CN101186918A - 玉米个体pv-imgt32(nk603)和用于对其检测的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一个能够使转基因玉米植株具有耐药性的DNA构建体。同时也提供了以插入玉米基因组的重组构建体的DNA序列和插入位点的侧翼基因组序列为基础的检测PV－ZMGT32(nk603)玉米个体存在的分析方法。

Description

玉米个体PV-IMGT32(NK603)和用于对其检测的组合物和方法
本申请是申请日为2001年6月22日，申请号为01122036.8的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及植物分子生物学领域，特别是涉及用于使植物具有对草甘膦的耐药性的一种DNA构建体。本发明更特别地涉及一种对草甘膦具有耐药性的玉米植株PV-ZMGT32(nk603)和检测在样品及其组成中玉米植株PV-ZMGT32(nk603)DNA的存在与否的分析方法。
发明背景
本发明涉及对草甘膦除草剂具有耐药性的玉米(Zea mays)植株PV-ZMGT32(nk603)和玉米植株PV-ZMGT32(nk603)的DNA植物表达构建体，以及在玉米PV-ZMGT32(nk603)及其后代中转基因/基因组插入片段的检测。
玉米是一种重要的作物，在世界很多地方它是主要的食物来源。生物工艺学的方法已经被应用于玉米以改善其农艺学特性和产品质量。上述的农艺学特性之一是对除草剂的耐药性，特别是对草甘膦除草剂的耐药性。玉米的这种特性可以通过转基因在玉米植株中的表达而得到(美国专利号6,040,497)。
人们已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，这种影响可能是由于染色质的结构(即异染色质)或转录调节元件(例如，增强子)紧靠整合位点的接近(Weising等，Ann.Rev.Genet22：421-477，1988)造成的。由于这个原因，通常需要筛选大量的个体(event)才能鉴定出具有所关注引入的基因最理想表达特征的个体。例如，人们观察到在植物或其他生物体内，外源基因在不同的个体之间表达水平有很大的差异。另外在外源基因表达的时间和空间模式上也会有差异，例如，外源基因在不同植物组织之间相对表达上的差异性，这种差异性表现在实际表达模式可能与根据外源基因构建中的转录调节元件所预期的表达模式不一致。因此，通常情况下需要产生成百上千个不同的基因重组个体，然后从这些个体中筛选出单个具有商业应用前景的预期转基因表达水平和模式的个体。具有预期转基因表达水平或模式的个体用于采用传统育种方法通过有性异型杂交将外源基因渗入到其它遗传背景的个体中。通过这种杂交作用产生的后代保持了原始转化体的转基因表达特性。这种策略用于保证在很好适应本地生长条件的各种品种中基因的可靠表达。
如果能够检测一个特定个体基因的存在以确定有性杂交的后代是否含有所关注的转基因，将是有利的。另外，检测特定个体基因存在与否的方法也将有助于遵守相关的条例，例如要求来源于重组作物植物的食物在投入市场前需要获得正式批准和进行标记。通过目前熟知的任何一种核酸检测方法，例如聚合酶链式反应(PCR)或利用核酸探针进行DNA杂交来检测转基因的存在都是可能的。这些检测方法的对象普遍都集中在常用的基因元件，如启动子、终止子、标记物基因等。因此，如果与插入DNA相邻的染色体DNA(“侧翼DNA”)的序列未知，上述这些方法就不能够用来区别不同个体间的差异，特别是那些用相同的DNA构建体得到的个体。人们曾经讨论过一类个体特异性的PCR分析方法，例如，Windels等(Med.Fac.Landbouww.Univ.Gent 64\5b：459-462，1999)通过使用一个引物组的PCR分析方法鉴定草甘膦耐药性的大豆个体40-3-2，他们所用的引物组跨越了插入DNA和侧翼DNA的接合部位，具体地说，是包括了插入DNA的序列的一个引物，和包括了侧翼DNA的序列的第二引物。
本发明概述
根据本发明的一个方面，提供了一个DNA构建体，当其在植物细胞内表达时，该植物获得对草甘膦除草剂的耐药性。本发明优选涉及生产和选择具有草甘膦耐药性的单子叶谷类植物的方法。该DNA构建体由两个转源基因表达组件构成。第一个基因表达组件包含一个由水稻(Oryzae sativa)肌动蛋白1启动子和水稻肌动蛋白1内含子组成的DNA分子，所述内含子和编码叶绿体转运肽序列的DNA分子操作连接起来，该DNA分子和编码草甘膦抗性5-烯醇-丙酮酰莽草酸(pyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSPS)的DNA分子操作连接起来，和包含有3’转录终止子的DNA分子操作连接起来。第二个DNA构建体的转基因表达组件包含一个花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的DNA分子，该分子和包含Hsp70内含子的DNA分子操作连接起来，和编码叶绿体转运肽序列的DNA分子操作连接起来，再和编码草甘膦抗性5-烯醇-丙酮酰莽草酸(pyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSPS)的DNA分子操作连接起来，和包含有3’转录终止子的DNA分子操作连接起来。
更为具体地，所提供的DNA构建体在植物细胞中表达时，该植物获得对草甘膦除草剂的耐药性。本发明优选涉及生产和选择具有草甘膦耐药性的单子叶谷类植物。该DNA构建体由两个转基因表达组件构成。第一个表达组件由一个由水稻(Oryzae sativa)肌动蛋白1启动子和水稻肌动蛋白1内含子操作连接到编码Arabidopsis EPSPS叶绿体转运肽序列的DNA分子上，操作连接到从根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens sp.)CP4株中分离得到的编码草甘膦抗性5-烯醇-丙酮酰莽草酸(pyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSPS)的DNA分子上，操作连接到由胭脂碱合酶转录终止子组成的DNA分子上而组成。第二个转基因表达组件由含有增强子区域串联重复的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的DNA分子操作连接到由Zea mays Hsp70内含子组成的DNA分子上，操作连接到编码Arabidopsis EPSPS叶绿体转运肽序列的DNA分子上，操作连接到从根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefacienssp.)CP4株中分离得到的编码草甘膦抗性5-烯醇-丙酮酰莽草酸(pyruvylshikimate)-3-磷酸合酶(EPSPS)的DNA分子上，操作连接到由胭脂碱合酶转录终止子组成的DNA分子上而组成。
根据本发明的另一个方面，提供了用于检测存在转基因/基因组插入区域的组合物和方法，该插入区域来源于一种新的被称为PV-ZMGT32(nk603)的玉米植株。所提供的DNA分子包括至少一个PV-ZMGT32(nk603)的连接序列，该序列选自5’TGTAGCGGCCCACGCGTGGT3’(SEQ ID NO：9) ，5’TACCACGCGACACACTTC3’(SEQ OD NO：10)，和5’TGCTGTTCTGCTGACTTT3’(SEQ ID NO：11)以及它们的互补序列；其中连接序列跨越了插入基因组的异源DNA和来自于玉米细胞的侧翼插入位点的DNA之间的结合部位，该连接序列用于鉴定这一个体的发生。含有这些分子的玉米植株和种子是本发明的一个方面。
一个新的DNA分子5’ACCAAGCTTTTATAATAG3’(SEQ ID NO：12)及其互补序列，其中该DNA分子在PV-ZMGT32(nk603)及其后代中是新的。包含该分子的玉米植株和种子是本发明的一个方面。
根据本发明的另一个方面，包含有新的转基因/基因组插入区域，SEQID NO：7和SEQ ID NO：8以及和SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8同源或互补的DNA分子是本发明的一个方面。
