EA020111B1 - {5-[4-(3,3-ДИМЕТИЛАЗЕТИДИН-1-КАРБОНИЛ)ФЕНИЛ]-[1,2,4]ТРИАЗОЛ[1,5-a]ПИРИДИН-2-ИЛ}АМИД ЦИКЛОПРОПАНКАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ - Google Patents

Abstract

В изобретении описан {5-[4-(3,3-диметилазетидин-1-карбонил)фенил]-[1,2,4]триазол[1,5-а]пиридин-2-ил}амид циклопропанкарбоновой кислоты, представленный структурной формулой (I). Данное соединение можно получить в виде фармацевтической композиции, которая может быть использована для предупреждения и лечения ряда состояний у млекопитающих, включая людей, включая путем неограничивающего примера воспалительные состояния, аутоиммунные заболевания, пролиферативные заболевания, отторжения трансплантата, заболевания, включающие в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденные пороки развития хрящевой ткани и/или заболевания, связанные с гиперсекрецией IL6.

Description

Настоящее изобретение относится к соединению, которое является ингибитором 1ЛК, семейству тирозинкиназ, участвующих в воспалительных состояниях, аутоиммунных заболеваниях, пролиферативных заболеваниях, отторжении трансплантата, заболеваниях, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденные пороки развития хрящевой ткани и/или заболевания, связанные с гиперсекрецией 1Ьб. В настоящем изобретении также предоставлены способы получения данного соединения, фармацевтические композиции, содержащие данное соединение, и способы предупреждения и/или лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжений трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ьб, путем введения соединения данного изобретения.

Янус-киназы (ТАК) представляют собой цитоплазматические тирозинкиназы, передающие цитокиновый сигнал от мембранных рецепторов к факторам транскрипции 8ТАТ. Описано четыре члена семейства 1АК: 1АК1, 1АК2, 1АК3 и ΤΥΚ2. При связывании цитокина со своим рецептором члены семейства 1АК ауто- и/или трансфосфорилируют друг друга с последующим фосфорилированием 8ТАТ, которые затем мигрируют в ядро для модулирования транскрипции. Внутриклеточная передача сигнала 1АК8ТАТ обеспечивается интерферонами, большинством интерлейкинов, а также множеством цитокинов и эндокринных факторов, таких как ЕРО, ТРО, ОН, О8М, ЫЕ, СЫТЕ, 6М-С8Е и РКЬ (Уатсйепкет XV. с1 а1. (2008)).

Генетические модели в сочетании и исследованием малых молекул ингибиторов 1АК выявили терапевтический потенциал нескольких 1АК. При помощи генетики мышей и людей подтверждено, что 1АК3 является иммуносуппрессорной мишенью (О'811са 1. с1 а1. (2004)). Ингибиторы 1АК3 были успешно приняты в клиническую разработку, первоначально для случаев отторжения трансплантата органов, но впоследствии также и для других иммуновоспалительных показаний, таких как ревматоидный артрит (КА), псориаз и болезнь Крона (Ййр://с11шса11пак.доу/).

ТУК2 представляет собой возможную мишень в случае иммуновоспалительных заболеваний, что подтверждено методом генетики человека и исследованиями нокаутных мышей (Ьеуу Ό. Апб Ьоошщ С. (2007)).

1АК1 представляет собой новую мишень в области иммуновоспалительных заболеваний. 1АК1 гетеродимеризуется с другими 1АК для передачи сигнала от провоспалительных цитокинов. Следовательно, ожидается, что ингибирование 1АК1 и/или других 1АК окажет благоприятное терапевтическое воздействие в случае ряда воспалительных состояний, а также других заболеваний, передающихся путем 1АК-опосредованной передачи сигнала.

Предпосылки к созданию изобретения

Дегенерация хряща является признаком различных заболеваний, среди которых наиболее известными являются ревматоидный артрит и остеоартрит. Ревматоидный артрит (КА) представляет собой хроническое дегенеративное поражение сустава, характеризуемое воспалением и разрушением структур сустава. Если не лечить данное заболевание, это приводит к значительной недееспособности и боли вследствие потери функций сустава и даже к преждевременной смерти. Таким образом, целью терапии КА является не только замедлить развитие болезни, но добиться ремиссии, чтобы остановить разрушение сустава. Вследствие тяжести последствий данного заболевания широкое распространение КА (приблизительно 0,8% взрослых поражены по всему миру) означает большое социоэкономическое воздействие (в отношении обзоров по КА авторы изобретения ссылаются на 8шо1еи апб 81етет (2003); Ьее апб УетЫаН (2001); Сйоу апб Рапау1 (2001); О'1)е11 (2004) и Енсйет (2003)).

Остеоартрит (называемый также ОА, или артрит, обусловленный изнашиванием) представляет собой наиболее распространенную форму артрита и характеризуется потерей суставного хряща, зачастую связанную с гипертрофией кости и болью. В отношении исчерпывающего обзора по остеоартриту авторы изобретения обращаются к V^е1апб е1 а1. (2005).

Остеоартрит с трудом поддается лечению. В настоящее время отсутствуют надежные методы лечения и лечение направлено на облегчение боли и предупреждение деформации пораженного сустава. Общепринятые методы лечения включают в себя использование нестероидных и противовоспалительных лекарственных препаратов (Ν8ΛΙΩ). Несмотря на то что для лечения остеоартрита рекомендуют пищевые добавки, такие как хондроитин и сульфат глюкозамина, в ходе недавнего клинического исследования было выяснено, что оба метода лечения не уменьшают боль, связанную с остеоартритом (С1едд е1 а1., 200б). В целом, доступные лекарственные средства, корректирующие заболевание остеоартритом, отсутствуют.

Стимуляция анаболических процессов, блокирование катаболических процессов или сочетание двух этих процессов может привести к стабилизации сустава и, возможно, даже реверсии поражения и, следовательно, предупреждает дальнейшее развитие данного заболевания. Анаболическая стимуляция хондроцитов может стимулироваться различными спусковыми механизмами. Инсулиноподобный фактор роста-1 (ΙΟΕ-Ι) является доминирующим анаболическим фактором роста в синовиальной жидкости и стимулирует синтез как протеогликанов, так и коллагена. Кроме того, было показано, что члены семей

- 1 020111 ства морфогенетических белков костей (ВМР), а именно ВМР2, ВМР4, ВМРб и ВМР7, и члены семейства трансформирующих факторов роста человека-β (ТОР-β) способны вызывать анаболическую стимуляцию хондроцитов (СйиЫиккауа аиб Киейиег, 2003). Недавно было идентифицировано соединение, вызывающее анаболическую стимуляцию хондроцитов (патент США № 6500854; ЕР 1391211). Однако для большинства из этих соединений проявляются серьезные побочные эффекты и, следовательно, существует значительная необходимость в соединениях, стимулирующих дифференциацию хондроцитов без этих побочных эффектов.

УанбедН|Н81е е! а1. (^О 2005/124342) обнаружили, что 1АК1 представляет собой мишень, ингибирование которой может иметь терапевтическое значение в случае нескольких заболеваний, включая ОА. 1АК1 принадлежит к семейству Янус-киназ (1АК) цитоплазматических тирозинкиназ, участвующих в опосредованной цитокиновыми рецепторами внутриклеточной передаче сигнала. Семейство 1АК состоит из 4 членов: 1АК1, 1АК2, 1АК3 и ТУК2. 1АК вовлекаются в цитокиновые рецепторы при связывании с цитокином с последующей гетеродимеризацией цитокинового рецептора и совместно используемой рецепторной субъединицы (общая цепь гамма-с, др130). Затем 1АК активируются путем ауто- и/или трансфосфорилирования другой 1АК, что приводит к фосфорилированию рецепторов и рекрутингу и фосфорилированию членов передатчиков сигнала и активатора транскрипции (8ТАТ). Фосфорилированные 8ТАТ димеризуются и перемещаются в ядро, где они связываются с энхансерными областями цитокин-респонсивных генов. Нокаут гена 1АК1 у мышей показал, что 1АК1 играет существенные и неизбыточные роли в процессе развития: 1АК1-/-мышей умерли в течение 24 ч после рождения и развитие лимфоцитов было сильно нарушено. Более того, клетки 1АК1-/- не были или были менее реакционноспособны по отношению к цитокинам, чем в случае использования цитокиновых рецепторов II класса, цитокиновых рецепторов, использующих субъединицу гамма-с для передачи сигнала, и семейства цитокиновых рецепторов, использующих субъединицу др130 для передачи сигнала (ВоФд е! а1., 1998.)

Различные группы подразумевали передачу сигнала 1АК-8ТАТ в биологии хондроцитов. Ь1 е! а1. (2001) показали, что онкостатин М вызывает экспрессию генов ММР и Т1МР3 в первичных хондроцитах за счет активации путей передачи сигнала 1АК/8ТАТ и МАРК. Окак1 е! а1. (2003) показали, что опосредованное интерфероном-гамма ингибирование коллагена II в хондроцитах включает в себя передачу сигнала 1АК-8ТАТ. ΓΕ1-β вызывает катаболизм хряща за счет снижения экспрессии компонентов матрикса и за счет экспрессии коллагеназ и индуцируемой синтазы оксида азота (N082), которая опосредует образование оксида азота (N0). О!его е! а1., (2005) показали, что лептин и ΓΕ1-β синергитически вызывают образование N0 или экспрессию N082 мРНК в хондроцитах и что она блокируется ингибитором 1АК. Ьедеибге е! а1. (2003) показали, что рецептор ГЬб/ГЬб вызывает даунрегуляцию хрящ-специфичных матриксных генов коллагена II, ядра аггрекана и связывающего белка в суставных хондроцитах быка и что это опосредуется передачей сигнала 1АК/8ТАТ. Следовательно, данные наблюдения предполагают роль активности 1АК-киназы в гомеостазе хряща и терапевтические возможности для ингибиторов 1АКкиназ.

Члены семейства 1АК участвовали в дополнительных состояниях, включающих в себя миелопролиферативные нарушения (О'8иШуаи е! а1., 2007, Мо1. Iттиио1. 44(10):2497-506), для которых были определены мутации в 1АК2. Это указывает на то, что ингибиторы 1АК, в частности 1АК2, также могут быть использованы при лечении миелопролиферативных нарушений. Кроме того, семейство 1АК, в частности 1АК1, связано с различными видами рака, в частности различными видами лейкоза, например острым миелоидным лейкозом (О'8иШуаи е! а1., 2007, Мо1. Iттиио1. 44 (10) :2497-506; Х1аид е! а1., 2008, Иеиййсайои о£ котайс 1АК1 ти1айоик т райеи!к \\Й11 аси!е туе1о1б 1еикет1а В1ооб Ρίτκ! Ебйюи Рарег, ргериЫщйеб оийие ЭесетЬег 26, 2007; ЭО! 10.1182/Ь1ооб-2007-05-090308) и острым лимфобластическим лейкозом (МиШдйаи е! а1., 2009), или солидными опухолями, например лейомиосаркомой матки (СоиКаийиекси е! а1., 2007, Тгеибк т Вюсйет1са1 8с1еисек 33(3): 122-131), раком предстательной железы (Тат е! а1., 2007, Впйкй 1оигиа1 о£ Саисег, 97, 378-383). Эти результаты указывают на то, что ингибиторы 1АК, в частности 1АК1 и/или 1АК2, могут также быть использованы при лечении различных видов рака (лейкозов и солидных опухолей, например лейомиосаркомы матки, рака предстательной железы).

Кроме того, болезнь Кастлмана, множественная миелома, мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, псориаз и саркома Капоши, по-видимому, происходят вследствие гиперсекреции цитокина ГЕ-6, биологические эффекты которого опосредуются внутриклеточной передачей сигнала 1АК-8ТАТ (Те!кир Nака, №п1иго №кЫто!о аиб Табатйки КзкНипоЮ. ΛτίΗτίΙΐδ Век 2002, 4 (кирр1 3): 8233-8242). Эти результаты указывают на то, что ингибиторы 1АК могут также быть использованы при лечении указанных заболеваний.

Для 1АК3 и Тук2 была установлена связь с аутоиммунными заболеваниями. Мутации в 1АК3, а также в верхних компонентах передачи сигнала цепи гамма-с рецептора и ГЕ7 составляют в сумме приблизительно 70% случаев тяжелого комбинированного иммунодефицита. Следует отметить, что 1АК1 сотрудничает с 1АК3 в передаче сигналов от цепи гамма-с рецептора. Полиморфизм Тук2 заметен в системной красной волчанке (8ЬЕ) (О'8иШуаи е! а1., 2007, Мо1. Iттиио1. 44(10):2497-506). Поэтому избрание мишенью семейства 1АК может предоставить терапевтическую возможность в области иммуновос

- 2 020111 палительных заболеваний.

Существующие в настоящее время терапевтические методы лечения не являются удовлетворительными и, следовательно, сохраняется необходимость в получении других соединений, которые могут быть полезны при лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжений трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ьб. Таким образом, в настоящем изобретении предоставлено соединение, способы его получения и фармацевтические композиции, содержащие соединение настоящего изобретения совместно с подходящим фармацевтическим носителем. В частности, данное соединение проявляет высокую эффективность и селективность в отношении 1ΆΚ1 по сравнению с другими членами семейства 1ΛΚ, помимо 385 киназы и некиназных мишеней. Кроме того, данные указывают на то, что данное соединение обладает хорошими пределами безопасности. Поэтому сделан вывод о том, что в настоящем изобретении предложена новая возможность лечения заболеваний, опосредованных 1ΆΚ1, в частности воспалительных заболеваний, таких как 8ЬЕ (системная красная волчанка) и КА.

Кроме того, в настоящем изобретении предоставлено использование соединения изобретения для получения лекарственного средства для лечения данных заболеваний и состояний.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение основано на открытии того факта, что ингибиторы 1АК, в частности 1АК1, применимы для лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжений трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ьб. В настоящем изобретении также предоставлены способы получения данных соединений, фармацевтические композиции, содержащие данные соединения, и способы лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжений трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков хрящевой ткани и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ьб, при введении соединения данного изобретения.

Соответственно в первом аспекте изобретения описано соединение данного изобретения, имеющее формулу I

о N

Соединение изобретения представляет собой новый ингибитор 1АК, проявляющий высокую эффективность и селективность в отношении 1АК1 по сравнению с другими членами семейства 1АК, помимо 385 киназы и некиназных мишеней, а также обладает хорошими пределами безопасности. Использование соединения с таким профилем может привести к преимуществам при лечении воспалительных заболеваний, в частности 8ЬЕ и КА, благодаря низкому проценту неспецифичных эффектов.

В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлены фармацевтические композиции, содержащие соединение данного изобретения, и фармацевтический носитель, эксципиент или разбавитель. Кроме того, соединение данного изобретения, применимое в фармацевтических композициях и описанных в данном описании способах лечения, является фармацевтически приемлемым согласно получению и использованию. В данном аспекте изобретения фармацевтическая композиция может также содержать дополнительные активные ингредиенты, подходящие для использования в сочетании с соединением данного изобретения.

В следующем аспекте изобретения в данном изобретении предоставлен способ лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного состоянием из числа перечисленных в настоящем описании и, в частности, таким состоянием, которое может быть связано с аберрантной активностью 1АК, например воспалительными состояниями, аутоиммунными заболеваниями, пролиферативными заболеваниями, отторжениями трансплантата, заболеваниями, включающими в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденными пороками развития хрящевой ткани и/или заболеваниями, связанными с гиперсекрецией 1Ьб, при этом данный способ включает в себя введение терапевтически эффективного количества соединения данного изобретения или одной или более раскрытых в описании фармацевтических композиций. В конкретном аспекте в данном изобретении предоставлен способ лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного состоянием, которое может быть связано с аберрантной активностью 1АК, в частности воспалительными состояниями, пролиферативными заболеваниями и заболеваниями, включающими в себя ухудшение обновления хрящевой ткани.

В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлено соединение данного изобретения,

- 3 020111 предназначенное для лечения или предупреждения состояния из числа перечисленных в настоящем описании, в частности таких состояний, которые могут быть связаны с аберрантной активностью 1ЛК, такие как воспалительные состояния, аутоиммунные заболевания, пролиферативные заболевания, отторжения трансплантата, заболевания, включающие в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденные пороки развития хрящевой ткани и/или заболевания, связанные с гиперсекрецией 1Ьб. В конкретном аспекте в настоящем изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения или предупреждения состояния, связанного с аберрантной активностью 1ЛК1, в частности воспалительных состояний, пролиферативных заболеваний и заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани.

В еще одном аспекте, связанном со способом лечения, в данном изобретении предоставлен способ лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного состоянием, причинно связанным с описанной в данном описании аномальной активностью 1ЛК, при этом данный способ включает в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций, или соединения данного изобретения. В конкретном варианте осуществления аномальная активность 1ЛК представляет собой аномальную активность 1ЛК1.

В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения или предупреждения состояния, причинно связанного с аномальной активностью 1ЛК. В конкретном варианте осуществления аномальная активность 1ЛК представляет собой аномальную активность 1ЛК1.

В дополнительных аспектах в данном изобретении предоставлены способы синтеза соединения изобретения, при этом репрезентативные методики и пути синтеза описаны в данном описании далее.

Соответственно главной целью данного изобретения является предоставление соединения, способного модифицировать активность 1ЛК и, таким образом, предупреждать или излечивать любые состояния, которые могут быть причинно связаны с ней. В частности, любые состояния, которые могут быть причинно связаны с активностью 1ЛК1.

Следующей целью настоящего изобретения является предоставление соединения, способного лечить или облегчать состояния или заболевания либо их симптомы, такие как воспалительные состояния, аутоиммунные заболевания, пролиферативные заболевания, отторжения трансплантата, заболевания, включающие в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденные пороки развития хрящевой ткани и/или заболевания, связанные с гиперсекрецией 1Ьб, которые могут быть причинно связаны с активностью 1ЛК. В частности, любое заболевание или состояние, которое может быть причинно связано с активностью 1ЛК1.

Еще одной целью данного изобретения является предоставление фармацевтических композиций, которые могут быть использованы для лечения или предупреждения множества болезненных состояний, включая заболевания, связанные с активностью 1ЛК, такие как воспалительные состояния, аутоиммунные заболевания, пролиферативные заболевания, отторжения трансплантата, заболевания, включающие в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденные пороки развития хрящевой ткани и/или заболевания, связанные с гиперсекрецией 1Ьб. В частности, состояния, связанные с активностью 1ЛК1.

Другие цели и преимущества будут очевидны специалистам в данной области из рассмотрения последующего подробного описания.

Подробное описание изобретения

Определения.

Подразумевается, что следующие термины имеют приведенные ниже значения и полезны для понимания описания и предусмотренных рамок настоящего изобретения.

При описании данного изобретения, которое может включать в себя соединения, фармацевтические композиции, содержащие подобные соединения и способы применения подобных соединений и композиций, следующие термины, в случае их наличия, имеют следующие значения, если не указано иначе. Следует также понимать, что при описании в настоящем описании любая из определенных ниже групп может быть замещена рядом заместителей и что подразумевается, что соответствующие определения включают в себя подобные замещенные группы в свои рамки, установленные ниже. Если не указано иначе, термин замещенный следует определять, как установлено далее. Кроме того, следует понимать, что при использовании в настоящем описании термины группы и радикалы можно считать взаимозаменяемыми.

