ES2270249T3 - Imidazonaftiridinas y su uso para inducir la biosintesis de citoquina. - Google Patents

Abstract

El compuesto 2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4, 5-c][1, 5]naftiridin-4- amina o su sal farmacéuticamente aceptable.

Description

Imidazonaftiridinas y su uso para inducir la biosíntesis de citoquina.

Esta invención se refiere al compuesto de imidazonaftiridina 2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridin-4-amina o sus sales farmacéuticamente aceptables. Esta invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen los anteriores compuestos de imidazonaftiridina. Otro aspecto de esta invención se refiere al uso de estos compuestos como inmunomoduladores y para inducir la biosíntesis de citoquinas en animales.

El primer informe fiable acerca del sistema de anillos de 1H-imidazo[4,5-c]quinoleína, Backman et al., J. Org. Chem. 15, 1278-1284 (1950) describe la síntesis de 1-(6-metoxi-8-quinolinil)-2-metil-1H-imidazo[4,5-c]quinoleína para un uso posible como agente antimalárico. Posteriormente, se indicó la síntesis de diversas 1H-imidazo[4,5-c]quinoleínas sustituidas. Por ejemplo, Jain et al., J. Med. Chem., 11, pp. 87-92 (1968), sintetizan el compuesto 1-[2-(4-piperidil)etil]-1H-midazo[4,5-c]quinoleína como posible agente anticonvulsivo y cardiovascular. Además, Baranov et al., Chem. Abs. 85, 94362 (1976), han indicado varias 2-oxoimidazo[4,5-c]quinoleínas, y Berenyl et al., J. Heterocyclic Chem. 18, 1537-1540 (1981), han indicado ciertas 2-oxoimidazo[4,5-c]quinoleínas.

Posteriormente, se ha descubierto que ciertas 1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-aminas y sus derivados 1- y 2-sustituidos son útiles como agentes antivíricos, broncodilatadores e inmunomoduladores. Estos se describen, entre otros, en las patentes de EEUU nº 4.689.338; 4.698.348; 4.929.624; 5.037.986; 5.268.376; 5.346.905; y 5.389.640, todas las cuales se incorporan en la presente como referencia. Aunque continúa habiendo interés en el sistema de anillos de imidazoquinoleína, como puede observarse, por ejemplo, en el documento WO 98/30562, sigue habiendo necesidad de compuestos que tengan la capacidad de modular la respuesta inmunológica, mediante la inducción de la biosíntesis de citoquinas u otros mecanismos.

La presente invención se refiere al compuesto 2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridin-4-amina o su sal farmacéuticamente aceptable. Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz del anterior compuesto o sal, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otra realización de la presente invención se refiere al anterior compuesto o sal para su uso en un método para inducir la biosíntesis de citoquinas en un animal. Además, la presente invención se refiere al uso del anterior compuesto o sal para preparar un medicamento para inducir la biosíntesis de citoquinas en un animal. Otra realización de la presente invención se refiere al anterior compuesto o sal para su uso en un método para tratar una infección vírica en un animal. Además, la presente invención proporciona el uso del anterior compuesto o sal para preparar un medicamento para tratar una infección vírica en un animal.

Los compuestos de la presente invención son útiles como modificadores de la respuesta inmunológica debido a su capacidad para inducir la biosíntesis de citoquinas y modular, de otra manera, la respuesta inmunológica cuando se administran a animales. Esta capacidad hace que los compuestos sean útiles en el tratamiento de una diversidad de trastornos, por ejemplo enfermedades víricas y tumores que responden a estos cambios en la respuesta inmunológica.

La presente memoria descriptiva describe compuestos de fórmula I:

\vskip1.000000\baselineskip

1

en la que

A es =N-CR=CR-CR=; =CR-N=CR-CR=; =CR-CR=N-CR=; o =CR-CR=CR-N=;

R_{1} se selecciona del grupo que consiste en:

-

hidrógeno;

-

alquilo C_{1-20} o alquenilo C_{2-20} que está sin sustituir o sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en:

-

arilo;

-

heteroarilo;

-

heterociclilo;

-

O-alquilo C_{1-20},

-

O-(alquil C_{1-20})_{0-1}-arilo;

-

O-(alquil C_{1-20})_{0-1}-heteroarilo;

-

O-(alquil C_{1-20})_{0-1}-heterociclilo;

-

(alcoxi C_{1-20})-carbonilo;

-

S(O)_{0-2}-alquilo C_{1-20};

-

S(O)_{0-2}-(alquil C_{1-20})_{0-1}-arilo;

-

S(O)_{0-2}-(alquil C_{1-20})_{0-1}-heteroarilo;

-

S(O)_{0-2}-(alquil C_{1-20})_{0-1}-heterociclilo;

-

N(R_{3})_{2};

-

N_{3};

oxo;

-

halógeno;

-

NO_{2};

