CZ307184B6

CZ307184B6 - 2-Methyl-1-(2-methylpropyl)-1H-imidazo[4,5-c][1,5]naftyridin-4-amin a farmaceutická kompozice s jeho obsahem

Info

Publication number: CZ307184B6
Application number: CZ2007-268A
Authority: CZ
Inventors: Kyle J. Lingstrom
Original assignee: Minnesota Mining And Manufacturing Company
Priority date: 1997-12-11
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2018-02-28
Also published as: US20030083500A1; US6624172B2; RU2221798C2; US20030212093A1; US7678918B2; CA2311456C; EE04314B1; US6638944B2; RU2314307C2; AU753864B2; PL341159A1; US20070167481A1; CA2311456A1; US20050288320A1; WO1999029693A8; IL178091A; DE69835309T2; NO20035718D0; KR20040011532A; EE200000349A

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká 2-methyl-l-(2-methylpropyl)-l//-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridin4-aminu a jeho farmaceuticky vhodných solí a farmaceutických kompozic obsahujících tyto sloučeniny. Dalším aspektem předkládaného vynálezu je použití těchto sloučenin jako imunomodulátoru a pro indukci biosyntézy cytokinu, jakož i léčení virových a neoplastických chorob v živočiších.

Dosavadní stav techniky

První spolehlivá zpráva o l/7-imidazo[4,5-c]chinolinovém kruhovém systému, Backman a kol., J. Org. Chem., 15, 1278 až 1284 (1950) popisuje syntézu l-(6-methoxy-8-chinolinyl)-2methyl-l//-imidazo[4,5-c]chinolinu a jeho možné použití jako antimalarického činidla. Později byly oznámeny syntézy různě substituovaných l//-imidazo-[4,5-c]chinolinu. Tak například Jain a kok, J. Med. Chem. 11, str. 87 až 92 (1968) syntetizovali 1 -[2-(4-piperidyl)—ethyl]-1Himidazo[4,5-c]chinolin jakožto potenciální antikonvulsivní a kardiovaskulární činidlo. Také Baranov a kol., Chem. Abs. 85, 94362 (1976) oznámili syntézu několika 2-oximidazo[4,5c]chinolinu a Berenyi a kol., J. Heterocyclic Chem. 18, 1537 až 1540 (1981) rovněž oznámili syntézu určitých 2-oxoimidazo[4,5-c]-chinolinů.

O určitých 17/-imidazo[4,5-c]chinolin-4-aminech a 1- a jejich 2-substituovaných derivátech bylo zjištěno, že jsou užitečné jako protivirová činidla, bronchodilatátory a imunomodulátory. Tyto sloučeniny jsou popsány v patentech US 4 689 338; US 4 698 348; US 4 929 624; US 5 037 986; US 5 268 376; US 5 346 905; a US 5 389 640, které jsou zde uváděny jako odkaz. Ačkoliv je stále zájem o sloučeniny s imidazochinolinovým kruhovým systémem, jak vyplývá například z WO 98/30 562, pokračuje potřeba sloučenin, které mají schopnost modulovat imunitní odezvu indukcí biosyntézy cytokinu nebo jinými mechanizmy.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je 2-methyl-l-(2-methylpropyl)-lH-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridin-4amin strukturního vzorce I

NH₂ (I) a jeho farmaceuticky vhodné soli.

Tyto sloučeniny indukují biosyntézu cytokinu v živočiších.

Předmětem vynálezu je také farmaceutická kompozice obsahující farmaceuticky účinné množství sloučeniny vzorce I nebo její farmaceuticky vhodné soli a farmaceuticky přijatelný nosič.

Předmětem vynálezu je dále také

- způsob indukce biosyntézy cytokinu;

- způsob léčení virové choroby; a

- způsob léčení neoplastické choroby;

v živočichovi. Podstata těchto způsobů spočívá v tom, že se živočichovi podá účinné množství sloučeniny vzorce I nebo její farmaceuticky vhodné soli nebo farmaceutické kompozice obsahující tuto sloučeninu nebo její sůl.