Фармацевтически приемлемый означает принятый или могущий быть принятым регулирующим ведомством федерального или государственного правительства либо соответствующим ведомством в странах, отличных от Соединенных Штатов, или тот, который перечислен в фармакопее США или других общепринятых фармакопеях для использования для животных, а более конкретно, для людей.

Фармацевтически приемлемая соль относится к соли соединения данного изобретения, которая является фармацевтически приемлемой и которая обладает требуемой фармакологической активностью исходного соединения. В частности, подобные соли не являются токсичными, могут представлять собой соли присоединения неорганических или органических кислот и соли присоединения оснований. Конкретно, подобные соли включают в себя (1) соли присоединения кислоты, полученные с неорганически

- 4 020111 ми кислотами, такими как хлористо-водородная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.д.; или полученные с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, пропионовая кислота, капроевая кислота, циклопентанпропионовая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота, молочная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, 3-(4-гидроксибензоил)бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, 1,2-этандисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 4-хлорбензолсульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 4толуолсульфоновая кислота, камфорсульфоновая кислота, 4-метилбицикло[2.2.2]окт-2-ен-1-карбоновая кислота, глюкогептоновая кислота, 3-фенилпропионовая кислота, триметилуксусная кислота, третбутилуксусная кислота, лаурилсерная кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, гидроксинафтойная кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, муконовая кислота и так далее; или (2) соли, образованные в том случае, когда кислый протон, имеющийся в исходном соединении, либо замещен ионом металла, например ионом щелочного металла, ионом щелочно-земельного металла, или ионом алюминия; или координирован с органическим основанием, таким как этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, Ν-метилглюкамин и т.д. Кроме того, соли включают в себя, только в качестве примера, соли натрия, калия, кальция, магния, аммония, тетраалкиламмония и так далее; а в случае, когда соединение содержит основную функциональную группу, соли нетоксичных органических или неорганических кислот, такие как гидрохлорид, гидробромид, тартрат, мезилат, ацетат, малеат, оксалат и т.д. Термин фармацевтически приемлемый катион относится к приемлемому катионному противоиону кислотной функциональной группы. Примерами подобных катионов являются катионы натрия, калия, кальция, магния, аммония, тетраалкиламмония и т.д.

Фармацевтически приемлемый разбавитель относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю, с которым вводят соединение данного изобретения.

Пролекарства относятся к соединениям, включая производные соединений данного изобретения, которые содержат отщепляемые группы и в результате сольволиза или в физиологических условиях превращаются в соединения данного изобретения, которые фармацевтически активны ίη νίνο. Подобные примеры включают в себя, но не ограничиваются производными холинового эфира и т.д., Νалкилмормолинового эфира и т.д.

Сольват относится к формам соединения, которые ассоциированы с растворителем, обычно по реакции сольволиза.

Данная физическая ассоциация включает в себя связывание за счет водородных связей. Обычные растворители включают в себя воду, этанол, уксусную кислоту и т.д. Соединения данного изобретения могут быть получены, например, в кристаллической форме и могут быть сольватированы или гидратированы. Подходящие сольваты включают в себя фармацевтически приемлемые сольваты, такие как гидраты, а также включают в себя как стехиометрические сольваты, так и нестехиометрические сольваты. В некоторых случаях сольват может быть выделен, например, когда одна или более молекул растворителя входят в кристаллическую решетку кристаллического твердого вещества. Сольват включает в себя как фазу в растворе, так и выделяемые сольваты. Представительные сольваты включают в себя гидраты, этаноляты и метаноляты.

Субъект включает в себя людей. Термины человек, пациент и субъект используются в настоящем описании взаимозаменяемо.

Терапевтически эффективное количество означает количество соединения, которого при введении субъекту для лечения заболевания достаточно для осуществления подобного лечения данного заболевания. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от соединения, заболевания и его тяжести и возраста, массы и т.д., подлежащего лечению субъекта.

Предупреждающий или предупреждение относится к снижению риска получения или развития заболевания или нарушения (то есть приведение к тому, что по меньшей мере один из клинических симптомов заболевания не развивается у субъекта, который может подвергаться действию вызывающего заболевание агента или предрасположен к заболеванию до начала заболевания).

Термин профилактика относится к предупреждению и относится к мере или процедуре, целью которой является предупреждение, а не лечение или излечение от заболевания. Неограничивающие примеры профилактических мер могут включать в себя введение вакцин, введение низкомолекулярного гепарина находящимся в стационаре пациентам, подвергающимся риску получить тромбоз, например, вследствие обездвиживания, и введение противомалярийного агента, такого как хлорохин, перед визитом в географический регион, в котором малярия является эндемической, или где высок риск контакта с малярией.

Лечащий или лечение любого заболевания или нарушения относится в одном из вариантов осуществления к облегчения данного заболевания или нарушения (то есть остановке заболевания или проявления, степени или тяжести по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В другом варианте осуществления лечащий или лечение относится к облегчению по меньшей мере одного физического параметра, который может быть незаметен для субъекта. В еще одном варианте осуществле

- 5 020111 ния лечащий или лечение относится к модулированию заболевания или нарушения, либо физически (например, стабилизация заметного симптома), физиологически (например, стабилизация физического параметра), или и того, и другого. В следующем варианте осуществления лечащий или лечение относится к замедлению развития заболевания.

Используемый в настоящем описании термин воспалительное состояние(состояния) относится к группе состояний, включающих в себя ревматоидный артрит, остеоартрит, юношеский идиопатический артрит, псориаз, аллергическое заболевание дыхательных путей (например, астма, ринит), воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона, колит), вызванные эндотоксинами болезненные состояния (например, осложнения после аортокоронарного шунтирования или хронические эндотоксические состояния, приводящие, например, к хронической сердечной недостаточности) и родственные заболевания с участием хрящей, такие как заболевания суставов. В частности, данный термин относится к ревматоидному артриту, остеоартриту, аллергическому заболеванию дыхательных путей (например, астме) и воспалительным заболеваниям кишечника.

Используемый в настоящем описании термин аутоиммунное заболевание(заболевания) относится к группе заболеваний, включающих в себя обструктивное заболевание дыхательных путей, включая такие состояния, как СОРИ, астму (например, наследственную бронхиальную астму, пылевую астму, детскую астму), в особенности хроническую или застарелую астму (например, позднюю астму, или гиперреактивность дыхательных путей), бронхит, включая бронхиальную астму, системную красную волчанку (8ЬЕ), рассеянный склероз, сахарный диабет I типа и связанные с ним осложнения, эндогенную экзему (атопический дерматит), контактный дерматит и другие экзематозные дерматиты, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона и неспецифический язвенный колит), атеросклероз и боковой амиотрофический склероз. В частности, данный термин относится к СОРИ, астме, системной красной волчанке, сахарному диабету I типа и воспалительному заболеванию кишечника.

Используемый в настоящем описании термин пролиферативное заболевание(заболевания) относится к таким состояниям, как рак (например, лейомиосаркома матки или рак предстательной железы), миелопролиферативные нарушения (например, истинная полицитемия, эссенциальный тромбоцитоз и миелофиброз), лейкоз (например, острый миелоидный лейкоз и острый лимфобластический лейкоз), множественная миелома, псориаз, рестеноз, склеродермит или фиброз. В особенности данный термин относится к раку, лейкозу, множественной миеломе и псориазу.

Используемый в настоящем описании термин рак относится к злокачественному или доброкачественному разрастанию клеток на коже или в органах тела, например, но без ограничения, груди, предстательной железы, легких, почке, поджелудочной железы, желудка или кишечника. Рак имеет тенденцию к проникновению в соседнюю ткань и распространению (метастазированию) в отдаленные органы, например кости, печень, легкие или мозг. Используемый в настоящем описании термин рак включает в себя как метастатические типы опухолевых клеток, такие как меланома, лимфома, лейкемия, фибросаркома, рабдомиосаркома и мастоцитома, и типы тканевой карциномы, такие как, но не ограниченные, колоректальным раком, раком предстательной железы, мелкоклеточным раком легких и немелкоклеточным раком легких, раком груди, раком поджелудочной железы, раком мочевого пузыря, раком почки, раком желудка, глиобластомой, первичным раком печени, раком яичника, раком предстательной железы и лейомиосаркомой матки.

Используемый в настоящем описании термин лейкоз относится к неопластическим заболеваниям крови и кроветворных органов. Подобные заболевания могут привести к дисфункции костного мозга и иммунной системы, что сделает реципиента крайне восприимчивым к инфекции и кровотечению. В особенности термин лейкоз относится к острому миелоидному лейкозу (АМЬ) и острому лимфобластическому лейкозу (АЬЬ).

Используемый в настоящем описании термин отторжение трансплантата относится к острому или хроническому отторжению алло- или ксенотрансплантатов, или клеток, ткани или солидных органов, например панкреатических островков, стволовых клеток, костного мозга, кожи, мышцы, корнеальной ткани, нейронной ткани, сердца, легких, объединенных сердца-легких, почки, печени, кишечника, поджелудочной железы, трахеи или пищевода, или заболеваний трансплантат против хозяина.

Используемый в настоящем описании термин заболевания, включающие в себя ухудшение обновления хрящевой ткани включает в себя такие состояния, как остеоартрит, псориатический артрит, юношеский ревматоидный артрит, подагрический артрит, септический, или инфекционный артрит, реактивный артрит, рефлекторная симпатическая дистрофия, альгодистрофия, синдром Титце, или реберный хондрит, фибромиалгия, остеохондрит, нейрогенный, или нейропатический артрит, артропатия, эндемические формы артрита типа деформирующего эндемического остеоартроза, болезнь Мселени и болезнь Хандигоду; дегенерация, возникающая вследствие фибромиалгии, системной красной волчанки, склеродермии и анкилозирующего спондилоартрита.

Используемый в настоящем описании термин врожденный порок(и) хряща включает в себя такие состояния, как наследственный хондролиз, хондродисплазия и псевдохондродисплазия, в частности, но без ограничения, микротию, анотию, метафизарную хондродисплазию и родственные нарушения.

Используемый в настоящем описании термин заболевание(я), связанные с гиперсекрецией 1Ьб включает в себя такие состояния, как болезнь Кастлмана, множественная миелома, псориаз, саркома Капоши и/или мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит.

Используемый в настоящем описании термин 1АК относится к семейству янус-киназ (ТАК), которые представляют собой цитоплазматические тирозинкиназы, передающие цитокиновый сигнал от мембранных рецепторов к факторам транскрипции 8ТАТ. Описаны четыре члена семейства 1АК: 1АК1, 1АК2, 1АК3 и ТУК2, и термин 1АК может относиться ко всем членам семейства 1АК вместе или к одному или более членам семейства 1АК, как указано в контексте.

Подразумевается, что соединение(я) изобретения и эквивалентные выражения включают в себя соединение описанной в данном описании формулы, при этом данное выражение включает в себя фармацевтически приемлемые соли и сольваты, например гидраты и сольваты фармацевтически приемлемых солей, где это позволяет контекст. Аналогичным образом, подразумевается, что ссылка на промежуточные соединения, вне зависимости от того, заявлены ли они сами, включает в себя их соли и сольваты, где это позволяет контекст.

Когда в настоящем описании ссылаются на интервалы, например, но без ограничения, С₁ -С₈ алкил, цитирование интервала следует считать представлением каждого члена указанного интервала.

Другие производные соединений данного изобретения обладают активностью как в форме своих кислот, так и формах производных кислот, но в форме кислотной чувствительной формы часто проявляют преимущества растворимости, совместимости с тканями или замедленного высвобождения в организме млекопитающего (смотрите Виибдагб, Н., Эемдп о£ Ргобгидз, р. 7-9, 21-24, Е18еу1ег, АшЦегбаш 1985). Пролекарства включают в себя производные кислот, которые хорошо известны практикующим специалистам в данной области, например, такие как сложные эфиры, полученные реакцией исходной кислоты с подходящим спиртом, или амиды, полученные реакцией соединения исходной кислоты с замещенным или незамещенным амином, или ангидриды кислот, или смешанные ангидриды. Особенно полезными пролекарствами являются простые алифатические или ароматические сложные эфиры, амиды и ангидриды, полученные из кислотных групп, являющихся боковыми в соединениях данного изобретения. В некоторых случаях желательно получить пролекарства типа двойных сложных эфиров, такие как (ацилокси)алкиловые сложные эфиры или ((алкоксикарбонил)окси)алкиловые сложные эфиры. В частности, подобные пролекарства представляют собой С₁-С₈ алкил, С₂-С₈ алкенил, арил, С₇-С₁₂ замещенный арил и С₇-С₁₂ арилалкиловые сложные эфиры соединений данного изобретения.

Используемый в настоящем описании термин изотопный вариант относится к соединению, содержащему искусственные процентные доли изотопов одного или более атомов, которые составляют подобное соединение. Например, изотопный вариант соединения может содержать один или более нерадиоактивных изотопов, например, таких как дейтерий (²Н или И), углерода-13 (¹³С), азота-15 (¹⁵Ν) или т.п. Будет понятно, что в соединении, в котором осуществлено подобное изотопное замещение, следующие атомы, в случае, когда они присутствуют, могут изменяться так, что, например, любой атом водорода может представлять собой ²Н/И, любой атом углерода может представлять собой ¹³С или любой атом азота может представлять собой ¹⁵Ν, и что наличие и расположение подобных атомов можно определить в пределах квалификации в данной области техники. Аналогичным образом, изобретение может включать в себя получение изотопных вариантов с радиоизотопами, например, в случае, когда полученные соединения могут быть использованы для исследований распределения лекарственного средства и/или субстрата в тканях. Для данной цели особенно полезны радиоактивные изотопы тритий, то есть ³Н, и углерод-14, то есть ¹⁴С, ввиду простоты их введения и простых способов определения. Кроме того, можно получить соединения, которые замещены изотопами, излучающими позитроны, такими как ^ПС, ¹⁸Е, ¹⁵О и ¹³Ν, и применимы в исследованиях методом позитрон-эмиссионной томографии (РЕТ) для изучения занятости рецепторов субстрата.

Подразумевается, что все изотопные варианты предоставленных в настоящем описании соединений, вне зависимости от того, являются ли они радиоактивными или нет, входят в объем данного изобретения.

Стереоизомеры, которые не являются зеркальными отображениями друг друга, называются диастереомерами, а стереоизомеры, являющиеся взаимно несовмещающимися зеркальными отображениями друг друга, называются энантиомерами. Если в соединении имеется асимметрический центр, например он связан с четырьмя различными группами, возможно наличие пары энантиомеров. Энантиомер можно охарактеризовать абсолютной конфигурацией его асимметрического центра и описать при помощи правил Я- и ^-последовательности Канна и Прелога или характера вращения данной молекулой плоскости поляризованного света и обозначить ее как правовращающую или левовращающую (то есть как (+)- или (-)-изомеры соответственно). Хиральное соединение может существовать либо в виде индивидуального энантиомера, либо в виде их смеси. Смесь, содержащая равные количества энантиомеров, называют рацемической смесью.

Таутомеры относятся к соединениям, которые представляют собой взаимопревращающиеся формы структуры конкретного соединения и которые отличаются расположением атомов водорода и электронов. Так, в результате перемещения электронов и какого-либо атома (обычно Н) в равновесии могут находиться две структуры. Например, енолы и кетоны являются таутомерами, поскольку они быстро

- 7 020111 превращаются друг в друга при обработке их либо кислотой, либо основанием. Другим примером таутомерии являются аци- и нитро-формы фенилнитрометана, которые получаются аналогичным образом при обработке кислотой или основанием.

Таутомерные формы могут иметь отношение к достижению оптимальной химической реакционноспособности и биологической активности рассматриваемого соединения.

Соединение данного изобретения может содержать один или более асимметрических центров; поэтому подобные соединения можно получить в виде индивидуальных (К)- или (8)-стереоизомеров либо в виде их смесей.

Если не указано иначе, подразумевается, что описание или название конкретного соединения в описании и формуле изобретения включает в себя индивидуальные энантиомеры и смеси, рацемические или другие. Методы определения стереохимической структуры и разделения стереоизомеров хорошо известны в данной области техники.

Соединение.

Настоящее изобретение основано на том факте, что ингибиторы 1ЛК применимы для лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжении трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков хрящевой ткани и заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ьб. Кроме того, в настоящем изобретении предоставлены способы получения данного соединения, фармацевтические композиции, содержащие данное соединение, и способы лечения заболеваний, включающих в себя разрушение хряща, разрушение костей и/или суставов, и/или воспаление, путем введения соединения данного изобретения. Настоящее соединение является ингибитором членов семейства 1ЛК, конкретно, оно ингибирует активность 1ЛК1, 1ЛК2, 1ЛК3 и ΤΥΚ2. В частности, оно ингибирует активность 1ЛК1.

Соответственно в первом аспекте данного изобретения описано соединение изобретения, имеющее формулу I

I

Соединение данного изобретения представляет собой {5-[4-(3,3-диметилазетидин-1карбонил)фенил]-[1,2,4]триазол[1,5-а]пиридин-2-ил}амид циклопропанкарбоновой кислоты.

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения не является изотопным вариантом.

В одном из аспектов соединение данного изобретения находится в форме свободного основания.

В одном из аспектов соединение данного изобретения представляет собой фармацевтически приемлемую соль.

В одном из аспектов соединение данного изобретения представляет собой сольват данного соединения.

В одном из аспектов соединение данного изобретения представляет собой сольват фармацевтически приемлемой соли данного соединения.

В некоторых аспектах в настоящем изобретении предоставлены пролекарства и производные соединения согласно приведенной выше формуле. Пролекарства представляют собой производные соединений данного изобретения, которые содержат метаболически отщепляемые группы, и в результате сольволиза или в физиологических условиях превращаются в соединения данного изобретения, которые фармацевтически активны ίη νίνο. Подобные примеры включают в себя, но не ограничиваются сложноэфирными производными холина, сложными эфирами Ν-алкилморфолина и т.д.

Другие производные соединения данного изобретения обладают активностью как в форме их кислот, так и производных кислот, но форма быстро реагирующей кислоты часто проявляет преимущества в отношении растворимости, совместимости с тканями или замедленного высвобождения в организме млекопитающего (см. Випбдагб, Η., Ωοδίβη оГ Ргобгидк, р. 7-9, 21-24, ЕКсуюг. Лтйегбат 1985). Пролекарства включают в себя производные кислот, которые хорошо известны специалистам, практикующим в данной области, например, такие как сложные эфиры, полученные реакцией исходной кислоты с подходящим спиртом, или амиды, полученные реакцией соединения исходной кислоты с замещенным или незамещенным амином, или ангидриды кислот, или смешанные ангидриды. Предпочтительными пролекарствами являются простые алифатические или ароматические сложные эфиры, амиды и ангидриды, полученные из кислотных групп, являющихся боковыми в соединениях данного изобретения. В некоторых случаях желательно получить пролекарства типа двойных сложных эфиров, такие как (ацилокси)алкиловые сложные эфиры или ((алкоксикарбонил)окси)алкиловые сложные эфиры. В особенности

- 8 020111 полезны С1 до С₈ алкил, С₂-С₈ алкенил, арил, С₇-С1₂ замещенный арил и С₇-С1₂ арилалкиловые сложные эфиры соединений данного изобретения.

Фармацевтические композиции.