-

OH; y

-

SH; y

-

(alquil C_{1-20})-NR_{3}-Q-X-R_{4} o -(alquenil C_{2-20})-NR_{3}-Q-X-R_{4}, en el que Q es -CO- o -SO_{2}-; X es un enlace, -O- o -NR_{3}-, y R_{4} es arilo; heteroarilo; heterociclilo; o alquilo C_{1-20} o alquenilo C_{2-20} que está sin sustituir o sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en:

-

arilo;

-

heteroarilo;

-

heterociclilo;

-

O-alquilo C_{1-20},

-

O-(alquil C_{1-20})_{0-1}-arilo;

-

O-(alquil C_{1-20})_{0-1}-heteroarilo;

-

O-(alquil C_{1-20})_{0-1}-heterociclilo;

-

(alcoxi C_{1-20})-carbonilo;

-

S(O)_{0-2}-alquilo C_{1-20};

-

S(O)_{0-2}-(alquil C_{1-20})_{0-1}-arilo;

-

S(O)_{0-2}-(alquil C_{1-20})_{0-1}-heteroarilo;

-

S(O)_{0-2}-(alquil C_{1-20})_{0-1}-heterociclilo;

-

N(R_{3})_{2};

-

NR_{39}-CO-O-alquilo C_{1-20};

-

N_{3};

oxo;

-

halógeno;

-

NO_{2};

-

OH; y

-

SH; o R_{4} es

2

en el que Y es -N- o -CR-;

R_{2} se selecciona del grupo que consiste en:

-

hidrógeno;

-

alquilo C_{1-10};

-

alquenilo C_{2-10};

-

arilo;

-

(alquil C_{1-10})-O-alquilo C_{1-10};

-

(alquil C_{1-10})-O-alquenilo C_{2-10}; y

-

alquilo C_{1-10} o alquenilo C_{2-10} sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en:

-

OH;

-

halógeno;

-

N(R_{3})_{2};

-

CO-N(R_{3})_{2};

-

CO-alquilo C_{1-10};

-

N_{3};

-

arilo;

-

heteroarilo;

-

heterociclilo;

-

CO-arilo; y

-

CO-heteroarilo;

\newpage

cada R_{3} se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C_{1-10}; y

cada R se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1-10}, alcoxi C_{1-10}, halógeno y trifluorometilo, o su sal farmacéuticamente aceptable.

Tal como se utiliza en la presente, los términos "alquilo", "alquenilo" y el prefijo "alq-" incluyen grupos de cadena lineal y ramificada y grupos cíclicos, es decir, cicloalquilo y cicloalquenilo. Estos grupos cíclicos pueden ser monocíclicos o policíclicos, y tienen preferiblemente de 3 a 10 átomos de carbono del anillo. Los ejemplos de grupos cíclicos incluyen ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo y adamantilo.

El término "arilo", tal como se utiliza en la presente, incluye anillos o sistemas de anillos aromáticos carbocíclicos. Los ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, naftilo, bifenilo, fluorenilo e indenilo. El término "heteroarilo" incluye anillos o sistemas de anillos aromáticos que contienen al menos un heteroátomo (por ejemplo, O, S, N) en el anillo. Los grupos heteroarilo adecuados incluyen furilo, tienilo, piridilo, quinolinilo, tetrazolilo, imidazo, etcétera.

"Heterociclilo" incluye anillos o sistemas de anillos no aromáticos que contienen al menos un heteroátomo (por ejemplo, O, S, N) en el anillo. Los ejemplos de grupos heterocíclicos incluyen pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, morfolinilo, tiazolidinilo e imidazolidinilo.

Los grupos arilo, heteroarilo y heterociclilo pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo C_{1-20}, hidroxi, halógeno, N(R_{3})_{2}, NO_{2}, alcoxi C_{1-20}, (alquil C_{1-20})tio, trihalometilo, acilo C_{1-20}, arilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, (alquil C_{1-10})_{0-1}-arilo, (alquil C_{1-10})_{0-1}-heteroarilo, nitrilo, (alcoxi C_{1-20})carbonilo, oxo, arilalquilo en el que el grupo alquilo tiene de 1 a 10 átomos de carbono, y heteroarilalquilo en el que el grupo alquilo tiene de 1 a 10 átomos de carbono.

La invención incluye el compuesto 2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridin-4-amina en cualquiera de sus formas farmacéuticamente aceptables, incluyendo los isómeros, tales como enantiómeros, sales, solvatos, polimorfos y similares.

Preparación de los compuestos

Los compuestos de fórmula I en la que A es =CR-CR=CR-N=, y R, R_{1} y R_{2} son como se definió anteriormente, pueden prepararse según el esquema de reacción III.

