。为了制备特定的已知序列的ODN以便与靶序列互补，可按本领域的技术状况进行寡聚核苷酸的合成，下文将对优选的方法进行描述。优选的方法描述于1993年7月12日申请、申请号为08/090,408的申请(该申请已被授权并且公开费已缴)中。将该08/090,408申请的说明书内容引入本文作参考。
所谓“连接基”是共价连结轭合物的寡核苷酸部分与小沟结合基的一种基团。优选地，该连接基是通过含有不超过15个原子的链进行连接的结构。根据本发明，小沟结合基也优选与寡核苷酸的3′或5′-端共价结合。然而，与中间位置的核苷酸、尤其与中间位置的核苷酸的碱基相连也属于本发明的范围。一般而言，连接基是双官能分子衍生物，以便一个官能团如氨基可与例如ODN5′-端磷酸酯相连，另一官能团如羰基(CO)可与小沟结合基的氨基相连。此外，连接基也可以是氨基醇类衍生物，使羟基例如可与ODN3′端磷酸酯相连，而氨基则与小沟结合基的羰基相连。连接基的另一方案包括与氨基酸相连的氨基醇(通过酯键与3′端磷酸酯连接)，而所述的氨基酸则通过肽键与小沟结合剂的羰基相接。这样，连接基的优选方案为具有下列通式的结构：-HN(CH2)mCO、O(CH2)mCO和(CH2)mCH(OH)(CH2)mNHCO(CH2)mNH，其中m值应满足使小沟结合基与ODN之间相隔不超过约15个原子。连接基的优选结构是-O(CH2)6NH、-OCH2CH(OH)CH2NHCOCH2CH2NH和-HN(CH2)5CO。正如上面已指出的那样，连接基也可被认为是小沟结合基的一部分，在那种情况下，可以认为小沟结合剂直接与ODN相连。
小沟结合基结构的基本限制在上面已经指出，而且其尚难由特定的化学结构定义。小沟结合基上除了有可与小沟结合的分子结构外，还可有另外的官能团，只要这些官能团不干扰小沟的结合能力。例如，可使信息基团与小沟结合基共价结合，所述信息基团可使小沟结合剂易于通过颜色、紫外光谱或其它可见的物理或化学性质被检测出来。该信息基团的例子是偶氨苯官能基，在优选实施方案的实例中它通过-HN(CH2)mCOO(CH2)mS(CH2)m-桥与小沟结合基的羰基相连。另外，小沟结合基带有的信息基团或其它基团也可看成小沟结合基本身的一部分。
优选的ODN-MGB轭合物可用下文所列的结构式1来定义其结构，该定义包括根据本发明的优选的小沟结合基，同样也可包括部分或全部的连接基及其它辅助基团如上面讨论的信息基团。
                        结构式1
这里X为O或S；
q为3至100之间的整数；
R8是H、OH、具有1-6个碳原子的烷氧基、O-C2-C6链烯基或F；
B是糖苷配基，选自存在于核酸内的天然杂环碱基和6-羟基嘌呤、2-氨基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-N4-亚乙烯基胞嘧啶、4-氨基吡咯并[3，4-d]嘧啶、6-氨基-4-羟基吡咯并[3，4-d]嘧啶；
W1是H、PO(OH)2或其盐，或者是与所述的寡核苷酸3′-或5′-端相连的小沟结合基，该W1包括通过不超过15个原子共价连接小沟结合基和寡核苷酸的连接基；
W2是无或与一个糖苷配基B相连的小沟结合基，该W2包括将小沟结合基共价连接到所述糖苷配基B上的连接基，或者W2是含有连接臂的交联官能团，该连接臂使所述的交联官能团与所述的糖苷配基共价连结。
其中小沟结合基是分子量为150-2000道尔顿、以非嵌入方式与双链DNA、RNA或杂合体的小沟相结合的、其缔合常数大于约103的分子基团，条件是所述的W1和W2至少一个为小沟结合基；
包含有连接基的小沟结合基具有选自(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的通式：
                    R1-(HN-Y1-CO)n-R2
                           (a)
其中Y1表示含有两个双键和0-3个杂原子(选自N、S、O)的五元环，NH和CO分别与同环的两个碳原子相连，这两个碳原子被一个原子隔开，这个原子未被取代或仅被H取代，环上的其余的原子可被1、2或3个R3基任意取代；
                    R1-(R6N-Y2-CO)n-R2
                            (b)
其中Y2是六元芳香环与含有一个双键的五元环缩合成的稠合环，该稠合环含有0-3个杂原子(所述杂原子选自氮、硫、氧)，R6N和CO分别与稠合环的两个不同环上的碳原子相连，这两个碳原子从一个共同桥头原子算起，CO和NR6之间在稠合环的一边有两个非桥头环原子而在另一边有三个非桥头环原子，所述的稠合环一边的两个非桥头环原子可被R7任意取代，另一边的三个非桥头环原子可被R3任意取代；
                    R1-(CO-Y3-NH)n-R2
                           (c)
其中Y3是含有0-3个N杂原子的六元芳香环，CO和NH分别与环上相对处于1、4位的两个碳原子相连，六元环被连有CO或NH的两个碳原子分成两边，一边未与CO或NH基团相连的两个环原子被R3任意取代，另一边未与CO或NH基团相连的两个环原子被R7任意取代；
            R1-(NH-Y4-NH-CO-Y4-CO)p-R2
                       (d)
其中Y4是含有0-3个N杂原子的6元芳香环，NH、CO分别与环上相对处于1、4位的两个碳原子相连，该六元环被环上连有CO或NH的两个碳原子分成两边，一边未与CO或NH相连的两个环原子可被R3任意取代，另一边未与CO或NH基团相连的两个环原子可被R7任意取代；
                   R1-(Y5)n-R2
                       (e)
其中Y5是六元芳香环与含有一个双键的五元环的稠合环，该稠合环有0-3个杂原子，所述杂原子选自N、S、O，R1和R2分别与稠合环的不同环上的环碳原子相连，它们从共同的桥头原子算起均是第二个环原子，在R1和R2之间该稠合环的一边有两个非桥头环原子而在另一边则有三个非桥头环原子，所述的稠合环一边的两个非桥头环原子可被R7任意取代，另一边的三个非桥头环原子可被R3任意取代；
这里R1、R2独立地为H、F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N(R4)2、N(R4)3 +、OH、-O-、-S-、OR4、SH、SR4、COR4、CONHR4、CON(R4)2、R4、H2N(CH2)mCO、CONH2、CONHR4、H2N(CH2)mCOO(CH2)mS(CH2)mC6H4NNC6H4、-HN(CH2)mCO、-CONH-、-CONR4、-HN(CH2)mCOO(CH2)mS(CH2)mC6H4NNC6H4和-(CH2)mCH(OH)(CH2)mNHCO(CH2)mNH-，或者R1和R2中有一个基团下存在；
R3为选自下列基团的基团：F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N(R4)2、N(R4)3 +、OH、OR4、SH、SR4、COR4、CONHR4、CON(R4)2和R4，或者R3是可形成与Y1环成稠合环的3、4、5或6元环的基团；
R4是含有1-20个碳原子的烷基或环烷基、含有1-20个碳原子和1-3个双键的链烯基或环烯基、含有不超过25个碳原子的碳环芳基、含有不超过25个碳原子的杂环芳基、含有不多于25个碳原子的碳环或杂环芳烷基，其中R4可被1、2或3个F、Cl、Br、I、NH2、NHR5、N(R5)2、N(R5)3 +、OH、OR5、SH、SR5、COR5、CONHR5、CON(R5)2或R5基团任意取代；
R5是具有1-6个碳原子的烷基，
R6是H、具有1-5个碳原子的烷基，或者R6和R7共同形成一个4、5或6元环，任意-O-、-S-、-NH-、-NCH3-或N-低级烷基是上述环的一部分；
R7是F、CH3-或-CH2CH3；-CH2-或-CH2CH2-；
m是1-10之间的整数
n是1-10之间的整数，以及
P是1-5之间的整数。
本发明更为优选的ODN-MGB轭合物是其中的小沟结合基定义如下的那些轭合物：
(1)小沟结合基由上面的通式(a)表示，并且其五元环的结构为：
                        结构式2
(2)小沟结合基由通式(a)表示，其中的五元环的结构为：
Figure A20041005589700232
                        结构式3
(3)小沟结合基由通式(b)表示，且其中稠合环的结构为：
Figure A20041005589700233
                        结构式4
含交联基的实施方案
本发明优选的一类ODN-MGB轭合物还包括一个或多个“交联基”，在ODN-MGB轭合物与互补DNA、RNA或其片断的靶序列结合后，所述的交联基即与靶序列进行不可逆的反应，形成共价键。这种与靶序列的共价结合可用用分析、诊断如用作杂交探针，还可用于治疗用途(用作反义核酸、反义基团)。小沟结合基与ODN的共价结合增强了ODN-MGB轭合物与靶序列间初始的非共价结合力，因而有利于随后的通过交联基的共价结合。就掺入到这类ODN-MGB轭合物中的交联基而言，应考虑下列情况。
本发明的交联基与ODN-MGB轭合物的某一部位共价结合。其长度和立体取向应符合这样的要求，即在ODN-MGB轭合物与靶序列杂交后，该交联基应到达靶DNA或RNA内的适当的反应位点。就定义而言，交联基(剂)具有与靶DNA或RNA序列的活性基团反应的活性基团。该交联基(剂)可与ODN-MGB轭合物的一个或多个杂环碱基、与糖基或修饰的糖基、磷酸酯基或修饰的磷酸酯共价结合。交联基也可与小沟结合基相连，只要不影响它与小沟的结合能力。最好交联基(剂)与一个杂环碱基相连。
简单而言，交联剂从概念上可分成两个基团或部分，即反应活性基和臂(A)，所述的反应活性基一般是而且最好是亲电离去基(L)，所述的臂将离去基连接到ODN-MGB上的各自位点上。这些离去基例如可以选自Cl、Br、I、SO2R、或S+RR′，其中R、R′互不相干地为(C1-C6)烷基或芳基，或者R′或R′一起形成C1-6亚烃基桥。其中以Cl、Br、I为最佳。在这些基团中，卤乙酰基如-COCH2I和双官能“氮芥”如-N-[(CH2)2-Cl]2是优选的。各离去基由于其离去能力(不同)而会有所变化。依据各离去基的内在性质和反应活性来选择在每种情况下要用的离去基以得到所需的不可逆结合探针的特异性。
虽然上面已指出，“臂/(或连接臂)A从概念上可被认为是一个实体，即使ODN-MGB与离去基共价结合的实体，使离去基相对于ODN-MGB保持期望的距离和立体位置。实际上臂A可在合成方案中构建出来，其中在小沟结合基与ODN-MGB或ODN连接前，双官能分子通过其第一官能团与ODN-MGB轭合物或ODN共价结合(例如通过磷酸酯键连于ODN的3′或5′-端、通过C-C键与杂环碱基相连，或通过C-N键与氨基取代的杂环碱基相连)，并通过其第二官能团(如-NH2)与烃基桥(烷基桥、烷基芳基桥或芳基桥等)连接，而这些桥上携带有离去基。
交联基的一般通式为-A-L或A-L2，L为上面定义的离去基，A是与ODN-MGB共价结合的部分。臂A本身在ODN-MGB与靶序列杂交的条件下应无反应活性(只有通过离去基才表现反应活性)，并应使离去基与希望的反应位点如靶序列中鸟嘌呤(G)的N-7位保持所需的立体位置与距离。通常A的长度与约有2-20个碳原子的正烷基链长相当。
一类优选交联基的较为具体的示例性的通式是：
                  -(CH2)q-Y-(CH2)m-L，
其中L是离去基(定义如上)，m和q各自独立地为0-8(包括0和8)，而Y定义为“官能连接基”为了清楚描述起见，该官能连接基应与连接小沟结合基和寡核苷酸(ODN)的“连接基”区别开来，尽管此处所述的连接交联基的“官能连接基”也可用来使小沟结合基与ODN的任何一端或与ODN的中间位置的核苷酸相连。“官能连接基”是有两个官能团如-HN2和OH、或COOH和OH、或COOH和NH2的基团，它们能连接(CH2)q和(CH2)m成桥。末端炔基(HC≡C-)基也是Y的一个恰当的官能团，因为它能与某些杂环偶联，如下文所述。
一类优选交联基的其它示例性的且较为具体的通式为：
-(CH2)q-NH-CO-(CH2)m-(X)n-N(R1)-(CH2)p-L和-(CH2)q′-O-(CH2)q″-NH-CO-(CH2)m-(X)n-N(R1)-(CH2)p-L
这里q、m、L的定义同上文描述交联基时所述的定义。q′为3-7(包括3和7)，q″为1-7(包括1和7)，X为苯基或简单取代的苯基(如Cl、Br、低级烷基或低级烷氧基取代的苯基)，n为0或1，p为1-6的整数，R1为H、低级烷基或(CH2)p-L。p优选为2。本领域的专业人员都清楚-N(R1)-(CH2)2-L描述的是氮芥的结构，后者是一类潜在的烷化剂。在ODN-MGB轭合物中，那些其中的交联剂含有-N(R1)-(CH2)2-L这样的官能团的是特别优选的，其中L是卤素，最好为Cl；更为优选的是其中的交联剂含有N-[(CH2)2-L]2(双官能氮芥)这样基团的那些。交联剂的部分结构最好含有基团：
             -CO-(CH2)3-C6H4-N[(CH2)2Cl]2
在一个最优实施方案中，刚才提到的交联基与ODN的5′和3′-端带有N-正己基氨基的尾巴相连，结构如下：
R1-O-(CH2)6-NH-CO-(CH2)3-C6H4-N-[(CH2)2Cl]2
其中R′表示ODN的5′或3′-端磷酸酯基。另一末端或中间的核苷酸与小沟结合基相结合。