При использовании в качестве фармацевтического средства соединение данного изобретения обычно вводят в виде фармацевтической композиции. Подобные композиции можно получить способом, который хорошо известен в области фармацевтики и содержит по меньшей мере одно активное соединение. Как правило, соединение данного изобретения вводят в фармацевтически эффективном количестве. Реально вводимое количество соединения обычно будет определяться врачом, принимая во внимание относящиеся к делу обстоятельства, включая подлежащее лечению состояние, выбранный способ введения, реальное вводимое соединение, возраст, вес и реакцию индивидуального пациента, тяжесть симптомов пациента и т.д.

Фармацевтические композиции данного изобретения можно вводить рядом способов, включая пероральный, ректальный, чрескожный, подкожный, внутрисуставной, внутривенный, внутримышечный и интраназальный. В зависимости от предназначенного способа доставки из соединения данного изобретения предпочтительно составляют препарат либо в виде инъекции, либо пероральных композиций, либо в виде мазей, в виде лосьонов, либо в виде пластырей, все из которых предназначены для чрескожного введения.

Композиции для перорального введения могут принимать форму нефасованных жидких растворов или суспензий ,или нефасованных порошков. Однако более общепринятым является предоставление композиций в виде разовых дозированных форм для облегчения точной дозировки. Термин разовая дозированная форма относится к физически дискретным единицам, которые подходят в качестве единичных доз для субъектов, являющихся людьми, и других млекопитающих, при этом каждая единица содержит заранее определенное количество активного вещества, рассчитанное для оказания требуемого терапевтического эффекта, в сочетании с подходящим фармацевтическим эксципиентом, разбавителем или носителем. Типичные разовые дозированные формы включают в себя предварительно заполненные, предварительно отмеренные ампулы или шприцы с жидкими композициями, или пилюли, таблетки, капсулы или т.п. в случае твердых композиций. В подобных композициях соединение данного изобретения обычно является минорным компонентом (от около 0,1 до около 50 мас.% или предпочтительно от около 1 до около 40 мас.%), при этом остаток представляет собой различные разбавители или носители или технологические вспомогательные вещества, полезные для получения требуемой дозированной формы.

Жидкие формы, подходящие для перорального введения, могут включать в себя подходящий водный или неводный разбавитель с буферными веществами, суспендирующими и диспергирующими агентами, красителями, вкусовыми веществами и т.д. Твердые формы могут включать в себя, например, любой из следующих ингредиентов или соединений, имеющих аналогичную природу: связывающее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая смола или желатин, эксципиент, такой как крахмал или лактоза, разрыхляющий агент, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал, смазывающее вещество, такое как стеарат магния, глидант, такой как коллоидная двуокись кремния, подслащивающее вещество, такое как сахароза или сахарин, или вкусовой агент, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновое вкусовое вещество.

Основу композиций для инъекций обычно составляет инъецируемый стерильный физиологический раствор, или физиологический раствор с фосфатным буфером, или другие инъецируемые носители, известные в данной области. Как и раньше, активное соединение в подобных композициях обычно представляет собой минорный компонент, часто составляющий от около 0,05 до 10 мас.%, при этом остаток является инъецируемым носителем и т.д.

Чрескожные композиции обычно составляют в виде местной мази или крема, содержащего активный ингредиент(ы), обычно в количестве, изменяющемся в интервале от около 0,01 до около 20 мас.%, предпочтительно от около 0,1 до около 20 мас.%, предпочтительно от около 0,1 до около 10 мас.% и более предпочтительно от около 0,5 до около 15 мас.%. При составлении препарата в виде мази активные ингредиенты будут обычно соединены либо с парафиновой, либо несмешивающейся с водой основой мази. Альтернативным образом, из активных ингредиентов можно составить препарат в виде крема, например с кремовой основой масло-в-воде. Такие чрескожные препараты хорошо известны в данной области и, как правило, содержат дополнительные ингредиенты для повышения кожного проникновения или устойчивости активных ингредиентов препарата. Все подобные известные чрескожные препараты и ингредиенты включены в объем данного изобретения.

Соединение данного изобретения можно также вводить путем чрескожного приспособления. Соответственно чрескожное введение можно осуществить с использованием пластыря либо типа резервуара, либо пористой мембраны, или ряда твердых матриц.

Описанные выше компоненты для вводимых перорально, путем инъекций или вводимых местно композиций являются лишь репрезентативными. Другие вещества, а также методики обработки и т.п. изложены в 8 части Кешшд1оп'8 Рйаттасеийса1 8аспсс5. 17⁴¹¹ οάίΐίοη. 1985, Маск РиЫйЫид Сотрапу, Еайои, Репину 1уаша, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.

Соединение данного изобретения можно также вводить в виде форм замедленного высвобождения

- 9 020111 или систем доставки лекарственных препаратов с замедленным высвобождением. Описание репрезентативных веществ для замедленного высвобождения можно найти в Кеттд1ои'8 Рйагтасеийса1 Баеисек.

Следующие примеры препаратов иллюстрируют репрезентативные фармацевтические композиции, которые можно получить согласно данному изобретению. Однако настоящее изобретение не ограничено следующими фармацевтическими композициями.

Препарат 1. Таблетки.

Соединение данного изобретения можно смешивать в виде сухого порошка со связывающим веществом из сухого желатина в массовом соотношении приблизительно 1:2. В качестве смазывающего вещества можно добавить минорное количество стеарата магния. Из данной смеси можно сформовать таблетки по 240-270 мг (80-90 мг активного амидного соединения на таблетку) при помощи таблеточного пресса.

Препарат 2. Капсулы.

Соединение данного изобретения можно смешивать в виде сухого порошка с разбавителем из крахмала в массовом соотношении приблизительно 1:1. Данной смесью можно заполнить капсулы по 250 мг (125 мг активного амидного соединения на капсулу).

Препарат 3. Жидкость.

Соединение данного изобретения (125 мг) можно смешать с сахарозой (1,75 г) и ксантановой смолой (4 мг) и полученную смесь можно перемешать, пропустить через сито № 10 меш США, а затем смешать с предварительно приготовленным раствором микрокристаллической целлюлозы и карбоксиметилцеллюлозы натрия (11:89, 50 мг) в воде. Бензоат натрия (10 мг), вкусовое вещество и краситель можно разбавить водой и прибавить при перемешивании. После этого при перемешивании можно добавить достаточное количество воды. Затем можно добавить достаточное количество воды для получения общего объема 5 мл.

Препарат 4. Таблетки.

Соединение данного изобретения можно смешивать в виде сухого порошка со связывающим веществом из сухого желатина в массовом соотношении приблизительно 1:2. В качестве смазывающего вещества можно добавить минорное количество стеарата магния. Данную смесь формуют в таблетки по 450900 мг (150-300 мг активного амидного соединения) при помощи таблеточного пресса.

Препарат 5. Инъекция.

Соединение данного изобретения можно растворить или суспендировать в забуференной стерильной солевой водной среде для инъекций в концентрации приблизительно 5 мг/мл.

Препарат 6. Местно.

Стеариловый спирт (250 г) и белый петролатум (250 г) можно расплавить примерно при 75°С, а затем можно прибавить смесь соединения данного изобретения (50 г), метилпарабен (0,25 г), пропилпарабен (0,15 г), лаурилсульфат натрия (10 г) и пропиленгликоль (120 г), растворенные в воде (около 370 г), и можно перемешивать полученную смесь, пока она не затвердеет.

Способы лечения.

Соединение данного изобретения можно использовать в качестве терапевтического агента для лечения состояний у млекопитающих, которые причинно связаны, или относятся к аберрантной активности 1ЛК. В частности, состояния относятся к аберрантной активности 1АК1. Соответственно соединение и фармацевтические композиции данного изобретения находят применение в качестве терапевтических средств для предупреждения и/или лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжений трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков хрящевой ткани и заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ь6, у млекопитающих, включая людей.

В дополнительных аспектах способа лечения в данном изобретении предоставлены способы лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного воспалительным состоянием. Данный способ включает в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций или соединений данного изобретения. В конкретном варианте осуществления воспалительное состояние выбирают из ревматоидного артрита, остеоартрита, аллергического заболевания дыхательных путей (например, астмы) и воспалительных заболеваний кишечника.

В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения, предупреждения или профилактики воспалительного состояния. В конкретном варианте осуществления воспалительное состояние выбирают из ревматоидного артрита, остеоартрита, аллергического заболевания дыхательных путей (например, астмы) и воспалительных заболеваний кишечника.

В дополнительных аспектах способа лечения в данном изобретении предоставлены способы лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного аутоиммунным заболеванием. Данные способы включают в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций или соединений данного изобретения. В конкретном способе осуществления аутоиммунное заболевание выбирают из СОРИ, астмы, сис

- 10 020111 темной красной волчанки, сахарного диабета I типа и воспалительного заболевания кишечника.

В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения, предупреждения или профилактики аутоиммунного заболевания. В конкретном способе осуществления аутоиммунное заболевание выбирают из СОРЭ. астмы, системной красной волчанки, сахарного диабета I типа и воспалительного заболевания кишечника.

В следующих аспектах способа лечения в данном изобретении предоставлены способы лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного пролиферативным заболеванием, в частности раком (например, солидными опухолями, такими как лейомиосаркома матки или рак предстательной железы), лейкозом (например, ЛМЬ или ЛЬЬ), множественной миеломой и/или псориазом. Данные способы включают в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций или соединений данного изобретения.

В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения, предупреждения или профилактики пролиферативного заболевания, в частности рака (например, солидных опухолей, таких как лейомиосаркома матки или рак предстательной железы), лейкоза (например, ЛМЬ или ЛЬЬ), множественной миеломы и/или псориаза.

В следующих аспектах способа лечения в данном изобретении предоставлены способы лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного отторжением трансплантата. Данные способы включают в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций или соединений данного изобретения. В конкретном варианте осуществления в данном изобретении предоставлены способы лечения отторжения трансплантата органа.

В аспекте способа лечения в данном изобретении предоставлен способ лечения, предупреждения или профилактики млекопитающего, восприимчивого или пораженного заболеванием, включающим в себя ухудшение обновления хрящевой ткани. Данные способы включают в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций или соединений данного изобретения.

В другом аспекте в данном изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения, предупреждения или профилактики заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани.

Кроме того, в настоящем изобретении предоставлен способ лечения врожденных пороков развития хрящевой ткани. Данные способы включают в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций или соединений данного изобретения.

В другом аспекте в данном изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения, предупреждения или профилактики врожденных пороков развития хрящевой ткани.

В следующем аспекте способов лечения в данном изобретении предоставлены способы лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного заболеваниями, связанными с гиперсекрецией 1Ьб, в частности болезнью Кастлмана или мезангиальным пролиферативным гломерулонефритом. Данные способы включают в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций или соединений данного изобретения.

В следующем аспекте в данном изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения, предупреждения или профилактики заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ьб, в частности болезни Кастлмана или мезангиального пролиферативного гломерулонефрита.

В качестве следующего аспекта изобретения предоставлено соединение данного изобретения для использования в качестве фармацевтического средства, в особенности при лечении или предупреждении вышеупомянутых состояний и заболеваний. Кроме того, в настоящем описании предоставлено использование соединения для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения одного из упомянутых выше состояний и заболеваний.

Особый режим настоящего способа включает в себя введение субъекту, страдающему воспалительным состоянием, эффективного количества соединения данного изобретения в течение периода времени, достаточного для снижения степени воспаления у субъекта и предпочтительно прекращения процессов, ответственных за указанное воспаление. Особый вариант осуществления данного способа включает в себя введение эффективного количества соединения данного изобретения рассматриваемому пациенту, страдающему или восприимчивому к развитию ревматоидного артрита, в течение периода времени, которого достаточно соответственно для снижения или предупреждения воспаления в суставах указанного пациента, а предпочтительно для прекращения процессов, ответственных за указанное воспаление.

Следующий особый режим настоящего способа включает в себя введение субъекту, страдающему заболеваниями, включающими в себя ухудшение обновления хрящевой ткани (например, остеоартрит), эффективного количества соединения данного изобретения в течение периода времени, достаточного для

- 11 020111 снижения, а предпочтительно прекращения самоподдерживающихся процессов, ответственных за указанное разрушение. Конкретный вариант осуществления данного способа включает в себя введение эффективного количества соединения данного изобретения субъекту пациенту, страдающему или восприимчивому к развитию остеоартрита, в течение периода времени, которого достаточно соответственно для снижения или предупреждения разрушения суставов указанного пациента, а предпочтительно для прекращения самоподдерживающихся процессов, ответственных за указанное разрушение. В конкретном варианте осуществления указанное соединение может проявлять анаболические и/или антианаболические свойства в отношении хрящевой ткани.

Концентрация дозы для инъекции изменяется в интервале от около 0,1 по меньшей мере до 10 мг/кг/ч, значительно в пользу интервала от около 1 до около 120 ч и особенно от 24 до 96 ч. Для достижения соответствующих концентраций стационарного состояния можно также вводить предварительно наполненный болюс, содержащий от около 0,1 до около 10 мг/кг или более. Ожидается, что максимальная общая доза не превысит примерно 2 г/день для пациентов массой от 40 до 80 кг, являющихся людьми.

Для предупреждения и/или лечения продолжительных состояний, таких как дегенеративные состояния, режим лечения обычно продолжается в течение многих месяцев или лет, так что в целях удобства и переносимости пациента предпочтительной является пероральная доза. В случае перорального дозирования репрезентативными режимами являются от одной до пяти, а в особенности от двух до четырех, и обычно три пероральные дозы в день. При использовании данных схем дозирования каждая доза предоставляет от около 0,01 до около 20 мг/кг соединения данного изобретения, при этом каждая из конкретных доз предоставляет от около 0,1 до около 10 мг/кг, а в особенности от около 1 до около 5 мг/кг.

Чрескожные дозы обычно выбирают для получения похожей или более низкой концентрации в крови, чем концентрации, которые достигаются при использовании инъецируемых доз.

В случае использования для предупреждения начала воспалительного состояния соединение данного изобретения будут вводить пациенту, имеющему риск развития данного состояния, обычно по совету и под наблюдением врача в описанных выше концентрациях дозировок. Как правило, в число пациентов, имеющих риск развития конкретного состояния, входят пациенты, в семейном анамнезе которых имеется данное состояние, или пациенты, для которых по данным генетического тестирования или скрининга была установлена особая восприимчивость к развитию данного состояния.

Соединение данного изобретения можно вводить в виде единственного активного агента или его можно вводить в сочетании с другими терапевтическими агентами, включая другие соединения, которые проявляют аналогичную или похожую терапевтическую активность и для которых установлена безопасность и эффективность в случае подобного комбинированного введения. В конкретном варианте осуществления совместное введении двух (или более) агентов допускает использование значительно более малых доз каждого из них, что снижает, таким образом, наблюдаемые подобные эффекты.

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения воспалительного состояния; конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются иммунорегуляторными агентами, например азатиоприном, кортикостероидами (например, преднизолоном, или дексаметазоном), циклофосфамидом, циклоспорином А, такролимусом, микофенолятмофетилом, муромонабом-СБ3 (ОКТ3, например, Ог11юсо1опс®). АТС, аспирином, ацетаминопрофеном, ибупрофеном, напроксеном и пироксикамом.

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения артрита (например, ревматоидного артрита); конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются анальгетиками, нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами (Ν8ΑΙΌ8), стероидами, синтетическими ΌΜΑΚΌ8 (например, но без ограничения, метотрексатом, лефлуномидом, сульфазалазином, ауранофином, ауротиомалатом натрия, пеницилламином, хлоррохином, гилроксихлорохином, азатиоприном и циклоспорином) и биологическими ΌΜΑΚΌ8 (например, но без ограничения, инфликсимабом, этанерсептом, адалиммабом, ритуксимабом и абатасептом).

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения пролиферативных нарушений; конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются метотрексатом, лейковорином, адриамицином, пренизоном, блеомицином, циклофосфамидом, 5-фторурацилом, паклитакселом, доцетакселем, винкристином, винбластином, винорельбином, доксорубицином, тамоксифеном, торемифеном, мегестролацетатом, анастрозолом, госерелином, анти-НЕК2 моноклональным антителом (например, Нетсерйи™), капецитабином, гидрохлоридом рабоксифена, ингибиторами ЕОЕВ (например, 1те88а®, Татсеуа™, ЕгЬйих™), ингибиторами УЕОЕ (например, Ауайш™), ингибиторами протеасом (например, Уе1сабе™), Сйуес® и ингибиторами 115р90 (например, 17-ААС). Кроме того, соединение данного изобретения вводят совместно с другими терапевтическими средствами, включающими в себя, но не ограниченными, лучевую терапию или хирургию. В конкретном варианте осуществления пролиферативное нарушение выбирают из рака, миелопролиферативного заболевания или лейкоза.

- 12 020111

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения аутоиммунных заболеваний; конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются глюкокортикоидами, цитостатическими агентами (например, аналогами пурина), алкилирующими агентами (например, азотистыми ипритами (циклофосфамид), нитрозомочевинами, соединениями платины и другими), антиметаболитами (например, метотрексатом, азатиоприном и меркаптопурином), цитотоксическими антибиотиками (например, дактиномицином, антрациклинами, митомицином С, блеомицином и митрамицином), антителами (например, антиСЭ20, анти-СЭ25. или анти-СЭЗ (ОТК3) моноклональными антителами, А1дат® и Тйутод1оЬи1те®), циклоспорином, такролимусом, рапамицином (сиролимусом), интерферонами (например, ΙΕΝ-β), ΤΝΒсвязывающими белками (например, инфликсимабом (Кетюабе™), этанерсептом (ЕиЬге1™) или адалимумабом (Нгтига™)), микофенолятом, финголимодом и мириоцином.

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения отторжения трансплантата; конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются ингибиторами кальцинеурина (например, циклоспорином или такролимусом (ЕК506)), ингибиторами тТОВ (например, сиролимусом, эверолимусом), антипролиферативными кортикостероидами (например, преднизолоном, гидрокортизоном), антителами (например, моноклональными антителами к анти-1Ь-2Ва рецептору, базиликсимабом, даклизумабом), поликлональными анти-Т-клеточными антителами (например, анти-тимоцитарным глобулином (АТС), антилимфоцитарным глобулином (АЬС)).

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения астмы и/или ринита и/или СОРЭ; конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются: агонистами в₂-адренорецепторов (например, салбутамолом, левалбутеролом, тербуталином и битолтеролом), эпинефрином (в виде ингаляции или таблеток), антихолинергическими средствами (например, ипратропиумбромидом), глюкокортикоидами (пероральными или вводимыми путем ингаляциями), в₂-антагонистами длительного действия (например, салметеролом, формотеролом, бамбутеролом и пероральным альбутеролом замедленного высвобождения), сочетанием вводимых путем ингаляции стероидов и бронходилататорами длительного действия (например, флутиказоном/салметеролом, бутезонидом/формотеролом), антагонистами и ингибиторами синтеза лейкотриена (например, монтелукастом, зафирлукастом и зилейтоном), ингибиторами высвобождения медиаторов (например, кромогликатом и кетонифеном), биологическими регуляторами отклика 1дЕ (например, омализумабом), антигистаминными препаратами (например, цетеризином, циннаризином, фексофенадином) и вазоконстрикторами (например, оксиметазолином, ксилометазолином, нафазолином и трамазолином).

