ES2201484T3

ES2201484T3 - Utilizacion de compuestos de quinazolina para el tratamiento de la enfermedad de la poliquistosis renal.

Info

Publication number: ES2201484T3
Application number: ES98918802T
Authority: ES
Inventors: Philip Frost
Original assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Priority date: 1997-05-06
Filing date: 1998-04-28
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2018-04-28
Also published as: EP0980244A1; JP4327259B2; AR012660A1; CN1195521C; AU7165698A; EP0980244B1; CA2288705A1; DE69815340T2; DK0980244T3; CA2288705C; CN1255062A; PT980244E; WO1998050038A1; JP2001523267A; ATE241986T1; HK1025262A1; DE69815340D1; ZA983731B

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para tratar o inhibir la enfermedad poliquistos de los riñones en un mamífero que lo requiere que consiste en administrar a dicho mamífero un compuesto que tiene la **fórmula** donde X es fenilo que está opcionalmente sustituido, R y R1 cada uno, independientemente, es hidrógeno, halógeno, alquilo, alcoxi, hidroxi o trifluormetil; R2 es hidrógeno, alquilo, alcoxi, hidroxi, trifluormetil; Y es un radical elegido en el grupo que consiste en (a). (b), (c), (d), (e), (f) y (g); R3 es independientemente hidrógeno, alquilo, carboxi, carboalcoxi, fenilo o carboalquilo; n = 2-4; o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, siempre que cada uno de R3 de Y pueda ser igual o diferente.

Description

Utilización de compuestos de quinazolina para el tratamiento de la enfermedad de la poliquistosis renal.

La presente invención se refiere a la utilización de ciertos compuestos de quinazolina para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de la enfermedad de la poliquistosis renal.

La poliquistosis renal aparece en dos formas; autosómica recesiva (ARPKD) y autosómica dominante (ADPKD). Las dos formas de la enfermedad tienen distinta base genética, y se han identificado dos genes que causan la ADPKD, mientras que no se han identificado los causantes de la ARPKD. Sin embargo, las características de la enfermedad son muy similares. Ambas se originan debido a la proliferación de las células epiteliales tubulares, que, en última instancia, conduce a la destrucción de la estructura tubular y la formación de quistes, lo que se traduce en insuficiencia renal crónica. Se está aclarando la razón de la formación de quistes, dado que hay pruebas fiables de que el nivel de factores de crecimiento EGF/TGF\alpha (estos dos factores de crecimiento comparten el mismo receptor celular) está considerablemente elevado en el líquido quístico en estas lesiones. Además, se ha señalado que tanto en la ARPKD como en la ADPKD el receptor de EGF está ubicado en posición incorrecta, ya que está presente en la superficie luminal, cerca del líquido quístico, en vez de en la región basolateral, que es lo normal en las células epiteliales tubulares. También se ha demostrado que el TGF\alpha y el EGF provocan quistes en tejidos renales in vitro. Además, la sobreexpresión del TGF\alpha en ratones transgénicos genera quistes in vivo, es decir, los animales que presentan sobreexpresión constitutiva del TGF\alpha desarrollarán quistes renales. Es más, el líquido del quiste renal contiene péptidos similares a EGR y EGF en concentraciones mitogénicas y, finalmente, el tejido del quiste renal presenta una expresión del TGF\alpha aumentada.

El documento EP-A-0787722 describe compuestos de fórmula 1, como se definen más adelante en la presente memoria, que son útiles como agentes antineoplásicos.

La presente invención proporciona un medicamento para el tratamiento o la inhibición de la poliquistosis renal en un mamífero que lo necesite, que comprende administrar a dicho mamífero un compuesto de Fórmula 1:

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en la que:

X es fenilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados a partir del grupo formado por halógeno, alquilo de 1-6 átomos de carbono, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, hidroxi, trifluorometilo, ciano, nitro, carboxi, carboalcoxi de 2-7 átomos de carbono, carboalquilo de 2-7 átomos de carbono, amino, y alcanoílamino de 1-6 átomos de carbono;

R y R_{1} son, cada uno independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo de 1-6 átomos de carbono, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, hidroxi o trifluorometilo;

R_{2} es hidrógeno, alquilo de 1-6 átomos de carbono, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, hidroxi, trifluorometilo;

Y es un radical seleccionado a partir del grupo formado por

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R_{3} es, independientemente, hidrógeno, alquilo de 1-6 átomos de carbono, carboxi, carboalcoxi de 1-6 átomos de carbono, fenilo o carboalquilo de 2-7 átomos de carbono;

n= 2-4;

o una sal de los mismos, aceptable desde el punto de vista farmacéutico, con la salvedad de que cada R_{3} de Y puede ser igual o distinto.

Las sales aceptables desde el punto de vista farmacéutico son aquellas derivadas de ácidos orgánicos e inorgánicos, tales como acético, láctico, cítrico, tartárico, succínico, maleico, malónico, glucónico, clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, metanosulfónico y ácidos conocidos similares aceptables.

La porción de alquilo de los sustituyentes alquilo, alcoxi, carboalcoxi, carboalquilo, y alcanoílamino incluye cadenas carbonadas tanto lineales como ramificadas. Carboxi se define como un radical -CO_{2}H. Carboalcoxi de 2-7 átomos de carbono se define como un radical -CO_{2}R'', en el que R'' es un radical alquilo de 1-6 átomos de carbono. Carboalquilo se define como un radical -COR'', en el que R'' es un radical alquilo de 1-6 átomos de carbono. Cuando X está sustituido, es preferible que esté mono-, di- o trisustituido, siendo el más preferido el monosustituido. Cuando un compuesto de la presente invención contiene un centro asimétrico, la presente invención cubre los enantiómeros R y S individuales, así como el racemato de dicho compuesto.