含有足够长度的SEQ ID NO：7 DNA序列的转基因部分和类似的足够长度的SEQ ID NO：7的5’侧翼玉米DNA序列的DNA分子，或者含有类似足够长度的SEQ ID NO：8 DNA序列的转基因部分和类似的足够长度的SEQ ID NO：8转基因3’侧翼DNA序列的DNA分子，其中这些DNA分子用作DNA扩增方法中的DNA引物，以提供特异性来自于PV-ZMGT32(nk603)及其后代的DNA扩增子产物，是本发明的另一个方面。与一定长度的SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8同源或互补的DNA引物是本发明的一个方面。用DNA引物所产生的用于鉴定玉米个体PV-ZMGT32(nk603)及其后代的扩增子是本发明的一个主题。
根据本发明的另一个方面，提供了检测样品中与玉米个体PV-ZMGT32(nk603)对应的DNA存在的方法。这样的方法包括：(a)将含有DNA的样品与DNA引物组接触，该引物组用于和提取自玉米个体PV-ZMGT32(nk603)的基因组DNA进行核酸扩增反应时，产生可用于鉴定玉米个体PV-ZMGT32(nk603)的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，从而产生扩增子；和(c)检测该扩增子。一对含有与SEQ ID NO：7和SEQID NO：8同源或互补的DNA引物组的DNA分子，该引物组的作用是在核酸扩增反应中产生可用于鉴定PV-ZMGT32(nk603)的扩增子DNA分子。更为具体的，一对含有DNA引物组的DNA分子，其中的DNA分子被鉴定为SEQ ID NO：13或其互补序列和SEQ ID NO：14或其互补序列；SEQ ID NO：15或其互补序列和SEQ ID NO：16或其互补序列。包含有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14 DNA分子的扩增子。包含有SEQ IDNO：15和SEQ ID NO：16 DNA分子的扩增子。通过上述方法产生的扩增子可以在严格条件下和SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、或SEQ ID NO：12进行杂交。
根据本发明的另一个方面，检测样品中与PV-ZMGT32(nk603)个体对应的DNA分子存在的方法，这样的方法包括：(a)将含有从玉米植株中提取的DNA的样品与DNA探针分子相接触，该探针分子可以在严格条件下和来自于玉米个体PV-ZMGT32(nk603)的基因组DNA发生杂交，而不和对照组玉米植株DNA在严格条件下发生杂交；(b)将样品和探针置于严格杂交条件下；和(c)检测探针和DNA的杂交情况。更为具体的，一种检测样品中与PV-ZMGT32(nk603)个体对应的DNA分子存在的方法，该方法，由如下步骤组成：(a)将含有从玉米植株中提取的DNA的样品与DNA探针分子相接触，该探针分子由SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12组成，其中该DNA探针分子在严格条件下和来自于玉米植株PV-ZMGT32(nk603)的基因组DNA进行杂交，而不和对照组玉米植株DNA在严格条件下发生杂交；(b)将样品和探针置于严格杂交条件下；和(c)检测探针和DNA的杂交情况。
根据本发明的另一个方面，提供了生产对草甘膦具有耐药性的玉米植株的方法，该方法包括如下步骤：(a)将第一亲本玉米系与第二亲本玉米系进行有性杂交，第一亲本玉米系含有本发明的表达组件，该表达组件产生对施用草甘膦的耐药性，第二亲本玉米系缺乏草甘膦耐药性，从而产生大量的子代植株；和(b)挑选能够耐受施用草甘膦的子代植株。这样的方法可以任选地包括进一步将子代植株和第二亲本玉米进行回交的步骤，以产生纯育的具有草甘磷抗性的玉米植株。
根据本发明的另一个方面，提供了一种方法以挑选本发明中对草甘磷具有耐药性的玉米植株和其后代，该方法包括，从植株样品中提取DNA，将DNA和选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、或SEQ ID NO：12或其互补序列的标记物核酸分子相接触，检测该标记物核酸分子和DNA的杂交情况，进行标记物辅助育种分析以确定草甘膦耐药性特征和标记物核酸分子的遗传学连锁。
本发明提供了一种生产对草甘膦除草剂具有耐药性的玉米植株的方法，该方法包括用DNA构建体(pMON25496)转化玉米细胞，选择对有效剂量草甘磷处理有耐药性的玉米细胞，培育该玉米细胞长成可育的玉米植株。这种可育的玉米植株可以自花授粉或与可配伍的玉米品种进行杂交以产生对草甘磷具有耐药性的子代。
本发明进一步涉及一种DNA检测试剂盒，该试剂盒至少包括一种DNA分子，该DNA分子具有足够长度的与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8同源或互补的连续的核苷酸，其作用是作为对玉米植株PV-ZMGT32(nk603)或其后代特异性的DNA引物或探针。
本发明进一步涉及ATCC登记号为No.PTA-2478的具有草甘膦耐药性的玉米(Zea mays)PV-ZMGT32(nk603)植株和种子以及其产生的后代。通过种植对草甘膦具有耐药性的玉米植株PV-ZMGT32(nk603)而得到的玉米植株或其组成部分，玉米植株PV-ZMGT32(nk603)的花粉和胚珠。玉米植株PV-ZMGT32(nk603)及其后代的营养细胞的细胞核，花粉细胞的细胞核，卵细胞的细胞核。本发明的来源于玉米植株和种子PV-ZMGT32(nk603)的DNA引物分子提供了一种特异性的扩增子产物是本发明的一个方面。
本发明前述和其他的方面在下面的详细描述和附图中会更为明确。
附图简述
附图1.质粒pMON25496的结构图
优选实施方案的详细描述
本申请对在06/22/00日提交的、美国临时申请号60/213,567的申请，10/13/00日提交的、美国临时申请号60/241,215的申请，以及在10/13/00日提交的，美国临时申请号60/240,014的申请提出利益要求。如下所提供的定义和方法是为了更好地定义本发明以及指导那些本领域的普通技术人员实践本发明。除非另外指出，所用的术语应该根据相关领域的普通技术人员的常规用法进行理解。分子生物学的一般性术语的定义可以在Rieger等著的《Glossary of Genetics：Classical and Molecular》(第5版，Springer-Verlag：纽约，1991)一书中和Lewin所著的《Genes V》(牛津大学出版社：纽约1994.)一书中找到。所用的DNA碱基命名法是在37 CFR§1.822中提出的。
于此所用的术语“玉米”指的是“Zea mays”或玉蜀黍，它包括可以和玉米进行育种的所有植物品种，包括野生玉蜀黍品种。
于此所用的术语“包括”指的是“包含但不局限于”。
草甘膦指的是N-膦酰基甲基氨基乙酸及其盐类，草甘膦是Roundup除草剂(孟山都公司)的活性成分。用“草甘膦除草剂”进行处理指的是用Roundup，Roundup Ultra，Roundup UltraMax除草剂或其他任何一种含有草甘膦的除草剂制剂进行处理。为了达到有效生物学剂量而对某种草甘膦制剂使用率的选择不超出普通农艺技术人员的技能。
DNA构建体是DNA分子互相连接起来的组装，该组装提供了一个或多个表达组件。DNA构建体优选地是能够在细菌细胞内自我复制，而且含有不同的限制性内切酶位点的质粒，所含的限制性内切酶位点用于导入提供功能性基因元件，即启动子、内含子、前导序列、编码序列、3’终止子区域和其他序列的DNA分子。DNA构建体中所含有的表达组件包括提供信使RNA的转录所必需的基因元件。该表达组件可以设计为在原核细胞或真核细胞中表达。本发明的表达组件被设计为最优选地在植物细胞内表达。转基因植物体内表达组件的组合会导致产生非预期的表型。在本发明中，在DNA构建体(pMON25496)中所提供的水稻肌动蛋白1启动子组件和CaMV 35S启动子组件的组合与单一组件相比，以及与含有3个水稻肌动蛋白1启动子组件拷贝的商业标准GA21相比，加强了转基因玉米植株对草甘膦除草剂的耐药性。