Кроме того, соединение данного изобретения можно вводить в сочетании с неотложными терапевтическими средствами в случае астмы и/или СОРЭ, при этом подобные виды терапии включают в себя введение кислорода или кислородно-гелиевой смеси, распыленный сальбутамол или тербуталин (необязательно в сочетании с антихолинергическими препаратами (например, ипратропием)), системные стероиды (пероральные, или внутривенные, например преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, дексаметазон или гидрокортизон), внутривенный сальбутамол, непрецифические β-агонисты, вводимые путем инъекции или ингаляции (например, эпинефрин, изоэтарин, изопротеренол, метапротеренол), антихолинергические средства (внутривенно или распыленные, например гликопирролат, атропин, ипратропий), метилксантины (теофиллин, аминофиллин, бамифиллин), ингаляционные анестетики, обладающие бронходилатирующим эффектов (например, изофлуран, галотан, энфлуран), кетамин и внутривенный сульфат магния.

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения воспалительной болезни кишечника (ΙΒΌ); конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются глюкокортикоидами (например, преднизоном, будезонидом), синтетическими модифицирующими заболевание иммуномодулирующими агентами (например, метотрексатом, лефлуномидом, сульфазалазином, мезалазином, азатиоприном, 6меркаптопурином и циклоспорином) и биологическими модифицирующими заболевание иммуномодулирующими агентами (например, адалимумабом, ритуксимабом и абатасептом).

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтически агентом для лечения и/или предупреждения системной красной волчанки; конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются модифицирующими заболевание противоревматическими лекарственными средствами (ΌΜΑΚΌ), такими как антималярийные препараты (например, плаквенил, гидроксихлорохин), иммунодепрессантами (например, метотрексат и азатиоприн), циклофосфамидом и микофеноловой кислотой; иммуносуппрессивными лекарственными средствами и анальгетиками, такими как нестероидные противовоспалительные лекарственными препаратами, опиаты (например, декстропропоксифен и ко-кодамол), опиоиды (например, гидрокодон, оксикодон, Μ8 Соийи или метадон) и содержащим фентанил чрескожным пластырем Дюрогезик.

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим

- 13 020111 терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения псориаза; конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются местными видами лечения, такими как растворы для погружения, увлажняющие кремы, лечебные кремы и мази, содержащие каменноугольный деготь, дитранол (антралин), кортикостероиды типа дезоксиметазона (Τορίεοή™), флуоцинонид, аналоги витамина Ό₃ (например, кальципотриол), ретиноиды арганового масла (этретинат, ацитретин, тазаротен), системные курсы лечения, такие как метотрексат, циклоспорин, ретиноиды, тиогуанин, гидроксимочевина, сульфалазин, микофенолятмофетил, азатиоприн, такролимус, эфиры фумаровой кислоты или биопрепараты, такие как Лтсбус™. Ншшга™, Веткабе™, Карйуа™ и устекинумаб (блокатор 1Ь-12 и 1Ь-23). Кроме того, соединение данного изобретения можно вводить в сочетании с другими видами терапии, включающими в себя, но не ограниченными фототерапией или фотохимиотерапией (например, псорален и фототерапия ультрафиолетовыми лучами диапазона А (РИУЛ)).

В совместное введение входят любые способы доставки пациенту двух или более терапевтических агентов как части одного и того же режима лечения, как будет очевидно специалисту в данной области. Несмотря на то что два или более агентов можно вводить одновременно в виде одного препарата, это не существенно. Данные агенты можно вводить в составе различных препаратов и в разное время.

Общие методики синтеза

Общее.

Соединение данного изобретения можно получить из легко доступных исходных веществ с использованием следующих общих способов и методик. Понятно, что в случае, когда приведены типичные или предпочтительные условия способа (например, температура реакции, продолжительность, молярные соотношения реагентов, растворители, давление т.д.), можно также использовать другие условия способа, если не установлено иначе. Оптимальные условия реакции могут изменяться в зависимости от конкретных используемых реагентов или растворителя, но специалист в данной области может определить такие условия путем стандартных способов оптимизации.

Кроме того, для специалистов в данной области будет очевидно, что могут потребоваться стандартные защитные группы, чтобы предотвратить протекание нежелательных реакций с участием некоторых функциональных групп. Выбор подходящей защитной группы для конкретной функциональной группы, а также подходящих условий для защиты и снятия защиты хорошо известен в данной области. Например, многочисленные защитные группы и их введение и удаление описаны у Τ.^. Сгееи апб Р.С.М. \УиК Ргокейуе Сгоирк ίη Огдаше 8уййек1к, \УПеу, Ыете Уогк, 1991 и в приведенных там ссылках.

Следующие способы представлены подробно в отношении получения репрезентативных бициклогетероарилов, которые были перечислены в настоящем описании ранее. Специалист в области органического синтеза может получить соединение данного изобретения из известных или коммерчески доступных исходных веществ и реагентов.

Все реагенты были технического качества и использовались без дополнительной очистки, если не установлено иначе. В реакциях, проводимых в атмосфере инертного газа, использовали коммерчески доступные безводные растворители. Во всех остальных случаях использовали растворители, чистые для анализа, если не указано иначе. Колоночную хроматографию осуществляли на силикагеле 60 (35-70 мкм). Тонкослойную хроматографию проводили на пластинах с предварительно нанесенным силикагелем Е-254 (толщина 0,25 мм). Спектры ¹Н-ЯМР регистрировали на спектрометре Вгикег ΌΡΧ 400 (400 МГц). Химические сдвиги (δ) в спектрах Ή-ЯМР приведены в миллионных долях (м.д.) относительно тетраметилсилана (δ 0,00) или пика остаточного протона соответствующего растворителя, то есть СНС1₃ (δ 7,27) в качестве внутреннего стандарта. Мультиплетность приведена в виде синглета (с), дублета (д), триплета (т), квадруплета (кв), мультиплета (м) и уширенного сигнала (уш). Константы спин-спинового взаимодействия (1) приведены в Гц. Масс-спектры с электроспреевой ионизацией регистрировали на спектрометре Мкготакк р1а1Гогт ЬС/М8. Колонка, используемая для всех анализов методом ВЭЖХ: \Уа1егк Лецийу ИРЬС ВЕН С18 1,7 мкм, 2,1 мм Шх50 мм Ь (№ партии 186002350).

Препаративная ВЭЖХ: \Уа1егк ХВпбде Ргер С18 5 мкм ΟΌΒ 19 мм Шх100 мм Ь (№ партии 186002978). Все методы проводили с использованием градиентов МеСЫ/Н₂О. В Н₂О содержалась либо 0,1% ТФА, либо 0,1% ΝΗ₃.

- 14 020111

Следующее представляет собой список сокращений, используемых в экспериментальной части:

БСМ	Хлористый метилен
ΠΐΡΕΑ	Ν,Ν-диизопропилэтиламин
МеСЫ	Ацетонитрил
ВОС	Трет-бутоксикарбонил
ДМФА	N,N-диметилформамид
Кат.	Каталитическое количество
ТФА	Трифторуксусная кислота
ТГФ	Тетрагидрофуран
ЯМР	Ядерный магнитный резонанс
ДМСО	Диметилсульфоксид
жх-мс	Хроматомасс-спектрометрия
М.д.	Миллионная доля
Ρά/С	Палладий на активированном угле 10%
РМВ	Пара-метоксибензил
РуВОР	Гексафторборат бензотриазол-1илокситрис(пирролидин)фосфония
ЕбОАс	Этилацетат
АРС1	Химическая ионизация при атмосферном давлении
ке	Время удерживания
с	синглет
ущ С	Уширенный синглет
м	мультиплет
мин	минута
Мл	миллилитр
мкл	микролитр
г	грамм
мг	миллиграмм
РйС12дрр£	[1,1'-бис(дифенилфосфин)ферроцен]дихлорпалладий(II)
ТЕА	Триэтиламин
ММР	Матричная металлопротеиназа
ЫНАС	Нормальные хондроциты суставного хряща человека
зЬрнк	Малые РНК, образующие шпильки
РНК	Рибонуклеиновая кислота
Αά-θίΡΗΚ	Кодированная аденовирусом είΡΗΚ
РВЗТ	Физиологический раствор с фосфатным буфером, содержащий Тмееп 3,2 мМ Ма2НРО4, 0,5 мМ КН2РО4, 1,3 мМ КС1,135 мМ ЫаС1,0,05% Τν/еел 20, рН 7,4
АРМА	Ацетат 4-аминофенилртути
ЮМЕМ	Минимальная питательная среда Игла, модифицированная Далбекко
ЕВЗ	Плодная бычья сыворотка
ИСАЕ	Клеточный рецептор аденовируса человека
3-ΜΟΙ	Множественность инфекции, равная 3
άΝΤΡ	Дезоксирибонуклеозидтрифосфат
ОРСК	Количественная полимеразно-цепная реакция
кДНК	Комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
ΟΑΡϋΗ	Глицеральдегид фосфатдегидрогеназа

- 15 020111

Синтез соединения изобретения

Соединение согласно данному изобретению можно получить согласно следующей схеме. Общий способ синтеза.

Схема

ΝΗ-,ΟΗ.ΗΟΙ 'Ργ₂ΝΕΙ ЕЮН/МеОН Δ

-Ι.Κεοα,Ε^Ν 2. ΝΙ-Ц/МеОН

ΟΗ₃ΟΝ, 20 °С [ 20 °С

Аг (5)

ОН

Аг—В⁷

ОН

в которой Аг представляет собой фенил-Ы-гетероциклоалкил, Ь1 является -СО- и гетероциклоалкильная группа необязательно замещена.

Общее.

1.1.1. 1-(б-Бромпиридин-2-ил)-3-карбэтокситиомочевина (2)

(2)

К раствору 2-амино-б-бромпиридина (1) (253,8 г, 1,4б7 моль) в Ό0Μ (2,5 л), охлажденного до 5°С, прибавляют по каплям этоксикарбонилизотиоцианат (173,0 мл, 1,4б7 моль) в течение 15 мин. Затем реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры (20°С) и перемешивают в течение 1б ч. В результате упаривания в вакууме получают твердое вещество, которое можно выделить фильтрованием, тщательно промывают петролейным эфиром (3хб00 мл) и сушат на воздухе, получая (2). Данную тиомочевину можно использовать на следующей стадии как таковую без какой-либо очистки. 'Η (400 МГц, ΟΌΟ1₃) δ 12,03 (1Н, уш.с, ΝΗ), 8,81 (1Н, д, 1=7,8 Гц, Н-3), 8,15 (1Н, уш.с, ΝΗ), 7,б0 (1Н, т, 1=8,0 Гц, Н-4), 7,32 (1Н, дд, 1=7,7 и 0,б Гц, Н-5), 4,31 (2Н, кв, 1=7,1 Гц, СН₂), 1,35 (3Н, т, 1=7,1 Гц, СН₃).

1.1.2. 5-Бром-[1,2,4]триазол[1,5-а]пиридин-2-иламин (3)

К суспензии гидрохлорида гидроксиламина (101,8 г, 1,4б5 моль) в смеси ЕЮН/МеОН (1:1, 900 мл) прибавляют Ν,Ν-диизопропилэтиламин (145,3 мл, 0,879 моль) и перемешивают смесь при комнатной температуре (20°С) в течение 1 ч. После этого прибавляют 1-(б-бромпиридин-2-ил)-3карбэтокситиомочевину (2) (89,0 г, 0,293 моль) и смесь медленно нагревают до кипения с обратным холодильником (примечание: для гашения выделяющегося Н₂§ необходима поглотительная трубка с хлорной известью). После 3 ч при кипении с обратным холодильником смесь оставляют охлаждаться и фильтруют, выделяя выпавший осадок.

Дополнительное количество продукта выделяют в результате упаривания фильтрата в вакууме, добавления Н₂О (250 мл) и фильтрования. Объединенные осадки последовательно промывают Н₂О (250 мл), ЕЮН/МеОН (1:1, 250 мл) и ЕьО (250 мл), затем сушат в вакууме, получая производное триазолпиридина (3) в виде твердого вещества. Данное соединение можно использовать на следующей стадии как таковое без какой-либо очистки. 'Н (400 МГц, ДМСО-б_б) δ 7,43-7,34 (2Н, м, 2хароматический Н), 7,24 (1Н, дд, 1=б,8 и 1,8 Гц, ароматический Н), б,30 (2Н, уш, N^0; т/ζ 213/215 (1:1, М+Н⁴, 100%).

1.1.3. (5-Бром-[1,2,4]триазол[1,5-а]пиридин-2-ил)амид циклопропанкарбоновой кислоты (4)

К раствору 2-аминотриазолпиридина (3) (7,10 г, 33,3 ммоль) в сухом ί.Ή₃ί’Ν (150 мл) при 5°С добавляют Εΐ₃Ν (11,б мл, 83,3 ммоль), после чего добавляют циклопропанкарбонилхлорид (83,3 ммоль). Затем реакционную смесь оставляют нагреваться до температуры окружающей среды и перемешивают до тех пор, пока не израсходуется все исходное вещество (3). При необходимости, для гарантии полного протекания реакции добавляют еще Εΐ₃Ν (4,б4 мл, 33,3 ммоль) и циклопропанкарбонилхлорид (33,3 ммоль). После выпаривания растворителя в вакууме полученный остаток обрабатывают 7н. раствором аммиака в метаноле (50 мл) и перемешивают при температуре окружающей среды (в течение 1-1б ч) для гидролиза какого-либо продукта бис-ацилирования. Выделение продукта проводят, удаляя летучие ве

- 1б 020111 щества в вакууме с последующим растиранием в ЕьО (50 мл). Осадки выделяют фильтрованием, промывают Н₂О (2x50 мл), ацетоном (50 мл) и Е1₂О (50 мл), затем сушат в вакууме, получая требуемое бромпромежуточное соединение (4).

Методика синтеза для получения соединения данного изобретения.

Соединение 1.

Стадия 1. Сочетание по Сузуки

К раствору (5-бром-[1,2,4]триазол[1,5-а]пиридин-2-ил)амида циклопропанкарбоновой кислоты (промежуточное соединение 4, 5 г, 0,018 моль) в смеси 1,4-диоксан/вода (5:1) добавляли 4карбоксифенилбороновую кислоту (3,5 г, 0,021 моль). К раствору добавляли К₂СО₃ (5,0 г, 0,036 моль) и РбСЕбррГ (5%). После этого полученную смесь нагревали традиционным нагреванием на масляной бане при 90°С в течение 16 ч. Добавляли 1 М раствор НС1, и в кислом растворе образовывался осадок. Данный осадок отфильтровывали, сушили в вакууме, получая указанное в заголовке соединение, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Стадия 2. {5-[4-(3,3-Диметилазетидин-1-карбонил)фенил]-[1,2,4]триазол[1,5-а]пиридин-2-ил}амид циклопропанкарбоновой кислоты (соединение 1)

К раствору 4-[2-(циклопропанкарбониламино)-[1,2,4]триазол[1,5-а]пиридин-5-ил]бензойной кислоты (4 г, 0,012 моль) в ОСМ (150 мл) добавляли ΕΌΟ (3,59 г, 0,019 моль), НОВ! (2,53 г, 0,019 моль) и ΌΙРЕА (4,48 мл) при комнатной температуре. Полученную смесь перемешивали в течение 10 мин при комнатной температуре. К раствору добавляли гидрохлоридную соль диметилазетидина (1,64 г, 0,013 моль) и перемешивали смесь в течение 16 ч. К реакционной смеси добавляли воду. Органический слой отделяли и промывали 2н. раствором ЫаОН, 2н. раствором НС1 и водой. Органическую фазу сушили над Мд§О₄, фильтровали и упаривали в вакууме. В результате очистки методом флэш-хроматографии (элюент: от смеси 1:1 петролейный эфир/ЕЮАс до чистого Е(ОАс) получали {5-[4-(3,3-диметилазетидин-1карбонил)фенил]-[1,2,4]триазол[1,5-а]пиридин-2-ил}амид циклопропанкарбоновой кислоты.

Соединение данного изобретения, которое было получено или которое можно получить согласно описанному здесь способу синтеза, приведено ниже в табл. I. Спектральные данные ЯМР соединения изобретения представлены в табл. ΙΙ.

Таблица I Данные масс-спектрометрии соединения изобретения

№ соед.	Структура	Название	М	МС опр.
1	Н °	{5- [4- (3,3диме тилаз етидин-1карбонил)фенил][1,2,4]триазол[1,5а]пиридин-2 -ил}амид циклопропанкарбоновой кислоты	389,46	390,0

Таблица II

Данные ЯМР соединения изобретения

- 17 020111

№ соед.	Данные ЯМР (δ)
1	Рн, ДМСО-ЦЦ 11,01 (1Н, уш, ΝΗ) , 8,08 (2Н, д, АгН), 7,79 (2Н, д, АгН), 7,73 (1Н, д, АгН), 7,72 (1Н, с, АГН) , 7,35 (1Н, дд, АгН), 4,04 (2Н, УШ, СН2) , 3,77 (2Н, уш, СН2), 2,02 (1Н, уш, СН) , 1,27 (6Н, с, 2хСН3) , 0,81 (4Н, м, 2хСН2) .

Биологические примеры. Пример 1. Анализ ίη νίΐΓΟ. Пример 1.1. Анализ ингибирования 1ЛК1.

Рекомбинантную 1ЛК1 человека (каталитический домен, аминокислоты 8бб-1154; номер по каталогу РУ4774) получали от ΙηνίίΓΟ^βη. Инкубировали 1 нг 1ЛК1 с 20 нМ белка и11дк1-1ЛК1(1уг1023) (номер по каталогу Регкт Е1тег ТКЕ0121) в киназном реакционном буфере (25 мМ МОР8 рН б,8, 0,01б% Вгу35, 8,33 мМ МдС1₂, 3,33 мМ ЭТТ. 7 мкМ АТФ) в присутствии или в отсутствие 4 мкл, содержащих тестируемое соединение или разбавитель (ДМСО, 1% конечная концентрация) в общем объеме 20 мкл на белом планшете 384 Ьиттокас (Сгетег, номер по каталогу 781075). Через б0 мин при комнатной температуре реакции останавливали добавлением 20 мкл/лунку детекторной смеси (1хдетекторный буфер (Регкт Е1тег, номер по каталогу СК97-100С), 0,5 нМ европий-анти-фосфотирозина (РТбб) (Регкт Е1тег, номер по каталогу ЛИ00б8), 10 мМ ЭДТА). Считывание осуществляли с использованием Εηνίδίοη при возбуждении при 320 нм и определяя излучение при б15 нм (Регк1н Е1тег). Киназную активность рассчитывали, вычитая относительные единицы флуоресценции (КЕИ), полученные в присутствии положительного контрольного ингибитора (10 мкМ стауроспорин) из КЕИ, полученных в присутствии разбавителя. Способность тестируемого соединения ингибировать данную активность определяли как процент ингибировання=((КЕυ, определенные для образца в присутствии тестируемого соединения - КЕИ, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором), деленное на (КЕИ, определенные в присутствии разбавителя - КЕИ, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором)) -100.

Получали серийные разбавления дозы для соединений, что позволяет тестировать влияние дозаотклик в анализе 1ЛК1 и вычислить 1С₅₀ для данного соединения. Каждое соединение тестировали стандартным образом при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разбавлением 1/5, 8 точек (20 мкМ-4 мкМ-800 нМ-1б0 нМ-32 нМ-б,4 нМ-1,28 нМ-0,2б нМ) при конечной концентрации 1% ДМСО. При повышении эффективности серий соединения готовят дополнительные разбавления и/или снижают верхнюю концентрацию (например, 5, 1 мкМ). Данные представлены в виде средней 1С₅₀ из анализов±средняя квадратическая ошибка среднего значения.