De los compuestos de la presente invención, los miembros preferidos incluyen aquellos en los que R, R_{1} y R_{2} son hidrógeno; y aquellos en los que R, R_{1} y R_{2} son hidrógeno y X no está sustituido o está monosustituido con halógeno o alquilo de 1-6 átomos de carbono.

La preparación de los compuestos de la presente invención abarcados por la Fórmula 9 se describe más adelante en el Diagrama de flujo A, en el que R, R_{1}, R_{2}, R_{3}, X y n se han definido y R_{4} es alquilo de 1-6 átomos de carbono (preferiblemente isobutilo). Y' es un radical seleccionado a partir del grupo formado por:

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en el que cada R'_{3} es, independientemente, alquilo de 1-6 átomos de carbono, carboxi, carboalcoxi de 1-6 átomos de carbono, fenilo o carboalquilo de 2-7 átomos de carbono. Según la secuencia de reacción presentada en el diagrama de flujo A, se calienta un 5-nitroantranilonitrilo de Fórmula 2 a aproximadamente 100ºC con o sin disolvente que contiene un exceso de dimetilacetal de dimetilformamida, para proporcionar una amidina de Fórmula 3. El calentamiento de una solución de la amidina 3 y la anilina 4 en ácido acético durante 1 a 5 horas da lugar a las 6-nitro-4-anilinoquinazolinas de Fórmula 5. La reducción del grupo nitro de 5 utilizando un agente reductor, tal como hierro, en una mezcla de ácido acético-alcohol a temperatura elevada da lugar a las 6-amino-4-anilinoquinazolinas de Fórmula 6. La acilación de 6, bien con un cloruro del ácido de Fórmula 7 o con un anhídrido mixto de Fórmula 8 (preparado a partir del ácido carboxílico correspondiente), en un disolvente inerte tal como tetrahidrofurano (THF) en presencia de una base orgánica tal como piridina o trietilamina, da lugar a los compuestos de la presente invención representados por la Fórmula 9. En aquellos casos en los que 7 u 8 tienen un carbono asimétrico, pueden utilizarse como racemato o como los enantiómeros R o S individuales, en cuyo caso los compuestos de la presente invención estarán en forma racémica o en las formas R y S ópticamente activas, respectivamente. Los 5-nitroantranilonitrilos de Fórmula 2 necesarios para preparar los compuestos de la presente invención son conocidos en la técnica o pueden prepararse por procedimientos conocidos en la técnica, como se detalla en las siguientes referencias: Baudet, Recl.Trav.Chim.Pays-Bas, 43, 710 (1924); Hartmans, Recl. Trav. Chim. Pays-Bas, 65, 468, 469 (1946); Taylor et al., J. Amer. Chem. Soc., 82, 6058, 6063 (1960); Taylor et al., J. Amer. Chem. Soc., 82, 3152, 3154 (1960); Deshpande; Seshadri, Indian J. Chem., 11, 538 (1973); Katritzky, Alan R.; Laurenzo, Kathleen S., J. Org. Chem., 51 (1986); Niclas, Hans-Joachim; Bohle, Matthias; Rick, Jens-Detlev; Zeuner, Frank; Zoelch, Lothar, Z. Chem., 25(4), 137-138 (1985).

Diagrama de flujo A

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La preparación de los compuestos de la presente invención abarcados por la Fórmula 12 se describe más adelante en el Diagrama de flujo B, en el que R, R_{1}, R_{2}, X y n se han descrito anteriormente. Cada R_{5} es, independientemente, hidrógeno, fenilo o alquilo de 1-6 átomos de carbono. Según la reacción presentada en el Diagrama de flujo B, las 6-amino-4-anilinoquinazolinas de Fórmula 10 (preparadas como en el Diagrama de flujo A) se acilan con un anhídrido cíclico de Fórmula 11 en un disolvente inerte tal como tetrahidrofurano en presencia de un catalizador básico, tal como piridina o trietilamina.

Diagrama de flujo B

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Se evaluaron compuestos representativos de la presente invención en diversos procedimientos estándar de análisis farmacológico que demostraron que los compuestos de la presente invención presentan una significativa actividad como inhibidores de las tirosina-quinasas de proteínas, y son agentes antiproliferativos. Sobre la base de la actividad mostrada en los procedimientos estándar de análisis farmacológico, los compuestos de la presente invención son, por consiguiente, útiles como agentes antineoplásicos. Los procedimientos de análisis utilizados y los resultados obtenidos se muestran más adelante.

La preparación de los compuestos de la presente invención abarcados por la Fórmula 19 se describe más adelante en el Diagrama de flujo C, en el que Y', R_{4} y X se han descrito anteriormente. Según las reacciones presentadas en el Diagrama de flujo C, la 4-cloro-6-nitroquinazolina, 13, (Morley, JS. y Simpson, J. Chem.. Soc., 360 (1948)) se reduce para dar 6-amino-4-cloroquinazolina, 14, utilizando un agente reductor tal como hidrosulfito de sodio en un sistema de dos fases que consta de tetrahidrofurano y agua en presencia de una pequeña cantidad de catalizador de transferencia de fase. La acilación de 14, bien con un cloruro de ácido de Fórmula 15 o con un anhídrido mixto de Fórmula 16 (que se prepara a partir del correspondiente ácido carboxílico), en un disolvente inerte tal como tetrahidrofurano (THF) en presencia de una base orgánica tal como piridina o N-metilmorfolina da lugar a los compuestos de Fórmula 17. En aquellos casos en que 15 ó 16 tienen un carbono asimétrico, pueden utilizarse como racemato o como los enantiómeros R o S individuales, en cuyo caso los compuestos de la presente invención estarán en forma racémica o en las formas R y S ópticamente activas, respectivamente. El calentamiento de un compuesto de Fórmula 17 con una anilina de Fórmula 18, en un disolvente inerte tal como isopropanol, da lugar a los compuestos de la presente invención representados por la Fórmula 19.