Sloučenina vzorce I je užitečná jako modifikátor imunitní odezvy v důsledku své schopnosti indukovat biosyntézu cytokinu a jinak modulovat imunitní odezvu, když je podána živočichům. Tato schopnost činí tuto sloučeninu užitečnou při léčbě různých stavů, například virových nemocí a nádorů, které jsou citlivé na takové změny v imunitní odezvě.

2-Methyl-l-(2-methylpropyl)-l/7-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridin-4-amin vzorce I se může připravit podle následujícího reakčního schématu

Reakční schéma

(4) (2)

Ve stupni I reakčního schématu se chloruje 3 nitro [ 1.5jnaft\ ridin 4 <7l vzorce XXIX za použití vhodného chloračního činidla, jako je oxychlorid fosforečný, čímž se získá 4-chlor-3nitrof 1,5]nafityridin vzorce XXX. Reakce se může provést reakcí sloučeniny vzorce XXIX s

-2CZ 307184 B6 oxychloridem fosforečným ve vhodném rozpouštědle, jako je Ν,Ν-dimethylformamid za mírného zahřívání (cca 55 °C). Sloučenina se může izolovat konvenčními způsoby nebo se použít bez izolace, jak je popsáno dále ve spojení se stupněm 2. Sloučenina vzorce XXIX je známá a její příprava je popsána Hartem v Journal ofthe Chemical Society, str. 212-214 (1956).

Ve stupni 2 reakčního schématu reaguje 4-chlor-3-nitro[l,5]naftyridin vzorce XXX s isobutylaminem za vzniku 3 -nitro| l.5jnaftyridin-4-aminu vzorce XXXI. Reakce se může provádět přidáním vody a potom přebytku aminu k reakční směsi vznikající ve stupni 1 a potom zahříváním v parní lázni. Reakce se také může provést přidáním přebytku aminu k roztoku sloučeniny XXX ve vhodném rozpouštědle, jako je dichlormethan, a případně za zahřívání.

Ve stupni 3 reakčního schématu se redukuje 3-nitro-[l,5]naftyridin-4-amin vzorce XXXI na [l,5]naftyridin-3,4-diamin vzorce XXXII. Reakce se výhodně provádí za použití konvenčního heterogenního hydrogenačního katalyzátoru, jako je platina na uhlíku nebo palladium na uhlíku. Reakce se konvenčně provádí v Parrově aparatuře ve vhodném rozpouštědle, jako je ethylacetát.

Ve stupni 4 reakčního schématu reaguje sloučenina vzorce XXXII s kyselinou octovou nebo s jejím ekvivalentem za vzniku lH-imidazo[4,5-c][l,7]naftyridinu vzorce XXX1I1. Vhodné ekvivalenty kyseliny octové jsou halogenidy kyselin, ortoestery a 1,1 -dialkoxyalkyl alkanoáty. Reakce se může provádět v nepřítomnosti rozpouštědla, v karboxylové kyselině, jako je kyselina octová, nebo v inertním rozpouštědle v přítomnosti kyseliny octové. Reakce se provádí za dostatečného zahřívání, aby se odstraňoval alkohol nebo voda tvořené jako vedlejší produkty reakce.

Alternativně, stupeň 4 se může provést (i) reakcí sloučeniny vzorce XXXII acylačním činidlem; a potom (ii) cyklizací produktu. Část (i) zahrnuje reakci sloučeniny vzorce XXXII s acetylchloridem nebo acetylbromidem. Reakce se může provést přidáním acetylhalogenidu regulovaným způsobem (například po kapkách) k roztoku sloučeniny vzorce XXXII ve vhodném rozpouštědle, jako je dichlormethan, při snížené teplotě (například 0 °C). Vzniklý amidový meziprodukt se může izolovat odstraněním rozpouštědla. Část (ii) zahrnuje cyklizací produktu z části (ii) jeho reakcí s methanolickým amoniakem za zvýšené teploty (například 150 °C) a tlaku.

Ve stupni 5 reakčního schématu se sloučenina vzorce XXXIII oxiduje za použití konvenčního oxidačního činidla, které je schopné tvořit A-oxidy za vzniku l//-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridin5A-oxidu vzorce XXXIV. Výhodné reakční podmínky zahrnují reakci roztoku sloučeniny vzorce XXXIII v chloroformu s 3-chlorperoxybenzoovou kyselinou při okolních podmínkách.