根据本发明的其它的优选实施方案，交联基与杂环碱基如与ODN-MGB轭合物中的2-脱氧尿核苷酸的尿嘧啶共价结合。这种结合可通过氨基进行，亦即可使”臂-离去基结合体”(A-L)与ODN的5-氨基-2′-脱氧尿苷酸相连。在另一优选实施方案中，“A-L”通过碳-碳键与ODN的2′-脱氧尿苷酸的5-位相连。一般而言，5-取代的2′-脱氧尿苷可通过改进的Robins等人的方法(Can.J.Chem，60：554(1982)；J.Org.Chem.48：1854(1983)进行合成。根据该改进的方法，在钯催化下，取代的1-炔烃与5-碘-2′-脱氧尿苷偶联反应得到乙炔偶合产物。该乙炔脱氧尿苷类似物用例如兰尼镍还原，得饱和化合物，然后使后者直接转化为用于自动DNA合成仪的试剂。可按照该方法与5-磺-2′-脱氧尿苷进行偶联反应的其它试剂是HC≡CCH2OCH2CH2N(CO)2C6H4(苯二甲酰亚氨基乙氧基丙炔-1)和HC≡CCH2OCH2CH2NHCOCF3(三氟乙酰氨基乙氧基丙炔-1)。
本这些实施例中，将按上述路线合成的核苷引入ODN，并仅在除去了各自的苯二甲酰基或三氟乙酰基等保护基后，使交联剂的烷化部分与末端氨基结合。其中交联剂与杂环碱基相连的其它核苷酸的例子是2′-脱氧-4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶衍生物。这些化合物可根据已公开的PCT申请WO：90/03370(1990年4月5日公开)的方法制备。
在对本发明修饰的ODN的结构进行一般讨论时，发现以球-棍模型和高分辨率计算机图形学对双链DNA的研究表明嘌呤的7-位和嘧啶的5′-位位于双链核酸B型螺旋体的大沟上。这些位置可用较大体积的侧链取代，而不影响碱基的杂交性质。这些侧链可通过脱氧胸苷(dThd)或脱氧胸苷(dCyd)衍化引入或通过杂环碱基的直接全合成然后再进行糖基化而引入。这些修饰的核苷可被转化为用自动DNA合成仪引入到寡核酸中的适当活化的核苷酸。吡唑并[3，4-d]嘧啶是腺嘌呤类似物，交联臂与其3-位(相当于嘌呤的7-位)相连。
该交联侧链(臂＝A)应有足够的长度，使其能从嘌呤的7-或8-位、嘧啶的5-位、吡咯并嘧啶的5-位或吡唑并嘧啶的3-位穿过大沟与嘌呤(最好为鸟嘌呤)的N-7位反应，这个嘌呤位于含有该被修饰类似物的碱基对的上方(在寡聚物的3′端)。在该双链复合体内，当碱基与另一碱基配对时，该交联侧链(臂＝A)使官能团离开这个已配对的碱基。象上面所指出的那样，广义上讲，臂A的长度应与含2-20碳的正烷基链长相当。最好臂A为含有1-12碳原子的亚烷基、含有2-12碳原子且1或2个烯键的链烯基、含有2-12碳原子且1或2个炔键的炔基，或者其末端用亲核基如O、S、氨基取代的基团或被保护的其衍生物(例如三氟乙酰氨基、苯二甲酰亚氨基、CONR′、NR′CO、SO2NR′(这里R′＝H或C1-6烷基)取代的基团)。这些官能团包括脂肪胺或芳香胺)表现出亲核性且能与下面这些基团相连：
-(CH2)m-L和
-CO-(CH2)m-(X)n-N(R1)-(CH2)p-L
如上文所述，这些基团是示例性交联官能基的一部分。
在连有交联基(A-L)或其适当的前体如-(CH2)q-NH2或-(CH2)q-Y，其中Y以亲核基团如NH2为末端)的核苷或核苷酸合成后，本发明的修饰的寡核苷酸的进一步合成可根据本领域现有的方法进行。因此，为合成寡核苷酸，在核苷或核苷酸上引入保护基并使这些化合物活化以用于寡核苷酸的合成。向被保护的、活化型核苷(酸)的转化可参考有关2′-脱氧核苷的几篇综述(见Sonveaux，生物有机化学(Bioorganic Chemistry)14：274-325(1986)；Jones，寡核苷酸的合成-一种实际的途径(“Oligonucleotide Synthesis，aPractical Approach”)，M.J.Gait，编辑，IRL出版，23-34页(1984))。
将活化核苷酸引入寡核苷酸的方法与DNA和RNA的合成相似，即将正确的核苷酸逐步连接成一条与靶DNA或RNA的核苷酸序列互补的核苷酸链。核苷酸的引入可采用酶法或化学合成法。可将核苷酸修饰成其相应的5′-O-二甲氧基三苯甲基-3′-(N，N-二异丙基)亚磷酰胺氰乙酯衍生物，再按(Oligonucleotide Synthesis：APractical Approach)文中的方法掺入合成的寡核苷酸。然后，N-保护基与其它保护基分别用氨解和本领域已知的常规方法脱去。
在一个优选实施方案中，活化核苷酸可根据使用的合成仪的使用方法和操作规程直接用于自动DNA合成仪。采用标准经济的亚磷酰胺或H-磷酸酯合成化学法，该寡核苷酸可在合成仪上制备。
在寡核苷酸合成及除去任何保护基后，可将含离去基如卤乙酰基或-CO-(CH2)m-(X)n-N(R1)-(CH2)p-L(最好是CO-(CH2)3-C6H4-N[CH2CH2Cl]2)基团加到末端氨基烷基或类似末尾(-(CH2)q-Y)上。
如果交联剂(A-L)通过例如烷基氨基(其通式为-(CH2)q-L，其中Y以氨基为末端)与寡核苷酸的3′端或5′-端相连，在这种情况下应先合成带有氨基烷基末端的寡核苷酸，然后再将烷化基如上面提到的卤酰基或-CO-(CH2)m-(X)n-N(R1)-(CH2)p-L引入其中，来进行寡核苷酸的合成。
优选的示例性ODN-MGB轭合物的结构如下，该轭合物具有与核苷酸碱基之一相连的交联剂：
5′-GGTTATTTTTGAAGATACGAATTTCUCCAGAGACACAGCAGGATTTGTCA-CDPI3
其中符号“ U”(该50聚核苷酸中的第26位核苷酸)表示5-(3-氨基丙基)-2′-脱氧尿苷，该尿苷具有与氨基相连的苯丁酸氮芥残基。符号“CDPI3”表示小沟结合基(将结合反应路线1描述于下文)。通过采用5′-O-三苯甲基-5-三氟乙酰氨基丙基-2′-脱氧尿苷-3′-(N，N-二异丙基-氰乙基-亚磷酰胺，根据Gibson，K.J.和Benkovic，S.J.的方法将5-(3-氨基丙基)-2′-脱氧尿苷引入寡核苷酸中(Gibson，K.J.，& Benkovic，S.J.核酸研究(Nucleic AcidRes.)1987，15：6455)。ODN与苯丁酸氮芥残基和小沟结合基的连接描述于下文的实验部分。
小沟结合基和ODN-MGB轭合物的合成
目前，最优选的本发明小沟结合基是从1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸和4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸衍生的寡肽。这些寡肽是合成肽，它们具有分别由结构式2和结构式4所示的重复单元，其中聚合度m值优选为3-5。对结构式2所示的肽，m值以5为最佳；对结构式4所示的肽，m值以3为最好。反应路线1是一个三肽(简称为CDPI3)的合成路线，该肽经修饰或不经修饰可直接与ODN相连，得到优选的本发明ODN-MGB轭合物。
Figure A20041005589700301
                    反应路线1
在反应路线1中，起始原料为3-氨基甲酰基-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸或3-叔丁氧羰基-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸，它们可按有关的化学文献方法(D.L.Boger，R.S.Coleman和B.J.Invergo，有机化学杂志(J.Org.Che-m.)，1987，52：1521-1530)制备。起始原料以三氟乙酸四氟苯酯(TFP-TFA)处理，转化成活性酯。在化合物1a中，R为CONH20在1b中，R为叔丁氧羰基(tBoc)。叔丁氧羰基(tBoc)是熟知的可用酸除去的用于保护氨基的保护基。使所得的活化酯1a和1b与1，2-二氢-3H-吡咯吲哚-7-羧酸甲酯(亦可根据文献合成，参见D.L.Boger、R.S.Coleman和B.J.Invergo，J.Org.Chem.，1987，52：1521-1530)反应，得二肽2a和2c。再用碱处理去掉羧基官能团中的甲基以得到有游离羧基的二肽。该二肽用四氟苯酚再次活化得活化酯(当R＝CONH2，TFP-CDPI2时为2e；当R＝tBoc，TFP-tBoc-CDPI2时为2f)，在经TFP-TFA活化后，该二肽活化酯可与ODN结合形成ODN-MGB轭合物，其合成见三肽。该二肽的活化酯也可与另一分子1，2-二氢-3H-吡咯并吲哚-7-羧酸甲酯反应，得到三肽(其羧基通过甲酯保护)3a(3-氨甲酰基-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸甲酯三肽)。所述的甲基用碱水解除去，使所得的三肽3b经四氟苯酚活化得活化的四氟苯酯3c(3-氨甲酰基-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸-2，3，5，6-四氟苯酯三聚体，TFP-CDDI3)。通过重复上述步骤，活化的四氟苯酯3c可用来进一步使肽链延长，即通过与1，2-二氢-3H-吡咯并吲哚-7-羧酸甲酯反应，使所得的甲酯皂化，并如果需要再与TFP-TFA反应，得到掺入了4个CDP[的肽的活化四氟苯酯。因此，很容易理解，可进一步重复这些步骤，直至得到含有所需数目CDPI单体的寡肽。在本文所述的优选实施方案中，三肽3c的四氟苯基活化酯用来与ODN偶联得ODN-MGB轭合物，或者在适当修饰的CPG(控制孔径的玻璃)固相载体上合成ODN-MGB共轭物，这一过程结合反应路线4和5描述于下文。反应路线1表明其最后步骤是从三肽3c的四氟苯基活化酯(TFP-CDPI3)制备羟基丙基胺衍生物的步骤。三肽3d的羟基丙胺衍生物3d(3-氨基甲酰基-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羰基-1-酰氨基-3-丙醇三聚体，CDPI3-3-羟基丙胺)可用来与ODN结合得到本发明的ODN-MGB。然而，该三肽3d还可作为游离的小沟结合剂在下文描述的某些结合研究中用作对照。
Figure A20041005589700321
Figure A20041005589700331
                      反应路线2
反应路线2公开了另一优选的小沟结合剂(肽)的合成路线，其中的单体为4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸残基，而且这个肽含有信息基团/含苯偶氮基。这样，在N，N-二环己基碳二亚胺存在下，6-[(叔丁氧基)甲酰氨基]己酸与2-[4-(苯偶氮基)-苄基硫]乙醇缩合得到化合物11(5-[(叔丁氧基)甲酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)苄基硫)乙酯)。用三氟乙酸(TFA)将化合物11中的保护基tBoc脱去，所得的有游离氨基的化合物与受tBoc保护的4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸的活化酯反应。所述的活化酯化合物(1，2，3-苯并三唑-1-基1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基-吡咯-2-羧酸酯)可由1-甲基-4-[(叔丁氧基)甲酰氮基]吡咯-2-羧酸制得，后者可根据文献方法(L.Grehn，V.Ragnarsson，J.Org.Chem.，1981，46，3492-3497)得到。反应得到的化合物12(5-[1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)苄基硫]乙酯)含有一个2-氨基-N-甲基吡咯羧酸残基，该残基上连有含有苯偶氮基的信息基团。用三氟乙酸除去保护基tBoc后，再与一分子或多分子的1-甲基-4-叔丁氧基甲酰氨基-吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯进行偶联反应，直至得到含所需数目残基的寡聚肽。这样具有n个单体残基及1个游离氨基的化合物在反应路线2中如图16a所示。16a可与受tBoc保护的6-氨基己酸的活化酯(如1，2，3-苯并三唑-1基活化酯)反应，得到如反应路线2中以16b所示的寡肽。可在酸性条件下除去16b中的tBoc保护基，并可将所得的具游离氨基的衍生物，通过传统合成方法与ODN的3′-磷或5′-磷酸相连。此外，具游离氨基的该衍生物还可通过双官能连接基(如上文所述)与寡核苷酸的3′或5′-羟基相连。
Figure A20041005589700341
                        反应路线3
反应路线3描述的是以3′-氨基或5′-氨基为末端的寡核苷酸与四氟苯基(TFP)酯活化的小沟结合(寡)肽相偶联的一般方法。虽然在该图中显示的是根据反应路线1得到的以TFP活化的小沟结合化合物的使用，但应记住这个一般方法也适用于其它的四氟苯基活化的小沟结合剂与ODN的偶连。反应路线3中的标号1a～3c指的是按反应路线1制备的示例化合物。
3′-或5′-端氨基为末端的寡核苷酸可通过常规方法合成；例如氨基己基通过可商购的N-甲氧基三苯甲基氨基己基亚磷酰胺与ODN的任何一端连接。此外，以氨基为末端的ODN也可根据1993年7月12日申请的申请号为08/090,408(已批准授权且公布费已付)所公开的方法合成。该专利申请的说明书的内容引入本文作参考。根据本合成路线，将以氨基为末端的ODN转化为十六烷基三甲铵盐，以使其可溶于有机溶剂，再使其与四氟苯基酯活化的小沟结合剂缩合，反应最好以DMSO为溶剂。
Figure A20041005589700351
                         反应路线4