转基因“个体”是通过用异源基因构建体转化植物细胞而得到的，包括一个含有目的转基因的核酸表达组件，由转基因插入植物基因组而得到的植物群体的再生，挑选具有插入特定基因组位点特征的特定植株。术语“个体”指的是原始转化体和包含有异源DNA的转化体的后代。术语“个体”也指转化体和含有异源DNA的其他品种个体之间进行有性杂交而得到的后代。即使经过与循环的亲本进行反复回交，来自于转化体亲本的插入的DNA和侧翼DNA在杂交的子代中，继续存在染色体上的相同位点。术语“个体”也指来自于原始转化体的DNA，该原始转化体含有插入DNA和与插入DNA紧密相邻的侧翼基因组序列，该插入DNA被预期转移到子代中，作为含有插入DNA(例如，原始转化体和其自交产生的后代)的亲本系和不含插入DNA的亲本系有性杂交的结果，子代接受了包含有目的转基因的插入DNA。培育一种具有草甘膦耐药性的玉米植株PV-ZMGT32(nk603)，通过以下步骤：首先进行第一亲本系与第二亲本系的有性杂交，第一亲本玉米植株由培育自转基因玉米植株PV-ZMGT32(nk603)(ATCC登记号No.PTA-2478)及其后代的玉米植株组成，该转基因玉米植株及其后代是通过利用本发明的对施用草甘膦除草剂具有耐药性的表达组件转染而得到的，第二亲本玉米植株缺乏对草甘膦除草剂的耐药性，从而产生了多样的第一代子代植株；然后挑选对施用草甘膦除草剂具有耐药性的第一代子代植株，进行自交，从而产生大量第二代子代植株；接着从第二代子代植株中挑选对草甘膦除草剂具有耐药性的植株。这些步骤可以进一步包括将第一代草甘膦耐药性子代植株或第二代草甘膦耐药性子代植株与第二亲本玉米植株或第三亲本玉米植株进行回交，从而产生对施用草甘膦除草剂具有耐药性的玉米植株。
同样应该理解的是，两株不同的转基因植物也可以配对产生具有两个独立的、分离性添加的外源基因的后代。适当后代的自交可以得到对两个添加的外源基因来说都是纯合子的后代植株。与亲本植株的回交以及与非转基因植物的远交，如营养体繁殖也是可以预期的。对其它普遍用于获得不同特性和农作物的育种方法的描述可以在参考文献之一中找到，例如，Fehr的《Breeding Methods for Cultivar Development》(WilcoxJ.编著，American Society of Agronomy，Madison WI(1987))。
“探针”是一段分离的核酸分子，其上结合有常规的可检测标记或报道性分子，例如，放射性同位素、配体、化学发光剂或酶类。这样的探针与目标核酸的一条链是互补的，在本发明中，探针的互补对象是来自玉米个体PV-ZMGT32(nk603)基因组DNA的一条链，该基因组DNA来源于玉米植株或含有该个体DNA的样品。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括聚酰胺和其他用于特异性结合到目标DNA序列的探针材料，这些材料还可以用于检测目标DNA序列的存在。
“引物”是一段分离的核酸分子，它可以经过通过核酸杂交，退火结合到互补目标DNA链上，在引物和目标DNA链之间形成杂合体；然后在聚合酶，例如DNA聚合酶，的作用下沿着目标DNA链延伸。本发明的引物对涉及其在目标核酸序列扩增中的应用，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规的核酸扩增方法。
探针和引物要有足够的核苷酸长度从而在操作人员设定的杂交或反应条件下特异性地结合到目标DNA序列上。这段长度可以是满足所选检测方法需要的任意足够的长度。一般的，使用长度为11个核苷酸或更长，优选使用长度为18个核苷酸或更长，更优选的使用长度为24个核苷酸或更长，最优选使用长度为30个核苷酸或更长。这样的探针和引物在高度严格的杂交条件下特异性地和目标序列杂交。优选地，根据本发明的探针和引物和与目标序列连续核苷酸具有全DNA序列相似性，尽管探针与目标DNA序列不同而且那些保持了与目标DNA序列杂交能力的探针可以通过常规方法设计得到。
制备和使用探针和引物的方法在文献中进行过描述，例如，在《分子克隆：实验手册》(《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》)第2版，vol.1-3，Sambrook等编著，冷泉巷实验出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，冷泉港，NY，1989(下文中略作“Sambrook等，1989”)；《当代分子生物学方法》(《Current Protocols in MolecularBiology》)，Ausubel等编著，Greene Publishing and WileyInterscience，纽约，1992(周期性更新)(下文略作“Ausubel等，1992”)；以及Innis等的《PCR方案：方法和应用指南》(《PCR Protocols：A Guide to Methodsand Applications》)，科学出版社：San Diego，1990。PCR引物对可以从已知序列中得到，例如使用专门为此目的设计的计算机程序，象Primer(Version 0.5，1991，whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA)。
这里所公开的基于侧翼DNA和插入序列的引物和探针能够通过常规方法，例如再克隆和测序，确定(如果需要，也可以改正)所公开的序列。
本发明的核酸探针和引物在严格条件下和目标DNA序列发生杂交。任何一种常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定样品中来源于转基因个体的DNA的存在。核酸分子或其片段在一定的条件下能够和其他核酸分子发生特异性杂交。如这里所用的，如果两个核酸分子能够形成一个反平行、双链的核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此之间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性则称一个核酸分子与另一个核酸分子互补。如这里所用的，如果一个核酸分子的每一个核苷酸都和另一个核酸分子的对应核苷酸互补，则称这两个核酸分子具有“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性彼此杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下发生退火并结合在一起，则称这两个分子具有“最低程度的互补性”。类似的，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性彼此杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下发生退火并结合在一起，则称这两个分子具有“互补性”。常规的严格条件在Sambrook等，1989和Haymes等的《核酸杂实践方法》(《Nucleic Acid Hybridizaton，A Praticai Approach》)(IRL Press，Washington，DC(1985))中有所描述。与完全互补性的偏差是允许的，只要这样的偏差不会完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，只需要保证其在序列上有足够的互补性，能够在使用的特定的溶剂和盐浓度条件下形成一个稳定的双链结构。