Таблица ΙΙΙ Значения 1С₅₀ соединения для ίΛΙ<1

В’ Соед.	ЦАК1 (нМ)
1	6,6+0,7

Пример 1.2. Анализ на определение К1 1ЛК1.

Для определения К1 с ферментом смешивали различные количества ингибитора и следили за ферментной реакцией как функцией концентрации АТФ. К1 определяли при помощи двойного взаимного графического отображения Кт относительно концентрации соединения (график Вте\уеауег-Вигк). ДАК1 (Ιηνίίτο^η, РУ4774) использовали при конечной концентрации 500 нг/мл. Субстрат представлял собой натриевую соль Ро1у(61и,Туг) (4:1), М.м. 20000-50000 (Б1дта, Р0275). Реакцию проводили в 25 мМ Нерек рН 7,5; 0,01% Т\уеен 20, 10 мМ МдС1₂ при различных концентрациях АТФ и соединения и останавливали добавлением 150 мМ фосфорной кислоты. Определение включенного фосфата в Ро1у6Т субстрата осуществляли, помещая образцы на фильтрующий планшет (с использованием харвестера, Регкт Е1тег) с последующим промыванием. Включенный ³³Р в Ро1уСТ определяют на сцинцилляционном счетчике Торсона! после добавления сцинцилляционной жидкости в фильтрующие планшеты (Регк1н Е1тег).

При тестировании в данном анализе соединения 1 получали значение К1, равное б,9 нМ.

Альтернативным образом, для определения К1 с ферментом смешивали различные количества ингибитора и следили за ферментной реакцией как функцией концентрации АТФ. К1 определяли при помощи двойного взаимного графического отображения Кт относительно концентрации соединения (график Ететеауег-Вигк). В данном анализе использовали 1 нг ДАК1 (ΙηνίΙΐΌ^η, РУ4774). Субстрат представлял собой 50 нМ пептида иНдН-.ТЛК-1 (Туг1023) (Регк1н Е1тег, ТКЕ0121). Реакцию проводили в 25 мМ МОР8 рН б,8, 0,01%, 2 мМ ИТТ, 5 мМ МдС1₂ Вгу-35 при различных концентрациях АТФ и соединения. Фосфорилированный субстрат определяли с использованием Еи-меченного антифосфотирозинового антитела РТбб (Регк1н Е1тег, ЛИ00б8). Считывание осуществляли при помощи Епуыоп (Регк1н Е1тег) при возбуждении при 320 нм и последующем излучении при б15 и бб5 нм.

- 18 020111

При тестировании в данном анализе соединения 1 получали значение К1, равное 5,6 нМ.

Пример 1.3. Анализ ингибирования 1АК2.

Рекомбинантную 1АК2 человека (каталитический домен, аминокислоты 866-1154; номер по каталогу РУ4210) получали от 1пуйгодеп. Инкубировали 0,0125 тИ 1АК2 с 25 нМ пептида и11дЬ(-ЛАК1((уг1023) (номер по каталогу Регкт Е1тег ТКР0121) в киназном реакционном буфере (41,66 мМ НЕРЕ8 рН 7,0, 0,016% Тгйоп Х-100, 12,5 мМ МдС1₂, 3,33 мМ ΌΤΤ, 7,5 мкМ АТФ) в присутствии или в отсутствие 4 мкл, содержащих тестируемое соединение или разбавитель (ДМСО, 1% конечная концентрация) в общем объеме 20 мкл на белом планшете 384 Ьиттойас (Стешет, номер по каталогу 781075). Через 60 мин при комнатной температуре реакции останавливали добавлением 20 мкл/лунку детекторной смеси (1хдетекторный буфер (Регкт Е1тег, номер по каталогу СК97-100С), 0,5 нМ европий-антифосфотирозина (РТ66) (Регк1и Е1тег, номер по каталогу АЭ0068). 10 мМ ЭДТА. Считывание осуществляли с использованием Епу18юп при возбуждении при 320 нм и определяя излучение при 615 нм (Регк1и Е1тег). Киназную активность рассчитывали, вычитая относительные единицы флуоресценции (КРИ), полученные в присутствии положительного контрольного ингибитора (10 мкМ стауроспорин) из КРИ, полученных в присутствии разбавителя. Способность тестируемого соединения ингибировать данную активность определяли как процент ингибирования=((КРи, определенные для образца в присутствии тестируемого соединения - КРИ, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором), деленное на (КРИ, определенные в присутствии разбавителя - КРИ, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором)) -100.

Получали серийные разбавления дозы для соединений, что позволяет тестировать влияние дозаотклик в анализе 1АК2 и вычислить 1С₅₀ для данного соединения. Каждое соединение тестировали стандартным образом при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разбавлением 1/5, 8 точек (20 мкМ-4 мкМ-800 нМ-160 нМ-32 нМ-6,4 нМ-1,28 нМ-0,26 нМ) при конечной концентрации 1% ДМСО. При повышении эффективности серий соединения готовят дополнительные разбавления и/или снижают верхнюю концентрацию (например, 5, 1 мкМ). Данные представлены в виде средней 1С₅₀ из анализов±средняя квадратическая ошибка среднего значения.

Таблица IV Значения 1С₅₀ соединения для 1АК2

№ соед.	ЦАК2 (нМ)
1	67±5

Пример 1.4. Анализ на определение К1 1АК2.

Для определения К1 с ферментом смешивали различные количества ингибитора и следили за ферментной реакцией как функцией концентрации АТФ. К1 определяли при помощи двойного взаимного графического отображения Кт относительно концентрации соединения (график Ьтетеауег-Вигк). В данном анализе использовали 0,025 тИ 1АК2 (1пуйгодеп, РV4210). Субстрат представлял собой натриевую соль Ро1у(С1и,Туг) (4:1), М.м. 20000-50000 (81дта, Р0275). Реакцию проводили в 10 мМ МОР8 рН 7,5, 0,5 мМ ЭДТА, 0,01% Вгу-35, 1 мМ ΌΤΤ, 15 мМ МдАс при различных концентрациях АТФ и соединения и останавливали добавлением 150 мМ фосфорной кислоты. Определение включенного фосфата в Ро1уСТ субстрата осуществляли, помещая образцы на фильтрующий планшет (с использованием харвестера, Регкт Е1тег) с последующим промыванием. Включенный ³³Р в Ро1уСТ определяют на сцинцилляционном счетчике Торсоип! после добавления сцинцилляционной жидкости в фильтрующие планшеты (Регкт Е1тег).

При тестировании в данном анализе соединения 1 получали значение К1, равное 126 нМ.

Альтернативным образом, для определения К1 с ферментом смешивали различные количества ингибитора и следили за ферментной реакцией как функцией концентрации АТФ. К1 определяли при помощи двойного взаимного графического отображения Кт относительно концентрации соединения (график Ыпе^еауег-Вцгк). В данном анализе использовали 0,0125 тИ 1АК2 (1пуйтодеп, РV4210). Субстрат представлял собой 50 нМ пептида υ1ίβ1ιΙ-ΙΛΙ<-1 (Туг1023) (Регкт Е1тег, ТКР0121). Реакцию проводили в 25 мМ НЕРЕ8 рН 7,0, 0,01% Тгйоп Х-100, 2 мМ ОТТ, 7,5 мМ МдС1₂ при различных концентрациях АТФ и соединения. Фосфорилированный субстрат определяли с использованием Еи-меченного антифосфотирозинового антитела РТ66 (Регкт Е1тег, А00068). Считывание осуществляли при помощи Епизюп (Регкт Е1тег) при возбуждении при 320 нм и последующем излучении при 615 и 665 нм.

При тестировании в данном анализе соединения 1 получали значение К1, равное 35 нМ.

Пример 1.5. Анализ ингибирования 1АК3.

Каталитический домен рекомбинантной 1АК3 человека (аминокислоты 781-1124; номер по каталогу РV3855) получали от 1пуйгодеп. Инкубировали 0,025 МИ 1АК3 с 2,5 мкг субстрата ро1уСТ (номер по каталогу 81дта Р0275) в киназном реакционном буфере (25 мМ Тт рН 7,5, 0,5 мМ ЕСТА, 0,5 мМ NазVО₄, 5 мМ Ь-глицеринфосфата, 0,01% Тгйоп Х-100, 1 мкМ нерадиоактивного АТФ, 0,25 мкКи ³³Ргамма-АТФ (СЕ Неа11йсате, номер по каталогу АН9968) конечные концентрации)) в присутствии или в отсутствие 5 мкл, содержащих тестируемое соединение или разбавитель (ДМСО, 1% конечная концен

- 19 020111 трация) в общем объеме 25 мкл в полипропиленовом 9б-луночном планшете (Сгетег, У-образное дно). Через 105 мин при 30°С реакции останавливали добавлением 25 мкл/лунку 150 мМ фосфорной кислоты. Все остановленные киназные реакционные смеси переносили в предварительно промытые (75 мМ фосфорной кислотой) 9б-луночные фильтрующие планшеты (Регкш Е1тег, номер по каталогу 6005177) с использованием клеточного харвестера (Регкш Е1тег). Планшеты б раз промывали раствором 75 мМ фосфорной кислоты в количестве 300 мкл на лунку и плотно закрывали дно планшетов. Добавляли 40 мкл/лунку М1сго8С1иЗ-20, плотно закрывали верх планшетов и осуществляли считывание данных с использованием ТорсоииЗ (Регкш Е1тег). Активность киназы рассчитывали, вычитая количество подсчетов в 1 мин (срт), полученных в присутствии положительного контрольного ингибитора (10 мкМ стауроспорина), из срт, полученных в присутствии разбавителя. Способность тестируемого соединения ингибировать данную активность определяли как процент ингибирования=((срт, определенные для образца в присутствии тестируемого соединения - срт, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором), деленное на (срт, определенные в присутствии разбавителя - срт, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором)) -100.

Получали серийные разбавления дозы для соединения, что позволяет тестировать влияние дозаотклик в анализе .ΤΑΚ3 и вычислить 1С₅₀ для данного соединения. Каждое соединение тестировали стандартным образом при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разбавлением 1/3, 8 точек (20 мкМ-б,б7 мкМ-2,22 мкМ-740 нМ-247 нМ-82 нМ-27 нМ-9 нМ) при конечной концентрации 1% ДМСО. При повышении эффективности серий соединения готовят дополнительные разбавления и/или снижают верхнюю концентрацию (например, 5, 1 мкМ). Данные представлены в виде средней 1С₅₀ из анализов±средняя квадратическая ошибка среднего значения.

Таблица V Значения 1С₅₀ соединения для ΙΑΚ3

№ соед.	ДАКЗ (нМ)
1	408±62

Пример 1.б. Анализ на определение Κι ΙΑΚ3.

Для определения Κί с ферментом смешивали различные количества ингибитора и следили за ферментной реакцией как функцией концентрации АТФ. Κί определяли при помощи двойного взаимного графического отображения относительно концентрации соединения (график Ьтетеауег-Вигк). ίΑΚ3 (Сагпа В1О8С1еисе8, 09СВ8-0б25В) использовали при конечной концентрации 10 мг/мл. Субстрат представлял собой натриевую соль Ро1у(С1и,Туг) (4:1), М.м. 20000-50000 (81дша, Р0275). Реакцию проводили в 25 мМ Тп8 рН 7,5, 0,01% ТгПоп Х-100, 0,5 мМ ЕСТА, 2,5 мМ ΌΤΤ, 0,5 мМ Ыа₃УО₄, 5 мМ Ьглицеринфосфота, 10 мМ МдС1₂ при различных концентрациях АТФ и соединения и останавливали добавлением 150 мМ фосфорной кислоты. Определение включенного фосфата в Ро1уСТ субстрата осуществляли, помещая образцы на фильтрующий планшет (с использованием харвестера, Регкш Е1тег) с последующим промыванием. Включенный ³³Р в Ро1уСТ определяют на сцинцилляционном счетчике ТорсошИ после добавления сцинцилляционной жидкости в фильтрующие планшеты (Регкш Е1тег).

При тестировании в данном анализе соединения 1 получали значение Κί, равное 188 нМ.

Пример 1.7. Анализ ингибирования ТУК.2.

Каталитический домен рекомбинантной ТУ1<2 человека (аминокислоты 871-1187; номер по каталогу 08-147) получали от Сагпа Вювшепсев. Инкубировали 5 нг ТУК.2 с 12,5 мкг субстрата ро1уСТ (номер по каталогу 81дта Р0275) в киназном реакционном буфере (25 мМ НЕРЕ8 рН 7,5, 100 мМ ЫаС1, 0,2 мМ Ыа₃УО₄, 0,1% №-40, 0,1 мкМ нерадиоактивного АТФ, 0,125 мкКи ³³Р-гамма-АТФ (СЕ НеаИЪсаге, номер по каталогу АН99б8) конечные концентрации)) в присутствии или в отсутствие 5 мкл, содержащих тестируемое соединение или разбавитель (ДМСО, 1% конечная концентрация) в общем объеме 25 мкл в полипропиленовом 9б-луночном планшете (Сгетег, У-образное дно). Через 90 мин при 30°С реакции останавливали добавлением 25 мкл/лунку 150 мМ фосфорной кислоты. Все остановленные киназные реакционные смеси переносили в предварительно промытые (75 мМ фосфорной кислотой) 9б-луночные фильтрующие планшеты (Регкш Е1тег, номер по каталогу б005177) с использованием клеточного харвестера (Регкш Е1тег). Планшеты б раз промывали раствором 75 мМ фосфорной кислоты в количестве 300 мкл на лунку и плотно закрывали дно планшетов. Добавляли 40 мкл/лунку Мюго8СШ1-20, плотно закрывали верх планшетов и осуществляли считывание данных с использованием ТорсошИ (Регкш Е1тег). Активность киназы рассчитывали, вычитая количество подсчетов в 1 мин (срт), полученных в присутствии положительного контрольного ингибитора (10 мкМ стауроспорина), из срт, полученных в присутствии разбавителя. Способность тестируемого соединения ингибировать данную активность определяли как процент ингибирования=((срт, определенные для образца в присутствии тестируемого соединения - срт, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором), деленное на (срт, определенные в присутствии разбавителя - срт, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором))-100.

Получали серийные разбавления дозы для соединения, что позволяет тестировать влияние доза

- 20 020111 отклик в анализе ΤΥΚ2 и вычислить 1С₅₀ для данного соединения. Каждое соединение тестировали стандартным образом при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разбавлением 1/3, 8 точек (20 мкМ-б,б7 мкМ-2,22 мкМ-740 нМ-247 нМ-82 нМ-27 нМ-9 нМ) при конечной концентрации 1% ДМСО. При повышении эффективности серий соединения готовят дополнительные разбавления и/или снижают верхнюю концентрацию (например, 5, 1 мкМ). Данные представлены в виде средней 1С₅₀ из анализов±средняя квадратическая ошибка среднего значения.

Таблица VI Значения ΤΥΚ2 1С₅₀ для соединения

№ соед.	ΤΥΚ2 (нМ)
1	219±37

Пример 2. Клеточные анализы.

Пример 2.1. Анализ передачи сигнала 1АК-8ТАТ.

Клетки НеЬа выдерживали в минимальной питательной среде Игла, модифицированной Далбекко (ΌΜΕΜ), содержащей 10% инактивированной нагреванием плодной телячьей сыворотки, 100 и/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки НеЬа использовали при 70% слиянии для трансфекции. 20000 клеток в 87 мкл среды клеточной культуры быстро трансфицировали 40 нг репортера р8ТАТ1(2)люциферазы, 8 нг репортера Ьас2 в качестве внутреннего контрольного репортера и 52 нг рВ8К с использованием 0,32 мкл 1е1-РЕ1 (Ро1ур1и§) в качестве реагента трансфекции на лунку в формате 9блуночного планшета. После инкубации в течение ночи при 37°С в присутствии 10% СО₂ трансфекционную среду удаляли. Добавляли 75 мкл ΌΜΕΜ и 1,5% инактивированной нагреванием плодной телячьей сыворотки. В течение б0 мин добавляли 15 мкл соединения в концентрации хб,7, а затем 10 мкл О8М человека (Рерго1есй) в конечной концентрации 33 нг/мл.

Все соединения тестировали по два раза, начиная с 20 мкМ с последующим серийным разбавлением 1/3, в целом 8 доз (20 мкМ-б,б мкМ-2,2 мкМ-740 нМ-250 нМ-82 нМ-27 нМ-9 нМ) при конечной концентрации 0,2% ДМСО.

После инкубации в течение ночи при 37°С в присутствии 10% СО₂ клетки лизировали в 100 мкл лизисного буфера/лунку (РВ8, 0,9 мМ СаС1₂, 0,5 мМ МдС1₂, 5% трегалозы, 0,025% тергитола ΝΓ9. 0,15% В8А).

мкл клеточного лизата использовали для считывания активности β-галактозидазы при добавлении 180 мкл раствора (Юа1 (30 мкл О№6 4 мг/мл и 150 мкл β-галактозидазного буфера (0,0б М №₂НРО₄, 0,04 М NаН₂РО₄, 1 мМ МдС1₂)) в течение 20 мин. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М №ьС.'О₃. Поглощение считывали при 405 нм.

Активность люциферазы определяли при использовании 40 мкл клеточного лизата и 40 мкл 81еа4у1йе®, как описано производителем (Регкш Е1тег), при помощи Επνίβίοη (Регкт Е1тег).

мкМ ингибитора раи-1АК использовали в качестве положительного контроля (100% ингибирования). В качестве отрицательного контроля использовали 0,5% ДМСО (0% ингибирования). Положительный и отрицательный контроль использовали для расчета значений ζ' и ''процента ингибирования (ΗΝ).

Процент ингибирования=((флуоресценция, определенная в присутствии разбавителя - флуоресценция, определенная для образца в присутствии тестируемого соединения), поделить на (флуоресценцию, определенную в присутствии разбавителя флуоресценция, определенную для образца в отсутствие триггера))-100.

Значения ΓΙΝ наносили на график для тестированных соединений в виде зависимости доза-отклик и получали значения ЕС₅₀.

Таблица VII

Значения ЕС₅₀ соединения при передаче сигнала 8ТАТ

№ соед.	ЕСзо (нМ)
1	539±130

Пример 2.2. Анализ передачи сигнала О8МЛЬ-1в.