Diagrama de flujo C

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La preparación de los compuestos de la presente invención abarcados por la Fórmula 26 se describe más adelante en el Diagrama de flujo D, en el que Y', R_{4} y X se han descrito anteriormente. Según las reacciones presentadas en el Diagrama de flujo D, el grupo nitro de 20 (preparado como en el Diagrama de flujo A) se reduce para formar el compuesto amino correspondiente 21, utilizando un catalizador de paladio y una fuente de hidrógeno, que puede ser hidrógeno por sí mismo o ciclohexeno. La acilación de 21, bien con un cloruro de ácido de Fórmula 22 o con un anhídrido mixto de Fórmula 23 (que se prepara a partir del correspondiente ácido carboxílico), en un disolvente inerte tal como tetrahidrofurano (THF) en presencia de una base orgánica tal como piridina o N-metilmorfolina da lugar a los compuestos de Fórmula 24. En aquellos casos en que 22 ó 23 tienen un carbono asimétrico, pueden utilizarse como racemato o como los enantiómeros R o S individuales, en cuyo caso los compuestos de la presente invención estarán en forma racémica o en las formas R y S ópticamente activas, respectivamente. El calentamiento de un compuesto de Fórmula 24 con una anilina de Fórmula 25 en un disolvente tal como ácido acético da lugar a los compuestos de la presente invención representados por la Fórmula 26.

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Diagrama de flujo D

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La capacidad de los compuestos de la presente invención para tratar o inhibir la poliquistosis renal se demostró en procedimientos estándar de análisis farmacológico in vitro e in vivo, como se describe más adelante. El compuesto del Ejemplo 9 se evaluó en estos procedimientos, que simulan la poliquistosis renal en seres humanos, como un compuesto representativo de la presente invención.

Evaluación in vitro: Cultivo de órganos metanéfricos

Este procedimiento estándar de análisis farmacológico in vitro medía la capacidad del compuesto de prueba de inhibir la unión al receptor de EGF (análisis de inmunotransferencia de RGF-R inmunoprecipitado activado) y de inhibir la formación de quistes tubulares (índice quístico) en cultivo de células metanéfricas de ratón fetal. El procedimiento utilizando cultivo, exento de suero, de metanefros de ratón fetal ha sido previamente descrito en detalle [Avner, E.D., Pediatr. Nephrol. 2: 92 (1989); Avner, E.D., Kidney Int. 36: 960 (1989); Pediatr. nephrol. 4: 372 (1990); Sweeney, W.E., J. Tiss. Cult. Meth. 13: 163 (1991); Pugh, J.P., Kidney Int. 47: 774 (1995)]. Brevemente, metanefros de embriones de ratones albinos Swiss Webster (E13 \pm 0,4 días de gestación) o riñones enteros del día E-15 hasta P-14 se cortaron en tiras de 150 \mum, se cultivaron en medio químicamente definido durante 120 horas en un aparato de cultivo de órganos de tipo Trowell a 36 \pm 0,5ºC y 95% de humedad en un ambiente de aire mezclado - 5% de CO_{2}. El medio basal consistía en medio de Dublecco modificado por Eagle y medio F-12 de Ham, enriquecido con insulina (8,3 x 10^{-7} M), prostaglandina E1 (7,1 x 10^{-8} M), selenio 6,8 x 10^{-9} M)), transferrina (6,2 x 10^{-8} M) y triyodotironina (2 x 10^{-9} M).

El medio enriquecido constaba de medio basal al que se había añadido bien EGF (15 ng/ml) o EGF (15 ng/ml) más el compuesto del Ejemplo 9 a concentraciones de 0,1 nM y 1 nM (solubilizado en DMSO). Los explantes del día 14, quísticos (BPK) y testigos (Balb/C), se cultivaron durante 120 horas en las siguiente condiciones:

1.: Medio basal al que se añadió DMSO como testigo del disolvente del fármaco

2.: EGF (15 ng/ml)

3.: EGF (15 ng/ml) durante 120 horas y Ejemplo 9 (0,1 nM) durante 2 horas al día

4.: EGF (15 ng/ml) y Ejemplo 9 (0,1 nM) durante 120 horas

5.: EGF (15 ng/ml) y Ejemplo 9 (1,0 nM) durante 120 horas

En cada cultivo, el medio de cultivo de tejidos se sustituyó con medio recién preparado, cada 24 horas.

Los cultivos de explantes se recogieron a las 120 h, se homogeneizaron y las células se rompieron haciéndolas pasar a través de una aguja de calibre 21. [Donaldson, R.W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8477 (1992); Honegger, A.M., J. Cell Biol. 110: 1541 (1990]. El residuo celular se sedimentó y el sobrenadante se transfirió a un tubo de microcentrifugadora al que se añadieron 4,0 \mug de anti-EGFR por \mug de proteína total. La mezcla se incubó durante una hora y se añadieron 50 \mul de proteína A/G PLUS-Agarosa y esta mezcla se incubó a 4ºC durante otras 12 horas. Los tubos se centrifugaron durante 20 minutos a 4ºC para recoger los inmunoprecipitados. El sobrenadante se desechó y el sedimento se lavó dos veces con 1 ml de tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasas. Tras un lavado final, el sedimento se resuspendió en 25 \mul de RIPA, al que se añadió tampón de muestra de Lanelli 5x. La mezcla se hirvió durante 5 min y después se analizó por inmunotransferencia con anticuerpos anti-fosfotirosina. Los resultados de este procedimiento de análisis demostraron que la fosforilación del receptor del EGF tenía lugar en presencia del EGF, y que se inhibía por el compuesto del Ejemplo 9, en los tres protocolos, mostrando el que contenía 1,0 nM la máxima inhibición. Estos resultados apuntan a una inhibición de la función del receptor