反应路线4公开的是以5′-氨基为末端的寡核苷酸与小沟结合剂的活化酯偶联的另一方法。该图中的例子是自3-氨基甲酰基-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸残基衍生的三肽的四氟苯酯(TFP-CDPI3)，但应该明白这个结合本反应路线公开的一般原理也适用于其它小沟结合剂。在该方法中，ODN仍然与CPG载体相连，并且在其氨基末端有游离氨基。可通过上面提到的N-甲氧基三苯甲基氨基己基亚磷酰胺得到，在该磷酰胺偶合后，脱去其中的甲氧基三苯甲基以得到结合在CPG上以氨基为末端的ODN。此外，这个连有CPG的化合物还可按上文提到的专利申请No.08/090,408及其引用的文献所公开的方法合成。顺便总结一下，逐步合成与CPG载体偶联的ODN，该ODN带有末端氨基，该氨基是以9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护的。当所需的寡核苷酸合成完毕后，脱去Fmoc，这时ODN仍然与CPG载体相连。根据本发明的反应路线4，使带有游离氨基结合在CPG上以氨基为末端的ODN与活化酯(TFP-CDPI3，3c)或类似的小沟结合剂活化酯缩合。此后通过常规方法(最经常用氨处理)，将ODN-MGB轭合物从CPG载体上脱下。
Figure A20041005589700361
a试剂：(a)TFD-TFA、三乙胺、CH2Cl2；(b)3-氨基-1，2-丙二醇、CH2Cl2；(c)DMTrCl、吡啶；(d)琥珀酸酐、N-甲基咪唑、CH2Cl2、TFP-TFA；(e)烷基胺CPG、吡啶；(f)哌啶、DMF；(g)TFP-CDPI3(反应路线1中的3c)、DMF
                       反应路线5
反应路线5所示的是合成本发明的ODN-MGB轭合物的另一优选方法。具体地讲，该法是先把连接分子与CPG载体相连，然后再把活化的小沟结合剂与连接分子相连，用自动ODN合成仪，以刚才述及的修饰的CPG为载体，逐步合成所需序列的寡核苷酸。仅当完成了所需序列的ODN部分的合成后，才从CPG载体上脱下ODN-MGB轭合物。这里的连接分子为三官能团，每个官能团具有不同的反应活性，一个与CPG载体相连，另一个与活化的小沟结合基反应，第三个则用于ODN的合成。有关这个合成方法和可用于该方法内的三官能连接分子的更一般的详细描述见于申请号为08/090,408的申请中，但该申请未涉及小沟结合剂。在反应路线5所示的合成方法中，以β-丙氨酰基-3-氨基-1，2-丙二醇作为三官能连接分子，以TFP-CDPI3为活化的小沟结合剂。
这样根据反应路线5，Fmoc保护的β-丙氨酸与三氟乙酸四氟苯酯(TFP-TFA)反应以得到3-[N-(9-芴基甲氧基羰基)]氨基丙酸2，3，5，6-四氟苯酯(4)。活化酯4与3-氨基-1，2-丙二醇反应得到1-[3-[N-(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基-(R，S)-2，3-丙二醇(5)。此后，化合物5的伯羟基用二甲氧基三苯甲基保护，得到1-[3-[N-(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基-(R，S)-2-[[二(甲氧基苯基)苯基甲氧基]甲基]2-乙醇(6)。化合物6的仲羟基与琥珀酸酐反应，此后将所得化合物中的羧基转化为活化酯1-[3-[N-(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基-(R，S)-2-[[二(甲氧基苯基)苯基甲氧基]甲基]-2-乙基丁二酸2，3，5，6-四氟苯酯(7)。然后使化合物7与长链氨基烷基-CPG(LCAA-CPG或烷基氨基CPG)相连(后者可自市售购得并在申请号为08/090,408的专利申请中已有描述)。得到的“经修饰的CPG”以化合物8示于反应路线5中。用中性碱(溶于二甲基甲酰胺中的哌啶)脱去保护基Fmoc得到经修饰的CPG(9)，该化合物9含有作为连接剂的一部分的游离的伯胺基。下一步，使活化的小沟结合剂(这里为TFP-CDPI3，化合物3c)与化合物9的伯氨基反应，得修饰的CPG(10)，后者含有小沟结合基和用二甲氧基三苯甲基保护的连接基的伯羟基。在接下来的步骤中(虽然这些反应步骤未在反应路线5中示出)，二甲氧基三苯甲基被除去，ODN的合成用自动合成仪按现认为是本领域常规方法的方法进行。合成完毕后，用氨将ODN-MGB轭合物从CPG载体上脱下。这时连接3-氨基-1，2-丙二醇的仲羟基与CPG载体的键断裂。
生物学试验与结果讨论
ODN-MGB轭合物能与单链DNA结合。在重组酶作用下它们也能与双链DNA结合，并且在某些情况下还能与单链RNA及DNA和RNA的杂交体结合。但只有ODN与靶DNA或RNA的靶序列按Watson-Crick规则互补或基本上互补时，才发生这种结合。满足这一条件后，ODN-MGB轭合物与靶序列的结合明显强于无MGB与之结合的同样的ODN与靶序列的结合。这些可用下面的生物学试验来证实，这些使得本发明的ODN-MGB轭合物可作为靶DNA或RNA序列的分析和诊断杂交探针，也可用作反义核酸和反义基因治疗剂。
                         表1
(dAP)8+(dTp)8双链螺旋体的熔化温度(Tm)的数据a，表中双链螺体寡核苷酸的3′端连有嵌入剂或寡聚(1-甲基-2-羧基-4-氨基)吡咯残基。
复合物     Tm     ΔTm b
(dAP)8+(dTp)8     21.1     -
(dAP)8+(dTp)8+偏端霉素Ac     47.1     26.0
(dAP)8+(dTp)8-Xm m＝2     39.4     18.3
                     m＝3     51.7     30.6
                     m＝4     60.2     39.1
                     m＝5     65.4     44.3
(dTP)8+(dAp)8-Xm m＝2     29.1     8.0
                     m＝3     39.0     17.9
                     m＝4     42.7     21.6
                     m＝5     52.6     31.5
(dAP)8-Y+(dTp)8     30.5     9.4
(dAP)8-Y+(dTp)8-Yd     42.9     21.8
a参数为至少三次实验的平均值。双链螺旋体在0.2M NaCl、0.1mM EDTA、0.01M(±0.1℃)Na2HPO4，pH7.0的缓冲液中熔化，(dTP)8·(dAP)8的浓度为2.5×10-5M。
b修饰和未修饰双链螺旋体的熔化温度的差值(ΔTm)
c偏端霉素的浓度为2.5×10-5M
d ODN的3′磷酸酯通过β-丙氨酸接头与溴乙锭的8-氨基连接，方法参考文献12。
表1列出了几种互补寡核苷酸所形成的复合物的熔化温度，所述的寡核苷酸连有小沟结合基，后者是自4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸残基衍生而来，该小沟结合基具体地以表1下面的结构式X表示。需要指出，X还包括自6-氨基己酸衍生的连接基。此处使用的寡核苷酸为八聚2′-脱氧腺苷酸和8-聚2′-脱氧胸苷酸。小沟结合基(X)与寡核苷酸3′-磷酸酯端相连，这些ODN的5′端无磷酸酯。关于这一点，须指出的是本表(包括其它表)中的寡核苷酸按本领域的习惯方式缩写。基团Y表示通过“β-丙氨基”连接基与3′-磷酯相连的溴乙锭部分。Y代表嵌入基，作为与小沟结合基比较时的对照。m表示存在于表中的各ODN-MGB中的4-氨基-N-甲基-吡咯-2-羧酸残基的数目。
正如本领域所公知的，寡核苷酸或多聚核苷酸双链螺旋体的熔化温度(Tm)定义为50％的寡核苷酸或多聚核苷酸自其双链螺旋体(WatsonCrick氢键型)解离时的温度。熔化温度越高则意味着双链螺旋体愈稳定。此外，还已知寡核苷酸和多聚核苷酸的Tm还依赖于寡核苷酸在测熔化温度溶液中的浓度，浓度高，则测得的熔化温度也高。这些表中所列的Tm是在表中或实验部分所指出的条件下测定的。ΔTm表示修饰的双链螺旋体的熔化温度与未与小沟结合基结合的(dAp)8·(dTp)8复合物的熔化温度的差值。
从表1可以发现，共价结合的小沟结合基显著增加了双链复合体的稳定性(熔化温度Tm升高)，这里小沟结合基(X)与(dTp)8或(dAp)8寡核苷酸相连。这种情况下，当小沟结合基是5肽时，稳定程度达到最大(熔化温度最高)。在比较试验中，当嵌入基Y与(dAp)8寡核苷酸结合时，则稳定程度相对地小得多。在该试验中，甚至当嵌入基Y与寡聚体的两条链同时连接时，熔化温度的增加也比连有5个4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸残基的小沟结合基要小。
                           表2
由十六聚或八聚胸苷酸和带有寡聚脱氧腺苷酸的寡聚(1-甲基-2-羧基-4-氨基)吡咯衍生物所形成的双链螺旋体的熔化温度(Tm)数据，该温度是在0.2M NaCl、0.01M Na2HPO4、0.1MEDTA(pH7.0)中测定的。X的定义与表1中的相同。
寡核苷酸衍生物     Tm℃     ΔTm℃
(dTp)16     48.5     -
(dTp)16-NH(CH2)6COOH     49     0.5
(dTp)16-X m＝1     49.3     0.8
           m＝2     55.6     7.1
           m＝3     61     12.5
           m＝4     66     17.5
           m＝5     68     19.5
(dTp)8     28     -
(dTp)8-X  m＝1     28     0
           m＝2     40     12
           m＝3     52     24
           m＝4     60     32
           m＝5     66     38
表2公开信息的方式与表1类似。在本表报导的试验中，使带有小沟结合基(用X表示，同表1中的X)的16-聚胸苷酸与多聚脱氧腺苷酸形成复合物。作为对照，对在其3′-磷酸酯端与6-氨基己酸相连的16聚胸苷酸(dTp)16也进行了测验。此外，还对8聚胸苷酸(dTp)8及其与具有不同长度肽链的小沟结合基所形成的轭合物进行了实验。在这些实验中，与ODN相连的小沟结合剂也显著增加了ODN-MGB与互补DNA链所形成的复合物的稳定性。当小沟结合基内的4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸残基的数目为5个时，则复合物最稳定。相反，16聚ODN上的氨酸己酸尾巴，实际上不能增加复合物的稳定性。
                         表3
由poly(Tp)8或poly(rA)与末端连有配体CDPI1-3或BocDPI1-2的(Tp)8所形成的双链螺旋体的熔化温度a。
八聚胸苷酸衍生物        poly(dA)         poly(rA)
    Tm     ΔTm     Tm     ΔTm
(dTp)7dTp-L1     25     -     13     -
(dTp)7dTp-L1-X    m＝1     34     9     18     5
(dTp)7dTp-L1-X    m＝2     50     25     -b     -
(dTp)7dTp-L1-X    m＝3     68(65)     43(40)     32(31)     19(18)
(dTp)7dTp-L1-Y    m＝1     26     1     12     -1
(dTp)7dTp-L1-Y    m＝2     43     18     17     4
L1-pdT(pdT)7     24     -     12     -
X-L1-pdT(pdT)7    m＝1     31     7     14     2
X-L1-pdT(pdT)7    m＝2     49     25     -b     -
X-L1-pdT(pdT)7    m＝3     68     44     35     23
Y-L1-pdT(pdT)7    m＝1     23     -1     9     -3
Y-L1-pdT(pdT)7    m＝2     41     17     19     7
a括号内的数据是带有接头L2的该衍生物测得的。
b没观察到熔化转变。
L1＝-O(CH2)6NH-    L2＝-OCH2CH(OH)CH2NHCOCH2CH2NH-
表3公开的是熔化温度(Tm)和熔化温度差值(ΔTm)，这里寡核苷酸是八聚胸苷酸，并有一个小沟结合基与它的5′-磷酸酯或3′-磷酸酯端相连(如表3所示)。此处小沟结合基用X表示，Y是基于1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸(CDPI或BocDPI)残基的寡肽，其结构见表3。这些小沟连接肽(基)通过连接基“L1或L2”与ODN相连，L1和L2的结构见表下面。对该ODN-MGB轭合物与互补的均聚核苷酸或均聚脱氧核苷酸进行温育。这样对含有聚胸苷酸的ODN-MGB轭合物，使用聚腺苷酸或聚脱氧腺苷酸与之结合。熔化温度的变化(ΔTm)是复合物的熔化温度相对于在ODN的相应末端带有连接基L1或L2但不含小沟结合基的相应的ODN的熔化温度的差值。从表3可以发现，这些ODN-MGB复合物再次显示出带有互补的均聚脱氧核苷酸的复合物有显著的稳定性。而且在这些实验中，当小沟结合基具有3个CDPI单位时，形成的复合物最稳定。令人惊异的是甚至当ODN-MGB和能与之互补结合的均聚核苷酸保温时，也发生复合物的稳定作用。这种吃惊是因为现有技术普遍认为游离小沟结合分子并不与DNA-RNA杂交体结合之故。
