ES2261330T3 - Composiciones y procedimientos para la deteccion de trnsformante de maiz pv-zmgt32 (nk603). - Google Patents
Composiciones y procedimientos para la deteccion de trnsformante de maiz pv-zmgt32 (nk603).Info
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Abstract
Una molécula de DNA que comprende una secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.: 8.
Description
Composiciones y procedimientos para la detección
de transformación de maíz PV-ZMGT32 (nk603).
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular de plantas, específicamente la invención se
refiere a una molécula de DNA que comprende una secuencia de
nucleótidos diagnosticada para tolerancia a glifosato en una planta.
La invención se refiere más específicamente a selección de un rasgo
de tolerancia a glifosato en plantas de maíz y a ensayos para
detectar la presencia de DNA de PV-ZMGT32 (nk603) de
planta de maíz en una muestra.
La invención se refiere a la selección de un
rasgo de tolerancia a herbicida glifosato en plantas de maíz (Zea
mays) y a la detección de la región de inserción
transgénica/genómica en maíz PV-ZMGT32 (nk603) y la
progenie del mismo.
El maíz es un cultivo importante y es una fuente
de comida principal en muchas áreas del mundo. Los procedimientos de
la biotecnología se han aplicado al maíz para mejora de los rasgos
agronómicos y la calidad del producto. Un rasgo agronómico tal es
tolerancia a herbicidas, en particular tolerancia al herbicida
glifosato. Este rasgo en maíz se ha conferido mediante la expresión
de un transgén en las plantas de maíz (patente de los Estados Unidos
Nº.: 6.040.497). La tolerancia a glifosato se ha conferido también a
otras plantas monocotiledóneas mediante transformación con un gen
quimérico CP4, por ejemplo a césped (documento US 5.048.956).
La expresión de genes extraños en plantas se
conoce por estar influida por su posición cromosómica, debida quizás
a la estructura de cromatina (por ejemplo heterocromatina) o la
proximidad de elementos reguladores transcripcionales (por ejemplo,
potenciadores) cerca del sitio de integración (Weising y col.,
Ann. Rev. Genet. 22: 421-427, 1988). Por esta
razón, a menudo es necesario someter a una revisión un gran número
de casos con el fin de identificar un caso caracterizado por la
expresión óptima de un gen introducido de interés. Por ejemplo, se
ha observado en plantas y en otros organismos que puede haber una
amplia variación en niveles de expresión de genes introducidos
entre casos. Puede haber también diferencias entre patrones
espaciales o temporales de expresión, por ejemplo, diferencias en la
expresión relativa de un transgén en diversos tejidos vegetales, que
puede no corresponder a los patrones esperados de elementos
reguladores presentes en la construcción génica introducida. Por
esta razón, es común producir cientos o miles de casos diferentes y
someter a una revisión aquellos casos para un caso simple que tiene
niveles y patrones de expresión transgénica deseados para propósitos
comerciales. Un caso que tiene niveles y patrones de expresión
transgénica deseados es útil para introducir en la dotación
genética mediante retrocruzamiento de híbridos el transgén dentro de
otros antecedentes genéticos mediante cruzamiento sexual entre
diferentes cepas usando procedimientos de reproducción
convencionales. La progenie de tales cruces mantiene las
características de expresión transgénica del transformante original.
Esta estrategia se usa para asegurar expresión génica fiable en un
número de variedades que están bien adaptadas a las condiciones de
crecimiento locales.
Sería ventajoso poder detectar la presencia de
un caso en particular con el fin de determinar si la progenie de un
cruzamiento sexual contiene un transgén de interés. Además, un
procedimiento para detectar un caso en particular sería útil para
cumplir con las regulaciones que requieren la aprobación anterior a
la comercialización y etiquetado de alimentos derivados de plantas
de cultivo recombinantes, por ejemplo. Es posible detectar la
presencia de un transgén mediante cualquier procedimiento de
detección de ácidos nucleicos bien conocido tal como la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridación de DNA usando sondas
de ácido nucleico. Estos procedimientos de detección generalmente
se centran en elementos genéticos usados frecuentemente, tales como
promotores, terminadores, genes marcadores, etc. Como un resultado,
tales procedimientos no pueden ser útiles para discriminar entre
diferentes elementos, particularmente aquellos producidos usando la
misma construcción de DNA a menos que se conozca la secuencia de DNA
del DNA cromosómico adyacente al DNA insertado ("DNA
flanqueante"). Un ensayo de PCR específico de caso se discute,
por ejemplo, por Windels y col. (Med. Fac. Landbouww, Univ.
Gent 64/5b: 459-462, 1999), quienes identificaron el
caso 40-3-2 de soja tolerante a
glifosato mediante PCR usando un grupo de cebadores que abarcan el
empalme entre el inserto y el DNA flanqueante, específicamente un
cebador que incluye secuencia del inserto y un segundo cebador que
incluye secuencia del DNA flanqueante.
La presente invención proporciona:
(1) una molécula de DNA que comprende una
secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID
Nº.: 8;
(2) un par de moléculas de DNA que comprende:
una primera molécula de DNA y una segunda molécula de DNA, en el que
las moléculas de DNA son de suficiente longitud de nucleótidos
contiguos de SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.: 8 o sus complementos para
funcionar como cebadores de DNA o sondas diagnósticas para DNA
extraído de planta de maíz PV-ZMGT32 (nk603) o la
progenie del mismo;
(3) un procedimiento para detectar la molécula
de DNA de (1);
(4) un procedimiento para seleccionar un rasgo
de tolerancia a glifosato en plantas de maíz;
(5) un kit de detección de DNA que comprende: al
menos una molécula de DNA de suficiente longitud de nucleótidos
contiguos homólogos o complementarios a SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.:
8 para funcionar como un cebador de DNA o sonda específica para caso
de maíz PV-ZMGT32 (nk603) y/o su progenie.
Esta invención se refiere preferiblemente a los
procedimientos para seleccionar una planta de cultivo
monocotiledónea tolerante a glifosato, en plantas de cultivo
particulares transformadas con construcciones de DNA que constan de
dos cartuchos de expresión transgénicos. El primer cartucho de
expresión comprende:
una molécula de DNA de un promotor de actina 1
de arroz (Oryza sativa) y un intrón de actina 1 de arroz
unido operativamente a una molécula de DNA que codifica una
secuencia de péptido de tránsito de cloroplasto, conectada
operativamente a una molécula de DNA que codifica una
5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) resistente a glifosato, conectada operativamente a
una molécula de DNA que comprende un terminador transcripcional 3'.
El segundo cartucho de expresión transgénica de la construcción de
DNA comprende una molécula de DNA del promotor del virus del mosaico
de la coliflor (CaMV) 35S, conectado operativamente a una molécula
de DNA que comprende un intrón Hsp70, conectado operativamente a
una molécula de DNA que codifica una secuencia peptídica de transito
de cloroplasto, unida operativamente a una molécula de DNA que
codifica una
5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) resistente a glifosato, conectada operativamente a
una molécula de DNA que comprende un terminador transcripcional
3'.
Tal construcción de DNA cuando se expresa en
células vegetales y en plantas confiere tolerancia a herbicida de
glifosato. Esta invención se refiere preferiblemente a los
procedimientos para seleccionar una planta de maíz tolerante a
glifosato. Como se expuso anteriormente, la construcción de DNA
consta de dos cartuchos de expresión transgénica. El primer cartucho
de expresión consta de una molécula de DNA de un promotor de actina
1 de arroz (Oryza sativa) e intrón de actina 1 de arroz unido
operativamente a una molécula de DNA que codifica una secuencia
peptídica de tránsito de cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis,
conectada operativamente a una molécula de DNA que codifica una
5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) resistente a glifosato aislada de Agrobacterium
tumefasciens sp., cepa CP4, conectada operativamente a una
molécula de DNA que consta de un terminador transcripcional de
nopalina sintasa. El segundo cartucho de expresión consta de una
molécula de DNA del promotor del virus del mosaico de la coliflor
(CaMV) 35S que contiene una duplicación en tándem de la región
potenciadora, conectada operativamente a una molécula de DNA que
codifica una
5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) resistente a glifosato aislada de Agrobacterium
tumefasciens sp., cepa CP4, conectada operativamente a una
molécula de DNA que consta de un terminador transcripcional de
nopalina sintasa.