El grado de formación de quistes de los túbulos proximales se cuantificó utilizando un índice quístico. El índice proviene de métodos morfométricos lumínicos básicos [Loud, A.V., Lab Invest. 50: 250 (1984)] y se ha normalizado como herramienta para la cuantificación de la formación de quistes en sistemas de cultivo de órganos [Pugh, J.P., Kidney Int. 47: 774 (1995); Avner, E.D., Kidney Int. 28: 447 (1985); Avner E.D., J. Lab. Clin. Med. 109: 441(1987)]. Tras la preparación histológica habitual, se valoraron 8 a 10 cortes seriados de 3 \muM de explantes intactos, con un micrómetro ocular, para la formación de quistes en Lotus tetragonolobus - segmentos tubulares positivos, y Dolichos biflorus - segmentos tubulares positivos en una escala de 0 (sin quistes observables) a 5 (quistes múltiples mayores de 0,20 mm). Para cada grupo de tratamiento se determinó un índice quístico en un total de 6 a 8 explantes tras 120 horas de incubación según la siguiente escala.

Índice quístico

0 - ningún quiste observado
1 - quistes únicos o múltiples	0,05 mm
2 - quistes múltiples	> 0,05 mm; = 0,10 mm
3 - quistes múltiples	> 0,10 mm; = 0,15 mm
4 - quistes múltiples	> 0,15 mm; = 0,20 mm
5 - quistes múltiples	> 0,20 mm

La siguiente tabla presenta un resumen de los resultados obtenidos.

Grupo de tratamiento	Índice quístico
Medio basal	3,875 \pm 0,25
EGF (15 ng/ml)	3,5 \pm 0,29
EGF (15 ng/ml; 120 h)+ Ejemplo 9 (0,1 nM; 2 horas al día)	3,375 \pm 0,48
EGF (15 ng/ml; 120 h)+ Ejemplo 9 (0,1 nM; 120 horas)	1,5 \pm 0,5
EGF (15 ng/ml; 120 h) + Ejemplo 9 (1,0 nM; 120 horas al día)	0,75 \pm 0,95

Estos resultados indican que el compuesto del Ejemplo 9 redujo las lesiones quísticas en los túbulos colectores de modo dependiente de la dosis, demostrando de este modo la inhibición de la formación de quistes asociada a la poliquistosis renal.

Tras 120 horas de incubación, se evaluaron histológicamente los explantes intactos de los grupos testigo y de tratamiento. Los tejidos se fijaron en paraformaldehído al 4,0% en tampón fosfato (pH 7,4) durante 30 minutos a 40ºC. A continuación se lavaron los explantes, se deshidrataron con acetona de concentración creciente, y se incluyeron en medio de inclusión plástico. Se hicieron cortes de 3 \muM en un ultramicrotomo, se montaron en portaobjetos de vidrio y se tiñeron con hematoxilina o con lectinas específicas de segmentos. Los glomérulos se identificaron histológicamente como se ha descrito previamente [Sweeney W.E., J. Tiss. Cult. Meth. 13: 163 (1991)]. Los túbulos proximales se identificaron por tinción con la lectina de Lotus tetragonolobus (LTA) y los túbulos colectores se identificaron por tinción con la lectina de Dolichos biflorus (DBA) [Pugh J.P., Kidney. Int. 47: 774 (1995); Nauta, J., Pediatr. Nephrol. 7: 163 (1993)]. Estos estudios demostraron que la presencia del EGF (15 ng/ml) en el medio mantiene la estructura quística de los metanefros. Estos quistes se tiñen con DBA - lo que indica que provienen de los túbulos colectores. Metanefros idénticos que se cultivaron en presencia de 15 ng/ml de EGF más 1,0 nM del compuesto del Ejemplo 9 muestran una regresión dramática de los quistes de los túbulos colectores, con poca o ninguna toxicidad observada en el parénquima circundante.

Evaluación in vivo

Se dividieron ratones en cuatro grupos; el primer grupo estaba compuesto de animales BPK (modelo murino de PKD autosómica recesiva) tratados con 0,25 mg del compuesto del Ejemplo 9 en los días 7, 14 y 21 (por vía IP); el segundo grupo estaba compuesto de animales BPK testigos, no tratados; el tercer grupo estaba compuesto de testigos normales tratados (la misma pauta de dosificación anterior); y el cuarto grupo estaba compuesto de testigos normales no tratados. En la camada de los animales BPK no tratados había 2 crías claramente quísticas el día 17. Se extrajo el tejido de ambos grupos el día 24. Los riñones e hígados extraídos de ambas camadas se fijaron durante 30 min en paraformaldehído al 4%, recién preparado, se enjuagaron y se deshidrataron con acetona de concentración creciente. Los tejidos se dejaron en un lecho de análisis inmunológico durante 40 horas y después se sometieron a inclusión.

El análisis macroscópico de los tejidos recién extraídos del grupo BPK tratado mostró 3 de 8 animales con riñones quísticos, que sólo se pusieron de manifiesto al disecar los animales. El tamaño de los riñones fue mayor que el de los riñones de los otros animales tratados, pero resultaron mucho más pequeños que los riñones quísticos no tratados (aproximadamente el 40% del tamaño de los riñones quísticos no tratados). Los riñones testigo tratados resultaron algo más pequeños que los riñones testigo no tratados.