如这里所用的，基本同源的序列是指一段核酸分子，该核酸分子在高度严格的条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性的杂交。启动DNA杂交的适当的严格条件，例如，大约45℃条件下6.0 x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后用2.0 x SSC在50℃条件下冲洗，为本领域的技术人员所熟知，这些条件也可以在《当代分子生物学方法》《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。例如，在冲洗步骤中的盐浓度可以从低严格条件的约2.0xSSC、50℃到高严格条件的约0.2xSSC、50℃中选择。另外，清洗步骤中的温度条件可以从低严格条件下的室温，约22℃，升高到高严格条件下的约65℃。温度条件和盐浓度都可以发生改变，也可以其中一个保持恒定而另一个变量发生改变。在一个优选的实施方案中，本发明的一个核酸分子可以在适度严格条件下，例如大约65℃、和大约2.0xSSC，和前面提出的SEQ ID NO：9、10、11和12中的一个或多个核酸分子或其互补序列或其片段发生杂交。在一个特别优选的实施方案中，本发明的一个核酸分子在高度严格条件下和前面提出的SEQ IDNO：9到SEQ ID NO：12中的一个或多个核酸分子或其互补序列或其片段发生杂交。在本发明的一个方面中，本发明的一个优选的标记物核酸分子具有的核酸序列是前面提出的SEQ ID NO：9到SEQ ID NO：12或其互补序列或其片段的序列。在本发明的另一个方面中，本发明的一个优选的标记物核酸分子的序列与前述的SEQ ID NO：9到SEQ ID NO：12或其互补序列或其片段的序列有80％到100％或90％到100％的序列同一性。在本发明的一个进一步的方面中，一个优选的标记物核酸分子的序列与前述的SEQ ID NO：9到SEQ ID NO：12或其互补序列或其片段的序列有95％到100％的序列同一性。SEQ ID NO：9到SEQ ID NO：12可以用来作为植物育种方法中的标记物以鉴定基因杂交的后代，该方法与《DNA标记物：方法，应用和综述》《DNA markers：Protocols，applications，and reviews》(1997，173-185，Cregan等编著，Wiley-Liss NY；)中介绍的简单序列重复DNA标记物分析方法类似，上述所有引用的文献在此完全引入作为参考。探针和目标DNA分子的杂交可以通过任何一种为本领域技术人员所熟知的方法进行检测，这些方法包括，但不局限于：荧光标记、放射性标记、抗体类标记和化学发光标记。
关于使用特定扩增引物对目标核酸序列进行的扩增(例如，PCR)，“严格条件”指的是仅仅允许引物对同目标核酸序列发生杂交的条件，具有与目标DNA相应的野生型序列(或其互补序列)的引物对，能够在DNA热扩增反应中结合到目标DNA并且优选产生唯一的扩增产物，即扩增子。
术语“特异性结合(目标序列)”指的是探针或引物在严格杂交条件下仅仅同含有目标序列的样品中的目标序列发生杂交。
如这里所用的，“经过扩增的DNA”或“扩增子”指的是作为核酸模板一部分的目标核酸序列的核酸扩增产物。例如，为了确定通过有性杂交方式得到玉米植株是否含有来自于本发明玉米植株的转基因个体基因组DNA，可以将从玉米植株组织样品中提取的DNA通过核酸扩增方法产生扩增子用于检测转基因个体DNA的存在，其所用的引物对包括一个来源于植物基因组中与插入的外源DNA插入位点相邻的侧翼序列的第一引物，和来源于插入的异源DNA的第二引物。扩增子具有一定的长度和序列也可用于对转基因个体的检测。扩增子的长度范围可以是引物对的联合长度加上1个核苷酸碱基对、优选加上约五十个核苷酸碱基对、更为优选加上约两百五十个核苷酸碱基对以及甚为优选加上约四百五十个核苷酸碱基对范围。可选的，引物对可以来自于插入DNA两侧的侧翼序列，这样就会产生包括整个插入核苷酸序列(例如，图1中，pMON25496表达构建体中的Mlu1 DNA片段，约6706个核苷酸碱基对)的扩增子。来源于植株基因组序列的引物对中的一个可以位于距插入的DNA序列一定距离处，这段距离范围可以从1个核苷酸碱基对到扩增反应的极限，或约两万个核苷酸碱基对。“扩增子”术语的使用特别排除了在DNA热扩增反应中形成的引物二聚体。
核酸扩增反应可以通过本领域中所知的任何一种核酸扩增方法实现，包括，聚合酶链式反应(PCR)。各种核酸扩增方法在本领域内为人所知而且特别在美国专利号4,683,195和4,683,202以及在《PCR方案：方法和应用指南》(《PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications》)Innis等编著，Academic Press，San Diego，1990)中有所描述。PCR扩增方法已经被发展到可以扩增长度达到22kb的基因组DNA和42kb的噬菌体DNA(Cheng等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Aca.Sci.USA)91：5695-5699，1994)。这些方法和其他一些在DNA扩增领域为人所知的方法可以在本发明的具体实践操作中使用。插入的异源DNA序列和来自于玉米个体PV-ZMGT32(nk603)的侧翼DNA序列可以通过扩增从ATCC保藏登记编号为No.PTA-2478的种子或植株中提取的DNA的序列进行检验(如果必要可以进行修正)，该扩增过程所用的DNA引物来源于其中所提供的序列，扩增后对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准的DNA测序。
这些方法所产生的扩增子可以通过多种技术进行检测。其中一个方法是Genetic Bit Analysis(Nikiforov，等.核酸研究(Nucleic Acid Res.)22：4167-4175，1994)，该方法设计了一个跨越插入的DNA序列和相邻的侧翼基因组序列的DNA寡核苷酸链。将该寡核苷酸链固定在一个微孔板的微孔内。在对所关注的区域进行PCR扩增(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列各使用一个引物)后，单链PCR产物可以和固定化的寡聚核苷酸链进行杂交，并且作为单碱基延伸反应的模板，该延伸反应使用了DNA聚合酶和为下一个预期的碱基特定标记的ddNTPs。可以通过荧光或ELISA类方法读出结果。信号代表了插入/侧翼序列的存在，说明进行了成功的扩增、杂交和单碱基延伸反应。
另一种方法是Winge(Innov.Pharma.Tech.00：18-24，2000)所描述的高温测序技术。在此方法中设计了一个跨越插入DNA和相邻的基因组DNA结合部位的寡聚核苷酸链。将该寡聚核苷酸和所关注区域的单链PCR产物(在插入序列内和相邻的侧翼基因组序列各使用一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶、ATP、硫酰基酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷-5’-磷硫酸盐和荧光素一起进行温育。分别加入DNTPs，结合的结果会导致产生可测量的光信号。光信号代表了转基因插入/侧翼序列的存在，说明进行了成功的扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸反应。
Chen等(基因组研究(Genome Res.)9：492-498，1999)所述的荧光偏振现象也是一种可以用于检测本发明扩增子的方法。使用这种方法需要设计一个跨越插入DNA和相邻的基因组DNA结合部位的寡聚核苷酸链。将该寡聚核苷酸和所关注区域的单链PCR产物(在插入的DNA内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)进行杂交，然后和DNA聚合酶以及一种荧光标记的ddNTP一起进行温育。单碱基延伸会导致插入ddNTP。这种插入可以通过使用荧光仪测量其偏振的改变。偏振的改变代表了转基因插入/侧翼序列的存在，说明进行了成功的扩增、杂交和单碱基延伸反应。
Taqman(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)被描述为一种检测和定量分析DNA序列存在的方法，该方法在制造商所提供的使用说明中有详细介绍。现简要说明如下，设计一个跨越了插入DNA和相邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡聚核苷酸探针。该FRET探针和PCR引物(插入DNA序列内和相邻的侧翼基因组序列各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs存在下进行循环反应。FRET探针的杂交导致FRET探针上荧光部分和淬灭部分的分裂以及荧光部分的释放。荧光信号的产生代表了转基因插入序列/侧翼序列的存在，说明进行了成功的扩增和杂交。
Tyangi等(自然生物技术(Nature Biotech.)14：303-308，1996)介绍了分子标志在序列检测中的应用。简要说明如下，设计一个跨越了插入DNA和相邻的基因组侧翼结合部位的FRET寡聚核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致其含有二级结构，该二级结构能够在近距离内保持荧光部分和淬灭部分。该FRET探针和PCR引物(插入DNA序列内和相邻的侧翼基因组序列中各使用一个引物)在热稳定聚合酶和dNTPs存在下进行循环反应。经过成功的PCR扩增，FRET探针和目标序列的杂交导致探针二级结构的丧失，从而使荧光部分和淬灭部分在空间上发生分离。产生荧光信号。荧光信号的产生代表了转基因插入序列/侧翼序列的存在，说明进行了成功的扩增和杂交。