De acuerdo con la invención, las composiciones y
procedimientos se proporcionan para detectar la presencia de la
región de inserción transgénica/genómica a partir de una planta de
maíz nueva denominada PV-ZMGT32 (nk603). Se
proporcionan moléculas de DNA que comprenden al menos una secuencia
de empalme de PV-ZMGT32 (nk603) seleccionada del
grupo que consta de 5' TGTAGCGGCCCACGCGTGG 3' (SEQ ID Nº.: 9), 5'
TACCACGCGACA
CACTTC 3' (SEQ ID Nº.: 10), y 5' TGCTGTTCTGCTGACTTT 3' (SEQ ID Nº.: 11) y complementos de las mismas; en las que una secuencia de empalme abarca el empalme entre los DNA heterólogos insertados dentro del genoma y el DNA de la célula de maíz flanqueante del sitio de inserción y es diagnóstica para el caso. La selección de las plantas y semillas de maíz que comprenden estas moléculas es un aspecto de la invención.
CACTTC 3' (SEQ ID Nº.: 10), y 5' TGCTGTTCTGCTGACTTT 3' (SEQ ID Nº.: 11) y complementos de las mismas; en las que una secuencia de empalme abarca el empalme entre los DNA heterólogos insertados dentro del genoma y el DNA de la célula de maíz flanqueante del sitio de inserción y es diagnóstica para el caso. La selección de las plantas y semillas de maíz que comprenden estas moléculas es un aspecto de la invención.
Una molécula de DNA novedosa 5'
ACCAAGCTTTTATAATAG 3' (SEQ ID Nº.: 12) y el complemento de la misma,
en la que esta molécula de DNA es novedosa en
PV-ZMGT32 (nk603) y su progenie, la selección de
plantas y semillas de maíz que comprenden está molécula son otros
aspectos de esta invención.
Las moléculas de DNA que comprenden la región de
inserción transgénica/genómica novedosa, SEQ ID Nº.: 7 y SEQ ID Nº.:
8 y son homólogas o complementarias con SEQ ID Nº.: 7 y SEQ ID Nº.:
8 son también un aspecto de esta invención.
Las moléculas de DNA que comprenden una longitud
suficiente de una parte transgénica de la secuencia de DNA de SEQ ID
Nº.: 7 y una longitud suficiente similar de una secuencia de DNA de
maíz flanqueante 5' de SEQ ID Nº.: 7; o una longitud suficiente
similar de una parte transgénica de la secuencia de DNA de SEQ ID
Nº.: 8 y una longitud suficiente similar de una secuencia de DNA 3'
que flanquea el transgén, en la que estas moléculas de DNA son
útiles como cebadores de DNA en los procedimientos de amplificación
de DNA tal como para proporcionar un producto amplicón de DNA
producido específicamente a partir de DNA de
PV-ZMGT32 (nk603) y su progenie son otro aspecto de
la invención. Los cebadores de DNA homólogos de o complementarios a
una longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID Nº.: 7 y
SEQ ID Nº.: 8 para funcionar como cebadores o sondas de DNA
diagnósticos para DNA extraído de planta de maíz
PV-ZMGT32 (nk603) o la progenie de los mismos son
también un aspecto de esta invención.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se
proporcionan procedimientos de detectar la presencia de DNA
correspondientes al caso de maíz PV-ZMGT32 (nk603)
incluso en una muestra. Tales procedimientos comprenden: (a) extraer
una muestra de DNA a partir de una planta de maíz; (b) poner en
contacto la muestra de DNA con un par cebador de DNA que comprende
moléculas cebadoras de DNA de suficiente longitud de nucleótidos
contiguos de SEQ ID Nº.: 7 o su complemento, o SEQ ID Nº.: 8 o su
complemento para funcionar como cebadores o sondas diagnósticas para
DNA extraídos a partir de planta de maíz PV-ZMGT32
(nk603) o progenie de la misma; (c) proporcionar una condición de
reacción de amplificación de ácido nucleico; (d) llevar a cabo dicha
reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de este
modo una molécula de amplicón de DNA; y (e) detectar la molécula de
amplicón de DNA.
Se proporciona un par de moléculas de DNA que
comprenden un grupo de cebadores de DNA que son homólogos a o
complementarios con SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.: 8 que funciona en
una reacción de amplificación de ácidos nucleicos para producir un
diagnóstico molecular de DNA de amplicón para
PV-ZMGT32 (nk603). Más específicamente, se
proporciona un par de moléculas de DNA que comprende un grupo de
cebadores de DNA, en el que las moléculas de DNA se identificaron
como SEQ ID Nº.: 13 o complementos de la misma y SEQ ID Nº.: 14 o
comple-
mentos de la misma; SEQ ID Nº.: 15 o complementos de la misma y SEQ ID Nº.: 16 o complementos de la misma.
mentos de la misma; SEQ ID Nº.: 15 o complementos de la misma y SEQ ID Nº.: 16 o complementos de la misma.
El amplicón producido mediante el procedimiento
descrito anteriormente se puede hibridar bajo condiciones
restrictivas a SEQ ID Nº.: 9, SEQ ID Nº.: 10, SEQ ID Nº.: 11, o SEQ
ID Nº.: 12.
De acuerdo con otro aspecto de la invención,
procedimientos de detectar la presencia de una molécula de DNA
corresponden al caso de PV-ZMGT32 (nk603) en una
muestra, tales procedimientos constan de (a) poner en contacto la
muestra que comprende DNA extraído a partir de una planta de maíz
con una molécula de sonda de DNA que consta de SEQ ID Nº.: 9, SEQ ID
Nº.: 10, SEQ ID Nº.: 11, o SEQ ID Nº.: 12, en la que dicha molécula
de sonda de DNA hibrida bajo condiciones restrictivas con DNA
genómico de un PV-ZMGT32 de caso de maíz y no
hibrida bajo condiciones restrictivas con una planta de maíz
control; (b) someter la muestra y sonda a condiciones de
hibridación restrictiva; y (c) detectar hibridación de la sonda del
DNA.
Procedimientos de producir una planta de maíz
que tolera aplicación de glifosato comprenden las etapas de (a)
cruzar sexualmente una primera línea de maíz parental que comprende
los cartuchos de expresión de la presente invención, los cuales
confieren tolerancia a aplicación de glifosato, y una segunda línea
de maíz parental que carece de tolerancia a glifosato, produciendo
de este modo una pluralidad de plantas de la progenie; y (b)
seleccionar una planta de la progenie que tolera aplicación de
glifosato. Tales procedimientos pueden comprender opcionalmente la
etapa adicional de retrocruzar la planta de progenie con la segunda
línea de maíz parental para producir una planta de maíz de un linaje
verdadero que tolera la aplicación de glifosato.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se
proporciona un procedimiento para seleccionar plantas de maíz
tolerantes a glifosato de la presente invención y progenie de las
mismos comprendiendo extraer DNA a partir de una muestra de planta,
poniendo en contacto un DNA con una molécula de ácido nucleico
marcadora seleccionada del grupo que consta de SEQ ID Nº.: 9, SEQ ID
Nº.: 10, SEQ ID Nº.: 11, o SEQ ID Nº.: 12, o complementos de las
mismas, detectar la hibridación de dicha molécula de ácido nucleico
marcadora al DNA, y llevar a cabo un análisis de reproducción
asistida de marcador para el vínculo genético del rasgo de
tolerancia a glifosato para la molécula de ácido nucleico
marcadora.
La invención se refiere adicionalmente a un kit
de detección de DNA que comprende al menos una molécula de DNA de
longitud suficiente de nucleótidos contiguos homólogos o
complementarios a SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.: 8 para funcionar como
un cebador de DNA o sonda específica para PV-ZMGT32
(nk603) de caso de maíz y/o su progenie.
Lo precedente y otros aspectos de la invención
llegarán a ser más patentes a partir de la siguiente descripción
detallada y dibujos acompañantes.
Figura 1. Mapa de plásmido de pMON25496.
Las siguientes definiciones y procedimientos se
proporcionaron para definir mejor la presente invención y para guiar
a aquellos de habilidad ordinaria en la técnica en la práctica de la
presente invención. A menos que se señale otra cosa, los términos
son para entenderse de acuerdo al uso convencional por aquellos de
habilidad ordinaria en la técnica relevante. Las definiciones de
términos comunes en biología molecular se pueden encontrar también
en Rieger y col., Glossary of Genetics: Classical and
Molecular, 5ª edición, Springer-Verlag: Nueva
York, 1991; y Lewin, Genes V, Oxford University Press: Nueva York,
1994. Se usa la nomenclatura para bases de DNA como se expone en 37
CFR \NAK 1,822.