Se evaluó el volumen total de los riñones en los cuatro grupos. Los riñones del grupo BPK no tratado presentaron un tamaño de aproximadamente 6 veces el de los riñones del grupo testigo no tratado. Los riñones del grupo BPK tratado presentaron un tamaño de aproximadamente 2 veces el de los riñones del grupo BPK no tratado, y resultaron 3 veces más pequeños que los riñones del grupo BPK no tratado. Los riñones del grupo testigo tratado presentaron una ligera disminución en su volumen, en comparación con los riñones del grupo testigo no tratado, sin cambios morfológicos aparentes. No se observó nefrotoxicidad en los ratones normales tratados con el compuesto del Ejemplo 9.

La evaluación histológica de los riñones testigo (no quísticos) mostró un aspecto morfológico normal tanto en los grupos tratados (con el compuesto del Ejemplo 9) como no tratados. Las tinciones tricrómicas (para fibrosis) de estos riñones no quísticos no mostraron cambios fibróticos (acumulación de colágeno) en los riñones tratados o sin tratar.

Los cortes histológicos de riñones quísticos no tratados del día 24 mostraron una intensa enfermedad quística, con pequeños islotes de estructuras renales normales comprimidas por lesiones quísticas dilatadas. La tinción con DBA y LTA demostró que en esta etapa tardía de la génesis de quistes, las lesiones provienen casi exclusivamente de túbulos colectores. Hay que destacar que las lesiones quísticas provenientes de túbulos colectores son características de la ARPKD humana.

En contraposición a estos riñones no tratados, los riñones provenientes de animales tratados con tres inyecciones semanales del compuesto del Ejemplo 9 (30 mg/kg) presentaron sólo enfermedad quística leve a moderada, con túbulos colectores normales claramente visibles entre pequeños quistes residuales en túbulos proximales. Además, la tinción tricrómica (para fibrosis) de los riñones del grupo tratado con el compuesto del Ejemplo 9 presentaron una considerable reducción en la acumulación de colágeno y una red bien organizada de estructuras tubulares.

La tinción histológica del hígado mostró una tríada portal normal en animales testigo no tratados. En contraposición, los hígados de animales BPK presentaron anomalías, múltiples conductos biliares y una notable hiperplasia del epitelio biliar. los hígados de animales BPK tratados con el compuesto del Ejemplo 9 presentaron una mejora dramática en la morfología, mostrando sólo una leve hiperplasia biliar. Este efecto del compuesto del Ejemplo 9 en el hígado constituye la primera demostración de la posible reversibilidad de la enfermedad hepática en este procedimiento estándar de análisis farmacológico de PKD murina.

Sobre la base de los resultados obtenidos con los compuestos representativos de la presente invención, los compuestos de la presente invención son útiles para el tratamiento o la inhibición de la poliquistosis renal.

Los compuestos de la presente invención pueden formularse solos o pueden combinarse para su administración con uno o más excipientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico. Por ejemplo, disolventes, diluyentes y similares, y pueden administrarse por vía oral en formas tales como comprimidos, cápsulas, polvos dispersables, gránulos, o suspensiones que contienen, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 a 5% de dispersante, jarabes que contienen, por ejemplo, de aproximadamente 10 a 50% de azúcar, y elixires que contienen, por ejemplo, de aproximadamente 20 a 50% de etanol, y similares; o por vía parenteral en forma de solución o suspensión inyectable estéril que contiene de aproximadamente 0,05 a 5% de dispersante en un medio isotónico. Dichas preparaciones farmacéuticas pueden contener, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 hasta aproximadamente 90% del principio activo en combinación con el excipiente, más habitualmente entre aproximadamente 5% y 60% en peso.

La dosis concreta utilizada del principio activo puede variar dependiendo del compuesto particular empleado, la forma de administración y la gravedad del trastorno que se va a tratar. Sin embargo, se obtienen, en general, resultados satisfactorios cuando los compuestos de la invención se administran en una dosis diaria de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1.000 mg/kg de peso corporal del animal, administrados opcionalmente en dosis divididas de dos a cuatro veces al día, o en forma de liberación sostenida. Para la mayoría de los grandes mamíferos, la dosis diaria total es de aproximadamente 1 a 1.000 mg, preferiblemente de aproximadamente 2 a 500 mg. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso interno comprenden de aproximadamente 0,5 a 1000 mg del compuesto activo mezclado a conciencia con un excipiente sólido o líquido aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Esta pauta de dosificación puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden administrarse varias dosis divididas cada día o puede reducirse la dosis proporcionalmente según lo requieran las necesidades de la situación terapéutica.

Estos compuestos activos pueden administrarse por vía oral, así como por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Los excipientes sólidos incluyen almidón, lactosa, fosfato dicálcico, celulosa microcristalina, sacarosa y caolín, mientras que los portadores líquidos incluyen agua estéril, polietilenglicoles, tensioactivos no iónicos y aceites comestibles tales como aceites de maíz, de cacahuete y de sésamo, según convenga a la naturaleza del principio activo y a la forma particular de administración deseada. También pueden incluirse, ventajosamente, aditivos tradicionalmente empleados en la preparación de composiciones farmacéuticas, tales como saborizantes, colorantes, conservantes y antioxidantes, por ejemplo, vitamina E, ácido ascórbico, BHT y BHA.

Las composiciones farmacéuticas preferidas, desde el punto de vista de la facilidad de preparación y administración, son las composiciones sólidas, en particular los comprimidos y las cápsulas rellenadas con sólidos o líquidos. Es preferida la administración oral de los compuestos.

En algunos casos puede ser deseable administrar los compuestos directamente en las vías respiratorias en forma de aerosol.