下面的实施例用于示范本发明某些优选的实施方案的实施例。本领域的技术人员应当理解的是随后的这些实施例中所公开的技术方法代表了发明人在本发明的实际操作中发现的作用良好的方法，因此可以被认为在实际操作中构成优选的实施例。然而，本领域的技术人员应该理解的是，在本发明的范围内对公开的特定实施方案可能会进行很多的改动，但在不背离本发明的范围和精神的条件下，仍可以得到类似的实验结果。
实施例
实施例1
转基因玉米个体PV-ZMGT32(nk603)(下文以nk603代表)是通过用来源于pMON25496(附图1)的线性Mlu I DNA片段对玉米胚胎(Songstad等，In Vitro Cell Plant 32：179-183，1996)进行微粒轰击而得到的。该DNA片段含有两个转基因表达组件，这两个组件共同使玉米植株具有对草甘膦的耐药性。第一个表达组件由水稻肌动蛋白1启动子和内含子(P-Os.Act1和I-Os.Act1，美国专利号5,641,876)，操作连接到ArabidopsisEPSPS叶绿体转运肽(TS-At.EPSPS：CTP2，Klee等，分子、基因、遗传(Mol.Gen.Genet.)210：47-442，1987)上，操作连接到来土壤杆菌属CP4株(AGRTU.aroA：CP4，美国专利号5,633,435)的草甘膦耐药性的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)上，并操作地连接到胭脂碱合酶的转录终止子(T-AGRTU.nos，Fraley等美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80：4803-4807,1983)上而组成。第二个转基因表达组件由含有增强子区域的串联重复的花椰菜花叶病毒35S启动子(P-CaMV.35S，Kay等Science 236：1299-1302，1987；美国专利号5,164,316)，操作连接到Zea mays的Hsp70内含子(I-Zm.Hsp70，美国专利号5,362,865)上，操作连接到Arabidopsis EPSPS叶绿体转运肽(TS-At.EPSPS：CTP2，Klee等，分子、基因、遗传(Mol.Gen.Genet.)210：47-442，1987)上，操作连接到来自土壤杆菌CP4株(AGRTU.aroA：CP4，美国专利号5,633,435)的草甘膦耐药性的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)上，和操作连接到胭脂碱合酶的转录终止子(T-AGRTU.nos，Fraley等美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80：4803-4807,1983)上而组成。经过轰击后，具有草甘膦耐药性的转基因胼胝体在含有3mM草甘膦的培养基中进行挑取，然后再生得到植株。一共产生了来自91个独立转基因个体的304株植株，然后依据一个高级的特性组合从这个群体中挑选nk603，这些特性包括草甘膦耐药性、农艺学表现和单个转基因插入。对nk603个体及其后代进行的温室和大田生长评估说明该转基因插入使其获得了在V4和V8叶期使用时为340g草甘膦/英亩的耐药性(840g草甘膦/公顷；32ozRoundupUltra/英亩)，该标准超过了对完整营养期(vegetative)和繁殖期(productive)耐药性的商品规格。
实施例2
将草甘磷耐药性nk603玉米个体和目前的商业标准，GA21(美国专利号6,040,497)进行对草甘膦营养期损伤的耐药性和对产量的影响的比较。GA21含有至少3个转基因表达组件在GA21个体基因组中以串联形式排列(SCP/GMO/232-Final，European commission Health & ConsumerProtection Directorate-General)。GA21的转基因组件由一个水稻肌动蛋白1启动子和连接到一个核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶叶绿体转运肽上，连接到一个修饰过的玉米草甘磷抗性EPSPS和一个3’胭脂碱合酶的转录终止子区的内含子组成。nk603和GA21的植株被成行种植在重复的田间试验小区上。处理条件为1)不喷洒，2)按64oz/英亩剂量在V4叶期喷洒Roundup Ultra，然后在V8期按相同剂量再次喷洒RoundupUltra，3)按96oz/英亩剂量在V4叶期喷洒Roundup Ultra，然后在V8期按相同剂量再次喷洒Roundup Ultra。营养期耐药性是以营养期损伤百分比的形式进行度量的，该百分比是根据在V8期除草剂处理后第10天观察到的叶子畸形数量而确定的。每个试验小区的产量是以蒲式耳/英亩以及除草剂处理后与未喷洒组相比产量降低率的形式进行度量的。表1所显示的结果说明和GA21植株相比，nk603显示出更低的营养期损伤率，而观察到的产量降低率也比GA21要小。在未喷洒小区也观察到低的营养期损伤发生率，这种现象归因于各种环境因素的影响而不是因为暴露于草甘膦除草剂的影响。将nk603中pMON25496的双表达组件和3个单独的仅由CaMV.35S启动子驱动草甘膦耐药性基因(AGRTU.aroA：CP4)表达的玉米个体就营养期损伤率和繁殖率进行比较。观察到双表达组件与3个单独的玉米个体(ev1，ev2，ev3)相比，可以使玉米获得更高的营养期耐药性和繁殖耐药性，这3个单独的玉米个体仅含有由CaMV.35S启动子驱动草甘膦耐药性基因的表达组件。nk603加上3个附加的来自pMON25496的玉米个体和6个来源于草甘膦耐药性基因表达仅仅被水稻肌动蛋白启动子和内含子(P-Os.Act1/I-Os.Act1)所驱动的构建体的玉米个体的平均伤害水平进行比较，可以观察到前者使玉米个体获得更高的对草甘膦除草剂的营养期耐药性水平。用双表达组件转化的植物和来源于用单表达组件转化的植物相比较，前者对营养期和繁殖期损伤具有更高水平的草甘膦耐药性，因此就导致了对使用草甘膦除草剂带来的产量降低的抗性的提高。pMON25496构建体在nk603的单一位点上提供了两个植物表达组件，与在商业标准GA21中的3个串联插入相比，提高了对草甘膦的耐药性水平。
表1.nk603的草甘膦耐药性-营养期损伤、产量和繁殖率
  个体   处理条件 ％营养期损伤*  产量(蒲式 耳/英亩)  ％产量降 低率
  GA21   未喷洒V4期和V8期各64盎司Roundup Ultra处理V4期和V8期各96盎司Roundup Ultra处理     0.35.38.3     142.2134.1129.1 5.79.2
  nk603   未喷洒V4期和V8期各64盎司Roundup Ultra处理V4期和V8期各96盎司Roundup Ultra处理     0.92.94.7     145.6138.5140.1 4.93.8
处理条件 繁殖率 **
    nk603CaMV.35Sev 1CaMV.35Sev 2CaMV.35Sev 3 V8期64盎司RoundupUltra处理V8期64盎司RoundupUltra处理V8期64盎司RoundupUltra处理V8期64盎司RoundupUltra处理 4.52.02.22.4
  处理条件   平均％营养期 损伤率 *
  nk603加上3个附加的pMON25496个体6个P-Os.Act1单组件个体   V4期和V8期各128盎司RoundupUltra处理V4期和V8期各128盎司RoundupUltra处理 22.928.9
*表示营养期损伤率是在V8期处理后第10天进行的观察，它是评估由于草甘磷处理引起的营养期损伤的一个标准。**表示雄性繁殖率：4-5＝完全可育；3＝花粉排出显著降低；0-2＝完全不育-高度不育，不适于商业应用。
实施例3