Como se usa en el presente documento, el término
"comprendiendo" significa "incluyendo pero no limitado
a".
"Glifosato" se refiere a
N-fosfonometilglicina y sus sales. El glifosato es
el ingrediente activo del herbicida Roundup® (Monsanto Co.).
Tratamientos con "herbicida de glifosato" se refiere a
tratamientos con los herbicidas Roundup®, Roundup Ultra®, Roundup
UltraMax® o cualquier otra formulación herbicida que contenga
glifosato. La selección de las velocidades de aplicación para una
formulación de glifosato que constituye una dosis biológicamente
efectiva esta dentro del alcance del técnico agrícola normal.
Una construcción de DNA es un ensamblado de
moléculas de DNA unidas conjuntamente que proporcionan uno o más
cartuchos de expresión. La construcción de DNA es preferiblemente un
plásmido que se deja para su autorreplicación en una célula
bacteriana y contiene diversos sitios de restricción de enzimas
endonucleasas que son útiles para introducir moléculas de DNA que
proporcionan elementos genéticos funcionales, es decir, secuencias
promotoras, intrones, líderes, codificadoras, regiones de
terminación 3', entre otras. Los cartuchos de expresión contenidos
en una construcción de DNA comprenden los elementos genéticos
necesarios para proporcionar transcripción de un RNA mensajero. Los
cartuchos de expresión contenidos dentro de una construcción de DNA
comprenden los elementos genéticos necesarios para proporcionar
transcripción de un RNA mensajero. Los cartuchos de expresión se
pueden diseñar para expresarse en células procariotas o células
eucariotas. Los cartuchos de expresión se pueden diseñar para
expresarse más preferiblemente en células de plantas La combinación
de cartuchos de expresión en plantas transgénicas puede conducir a
fenotipos inesperados. La combinación de cartuchos de expresión en
plantas transgénicas puede conducir a fenotipos inesperados. La
combinación del cartucho promotor de actina 1 de arroz y el cartucho
promotor de CaMV 35S proporcionado en una construcción de DNA
(pMON25496) potenció la tolerancia de la planta de maíz transgénico
a herbicida de glifosato cuando se comparó con los cartuchos
aislados solos y al estándar comercial llamado GA21 que contiene
tres copias de un cartucho promotor de actina 1 de
arroz.
arroz.
Un "caso" transgénico se produce mediante
transformación de células de plantas con una construcción de DNA
heterólogo, que incluye un cartucho de expresión de ácidos nucleicos
que comprende un transgén de interés, la regeneración de una
población de plantas resultantes de la inserción del transgén dentro
del genoma de la planta, y selección de una planta en particular
caracterizada por la inserción dentro de una localización genómica
en particular. El término "caso" se refiere al transformante
original y la progenie del transformante que incluye el DNA
heterólogo. El término "caso" se refiere también a la progenie
producida mediante un cruce sexual entre individuos de diferentes
cepas entre el transformante y otra variedad que incluya el DNA
heterólogo. Incluso después de retrocruzamientos repetidos con un
padre recurrente, el DNA insertado y el DNA flanqueante a partir del
padre transformado están presentes en la progenie del cruce en la
misma localización cromosómica. El término "caso" también se
refiere a DNA del transformante original que comprende el DNA
insertado y la secuencia genómica flanqueante inmediatamente
adyacente al DNA insertado que debería esperarse al transferirse a
una progenie que recibe DNA insertado incluyendo el transgén de
interés como el resultado de un cruzamiento sexual de una línea
parental que incluye el DNA insertado (por ejemplo, el transformante
original y la progenie resultante de autofecundación) y una línea
parental que no contiene el DNA insertado. Una planta de maíz
tolerante a glifosato PV-ZMGT32 (nk603) se puede
multiplicar primero cruzando sexualmente una primera planta de maíz
parental constituida por una planta de maíz crecida a partir de la
planta de maíz transgénico PV-ZMGT32 (nk603) que
tiene número de acceso de la ATCC PTA-2478 y
progenie de la misma derivada de transformación con cartuchos de
expresión adecuados que toleran aplicación de herbicida glifosato, y
una segunda planta de maíz parental que carece de la tolerancia a
herbicida glifosato; y autofecundando la planta de primera
generación, produciendo por lo tanto una pluralidad de plantas de
segunda generación; y seleccionando después a partir de las plantas
de la segunda generación una planta tolerante al herbicida
glifosato. Estas etapas pueden incluir adicionalmente el
retrocruzamiento de la primera planta de la progenie tolerante a
glifosato con la segunda planta de maíz parental o una tercera
planta de maíz parental, produciendo de este modo una planta de maíz
que tolera la aplicación de herbicida glifosato.
Se entenderá también que diferentes plantas
transgénicas se pueden aparear también para producir prole que
contiene dos genes exógenos, añadidos segregados independientemente.
La autofecundación de la generación adecuada puede producir plantas
que son homocigóticas para ambos genes exógenos, añadidos. Se
consideran también el retrocruzamiento con una planta parental y el
cruzamiento sexual entre diferentes cepas con una planta no
transgénica, y su propagación vegetativa. Las descripciones de otros
procedimientos de reproducción que se usan comúnmente para
diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en una de varias
referencias, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar
Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy,
Madison WI (1987).
Una "sonda" es un ácido nucleico aislado el
cual se une a una etiqueta detectable convencional o molécula
notificadora, por ejemplo, un isótopo radiactivo, ligando, agente
quimioluminiscente, o enzima. Una sonda tal es complementaria a una
hebra de ácido nucleico diana, en el caso de la presente invención,
a una hebra de DNA genómico a partir de caso de maíz transgénico
PV-ZMGT32 (nk603) de una planta de maíz o de una
muestra que incluye DNA del caso. Las sondas incluyen no sólo ácidos
desoxirribonucleico o ribonucleico sino también poliamidas y otros
materiales de sonda que unen específicamente a una secuencia de DNA
diana y se pueden usar para detectarla presencia de esa secuencia de
DNA diana.
Los "cebadores" son ácidos nucleicos
aislados que se fusionan a una hebra de DNA diana complementaria
mediante hibridación de ácidos nucleicos para formar un híbrido
entre el cebador y la hebra de DNA diana, después se prolongan a lo
largo de la hebra de DNA diana mediante una polimerasa, por ejemplo,
una polimerasa de DNA. Los pares de cebadores se refieren a su uso
para amplificación de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo,
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros
procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos
convencionales.
Sondas y cebadores son de suficiente longitud
nucleotídica para unir la secuencia de DNA diana específicamente en
las condiciones de hibridación o condiciones de reacción
determinadas por el operador. Esta longitud puede ser de cualquier
longitud que sea de suficiente longitud para ser útil en el
procedimiento de detección de elección. Generalmente, se usan 11
nucleótidos o más en longitud, preferiblemente 18 nucleótidos o más,
más preferiblemente 24 nucleótidos o más, y lo más preferible 30
nucleótidos o más. Tales sondas y cebadores hibridan específicamente
con una secuencia diana bajo condiciones de hibridación de alta
restrictividad. Preferiblemente, las sondas y cebadores tienen
similaridad de secuencia de DNA completa de nucleótidos contiguos
con la secuencia diana, aunque las sondas que difieren de la
secuencia de DNA diana y que retienen la capacidad para hibridar con
secuencias de DNA diana se pueden diseñar por procedimientos
convencionales.
Los procedimientos para preparar y usar sondas y
cebadores se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª edición, vol. 1-3, ed.
Sambrook y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, 1989 (en adelante en este documento, "Sambrook y col.,
1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed.
Ausubel y col., Greene Publishing y
Wiley-Interscience, Nueva York, 1992 (con
actualizaciones periódicas) (en adelante en este documento,
"Ausubel y col., 1992"); e Innis y col., PCR protocols: A
Guide to Methods and Applications, Academic Press; San Diego,
1990. Los pares de cebadores de PCR se pueden derivar de una
secuencia conocida, por ejemplo, usando programas de ordenador para
ese propósito tal como Cebador (Versión 0,5, © 1991, Whiteland
Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).