Estos compuestos activos también pueden administrarse por vía parenteral o intraperitoneal. Las soluciones o suspensiones de estos compuestos activos en forma de base libre o de sal farmacológicamente aceptable, pueden preparase en agua mezclada de forma adecuada con un tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden preparase en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir la proliferación de microorganismos.

Las formas farmacéuticas aceptables para su uso en inyecciones incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser líquida para que pueda administrarse fácilmente con jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe protegerse de la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El excipiente puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales.

A continuación se describe la preparación de ejemplos representativos de los compuestos de la presente invención.

Ejemplo 1 N'-(2-ciano-4-nitrofenil)-N,N-dimetilformamidina

Una porción de 40,8 g de 5-nitroantranilonitrilo y 40 ml de dimetilacetal de N,N-dimetilformamida se calentaron en un baño de vapor durante 2 horas. Los disolventes se eliminaron a baja presión y el residuo se recogió en cloruro de metileno. Tras hacer pasar esta solución a través de Magnesol, el disolvente se eliminó. Tras lavar con éter se obtuvieron 50,8 g de N'-(2-ciano-4-nitrofenil)-N,N-dimetilformamidina.

Ejemplo 2 N-(3-bromofenil)-6-nitro-4-quinazolinamina

Una solución de 23,74 ml de 3-bromoanilina y 40,5 g N'-(2-ciano-4-nitrofenil)-N,N-dimetilformamidina en 100 ml de ácido acético glacial se agitó y calentó en un baño de aceite a 148ºC durante 1,5 horas. Tras enfriar, la filtración del sólido resultante da lugar a un rendimiento cuantitativo de N-(3-bromofenil)-6-nitro-4-quinazolinamina:

p.f. = 267-270ºC; espectro de masas (m/e): 345.

Ejemplo 3 N-(3-bromofenil)-4,6-quinazolindiamina

Una mezcla de 34,5 g de N-(3-bromofenil)-6-nitro-4-quinazolinamina y 16,8 g de polvo de hierro en 150 ml de etanol y 150 ml de ácido acético glacial se calentó en un baño de aceite a 120ºC durante 2 horas. Tras la filtración del sólido, se añadió carbonato de sodio sólido al filtrado, dando lugar a un sólido, que se filtró y se extrajo con metanol. Los extractos se trataron con carbón y se evaporaron, para formar un sólido. Tras lavar el sólido con éter, se obtuvieron 27,5 g de N-(3-bromofenil)-4,6-quinazolindiamina: espectro de masas (m/e): 315.

Ejemplo 4 Ácido 4-[[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]amino]-4-oxo-(Z)-2-butenoico

Una porción de 15 ml de piridina se añadió a 1,6 g de N-(3-bromofenil)-4,6-quinazolindiamina y 0,6 g de anhídrido maleico. Tras agitar durante toda la noche, los disolventes se eliminaron en el evaporador rotatorio. El sólido se recogió en aproximadamente 400 ml de etanol caliente y el material insoluble se filtró, para dar 0,33 g de ácido 4-[[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]amino]-4-oxo-(Z)-2-butenoico: espectro de masas (m/e): M+H 413, 415.

Ejemplo 5 Éster etílico del ácido 4-[[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]amino]-4- oxo-(E)-2-butenoico

Una solución de N-(3-bromofenil)-4,6-quinazolindiamina en 15 ml de piridina se enfrió en un baño de hielo y se le añadió gota a gota una solución de 1,22 g de cloruro de etilfumarilo en 10 ml de cloruro de metileno. Tras agitar durante 1,5 horas, se dejó que la reacción alcanzase la temperatura ambiente. Los disolventes se eliminaron a baja presión y el residuo se trató con agua. El sólido rojo se filtró y se extrajo con acetona caliente. Tras la filtración del material insoluble el filtrado se concentró, para dar 0,45 g del éster etílico del ácido 4-[[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]amino]-4-oxo-(E)-2-butenoico: p.f. = 259-263ºC, espectro de masas (m/e): M+H 441, 443.

Ejemplo 6 N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-3-metil-2-butenamida

Una solución de 1,58 g de N-(3-bromofenil)-4,6-quinazolindiamina en 15 ml de piridina se enfrió en un baño de hielo y se le añadió gota a gota una solución de 0,67 ml de cloruro de 3,3-dimetilacriloílo en 7 ml de éter. Tras agitar y enfriar durante 2 horas, los disolventes se eliminaron a baja presión. El residuo se trató con agua y el sólido resultante se recristalizó en metil-cellusolve, para dar 0,97 g de N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-3-metil-2-butenamida: p.f. = 300-301ºC, espectro de masas (m/e): 396, 398.

Ejemplo 7 N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-(E)-2-butenamida

Una solución de 1,6 g de N-(3-bromofenil)-4,6-quinazolindiamina en 15 ml de piridina se enfrió en un baño de hielo y se le añadió gota a gota una solución de 0,57 ml de cloruro de trans-crotonoílo en 6 ml de éter. Tras agitar y enfriar durante 2 horas, los disolventes se eliminaron a baja presión. El residuo se trató con agua y el sólido resultante se recristalizó en n-butanol, para dar 0,69 g de N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-(E)-2-butenamida: p.f. = 153-160ºC, espectro de masas (m/e): M+H 383, 385.

Ejemplo 8 N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-metil-2-propenamida

Una solución de 1,6 g de N-(3-bromofenil)-4,6-quinazolindiamina en 15 ml de piridina se enfrió en un baño de hielo y se le añadió gota a gota una solución de 0,59 ml de cloruro de metacriloílo en 6 ml de éter. Tras agitar y enfriar durante 2 horas, los disolventes se eliminaron a baja presión. El residuo se trató con agua y el sólido resultante se recogió en n-butanol (con calentamiento). La adición de éter a la solución enfriada da lugar a 0,44 g de N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-metil-2-propenamida:

p.f. = 40-245ºC, espectro de masas (m/e): M+H 383, 385.