来自nk603的相应的侧翼DNA分子使用了Genome WalkerTM试剂盒(catalog#K 1807-1，CloneTech Laboratories，Inc，Palo Alto，CA)中所介绍的连接衔接子和嵌套式聚合酶链式反应方法进行了克隆。首先，来自nk603个体的基因组DNA用CTAB纯化方法(Rogers等，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)5：69-76，1985)进行纯化。用于扩增的基因组DNA文库根据试剂盒制造商的说明(Genome WalkerTM，CloneTechLaboratories，Inc，Palo Alto，CA)进行准备。在各自的反应中，基因组DNA用下述的平头限制性内切酶在37℃条件下消化过夜：EcoRV，ScaI，DraI，PvuII和StuI(CloneTech Laboratories，Inc，Palo Alto，CA)。反应混合物用苯酚：三氯甲烷进行抽提，在水相中加入乙醇以沉淀DNA，离心收集沉淀，然后在Tris-EDTA缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0.1mMEDTA)中将沉淀重悬。将纯化的平头基因组DNA片段按照制造商的说明连接到Genome WalkerTM衔接子上。连接后，对各反应用热处理(70℃条件下5分钟)以终止反应，然后用Tris-EDTA缓冲液稀释10倍。将1μl各个分别的连接产物在50μl反应物中进行扩增，所述反应物包括1μl各自的衔接子连接文库、1μl的10μM Genome WalkerTM衔接子引物AP1(5’G TATATCGACTCACTATAGGGC3’，SEQ ID NO：1)、1μl的10mM nk603转基因-特异性寡聚核苷酸(5’TGACGTATCAAAGTACCGA CAAAAA CATCC3’，SEQ ID NO：2)、1μl 10mM脱氧核糖核苷酸2.5μl二甲基亚砜、5μl含有MgCl2的10x PCR缓冲液、0.5μl(2.5个单位)AmpliTaq热稳定型DNA聚合酶(PE Applied Biosystems，FosterCity，CA)，最后用水稀释到50μl。反应是在一个温度循环仪中在计算的温度控制下进行的，温度循环条件如下：95℃下9分钟进行1个循环；94℃下2秒钟、70℃下3分钟进行7个循环；94℃下2秒钟、65℃下3分钟进行36个循环；65℃下4分钟进行1个循环。将1μl的各个初级反应液用水稀释50倍，然后在二级反应条件下扩增(1μl各个稀释的初级反应液、1μl的10μM Genome WalkerTM嵌套式衔接子引物AP2(5’ACTATAGGG CACGCGTGGT3’，SEQ ID NO：3)(由制造商提供)、1μl的10μM nk603转基因-特异性嵌套式寡聚核苷酸(5’CTTTGTTTTATTTTGGAC TA TCCCGACTC3’，SEQ ID NO：4)、1μl的10mM脱氧核糖核苷酸、2.5μl二甲亚砜、5μl含有MgCl2的10XPCR缓冲液、0.5μl(2.5个单位)AmpliTaq热稳定型DNA聚合酶(PEApplied Biosystems，Foster City，CA)，最后用水稀释到50μl。)使用如下的循环条件进行扩增：95℃下9分钟进行1个循环；94℃下2秒钟、70℃下3分钟进行5个循环；94℃下2秒钟、65℃下3分钟进行24个循环；65℃下4分钟进行1个循环。
将代表跨越了nk603转基因插入和邻近的侧翼玉米DNA的结合部位的5’区域的PCR产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化，接着用QIAquickGel Extration Kit(catalog#28704，Qiagen Inc.，Valencia，CA)从琼脂糖基质中分离出纯化的PCR产物，接着定向克隆到pGEM-T Easy载体(catalog#A1360，Promega，Madison，WI)中。克隆后的PCR产物的鉴定及其与pMON25496的Mlu I片段的关系通过DNA序列分析(ABIPrismTM377，PE Biosystems，Foster City，CA和DNASTAR序列分析软件，DNASTAR Inc.，Madison，WI)进行确定。
类似地，nk603的3’侧翼玉米DNA序列使用退火成T-AGRTU.nos转录终止子的嵌套式基因特异性引物，例如，SEQ ID NO：5(5’AGATTGAATCC TG TTGCCGGTCTTGC3’)和SEQ ID NO：6(5’CAGG TGT CATCT A TG TTA CTAGATCGGG3’)进行扩增和克隆。在nk603转基因/基因组插入序列中有两个T-AGRTU.nos转录终止子，一个在构建体的内部，一个在与玉米基因组DNA相邻的构建体的3’末端。对通过上述反应产生的PCR产物测序，跨越了转基因和侧翼序列接合部位的DNA序列，通过与前述已知的pMON25496构建体的基因元件序列相比较就可以与内部T-AGRT U.nos的产物相区别。
nk603转基因插入位点两侧的玉米DNA侧翼序列通过对由GenomeWalkerTM得到的扩增产物进行测序以及和已知转基因序列相比较来确定。在转基因插入序列的5’末端，位于插入接合部位附近的一个长度为498bp的片段的序列已经被确定(SEQ ID NO：7)。该序列由304个碱基对(bp)的玉米侧翼基因组DNA序列(SEQ ID NO：7的核苷酸1-304)、45个bp的pMON25496构建体DNA序列(SEQ ID NO：7的核苷酸305-349)和149个bp的P-Os.Act1 5’末端DNA序列(SEQ ID NO：7的核苷酸305-498)组成。
在3’插入接合部位附近的一个1183bp片段的DNA序列已经被确定(SEQ ID NO：8)，该序列以164bp的T-AGRTU.nos转录终止子序列(SEQ ID NO：8的核苷酸1-164)作为起始，然后是217个bp的pMON25496构建体DNA序列(SEQ ID NO：8的核苷酸165-381)和305个bp的玉米质体基因，rps11和rpoA(每一个基因的部分片段，对应于Genebank目录编号为X07810的63-363位碱基，对应于SEQ ID NO：8的碱基382-686)，余下的DNA序列由整合位点侧翼的玉米基因组DNA序列(与SEQ ID NO：8的碱基687-1193对应)组成。
接合DNA分子，SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12在nk603中是新的DNA分子，他们可以用于检测玉米植株nk603及其后代。SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中的接合分子代表了转基因DNA片段和玉米基因组DNA插入位点两侧的约9个核苷。SEQ ID NO：9位于SEQ ID NO：7的295-314核苷酸位置上。接合序列SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11分别位于SEQ ID NO：8的373-390和678-695核苷位置上，代表了构建体DNA序列和玉米质体DNA序列的接合DNA分子(SEQ ID NO：10)以及构建体序列和玉米基因组DNA序列的接合DNA分子(SEQ ID NO：11)。SEQ ID NO：12位于SEQ ID NO：8的156-173核苷位置上，代表了nk603中的一个新的DNA分子，因为该分子是T-AGRTU.nos终止子序列和一个水稻肌动蛋白启动子DNA序列的反向片段的融合。
实施例4