Cebadores y sondas basados en las secuencias
flanqueantes y de inserto de DNA descritas en el presente documento
se pueden usar para confirmar (y, si es necesario, para corregir)
las secuencias descritas mediante procedimientos convencionales, por
ejemplo, reclonando y secuenciando tales secuencias.
Las sondas y cebadores de ácidos nucleicos de la
presente invención hibridan bajo condiciones restrictivas con una
secuencia de DNA diana. Cualquier procedimiento de hibridación o
amplificación de ácido nucleico convencional se puede usar para
identificar la presencia de DNA a partir de un caso transgénico en
una muestra. Moléculas de ácido nucleico o fragmentos de las mismas
son capaces de hibridar específicamente con otras moléculas de ácido
nucleico bajo ciertas circunstancias. Como se usan en el presente
documento, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces
de hibridar específicamente la una a la otra si las dos moléculas
son capaces de formar una estructura de ácido nucleico de cadena
doble, antiparalela. Se dice que una molécula de ácido nucleico es
el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si ellas
presentan complementariedad completa. Como se usa en el presente
documento, se dice que moléculas presentan "complementariedad
completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es
complementario con un nucleótido de la otra. Se dice de dos
moléculas que son "mínimamente complementarias" si pueden
hibridar una con la otra con suficiente estabilidad para permitirlas
permanecer fusionadas la una a la otra bajo al menos condiciones
convencionales de "baja restrictividad". De forma similar, se
dice que las moléculas son "complementarias" si se pueden
hibridar una con la otra con suficiente estabilidad para permitirlas
permanecer fusionadas una a la otra bajo condiciones convencionales
de "alta restrictividad". Las condiciones de restrictividad
convencionales se describen por Sambrook y col., 1989, y por Hames y
col., en: Nucleic Acid Hybridation, A Practical
Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Son permisibles por
lo tanto desviaciones de la complementariedad completa, en tanto en
cuanto tales desviaciones no descartan completamente la capacidad
de las moléculas para formar una estructura de cadena doble. Con el
fin de que una molécula de ácido nucleico sirva como un cebador o
sonda necesita sólo ser suficientemente complementaria en secuencia
para ser capaz de formar una estructura de doble cadena estable bajo
el disolvente y sales de concentraciones empleadas en
particular.
Como se usa en el presente documento, una
secuencia sustancialmente homóloga es una molécula de ácido nucleico
que se hibridará específicamente al complemento de la molécula de
ácido nucleico a la cual se está comparando bajo condiciones de alta
restrictividad. Las condiciones de restrictividad apropiada las
cuales promueven la hibridación de DNA, por ejemplo, cloruro de
sodio/citrato de sodio 6X (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por
un lavado de SSC 2X a 50ºC, se conocen por aquellos expertos en la
técnica o se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular
Biology, John Willey & Sons, N.Y. (1989),
6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sal
en la etapa de lavado se puede seleccionar de una restrictividad
baja de aproximadamente SSC 2X a 50ºC a una restrictividad alta de
aproximadamente SSC 0,2X a 50ºC. Además, la temperatura en la etapa
de lavado se puede incrementar a partir de condiciones de baja
restrictividad a temperatura ambiente, aproximadamente 22ºC, en
condiciones de alta restrictividad a aproximadamente 65ºC. Tanto
temperatura como sal se pueden variar, o, bien la temperatura o bien
la concentración de sal pueden mantenerse constantes mientras la
otra variable se cambia. En una realización preferida, un ácido
nucleico de la presente invención hibridará específicamente con una
o más de las moléculas de ácido nucleico expuestas en SEQ ID Nº.: 9,
10, 11, y 12, o complementos de las mismas o fragmentos de
cualquiera bajo condiciones moderadamente restrictivas, por ejemplo
a aproximadamente 2,0 x SSC y aproximadamente 65ºC. En una
realización particularmente preferida, un ácido nucleico de la
presente invención hibridará específicamente con una o más de las
moléculas de ácido nucleico expuestas en de la SEQ ID Nº.: 9 a la
SEQ ID Nº.: 12 o complementos o fragmentos de cualquiera bajo
condiciones de lata restrictividad. En un aspecto de la presente
invención, un marcador preferido de molécula de ácido nucleico de la
presente invención tiene la secuencia de ácidos nucleicos expuesta
de la SEQ ID Nº.: 9 a la SEQ ID Nº.: 12 o complementos de las
mismas.
En un aspecto adicional de la presente
invención, una molécula de ácido nucleico marcadora preferida de la
presente invención comparte una identidad de secuencia del 100% con
una secuencia explicada en de la SEQ ID Nº.: 9 a la SEQ ID Nº.: 12 o
complementos de las mismas. De la SEQ ID Nº.: 9 a la SEQ ID Nº.: 12
se pueden usar como marcadores en procedimientos de reproducción
vegetal para identificar la progenie de cruces genéticos de forma
similar a los procedimientos descritos para análisis de marcador de
DNA de repetición de secuencia simple, en "DNA markers:
Protocols, applications, and overviews": (1997)
173-185, Cregan, y col., eds.,
Wiley-Liss
NY.
NY.
La hibridación de la sonda de la secuencia de la
molécula de ácido nucleico diana se puede detectar mediante
cualquier número de procedimientos conocido por aquellos expertos en
la técnica, estos pueden incluir, pero no se limitan a, marcas
fluorescentes, marcas radiactivas, marcas basadas en antibióticos, y
marcas quimioluminiscentes.
Respecto a la amplificación (por ejemplo,
mediante PCR) usando un par de cebadores de amplificación en
particular, "condiciones restrictivas" son condiciones que
permiten al par cebador hibridar sólo con la secuencia diana de
ácido nucleico a la cual se uniría un cebador que tenga la secuencia
de tipo salvaje correspondiente (o su complemento) y que
preferiblemente permiten producir un único producto de
amplificación, el amplicón, en una reacción de amplificación térmica
de DNA.
El término "específico para (una secuencia
diana)" indica que una sonda o cebador hibrida bajo condiciones
de hibridación restrictivas sólo con la secuencia diana en una
muestra que comprende la secuencia diana.
Como se usa en el presente documento, "DNA
amplificado" o "amplicón" se refiere al producto de
amplificación de ácidos nucleicos de una secuencia de aminoácidos
diana que es parte de una plantilla de ácido nucleico. Por ejemplo,
para determinar si la planta de maíz que resulta de un cruce sexual
contiene DNA genómico de caso transgénico a partir de la planta de
maíz de la presente invención, el DNA extraído de una muestra de
tejido de planta de maíz se puede someter a un procedimiento de
amplificación de ácidos nucleicos usando un par cebador de DNA que
incluye un primer cebador derivado de la secuencia flanqueante en el
genoma de la planta adyacente al sitio de inserción del DNA
heterólogo insertado, y un segundo cebador derivado del DNA
heterólogo insertado para producir un amplicón que es diagnóstico
para la presencia del DNA del caso. El amplicón es de una longitud y
tiene una secuencia que también es diagnóstica para el caso. El
amplicón puede variar en longitud desde la longitud combinada del
primer par más un par de bases nucleotídicas, preferiblemente más
aproximadamente cincuenta pares de bases nucleotídicas, más
preferiblemente más aproximadamente doscientos cincuenta pares de
bases nucleotídicas, e incluso más preferiblemente más
aproximadamente cuatrocientos cincuenta pares de bases
nucleotídicas. Alternativamente, un par cebador se puede derivar de
secuencia flanqueante en ambos lados del DNA insertado tal como para
producir un amplicón que incluye la secuencia nucleotídica del
inserto entera (por ejemplo, el fragmento de DNA Mlu1 de la
construcción de expresión pMON25496, figura 1, aproximadamente 6706
pares de bases nucleotídicas). Un miembro de un primer par derivado
de la secuencia genómica de plantas se puede localizar a distancia
de la secuencia de DNA insertado, esta distancia puede variar de un
par de bases hasta los límites de la reacción de amplificación, o
aproximadamente veintemil pares de bases nucleotídicas. El uso del
término "amplicón" excluye específicamente dímeros de cebador
que se pueden formar en la reacción de amplificación térmica
de
DNA.
DNA.