Esquema de reacción III

3

En la etapa (1) del esquema de reacción III, un 3-nitro[1,5]naftiridin-4-ol de fórmula XXIX se clora utilizando un agente clorante adecuado, tal como oxicloruro de fósforo, para proporcionar una 4-cloro-3-nitro[1,5]naftiridina de fórmula XXX. La reacción puede realizarse haciendo reaccionar un compuesto de fórmula XXIX con oxicloruro de fósforo en un disolvente adecuado, tal como N,N-dimetilformamida con calentamiento suave (aproximadamente 55ºC). El compuesto puede aislarse mediante métodos convencionales, o se puede seguir utilizando sin aislamiento, como se describe a continuación en conexión con la etapa (2). El compuesto de fórmula XXIX, en la que R es hidrógeno, es conocido y su preparación se ha descrito en Hart, Journal of the Chemical Society, pp. 212-214 (1956).

En la etapa (2) del esquema de reacción III, una 4-cloro-3-nitro[1,5]naftiridina de fórmula XXX se hace reaccionar con una amina de fórmula R_{1}NH_{2}, en la que R_{1} es como se definió anteriormente, para proporcionar una 3-nitro[1,5]naftiridin-4-amina de fórmula XXXI. La reacción puede realizarse añadiendo agua, después un exceso de amina a la mezcla de reacción que surge de la etapa (1), y después calentarse en un baño de vapor. La reacción también puede realizarse añadiendo un exceso de amina a una disolución de un compuesto de fórmula XXX en un disolvente adecuado, tal como diclorometano, y opcionalmente calentando. El compuesto de fórmula XXXI, en la que R_{1} es hidrógeno, es conocido y su preparación se ha descrito en Wozniak et al, J. R. Neth. Chem. Soc., 102 (12), pp. 511-513 (1983).

En la etapa (3) del esquema de reacción III, una 3-nitro[1,5]naftiridin-4-amina de fórmula XXXI se reduce para proporcionar una [1,5]naftiridin-3,4-diamina de fórmula XXXII. Preferiblemente, la reducción se realiza utilizando un catalizador de hidrogenación heterogéneo convencional, tal como platino sobre carbono o paladio sobre carbono. La reacción puede realizarse, de modo conveniente, en un aparato Parr en un disolvente adecuado, tal como acetato de etilo.

En la etapa (4) del esquema de reacción III, un compuesto de fórmula XXXII se hace reaccionar con un ácido carboxílico, o un equivalente de éste, para proporcionar una 1H- imidazo[4,5-c][1,5]naftiridina de fórmula XXXIII. Los equivalentes adecuados para el ácido carboxílico incluyen haluros de ácido, ortoésteres y alcanoatos de 1,1-dialcoxialquilo. El ácido carboxílico o su equivalente se selecciona de forma que proporciona el sustituyente R_{2} deseado en un compuesto de fórmula XXXIII. Por ejemplo, el acetato de dietoximetilo proporcionará un compuesto en el que R_{2} es hidrógeno, y el ortovalerato de trimetilo proporcionará un compuesto en el que R_{2} es butilo. La reacción puede realizarse en ausencia de disolvente, en un ácido carbóxilico tal como ácido acético, o un disolvente inerte en presencia de un ácido. La reacción se realiza con suficiente calentamiento para eliminar cualquier alcohol o agua formados como subproducto de la reacción.

Como alternativa, la etapa (4) puede realizarse (i) haciendo reaccionar un compuesto de fórmula XXXII con un agente acilante; y después (ii) ciclando el producto. La parte (i) implica hacer reaccionar un compuesto de fórmula XXXII con un haluro de acilo de fórmula R_{2}C(O)X, en la que R_{2} es como se definió anteriormente, y X es cloro o bromo. La reacción puede realizarse añadiendo el haluro de acilo de una manera controlada (por ejemplo, gota a gota) a una disolución de un compuesto de fórmula XXXII en un disolvente adecuado, tal como diclorometano, a una temperatura reducida (por ejemplo, 0ºC). El intermedio de amida resultante puede aislarse mediante la eliminación del disolvente. La parte (ii) implica ciclar el producto de la parte (i) haciéndolo reaccionar con amoniaco metanólico a una temperatura (por ejemplo, 150ºC) y presión elevadas.

En la etapa (5) del esquema de reacción III, un compuesto de fórmula XXXIII se oxida para proporcionar un 1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridin-5N-óxido de fórmula XXXIV utilizando un agente oxidante convencional que es capaz de formar N-óxidos. Las condiciones de reacción preferidas implican hacer reaccionar una disolución de un compuesto de fórmula XXXIII en cloroformo con ácido 3-cloroperoxibenzoico en condiciones ambientales.