DNA个体引物对被用来产生检测nk603的扩增子。这些个体引物对包括但不局限于5’扩增子DNA分子的SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14以及3’扩增子DNA分子的SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。除了这些引物对，任何一种来源于SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的引物对在DNA扩增反应中产生可用于检测nk603的DNA扩增子，这是本发明的一个方面。这些分析所用的对5’转基因插入/基因组结合区域的扩增条件在表2和表3中进行了说明。相同的方法也应用于3’扩增子DNA分子的扩增过程，该过程使用的引物DNA分子是SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16，不过对这些用DNA分子或其互补序列以产生用于鉴定nk603的扩增子DNA分子的方法的任何改动都属于本领域的一般性技术。另外，用于扩增玉米内源基因的一个对照引物对(SEQ ID NO：17和18)被包括在内，作为反应条件的一个内在标准。对nk603植物组织DNA抽提样品的分析应该包括一个nk603的阳性组织DNA抽提物对照，一个来源于非nk603玉米植物的阴性DNA抽提物对照和一个不含有模板玉米DNA抽提物的阴性对照。具有足够长度的附加的DNA引物分子可以由DNA扩增领域内的技术人员从SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中进行选择，而且扩增子制备的优化条件可以和表2和表3所示的方法不同，但都会产生可用于检测nk603的扩增子。这些带有对表2和3的方法的改变的DNA引物序列的使用在本发明的范围内。用于检测nk603的扩增子，其中至少有一个来源于SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的具有足够长度的DNA引物分子，这是本发明的一个方面。用于检测nk603的扩增子，其中至少有一个来源于pMON25496的任一基因元件的具有足够长度的DNA引物分子，这是本发明的一个方面。nk603扩增子的检验可以通过使用如表3所示的Stratagene Robocycler，MJ Engine，Perkin-Elmer 9700，或Eppendorf Mastercycler Gradient Thermocycler等仪器进行，也可以用本领域的技术人员所知的其他方法和设备进行。
表2：用于确定nk603 5’转基因插入/基因组结合区域的PCR程序和反应混合物
   步骤 试剂 数量 注释
    1 不含核酸酶的水     加入至终体积20μl
2 10X反应缓冲液(加入MgCl2) 2.0μl    1X最终浓度的缓冲液，1.5mM最终浓度的MgCl2
3 10mM浓度的dATP、dCTP、dGTP和dTTP溶液 0.4μl    200μM最终浓度的各种dNTP
4 个体引物(SEQ IDNO：13)(在1X TE缓冲液或不含核酸酶的水中重悬至浓度为10μM) 0.4μl 0.2μM最终浓度
5 个体引物(SEQ IDNO：14)(在1X TE缓冲液或不含核酸酶的水中重悬至浓度为10μM) 0.4μl 0.2μM最终浓度
6 对照引物(SEQ IDNO：17)(在1X TE缓冲液或不含核酸酶的水中重悬至浓度为10μM) 0.2μl 0.1μM最终浓度
7   对照引物(SEQ IDNO：18)(在1X TE缓冲液或不含核酸酶的水中重悬至浓度为10μM) 0.2μl 0.1μM最终浓度
8   不含DNA酶的RNA酶(500ng/μl) 0.1μl   50ng/反应
9   REDTaq DNA聚合酶(1单位/μl)    1.0μl(建议在进行下个步骤前更换吸头) 1单位/反应
10   经过抽提的DNA(模板)：1.待测样品*个体叶子*混合的叶子(最多50片叶子/库)2.阴性对照3.阴性对照4.阳性对照 1.10-200ng基因组DNA2.200ng基因组NDA50ng玉米基因组DNA(非nk603)非模板DNA50ng nk603基因组DNA
表3：不同的温度循环仪的PCR参数建议值
轻轻混合，如果需要的话(温度循环仪无顶部加热)，在各反应液上方加入1-2滴矿物油。然后在Stratagene Robocycler，MJ Engine，Perkin-Elmer 9700，或Eppendorf Mastercycler Gradient Thermocycler等仪器中按照下表中的循环参数进行PCR。
注：MJ Engine或Eppendorf Mastercycler Gradient Thermocycler应该运行在计算的模式下。Perkin-Elmer 9700 Thermocycler运行时rampspeed要设为最大。
  循环数量 设置：Stratagene Robocycler
  1 94℃3分钟
  38 94℃1分钟60℃1分钟72℃1分钟30秒
  1 72℃10分钟
  循环数量 设置：MJ Engine或Perkin-Elmer 9700
    1 94℃3分钟
    38 94℃10秒钟60℃30秒钟72℃1分钟
    1 72℃10分钟
  循环数量 设置：Eppendorf Mastercycler Gradient
    1 94℃3分钟
    38 94℃15秒钟60℃15秒钟72℃1分钟
    1 72℃10分钟
孟山都公司上述公开的PV-ZMGT32(nk603)的玉米种子按照布达佩斯条约于2001年9月18日在美国典型培养物保存中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110进行了保藏。其ATCC目录编号为PTA-2478，分类命名CornZeaMays：PV-ZMGT32。该保藏物在保存库中维持时间在30年，或最后一次取样后5年，或专利的有效期这三者中选取最长的一个，在这段时间内如有必要保藏物将进行更新。
在对本发明的原则进行了说明和描述后，本领域的技术人员应该可以清楚的看到在不违背上述原则的基础上，可以对本发明在具体的安排和细节上进行改动。我们要求在附录的权利要求书的范围和精神以内的所有的改动。
在本规范说明书中所引用的所有的出版物和发表的专利文献在这里引入作为参考，其性质和对每一篇单独的出版物和专利申请都特别指出作为参考是一致的。
序列表
<110>Monsanto Co
Behr，Car1
Hironaka，Catherine
Heck，Gregory
You，Jinsong
<120>玉米个体PV-ZMGT32(nk 603)和用于对其检测的组合物和方法
<130>38-21(52258) B
<150>60/213，567
<151>2000-06-22
<150>60/241，215
<151>2000-10-13
<150>60/240，014
<151>2000-10-13
<160>16
<170>版本3.0
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(22)
<223>全合成的
<400>1
gtatatcgac tcactatagg gc    22
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(30)
<223>全合成的
<400>2
tgacgtatca aagtaccgac aaaaacatcc    30
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(19)
<223>全合成的
<400>3
actatagggc acgcgtggt    19
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(29)
<223>全合成的
<400>4
ctttgtttta ttttggacta tcccgactc    29
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(26)
<223>全合成的
<400>5
agattgaatc ctgttgccgg tcttgc    26
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(28)
<223>全合成的
<400>6
gcggtgtcat ctatgttact agatcggg    28
<210>7
<211>498
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(498)
<223>1-304 Zea玉米基因组DNA
    305-349构建载体DNA
    350-498水稻肌动蛋白1启动子DNA
<400>7
aatcgatcca aaatcgcgac tgaaatggtg gaagaaagag agaacagaga gcctcacgtt     60
tccagggtga agtatcagag gatttaccgc ccatgccttt tatggagaca agaaggggag    120