                                           表4
异源双链螺旋体的熔化温度(Tm)，其中ODN的连接骨架为磷酸二酯和硫代磷酸酯链，吡咯并吲哚甲酰胺寡肽残基与ODN的不同部位连接a。
CpApTpCpCpGpCpT   洐生物                       ApGpCpGpGpApTpG                               衍生物
骨架链类型 末端修饰类型                       DNA                     2′-DNA PSa
    3′-L1-   3′L2-X     5′-X-L1-     3′-L2-X&5′-X-L1-     无b     5′-X-L1-   3′-L2-X
DNA 3′-L1-     41     52     45     50     33     27     40
3′-L2-X     57     81     78     77     50     73     77
5′-X-L1-     58     79     76     76     49     70     75
3′-L2-X5′-X-L1-     60     72     -     65     -     -     -
2′-DNA PSc 无b     32     43     32     -     24     16     28
5′-X-L1     38     69     67     -     28     62     63
3′-L2-X     45     74     71     -     36     64     69
a ODN在140mM KCl、10mM MgCl2、20mM HEPES-HCl(pH7.2)熔化混合物中的浓度是2×10-6M
b ODN有游离3′-和5′-OH
c PS为硫化磷酸酯连接
L1＝-O(CH2)6NH-    L2＝-OCH2CH(OH)CH2NHCOCH2CH2NH-
表4公开的是两个互补的八聚体衍生物(CpApTpCpCpGpCpT和ApGpCpGpGpApTpG)之间形成双链螺旋体的研究结果。每个八聚体均被修饰(如该表所示)以检验相应的寡聚脱氧核苷酸和有硫代磷酸酯骨架的寡聚脱氧核苷酸的杂交。该ODN仍然带有基于1，2-二氢-3H-吡咯[3，2-e]吲哚-7-羧酸(CDPI)残基的三肽(小沟结合基X)，该X通过结构为L1或L2的连接基与ODN的3′-或5′-端(如图所示)相连，(X、L1、L2的结构同表3中的)。为了对照，还测定了其中的ODN仅与连接基结合的双链螺旋体的熔化温度，从表中可以发现，小沟结合基的存在使双链螺旋体明显得以稳定，而且如每条链均共价连有小沟结合基时，则双链螺旋体更稳定。
                          表5
带有3′-寡聚吡咯并吲哚甲酰胺的寡肽残基的异源双链螺旋体的Tm。
      互补的ODN        d(AGCGGATG)p        d(AICIIATI)p
 3′-L1- 3′-L2-X  3′-L1- 3′-L1-X
d(CATCCGCT)p 3′-L1-     41     52     11     -
3′-L2-X     57     81     48     67
d(CATCCICT)p 3′-L1-     31     48     0     41
3′-L1-X     54     79     48     63
L1＝-O(CH2)gNH-    L2＝-OCH2CH(OH)CH2NHCOCH2CH2NH-
表5公开的是互补或大体互补的ODN进行温育并检验双链螺旋体形成时所获得的熔化温度。小沟结合基X和连接基L1和L2均示于该表中，而且它们均与表3、表4中的相同。象预料的那样，如果没有小沟结合基存在的话，当ODN链中的鸟嘌呤(G)被次黄嘌呤(I)取代时，双链螺旋体的结合很弱(Tm约为0℃)。然而，当用I取代寡核苷酸中的G时，一个共价连接的小沟结合基X的存在则使杂交体的稳定性(Tm)增加至约50℃，而以相互平行方向存在的两个小沟结合基，则使稳定性(Tm)增加至约63℃。而对含有鸟嘌呤的相同的链而言，一个小沟结合基使Tm增加15℃，两个则增加近45℃。就本案发明人所知，八聚核苷酸的熔化温度达到81℃是现有技术中从未有过的。
引物延长实验
ODN-MGB轭合物中的ODN部分与靶序列按Watson-Crick规则结合的序列特异性可通过引物延长实验来证实。在这个实验中，在T7DNA聚合酶的作用下，引物从模板的5′-端开始延长。将与模板链的靶序列按Watson-Crick互补的16聚核苷酸-小沟结合剂轭合物、T7DNA聚合酶和长的单链DNA模板一起温度。当小沟结合基与上述16聚ODN的5′-端相连时，则会发现引物延长终止于ODN-MGB与模板的结合部位，所述的小沟结合剂为吡咯并吲哚的三肽，如表5所示。但当16聚核苷酸与靶序列有一个错配碱基时，引物延长则不受阻碍。当小沟结合基与16聚ODN的3′-端相连时，也不影响引物延长。此外，在序列特异的16聚核苷酸、游离小沟结合剂(化合物3d，未与ODN共价结合)与酶和模板一起温育时，引物延长也不受影响。这些实验表明：ODN-MGB的序列特异性对于形成稳定的杂交体是重要的，小沟结合基也不单单只作为所述ODN与另一链非特异性结合的稳定剂(anchor)。ODN-MGB轭合物抑制引物延长的能力表明该ODN-MGB轭合物可作为PCR终止剂而用于诊断(见核酸研究(Nucleic Acid Research)，1993，21：5332-5336)。
狭缝印迹杂交试验
本发明的ODN-MGB轭合物可作为杂交探针。这可用下面的实验证实，实验中使用32P标记的ODN-MGB轭合物作诊断探针。与没有小沟结合基与之共价结合的同一ODN比较，该轭合物与互补链杂交的强度大，效率高，特异性高。狭缝印迹杂交试验是一个广泛应用的DNA探针诊断试验。ODN-MGB轭合物的这些性质改善了该分析的性能。
具体地讲，本文所述的实验其实验操作方法遵循标准的操作方法，如按Protoc als for Nucleic Acid Blotting and hybridization(1988，Amersham，United Kingdom)所述的方法进行。对与固定化质粒杂交的被标记的受试寡核苷酸(ODN)以每分钟计数进行定量，对杂交温度绘图。实验评价了四个与M13mp19 DNA(噬菌体DNA)互补的16聚寡核苷酸探针。其中的两个探针与噬菌体DNA某部位完全互补；一个含有3′共价结合的CDPI3而另一个未被修饰。第二对探针也与M13mp19 DNA的同一部位配对，但各有一个错误配对的碱基(图1中下划线碱基)。同样，一个ODN含有3′端结合的CDPI3，而另一个未被修饰。
狭缝杂交研究的结果如图1所示。与未修饰但序列相同的16聚核苷酸比较，含CDPI3的探针形成的杂交体熔化温度为50℃，不含CDPI3的则仅为33℃。这个较高的熔化温度使完全配对的杂交体的产率增加1倍多。当探针中有错误配对的碱基时，则相应杂交体的稳定性降低。CDPI3修饰的探针在37-50℃之间表现出高的序列分辨能力。而且，在这些杂交条件下没有证据表明CDPI3与靶M13mp19 DNA的预先已存在的双链区结合，这意味着这些轭合物完全的非持异性结合是不存在的。
培养的人细胞中基因的序列特异性烷基化作用
本发明的ODN-MGB轭合物(该轭合物上还共价连有烷化剂)可作为“反义基因”试剂，也就是如果ODN-MGB轭合物与靶基因内的靶序列互补，就可抑制非所需基因(致病基因)的表达。在这种情况下，MGB可提高ODN与双链DNA(gene)的结合力(在重组酶存在下)，而烷化基则使ODN-MGB轭合物与靶序列形成持久共价结合。
在验证性实验中，上面提到的五十聚核苷酸(经氮芥基(苯丁酸氮芥)修饰且3′端与CDPI3结合)序列特异性地与靶基因内的预期部位交联，这个靶基因(HLA DQ β10302等位基因)存在于活的人BSM细胞(一种人B-淋巴细胞系)中。把ODN-MGB轭合物加到BSM细胞悬浮液中，该轭合物最终浓度为1-50μM。3.5小时后，提取基因组DNA用热四氢吡咯处理，以使任何烷基化部位产生缺口。在0302等位基因靶区域的下游通过LM-PCR(聚合酶介导的连接链反应)扩增，LM-PCR这项技术是可用来检测断裂事件、分辨率达一个碱基的技术。产物经测序凝胶电泳分析表明修饰的ODN已经与靶部位结合并烷化在一起。而无CDPI3的类似ODN对靶DNA的烷化效率很小。
在上面的实验中，ODN-MGB轭合物对同源双链DNA的识别和结合可能是在核重组酶的参与下进行的。在类似实验和应用中，在其它活细胞中，内源性重组酶能催化ODN-CDPI3轭合物与双链基因组DNA间的序列特异性的靶向结合。当这些ODN有与之相连的交联剂时，它们能烷化靶DNA。在重组酶作用下，通过稳定所形成的D-环，CDPI3促进交联反应。交联是靶基因表达的强抑制剂。因此，交联的ODN-CDPI3轭合物可用作反义基因试剂。
具体的实施方案与实验部分
材料与方法
对空气及水敏感的反应均在氩气的微正压下进行。无水溶剂购自Aldrich公司(Milwaukee，WI)。闪式柱层析使用硅胶(230-400目)。熔点未经校正并采用Mel-Temp熔点仪测定。元素分析由定量技术公司(Boundbrook，NJ)完成。在200-400nm范围内的紫外-可见光吸收光谱用UV-2100(Shimadzu)或Lambda2(Perkin Elmer)分光光度计记录。核磁共振氢谱(1H NMR)用Bruker WP-200型光谱仪或Varian XL-200型分光光度计在20℃下测定；化学位移在ppm低磁场下，以四甲基硅为内标进行测定。
3-氨基甲酰-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸2，3，5，6-四氟苯酯(1a)。将3-氨基甲酰-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸(1.4g，6.1mmol，D.L.Boger，R.S.Coleman，B.J.Invergo，J.Org.Chem.，1987，52：1521-1530)和三乙胺(1.4ml，10mmol)溶解在15ml无水DMF中。向该溶液中滴加三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯酯(2.6g，10mmol，H.B.Gamper，M.W.Reed，T.Cox，J.S.Virosco，A.D.Adams，A.A.Gall，J.K.Scholler和R.B.Meyer，Jr.，Nucleic Acids Res.，1993，21(1)：145-150)。加毕，1小时后，减压(0.2mm真空)浓缩反应混合物。残留物用无水二氯甲烷2ml研制，加入50ml乙醚，混合物在0℃放置过夜，用多孔玻璃漏斗过滤收集沉淀，沉淀用50％乙醚/二氯甲烷(10ml)，乙醚(50ml)依次洗涤，真空干燥，得黄色固体1.8g(75％)：
1H NMR(Me2SO-d6，200MHz，ppm)12.32(s，1H，NH)，8.13(d，1H，J＝9Hz，C4-H)，8.01(m，1H，C6F4H)，7.41(s，1H，C8-H)，7.26(d，1H，J＝9Hz，C5-H)，6.17(s，2H，CONH2)，3.99(t，2H，J＝9Hz，NCH2CH2)，3.30(t，2H，J＝9Hz，NCH2CH2).C18H11N3O3F4×2H2O的理论值：C，50.3；H，3.52；N，9.7.实测值：C，50.81；H，3.60；N，9.95.
3-叔丁氧基羰基-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸2，3，5，6-四氟苯酯(1b)。将3-叔丁氧基羰基-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸(1.0g，3.7mmol，D.L.Boger，R.S.Coleman和B.J.Invergo，J.Org.Chem.，1987，52：1521-1530)和三乙胺(1.5ml，10mmol)溶解在10ml无水二氯甲烷中。向该溶液中滴加三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯酯(2.6g，10mmol)。反应4小时，然后减压蒸除CH2Cl2，残留物经闪式柱层析(4×20cm，正己烷-乙酸乙酯1∶2)得黄色晶体(1b)1.25g(75％)：
1H NMR(Me2SO- d 6，200MHz，ppm)12.39(d，1H，J＝1.4Hz，NH)，8.02(m，1H，C6F4H)，7.9(br s，1H，C4-H)，7.45(d，1H，J＝1.4Hz，C8-H)，7.33(d，1H，J＝9Hz，C5-H)，4.02(t，2H，J＝9Hz，NCH2CH2)，3.26(t，2H，J＝9Hz，NCH2CH2)，1.51(s，9H，C(CH3)3).C22H18N2O4F4的理论值：C，58.67；H，4.03；N，6.22.Found：C，58.45；H，4.09；N，6.13.