En la etapa (6) del esquema de reacción III, un compuesto de fórmula XXXIV se amina para proporcionar una 1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridin-4-amina de fórmula XXXV que es un subgénero de la fórmula I. La etapa (6) implica (i) hacer reaccionar un compuesto de fórmula XXXIV con un agente acilante; y después (ii) hacer reaccionar el producto con un agente aminante. La parte (i) de la etapa (6) implica hacer reaccionar un N-óxido con un agente acilante. Los agentes acilantes adecuados incluyen cloruros de alquil- o arilsulfonilo (por ejemplo, cloruro de bencensulfonilo, cloruro de metansulfonilo, cloruro de p-toluensulfonilo). Se prefieren los cloruros de arilsulfonilo. El cloruro de p-toluensulfonilo es el más preferido. La parte (ii) de la etapa (6) implica hacer reaccionar el producto de la parte (i) con un exceso de un agente aminante. Los agentes aminantes adecuados incluyen amoniaco (por ejemplo, en forma de hidróxido de amonio) y sales de amonio (por ejemplo, carbonato de amonio, bicarbonato de amonio, fosfato de amonio). Se prefiere el hidróxido de amonio. La reacción se realiza preferiblemente disolviendo el N-óxido de fórmula XXXIV en un disolvente inerte, tal como diclorometano, añadiendo el agente aminante a la disolución, y después añadiendo el agente acilante. Las condiciones preferidas implican enfriar de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 5ºC durante la adición del agente acilante. El producto o su sal farmacéuticamente aceptable puede aislarse utilizando métodos convencionales.

Como alternativa, la etapa (6) puede realizarse (i) haciendo reaccionar un compuesto de fórmula XXXIV con un isocianato; y después (ii) hidrolizando el producto. La parte (i) implica hacer reaccionar el N-óxido con un isocianato, en el que el grupo isocianato está unido a un grupo carbonilo. Los isocianatos preferidos incluyen isocianato de tricloroacetilo e isocianatos de aroílo, tal como isocianato de benzoílo. La reacción del isocianato con el N-óxido se realiza bajo condiciones sustancialmente anhidras añadiendo el isocianato a una disolución del N-óxido en un disolvente inerte, tal como diclorometano. El producto resultante puede aislarse mediante la eliminación del disolvente. La parte (ii) implica la hidrólisis del producto de la parte (i). La reacción pued realizarse mediante métodos convencionales, tal como calentamiento en presencia de agua o un alcanol inferior, opcionalmente en presencia de un catalizador, tal como un hidróxido de metal alcalino o un alcóxido inferior.

Ciertos grupos funcionales indicados en conexión con R_{1} y R_{2} pueden ser incompatibles con algunos de los reactivos del esquema de reacción III. Los compuestos que contienen estos grupos funcionales pueden ser preparados por los expertos en la técnica utilizando métodos muy conocidos de protección y manipulación de grupos funcionales. Por ejemplo, los grupos amina pueden protegerse cuando sea necesario mediante una derivatización con dicarbonato de di-terc-butilo.

Algunos compuestos de fórmula I contienen ciertos grupos funcionales que pueden prepararse con facilidad a partir de otros compuestos de fórmula I. Por ejemplo, los compuestos en los que el sustituyente R_{1} contiene un grupo amida pueden prepararse de modo conveniente haciendo reaccionar un cloruro de ácido con un compuesto de fórmula I, en la que el sustituyente R_{1} contiene una amina primaria. De modo similar, los compuestos en los que el sustituyente R_{1} contiene un grupo urea pueden prepararse haciendo reaccionar un isocianato con un compuesto de fórmula I, en la que el sustituyente R_{1} contiene una amina primaria. Además, los compuestos en los que el sustituyente R_{1} contiene un grupo carbamato pueden prepararse haciendo reaccionar un cloroforinato con un compuesto de fórmula I, en la que el sustituyente R_{1} contiene una amina primaria.

Composiciones farmacéuticas y actividad biológica

Las composiciones farmacéuticas de la invención contienen una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridin-4-amina o su sal farmacéuticamente aceptable, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en la presente, la expresión "una cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad del compuesto suficiente para inducir un efecto terapéutico, tal como la inducción de citoquinas o una actividad antivírica. Aunque la cantidad exacta de compuesto activo utilizado en la composición farmacéutica de la invención variará dependiendo de factores conocidos por los expertos en la técnica, tales como la naturaleza física y química del compuesto, así como la naturaleza del vehículo, y el régimen de dosificación previsto, se anticipa que las composiciones de la invención contendrán suficiente ingrediente activo para proporcionar una dosis de aproximadamente 100 ng/kg a aproximadamente 50 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 10 \mug/kg a aproximadamente 5 mg/kg del compuesto al sujeto. Puede utilizarse cualquiera de las formas de dosificación convencionales, tales como comprimidos, pastillas, formulaciones parenterales, jarabes, cremas, ungüentos, formulaciones en aerosol, parches transdérmicos, parches transmucósicos y similares.

Se ha demostrado que los compuestos de la invención inducen la producción de ciertas citoquinas en experimentos realizados según el método de ensayo indicado a continuación. Esta capacidad indica que los compuestos son útiles como modificadores de la respuesta inmunológica que pueden modular la respuesta inmunológica en una serie de maneras diferentes, haciendo que sean útiles en el tratamiento de una diversidad de trastornos.

Las citoquinas que son inducidas mediante la administración de compuestos según la invención incluyen, en general, interferón (IFN) y factor de necrosis tumoral (TNF), así como ciertas interleuquinas (IL). En particular, los compuestos inducen IFN-\alpha, TNF-\alpha, IL-1, 6, 10 y 12, y una diversidad de otras citoquinas. Entre otros efectos, las citoquinas inhiben la producción de virus y el crecimiento de células tumorales, haciendo que los compuestos sean útiles en el tratamiento de enfermedades víricas y tumores.