gaggtaaaca gatcagcatc agcgctcgaa agtttcgtca aaggatgcgg aactgtttcc    180
agccgccgtc gccattcggc cagactcctc ctctctcggc atgagccgat cttttctctg    240
gcatttccaa ccctagagac gtgcgtccct ggtgggctgc tcggccagca agccttgtag    300
cggcccacgc gtggtaccaa gcttgatatc cctagggcgg ccgcgttaac aagcttactc    360
gaggtcattc atatgcttga gaagagagtc gggatagtcc aaaataaaac aaaggtaaga    420
ttaccggtca aaagtgaaaa catcagttaa aaggtgtata aagtaaaata tcggtaataa    480
aaggtggccc aaagtgaa                                                  498
<210>8
<211>1183
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(1183)
<223>1-164根癌土壤杆菌nos 3′终止子
     165-381构建载体DNA
     382-683 Zea玉米质体基因，rpsll和rpoA
     687-1183 Zea玉米基因组DNA
<400>8
gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc     60
gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat    120
gttactagat cggggatatc cccggggaat tcggtaccaa gcttttataa tagtagaaaa     180
gagtaaattt cactttgggc caccttttat taccgatatt ttactttata ccacctttta     240
actgatgttt tcacttttga ccaggtaatc ttacctttgt tttattttgg actatcccga     300
ctctcttctc aagcatatga atgacctcga gtaagcttgt taacgcggcc gccctaggga     360
tatcaagctt ggtaccacgc gacacacttc cactctagtg tttgagtgga tcctgttatc     420
tcttctcgaa ccataacaga ctagtattat ttgatcattg aatcgtttat ttctcttgaa     480
agcggtttca ttttttttta cagacgtctt tttttaggag gtcgacatcc attatgcggc     540
ataggtgtta catcgcgtat acaacttaac cgtacaccac ttttagcaat ggctcgtaat     600
gcggcatctc ttccgctacc agcacctttt accataactt ctgctcgttg caaacccact     660
gtacgaatag catctactgc tgttctgctg actttatttt ttttaataaa gtgaaaaacc     720
ataaaatgga caacaacacc ctgcccttca ctaccggtcg gagcgacgcc gaagatgggg     780
ttcaacacgg tcgcgacacg gatgcaacgg accctccaag ccaatactcg aggccggacc     840
gacgacgtag gcaggggtgg ccataacgac ggtggcggca tccaacttgt tctttccctt     900
tctctgtctt caacttgcgc cggcagtctg ctagacccag gggatgctgt gtggaggaga     960
ggtcgcgggg cccgattttt atagcctggg cgaggacgag cttggccgaa ccgatccaga    1020
gctctgcgca aatcacgaag aaccagtggg gccgctcgcg cctagcccac cgccaggagc    1080
ggggcttgtt gcgagccgta gcgtcgggaa ggggacgacc cgctaggggg gcccatgctc    1140
cagcgcccag agagaaaaaa agaaaggaag gcgcgagatg atg                      1183
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(19)
<223>Zea玉米基因组和载体DNA
<400>9
tgtagcggcc cacgcgtgg                                   19
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(18)
<223>Zea玉米基因组和载体DNA
<400>10
taccacgcga cacacttc    18
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(18)
<223>Zea玉米基因组和载体DNA
<400>11
tgctgttctg ctgacttt    18
<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(18)
<223>根癌土壤杆菌nos 3′终止了和水稻肌动蛋白启动子DNA
<400>12
accaagcttt tataatag    18
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(22)
<223>全合成的
<400>13
aatcgatcca aaatcgcgac tg    22
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(22)
<223>全合成的
<400>14
ttcactttgg gccacctttt at    22
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(22)
<223>全合成的
<400>15
gacgttattt atgagatggg tt    22
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(22)
<223>全合成的
<400>16
catcatctcg cgccttcctt tc    22

Claims (4)

1.DNA分子，该分子选自SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，其中所述的DNA分子存在于玉米植株，种子，组织，细胞或细胞核中。
2.玉米细胞，其包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
3.玉米细胞核，其包含选自SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的DNA分子。
4.一种生产耐受施用的草甘膦除草剂的玉米植株的方法，该方法包括：
(a)使对草甘膦耐受的玉米植株与另一玉米植株杂交，所述的草甘膦耐受的玉米植株包含SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；
(b)从(a)中所述的杂交获得至少一株子代植株；
(c)通过喷洒草甘膦对子代进行筛选，其中所述的子代是草甘膦耐受的，并包含SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12。
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