La amplificación de ácidos nucleicos se puede
llevar a cabo mediante algunos de los diversos procedimientos de
amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la técnica,
incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se conoce
en la técnica una diversidad de procedimientos de amplificación y se
describe, entre otras cosas, en las patentes de los Estados Unidos
Nº^{s}.: 4.683.195 y 4.683.202 y en PCR Protocols: A Guide to
Methods and Applications, ed. Innis y col., Academic Press, San
Diego, 1990. Los procedimientos de amplificación se han desarrollado
para amplificar hasta 22 kb de DNA genómico y hasta 42 kb de DNA de
bacteriófago (Cheng y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
5695-5699, 1994). Estos procedimientos así como
otros procedimientos conocidos en la técnica de amplificación de DNA
se pueden usar en la práctica de la presente invención. La secuencia
de inserto de DNA heterólogo o secuencia de DNA flanqueante a partir
de caso de maíz PV-ZMGT32 (nk603) se puede verificar
(y corregir si es necesario) amplificando tales secuencias a partir
de DNA extraído a partir de la semilla o plantas de Nº. de acceso
de depósito de ATCC PTA-2478 usando cebadores de DNA
a partir de las secuencias proporcionadas en el presente documento
seguidas por secuenciación de DNA estándar del amplicón de PCR o del
DNA clo-
nado.
nado.
El amplicón producido mediante estos
procedimientos se puede detectar mediante una pluralidad de
técnicas. Uno de tales procedimientos es Análisis de Bits Genéticos
(Nikiforov, y col. Nucleic Acid Res. 22:
4167-4175, 1994) donde se diseña un oligonucleótido
de DNA el cual se solapa tanto con la secuencia de DNA genómico
adyacente flanqueante como con la secuencia de DNA insertada. El
oligonucleótido se inmoviliza en pocillos de una placa de
micropocillos. Tras someter a PCR a la región de interés (usando un
cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica
flanqueante adyacente), un producto de PCR de cadena simple se puede
hibridar con el oligonucleótido inmovilizado y servir como una
plantilla para una reacción de extensión de base única usando una
DNA polimerasa y ddNTP señalados específicos para la siguiente base
esperada. La lectura puede ser fluorescente o basada en ELISA. Una
señal indica presencia de la secuencia del inserto/secuencia
flanqueante debida a la amplificación, hibridación, y extensión de
base única exitosa.
Otro procedimiento es la técnica de
pirosecuenciación como se describe por Winge (Innov. Pharma
Tech. 00: 18-24, 2000). En este procedimiento se
diseña un oligonucleótido que se solapa con el DNA genómico
adyacente y el empalme de DNA del inserto. El oligonucleótido se
hibrida a producto de PCR de cadena simple a partir de la región de
interés (un cebador insertado en la secuencia y uno en la secuencia
genómica flanqueante) e incubado en presencia de una DNA polimerasa,
ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y
luciferina. Se añaden individualmente dNTP y la incorporación
resulta en una señal ligera la cual se mide. Una señal ligera indica
la presencia de la secuencia del inserto del transgén/secuencia
flanqueante debida a amplificación, hibridación, y extensión de
base única o multibase exitosas.
La Polarización de Fluorescencia como se
describe por Chen y col., (Genome Res. 9: 492-498,
1999) es un procedimiento el cual se puede usar para detectar el
amplicón de la presente invención. Usando este procedimiento se
diseña un oligonucleótido el cual se solapa con el DNA genómico
flanqueante y el empalme de DNA insertado. El oligonucleótido se
hibrida a producto de PCR de cadena simple a partir de la región de
interés (un cebador en el DNA insertado y uno en la secuencia de DNA
genómica flanqueante) e incubado en presencia de una DNA polimerasa
y un ddNTP señalado fluorescentemente. La extensión de base
individual da como resultado incorporación de los ddNTP. La
incorporación se puede medir como un cambio en polarización usando
un fluorómetro. Un cambio en polarización indica la presencia de la
secuencia de inserto/secuencia flanqueante debida a la
amplificación, hibridación, y extensión de base individual
exitosas.
Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA)
se describe como un procedimiento de detectar y cuantificar la
presencia de una secuencia de DNA y se entiende totalmente en las
instrucciones proporcionadas por el fabricante. Brevemente, se
diseña una sonda oligonucleotídica FRET la cual se solapa con la
región flanqueante y con el empalme de DNA del inserto. La sonda
FRET y los cebadores de PCR (un primer en la secuencia de DNA
insertado y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en
presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. La hibridación de
la sonda FRET da como resultado escisión y liberación del resto
fluorescente desde el resto desactivador de la sonda FRET. Una
señal fluorescente indica la presencia de la secuencia
flanqueante/secuencia del inserto del transgén debido a
amplificación e hibridación exitosas.
Se han descrito Balizas Moleculares para usar en
detección de secuencia en Tyangi, y col. (Nature Biotech. 14:
303-308, 1996). Brevemente, se diseña una sonda
oligonucleotídica FRET que se solapa con el empalme de DNA de
inserto y la región flanqueante genómica. La estructura única de la
sonda FRET dio como resultado contener estructura secundaria que
mantiene los restos fluorescente y desactivador en proximidad
cercana. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la
secuencia de inserto de DNA y uno en la secuencia genómica
flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y
dNTP. Tras amplificación de PCR exitosa, la hibridación de la sonda
FRET a la secuencia diana da como resultado la eliminación de la
estructura de sonda secundaria y la separación espacial de los
restos fluorescentes y desactivadores. Da como resultado una señal
fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia de la
secuencia de inserto del transgen/secuencia flanqueante debido a la
amplificación e hibridación exitosas.
Los siguientes ejemplos se incluyen para
demostrar ejemplos de ciertas realizaciones preferidas de la
invención. Se debería apreciar por aquellos de habilidad en la
técnica que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen
representan aproximaciones que los inventores han encontrado que
funcionan bien en la práctica de la invención, y así se puede
considerar para constituir ejemplos de modos preferidos para esta
práctica.
Ejemplo
1
El caso de maíz transgénico
PV-ZMGT32 (nk603) se generó mediante bombardeo con
microproyectiles de embriones de maíz (Songstad y col., In Vitro
Cell Plant 32: 179-183, 1996) usando un
fragmento de DNA de MLu I lineal derivado de pMON25496 (figura 1).
Este fragmento de DNA contiene dos cartuchos de expresión
transgénica que confieren colectivamente tolerancia a glifosato de
la planta de maíz. El primer cartucho se compone del promotor de la
actina 1 del arroz e intrón (P-Os.Act1 y
I-Os.Act1, patente de los Estados Unidos Nº.:
5.641.876), conectado operativamente a un péptido de transito de
cloroplasto EPSPS de Arabidopsis (TS-At.EPSPS:CTP2,
Klee y col., Mol. Gen. Genet. 210: 47-442,
1987), conectado operativamente con una
5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) tolerante a glifosato de cepa CP4 de
Agrobacterium sp. (AGRTU.aroA:CP4, patente de los
Estados Unidos Nº.: 5.633.435) y conectado operativamente con un
terminador transcripcional de nopalina sintasa
(T-AGRTU.nos, Fraley y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 80: 4803-4807, 1983). El segundo
cartucho de expresión de transgén consta del promotor del virus del
mosaico de la coliflor 35S que contiene una duplicación en tándem de
la región potenciadora (P-CaMV.35S, Kay y col.,
Science 236: 1299-1302, 1987; patente de los
Estados Unidos Nº.: 5.164.316), conectado operativamente a un intrón
de Hsp 70v de Zea mays (I-Zm.Hsp 70, patente de los
Estados Unidos Nº.: 5.362.865) conectado operativamente a un péptido
de tránsito de cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis
(TS-At.EPSPS:CTP2, Klee y col., Mol. Gen.
Genet. 210: 47-442, 1987), conectado
operativamente a una
5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) tolerante a glifosato de cepa CP4 de
Agrobacterium sp. (AGRTU.aroA:CP4, patente de los Estados
Unidos Nº.: 5.633.435) y conectado operativamente con un terminador
transcripcional de nopalina sintasa (T-AGRTU.nos,
Fraley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:
4803-4807, 1983). Tras el bombardeo, los callos
transgénicos tolerantes a glifosato se seleccionaron a partir de
esta población en base a una combinación superior de
características, incluyendo tolerancia a glifosato, realización
agronómica, e inserción transgénica única. Las evaluaciones de
invernadero y de campo del caso nk603 y su progenie derivada indicó
que esta inserción transgénica confiere tolerancia que excede
especificaciones comerciales para tolerancia vegetativa y
reproductiva total a 0,084 g glifosato/m^{2} (840 g de
glifosato/hectárea (340 g de glifosato/acre)); 2,24\cdot10^{-4}
kg de Roundup Ultra/m^{2} (2,24 kg de Roundup Ultra/ha (35 onzas
de Roundup Ultra/acre)) cuando se aplican a los estados foliares V4
y
V8.