Ve stupni 6 reakčního schématu se sloučenina vzorce XXXIV aminuje a poskytuje 2-methyl-l(2-methylpropyl)-l7/-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridin-4-amin vzorce I. Stupeň 6 zahrnuje (i) reakci sloučeniny vzorce XXXIV s acylačním činidlem; a potom (ii) reakci produktu s aminačním činidlem. Část (i) stupně 6 zahrnuje reakci A-oxidu s acylačním činidlem. Vhodná acylační činidla zahrnují alkyl- nebo arylsulfonylchloridy (například benzensulfonylchlorid, methansulfonylchlorid, /j-toluensulfonylchlorid). Výhodné jsou arylsulfonylchloridy, nejvýhodnější je p-toluensulfonylchlorid. Část (ii) stupně 6 zahrnuje reakci produktu z části (i) s přebytkem aminačního činidla. Vhodná aminační činidla zahrnují amoniak (například ve formě hydroxidu amonného) a amonné soli (například uhličitan amonný, hydrogenuhličitan amonný, fosforečnan amonný). Výhodný je hydroxid amonný. Reakce se výhodně provádí rozpuštěním X-oxidu vzorce XXXIV v inertním rozpouštědle, jako je dichlormethan, přidáním aminačního činidla k roztoku a potom přidáním acylačního činidla. Výhodné podmínky zahrnují chlazení na teplotu okolo 0 °C až okolo 5 °C během přidávání acylačního činidla. Produkt nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl se mohou izolovat konvenčními způsoby.

Alternativně se stupeň 6 může připravit (i) reakcí sloučeniny vzorce XXXIV s isokyanátem; a potom (ii) hydrolýzou produktu. Část (i) zahrnuje reakci V—oxidu s isokyanátem, kde isokyanátová skupina je vázána ke karbonylové skupině. Výhodné isokyanáty zahrnují

- 3 CZ 307184 B6 trihalogenisokyanát a aroylisokyanáty, jako je benzoylisokyanát. Reakce isokyanátu s A-oxidem se provádí v podstatě při bezvodých podmínkách přidáním isokyanátu k roztoku N-oxidu v inertním rozpouštědle, jako je dichlormethan. Vzniklý produkt se může izolovat odstraněním rozpouštědla. Část (ii) zahrnuje hydrolýzu produktu z části (i). Reakce se může provést konvenčními způsoby, jako je zahřívání v přítomnosti vody nebo nižšího alkanolu, případně v přítomnosti katalyzátoru, jako je hydroxid alkalického kovu nebo nižší alkoxid.

Určité meziprodukty používané k přípravě sloučeniny vzorce I nebyly dosud popsány.

Farmaceutické kompozice (prostředky) podle vynálezu obsahují terapeuticky účinné množství sloučeniny vzorce I, jak je definována shora, nebo její farmaceuticky vhodné soli (skupina těchto látek je dále označována termínem sloučeniny podle vynálezu), v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem. Výraz farmaceuticky účinné množství, jak se zde používá, zahrnuje množství sloučenin, které je dostatečné k indukci terapeutického účinku, jakoje indukce cytokinu a protivirová účinnost. Ačkoliv přesné množství aktivní sloučeniny použité ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu bude závislé na faktorech známých ve stavu techniky, jako je povaha nosiče a předpokládaný dávkový režim, předpokládá se, že kompozice podle vynálezu bude poskytovat dostatečné množství aktivní složky, jestliže poskytne dávku subjektu od okolo 100 pg/kg do okolo 50 mg/kg, výhodně od okolo 10 pg/kg do okolo 5 mg/kg sloučeniny. Jako dávkové formy se mohou použít jakékoliv konvenční dávkové formy, jako jsou například tablety, pastilky, parenterální formulace, sirupy, krémy, masti, aerosolové formulace, transdermální náplasti a transmukosální náplasti apod.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu vykazují schopnost produkovat určité cytokiny v experimentech prováděných podle zkušebních metod popsaných dále. Tato schopnost indikuje, že tyto sloučeniny jsou užitečné jako modifikátory imunitní odezvy, které mohou modulovat imunitní odezvu v řadě různých způsobů, což je činí užitečnými při léčbě řady chorob.