3-氨基甲酰基-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸二聚体甲酯(2a)。1，2-二氢-3H-吡咯并吲哚-7-羧酸甲酯(0.6g，1.5mmol)、化合物1a(0.45g，2.25mmol)和三乙胺(0.2ml，1.4mmol)溶解在10ml DMF中。使该溶液于室温反应24小时，然后在0℃反应12小时。过滤收集所得的不溶固体，并用DMF(10ml)、乙醚(20ml)洗涤，真空干燥得浅黄色固体2a(0.61g，91％)(1H NMR(Me2SO- d 6，200MHz，ppm)12.00(d，1H，J＝1.8Hz，NH′)，11.54(s，1H，NH)，8.28(d，1H，J＝9Hz，C4′-H)，7.97(d，1H，J＝9Hz，C4-H)，7.33(d，1H，J＝9z，C5′-H)，7.22(d，1H，J＝9z，C5-H)，7.13(d，1H，J＝1.4Hz，C8′-H)，6.94(d，1H，J＝1.1Hz，C8-H)，6.01(s，2H，CONH2)，4.62(t，2H，J＝8Hz，(NH2CH2)′)，3.98(t，2H，J＝8Hz，NCH2CH2)，3.88(s，3H，CH3)，3.41(t，2H，J＝8Hz，(NCH2CH2)′)，3.29(t，2H，NCH2CH2，因水使之部分变模糊).C24H21N5O5×1H2O×1DMF的理论值：C，58.69；H，5.84；N，15.21.Found：C，58.93；H，5.76；N，15.82.
3-叔丁氧基羰基-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸二聚体甲酯(2c)。将1，2-二氢-3H-吡咯吲哚-7-羧酸甲酯(0.5g，2.5mmol)、化合物1b(1.0g，2.2mmol)和三乙胺溶解在无水二甲基甲酰胺(DMF)中。使该溶液在室温反应10小时，在0℃反应12小时。过滤收集所得的不溶固体，用DMF(5ml)、乙醚(40ml)洗涤之。真空干燥得灰白色的固体2c 0.81g(74％)。
1H NMR(Me2SO- d 6，200MHz，ppm)12.01(s，1H，NH′)，11.64(s，1H，NH)，8.28(d，1H，J＝9Hz，C4′-H)，7.8(br s，1H，C4-H)，7.32(apparent t，2H，C5′-H+C5-H)，7.13(d，1H，J＝1.1Hz，C8′-H)，6.98(d，1H，J＝1.1Hz，C8-H)，4.62(t，2H，J＝8Hz，(NH2CH2)′)，4.02(t，2H，J＝8Hz，NCH2CH2)，3.88(s，3H，CH3)，3.41(t，2H，J＝8Hz，(NCH2CH2)′)，3.25(t，2H，NCH2CH2)，1.52(s，9H，C(CH3)).C28H28N4O5的理论值：C，67.19；H，5.64；N，11.19.实测值：66.72，H，5.69；N，11.31.
3-氨甲酰基-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸二聚体2，3，5，6-四氟苯酯(2e)。将化合物2b(1.2g，2.8mmol，D.L.Boge-r，R.S.Coleman和B.J.Invergo，J.Org.Chem.，1987，52：1521-1530)加入15ml无水二甲基甲酰胺(DMF)中，得悬浊液。滴加三氟乙酸四氟苯酯(2.0g，10mmol)至该悬浊液中，接着加入三乙胺(1.4ml，10mmol)，对反应混合物搅拌3小时。用旋转蒸发器减压)(0.2mm真空)浓缩反应混合物。所得的残留物用20ml无水二氯甲烷研制。所得的产物经过滤，依次用二氯甲烷(10ml)、乙醚(20ml)洗涤。真空干燥得黄色固体2e 1.5g(93％)：(1HNMR(Me2SO- d 6，200MHz，ppm)12.51(d，1H，J＝1.8Hz，NH′)，11.58(s，1H，NH)，8.39(d，1H，J＝8.9Hz，C4′-H)，8.04(m，1H，C6F4H)，7.98(d，1H，J＝8.8Hz，C4-H)，7.58(s，1H，C8′)，7.42(d，1H，J＝9Hz，C5′-H)，7.22(d，1H，J＝9Hz，C5-H)，6.98(s，1H，C8-H)，6.11(s，2H，CONH2)，4.66(t，2H，J＝7.8Hz，(NCH2CH2)′)，3.94(t，2H，J＝9.1Hz，NCH2CH2)，3.47(t，2H，J＝8Hz，(NCH2CH2)′)，3.29(t，2H，J＝9.1Hz，NCH2CH2).C29H19N5O4F4×1.5H2O的理论值：C，57.62；H，3.67；N，11.59.实测值：C，57.18；H，3.31；N，11.54.
3-叔丁氧基羰基-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸二聚体2，3，5，6-四氟苯酯(2f)。将化合物2d(0.25g，0.5mmol，D.C.Boger，R.S.Coleman和B.J.Invergo，J.Org.Chem.，1987，52：1521-1530)和三乙胺(0.5ml，3.5mmol)加入8ml无水二氯甲烷和2ml二甲基甲酰胺的混合物中，得悬浮液。向该悬浮液中滴加三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯酯(0.75g，2.9mmol)。对混合物搅拌20小时，所得透明溶液在真空中浓缩，并将残余物滴加至40ml 1M乙酸钠(pH7.5)中。对沉淀物离心，并依次用水(2×40ml)、10％甲醇/乙醚2×40ml)、乙醚(40ml)、正己烷(40ml)洗涤。最后真空干燥得浅黄色固体2f0.2g(91％)。
                          (1H NMR(Me2SO- d 6，200MHz，ppm)12.51(s，1H，NH′)，11.66(s，1H，NH)，8.37(d，1H，J＝8.8Hz，C4′-H)，8.03(m，1H，C6F4H)，7.8(brs，1H，C4-H)，7.58(s，1H，C8′-H)，7.40(d，1H，J＝9.1Hz，C5′-H)，7.27(d，1H，J＝8.6Hz，C5-H)，7.1(s，1H，C8-H)，4.65(t，2H，J＝8Hz，(NCH2CH2)′)，4.02(t，2H，J＝9Hz，NCH2CH2)，3.46(t，2H，J＝8Hz，(NCH2CH2)′)，3.25(t，2H，J＝8.9Hz，NCH2CH2)，1.51(s，9H，C(CH3)3).
C33H26N4O5F4×0.5H2O的理论值：C，61.59；H，4.23；N，8.71.实测值：C，61.73；H，4.12；N，8.61.
3-氨基甲酰基-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸三聚体甲酯(3a)。将1，2-二氢-3H-吡咯并吲哚-7-羧酸甲酯(1.0g，5mmol)、化合物2e(1.2g，2.1mmol)和三乙胺(0.1ml，mmol)溶于15ml无水DMF中。使该溶液于室温反应24小时，在0℃反应12小时。过滤收集所得的不溶固体，并依次用DMF(10ml)、CH2Cl2(20ml)和乙醚(20ml)洗涤之。真空干燥得浅黄色固体3a1.1g(83％)。
           (1H NMR(Me2SO- d 6，200MHz，ppm)12.02(s，1H，NH″)，11.75(s，1H，NH′)，11.56(s，1H，NH)，8.28(apparent t，2H，J＝8.3Hz，C4-H″+C4′-H)，7.98(d，1H，J＝9.4Hz，C4-H)，7.98(d，1H，J＝9Hz，C4-H)，7.39-7.33(2d，2H，C5″-H+C5′-H)，7.23(d，1H，J＝8.7Hz，C5-H)，7.14(d，1H，J＝1.6Hz，C8″-H)，7.10(d，1H，J＝1Hz，C8′-H)，6.97(s，1H，C8-H)，6.11(s，2H，CONH2)，4.65(t，4H，(NCH2CH2)″+(NCH2CH2)′)，3.98(t，2H，J＝8.7Hz，NCH2CH2)，3.88(s，3H，CH3)，3.48-3.25(m，6H，(NCH2CH2)″+(NCH2CH2)′+NCH2CH2，因水使之部分变模糊).C35H29N7O5×4.5H2O的理论值：C，59.32；H，5.0；N，13.03.实测值：C，58.9；N，5.06；N，13.77.
3-氨基甲酰基-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸三聚体2，3，5，6-四氟苯酯(3c)。化合物3b(1.1g，1.8mmol)在15ml无水MDF和三乙胺(1.4ml，10mmol)中形成悬浮液。向该悬浮液中滴加三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯酯(2.6g，10mmol)。对所得的混合物搅拌3小时。混合物减压(0.2mm真空)浓缩。用无水二氯甲烷(20ml)和甲醇(2ml)的混合物研制所得的残留物。过滤收集所得的产物，用CH2Cl2(20ml)、乙醚(20ml)洗涤之。真空干燥得黄绿色固体3c 1.3g(95％)。
(1H NMR(Me2SO- d 6，200MHz，ppm)12.54(d，1H，J＝1Hz，NH″)，11.79(s，1H，NH′)，11.56(s，1H，NH)，8.41(d，1H，J＝9.3Hz，C4-H″)，8.27(d，1H，J＝9.4Hz，C4′-H)，8.03(m，1H，C6F4H)，7.98(d，1H，J＝9Hz，C4-H)，7.56(s，1H，C8″-H)，7.45-7.35(m，2H，C5″-H+C5′-H)，7.23(d，1H，J＝9.2Hz，C5-H)，7.13(s，1H，C8′-H)，6.97(s，1H，C8-H)，6.11(s，2H，CONH2)，4.65(m，4H，(NCH2CH2)″+NCH2CH2)′)，3.98(t，2H，J＝8.7Hz，NCH2CH2)，3.45(m，4H，(NCH2CH2)″+(NCH2CH2)′)，3.25(t，2H，J＝8.7Hz，NCH2CH2).C40H27N7O5F4×2H2O的理论值：
C，61.59；H，4.23；N，8.71.实测值：C，61.73；H，4.12；N，8.61.
[3-氨基甲酰基-1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羰基]-1-酰氨基-3-丙醇三聚体(3d)。对3-氨基-1-丙醇(70μ1，1.4mmol)、化合物3c(75mg，0.1mmol)和三乙胺(0.1ml，mmol)溶于2.5ml无水DMF所得的溶液在室温搅拌10小时。所得的不溶固体过滤取集，并依次用DMF(2ml)CH2Cl2(10ml)和乙醚(20ml)洗涤。真空干燥得浅黄色固体3d(55mg，89％)。
             (1H NMR(Me2SO- d 6，200MHz，ppm)11.76(s，1H，NH″)，11.65(s，1H，NH′)，11.57(s，1H，NH)，8.47(m，1H，C4-H)，8.24(m，1H，C4-H)，7.99(d，1H，J＝8.4Hz，C4-H)，7.40-7.32(2d，2H，C5″-H+C5′-H)，7.23(d，1H，J＝8.9Hz，C5-H)，7.12(s，1H，C8″-H)，7.10(s，1H，C8′-H)，6.99(s，1H，C8-H)，6.12(s，3H，CONH2+NHCO)，4.66(t，4H，(NCH2CH2)″+(NCH2CH2)′)，3.98(t，2H，J＝8.7Hz，NCH2CH2)，3.51-3.25(m，10H，(NCH2CH2)″+(NCH2CH2)′+NCH2CH2+NHCH2+CH2OH，因水使之部分变模糊)，1.70(p，2H，J＝6.6Hz，CH2CH2CH2).
3-[N-(9-芴基甲氧羰基)]氨基丙酸2，3，5，6-四氟苯酯(4)。Fmoc-丙氨酸(2.0g，6.4mmol)和三乙胺(1.0ml，7mmol)用20ml无水CH2Cl2溶解。向所得溶液中滴加三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯酯(1.7g，6.5mmol)。1小时后，用旋转蒸发器除去CH2Cl2，残余物用30ml乙酸乙酯/正己烷(1∶1)重新溶解。用闪式柱层析(4×20cm，正乙烷/乙酸乙酯，31)得到白色固体状的粗品4。该粗品用己烷/乙酸乙酯重结晶，得白色晶体4(2.3g，78％)。
1H NMR(CDCl3，200MHz，ppm)7.73(d，2H，J＝7.1Hz，芳香质子)，7.75(d，2H，J＝7.7Hz，芳香质子)，7.24-7.42(m，4H，芳香质子)，7.01(m，1H，C6F4H)，5.21(br s，1H，-CONH-)，4.38(d，2H，J＝7.1Hz，-CH2OCO-)，4.20(m，1H，苄基质子)，3.58(m，2H，NCH2)，2.93(t，2H，J＝5.4Hz，-CH2CO-).
 C24H17NO4F4的理论值：C，62.75；H，3.73；N，3.05.实测值：C，62.52；H，3.59；N，3.01.
1-[3-[N-(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基-[R，S]-2，3-丙二醇(5)。3-氨基-1，2-丙二醇(0.6g)用10ml甲醇溶解，搅拌该溶液。向该搅拌过的溶液中加入化合物4(2.0g，4.35mmol)溶于无水CH2Cl2(20ml)所得的溶液。10分钟后，加入乙酸(3ml)，蒸发浓缩至于。残余物用100ml水研制，过滤收集所得的固体，并用水洗涤。在减压下与甲苯共蒸发除水。然后用50ml乙酸乙酯洗涤，接着真空干燥过夜，得白色晶体5(1.65g，99％)。1H NMR(CDCl3+MeOD- d4，200MHz，ppm，Me4Si)7.77(d，2H，J＝7.7Hz，aromatic protons)，7.61(d，2H，J＝7.3Hz，芳香质子protons)，7.45-7.29(m，4H，aromatic protons)，4.35(d，2H，J＝7.1Hz，-CH2OCO-)，4.22(m，1H，苄基质子)，3.72(m，1H，-CH-来自NHCH2CHOHCH2OH)，3.52-3.27(m，6H，OCONHCH2+CH2CHOHCH2OH)，2.44(t，2H，J＝6.6Hz，-CH2CO-)；C21H24N2O5的理论值：C，5.61；H，6.29；N，7.29％.实测值：C，65.43；H，6.28；N，7.21.