Было показано, что О8М и ГЬ-1 β проявляют синергетическую апрегуляцию уровня ММР13 в клеточной линии хондросаркомы человека 8А11353. Клетки высевали в 9б-луночные планшеты в количестве 15000 клеток/лунку в объеме 120 мкл ЭМЕМ (ШуИгодеи), содержащей 10% (об./об.) БВ8 и 1% смеси пенициллин/стрептомицин (Шуйгодеи), инкубируемой при 37°С и 5% СО₂. Клетки предварительно инкубировали в присутствии 15 мкл соединения в среде М199, содержащей 2% ДМСО в течение 1 ч перед запуском при помощи 15 мкл О8М и ЕБ-1в, достигая 25 нг/мл О8М и 1 нг/мл ГБ-1 β, и определяли концентрацию ММР13 в кондиционированной среде в течение 48 ч после запуска. Активность ММР13 определяли с использованием анализа активности захвата антитела. Для этого на 384-луночные планшеты (ΝϋΝ^ 4б0518 Мах18огЬ черный) наносили покрытие 35 мкл 1,5 мкг/мл раствора анти-человеческого антитела ММР13 (Β&Ό 8у51ет5, МАВ511) в течение 24 ч при 4°С. После промывания лунок 2 раза смесью РВ8 и 0,05% Тгееи оставшиеся сайты связывания блокировали 100 мкл 5% нежирного сухого моло

- 21 020111 ка (8айа Сгих. 50-2325. Βίοΐΐο) в РВ8 в течение 24 ч при 4°С. Затем лунки промывали 2 раза смесью РВ8 и 0,05% Ттеееп и добавляли 35 мкл супернатанта культуры в разбавлении 1/10, содержащего ММР13 в блокирующем буфере со 100-кратным разбавлением, и инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем лунки дважды промывали смесью РВ8 и 0,05% Ттеееп с последующей активацией ММР13 при добавлении 35 мкл 1,5 мМ ацетата 4-аминофенилртути (АРМА) (81дта, А9563) и инкубировании при 37°С в течение 1 ч. Лунки вновь промывали смесью РВ8 и 0,05% Ттеееп и добавляли 35 мкл субстрата ММР13 (В1ото1, Р-126, флуорогенный субстрат ОтшММР). После инкубирования в течение 24 ч при 37°С определяли флуоресценцию трансформированного субстрата при помощи приборасчетчика Регк1п Е1тег \Уа11ас Εηνίδίοη 2102 Ми1111аЬе1 Веабег (длина волны возбуждающего света: 320 нм, длина волны излучаемого света: 405 нм).

Процент ингибирования=((флуоресценция, определенная в присутствии разбавителя - флуоресценция, определенная для образца в присутствии тестируемого соединения), поделить на (флуоресценцию, определенную в присутствии разбавителя флуоресценция, определенную для образца в отсутствие триггера))-100.

Данные выражены в виде среднего ЕС₅₀ из анализов±средняя квадратическая ошибка среднего значения.

Таблица VIII Значения ЕС₅₀ ММР13 соединения

№ соед.	ес50 (нМ)
1	4196±2370

Пример 2.3. Анализ пролиферации РВЬ.

Лимфоциты периферической крови человека (РВЬ) стимулировали 1Ь-2 и определяли пролиферацию с использованием анализа на встраивание ВгйИ. Сначала РВЬ стимулировали в течение 72 ч РНА для индуцирования рецептора 1Ь-2, выдерживали без питания в течение 24 ч, чтобы остановить пролиферацию клеток, затем стимулировали 1Ь-2 еще в течение 72 ч (включая 24-часовое введение метки в ВгбИ). Клетки преинкубировали с тестируемыми соединениями в течение 1 ч перед добавлением 1Ь-2. Клетки выращивали в РРМ1 1640, содержащей 10% (об./об.) ЕВ8.

Пример 2.4. Анализ цельной крови (\УВА).

2.4.1. Протокол стимуляции ΙΕΝα.

Для прогноза селективности тестируемых соединений в отношении ингибирования 1АК1- по сравнению с 1АК2-зависимыми путями передачи сигнала ίη νίνο была создана физиологически релевантная модель ίη νίίτο с использованием цельной крови человека. В анализе \УВА кровь, взятую у людейдобровольцев, давших информированное согласие, обрабатывали ех νίνο соединением (11), а затем стимулировали либо в течение 30 мин интерфероном (ΙΕΝα, 1АК1-зависимый путь передачи сигнала), либо в течение 2 ч гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (6М-С8Р, 1АК2зависимый путь передачи сигнала).

2.4.1.1. Анализ фосфо-8ТАТ1.

При стимуляции ΙΕΝα увеличение фосфорилирования передатчиков сигнала и активаторов транскрипции 1 (р8ТАТ1) под действием ΙΕΝα в экстрактах белых кровяных клеток определяли при помощи анализа р8ТАТ1 ЕЫ8А. Фосфорилирование передатчика сигнала и активаторов транскрипции 1 (8ТАТ1) после инициирования интерфероном альфа (ΙΕΝα) представляет собой 1АК1-опосредованное событие. Анализ фосфо-8ТАТ1, который использовали для определения уровня фосфо-8ТАТ1 в экстрактах клеток, разрабатывали для того, чтобы оценить способность соединения ингибировать 1АК1-зависимые пути передачи сигнала.

Цельную человеческую кровь, взятую у людей-добровольцев, давших информированное согласие, обрабатывали ех νίνο соединением (11), а затем стимулировали в течение 30 мин ΙΕΝα. Увеличение фосфорилирования 8ТАТ1 под действием ΙΕΝα в экстрактах белых кровяных клеток определяли при помощи анализа фосфо-8ТАТ1 ЕЫ8А.

АСК-лизисный буфер включал в себя 0,15 М ИН₄С1, 10 мМ КНСО₃, 0,1 мМ ЭДТА. рН буфера составлял 7,3.

10-кратный концентрат клеточного лизисного буфера (часть набора для иммуноферментного анализ ЕЫ8А сэндвич-типа Ра1118сан Р1ю5р1ю-8ТАТ1 (Туг701) от Се11 δί^ηπΕη^) разбавляли в 10 раз Н₂О. Перед использованием в буфер добавляли ингибиторы протеиназы.

мкг ΙΕΝα растворяли в 40 мкл Н₂О, получая 500 мкг/мл исходного раствора. Данный исходный раствор хранили при -20°С.

Готовили 3-кратные серийные разбавления соединения в ДМСО (максимальная концентрация: 10 мМ). Затем данное соединение дополнительно разбавляли средой (фактор разбавления зависит от требуемой конечной концентрации соединения).

2.4.1.1.1. Инкубирование крови с соединением и стимуляция ΙΕΝα.

Человеческую кровь собирали в гепаринизированные пробирки. Данную кровь делили на аликвоты

- 22 020111 по 392 мкл. Затем к каждой аликвоте добавляли 4 мкл разбавления соединения и инкубировали пробы крови в течение 1 ч при 37°С. Исходный раствор ΙΡΝα разбавляли в 1000 раз средой КРМ1, получая 500 нг/мл рабочего раствора. К пробам крови добавляли 4 мкл 500 нг/мл рабочего раствора (конечная концентрация ΙΡΝη: 5 нг/мл). Пробы инкубировали при 37°С в течение 30 мин.

2.4.1.1.2. Получение экстрактов клеток.

В конце периода стимуляции к пробам крови добавляли 7,6 мл буфера АСК для лизирования красных кровяных клеток. Пробы перемешивали, переворачивая пробирки пять раз, и инкубировали реакционную смесь на льду в течение 5 мин. В процессе данного инкубирования лизис ВВС должен был быть очевидным. Клетки осаждали центрифугированием при 300 д, 4°С в течение 7 мин и удаляли супернатант. В каждую пробирку добавляли 10 мл 1хРВ8 и повторно суспендировали осадок после центрифугирования. Пробы вновь центрифугировали при 300 д, 4°С. Супернатант удаляли и вновь суспендировали осадок после центрифугирования в 500 мкл 1хРВ8. Затем клеточную суспензию переносили в чистую пробирку для микроцентрифугирования на 1,5 мл. Клетки осаждали центрифугированием при 700 д в течение 5 мин при 4°С. Супернатант удаляли и растворяли осадок в 150 мкл клеточного лизисного буфера. Пробы инкубировали на льду в течение 15 мин. После этого пробы хранили при -80°С до дальнейшей обработки.

2.4.1.1.3. Определение фосфорилирования 8ТАТ1 методом ЕЫ8А.

Для определения уровня фосфо-8ТАТ1 использовали набор для иммуноферментного анализ ЕЫ8Л сэндвич-типа РаИ8саи Р1ю5р1ю-8ТЛТ1 (Туг701) от Се11 81диа11ид (по каталогу № 7234).

Экстракты клеток размораживали на льду. Пробирки цетрифугировали в течение 5 мин при 16000 д, 4°С и получали просветленные лизаты. В то же время микролуночные полоски из набора приводили в равновесие при комнатной температуре и готовили промывной буфер, разбавляя промывной буфер 20хН₂О. Пробы разбавляли в 2 раза разбавителем проб и добавляли 100 мкл в микролуночные полоски. Полоски инкубировали в течение ночи при 4°С.

На следующий день лунки 3 раза промывали промывным буфером. В лунки добавляли 100 мкл детекторного антитела. Полоски инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Затем лунки снова 3 раза промывали промывным буфером. В каждую лунку добавляли 100 мкл НВР-связанного вторичного антитела и инкубировали пробы при 37°С. Через 30 мин лунки снова промывали 3 раза и во все лунки добавляли 100 мкл субстрата ТМВ. Когда цвет проб изменялся на синий, для остановки реакции добавляли 100 мкл 8ТОР-раствора. Поглощение измеряли при 450 нм.

2.4.1.2. ЕЫ8А 1Ь-8.

При стимуляции ОМ-С8Р повышение концентрации интерлейкина-8 (1Ь-8) в плазме крови определяли при помощи анализа 1Ь-8 методом ЕЬ18А. Индуцированная экспрессия 1Ь-8 гранулоцитарномакрофагальным колониестимулирующим фактором (ОМ-С8Р) представляет собой 1АК2опосредованное событие. ЕЬ18А 1Ь-8, который можно использовать для определения концентрации 1Ь-8 в образцах плазмы, разрабатывали для того, чтобы оценить способность соединения ингибировать 1АК2зависимые пути передачи сигнала.

Цельную человеческую кровь, взятую у людей-добровольцев, давших информированное согласие, обрабатывали ех νίνο соединением (1и), а затем стимулировали в течение 2 ч ОМ-С8Р. Увеличение концентрации 1Ь-8 в плазме крови определяли методом ЕЬ18А 1Ь-8.

мкг ОМ-С8Р растворяли в 100 мкл Н₂О, получая 100 мкг/мл исходного раствора. Данный исходный раствор хранили при -20°С.

Готовили 3-кратные серийные разбавления тестируемого соединения в ДМСО (максимальная концентрация: 10 мМ). Затем данное соединение дополнительно разбавляли средой (фактор разбавления зависит от требуемой конечной концентрации соединения).

2.4.1.2.1. Инкубирование крови с соединением и стимуляция ОМ-С8Р.

Человеческую кровь собирали в гепаринизированные пробирки. Данную кровь делили на аликвоты по 245 мкл. Затем к каждой аликвоте добавляли 2,5 мкл разбавления соединения и инкубировали пробы крови в течение 1 ч при 37°С. Исходный раствор ОМ-С8Р разбавляли в 100 раз средой ВРМ1, получая 1 мкг/мл рабочего раствора. К пробам крови добавляли 2,5 мкл 1 мкг/мл рабочего раствора (конечная концентрация ОМ-С8Р: 10 нг/мл). Пробы инкубировали при 37°С в течение 2 ч.

2.4.1.2.2. Получение образцов плазмы.

Пробы центрифугировали в течение 15 мин при 1000 д, 4°С.

Получали 100 мкл плазмы и хранили при -80°С до дальнейшего использования.

2.4.1.2.3. Определение концентрации 1Ь-8 методом ЕЫ8А.

Для определения концентрации 1Ь-8 использовали набор для хемилюминесцентного иммуноферментного анализа 1Ь-8 человека от Β&Ό 8у51ет5 (по каталогу № 08000В).

Промывной буфер готовили, разбавляя промывной буфер 10хН₂О. Рабочий О1о-реагент получали, добавляя 1 часть О1о-реагента 1 к 2 частям О1о-реагента В в течение от 15 мин до 4 ч перед использованием.

В каждую лунку добавляли 100 мкл разбавителя анализа ΚΟΙ-86. После этого добавляли 50 мкл об

- 23 020111 разца (плазмы). ЕЬ18А-планшет инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре, 500 об/мин. Все лунки 4 раза промывали промывным буфером и в каждую лунку добавляли 200 мкл конъюгата 1Ь-8. После инкубирования в течение 3 ч при комнатной температуре лунки 4 раза промывали промывным буфером и добавляли в каждую лунку 100 мкл рабочего С1о-реагента. ЕЬ18А-планшет инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре (защищали от света). Измеряли люминесценцию (время считывания 0,5 с/лунку).

2.4.1.4. Результаты.

р1С₅₀ соединения 1 при ингибировании ΙΝΡα-вызванного повышения концентрации р8ТАТ1 составило 6,32±0,07 (8ЕМ), тогда как р1С₅₀ при ингибировании СМ-С8Г-вызванного повышения 1Ь-8 составило 4,87±0,13 (8ЕМ) (результаты получены при использовании 6 доноров крови). Это показывает, что соединение 1 в 28 раз более селективно в отношении 1АК1-пути. чем в отношении 1АК2-пути. Следовательно, в клеточном окружении понятно, что соединение 1 проявляет селективность в отношении 1АК1 по сравнению с 1АК2. По-видимому, соединение 1 проявляет большую селективность в отношении 1АК1, чем в отношении 1АК2, по сравнению с известными структурно родственными соединениями или другими известными ингибиторами 1АК.

2.4.1.3. Обработка данных лечения и результаты.

С целью дальнейшего уточнения результатов данные ингибирования индукции фосфо-8ТАТ1 под действием ΙΝΡα в экстрактах клеток или ингибирования индукции 1Ь-8 под действием СМ-С8Р в плазме наносили на график относительно концентрации соединения и получали значения 1С₅₀ при использовании программного обеспечения СгарНраб. Данные сохранялись, если Я² превышал 0,8 и наклон горба был меньше 3, и сохраняли только тех доноров, для которых в обоих анализах получали достоверные данные.

Например, при представлении в данный дополнительный протокол анализа данных определенная р1С₅₀ соединения 1 в случае ингибирования вызванного ΙΝΡα повышения концентрации р8ТАТ1 составляла 6,21±0,09 (8ЕМ), тогда как р1С₅₀ в случае ингибирования 6М-С8Р-вызванного повышения 1Ь-8 составило 4,97±0,14 (8ЕМ) (результаты получены при использовании 6 доноров крови). Это подтверждает то, что соединение 1 в 17,6 раз более селективно в отношении 1АК1-пути, чем в отношении 1АК2-пути. Следовательно, в клеточном окружении понятно, что соединение 1 проявляет селективность в отношении 1АК1 по сравнению с 1АК2. По-видимому, соединение 1 проявляет большую селективность в отношении 1АК1, чем в отношении 1АК2, по сравнению с известными структурно родственными соединениями или другими известными ингибиторами 1АК.

2.4.2. Протокол стимуляции 1Ь-6.

Для установления селективности соединения в отношении 1АК1 по сравнению с 1АК2 был также проведен проточный цитометрический анализ ех νίνο с использованием человеческой цельной крови. Таким образом, кровь брали у людей-добровольцев, давших информированное согласие. После этого кровь приводили в равновесие в течение 30 мин при 37°С при осторожном качании, затем отбирали аликвоты в пробирки Эппендорфа. Добавляли соединение в различной концентрации и инкубировали при 37°С в течение 30 мин, а затем стимулировали в течение 20 мин при 37°С при осторожном качании интерлейкином 6 (1Ь-6) для стимуляции 1АК1-зависимого пути или СМ-С8Р для стимуляции 1АК2зависимого пути. После этого проводили оценку фосфо-8ТАТ1 и фосфо-8ТАТ5 при использовании анализа РАС8.

2.4.2.1. Анализы фосфо-8ТАТ1.

В случае 1Ь-6-стимулированного увеличения фосфорилирования переносчиков сигнала и активаторов транскрипции 1 (р8ТАТ1) в белой кровяной клетке человеческую цельную кровь, полученную у людей-добровольцев, которые дали информированное согласие, обрабатывали ех νίνο соединением в течение 30 мин, а затем стимулировали в течение 20 мин 1Ь-6. Увеличение фосфорилирования 8ТАТ1 под действием 1Ь-6 в лимфоцитах определяли с использованием анти-фосфо-8ТАТ1 антитела при помощи РАС8.

5-кратный буфер Ьу8е/Г1х (ΒΌ ΡΙιοΜΙολν, по каталогу № 558049) разбавляли в 5 раз дистиллированной водой и предварительно нагревали при 37°С. Оставшийся разбавленный Ьуке/Нх буфер отбрасывали.

мкг гЫЬ-6 (Я&Э 8у51ет5, по каталогу № 206-1Я) растворяли в 1 мл РВ8 0,1% В8А, получая 10 мкг/мл исходного раствора. Данный исходный раствор хранили в виде аликвот при -80°С.

Готовили 3-кратное серийное разбавление соединения в ДМСО (10 мМ исходного раствора). В образцы, обработанные контрольным веществом, добавляли ДМСО вместо соединения. Все образцы инкубировали при 1% конечной концентрации ДМСО.

2.4.2.1.1. Инкубирование крови с соединением и стимуляция действием 1Ь-6.

Человеческую кровь собирали в гепаринизированные пробирки. Данную кровь делили на аликвоты по 148,5 мкл. Затем к каждой аликвоте добавляли 1,5 мкл разбавления соединения и инкубировали пробы крови в течение 30 мин при 37°С при осторожном качании. К пробам крови добавляли исходный раствор 1Ь-6 (1,5 мкл) (конечная концентрация 10 нг/мл) и инкубировали пробы при 37°С в течение 20 мин

- 24 020111 при осторожном качании.

2.4.2.1.2. Препарат белых кровяных клеток и введение метки СЭ4.

В конце периода стимулирования 3 мл 1-кратного предварительно нагретого буфера Ьуке-Их мгновенно добавляли в пробы крови, недолгое время перемешивали вращением и инкубировали в течение 15 мин при 37°С на водяной бане, чтобы лизировать красные кровяные клетки и фиксировать лейкоциты, затем замораживали при -80°С до дальнейшего использования.

Для следующих стадий пробирки размораживали при 37°С в течение приблизительно 20 мин и центрифугировали в течение 5 мин при 400 д при 4°С. Осадок после центрифугирования промывали 3 мл холодного 1хРВ8 и после центрифугирования клеточный осадок повторно суспендировали в 100 мкл РВ8, содержащем 3% В8А. Добавляли НТС-конъюгированное анти-СО4 антитело или контрольное НТС-конъюгированное изотопное антитело и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, в темноте.

2.4.2.1.3. Пермеабилизация клеток и введение метки анти-фосфо-8ТАТ1 антителом.

После промывания клеток 1хРВ8 клеточный осадок повторно суспендировали в 100 мкл ледяного 1хРВ8 и добавляли 900 мкл ледяного 100%-ного метанола. Затем клетки инкубировали при 4°С в течение 30 мин для пермеабилизации.

После этого пермеабилизованные клетки промывали 1хРВ8, содержащим 3% В8А и, наконец, повторно суспендировали в 80 мкл 1хРВ8, содержащем 3% В8А.

Добавляли и перемешивали 20 мкл РЕ мышиного анти-8ТАТ1 (ρΥ701) или РЕ мышиного 1дО2аК изотопного контрольного антитела (ВО Вюкшепсек, по каталогу №№ 612564 и 559319 соответственно), затем инкубировали в течение 30 мин при 4°С в темноте.

После этого клетки однократно промывали 1хРВ8 и анализировали на проточном цитометре ЕАС8С’ап1о II (ВО Вюкшепсек).

2.4.2.1.4. Флуоресцентный анализ на ЕАС8Сап1о II.