V8.
\newpage
Ejemplo
2
El caso de maíz nk603 tolerante a glifosato se
comparó con el estándar comercial actual, GA21 (patente de los
Estados Unidos Nº.: 6.040.497), para tolerancia a daño vegetativo
con glifosato y efecto sobre producción. GA21 contiene al menos 3
cartuchos de expresión de transgén dispuestos en tándem en el genoma
de maíz del caso GA21 (SCP/GMO/232-Final, Dirección
General de la Comisión Europea de Salud y Protección al Consumidor).
El cartucho de transgén de GA21 consta de un promotor de actina 1 de
arroz e intrón unido a un péptido de tránsito de cloroplasto de
ribulosa 1,5-bifosfato carboxilasa unido a una EPSPS
resistente a glifosato de maíz modificado y una región de
terminación de transcripción de nopalina sintetasa 3'. Plantas de
nk603 y GA21 se plantaron en hileras en terrenos de campo
duplicados. Los tratamientos eran 1) no pulverizados, 2)
pulverizados a velocidad de 4,48\cdot10^{-4} kg/m^{2} (4,48
kg/hectárea (64 onzas/acre)) de Roundup Ultra® en estado foliar V4 y
de nuevo con velocidad de 4,48\cdot10^{-4} kg/m^{2} (4,48
kg/hectárea (64 onzas/acre)) de Roundup Ultra® en estado foliar V8,
3) pulverizados a 6,72\cdot10^{-4} kg/m^{2} (6,72 kg/hectárea
(96 onzas/acre)) de Roundup Ultra® en estado foliar V4 y de nuevo
con velocidad de 6,72\cdot10^{-4} kg/m^{2} (6,72 kg/hectárea
(96 onzas/acre)) de Roundup Ultra® en estado foliar V8. La
tolerancia vegetativa se midió como porcentaje de daño vegetativo
determinado mediante la cantidad de malformación foliar observada 10
días después del tratamiento con herbicida en el estado foliar V8.
El rendimiento de cada terreno se midió en toneladas/hectárea
(celemines/acre) y el porcentaje de reducción en rendimiento se
determinó por cada tratamiento de herbicida relativo al tratamiento
no pulverizado. El resultado mostrado en la Tabla 1 ilustra que
nk603 muestra un porcentaje menor de nivel de daño vegetativo que
las plantas GA21 y la reducción de rendimiento en porcentaje
observada es también menor para el caso nk603. Se observó una
incidencia baja de daño vegetativo en los terrenos no pulverizados,
esta observación es atribuible a diversos factores ambientales
distintos de la exposición a herbicida de glifosato. El doble
cartucho de expresión de pMON25496 en nk603 se comparó en daño
vegetativo y valoración de fertilidad de tres casos de maíz
independientes obtenidos sólo a partir de la expresión que dirige el
promotor CaMV.35S del gen de tolerancia a glifosato (AGRU.aroA:CP4).
Se observó que el doble cartucho de expresión confirió un nivel
mayor de tolerancia vegetativa y tolerancia reproductiva que tres
casos de maíz independientes (ev 1, ev 2 y ev 3) conteniendo sólo el
cartucho de expresión donde la expresión del gen de tolerancia a
glifosato se dirigió mediante el promotor de CaMV.35S. Un nivel más
alto de tolerancia vegetativa a daño con herbicida glifosato se
observó para nk603 más 3 casos de maíz adicionales derivados de
pMON25496 cuando se comparó al daño promedio de 6 casos de maíz
derivados de una construcción donde la expresión del gen de
tolerancia a glifosato se dirigió sólo mediante el promotor e intrón
de actina de arroz
(P-OS.Act1/I-Os.Act1). Las plantas
transformadas con el cartucho de doble expresión poseían un nivel
más alto de tolerancia a glifosato para daño vegetativo de
fertilidad que plantas derivadas de transformación con los cartuchos
de expresión aislados. Esto dio como resultado resistencia
incrementada a pérdida de rendimiento debida a aplicación de
herbicida glifosato. La construcción de pMON25496 proporcionó dos
cartuchos de expresión de plantas en una única localización en
nk603 que confiere un nivel más alto de tolerancia a glifosato que
la inserción en tándem triple que tiene lugar en el estándar
comercial, GA21.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
* {}\hskip0,25cm \begin{minipage}[t]{150mm} El daño vegetativo se observó 10 días después de tratamiento de V8, es una medida tomada para valorar daño vegetativo en respuesta a tratamiento glifosato. \end{minipage} |
** {}\hskip0,1cm \begin{minipage}[t]{150mm} Tasa de fertilidad masculina: 4-5 = totalmente fértil; 3 = emisión de polen significativamente reducida; 0-2 = completamente estéril-altamente estéril, no adecuado para uso comercial. \end{minipage} |
*** 64 onzas = 1,81 kg; 2,721552 kg = 96 onzas; 128 onzas = 3,63 kg |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La molécula de DNA flanqueante correspondiente
de nk603 se clonó usando adaptadores ligados y PCR adecuada como se
describe en el kit Genome Walker™ (catálogo #
K1807-1, CloneTech Laboratories, Inc., Palo Alto,
CA). Primero, el DNA genómico a partir del caso nk603 se purificó
mediante el procedimiento de purificación de CTAB (Rogers y col.,
Plant Mol. Biol. 5: 69-76, 1985). Las
bibliotecas de DNA genómico para amplificación se prepararon de
acuerdo con las instrucciones del fabricante (Genome Walker™,
CloneTech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). En reacciones
separadas, el DNA genómico se digirió durante toda una noche a 37ºC
con las siguientes endonucleasas de restricción de extremos romos:
EcoRV, ScaI, DraI, PvuII, y StuI (CloneTech Laboratories,
Inc., Palo Alto, CA). Las mezclas de reacción se extrajeron con
fenol:cloroformo, el DNA se precipitó mediante la adición de etanol
a la fase acuosa, se sedimentó mediante centrifugación, después se
resuspendió en tampón Tris-EDTA (10 mM de
Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM). Los fragmentos de DNA
genómicos de extremos romos purificados se ligaron a los adaptadores
de Genome Walker™ de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Después de la ligazón, cada reacción se trató con calor (70ºC
durante 5 minutos) para terminar la reacción y se diluyó 10 veces en
tampón Tris-EDTA. Un \mul de cada ligazón primaria
se amplificó después en 50 \mul de reacción que incluían 1 \mul
de biblioteca de adaptadores ligados respectiva, 1 \mul de cebador
AP1 adaptador de Genome Walker™ (5' GTATATCGACTCACTATAGGGC 3', SEQ.
ID. Nº.: 1) 10 \muM, 1 \mul de oligonucleótido específico de
transgén nk603 (5' TGACGTATCAAAGTACCGACAAAAACATCC 3', SEQ. ID. Nº.:
2) 10 \muM, 1 \mul de desoxirribonucleótidos 10 mM, 2,5 \mul
de dimetilsulfóxido, 5 \mul de tampón de PCR 10X que contiene
MgCl_{2}, 0,5 \mul (2,5 unidades) de DNA polimerasa termostable
Amplitaq (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) y H_{2}O a 50
\mul. Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador usando
control de temperatura calculado y las siguientes condiciones de
ciclación: 1 ciclo de 95ºC durante 9 minutos, 7 ciclos de 94ºC
durante 2 segundos, 70ºC durante 3 minutos; 36 ciclos de 94ºC
durante 2 segundos, 65ºC durante 3 minutos, 1 ciclo de 65ºC durante
4 minutos. Un \mul de cada reacción primaria se diluyó 50 veces
con agua y se amplificó en una reacción secundaria (1 \mul de
reacción primaria diluida respectiva, 1 \mul de cebador adaptador
AP2 adecuado de Genome Walker™ (5' ACTATAGGGCACGCGTGGT 3', SEQ. ID.