Cytokiny, které jsou indukovány podáním sloučenin podle vynálezu, obecně zahrnují interferon (1FN) a faktor nekrózy nádorů (TNF) a rovněž některé interleukiny (IL). Zejména sloučeniny podle vynálezu indukují IFN-a, TNF-cc, IL-1, 6, 10 a 12 a řadu jiných cytokinu. Mezi další účinky patří schopnost cytokinu inhibovat produkci virů a růst nádorových buněk, což činí tyto sloučeniny užitečné při léčbě nádorových a virových nemocí.

Vedle své schopnosti indukovat produkci cytokinu, sloučeniny podle vynálezu ovlivňují další aspekty přirozené imunitní odezvy. Například může být stimulována přirozená ničivá buněčná aktivita, což je účinek, ke kterému dochází v důsledku indukce cytokinu. Sloučeniny podle vynálezu mohou také aktivovat makrofágy, což zase stimuluje vylučování oxidu dusičného a produkci dalších cytokinu. Dále, sloučeniny podle vynálezu mohou způsobovat proliferaci a diferenciaci B-lymfocytů.

Sloučeniny podle vynálezu mají také účinek na získanou imunitní odezvu. Například, ačkoliv se má za to, že nemají jakýkoliv přímý účinek na buňky T nebo na přímou indukci cytokinu T buněk, produkce Thl (T helper type 1) cytokinu IFN-gama je indukována nepřímo a produkce Th2 IL—5 je inhibována po podání sloučenin. Tato účinnost znamená, že sloučeniny jsou účinné při léčbě nemocí, kde je požadována regulace Thl odezvy směrem nahoru a/nebo regulace Th2 odezvy směrem dolů. S ohledem na schopnost sloučenin vzorce I a vzorce II inhibovat Th2 imunitní odezvu, očekává se, že sloučeniny podle vynálezu budou užitečné při léčbě atopie, například atopické dermatitidy, astma, alergie, alergické rinitidy; jako vakcínové adjuvans pro imunitu zprostředkovanou buňkou; a jako možná léčba pro recidivující fungální choroby a chlamydii.

Modifikující účinky sloučenin podle vynálezu na imunitní odezvu je činí užitečnými při léčbě řady stavů. Vzhledem ke své schopnosti indukovat cytokiny, jako je IFN-a, TNF-α, jsou sloučeniny podle vynálezu zejména užitečné při léčbě virových nemocí a nádorů.

-4CZ 307184 B6

Imunomodulační účinnost předpokládá, že sloučeniny podle vynálezu jsou užitečné při léčbě nemocí, jako jsou, nikoliv však s omezením na virové nemoci, například bradavice na genitáliích, na chodidlech, bradavice obecně, Hepatitis B, Hepatitis C, Herpes Simplex Typ I a Typ II, moluskum kontagiózní, HIV, CMV, N7N, cervikální intraepiteliální neoplasie, lidský papileomavirus a spojené neoplazie; fungální nemoci, například kandida aspergillus, kryptokokální meningitida; neoplastické nemoci, jako je například bazální buněčný karcinom; buněčná leukemie, Kaposiův sarkom, reneální buněčný karcinom, plochý buněčný karcinom, myelogenózní leukemie, násobný myelom, melanom, ne-Hodgkinův lymfom, kožní T-buněčný lymfom a ostatní rakoviny; parasitické nemoci, například pneumocystis camii, cryptosporidiosis, histoplasmosis, toxoplasmosis, trypanosová infekce, leishmaniaóza; bakteriální infekce, například tuberkulóza, mykobakterium avium. Další nemoci a choroby, které mohou být ošetřeny za použití sloučenin podle vynálezu, zahrnují ekzém, eosinofilii, esenciální thrombocythaemii, malomocenství, násobnou sklerózu, Ommenův syndrom, revmatickou artritida, systemický lupus erythematosis, diskoidní lupus, Bowenovu nemoc a Bowenoidní papulosis.