Además de la capacidad para inducir la producción de citoquinas, los compuestos afectan a otros aspectos de la respuesta inmunológica innata. Por ejemplo, puede estimularse la actividad de las células asesinas naturales, un efecto que puede ser debido a la inducción de citoquinas. Los compuestos también pueden activar macrófagos que, a su vez, estimulan la secreción de óxido nítrico y la producción de más citoquinas. Además, los compuestos pueden provocar la proliferación y diferenciación de linfocitos B.

Los compuestos de la invención también tienen efecto sobre la respuesta inmunológica adquirida. Por ejemplo, aunque no se cree que se produzca un efecto directo sobre las células T o una inducción directa de citoquinas de células T, la producción de la citoquina IFN-\gamma por células T auxiliares de tipo 1 (Th1) se induce de manera indirecta, y la producción de la citoquina IL-5 por Th2 se inhibe tras la administración de los compuestos. Esta actividad significa que los compuestos son útiles en el tratamiento de enfermedades en las que se desea la sobrerregulación de la respuesta de Th1 y/o la infrarregulación de la respuesta de Th2. A la vista de la capacidad de los compuestos anteriores para inhibir la respuesta inmunológica de células T auxiliares de tipo 2, se espera que los compuestos sean útiles en el tratamiento de enfermedades atópicas, por ejemplo, dermatitis atópica, asma, alergia, rinitis alérgica; como un adyuvante de vacunas para la inmunidad mediada por células; y probablemente como un tratamiento para enfermedades fúngicas recurrentes y clamidia.

Los efectos modificadores de la respuesta inmunológica de los compuestos los hacen útiles en el tratamiento de una amplia diversidad de trastornos. Debido a su capacidad para inducir citoquinas tales como IFN-\alpha y TNF-\alpha, los compuestos son particularmente útiles en el tratamiento de enfermedades víricas y tumores. Esta actividad inmunomoduladora sugiere que los compuestos de la invención son útiles para tratar enfermedades tales como, pero sin limitarse a enfermedades víricas, por ejemplo verrugas genitales, verrugas comunes, verrugas plantares, hepatitis B, hepatitis C, virus del Herpes Simplex de tipo I y tipo II, molluscum contagiosm, HIV, CMV, VZV, neoplasia intraepitelial cervical, papilomavirus humano y neoplasias asociadas; enfermedades fúngicas, por ejemplo, cándida, aspergillus, y meningitis criptocócica; enfermedades neoplásicas, por ejemplo, carcinoma de células basales, leucemia de células pilosas, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células renales, carcinoma de células escamosas, leucemia mielogenosa, mieloma múltiple, melanoma, linfoma no hodgkiniano, linfoma de células T cutáneo y otros cánceres; enfermedades parasitarias, por ejemplo, Pneumocystis carinii, criptosporidiosis, histoplasmosis, toxoplasmosis, infección por tripanosoma y leishmaniasis; e infecciones bacterianas, por ejemplo, tuberculosis y Mycobacterium avium. Otras enfermedades o trastornos que pueden tratarse utilizando los compuestos de la invención incluyen eccema, eosinofilia, trombocitemia esencial, lepra, esclerosis múltiple, síndrome de Ommen, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, lupus discoide, enfermedad de Bowen, y papulosis bowenoide.

Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe un método para inducir la biosíntesis de citoquinas en un animal, que comprende administrar una cantidad eficaz del anterior compuesto al animal. Una cantidad de un compuesto eficaz para inducir la biosíntesis de citoquinas es una cantidad suficiente para provocar que uno o más tipos de células, tales como monocitos, macrófagos, células dendríticas y células B, produzcan una cantidad de una o más citoquinas, como por ejemplo IFN-\alpha, TNF-\alpha, IL-1, 6, 10 y 12, que sea mayor que los niveles de base de dichas citoquinas. La cantidad precisa variará dependiendo de factores conocidos en la técnica, pero se espera que sea una dosis de aproximadamente 100 ng/kg a aproximadamente 50 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 10 \mug/kg a aproximadamente 5 mg/kg. La presente memoria descriptiva describe también un método para tratar una infección vírica en un animal, que comprende administrar una cantidad eficaz del anterior compuesto al animal. Una cantidad eficaz para tratar o inhibir una infección vírica es una cantidad que provoque una reducción en una o más de las manifestaciones de la infección vírica, tales como lesiones víricas, carga vírica, velocidad de producción de virus y mortalidad, comparado con animales control sin tratar. La cantidad precisa variará dependiendo de factores conocidos en la técnica, pero se espera que sea una dosis de aproximadamente 100 ng/kg a aproximadamente 50 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 10 \mug/kg a aproximadamente 5 mg/kg.