1-[3-[N-(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基-[R，S]-2-[[二(甲氧基苯基)苯基甲氧基]甲基-2-乙醇(6)。将化合物5(1.6g，4.2mmol)溶于30ml无水吡啶中，搅拌所得的溶液。向上述搅拌过的溶液中加入4，4′-二甲氨基三苯基甲基氯(DMTrCl)(1.6g，4.7mmol)。在氩气保护下搅拌3小时后，将反应混合物蒸发至于，剩余的吡啶与甲苯共沸除去。残余物用100ml CH2Cl2溶解，并用水(2×100ml)洗涤，以Na2SO4干燥，蒸发至于。以乙酸乙酯作洗脱剂，用闪式柱层析(4×20cm)纯化所得的残余物得无色泡沫6(1.9g，66％)。
1H NMR(CDCl3，200MHz，ppm，Me4Si)7.72(d，2H，J＝7.2Hz，芳香质子)，7.56(d，2H，J＝7Hz，aromatic protons)，7.40-7.20(m，13H，芳香质子protons)，6.80(d，4H，J＝9Hz，DMTr质子)，5.76(brs，1H，NH)，5.42(br s，1H，NH)，4.35(d，2H，J＝6.6Hz，-CH2OCO-)，4.17(m，1H，苄基质子)，3.83(m，1H，-CH-from NHCH2CHOHCH2OH)，3.75(s，6H，OCH3)，3.60-3.30(m，4H，OCONHCH2+CH2CHOHCH2OH)，3.13(d，2H，J＝5.4Hz，CH2ODMTr)，2.30(t，2H，J＝5.4Hz，-CH2CO-)；
C42H42N2O7的理论值：C，73.45；H，6.16；N，4.08.实测值：C，65.43；H，6.28；N，7.21.
1-[3-[N-(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基-[R，S]-2-[[二(甲氧基苯基)苯基甲氧基]甲基]-2-乙基丁二酸2，3，5，6-四氟苯酯(7)。将化合物6(1.2g，1.75mmol)、三乙胺(0.2g，2mmol)、1-甲基咪唑(20μl)溶于10ml无水CH2Cl2中，向该溶液中加入琥珀酸酐(0.2g，2mmol)。搅拌该溶液20小时。向该溶液中加入三乙胺(60μl)，接着加入三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯酯(0.6g，2.2mmol)。1小时后，用旋转蒸发器在减压下除去CH2Cl2，然后残留物用15ml乙酸乙酯/己烷(1∶2)溶解。闪式柱层析((4×20cm)，正己烷/乙酸乙酯(2∶1)作洗脱剂))纯化，得浅黄色泡沫1b(1.2g，73％)。1H NMR(CDCl3，300MHz，ppm，Me4Si)7.71(d，2H，J＝7.2Hz，芳香质子)，7.54(d，2H，J＝7Hz，芳香质子)，7.40-7.20(m，13H，芳香质子)，7.00(m，1H，C6F4H)，6.78(d，4H，J＝7Hz，DMTr质子)，5.71(br s，1H，NH)，5.42(br s，1H，NH)，5.15(m，1H，-CH-来自NHCH2CHOHCH2OH)，4.31(d，2H，J＝6.2Hz，-CH2OCO-)，4.16(d，5.5Hz，1H，苄基质子)，3.74(s，6H，OCH3)，3.60-3.30(m，4H，OCONHCH2+CH2CHOHCH2OH)，3.20(br s，2H，CH2ODMTr)，2.98(br s，2H，COCH2CH2CO)，2.72(br s，2H，COCH2CH2CO)，2.20(br s，2H，-CH2CO-)；C42H42N2O7的理论值：
C，66.80；H，4.96；N，3.00.实测值：C，66.18；H，4.98；N，2.86.
CPG衍生物(8)的制备。将5.0g长链氨基烷基-CPG(LCAA-CPG)、0.5ml 1-甲基咪唑和溶于20ml无水吡啶的0.45g(0.5mmol)化合物7的混合物在100ml烧瓶中涡旋，3小时后，所述的CPG用多孔玻璃漏斗过滤，并依次用DMF、丙酮和乙醚各100ml洗涤。所述的CPG真空干燥，再用20ml吡啶、2ml乙酸酐和2ml的1-甲基咪唑的混合物处理。涡旋30分钟后，依次用吡啶、甲醇、乙醚洗涤所述的CPG，然后真空干燥之。根据文献方法(T.Atkinson和M.Smith.in M.Gait(ed.)，Oligo-nucleotide Synt-hesis，A Practical Approach，IRLPress，1984，Oxford，UK，pp.35-81)，发现其载容量为28μmol/g。
CPG衍生物(9)的制备。3.0g CPG衍生物(8)用溶于无水DMF中的20％哌啶溶液(20ml)处理两次，每次5分钟。该CPG依次用二甲基甲酰胺、甲醇和乙醚各100ml洗涤，然后真空干燥之。
CPG衍生物(10)的制备。将2.5g的化合物9、7.5ml三乙胺和溶于7.5ml无水DMSO中的0.38g(0.5mmol)化合物3c的混合物在50ml烧瓶(轨道混合器，150漏斗rpm)中涡旋。2天后，CPG用多孔玻璃漏斗过滤，并用DMSO、丙酮和乙醚各100ml洗涤，真空干燥所得的CPG，再用10ml吡啶、1ml乙酸酐和1ml 1-甲基咪唑的混合物处理。涡旋30分钟后，CPG衍生物用DMSO、吡啶、甲醇和乙醚洗涤，然后真空干燥。
5-[(叔丁氧基)甲酰氨基]戊基羧酸2-[4-(苯偶氮基)苄基硫]乙酯(11)。6-[(叔丁氧基)甲酰氨基]己酸(4.16g、18mmol)通过与无水DMF共蒸发(70℃)而干燥之。残留物用无水DMF(25ml)重新溶解，在0℃下加入2-[4-(苯偶氮基)-·苄基硫]-乙醇(4.08g，15mmol)、N，N′-二环己基碳二亚胺(3.71g，18mmol)、4-二甲氨基吡啶(1.83g，15mmol)。在0℃搅拌2小时、20℃搅拌12小时后，反应混合物通过与乙酸丁酯共沸蒸馏至干。再加入乙酸乙酯(150ml)。所得溶液依次用0.7M HCl(1×30ml)、5％NaHCO3和H2O(2×50ml)萃取。有机层以Na2SO4干燥，并采用旋转蒸发器浓缩。用20ml乙醚洗涤过滤得化合物11(6.91g，89％)。
1H NMR(CDCl3，200MHz，ppm)：7.91(m，4H)，7.52(m，5H)，4.48(t，2H)，4.34(s，2H)，3.20(t，2H)，3.08(m，2H)，2.35(t，2H)，1.64-1.2(m，7H)，1.41(s，9H).
1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基-吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯。将N，N′-二环己基碳二亚胺(1.1g，5.3mmol)加入1-甲基-4-[(叔丁氧基)甲酰氨基]吡咯-2-羧酸(1.2g，5.2mmol)和1-羟基苯并三唑(0.63g，4.7mmol)的混合物中。搅拌1小时后，该混合物用多孔玻璃漏斗过滤，分离析出的N，N′-二环己基碳二亚胺。将滤液蒸发至干，将残留物再溶解在氯仿-戊烷(1∶1)的混合物中。将所得溶液上样到硅胶柱上，合并含纯产物的级分，并将之蒸发至干，得1.45g为白色固体的目的产物，产率为80％。
mp＝138-138.5℃；1H NMR(CDCl3，200MHz)8.04(d，1H)，7.49-7.40(m，4H)，7.09(d，1H)，3.87(s，3H)，1.50(s，9H).
5-[1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)苄基硫]乙酯(12)。在0℃下将三氟乙酸(5ml)加入化合物11(0.73g，1.5mmol)中。于0℃搅拌20分钟后，使反应混合物与氯仿共蒸发至干，。将残留物溶解在无水二氯甲烷(15ml)中，然后加入1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基-吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯(0.59g，1.65mmol)和无水三乙胺(0.23g，2.3mmol)。于室温搅拌15分钟后，加入100ml氯仿。反应混合物用5％NaHCO3(2×20ml)、H2O(2×20ml)萃取。有机相以Na2SO4干燥，并用旋转蒸发器浓缩。经硅胶柱层析(用CHCl3作洗脱剂)得12(0.88g，91.8％)。1H NMR(CDCl3，200MHz，ppm)：7.88(m，4H)，7.46(m，5H)，6.74(s，1H)，6.38(s，1H)，6.26(s，1H)，5.87(t，1H)，4.18(t，2H，J＝6Hz)，3.82(s，3H)，3.79(s，2H)，3.3(m，2H)，2.63(t，2H，J＝6Hz)，2.30(t，2H，J＝6Hz)，1.64-1.2(m，6H)，1.46(s，9H).
5-[1-甲基-4-[1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)苄基硫]乙酯(13)。化合物12(2.43g，4mmol)用CH2Cl2(8ml)溶解，使该溶液于0℃下，用三氟乙酸(4ml)处理。将所得溶液于室温在烧瓶中放置1小时，然后使之在30ml 30％的K2CO3水溶液和30ml CH2Cl2之间分配。收集下层。水相用CH2Cl2(2×20ml)萃取，合并有机层。用水(1×20ml)洗涤后，以Na2SO4干燥，并浓缩。残留物溶解在CH2Cl2(10ml)中，加入1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯(1.43g，4mmol)和无水三乙胺(0.8g，8mmol)。室温搅拌30分钟后，加入100ml氯仿。该反应混合物用5％NaHCO3(2×20ml)、H2O(2×20ml)萃取。有机层以Na2SO4干燥，并用旋转蒸发器浓缩。硅胶(100g)柱层析(以CHCl3作洗脱剂)后得13(1.95g，66.8％)。
                          1H NMR(CDCl3，200MHz，ppm)：7.87(m，4H)，7.46(m，5H)，7.04(d，1H，J＝1.5Hz)，6.77(br s，1H)，6.52(br s，1H)，6.50(d，1H，J＝1.5Hz)，6.31(br s，1H)，5.95(t，1H)，4.19(t，2H，J＝6Hz)，3.85(s，6H)，3.78(s，2H)，3.32(m，2H)，2.64(t，2H，J＝6Hz)，2.31(t，2H，J＝6Hz)，1.64-1.2(m，6H)，1.48(s，9H).
5-[1-甲基-4-[1-甲基-4-[1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)苄基硫]乙酯(14)。化合物13(1.90g，2.6mmol)溶于无水CH2Cl2(6ml)所得的溶液在0℃下用3ml三氟乙酸处理。将所得的溶液在烧瓶中于室温放置1小时，然后使之在30％K2CO3(30ml)和CH2Cl2(30ml)之间分配。收集下层，水相用二氯甲烷(2×20ml)萃取，合并有机层并用水(1×20ml)洗涤。然后以Na2SO4干燥；并蒸发干燥。将残留物溶在CH2Cl2(2.5ml)中，加入1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯(1.4g，3.9mmol)、无水三乙胺(0.8g，8mmol)。室温搅拌1小时后加入CHCl3 100ml。反应混合物用5％NaHCO3(2×20ml)、H2O(2×20ml)萃取。有机层以Na2SO4干燥，并在旋转蒸发器上浓缩。用硅胶(100g)柱层析(以0～1.5％甲醇的氯仿溶液作洗脱剂)得14(1.56g，70.5％)。1H NMR(CDCl3，200MHz，ppm)：7.87(m，4H)，7.68(br s，1H)，7.60(br s，1H)，7.46(m，5H)，7.08(br s，2H)，6.78(br s，1H)，6.56(d，1H，J＝1.5Hz)，6.60(br s，1H)，6.55(d，1H，J＝1.5Hz)，6.03(t，1H)，4.18(t，2H，J＝6Hz)，3.86(m，9H)，3.78(s，2H)，3.32(m，2H)，2.63(t，2H，J＝6Hz)，2.30(t，2H，J＝6Hz)，1.64-1.2(m，6H)，1.48(s，9H).
2-[4-(苯偶氮基)苄基硫]乙基-5-[1-甲基-4-[1-甲基-4-[1-甲基-4-[1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸酯(15)。化合物14(0.32g，0.32mmol)溶于5ml无水CH2Cl2所得的溶液于0℃用2.5ml三氟乙酸处理。将所得的溶液在烧瓶中于室温放置1小时，然后使之在30％K2CO3(30ml)和CH2Cl2(30ml)之间分配。收集下层水相用二氯甲烷(2×20ml)萃取，合并有机层并用水(1×20ml)洗涤。然后以Na2SO4干燥，并蒸发干燥。将残留物溶在CH2Cl2(1ml)中，加入1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯(0.11g，0.32mmol)、无水三乙胺(0.06g，0.03mmol)。室温搅拌1.5小时后，加入CHCl3 100ml。反应混合物用5％NaHCO3(2×20ml)、H2O(2×20ml)萃取。有机层以Na2SO4干燥，并在旋转蒸发器上浓缩。用硅胶(100g)柱层析(以0～1.5％甲醇的氯仿溶液作洗脱剂)得0.25g化合物15(80％)。
                                        1H NMR(CDC13，200MHz，ppm)：8.17(br s，1H)，7.98(br s，)，7.96(br s，)，1H 7.85(m，4H)，7.44(m，5H)，7.09(brs，2H)，7.02(s，1H)，6.78(br s，1H)，6.74(br s，1H)，6.66(s，1H)，6.58(s，3H)，6.29(t，1H)，4.18(t，2H，J＝6Hz)，3.78(m，14M)，3.28(m，2H)，2.60(t，2H，J＝6Hz)，2.26(t，2H，J＝6Hz)，1.64-1.2(m，6H)，1.48(s，9H).