Ejemplo 9 N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-butinamida

Una solución de 0,50 g de ácido 2-butinoico en 10 ml de tetrahidrofurano se enfrió en un baño de hielo. Se añadió una porción de 0,79 ml de cloroformato de isobutilo seguido por de una porción de 0,66 ml de N-metilmorfolina. Tras aproximadamente 1 minuto, se añadió una solución de 1,6 g de N-(3-bromofenil)-4,6-quinazolindiamina en 10 ml de piridina. Se dejó que la reacción alcanzase la temperatura ambiente y se agitó durante toda la noche. Los disolventes se eliminaron a baja presión y el sólido se recristalizó en n-butanol, para dar 1,07 g de N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-butinamida: espectro de masas (m/e): 381, 383.

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Ejemplo 10 Ácido 4-[[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]amino]-4-oxo-(E)-2-butenoico

Se añadió una porción de 2,5 ml de hidróxido de sodio acuoso 10 N a 2,3 g de éster etílico del ácido 4-[[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]amino]-4-oxo-(E)-2-butenoico (Ejemplo 5) en 25 ml de etanol. Tras agitar durante una hora, se añadieron 2,1 ml de ácido clorhídrico concentrado y la reacción se agitó durante otras 2 horas. El sólido resultante se recristalizó en n-butanol, para dar 0,97 g de ácido 4-[[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]amino]-4-oxo-(E)-2-butenoico: espectro de masas (m/e): M+H 413.

Ejemplo 11 N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2,4-hexadienamida

Una solución de 0,67g de ácido 2,4-hexadienoico en 10 ml de tetrahidrofurano se enfrió en un baño de hielo. Se le añadió una porción de 0,79 ml de cloroformato de isobutilo, seguido por una porción de 0,66 ml de N-metilmorfolina. Tras aproximadamente 1 minuto, se le añadió una solución de 1,6 g de N-(3-bromofenil)-4,6-quinazolindiamina en 10 ml de piridina. Se dejó que la reacción alcanzase la temperatura ambiente y se agitó durante toda la noche. Los disolventes se eliminaron a baja presión y el sólido se recristalizó, para dar 1,0 g de N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2,4-hexadienamida: p.f. = 258-260ºC.

Ejemplo 12 N-[4-[(3-bromofenil)amino-6-quinazolinil]-2-ciclopentenoamida

Una solución de 0,43 g de ácido 2-ciclopentenoico en 5 ml de tetrahidrofurano se enfrió en un baño de hielo. Se le añadió una porción de 0,49 ml de cloroformato de isobutilo, seguido por una porción de 0,41 ml de N-metilmorfolina. Tras aproximadamente 1 minuto, se le añadió una solución de 1,0 g de N-(3-bromofenil)-4,6-quinazolindiamina en 10 ml de piridina. Se dejó que la reacción alcanzase la temperatura ambiente y se agitó durante toda la noche. Se añadieron otros 0,5 equivalentes de anhídrido mixto. La mezcla se agitó durante 5 horas. Los disolventes se eliminaron a baja presión y el sólido se purificó por cromatografía en gel de sílice, para dar 0,30 g de N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-ciclopentenoamida: espectro de masas (m/e): 409 (M+H, IE).

Ejemplo 13 N-[4-[(3-bromofenil)amino-6-quinazolinil]-2-propenamida

Una solución de 2,0 g de N-(3-bromofenil)-4,6-quinazolindiamina en 10 ml de piridina se enfrió en un baño de hielo y se añadió gota a gota una solución de 0,61 ml de cloruro de acriloílo en 30 ml de éter a 0ºC. Tras agitar a temperatura ambiente durante 3,5 horas, los disolventes se eliminaron a baja presión. El residuo se purificó por cromatografía, para dar 0,2 g de N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2- propenamida: espectro de masas (m/e): M+H 369.

Ejemplo 14 N-[4-[(3-bromofenil)amino-6-quinazolinil]-(3-fenil-2-propinamida)

Una solución de 0,93 g de ácido 3-fenil-2-propinoico en 10 ml de tetrahidrofurano se enfrió en un baño de hielo. Se añadió una porción de 0,82 ml de cloroformato de isobutilo, seguido por una porción de 0,69 ml de N-metilmorfolina. Tras aproximadamente 1 minuto, se añadió una solución de 1,0 g de N-(3-bromofenil)-4,6-quinazolindiamina en 7 ml de piridina. La reacción se mantuvo a 0ºC durante 1 h. Los disolventes se eliminaron a baja presión y el sólido se purificó por cromatografía en gel de sílice, para dar 0,01 g de N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-(3-fenil-2-propinamida): espectro de masas (m/e): 443,2, 445,2 (M+H, electronebulización).

Ejemplo 15 6-amino-4-cloroquinazolina

Una mezcla que constaba de 3,25 g de 4-cloro-6-nitroquinazolina, 10,8 g de hidrosulfito de sodio y 0,3 g del catalizador de transferencia de fase (C_{8}H_{17})_{3}NCH_{3}^{+} Cl^{-} en 97 ml de tetrahidrofurano y 32 ml de agua se agitó rápidamente durante 2 horas. La mezcla se diluyó con éter y la capa orgánica se separó. La solución orgánica se lavó con salmuera y después se secó con sulfato de magnesio. La solución se hizo pasar a través de una pequeña columna de gel de sílice. El disolvente se eliminó a 30ºC a baja presión, para dar 6-amino-4-cloroquinazolina, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación ulterior.