Podle toho vynález poskytuje způsob indukování biosyntézy cytokinu u živočichů, který spočívá v tom, že se živočichovi podá účinné množství sloučeniny vzorce I. Množství sloučeniny účinné k indukování biosyntézy cytokinu je množství dostatečné k tomu, aby způsobilo u jedné nebo více buněčných typů, jako jsou monocyty, makrofágy, dendritické buňky a B-buňky, produkovat množství jednoho nebo více cytokinu, například INF-α, TNF-a, IL-1, 6, 10 a 12, které je zvýšeno nad předpokládanou úroveň takových cytokinu. Přesné množství se bude lišit v závislosti na faktorech známých ve stavu techniky, ale dá se očekávat, že dávka bude obsahovat okolo od 100 ng/kg až do okolo 50 mg/kg, výhodně od 10 pg/kg až okolo 5 mg/kg. Vynález dále poskytuje způsob léčení virové infekce u živočichů, který spočívá v tom, že se podá živočichovi účinné množství sloučeniny vzorce I. Účinné množství k léčbě nebo k inhibici virové infekce je množství, které způsobí redukci jednoho nebo více projevů virové infekce, jako jsou virové léze, virové zatížení, rychlost tvorby virů a mortalita, ve srovnání s neošetřenými kontrolními zvířaty. Přesné množství bude závislé na faktorech známých ve stavu techniky, ale lze očekávat, že dávka bude obsahovat od 100 ng/kg do okolo 50 mg/kg, výhodně od okolo 10 pg/kg až okolo 5 mg/kg.

Předkládaný vynález je dále popsán následujícími příklady, které mají pouze ilustrativní charakter a v žádném případě neomezují rozsah vynálezu.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Sloučenina vzorce XXXI

A^/4-(2-Methylpropyl)-3-nitro[l ,5]naftyridin-4-amin

Oxychlorid fosforečný (0,6 ml, 6,44 mmol) se nechá reagovat s Ν,Ν-dimethylformamidem a potom se přidá k roztoku 3-nitro[l,5]naftyridin-4-olu (1,0 g, 5,23 mmol) v N,Ndimethylformamidu (20 ml). Reakční směs se zahřeje za použití v nádobě s duplikátorovým pláštěm s refluxujícím acetonem jako zdrojem tepla. Po 3 hodinách se reakční směs vlije do vody, přidá se isobutylamin (2,0 ml, 20,1 mmol) a směs se zahřívá v parní lázni. Po několika hodinách se reakční směs ochladí na teplotu místnosti, přefiltruje a promyje vodou. Vodná vrstva se extrahuje dichlormethanem. Dichlormethanový extrakt se promyje vodným hydrogenuhličitanem sodným, promyje vodou, vysuší nad síranem horečnatým a nanese na vrstvu silikagelu. Silikagel se ihned eluuje dichlormethanem k odstranění nečistot a potom 5% methanolem v dichlormethanu k získání produktu. Eluent se zkoncentruje do sucha a získá se #-(2 -methylpropyl)-3-nitro[l,5]naftyridin-4-amin jako pevná látka, teploty tání 97 až 99 °C.

- 5 CZ 307184 B6

Příklad 2

Sloučenina vzorce XXXIII

2-Methyl-l-(2-methylprop_\l)l//-imidazo(4.5-c][l.5|iiaftyridin

Část A:

Síran horečnatý (3 g) a katalytické množství 5% platiny na uhlíku se přidá k roztoku A⁴—(2— methylpropyl)-3-nitro[l,5]naftyridin-4-aminu (4,0 g, 16,2 mmol) v ethylacetátu (250 ml). Reakční směs se redukuje na Paarově aparatuře při 0,35 MPa tlaku vodíku po dobu 4 hodin. Reakční směs se filtruje k odstranění katalyzátoru a filtrát se koncentruje ve vakuu a získá se V⁴(2-methylpropyl)[l,5]-naftyridin-3,4-diamin jako surová pevná látka.