5-[1-甲基-4-[1-甲基-4-[1-甲基-4-[1-甲基-4-[1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)苄基硫]乙酯(16)。化合物15(0.65g，0.67mmol)溶于无水CH2Cl2(10ml)所得的溶液在0℃下用5ml三氟乙酸处理。将所得的黄色溶液在烧瓶中于室温放置1小时，然后使之在30％K2CO3(30ml)和CH2Cl2(30ml)之间分配。收集下层，水相用二氯甲烷(2×20ml)萃取，合并有机层并用水(1×20ml)洗涤。然后以Na2SO4干燥，并蒸发于燥。将残留物溶在CH2Cl2(1ml)中，加入1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯(0.24g，0.67mmol)、无水三乙胺(0.13g，0.67mmol)。室温搅拌3小时后，反应混合物与乙酸丁酯共蒸发至干。将残余物溶解在3ml2.5％DMF的CHCl3溶液中。用硅胶(100g)柱层析(以0～2.5％甲醇的氯仿溶液作洗脱剂)得0.67g化合物16(45％)。
4′-[二(2-氯乙基)氨基]苯基丁酸-2，3，5，6-四氟苯酯(苯丁酸氮芥2，3，5，6-四氟苯酯)。向苯丁酸氮芥0.25g(0.82mmol)(Fluka A.G.提供)、三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯酯0.3g(1.1mmol)溶于5ml无水CH2Cl2所得的溶液中加入0.2ml无水三乙胺。在氩气氛下，于室温对反应混合物搅拌0.5小时，并蒸发之。残留的油用硅胶柱层析，洗脱剂为正己烷/氯仿(2∶1)，得油状的酯0.28g(75％)。硅胶薄层层析(CHCl3)，保留值(Rf)为0.6；IR(CHCl3)为3010、1780、1613、1521、1485cm-1。
苯丁酸氮芥基与寡核苷酸的伯氨基的连接
寡核苷酸十六烷基三甲基铵盐的制备：将100μl寡核苷酸(50-500μg)水溶液(通常为三乙胺盐)注射到Dowex 50wx8(十六烷基三甲铵型)柱表面(柱由50％乙醇水溶液预洗)，用50％乙醇水溶液洗脱(0.1ml/min)该柱。含有寡核苷酸的级分用speedvac干燥2小时，并直接用于下列反应。
将寡核苷酸十六烷基三甲铵盐(50-100μg)的乙醇溶液(50μl)与0.08M 4′-[二(2-氯乙基)氨基]苯丁酸2，3，5，6-四氟苯酯的乙腈溶液(50μl)和3μl二异丙基乙胺混合。室温振摇3小时后，产物用2％LiClO4的丙酮溶液(1.5ml)沉淀。产物用2％LiClO4的丙酮溶液从水中再沉淀3次。最后寡核苷酸苯丁酸氮芥衍生物用反相层析纯化，产率为约50-80％。含产物的级分用丁醇浓缩。使分离得到的寡核苷酸苯丁酸氮芥衍生物在LiClO4的丙酮溶液中沉淀。用丙酮洗涤，在油泵产生的真空下干燥。所有涉及活泼寡核苷酸的操作要尽可能地快地进行，自收集层析组分后，将产物置于水浴溶液中。
寡核苷酸的合成
所有寡核苷酸均用1μmol适当的CPG载体，在ABB394合成仪上制备，实验操作按仪器制造商提供的实验指南进行。氰乙基氨基亚磷酸酯偶合化学法的标准试剂从Glen Research购买。5′-氨基己基修饰通过N-MMT-己醇胺亚磷酰胺接头(购自Glen Research)引入。3′-氨基己基修饰则用CPG载体引入，方法见以前的描述。(C.R.Petrie，Reed，A.D.Adams，R.B.Meyer，Jr.；Bioconjugate Chemistry，1992，3，85-87)。
轭合物的制备(反应路线3)
向氨基己基修饰的寡苷酸十六烷基三甲基铵盐(30-50nmol，Jost，J.-P.，Jiricny，J.，和Saluz，H.Quantitative Precipitation ofShort Oligonucleotides with 10w Concentrations ofCetyltrimethyl ammonium bromide.Nucleic Acids Res.1989，17：2143)和1.5μl N，N-二异丙基乙胺溶于40μl无水DMSO的溶液中，加入4mM TFP酯(1a，1b，2e，2f或3c)溶液(40μl)。反应混合物在室温保温12小时。通过加入2％LiClO4丙酮溶液(1.5ml)将寡核苷酸相关物质沉淀出来。沉淀用丙酮洗涤，真空干燥。沉淀重溶在50％DMF的水溶液(60μl)中，并按上述操作用2％的LiClO4丙酮溶液再沉淀。重复该操作两次。在50mM LiClO4存在下，采用20-75％的乙腈溶液梯度，用HPLC(4.6×250mm，C-18，Dynamax-300A，Rainin)纯化所得的残留物。含有纯产物的级分用speedvac真空干燥。将残留物再溶于60-80μl H2O中，再用2％LiClO4丙酮溶液(1.5ml)沉淀。用丙酮洗涤(2×1.5ml)后，真空干燥，将产物溶于100μl H2O中，终产物的产率为20-50％。
用Godovikova等的改进方法(T.S.Godovikova，V.F.Za-rytova，T.V.Maltzeva，L.M.Khalimskaya，Bioorgan.Khim.，1989，15：1246-1259)合成带有4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸残基的寡核苷酸轭合物。使含3′-磷酸酯的寡核苷酸十六烷基三甲基铵盐(50-100nmol)、三苯膦(10mg)、2，2′-二吡啶基二硫醚(10mg)、N，N-二甲氨基吡啶(10mg)和一种选白化合物11-16的化合物溶于100μl无水DMF中，所得溶液在室温反应20分钟。寡核苷酸类物质通过加入2％LiClO4丙酮溶液而沉淀出来。沉淀用丙酮洗涤，真空干燥。在50mM LiClO4存在下，采用20-75％乙腈溶液梯度，用HPLC纯化所得的残留物。含纯产物的级分用speedvac真空干燥。将残留物再溶于60-80μl H2O中，并用2％LiClO4丙酮溶液(1.5ml)沉淀。用丙酮(2×1.5ml)洗涤后，真空干燥。最后，将残留物溶于100μl H2O中，最终产率为30-50％。
轭合物的制备(反应路线4)
含5′-氨基己基的CPG-寡核苷酸衍生物自1μmol规模合成实验得到。用2％二氯乙酸的二氯甲烷溶液处理之，以从氨基上脱除保护基9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)，然后用乙腈洗涤，用氩气流干燥。将CPG-寡核苷酸转入1.5ml塑料试管中，再加入50mM四氟苯酯的无水DMSO溶液(100μl)。振荡试管24小时，然后用DMSO(3×1.5ml)、丙酮(2×1.5ml)洗涤，再真空干燥。采用标准的条件，CPG载体-寡核苷酸用浓氨水处理以使寡核苷酸去保护。所得的反应混合物采用上文所述的反相HPLC分离，一般产率为约50％。
热变性研究
带有4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸残基的寡核苷酸复合物的光学熔化曲线是在200nM NaCl、10nM Na2HPO4、0.1MM EDTA(pH7.0)溶液中，用Milichrom液相色谱的紫外检测器检测，在专为此目的而设计的热控槽中测得的。采集数据并按S.G.Lokhov等人的文献方法用计算机处理(S.G.Lokhov，M.A.Podyminogin，D.S.Sergeev，V.N.Silnikov，I.V.Kutyavin，G.V.Shishkin，V.F.Zarytova，Bioconjugate Chem.1992，3：414)。
带有1，2-二氢-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸(CDPI)残基的寡核苷酸复合物在140mM KCl、10mM MgCl2、20mMHEPES-HCl(pH7.2)溶液中熔化，用带有PTP-6自动多池温度控制程序的Lambda2(Perkin Elmer)分光光度计测定得到熔化温度。复合物的熔化温度(Tm)由得到的最大值确定。
引物延长反应
引物延长反应按Lee等描述的方法进行(Biochemistry，1994，33：6024-6030)，模板、引物和被保护的寡核苷酸的最后浓度分别为5×10-10M、4×10-8M和10-9M。在45℃引物延长15分钟，参考Lee等的文献，产物用凝胶电泳分析。
如无任何被保护的寡核苷酸存在，引物延长反应产生出高分子量的产物，该产物在测序胶上显示为不可分辨的带。对应于暂停位点或自发终止事件的弱带在所有反应混合物中均可反复观察到。与靶完全互补的未修饰的十六聚和三十二聚核苷酸不阻止引物延长。3′端连有CDPI3、与靶序列互补的八聚和十六聚核苷酸同样也无抑制活性。只有与靶序列完全互补且5′端连有CDPI3的十六聚核苷酸可抑制引物在T7DNA聚合酶作用下的延长。相应的5′端连有CDPI3的八聚核苷酸仅产生痕量的抑制产物。对照寡核苷酸证实：引物延长的抑制需要互补的寡核苷酸和与之共价连接的MGB。有一个错误配对碱基且5′端连有CDPI3的两个十六聚核苷酸与完全互补的ODN-MGB轭合物比较，其抑制活性要低得多。同时加入未修饰的十六聚核苷酸与等摩尔量的游离的CDPI3，不影响引物延长，这突出表明MGB与ODN共价结合对其抑制引物延长具有重要意义。当与靶序列完全互补的十六聚寡核苷酸5′连有吖啶基而不是MGB时，则观察到抑制活性丧失。
细胞培养交联实验
ODN-MGB轭合物与DQβ1等位基因模板链的第815-864位核苷酸互补(Proc.Natl.Acad.Sci，USA(1983)，80：7313-7317)，这里使用的人BSM B细胞对该等位基因是纯合的并能组成性地表达它。在加ODN之前，BSM细胞在25ml烧瓶中培养至密度为4.5×106细胞/ml培养基。对于每次处理，将2ml培养液中的细胞离心后重新悬浮在无血清的培养基中，所述培养基含有与苯丁酸氮芥连接的五十聚核苷酸(浓度为0、1、10或50μM)(同样浓度的两份血清中，一份ODN的3′端与CDPI3相连，另一份则不与CDPI3相连)。每个试样在37℃与5％CO2中，用48-孔微滴定板培养3.5小时。然后把细胞转至0.5ml Eppendorf离心管中，以2000rpm离心5分钟，用500μl磷酸盐(PBS)缓冲液洗二次，于37℃用蛋白酶K/SDS脱蛋白一晚上。苯酚/氯抽提和RnaseA消化后，DNA在90℃用1M四氢吡咯处理30分钟。四氢吡咯通过乙醇沉淀除去，LM-PCR按Lee等的方法进行(Biochemistry，1994，33：6024-6030)。扩增的DNA用测序胶分析，以观察序列特异性的任何缺裂，所述缺裂可能是由含苯丁酸氮芥的ODN对靶DNA的烷化产生的。结果表明靶中核苷酸断裂发生在ODN的交联基附近；此外，含CDPI3的五十聚核苷酸在序列特异性地烷化0302等位基因方面较无MGB的同一ODN强10倍。
由下列各组分制备完全培养基(无血清培养基不含HI-FCS)：
500ml含L-谷氨酸(2mM)的RPMI 1640(Gibco BRLCat.No.11875-036)
50ml HI-FCS(Gibco BRL Cat.No.26140，55℃热灭活30分钟)
50ml 100×青霉素/链霉素(Gibco BRL Cat.No.15070-022)
5ml 200mM L-谷氨酸(Gibco BRL Cat.No25030-024)
5ml 100×丙酮酸钠(11mg/ml；从Gibco BRL Cat.No.11840-030制得)
5ml 1M HEPES，pH7.3(Gibco BRL Cat No.15630-023)
                         序列表
(1)总的资料：
(i)申请人：Microprobe Corporation，Bothell
           WA98021
(ii)发明的题目：共价结合的寡核苷酸和小沟结合剂的轭合物
(iii)序列数目：2
(iv)通信地址：
  (A)收信人：Klin & Szekeres
  (B)街道：4199 Campus Drive，Suite 700
  (C)城市：欧文
  (D)州：加利福尼亚
  (E)国家：美国
  (F)邮政编码：92715
(v)计算机可读形式：
  (A)工具类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容机
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件：Patent In Release #1.0，#1.25版
(vi)当前申请资料：
  (A)申请号：美国08/415,370
  (B)递交日期：1995年4月3日
  (C)特征：
(viii)代理人/代理机构资料：
  (A)姓名：Szekeres，Fabor L，
  (B)登记号：28,675
  (C)档案号：491-09-pa8
(ix)电讯资料：
  (A)电话：714-854-5502
  (B)电传：714-854-5502
(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：50个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1
GGTTATTTTT GAAGATACGA ATTTCUCCAG AGACACAGCA GGATTTGTCA    50
(2)SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特征：
  (A)长度：16个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2
TTTTTTTTTTT TTTTT

Claims (28)

1.一种寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，包括含有多个核苷酸单位、一个3′端和一个5′端的寡核苷酸和通过连接基与至少一个所述的核苷酸共价结合的小沟结合基，所述的连接基通过不超过15个的原子将小沟结合基与寡核苷酸共价连接起来，其中所述的小沟结合基是分子量为约150-2000道尔顿以非嵌入方式与双链DNA、RNA或杂合体的小沟结合的分子基团，其缔合常数大于103M-1。
2.根据权利要求1的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中包含有连接基的小沟结合基具有选自(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的通式：
                R1-(HN-Y1-CO)n-R2
                      (a)
其中Y1表示含有两个双键和0-3个选自N、S、O杂原子的五元环，NH和CO分别与环上的两个碳原子相连，这两个碳原子被一个环原子隔开，当这两个碳原子之间的这个环原子是碳或氮时它仅被H取代，而当这个环原子是氧或硫时它则不被取代，环上的其余原子可被1、2或3个R3基任意取代；
                 R1-(R6N-Y2-CO)n-R2
                        (b)