Nº.: 3, proporcionado por el fabricante), 1 \mul de
oligonucleótido adecuado específico de transgén k603 (5'
CTTTGTTTTATTTTGGACTATCCCGACTC 3', SEQ. ID. Nº.: 4) 10 \muM, 1
\mul de desoxirribonucleótidos 10 mM, 2,5 \mul de
dimetilsulfóxido, 5 \mul de tampón de PCR 10X que contiene
MgCl_{2}, 0,5 \mul (2,5 unidades) de DNA polimerasa termostable
Amplitaq (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) y H_{2}O a 50
\mul usando las siguientes condiciones de ciclación: 1 ciclo de
95ºC durante 9 minutos; 5 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, 70ºC
durante 3 minutos; 24 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, 65ºC
durante 3 minutos, 1 ciclo de 65ºC durante 4 minutos.
Los productos de PCR, que representan regiones
5' que abarcan el empalme entre la inserción transgénica nk603 y el
DNA de maíz flanqueante vecino se purificaron mediante
electroforesis en gel de agarosa seguida por purificación a partir
de la matriz de agarosa usando el Kit de Extracción de Gel QIAquick
(catálogo # 28704, Qiagen Inc., Valencia, CA) y clonación directa
dentro del vector pGEM-T Easy (catalog. # A1360,
Promega, Madison, WI). La identidad de los productos de PCR clonados
y la relación con el fragmento Mlu I de pMON25496 se confirmó
mediante análisis de secuencia de DNA (ABI Prism™ 377, PE
Biosystems, Foster City, CA y software de análisis de secuencia
DNASTAR, DNASTAR Inc., Madison, WI).
De forma similar, la secuencia de DNA de maíz
flanqueante 3' de nk603 se amplificó y clonó usando cebadores
específicos de gen adecuados, tales como, SEQ ID Nº.: 5 (5'
AGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGC 3') y SEQ ID Nº.: 6 (5'
GCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGG 3') que se fusiona al terminador
transcripcional T-AGRTU.nos. Dos terminadores
transcripcionales T-AGRTU.nos están presentes en la
inserción transgénica/genómica nk603, uno interno en la construcción
y uno en el extremo 3' de la construcción adyacente al DNA genómico
de maíz. Los productos de PCR producidos en esta reacción se
secuenciaron y la secuencia de DNA que abarca el empalme entre el
transgén y la secuencia flanqueante se distinguió de los productos
del T-AGRTU.nos interno por comparación con las
secuencias de elementos genéticos conocidas de la construcción
pMON25496 como se describe previamente.
La secuencia de DNA de maíz que flanquea ambos
lados de la inserción transgénica se determinó para nk603
secuenciando los productos de amplificación derivados de Genome
Walker™ y el alineamiento para secuencia transgénica conocida. En
el extremo 5' de la inserción transgénica, se determinó la secuencia
de un segmento de 498 pares de bases alrededor del empalme de
inserción (SEQ. ID. Nº.: 7). Esto consistió en 304 pares de bases
(pb) de la secuencia de DNA genómico de maíz flanqueante
(nucleótidos 1-304 de SEQ. ID. Nº.: 7), 45 pares de
bases de secuencia de DNA de construcción pMON25496 (nucleótidos
305-349 de SEQ. ID. Nº.: 7) y 149 pares de bases de
secuencia de DNA a partir del extremo 5' de P-Os.Act
1 (nucleótidos 350-498 de SEQ. ID. Nº.: 7).
La secuencia de DNA se determinó para un
segmento de 1183 pares de bases alrededor del empalme de inserción
3' (SEQ. ID. Nº.: 8), que comienza con 164 pares de bases del
terminador transcripcional T-AGRTU.nos (nucleótidos
1-164 de SEQ. ID. Nº.: 8), 217 pb de secuencia de
DNA de construcción pMON25496 (nucleótidos 165-381
de SEQ. ID. Nº.: 8), 305 pb de genes plastídicos del maíz,
rps11 y rpoA (segmentos parciales de cada gen
correspondientes a las bases 63-363 del acceso al
Banco de Genes X07810, correspondientes a las bases
382-686 de la SEQ. ID. Nº.: 8), y la secuencia de
DNA restante constituido por secuencia de DNA de maíz genómico que
flanquea el sitio de integración (correspondiente a las bases
687-1183 de SEQ. ID. Nº.: 8).
Las moléculas de DNA de empalme, SEQ. ID. Nº.:
9, SEQ. ID. Nº.: 10, SEQ. ID. Nº.: 11, y SEQ. ID. Nº.: 12 son
moléculas de DNA novedosas en nk603 y son diagnósticas para planta
de maíz nk603 y su progenie. Las moléculas de empalme en SEQ. ID.
Nº.: 9, SEQ. ID. Nº.: 10 y SEQ. ID. Nº.: 11 representan
aproximadamente 9 nucleótidos en cada lado de un sitio de inserción
de un fragmento de DNA de transgén y fragmento de DNA de maíz. La
SEQ. ID. Nº.: 9 se encuentra en las posiciones nucleotídicas
296-314 de SEQ. ID. Nº.: 7. Las secuencias de
empalme SEQ. ID. Nº.: 10 y 1 están situadas en las posiciones
nucleotídicas 373-390 y 678-695
respectivamente, de SEQ. ID. Nº.: 8, representando una molécula de
DNA de empalme de secuencia de DNA de construcción con secuencia de
DNA de plastos de maíz (SEQ. ID. Nº.: 10) y secuencia de
construcción con secuencia de DNA genómico de maíz (SEQ. ID. Nº.:
11). SEQ. ID. Nº.: 12 se sitúa en posición nucleotídica
156-173 de SEQ. ID. Nº.: 8 y representa una molécula
de DNA novedosa en nk603 debido a que es una fusión entre la
secuencia del terminador T-AGRTU.nos con un
fragmento invertido de la secuencia de DNA promotora de actina de
arroz,
Ejemplo
4
Los pares cebadores del caso de DNA se usan para
producir un amplicón diagnóstico para nk603. Estos pares cebadores
de caso incluyen pero no se limitan a SEQ ID Nº.: 13 y SEQ ID Nº.:
14 para la molécula de DNA de amplicón 5' y SEQ ID Nº.: 15 y SEQ ID
Nº.: 16 para la molécula de DNA de amplicón 3'. Además de estos
pares cebadores, cualquier par cebador derivado de SEQ. ID. Nº.: 7 y
SEQ. ID. Nº.: 8 que cuando se use en una reacción de amplificación
de DNA produzca un diagnóstico de amplicón de DNA para nk603 es un
aspecto de la presente invención. Las condiciones de amplificación
para este análisis se ilustran en la tabla 2 y en la tabla 3 para la
región de empalme inserto de transgén/genómica. El mismo
procedimiento se aplica para amplificación del DNA del amplicón 3'
usando moléculas de DNA cebadoras SEQ ID Nº.: 15 y SEQ ID Nº.: 16,
sin embargo, cualquier modificación de estos procedimientos que usa
moléculas de DNA o complementos de las mismas para producir una
molécula diagnóstica de DNA de amplicón para nk603 está dentro de la
habilidad ordinaria en la técnica. Además, un par cebador control
(SEQ. ID. Nº.: 17 y 18) para amplificación de un gen de maíz
endógeno se incluye como un estándar interno para las condiciones de
reacción. El análisis de muestra de extracto de DNA de tejido de
planta nK603 incluye un control de extracto de DNA de tejido
positivo de nk603, un control de extracto de DNA negativo de una
planta de maíz que no es nk603, y un control negativo que no
contiene ningún extracto de DNA de maíz plantilla. Las moléculas de
cebador de DNA adicionales de longitud suficiente se pueden
seleccionar de SEQ. ID. Nº.: 7 y SEQ. ID. Nº.: 8 por aquellos
expertos en la técnica de procedimientos de amplificación de DNA, y
condiciones optimizadas para la producción de un amplicón pueden
diferir de los procedimientos mostrados en tabla 2 y tabla 3 pero
dan como resultado un diagnóstico de amplicón para nk603. El uso de
estas secuencias cebadoras de DNA con modificaciones a los
procedimientos de tabla 2 y 3 está dentro del alcance de la
invención.