La invención se describe más a fondo mediante los siguientes ejemplos, que se proporcionan sólo como ilustración y no pretenden ser limitantes de ninguna manera.

Ejemplo 1

(Ejemplo de referencia)

Compuesto de fórmula XXXI N^{4}-(2-metilpropil)-3-nitro[1,5]naftiridin-4-amina

Se hizo reaccionar oxicloruro de fósforo (0,6 ml, 6,44 mmol) con N,N-dimetilformamida, y después se añadió a una disolución de 3-nitro[1,5]naftiridin-4-ol (1,0 g, 5,23 mmol) en N,N-dimetilformamida (20 ml). La mezcla de reacción se calentó utilizando un matraz con camisa calefactora con acetona a reflujo como fuente de calor. Después de 3 horas, la mezcla de reacción se vertió en agua helada, se añadió isobutilanilina (2,0 ml, 20,1 mmol) y la mezcla se calentó en un baño de vapor. Después de varias horas, la mezcla de reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente, se filtró y se lavó con agua. La capa acuosa se extrajo con diclorometano. El extracto de diclorometano se lavó con bicarbonato de sodio acuoso, se lavó con agua, se secó sobre magnesio, se filtró y después se cargó sobre una capa de gel de sílice. El gel de sílice se eluyó inicialmente con diclorometano para eliminar una impureza, después con metanol al 5% en diclorometano para recuperar el producto. El eluyente se concentró hasta la sequedad para proporcionar N^{4}-(2-metilpropil)-3-nitro[1,5]naftiridin-4-amina como un sólido, p.f. 97-99ºC.

Ejemplo 2

(Ejemplo de referencia)

Compuesto de fórmula XXXIII 2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridina

Parte A

Se añadió sulfato de magnesio (3 g) y una cantidad catalítica de platino al 5% sobre carbono a una disolución de N^{4}-(2-metilpropil)-3-nitro[1,5]naftiridin-4-amina (4,0 g, 16,2 mmol) en acetato de etilo (250 ml). La mezcla de reacción se redujo en un aparato Parr a 50 psi (3,5 kg/cm^{2}) de hidrógeno durante cuatro horas. La mezcla de reacción se filtró para eliminar el catalizador, y el filtrado se concentró al vacío para proporcionar la N^{4}-(2-metilpropil)[1,5]naftiridin-3,4-diamina como un sólido bruto.

Parte B

El sólido bruto de la parte A se suspendió en ácido acético, se combinó con anhídrido acético y después se calentó a reflujo durante la noche. La mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo resultante se reunió con metanol para descomponer el exceso de anhídrido acético, y después se concentró al vacío. El residuo resultante se reunió con ciclohexano y después se concentró al vacío para eliminar el ácido acético. El residuo resultante se recristalizó en hexanos para proporcionar 2,2 g de 2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridina como agujas blancuzcas, p.f. 118-119ºC. Análisis: Calculado para C_{14}H_{16}N_{4}: %C, 69,97; %H, 6,71; %N, 23,31; Encontrado: %C, 69,24; %H, 6,67; %N, 23,23.

Ejemplo 3

(Ejemplo de referencia)

Compuesto de fórmula XXXIV 2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridin-5N-óxido

Se añadió ácido 3-cloroperoxibenzoico (4,5 g al 50%, 13,1 mmol) en pequeñas porciones a lo largo de un periodo de 30 minutos a una disolución de 2-metil -1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridina (2,1 g, 8,7 mmol) en cloroformo a temperatura ambiente. Después de 3 horas, la mezcla de reacción se diluyó con cloroformo, se lavó dos veces con hidróxido de sodio 2,0 M, una vez con agua, y una vez con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio y después se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida (gel de sílice, eluyendo con metanol al 5% en diclorometano) para proporcionar el 2-metil-1-(2-metilpropil) -1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridin-5N-óxido como un sólido, p.f. 228-230ºC. Análisis: Calculado para C_{14}H_{16}N_{4}O: %C, 65,61; %H, 6,29; %N, 21,86; Encontrado: %C, 65,73; %H, 6,31; %N, 21,95.

Ejemplo 4 Compuesto de fórmula I 2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridin-4-amina

5

Se añadió hidróxido de amonio (10 ml) a una disolución de 2-metil -1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridin-5N-óxido (1,1 g, 4,29 mmol) en diclorometano (50 ml). La mezcla de reacción se enfrió en un baño de hielo y después se añadió cloruro de tosilo (0,82 g, 4,29 mmol) en diclorometano. La reacción se calentó hasta aproximadamente 30ºC mientras se agitaba con rapidez. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La capa de diclorometano se separó, se lavó con hidróxido de sodio al 10%, agua y salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio, y después se concentró al vacío. El residuo se recristalizó en acetato de etilo para proporcionar 0,8 g de 2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridin-4-amina como un sólido, p.f. 228-230ºC. Análisis: Calculado para C_{14} H_{17}N_{5}: %C, 65,86; %H, 6,71; %N, 27,43; Encontrado: %C, 65,65; %H, 6,69; %N, 27,59.