Ejemplo 16 [4-cloro-6-quinazolinil]-2-butinamida

Una solución de 1,64 g de ácido 2-butinoico en 46 ml de tetrahidrofurano se enfrió en un baño de hielo. Se le añadió una porción de 2,34 ml de cloroformato de isobutilo, seguido por una porción de 4,13 ml de N-metilmorfolina. Tras aproximadamente 10 minutos, la mezcla se vertió en una solución de 6-amino-4-cloroquinazolina en 46 ml de tetrahidrofurano. Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla se vertió en una mezcla de salmuera y bicarbonato de sodio saturado y se extrajo con éter. La solución de éter se secó con sulfato de magnesio y se filtró. El disolvente se eliminó, dando lugar a [4-cloro-6-quinazolinil]-2-butinamida en forma de aceite coloreado, que se utilizó en la siguiente etapa sin purificación ulterior.

Ejemplo 17 N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-butinamida

Una solución que constaba de 1,76 g de [4-cloro-6-quinazolinil]-2-butinamida y 1,23 g de 3-bromoanilina se sometió a reflujo en atmósfera inerte en 23 ml de isopropanol durante 40 minutos. La mezcla se enfrió hasta la temperatura ambiente y se añadieron 200 ml de éter, para dar 0,4 g de N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-butinamida en forma de sal de clorhidrato. La neutralización con solución de bicarbonato de sodio, la extracción con acetato de etilo, la eliminación del disolvente y la recristalización en 1-butanol proporciona N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-butinamida, en forma de base libre.

Ejemplo 18 N'-(4-amino-2-cianofenil)-N,N-dimetilformamidina

Una solución de 6,0 g (27,5 mmol) de N'-(2-ciano-4-nitrofenil)-N,N-dimetilformamidina, 33,9 g (41,8 ml, 412,4 mmol) de ciclohexeno y 0,6 g de Pd/C al 10% en 360 ml de metanol se sometió a reflujo durante 4 h. La mezcla caliente se filtró a través de Celite. El disolvente se eliminó y el residuo se recristalizó en cloroformo-tetracloruro de carbono, para dar 4,9 g (95%) del compuesto del título en forma de sólido cristalino de color gris claro. Espectro de masas (m/e): 188,9 (M+H, electronebulización).

Ejemplo 19 N-[3-ciano-4-[[(dimetilamino)metileno]amino]fenil]-2-butinamida

Una solución de 2,01 g (23,9 mmol) de ácido 2-butinoico y 2,9 ml (22,3 mmol) de cloroformato de isobutilo en 30 ml de tetrahidrofurano se agitó a 0ºC en atmósfera de nitrógeno mientras se añadían 2,42 g (2,63 ml, 22,3 mmol) de N-metilmorfolina durante 3 min. Tras agitar durante 15 min, se añadió una solución de N'-(4-amino-2-cianofenil)-N,N-dimetilformamidina y 1,6 g (1,75 ml, 15,9 mmol) de N-metilmorfolina en 25 ml de tetrahidrofurano durante 4 min. La mezcla se agitó durante 30 min a 0ºC y durante 30 min a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con 70 ml de acetato de etilo y se vertió en una mezcla de salmuera y bicarbonato de sodio saturado. La capa orgánica se secó (MgSO_{4}) y se filtró a través de una almohadilla de gel de sílice. El disolvente se eliminó y el residuo se agitó con 50 ml de éter. El sólido en suspensión se recogió, para dar 3,61 g (89%) de un sólido blancuzco. Espectro de masas (m/e): 255,0 (M+H, electronebulización).

Ejemplo 20 N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-butinamida

Una solución de 3,0 g (11,8 mmol) de N-[3-ciano-4-[[(dimetilamino)metileno]amino]fenil]-2-butinamida y 2,23 g (12,98 mmol) de 3- bromoanilina en 18 ml de ácido acético se sometió a reflujo suavemente con agitación en atmósfera de nitrógeno durante 1 h y 15 min. La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se formó una masa sólida. El sólido se recogió por filtración y se lavó con éter-acetonitrilo 1:1, para dar un sólido amarillo, que se recristalizó en etanol, dando lugar a 2,51 g de N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-butinamida: espectro de masas (m/e): 381, 383.

Claims

1. Utilización de un compuesto de fórmula 1

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en la que:

X es fenilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados a partir del grupo formado por halógeno, alquilo de 1-6 átomos de carbono, alcoxi de 1-6 átomos de carbono, hidroxi, trifluorometilo, ciano, nitro, carboxi, carboalcoxi de 2-7 átomos de carbono, carboalquilo de 2-7 átomos de carbono, amino y alcanoílamino de 1-6 átomos de carbono;

Y es un radical seleccionado a partir de

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n= 2-4;

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que R, R_{1} y R_{2} son hidrógeno o una sal de los mismos, aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que X no está sustituido o está sustituido con halógeno o alquilo de 1-6 átomos de carbono.

4. Utilización según la reivindicación 1, en la que el compuesto de fórmula 1 se selecciona a partir de uno de los siguientes:

N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-butinamida

N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6quinazolinil]-2-metil-2-propenamida

N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2,4-hexadienamida

N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-(E)-2-butenamida

N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-3-metil-2-butenamida

4-[[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]amino]-4-oxo-(Z)-2-butenoico;

4-[[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]amino]-4-oxo-(E)-2-butenoico;

Éster etílico del ácido 4-[[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]amino]-4-oxo-(E)-2-butenoico

N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-ciclopentenamida

N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-2-propenamida; y

N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6-quinazolinil]-(3-fenil-2-propinamida), o una sal de los mismos, aceptable desde el punto de vista farmacéutico.