其中Y2是六元芳香环与含有一个双键的五元环缩合成的稠合环，该稠合环有0-3个选自N、S、O的杂原子，R6N和CO基团分别与稠合环的两个不同环上的碳原子相连，这两个碳原子从一个共同桥头原子算起，在两个环上都是第二位原子，在CO和NR6之间稠合环的一边有两个非桥头环原子而在另一边有三个非桥头环原子，所述的稠合环一边的两个非桥头环原子可被R7任意取代，另一边的三个非桥头0原子可被R3任意取代；
                R1-(CO-Y3-NH)n-R2
                      (c)
其中Y3是含有0-3个N杂原子的六元芳香环，CO和NH基团分别与环上相对处于1，4位的两个碳原子相连，六元环被连有CO或NH的两个碳原子分成两边，一边未与CO或NH基团相连的两个原子被R3任意取代，另一边未与CO或NH基团相连的两个环原子被R7任意取代；
         R1-(HN-Y4-HN-CO-Y4-CO)n-R2
                     (d)
Y4含有0-3个N杂原子的6元芳香环，NH、CO基团分别与环上的相对处于1，4位的两个碳原子相连，该六元环被环上连有CO或NH的两个碳原子分成两边，一边未与CO或NH相连的两个原子可被R3任意取代，另一边未与CO或NH基团相连的两个原子可被R7任意取代；
                 R1-(Y5)n-R2
                    (e)
Y5是六元芳香环与含有一个双键的五元环的稠合环，该稠合环有0-3个选自N、S、O的杂原子，R1和R2基团分别与稠合环的不同环上的碳原子相连，它们从共同的桥头原子算起均是第二个环原子，在R1和R2之间该稠合环的一边有两个非桥头环原子而在另一边则有三个非桥头环原子，所述的稠合环一边的两个非桥头环原子可被R7任意取代，另一边的三个非桥头环原子可被R3任意取代；
其中R1、R2独立地为H、F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N(R4)2、N(R4)3 +、OH、OR4、SH、SR4、COR4、CONHR4、CON(R4)2、R4、H2N(CH2)mCO、CONH2、CONHR4和
H2N(CH2)mCOO(CH2)mS(CH2)mC6H4NNC6H4、O(CH2)mCO、
O(CH2)mCH(OH)(CH2)mNHCO(CH2)mNH、-O-、-S-、-HN(CH2)mCO、
-CONH-、-CONR4、
-HN(CH2)mCOO(CH2)mS(CH2)mC6H4NNC6H4和
-(CH2)mCH(OH)(CH2)mNHCO(CH2)mNH-，或者R1和R2中有一个基团下存在；
R3为选自下列基团的基团：F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N(R4)2、N(R4)3 +、OH、OR4、SH、SR4、COR4、CONHR4、CON(R4)2和R4、或者R3是可形成与Y1环成稠合环的3、4、5或6元环的基团，该R3可被一个、二个、三个R4基团取代；
R4是含有1-20个碳原子的烷基或环烷基、含有1-20个碳原子和1-3个双键的链烯基或环烯基、含有不超过25个碳原子的碳环芳基、含有不超过25个碳原子的杂环芳基、含有不多于25个碳原子的碳环或杂环芳烷基，其中R4可被1、2或3个F、Cl、Br、I、NH2、NHR5、N(R5)2、N(R5)3 +、OH、OR5、SH、SR5、COR5、CONHR5、CON(R5)2或R5基团任意取代；
R5是具有1-6个碳原子的烷基，
R6是H、具有1-5个碳原子的烷基，或R6和R7共同形成一个4、5或6元环，-O-、-S-、-NH-、-NCH3-或N-低级烷基任意地是上述环的一部分；
R7是F、甲基或乙基；-CH2-、或-CH2CH2-；
m是1-10之间的整数
n是1-10之间的整数，以及
P是1-5之间的整数。
3.根据权利要求2的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的包括连接基内的小沟结合基由通式(a)代表。
4.根据权利要求2的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的包括连接基内的小沟结合基由通式(b)代表。
5.根据权利要求2的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的包括连接基内的小沟结合基由通式(c)代表。
6.根据权利要求2的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的包括连接基内的小沟结合基由通式(d)代表。
7.根据权利要求2的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的包括连接基内的小沟结合基由通式(e)代表。
8.根据权利要求1的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的小沟结合基与所述寡核苷酸的5′端相连。
9.根据权利要求1的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的小沟结合基与所述寡核苷酸的3′端相连。
10.根据权利要求1的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的小沟结合基与核苷酸单位相连，该核苷酸单位既不在所述寡核苷酸的3′端也不在所述寡核苷酸的5′端。
11.根据权利要求1的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的小沟结合基与核苷酸单位的杂环碱基相连。
12.根据权利要求10的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的小沟结合基与所述核苷酸单位的杂环碱基相连。
13.根据权利要求2的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的包括连接基在内的小沟结合基具有如下通式：
Figure A2004100558970005C1
其中n为2-5。
14.根据权利要求13的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的小沟结合基与所述寡核苷酸的3′端相连。
15.根据权利要求2的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的包括连接基在内的小沟结合基具有如下通式：
其中n＝2-5。
16.根据权利要求2的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的包括连接基在内的小沟结合基具有如下通式：
其中n＝2-5。
17.根据权利要求16的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的小沟结合基与所述寡核苷酸的3′端相连。
18.根据权利要求2的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的小沟结合基由通式(a)代表，式(a)中的5元环具有如下的结构：
19.根据权利要求2的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的小沟结合基由通式(a)代表，式(a)中的5元环具有如下的结构：
Figure A2004100558970006C3
20.根据权利要求2的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的小沟结合基由通式(b)代表，式(b)中的稠合环体系具有如下的结构：
21.根据权利要求1的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，还包括与至少一个所述的核苷酸单位共价相连的交联官能团。
22.一种寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，包括含有多个核苷酸单位、一个3′端和一个5′端的寡核苷酸和通过连接基与至少一个所述的核苷酸共价结合的小沟结合基，所述的连接基通过不超过15个的原子使该小沟结合基与所述的寡核苷酸共价结合，该结合物具有如下所示的通式：
Figure A2004100558970007C1
式中的X是O或S；
q为3至100之间的整数；
R8是H、OH、具有1-6个碳原子的烷氧基、O-C2-C6链烯基或F；
B是糖苷配基，选自存在于核酸内的天然杂环碱基和6-羟基嘌呤、2-氨基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-N4-亚乙烯基胞嘧啶、4-氨基吡咯并[3，4-d]嘧啶、6-氨基-4-羟基[3，4-d]嘧啶；
W1是H、PO(OH)2或其盐，或是与所述的寡核苷酸的3′-或5′-端相连的小沟结合基，该W1包括通过不超过15个的原子共价连接所述的小沟结合基和寡核苷酸的连接基；
W2是无或与一个糖苷配基B相连的小沟结合基，该W2包括将所述的小沟结合基共价连接到所述糖苷配基B上的连接基，或者W2是含有连接臂的交联官能团，该连接臂使所述的交联官能团与所述的糖苷配基共价连结；
其中小沟结合基是分子量为150-2000道尔顿以非嵌入方式与双链DNA、RNA或杂合体的小沟相结合的其缔合常数大于约103的分子基团，条件是所述的W1和W2至少一个为小沟结合基。
23.根据权利要求22的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的包括连接基内的小沟结合基具有选自(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的通式：
               R1-(HN-Y1-CO)n-R2
                     (a)
其中Y1表示含有两个双键和0-3个杂原子(选自N、S、O)的五元环，NH和CO分别与环上的两个碳原子相连，这两个碳原子被一个环原子隔开，当这两个碳原子之间的这个环原子是碳或氮时它仅被H取代，而当这个环原子是氧或硫时它则不被取代，环上的其余原子可被1、2或3个R3基团任意取代；
               R1-(R6N-Y2-CO)n-R2
                      (b)
其中Y2是六元芳香环与含有一个双键的五元环缩合成的稠合环，该稠合环体系中含有0-3个杂原子(所述杂原子选自氮、硫、氧)，R6N和CO分别与稠合环的两个不同环上的碳原子相连，这两个碳原子从一个共同桥头原子算起均是第二个环原子，在CO和NR6之间稠合环的一边有两个非桥头环原子而在另一边有三个非桥头环原子，所述的稠合环一边的两个非桥头环原子可被R7任意取代，另一边的三个非桥头环原子可被R3任意取代；
                 R1-(CO-Y3-NH)n-R2
                       (c)
其中Y3是含有0-3个N杂原子六元芳香环，CO和NH分别与环上相对处于1，4位的两个碳原子相连，六元环被连有CO或NH的两个碳原子分成两边，一边未与CO或NH基团相连的两个环原子被R3任意取代，另一边未与CO或NH基团相连的两个环原子被R7任意取代；
            R1-(HN-Y4-HN-CO-Y4-CO)p-R2
                        (d)
Y4含有0-3个N杂原子的6元芳香环，CO和NH分别与环上的相对处于1，4位的两个碳原子相连，该六元环被环上连有CO或NH的两个碳原子分成两边，一边未与CO或NH相连的两个环原子可被R3任意取代，另一边未与CO或NH基团相连的两个环原子可被R7任意取代；
                    R1-(Y5)n-R2
                        (e)
其中Y5是六元芳香环与含有一个双键的五元环的稠合环，该稠合环体系中含有0-3个杂原子，所述杂原子选自N、S、O；R1和R2分别与稠合环的不同环上的环碳原子相连，它们从共同的桥头原子算起均是第二个环原子，在R1和R2之间该稠合环的一边有两个非桥头环原子而在另一边则有三个非桥头环原子，所述的稠合环一边的两个非桥头环原子可被R7任意取代，另一边的三个非桥头环原子可被R3任意取代；
式中的R1、R2独立地为H、F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N(R4)2、N(R4)3 +、OH、OR4、SH、SR4、COR4、CONHR4、CON(R4)2、R4、H2N(CH2)mCO、CONH2、CONHR4和
H2N(CH2)mCOO(CH2)mS(CH2)mC6H4NNC6H4、-O-、-S-、
-HN(CH2)mCO、-CONH-、-CONR4、
-HN(CH2)mCOO(CH2)mS(CH2)mC6H4NNC6H4和
-(CH2)mCH(OH)(CH2)mNHCO(CH2)mNH-，或者R1和R2中有一个基团下存在；
R3为选自下列基团的基团：F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N(R4)2、N(R4)3 +、OH、OR4、SH、SR4、COR4、CONHR4、CON(R4)2和R4，或者R3是可形成与Y1环成稠合环的3、4、5或6元环的基团；
R4是含有1-20个碳原子的烷基或环烷基、含有1-20个碳原子和1-3个双键的链烯基或环烯基、含有不超过25个碳原子的碳环芳基、含有不超过25个碳原子的杂环芳基、含有不多于25个碳原子的碳环或杂环芳烷基，其中R4可被1、2或3个F、Cl、Br、I、NH2、NHR5、N(R5)2、N(R5)3 +、OH、OR5、SH、SR5、COR5、CONHR5、CON(R5)2或R5基团任意取代；
R5是具有1-6个碳原子的烷基，
R6是H、具有1-5个碳原子的烷基或R6和R7共同形成一个4、5或6元环，-O-、-S-、-NH-、-NCH3-或N-低级烷基任意地是所述环的一部分；
R7是F、甲基或乙基；-CH2-，或-CH2CH2-；
m是1-10之间的整数
n是1-10之间的整数，以及
P是1-5之间的整数。
24.根据权利要求23的寡核苷酸结合物，其中至少W1基团为小沟结合基和连接基，和W2为无。
25.根据权利要求23的寡核苷酸结合物，其中W2基团为小沟结合基和连接基。
26.根据权利要求24的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的包括连接基在内的小沟结合基由通式(a)代表，式(a)中的5元环具有如下的结构：
Figure A2004100558970010C1
27.根据权利要求24的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的小沟结合基由通式(a)代表，式(a)中的5元环具有如下的结构：
28.根据权利要求24的寡核苷酸和小沟结合剂的结合物，其中所述的小沟结合基由通式(b)代表，式(b)中的稠合环体系具有如下的结构：
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