Métodos de ensayo Inducción de citoquinas en células humanas

Se utilizó un sistema de células sanguíneas humanas in vitro para evaluar la inducción de citoquinas por los compuestos de la invención. La actividad se basa en la medida del interferón y el factor de necrosis tumoral (\propto) (IFN y TNF, respectivamente) segregados hacia el medio de cultivo, según se describe en Testerman et al., en "Cytokine Induction by the Immunomodulators Imiquimod and S-27609", Journal of Leukocyte Biology, 58, 365-372 (septiembre, 1995).

Preparación de células sanguíneas para el cultivo

Se recogió sangre completa de donantes humanos sanos mediante venipunción hacia tubos de tipo vacutainer con EDTA. Se separaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la sangre completa mediante centrifugación en gradiente de densidad Histopaque®-1077 (Sigma Chemicals, St. Louis, MO). Las PBMC se suspendieron a 1,5-2 x 10^{6} células/ml en medio RPMI 1640 que contiene suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, y disolución de penicilina/estreptomicina al 1% (RPMI completo). Se añadieron porciones de 1 ml de la suspensión de PBMC a placas de cultivo de tejidos estériles de fondo plano de 24 pocillos.

Preparación del compuesto

Los compuestos se solubilizaron en dimetilsulfóxido (DMSO). La concentración de DMSO no debe ser mayor que una concentración final de 1% para la adición a los pocillos de cultivo. Los compuestos se ensayan, en general, a un intervalo de concentración de 0,1 a 100 \muM.

Incubación

La disolución del compuesto de ensayo se añade a los pocillos que contienen 1 ml de PBMC en medio. Las placas se cubren con tapas de plástico, se mezclan con suavidad y después se incuban durante 18 a 24 horas a 37ºC en una atmósfera de dióxido de carbono al 5%.

Separación

Después de la incubación, las placas se centrifugan durante 5-10 minutos a 1000 rpm (aproximadamente 200 x g) a 4ºC. El sobrenadante del cultivo celular se retira con una pipeta de polipropileno estéril y se traslada a un criotubo estéril de 2 ml. Las muestras se mantienen a -70ºC hasta el análisis.

Análisis/cálculo de interferón

El interferón se determina mediante un bioensayo que utiliza células de carcinoma pulmonar humano A549 expuestas a encefalomiocarditis. Los detalles del método de bioensayo han sido descritos por G. L. Brennan y L. H. Kronenberg en "Automated Bioassay of Interferons in Micro-test Plates", Biotechniques, junio/julio, 78, 1983, incorporado en la presente como referencia. Expuesto con brevedad, el método es el siguiente: células A549 se incuban con muestras y diluciones patrón de interferón a 37ºC durante 24 horas. Las células incubadas entonces se infectan con un inóculo de virus de la encefalomiocarditis. Las células infectadas se incuban durante 24 horas más a 37ºC antes de cuantificar el efecto citopático vírico. El efecto citopático vírico se cuantifica mediante tinción, seguido de la puntuación visual de las placas. Los resultados se expresan como unidades de referencia alfa/ml basándose en el valor obtenido para el patrón de IFN de leucocitos humanos NIH.

Análisis del factor de necrosis tumoral (\propto)

La concentración del factor de necrosis tumoral (\propto) (TNF) se determina utilizando un kit de ELISA disponible en Genzyme, Cambridge, MA. Los resultados se expresan como pg/ml.

En la tabla a continuación, un "+" indica que el compuesto induce la citoquina indicada a esa concentración particular, un "-" indica que el compuesto no induce la citoquina indicada a esa concentración particular, y un "\pm" indica que los resultados fueron equívocos a esa concentración particular.

Inducción de citoquinas en células humanas
	IFN	TNF
Ejemplo	Concentración de la dosis (\muM)	Concentración de la dosis (\muM)
	0,1	1,0	10,0	100,0	0,1	1,0	10,0	100,0
4	No realizado	+	+	+	No realizado	-	+	-

Inducción de interferón (\alpha) en células humanas

Se utilizó un sistema de células sanguíneas humanas in vitro para evaluar la inducción de interferón por los compuestos de la invención. La actividad se basa en la medida del interferón segregado hacia el medio de cultivo. El interferón se mide mediante un bioensayo.

Preparación de células sanguíneas para el cultivo

Se recogió sangre completa mediante venipunción hacia tubos de tipo vacutainer con EDTA. Se separaron células mononucleares de sangre periférica (PBM) de la sangre completa utilizando tubos de separación de células de marca LeucoPREP^{TM} (disponibles en Becton Dickinson) o una disolución Ficoll-Paque® (disponible en Pharmacia LKB Biotechnology Inc, Piscataway, NJ). Las PBM se suspendieron a 1 x 10^{6}/ml en medio RPMI 1640 (disponible en GIBCO, Grand Island, NY) que contiene HEPES 25 mM (ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etansulfónico) y L-glutamina (se añadió una disolución de penicilina/estreptomicina al 1%) con adición de suero autólogo al 10% inactivado con calor (56ºC durante 30 minutos). Se añadieron porciones de 200 \mul de la suspensión de PBM a placas de cultivo de tejido estériles MicroTest III (fondo plano) de 96 pocillos.