Подсчитывали в целом 50000 событий и определяли фосфо-8ТАТ1 положительные клетки после стробирования на ΟΩ4+ клетках в лимфоцитарном гейте. Данные анализировали при помощи программного обеспечения ЕАС8О|уа, и они соответствовали проценту ингибирования стимуляции ГЬ-б, рассчитанному на процентную долю положительных клеток для фосфо-8ТАТ1 на СЭ4+ клетках.

2.4.2.2. Анализ фосфо-8ТАТ5.

В случае 6М-С8Е-стимулированного увеличения фосфорилирования переносчиков сигнала и активаторов транскрипции 5 (р8ТАТ5) в белой кровяной клетке человеческую цельную кровь, полученную у людей-добровольцев, которые дали информированное согласие, обрабатывали ех у1уо соединением в течение 30 мин, а затем стимулировали в течение 20 мин СМ-С8Е. Увеличение фосфорилирования 8ТАТ5 под действием ОМ-С8Е в моноцитах определяли с использованием анти-фосфо-8ТАТ5 антитела при помощи ЕАС8.

5-кратный буфер Ьуке/Нх (ВО РйокНоте, по каталогу № 558049) разбавляли в 5 раз дистиллированной водой и предварительно нагревали при 37°С. Оставшийся разбавленный Ьуке/Нх буфер отбрасывали.

мкг г11СМ-С’8Е (АЬСук 8. А., по каталогу № Р300-03) растворяли в 100 мкл РВ8 0,1% В8А, получая 100 мкг/мл исходного раствора. Данный исходный раствор хранили в виде аликвот при -80°С.

Готовили 3-кратное серийное разбавление соединения в ДМСО (10 мМ исходного раствора). В образцы, обработанные контрольным веществом, добавляли ДМСО вместо какого-либо тестируемого соединения. Все образцы инкубировали при 1% конечной концентрации ДМСО.

2.4.2.2.1. Инкубирование крови с соединением и стимуляция действием СМ-С8Е.

Человеческую кровь собирали в гепаринизированные пробирки. Данную кровь делили на аликвоты по 148,5 мкл. Затем к каждой аликвоте добавляли 1,5 мкл разбавления соединения и инкубировали пробы крови в течение 30 мин при 37°С при осторожном качании. К пробам крови добавляли исходный раствор СМ-С8Е (1,5 мкл) (конечная концентрация 20 пг/мл) и инкубировали пробы при 37°С в течение 20 мин при осторожном качании.

2.4.2.2.2. Препарат белых кровяных клеток и введение метки СЭ14.

В конце периода стимулирования 3 мл 1-кратного предварительно нагретого буфера Ьуке-Нх мгновенно добавляли в пробы крови, недолгое время перемешивали вращением и инкубировали в течение 15 мин при 37°С на водяной бане, чтобы лизировать красные кровяные клетки и фиксировать лейкоциты, затем замораживали при -80°С до дальнейшего использования.

Для следующих стадий пробирки размораживали при 37°С приблизительно в течение 20 мин и центрифугировали в течение 5 мин при 400 д при 4°С. Клеточный осадок промывали 3 мл холодного 1хРВ8 и после центрифугирования клеточный осадок повторно суспендировали в 100 мкл РВ8, содержащем 3% В8А. Добавляли НТС мышиное анти-СО14 антитело (ВО Вюкшепсек, по каталогу № 345784) или контрольное НТС мышиное !дС2Ы< изотопное антитело (ВО Вюкшепсек, по каталогу № 555057) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, в темноте.

2.4.2.2.3. Пермеабилизация клеток и введение метки анти-фосфо-8ТАТ5 антителом.

- 25 020111

После промывания клеток 1хРВ8 клеточный осадок повторно суспендировали в 100 мкл ледяного 1хРВ8 и добавляли 900 мкл ледяного 100%-ного метанола. Затем клетки инкубировали при 4°С в течение 30 мин для пермеабилизации.

После этого пермеабилизованные клетки промывали 1хРВ8, содержащим 3% В8А, и, наконец, повторно суспендировали в 80 мкл 1 хРВ8, содержащем 3% В8А.

Добавляли и перемешивали 20 мкл РЕ мышиного анти-8ТАТ5 (ρΥ694) или РЕ мышиного 1дС1К изотопного контрольного антитела (ВО ВЧоксЧепсек, по каталогу №№ 612567 и 554680 соответственно), затем инкубировали в течение 30 мин при 4°С в темноте.

После этого клетки однократно промывали 1хРВ8 и анализировали на проточном цитометре ЕАС8СапЧо II (ВО ВЧоксЧепсек).

2.4.2.2.4. Флуоресцентный анализ на ЕАС8Сап!о II.

Подсчитывали в целом 50000 событий и определяли фосфо-8ТАТ5 положительные клетки после стробирования на СЭ14+ клетках. Данные анализировали при помощи программного обеспечения ЕАС8О1уа, и они соответствовали проценту ингибирования стимуляции СМ-С8Е, рассчитанному на процентную долю положительных клеток для фосфо-8ТАТ5 на СЭ14+ клетках.

2.4.2.3. Результаты.

При представлении в данный протокол для соединения данного изобретения определяли процент ингибирования (РЮ), полученный из среднего значения 3 здоровых добровольцев. Например, тестировали соединение 1 и возвращались к ρ^₅ο=6,61 при ингибировании 8ТАТ1 фосфорилирования и ρ^₅ο=5,37 при ингибировании 8ТАТ5 фосфорилирования.

При сравнении влияния соединения 1 на 8ТАТ1 (ЧАК1-зависимый путь) и 8ТАТ5 (1АК2-зависимый путь) определяли 17,6-кратную селективность для ЧАК1 относительно ЧАК2.

Пример 3. Модели ίη νίνο.

Пример 3.1. Модель СЧА.

3.1.1. Материалы.

Полный адъювант Фрейнда (СЕА) и неполный адъювант Фрейнда (ЧЕА) приобретали у Эйсо. Коллаген коровы II типа (СП), липополисахарид (ЬР8) и энбрель приобретали у СЕопйгех (Ше й'АЬеан, Франция); 8щша (Ые й'АЬеан, Франция), \У11уе!! (25 мг шприц для инъекций, Франция) Асгок ОгдапЧск (Ра1о А1!о, СА) соответственно. Все остальные используемые реагенты были химически чистыми, и все растворители были аналитически чистыми.

3.1.2. Животные.

Крыс темного окраса агути (самцы, возраст 7-8 недель) получали из Наг1ап ЬаЬогаЧопек (МащопА1Гог1, Франция). Мышей ЭВА/1Ч (самцы, возраст 7 недель) получали из СепЧге й'Е1еуаде е! бе КергойнсЕоп ЧАКУЧЕК (СЕЮ) (Лаваль, Франция). Крыс и мышей выдерживали в 12-часовом цикле смены свет/темнота (0700-1900). Температуру поддерживали при 22°С, пищу и воду предоставляли свободно.

3.1.3. Вызванный коллагеном артрит (С'ЧА).

За один день до опыта готовили раствор СП (2 мг/мл) с содержанием 0,05 М уксусной кислоты и хранили при 4°С. Непосредственно перед иммунизацией смешивали равные объемы адъюванта ПЕА) и СП при помощи гомогенизатора в предварительно охлажденной стеклянной бутылке на водной бане со льдом. Лишний адъювант и продолжительная гомогенизация могут потребоваться, если не образуется эмульсии.

Мыши: делали инъекцию 0,1 мл эмульсии чрескожно в основание хвоста каждой мыши на 1 день, вторую бустер-дозу чрескожной инъекции (СП раствор при 1 мг/мл в СЕА 0,1 мл физиологического раствора) осуществляли на 21 день. Способ иммунизации модифицировали исходя из опубликованных способов (Οηνίά Ό. Вгапй, Кагу А. ЬаШат & ЕФгагй Е. КоНошес. Со11адеп-тйисей айЬпПк. №1!иге те!1юЙ5 2(5):1269-1275, 2007).

Крысы: делали инъекцию 0,2 мл эмульсии чрескожно в основание хвоста каждой крысе на 1 день, вторую бустер-дозу чрескожной инъекции (СП раствор при 2 мг/мл в СЕА 0,1 мл физиологического раствора) осуществляли на 9 день. Способ иммунизации модифицировали исходя из опубликованных способов (8ίηΐ5 NА е! а1, (2004) ТагдеПпд о51еос1а515 \νί!1ι хо1ейгошс асЛ ргеуеп(5 Ьопе йекЧгисПоп ш со11адепшйисей айЬгйщ, Аг!11п!15 КЬеит. 50 2338-2346; Чои е! а1., 2005).

3.1.4. Организация исследования.

Терапевтические эффекты тестируемых соединений исследовали на модели крысы или мыши СЧА. Животных разделяли случайным образом на равные группы, и в каждой группе содержалось 10 животных. Всех крыс вакцинировали на 1 день и повторно вакцинировали на 9 день. Всех мышей вакцинировали на 1 день и повторно вакцинировали на 21 день. Терапевтическое дозирование длилось с 16 по 30 день. Отрицательная контрольная группа получала разбавитель (МС 0,5%) и положительная контрольная группа - энбрель (10 мг/кг, 3 недели, к.с.). Рассматриваемое соединение обычно тестировали в виде 3 доз, например 3, 10, 30 мг/кг, р.о.

3.1.5. Клиническая оценка артрита.

Проводили оценку артрита согласно способу КЬасЫдЧап 2006, Ып е! а1. 2007 и ΝίκΗίάη е! а1. 2004.

- 26 020111

Опухание каждой из четырех лап расценивали по артритической оценке следующим образом: 0 - нет симптомов, 1 - слабая, но четко выраженная краснота одного типа суставов, такого как лодыжка, или запястье, или явная краснота и опухлость, ограниченные отдельными пальцами, вне зависимости от числа пораженных пальцев, 2 - умеренная краснота и опухлость двух или более типов суставов, 3 - сильная краснота и опухлость целой лапы, включая пальцы, 4 - максимально воспаленная конечность с вовлечением многочисленных суставов (максимальная совокупная клиническая артритическая оценка 16 на животное) (Νίδΐιίάα е) а1., 2004).

Чтобы допустить мета-анализ многочисленных исследований, значения клинической оценке нормировали следующим образом:

АИС клинической оценки (АИС оценки): площадь под кривой (АИС) с 1 по 14 день вычисляли для каждой отдельной крысы. АИС для каждого животного делили на среднюю АИС, полученную для разбавителя в исследовании, из которого получали данные относительно данного животного, и умножали на 100 (то есть АИС выражали в виде процентной доли средней АИС разбавителя на исследование).

Возрастание клинической оценки с 1 по 14 день (счет конечной точки): разницу в клинической оценке для каждого животного делили на среднюю разницу в клинической оценке, полученную для разбавителя в исследовании, из которого получали данные относительно данного животного, и умножали на 100 (то есть АИС выражали в виде процентной доли средней клинической оценки разбавителя на исследование).

3.1.6. Изменение массы тела (%) после начала артрита.

Клинически потеря массы тела связана с артритом (Ы1с11оп е) а1., 2005; АгдИск е) а1., 1998; Ка11, 2004; \ν;·ι15ΐηί11ι е) а1., 2004). Следовательно, изменение массы тела после начала артрита можно использовать в качестве неспецифической конечной точки для оценки влияния терапевтических средств на модель крысы. Изменение массы тела (%) после начала артрита можно вычислить следующим образом:

Мыши масса телз^ _недель) — масса тела^_{5 иеД}е_Л|.) масса тела_{(5 нелель})

Крысы масса тела(_{4 неде}д_И) — масса телар недели) _χ масса тела^з _недеЛн)

3.1.7. Оценка по Ларсену.

После смерти оценку по Ларсену выводили для обеих задних лапок всех крыс по меньшей мере 2 ученых. Вычисляли среднее значение данных оценок, получая одну оценку по Ларсену на крысу. Чтобы было можно провести сравнение оценок по Ларсену между исследованиями, оценку по Ларсену для каждой крысы делили на среднюю оценку по Ларсену, полученную для разбавителя в исследовании, к которому относится крыса, и умножить на 100 (то есть выражая оценку по Ларсену в виде процентной доли средней клинической оценки разбавителя на исследование). Рассчитывали и сравнивали среднюю оценку по Ларсену для различных групп, получавших лечение.

3.1.8. Рентгенологическое исследование.

Делали рентгеновские снимки задних лап каждого отдельного животного. Каждой из фотографий давали случайный слепой идентификационный номер, а тяжесть эрозии кости ранжировали при помощи двух независимых оценок системы радиологической оценки Ларсена следующим образом: 0 - нормальная с незатронутыми контурами костей и нормальным суставным пространством; 1 - легкая аномалия с одной или двумя внешними плюсневыми костями, в которых проявляется небольшая эрозия костей; 2 определенная ранняя аномалия с проявлением эрозии костей для трех-пяти внешних плюсневых костей; 3 - средняя деструктивная аномалия, при которой для всех внешних плюсневых костей, а также для любой одной или двух внутренних плюсневых костей проявляется определенная эрозия костей; 4 - тяжелая деструктивная аномалия, при которой для всех внешних плюсневых костей проявляется определенная эрозия костей и по меньшей мере один из внутренних плюсневых суставов полностью эродирован с частично сохранившимися контурами костей сустава; 5 - уродующая аномалия без контуров костей. Данная система оценок представляет собой модификацию от 5>;·ι1νοιηίπί е) а1., 2001; ВикЬ е) а1., 2002; §1т8 е) а1., 2004; 1ои е) а1., 2005.

3.1.9. Гистологический анализ.

После рентгенологического анализа задние лапки мышей фиксировали в 10% формалине с фосфатным буфером (рН 7,4), декальцинировали при помощи быстрого декальцификатора костей для высококачественного гистологического анализа (ЬаЬога)опе5 ЕигоЫо) и заливали парафином. Чтобы гарантировать исчерпывающую оценку артритических суставов, делали по меньшей мере четыре серийных среза (толщиной 5 мкм) и между каждой серией срезов делали промежутки по 100 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е). Гистологические исследования синовиального воспаления и повреждения костей и хрящевой ткани проводили двойным слепым методом. Для каждой лапки оценивали четыре параметра с использованием четырехточечной шкалы. Данные параметры представляли собой клеточную инфильтрацию, серьезность паннуса, эрозию хрящевой ткани и эрозию костей. Оценку проводили следующим образом: 1 - нормальная, 2 - легкая, 3 - умеренная, 4 - выраженная. Четыре данных оценки

- 27 020111 суммировали и представляли в виде дополнительной оценки, а именно общей оценки КА. Чтобы дать возможность сравнить гистологические отсчеты для разных исследований, общую гистологическую оценку для каждой крысы делили на среднюю общую гистологическую оценку, полученную для разбавителя в исследовании, к которому относится крыса, и умножали на 100 (то есть общую гистологическую оценку выражали в виде процентной доли средней общей гистологической оценки разбавителя на исследование). Проводили расчет и сопоставление средней общей гистологической оценки для различных групп, получавших лечение.

3.1.10. Микрокомпьютерный томографический (цСТ) анализ калканеуса (пяточной кости).

Разрушение кости, наблюдаемое при КА, происходит, главным образом, в кортикальном слое кости и может быть обнаружено методом цСТ анализа (81т§ Ν.Α. е! а1., 2004; ОЧе Ь. е! а1., ЕСТС Моп!геа1 2007). После сканирования и 3Э-объемной реконструкции пяточной кости разрушение кости определяют как число дискретных объектов, присутствующих на слайде, выделенных ίη чйсо перпендикулярно продольной оси кости. Чем больше разрушенная кость, тем больше дискретных объектов выделено. Анализируют 1000 срезов, равномерно распределенных вдоль пяточной кости (с промежутком около 10,8 мкм).

3.1.11. Результаты.

Соединение 1 тестировали в исследовании С1А на мышах в количестве 30 мг/кг и в исследовании С1А на крысах в количестве 30, 10, 3 и 1 мг/кг. Соединение 1 оказалось эффективным при всех отсчетах, осуществленных в исследовании С1А на крысах, при статистической достоверности в нескольких отсчетах, в частности значительные улучшения наблюдались для АИС клинической оценки (от 10 мг/кг), конечной клинической оценки (от 1 мг/кг), оценки по Ларсену (от 30 мг/кг) и опухания лапки (от 1 мг/кг).

Пример 3.2. Модель септического шока.

Инъекция липополисахарида (ЬР8) вызывает быстрое высвобождение растворимых рецепторов фактора некроза опухоли (Т№а) в периферию. Данную модель используют для анализа предполагаемых блокаторов высвобождения Т№ ίη νί\Ό.

Шесть самок мышей ВАЬВ/с1 (20 г) на группу лечат однократно заданными дозами, р.о. Через 30 мин делают ί.ρ. инъекцию ЬР8 (15 мкг/кг, серотип Е. Сой 0111:В4). Через 90 мин мышей подвергают эвтаназии и собирают кровь. Концентрации циркулирующего Т№а определяют при помощи коммерчески доступных наборов ЕЬ18А. В качестве контрольного противовоспалительного соединения используют дексаметазон (5 мкг/кг). Выбранные соединения тестируют при одной или многократных дозах, например 3, и/или 10, и/или 30 мг/кг, р.о.

Соединение 1 проявляло статистически достоверное снижение высвобождения ΤNΕ (>50%) при 30 мг/кг р.о.

Пример 3.3. Модель МАВ (модель с моноклональным антителом).

Модель МАВ дает возможность провести быструю оценку модулирования КА-подобной воспалительной реакции терапевтическими средствами (КасЫ§1ап Ь.М. №11иге Рго!осок (2006) 2512-2516: Со11адеп апЦЬойу-тйисей аг(Нг1115). Мышам ЭВА/ί делают инъекцию ί.ν. смесью тАЬ, направленных против коллагена II. Через день начинают лечение соединением (разбавитель: 10% об./об. ΗΡβί,Ό). Через три дня мыши получают ί.ρ. инъекцию ЬР8 (50 мкг/мышь), приводящую к быстрому началу воспаления. Лечение соединением продолжают в течение 10 дней после инъекции тАЬ. Воспаление определяют по измерению опухания лапки и регистрации клинической оценки каждой лапки. Представляют общие клинические оценки артрита четырех конечностей для демонстрации тяжести воспаления. Систему оценки применяют к каждой конечности с использованием шкалы 0-4, при этом 4 представляет собой наиболее тяжелое воспаление.

- Симптомы отсутствуют.

- Слабое, но отчетливое покраснение и опухание одного типа сустава, такого как лодыжка или запястье, или явное покраснение и опухание, ограниченное отдельными пальцами, вне зависимости от числа пораженных пальцев.

- Умеренное покраснение и опухание двух или более типов суставов.

- Сильное покраснение и опухание целой лапки, включая пальцы.

- Максимально воспаленная конечность с участием многочисленных суставов.

Пример 3.4. Онкологические модели.

Модели ίη νί\Ό для подтверждения эффективности малых молекул по отношению к 1АК2управляемым миелопролиферативным заболеваниям описаны Уегшд е! а1. Сапсег Се11 13, 311, 2008 и Сегоп е! а1. Сапсег Се11 13, 321, 2008.

Пример 3.5. Модель ΙΒΌ на мышах.

Модели 1п νίΙΐΌ и ш νί\Ό для подтверждения эффективности малых молекул по отношению к ΙΒΌ описаны \νίΠζ е! а1. 2007.

Пример 3.6. Модель астмы на мышах.