Část B:

Surová pevná látka z části A se přenese do kyseliny octové, smísí se s anhydridem kyseliny octové a zahřívá se při zpětném toku přes noc. Reakční směs se koncentruje ve vakuu. Vzniklý zbytek se smísí s methanolem za účelem rozkladu přebytku anhydridu kyseliny octové a potom se koncentruje ve vakuu. Vzniklý zbytek se smísí s cyklohexanem a potom se koncentruje ve vakuu k odstranění kyseliny octové. Vzniklý zbytek se rekrystaluje z hexanů a získá se 2,2 g 2-methyl-l-(2-methylpropyl)-17/-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridinu jako ne zcela bílé jehličky, teploty tání 118 až 119 °C. Analýza: Vypočteno pro C|₄H₁₆N₄: %C, 69,97; %H, 6,71; %N, 23,31; Nalezeno: %C, 69,24; %H, 6,67; %N, 23,23.

Příklad 3

Sloučenina vzorce XXXIV

2- Methyl-l-(2-methylpropyl)-l//-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridin-5N-oxid

3- Chlorperoxybenzoová kyselina (4,5 g, 50%, 13,1 mmol) se přidá v malých dávkách v průběhu 30 minut při teplotě místnosti k roztoku 2-methyl-l-(2-methylpropyl)-l//-imidazo-[4,5c][ 1,5]naftyridinu (2,1 g, 8,7 mmol). Po 3 hodinách se reakční směs zředí chloroformem, promyje se dvakrát 2,0M hydroxidem sodným, jedenkrát vodou a jedenkrát solankou, suší se nad síranem horečnatým a koncentruje se ve vakuu. Zbytek se čistí chromatografií (silikagel, eluce 5% methanolem v dichlormethanu) a získá se 2- meth\ l l-(2-methylpropyl)-l H—imidazo[4,5cJnaftyridin-óN-oxid jako pevná látka, teploty tání 228 až 230 °C. Analýza: Vypočteno pro C|₄H₁₆N₄O: %C, 65,61; %H, 6,29; %N, 21,86; Nalezeno: %C, 65,73; %H, 6,31; %N, 21,95.

Příklad 4

Sloučenina vzorce 1

2-Methyl-l-(2-methylpropyl)-l//-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridin-4-amin

-6CZ 307184 B6

Hydroxid amonný (10 ml) se přidá k roztoku 2-methyl-l-(2-methylpropyl)-l//-imidazo[4,5c][l,5]naftyridin-5N-oxidu (1,1 g, 4,29 mmol) v dichlormethanu (50 ml). Reakční směs se ochladí v ledové lázni a potom se přidá tosylchlorid (0,82 g, 4,29 mmol) v dichlormethanu. Reakční směs se ohřeje na přibližně 30 °C, přičemž se intenzivně míchá. Reakční směs se míchá při teplotě okolí přes noc. Dichlormethanová vrstva se oddělí, promyje se 10% hydroxidem sodným, vodou a solankou, suší se nad síranem horečnatým a koncentruje se ve vakuu. Zbytek se rekrystalizuje z ethylacetátu a získá se 0,8 g 2-methyl-l-(2-methylpropyl)-l/7-imidazo[4,5ú][l.5|naftyridin-4-aminu jako pevná látka, teploty tání 228 až 230 °C. Analýza: Vypočteno pro C|₄H_I7N₅: %C, 65,86; %H, 6,71; %N, 27,43; Nalezeno: %C, 65,65; %H, 6,69; %N, 27,59.

Zkušební metody

Indukce cytokinu v humánních buňkách

Pro stanovení indukce cytokinu sloučeninami podle vynálezu se používá in vitro systému humánních krvinek. Účinnost sloučenin se měří na základě měření množství interferonu a faktoru nekrózy nádorů (a) (IFN, respektive TNF), vyloučených do kultivačního média, jak popsali Testerman a kol. v Cytokine Induction by Immunomodulators Imiquimid and S-27609, Journal of Leukocyte Biology, 58, 365-372 (září 1995).

Krvinkový přípravek pro kultivaci

Úplná krev se odebere zdravým dárcům venipunkturou do zkumavek EDTA vacutainer. Periferní krevní mononukleární buňky (PBM) se oddělí od celkové krve pomocí Histopaque^R-1077 (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) odstředěním. PMMC se suspenduji při 1,5 až 2 x 10 buněk/ml v médiu RPMI 1640 obsahující 10% fetálního hovězího séra, 2mM L-glutamin a 1% roztok penicilin-streptomycinový roztok (RPMI kompletní). Do 24 jamek s plochým dnem kultivačních desek pro kultivaci tkání se přidá 1 ml dávky suspenze PBMC.