Preparación del compuesto

Los compuestos se solubilizaron en etanol, sulfóxido de dimetilo o agua de cultivo de tejido, después se diluyeron con agua de cultivo de tejido, hidróxido de sodio 0,01 N o ácido clorhídrico 0,01 N (la elección del disolvente dependerá de las características químicas del compuesto que se está ensayando). La concentración de etanol o DMSO no debe ser mayor que una concentración final de 1% para la adición a los pocillos de cultivo. Los compuestos se ensayaron inicialmente a un intervalo de concentración de aproximadamente 0,1 \mug/ml a aproximadamente 5 \mug/ml. Los compuestos que muestran inducción a una concentración de 0,5 \mug/ml entonces se ensayaron a un intervalo mayor de concentración.

Incubación

La disolución del compuesto de ensayo se añadió a un volumen (menor o igual que 50 \mul) a los pocillos que contienen 200 \mul de sangre completa diluida o de PBM en medio. Se añadió disolvente y/o medio a pocillos control (pocillos sin compuesto de ensayo) y según fuera necesario para ajustar el volumen final de cada pocillo a 250 \mul. Las placas se cubrieron con tapas de plástico, se mezclan en vórtice con suavidad y después se incubaron durante 48 horas a 37ºC en una atmósfera de dióxido de carbono al 5%.

Separación

Después de la incubación, las placas se cubrieron con película parafilm y después se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 a 15 minutos a 4ºC en una centrífuga Damon IEC modelo CRU-5000. Se retiró el medio (aproximadamente 200 \mul) de 4 a 8 pocillos, y se reunió en viales de congelación estériles de 2 ml. Las muestras se mantuvieron a -70ºC hasta el análisis.

Análisis/cálculo de interferón

El interferón se determina mediante un bioensayo que utiliza células de carcinoma pulmonar humano A549 expuestas a encefalomiocarditis. Los detalles del método de bioensayo han sido descritos por G. L. Brennan y L. H. Kronenberg en "Automated Bioassay of Interferons in Micro-test Plates", Biotechniques, junio/julio, 78, 1983, incorporado en la presente como referencia en su totalidad. Expuesto con brevedad, el método es el siguiente: diluciones de interferón y células A549 se incuban a 37ºC durante 12 a 24 horas. Las células incubadas se infectan con un inóculo de virus de la encefalomiocarditis. Las células infectadas se incuban durante más tiempo a 37ºC antes de cuantificar el efecto citopático vírico. El efecto citopático vírico se cuantifica mediante tinción, seguida de medidas de absorbancia espectrofotométricas. Los resultados se expresan como unidades de referencia alfa/ml basándose en el valor obtenido para el patrón de IF-L de leucocitos humanos NIH. El interferón se identificó como esencialmente interferón-alfa mediante ensayos de neutralización de tablero de damas contra anti-interferón humano de conejo (beta) y anti-interferón humano de cabra (alfa) utilizando monocapas de células A549 expuestas al virus de la encefalomiocarditis.

En la tabla a continuación, un "+" indica que el compuesto induce el interferón-\alpha a esa concentración particular, un "-" indica que el compuesto no induce el interferón-\alpha a esa concentración particular, y un "\pm" indica que los resultados fueron equívocos a esa concentración particular.

Inducción de interferón (\alpha) en células humanas
Ejemplo	Concentración de la dosis (\mug/ml)
	0,1	0,05	0,10	0,50	1,0	5,0	10,0	25,0	50,0
4	-	+	+	+	+	+	+	+	+

La presente invención se ha descrito con referencia a diversas realizaciones de la misma. La descripción detallada y los ejemplos precedentes se han proporcionado solamente para que se comprenda con claridad, y no se deben entender como limitaciones innecesarias. Será evidente para un experto en la técnica que se pueden hacer muchos cambios en las realizaciones descritas sin apartarse del alcance de la invención. Por tanto, el alcance de la invención no debe estar limitado a los detalles exactos de las composiciones y estructuras descritas en la presente memoria, sino más bien por el lenguaje de las reivindicaciones que siguen.

Claims (6)

1. El compuesto 2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftiridin-4-amina o su sal farmacéuticamente aceptable.

2. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un compuesto o sal de la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. El compuesto o sal según la reivindicación 1, para su uso en un método para inducir la biosíntesis de citoquinas en un animal.

4. El uso del compuesto o sal según la reivindicación 1, para preparar un medicamento para inducir la biosíntesis de citoquinas en un animal.

5. El compuesto o sal según la reivindicación 1, para su uso en un método para tratar una infección vírica en un animal.

6. El uso del compuesto o sal según la reivindicación 1, para preparar un medicamento para tratar una infección vírica en un animal.