El ensayo del amplicón de nk603 se puede llevar
a cabo usando un Stratagene Robocycler, MJ Engine,
Perkin-Elmer 9700, o termociclador Eppendorf
Mastercycler Gradient como se muestra en la tabla 3, o mediante
procedimientos y aparatos conocidos por aquellos expertos en la
técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\begin{minipage}[t]{155mm} Mezclar suavemente, si es necesario (no es peligroso encima del termociclador), añadir 1-2 gotas de aceite mineral encima de cada reacción. Continuar con PCR en un Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, o termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient usando los siguientes parámetros de ciclación. \end{minipage} | |
\begin{minipage}[t]{155mm} Nota: el Motor MJ del termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient se pondría en funcionamiento en el modo calculado:. Poner en funcionamiento el termociclador con la escala de velocidad fija al máximo. \end{minipage} | |
Nº de ciclo | Ajustes: Stratagene Robocycler |
1 | 94ºC 3 minutos |
38 | 94ºC 1 minuto |
60ºC 1 minuto | |
72ºC 1 minuto y 30 segundos | |
1 | 72ºC 10 minutos |
\vskip1.000000\baselineskip
Nº de ciclo | Ajustes: Motor MJ o Perkin-Elmer 9700 |
1 | 94ºC 3 minutos |
38 | 94ºC 10 segundos |
60ºC 30 segundos | |
72ºC 1 minuto | |
1 | 72ºC 10 minutos |
Nº de ciclo | Ajustes: Eppendorf Mastercycler Gradient |
1 | 94ºC 3 minutos |
38 | 94ºC 15 segundos |
60ºC 15 segundos | |
72ºC 1 minuto | |
1 | 72ºC 10 minutos |
Un depósito de la Monsanto Company, semilla de
maíz del caso PV-ZMGT32 (nk603) descrito
anteriormente se ha fabricado bajo el Tratado de Budapest con la
American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard,
Manassas, Va. 20110. El número de acceso de ATCC es
PTA-2478. El depósito se mantendrá en el archivo
durante un periodo de 30 años, 5 años tras la última solicitud, o
durante la vida efectiva de la patente, en el caso de que sea mayor,
y se reemplazará según sea necesario durante ese periodo.
<110> Monsanto Co
\hskip1cmBehr, Carl
\hskip1cmHironaka, Catherine
\hskip1cmHeck, Gregory
\hskip1cmYou, Jinaong
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Caso de maíz
PV-ZMGT32 (nk603) y Composición y Procedimientos
para Detección del Mismo
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 38-21
(52258)B
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/213.567
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
22-06-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/241.215
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
13-10-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/240.014
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
13-10-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn en versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> totalmente sintetizado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtatatcgac tcactatagg gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> totalmente sintetizada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgacgtatca aagtaccgac aaaaacatcc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> totalmente sintetizada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactatagggc acgcgtggt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> totalmente sintetizada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctttgtttta ttttggacta tcccgactc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> totalmente sintetizada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagattgaatc ctgttgccgg tcttgc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> totalmente sintetizada
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggtgtcat ctatgttact agatcggg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(498)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1-304 DNA genómico
de maíz Zea
\hskip1cm305-349 DNA de vector de construcción
\hskip1cm350-498 DNA de promotor actina 1 de arroz
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1883)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1-64 Terminador 3'
de Agrobacterium tumefasciens nos
\hskip1cm165-381 DNA de vector de construcción
\hskip1cm382-686 Genes plastídicos de maíz Zea, rps11 y rpoA
\hskip1cm687-1183 DBA genómico de maíz Zea
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA genómico de maíz Zea y de
vector
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtagcggcc cacgcgtgg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA plastídico de maíz Zea y
DNA de vector
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaccacgcga cacacttc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA genómico de maíz Zea y
DNA de vector
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctgttctg ctgacttt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA de terminador 3' de
Agrobacterium tumefasciens nos y promotor de actina de
arroz
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccaagcttt tataatag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> totalmente sintetizado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatcgatcca aaatcgcgac tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> totalmente sintetizado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcactttgg gccacctttt at
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> totalmente sintetizado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacgttattt atgagatggg tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> totalmente sintetizado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcatctcg cgccttcctt tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. Una molécula de DNA que comprende una
secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID
Nº.: 8.
2. Un par de moléculas de DNA que comprenden:
una primera molécula de DNA y una segunda molécula de DNA, en la que
las moléculas de DNA son de longitud suficiente de nucleótidos
contiguos de SEQ ID Nº.: 7 o su complemento para funcionar como
cebadores de DNA o sondas diagnósticas para DNA extraídas a partir
de planta de maíz PV-ZMGT32 (nk603) o progenie de la
misma.
3. Un par de moléculas de DNA que comprenden:
una primera molécula de DNA y una segunda molécula de DNA, en la que
las moléculas de DNA son de longitud suficiente de nucleótidos
contiguos de SEQ ID Nº.: 8 o su complemento para funcionar como
cebadores de DNA o sondas diagnósticas para DNA extraídas a partir
de planta de maíz PV-ZMGT32 (nk603) o progenie de la
misma.
4. Un procedimiento de detectar la presencia de
una molécula de DNA seleccionada del grupo constituido por de SEQ.
ID. Nº.: 7 y SEQ. ID. Nº.: 8 en una muestra de DNA, comprendiendo el
procedimiento:
(a) extraer una muestra de DNA de una planta de
maíz;
(b) poner en contacto la muestra de DNA con un
par cebador de DNA que comprende moléculas cebadoras de DNA de
longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID Nº.: 7 o su
complemento, o SEQ ID Nº.: 8 o su complemento para funcionar como
cebadores de DNA o sondas diagnósticas para DNA extraídas de planta
de maíz PV-ZMGT32 (nk603) o progenie de la
misma;
(c) proporcionar una condición de reacción de
amplificación de ácidos nucleicos;
(d) llevar a cabo dicha reacción de
amplificación, produciendo de este modo una molécula amplicón de
DNA; y
(e) detectar la molécula amplicón de DNA.
5. Un procedimiento de detectar la presencia de
una molécula de DNA seleccionada del grupo que consta de SEQ. ID.
Nº.: 7 y SEQ. ID. Nº.: 8 en una muestra de DNA, comprendiendo el
procedimiento:
(a) extraer una muestra de DNA de una planta de
maíz;
(b) poner en contacto la muestra de DNA con una
molécula de DNA identificada como SEQ. ID. Nº.: 9, SEQ. ID. Nº.: 10,
SEQ. ID. Nº.: 11, y SEQ. ID. Nº.: 12, en la que dicha molécula de
DNA es una sonda de DNA que hibrida bajo condiciones de hibridación
restrictivas con la molécula de DNA seleccionada del grupo
constituido por SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.: 8, y no hibrida bajo las
condiciones de hibridación restrictivas con una muestra de DNA que
no contien la molécula de DNA identificada como SEQ ID Nº.: 7 o SEQ
ID Nº.: 8;
(c) someter la muestra y sonda a condiciones de
hibridación restrictiva; y detectar hibridación de la sonda al
DNA.
6. Una molécula de DNA seleccionada del grupo
que consta de SEQ. ID. Nº.: 9, SEQ. ID. Nº.: 10, SEQ. ID. Nº.: 11, y
SEQ. ID. Nº.: 12, y complementos de la misma.
7. Un procedimiento de seleccionar un rasgo de
tolerancia a glifosato dentro de plantas de maíz que comprende
a) extraer una muestra de DNA a partir de
progenie de plantas de maíz;
b) poner en contacto la muestra de DNA con una
molécula de ácido nucleico marcador seleccionada a partir del grupo
que consta de SEQ. ID. Nº.: 9, SEQ. ID. Nº.: 10, SEQ. ID. Nº.: 11, y
SEQ. ID. Nº.: 12, o complementos de la misma;
c) llevar a cabo un procedimiento de
reproducción asistida por un marcador del rasgo de tolerancia a
glifosato, en el que el rasgo de tolerancia a glifosato está ligado
genéticamente a un complemento de la molécula de ácido nucleico
marcadora.
8. Un kit de detección de DNA que comprende: al
menos una molécula de DNA de suficiente longitud de nucleótidos
contiguos homólogos o complementarios a SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.:
8 para funcionar como un cebador o sonda de DNA específico para el
caso de maíz PV-ZMGT32 (nk603) y/o su progenie.
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