Výroba přípravků na bázi sloučenin podle vynálezu

Sloučeniny se rozpustí v dimethylsulfoxidu (DMSO). Koncentrace v DMSO pro přidání do kulturních jamek by neměla překročit finální koncentraci 1 %. Sloučeniny jsou obvykle testovány v koncentracích v rozsahu od 0,1 do 100pM.

Inkubace

Roztok testované sloučeniny se přidá do jamek obsahujících 1 ml PBMC v médiu. Desky se zakryjí plastovými víčky, jemně se promíchají a potom se inkubují při 37 °C v atmosféře obsahující 5 % oxidu uhličitého po dobu 18 až 14 h.

Separace

Po inkubaci se desky odstřeďují 5 až 10 minut při 1000 otáčkách za minutu (cca 200xg) při teplotě 4 °C. Buněčný kulturní supernatant se odstraní sterilní polypropylenovou pipetou a převede se do 2 ml sterilní kryozkumavky. Vzorky se udržují při teplotě -70 °C do analýzy.

- 7 CZ 307184 B6

Analýza/výpočet na interferon

Interferon se stanovuje biologickým stanovením za použití buněk z humánního plicního karcinomu A549, které byly vyprovokovány pomocí viru encephalomyocarditis. Podrobnosti tohoto biologického stanovení jsou uvedeny v G. L. Brennan a L. H. Kronenberg Automated Bioassay of Interferons in Micro-test Plates. Biotecniques, červen/červenec, 78, 1983, uváděné zde jako odkaz. Tento postup lze v krátkosti popsat takto. Buňky A549 se inkubují se vzorky a standardními zředěnými interferonovými vzorky při 37 °C po dobu 24 hodin. Inkubované buňky se infikují inokulem viru encephalomyocarditis. Infikované buňky se inkubují další období při 37 °C a potom se kvantitativně vyhodnotí virový cytopatoický účinek. Virový cytopatoický účinek se kvantifikuje obarvením vzorku a následným vizuálním hodnocením desek. Výsledky jsou vyjádřeny v hodnotách referenční jednotky interferonu (a) na mililitr a jsou vztaženy na hodnotu pro standard NIH HL IFN.

Analýza faktoru nekrózy nádorů (a)

Koncentrace faktoru nekrózy nádorů (a) (TNF) se stanoví za použití soupravy ELISA, která je dostupná od fy Genzyme, Cambridge, MA. Výsledky jsou vyjádřeny v pg/ml.

V tabulce uvedené dále + indikuje, že sloučenina indukovala indikovaný cytokin v této koncentraci, indikuje, že sloučenina neindukovala indikovaný cytokin v této koncentraci, a + indikuje, že výsledky byly stejné při této koncentraci.

Indukce cytokinu v lidských buňkách
	IFN	TNF
Příklad#	Koncentrace dávky (μΜ)	Koncentrace dávky (μΜ)
	0,1	1,0	10,0	100,0	0,1	1,0	10,0	100,0
—-----η ⁴ neprovedeno	+	+	+	neprovedeno	-	+	-

Indukce interferonu (a) v lidských buňkách

Ke stanovení indukce interferonu u sloučenin podle vynálezu byl použit systém lidských krvinek in vitro. Účinnost je měřena pomocí interferonu, vyloučeného do kultivačního prostředí. Interferon je měřen pomocí biozkoušky.

Příprava krvinek pro kultivaci

Veškerá krev se odebere venipunkturou do zkumavek EDTA vacutainer. Periferní krevní mononukleární buňky se (PBM) se získají pomocí separačních trubic pro buňky LeucoPREP^RBrand Cell Separation Tubes (od firmy Becton Dickinson) nebo Ficoll-Paque^R (použitelný z Pharmaci LKB Biotechnology lne. Piscataway, NJ). PBM jsou suspendovány v lxl0⁶/ml v RPMI 1640 médiu (dostupné z G1BCO, Grand Island, NY), obsahujícím 25 mM HEPES (N-2hydroxyethylpiperazin-V-2-ethansulfonová kyselina) a L-glutamin (1% penicilinstreptomycinový roztok) s 10% inaktivačním zahřátím 56 °C po dobu 30 minut) autologickým sérem, které bylo přidáno. 200 μΐ části PBM suspenze se přidají do 96 jamek (s plochým dnem) Mikrotestu III kultivačních misce se sterilní tkání.

Příprava sloučeniny

Sloučeniny jsou rozpuštěny v ethanolu, dimethylsulfoxidu nebo ve vodní tkáňové kultuře a poté zředěny vodní tkáňovou kulturou, 0,01 IN hydroxidem sodným nebo 0,01N kyselinou chlorovodíkovou (výběr rozpouštědla bude záviset na chemických charakteristikách sloučenin, které jsou testovány). Koncentrace ethanolu nebo DMSO by neměly překročit konečnou koncentraci 1 % po přidání do kultivačních jamek. Sloučeniny jsou nejprve testovány v

- 8 CZ 307184 B6 koncentracích v rozmezí od okolo 0,1 (pg/ml do okolo 5 pg/ml. Sloučeniny, které vykazují indukci v koncentracích 0,5 pg/ml. jsou poté testovány v širším koncentračním rozmezí.

Inkubace

Roztok testované sloučeniny je přidán (méně než nebo rovno 50 μΐ) do jamek, které obsahují 200 μΙ zředěné zdravé krve nebo PBM média. Rozpouštědlo a/nebo médium je přidáno do kontrolních jamek (jamky bez testované sloučeniny) a dále podle potřeby upraven konečný objem každé jamky na 250 μΙ. Misky jsou přikryty plastickými víčky, jemně vířeny a potom inkubovány po dobu 48 hodin při 37 °C s 5% atmosférou oxidu uhličitého.

Separace

Následuje inkubace, misky jsou pokryty filmem parafinu a poté centrifugovány při 1000 otáčkách za minutu po dobu 10 až 15 minut při 4 °C v Damon 1EC Model CRU-5000 centrifuze. Médium (okolo 200 μΐ) je odstraněno ze 4 až 8 misek a vloženo do 2ml sterilních ledových nádob. Vzorky jsou udržovány při -70 °C až do analýzy.

Analyzovaný /výpočet na interferon

Interferon se stanovuje biologickým stanovením za použití buněk z humánního plicního karcinomu A549, které byly vyprovokovány pomocí viru encephalomyocarditis. Podrobnosti tohoto biologického stanovení jsou uvedeny v G. L. Brennan a L. H. Kronenberg, Automated Bioassay of Interferons in Micro-test Plates, Biotechniques, červen/červenec; 78, 1983. Tento postup lze v krátkosti popsat takto. Zředěné interferonové vzorky a buňky A549 se inkubují 12 až 24 hodin při 37 °C. Inkubované buňky se infikují inokulem viru encephalomyocarditis. Infikované buňky se inkubují další období při 37 °C a potom se kvantitativně vyhodnotí virový cytopatoický účinek. Virový cytopatoický účinek se kvantifikuje obarvením vzorku a následným spektrofotometrickým měřením absorbance. Výsledky jsou vyjádřeny v hodnotách referenční hodnoty interferonu (a) na mililitr a jsou vztaženy na hodnotu získanou pro standard NIH HU IF-L. Interferon se identifikuje v podstatě jako všechen interferon (a) pomocí šachovnicových neutralizačních stanovení proti králičímu anti-humánnímu interferonu (a) a kozímu antihumánnímu interferonu (a) za použití monovrstev buněk A549, provokovaných virem encefalomyokarditis.

V tabulce uvedené dále + indikuje, že sloučenina indukovala indikovaný cytokin v přesné koncentraci, indikuje, že sloučenina neindukovala indikovaný cytokin v přesné koncentraci, a + indikuje, že výsledky byly stejné při přesné koncentraci.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. 2-Methyl-l-(2-methylpropyl)-177-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridin--4-amin a jeho farmaceuticky přijatelné soli.
2. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství sloučeniny nebo soli podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
3. 2-Methyl-l-(2-methylpropyl)-l/7-imidazo[4,5-c][l,5]naftyridin-4-amin nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl pro použití jako léčivo.
4. Farmaceutická kompozice podle nároku 2 pro použití jako léčivo.