Модели 1п νίΙΐΌ и ш νί\Ό для подтверждения эффективности малых молекул по отношению к астме описаны №ак е! а1., 2008; Ιρ е! а1. 2006; Регшк е! а1., 2002; ΚιιάΡκζ е! а1., 2008.

Пример 4. Модели токсичности, ЭМРК и безопасности.

- 28 020111

Пример 4.1. Термодинамическая растворимость.

Готовят раствор 1 мг/мл тестируемого соединения в 0,2 М фосфатном буфере с рН 7,4 или 0,1 М цитратном буфере с рН 3,0 при комнатной температуре в стеклянном сосуде.

Образцы вращают на диске ротатора 8ТК 4 (81иай δοίοηΙίΓίο. В1ЬЬу) со скоростью 3,0 при комнатной температуре в течение 24 ч.

Через 24 ч 800 мкл образца переносят в пробирку Эппендорфа и центрифугируют в течение 5 мин при 14000 об/мин. Затем 200 мкл супернатанта образца переносят на планшет МиНйсгссп 8о1иЬ11йу Р1а1с (М1Шроге, М88ЬВРС50) и фильтруют супернатант (10-12 мм рт. ст.) при помощи вакуумной гребенки в чистый полипропиленовый 9б-луночный планшет с У-образным дном Огетег (по каталогу № 651201). 5 мкл фильтрата разбавляют 95 мкл (Г20) того же буфера, который использовали для инкубирования в планшете, содержащем калибровочную кривую (Огетег, по каталогу № б51201).

Калибровочную кривую для данного соединения делают свежеприготовленной в ДМСО, начиная от 10 мМ исходного раствора в ДМСО, разбавленного фактором 2 в ДМСО (5000 мкМ), а затем еще разбавляют ДМСО до 19,5 мкМ. Затем 3 мкл серийного разбавления, начиная с 5000 мкМ, переносят в 97 мкл смеси ацетонитрил-буфер (50/50). Конечный интервал концентрации составляет от 2,5 до 150 мкМ.

Планшет герметизируют при помощи герметизирующих пленок (МА9бКЭ-048, те^ет.к1пе818.со.ик) и измеряют образцы при комнатной температуре методом ЖХ-МС (ΖΟ 1525 от \Уа1ег5) в оптимизированных условиях с использованием ОиапорШшхе для определения соответствующей массы молекулы.

Образцы анализируют на ЖХ-МС при скорости потока 1 мл/мин. Растворитель А представляет собой 15 мМ аммиак и растворитель В представляет собой ацетонитрил. Образец проходит в условиях положительного ионного спрея на колонку ХВпбде С18 3,5 мкМ (2,1x30 мм) от \Уа1ег5. Градиент растворителя имеет общее время прохода 2 мин и изменяется от 5 до 95% В.

Анализ площади пиков проводят при помощи пакета программ МакДупх и площади пиков образцов наносят на график относительно калибровочной кривой, получая растворимость соединения.

Значения растворимости приведены в мкМ или мкг/мл.

Пример 4.2. Растворимость в воде.

Начиная от 10 мМ исходного раствора в ДМСО, готовят серийное разбавление соединения в ДМСО. Серийные разбавления переносят в 9б-луночный планшет с Р-образным дном ΝυΝί МахйогЬ (по каталогу № 442404) и добавляют 0,2 М фосфатного буфера с рН 7,4 или 0,1 М цитратного буфера с рН 3,0 при комнатной температуре.

Конечная концентрация изменяется в интервале от 200 до 2,5 мкМ за 5 одинаковых стадий разбавления. Конечная концентрация ДМСО не превышала 2%. В угловые точки каждого 9б-луночного планшета прибавляют 200 мкМ пирена, и он служит контрольной точкой для калибровки Ζ-оси в микроскопе.

Планшеты для анализа герметизируют и инкубируют в течение 1 ч при 37°С при встряхивании при 230 об/мин. После этого планшеты сканируют под микроскопом с освещением белым светом, получая отдельные картинки осадка по концентрации. Осадок анализируют и переводят в число, которое наносят на график. Первая концентрация, при которой соединение оказывается полностью растворенным, представляет собой сообщенную концентрацию, однако истинная концентрация находится где-то между данной концентрацией и концентрацией одного шага разбавления в большую сторону.

Значения растворимости приведены в мкг/мл.

Пример 4.3. Связывание с белком плазмы (равновесный диализ).

мМ исходный раствор соединения в ДМСО разбавляют фактором 5 в ДМСО. Данный раствор дополнительно разбавляют в свежеразмороженной плазме крови человека, крысы, мыши или собаки (ВюКес1атайоп ΙΝί) при конечной концентрации 10 мкМ и конечной концентрации ДМСО 0,5% (5,5 мкл в 1094,5 мкл плазмы в 9б-луночном планшете РР-МайегЫоск (Огетег, по каталогу № 780285)).

Готовят планшет с вкладышами Р1егсе Кеб Эеу1се (ТНегтоЗаепОПс. по каталогу № 89809) и заполняют 750 мкл РВ8 буферный резервуар и 500 мкл спайковой плазмы в резервуар для плазмы. Планшет инкубируют в течение 4 ч при 37°С при встряхивании при 230 об/мин. После инкубации 120 мкл содержимого обоих резервуаров переносят в 3б0 мкл ацетонитрила в 9б-луночных круглодонных, РР планшетах с глубокими лунками Щипс, по каталогу № 278743) и герметизируют крышкой из алюминиевой фольги. Образцы перемешивают и помещают на лед на 30 мин. После этого данный планшет центрифугируют в течение 30 мин при 1200 гсГ при 4°С и переносят супернатант в 9б-луночный РР планшет с Уобразным дном (Огетег, б51201) для анализа методом ЖХ-МС.

Данный планшет герметизируют герметизирующими пленками (МА9бКЭ-048) от \\л\л\\кте515.сол.1к и измеряют образцы при комнатной температуре методом ЖХ-МС (ΖΟ 1525 от \Уа1ег5) в оптимизированных условиях с использованием ОиапорОпйхе для определения соответствующей массы молекулы.

Образцы анализируют методом ЖХ-МС при скорости потока 1 мл/мин. Растворитель А представляет собой 15 мМ аммиак и растворитель В представляет собой ацетонитрил. Образец проходит в условиях положительного ионного спрея на колонку ХВпбде С18 3,5 мкМ (2,1x30 мм) от \Уа1ег5. Градиент растворителя имеет общее время прохода 2 мин и изменяется от 5 до 95% В.

- 29 020111

Считается, что площадь пика соединения в буферном резервуаре и резервуаре плазмы является 100% соединения. Процент связывания с плазмой получают из этих результатов и представляют Ь1М8 в виде процента связывания с плазмой.

Растворимость соединения при конечной тестовой концентрации в РВ8 исследуют при помощи микроскопа, чтобы показать, наблюдается ли осадок или нет.

Пример 4.4. Склонность к пролонгированию ОТ.

Возможность пролонгирования ОТ оценивают методом локальной фиксации потенциала НЕКС.

4.4.1. Локальная фиксация потенциала в целой клетке.

Регистрацию локальной фиксации потенциала в целой клетке осуществляют при использовании усилителя ЕРС10, управляемого программным обеспечением Ри1ке ν8.77 (НЕКА). Сопротивление серий обычно меньше 10 МО и компенсируется более чем на 60%, из показаний рассеяние не вычитается. Электроды изготавливают из стекла для пипеток (Нагеагб).

Внешний раствор для погружения содержит 135 мМ №С1, 5 мМ КС1, 1,8 мМ СаС1₂, 5 мМ глюкозы, 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,4.

Внутренний раствор раЮй-пипетки содержит 100 мМ глюконата К, 20 мМ КС1, 1 мМ СаС1₂, 1 мМ МдС1₂, 5 мМ М-ьАТР, 2 мМ глутатиона, 1 мМ ЕСТА, 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,2.

Лекарственный препараты перфузируют при помощи биологической системы быстрой перфузии МЕУ-9/ЕУН-9.

Все снятия показаний осуществляют на клетках НЕК293, стабильно экспрессирующих НЕКС каналы. Клетки выращивают в 12-мм круглых покровных стеклах (Сегтап д1акк, Ве11ео), закрепленных в регистрационной камере при помощи двух платиновых стержней (Соо6Гс11о\у). Токи НЕКС индуцируют при помощи активирующего импульса до +40 мВ в течение 1000 мс с последующим импульсом хвостового тока до -50 мВ в течение 2000 мс, при этом удерживающее напряжение составляло -80 мВ. Импульсы подавали каждые 20 с и все опыты проводили при комнатной температуре.

4.4.2. Анализ данных.

Для каждого тестируемого соединения рассчитывали значения 1С₅₀ и 1С₂₀. Рассчитана кратная разница между 1С₂₀ и несвязанными Смс концентрациями тестируемого соединения, полученными при релевантных терапевтических дозах, определенных по результатам, полученным из модели С1А на крысах.

Что касается кривых зависимости концентрации от отклика, максимальную амплитуду хвостового тока измеряют при скачке напряжения до -50 мВ. Вычерчивание эмпирической кривой по данным зависимости концентрации от отклика осуществляют по уравнению у=а+[(Ь-а)/1+10а((1одс-х)ά)] где а представляет собой минимальный отклик, Ь представляет собой максимальный отклик и б является наклоном кривой, причем данное уравнение можно использовать для расчета как 1С₅₀ (где у=50 и с представляет собой значение 1С₅₀), так и 1С₂₀ (где у=20 и с представляет собой значение 1С₂₀). Для построения всех кривых использовали программное обеспечение СгарНРаб® Рпкт® (СгарНРаб® 8оП\\аге 1пе.). Разница в 100 раз или более указывает на низкий потенциал пролонгирования ОТ.

Пример 4.5. Микросомальная стабильность.

мМ исходный раствор соединения в ДМСО разбавляли в 1000 раз 182 мМ фосфатным буфером с рН 7,4 в 96-луночном планшете с глубокими лунками (Стешет, по каталогу № 780285) и преинкубировали при 37°С.

мкл деионизированной воды добавляли в лунку меченной штрих-кодом полипропиленовой пробирки для хранения Майях 2Ό (ТНегто Заепййе) и преинкубировали при 37°С.

Рабочий исходный раствор глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы (С6РЭН) готовили в 182 мМ фосфатном буфере с рН 7,4 и помещали на лед до использования. Кофактор, содержащий раствор МдС1₂, глюкоза-6-фосфата и NА^Ρ⁺, получали в деионизированной воде и помещали на лед до использования.

Получали конечный рабочий раствор, содержащий микросомы печени (Хепо1еей) рассматриваемых видов (человек, мышь, крыса, собака), описанный ранее С6РЭН, и кофакторы, и инкубировали данную смесь не более 20 мин при комнатной температуре.

К 40 мкл предварительно нагретой воды добавляли 30 мкл предварительно нагретого разбавления соединения и добавляли 30 мкл микросомальной смеси. Конечные концентрации реакции составляли 3 мкМ соединения, 1 мг микросом, 0,4 и/мл СОРЭН, 3,3 мМ МдС1₂, 3,3 мМ глюкозы-6-фосфата и 1,3 мМ NА^Ρ⁺.

Для определения процентной доли остатка соединения в нулевой период времени в лунку перед прибавлением микросомальной смеси добавляли МеОН или АСN (1:1). Планшеты герметизировали Майях 8ерга кеа1кТМ (Майях, по каталогу № 4464) и встряхивали в течение нескольких секунд, чтобы гарантировать полное смешение всех компонентов.

Образцы, реакцию в которых не останавливали, инкубируют при 37°С, 300 об/мин и через 1 ч инкубации реакцию останавливают добавлением МеОН или АСN (1:1).

После остановки реакции образцы перемешивали и помещали на лед в течение 30 мин для осаждения белков. Затем планшеты центрифугировали в течение 30 мин при 1200 геГ при 4°С и переносили супернатант в 96-луночный РР планшет с Υ-образным дном (Сгетег, 651201) на анализа методом ЖХ-МС.

- 30 020111

Данные планшеты герметизировали при помощи герметизирующих пленок (МА96КИ-048) \\л\л\\кте515.со.ик и измеряли образцы при комнатной температуре методом ЖХ-МС (ΖΟ 1525 от \Уа1ег5) в оптимизированных условиях с использованием ОиапорНп^е для определения соответствующей массы исходной молекулы.

Образцы анализировали методом ЖХ-МС при скорости потока 1 мл/мин. Растворитель А представлял собой 15 мМ аммиак и растворитель В представлял собой ацетонитрил в зависимости от используемого стоп-раствора. Образцы проходили в условиях положительного ионного спрея по колонке ХВпбде С18 3,5 мкМ (2,1х30 мм) от \Уа1ег5. Градиент растворителя имел общее время прохода 2 мин и изменялся от 5 до 95% В.

Площадь пика от исходного соединения в момент времени 0 считали за 100% остаток. Процентную долю, оставшуюся после 1 ч инкубации, рассчитывали из момента времени 0 и рассчитывали как оставшуюся процентную долю. Растворимость соединения при конечной тестовой концентрации в буферном растворе изучали под микроскопом и сообщали результаты.

Данные относительно микросомальной стабильности выражены в виде процентной доли общего количества соединения, оставшейся через б0 мин.

Таблица IX

Микросомальная стабильность

Соединение №	Человек	Крыса
1	76-100%	76-100%

Пример 4.б. Проницаемость Сасо2.

Двунаправленные анализы Сасо-2 проводили, как описано ниже. Клетки Сасо-2 получали в Европейской ассоциации клеточных культур (ЕСАСС, по каталогу № 8б010202) и использовали через 21 день выращивания клеток в 24-луночных планшетах Тгап5\те11 (Икйет ТКТ-545-020В).

Высевали 2х10⁵ клеток/лунку в планшетную среду, состоящую из ОМЕМ+С1и1аМАХ1+1% ΝΕΑΑ+10% ЕВ8 (Ее!а1С1опе 11)+1% Реп/8!тер. Среду меняли каждые 2-3 дня.

Тестируемое и эталонное соединения (пропранолол и родамин 123 или винбластин, все из которых получены от 81§та) готовили в сбансированном солевом растворе Хэнкса, содержащем 25 мМ НЕРЕ8 (рН 7,4), и добавляли либо в апикальные (125 мкл), либо в базолатеральные (б00 мкл) отсеки блока планшетов Тгап5\\'е11 в концентрации 10 мкМ при конечной концентрации ДМСО, составляющей 0,25%.

В донорный буфер во всех лунках добавляли 50 мкМ люциферового желтого (81дта), чтобы оценить целостность клеточных слоев путем мониторинга проникновения люциферового желтого. Люциферовый желтый (ΕΥ) не может свободно проникнуть через липофильные барьеры, при этом высокая скорость переноса ΕΥ свидетельствует о слабой целостности клеточного слоя.

Через 1 ч инкубации при 37°С при встряхивании на орбитальной качалке при 150 об/мин как из апикальных (А), так и из базальных (В) отсеков отбирали аликвоты по 70 мкл и добавляли в раствор 100 мкл ацетонитрил:вода 50:50, содержащий аналитический внутренний стандарт (0,5 мкМ карбамазепина) в 9б-луночном планшете.

Люциферовый желтый определяли при помощи 8рес1татах Сетии Х8 (Ех 42б нм и Ет 538 нм) в чистом 9б-луночном планшете, содержащем 150 мкл жидкости с базолатеральной и апикальной сторон.

Концентрацию соединения в образцах определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС).

Значения кажущейся проницаемости (Р_арр) рассчитывали по уравнению

Рарр [ О θ ДИ Η Θ НИ ё ] конечный акцепторХТГ_акц_ептор ( [СОёДИНёНИё] начальный лонорХУцонор) /ТннкХУдонор/площадь поверхностихбОхЮ'⁶ см/с где Т_инк - продолжительность инкубации;

площадь поверхности - 0,33 см².

Соотношения вытекания как признака активного оттока с апикальной поверхности клетки рассчитывали с использованием соотношения Р_аррВ>А/Р_аррА>В.

Использовали следующие критерии приемки анализа.

Пропанолол: значение Р_арр(А>В)>20(х 10^-6 см/с).

Родамин 123 или винбластин: значение Р_арр(А>В)<5 (х10^-6 см/с) при соотношении вытекания >5. Проницаемость люциферового желтого <100 нм/с.

Таблица Х

Скорость вытекания Сасо-2

Соединение Ν'	Рарр А>В (Х1О‘6 см/с)	Соотношение вытекания
1	7,8±0,8	6,1±0,6

Пример 4.7. Фармакокинетическое исследование.

4.7.1. Фармакокинетическое исследование на грызунах.

Из соединений получают препараты в смесях ПЭГ200/физиологический раствор или

- 31 020111

ПЭГ400/ДМСО/физиологический раствор для внутривенного способа введения и в 0,5% метилцеллюлозе или 10-30% гидроксипропил-β-цикло декстрине с рН 3 или 7,4 для перорального способа введения. Тестируемые соединения дозируют перорально в виде разового внутрипищеводного зонда при 5-10 мг/кг и дозируют внутривенно в виде болюса через хвостовую вену при 1 мг/кг. Каждая группа состоит из 3 крыс. Пробы крови отбирают либо из яремной вены при использовании канюлированных крыс, либо из ретро-орбитального синуса с использованием гепарина лития в качестве антикоагулянта в моменты времени в следующем интервале: от 0,05 до 8 ч (внутривенный способ) и от 0,25 до 6 или 24 ч (пероральный способ). Пробы цельной крови центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин и хранят образцы полученной плазмы при -20°С в ожидании анализа.

4.7.2. Фармакокинетическое исследование на собаках.

Из соединений получают препараты в смесях ПЭГ200/физиологический раствор для внутривенного способа введения и в 0,5% метилцеллюлозе или в смесях ПЭГ400/гидроксипропил-в-циклодекстрин, подкисленных лимонной кислотой до рН 2-3, для перорального способа введения. Тестируемые соединения дозируют перорально через желудочный зонд при 5-30 мг/кг и дозируют внутривенно в виде болюса или 10 мин инфузии через сонную артерию при 1 мг/кг. Каждая группа состоит из 3 самцов или самок собак породы бигль. Пробы крови отбирают либо из яремной вены при использовании гепарина лития в качестве антикоагулянта в моменты времени в интервале от 0,083 до 24 ч после введения дозы. Пробы цельной крови центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин и хранят образцы полученной плазмы при -20°С в ожидании анализа.

4.7.3. Количественная оценка концентрации соединения в плазме.

Концентрацию в плазме каждого соединения определяют методом ЖХ-МС/МС, в котором массспектрометр функционирует в режиме положительного электроспрея.

4.7.4. Определение фармакокинетических параметров.

Фармакокинетические параметры вычисляют с использованием ^ииои^и® (РйагЦдй!®, Иш!еб). Пример 4.8. 7-Дневное исследование токсичности на крысах.

7-Дневное исследование пероральной токсичности тестируемых соединений проводят на самцах крыс 8!гадие-Оа^1еу для оценки потенциала их токсичности и токсинокинетики при суточных дозах, составляющих 100, 300 и 500 мг/кг/день, при помощи желудочного зонда, при постоянном значении доза-объем, составляющем 5 мл/кг/день.

Из тестируемых соединений получают препараты в 30% (об./об.) НРвСИ в очищенной воде. Каждая группа включает в себя 5 доминирующих самцов крыс, а также 3 подчиняющихся животных для фармакокинетики. Четвертая группа получает только 30% (об./об.) НРвСИ в воде с той же частотой, объемом дозы и таким же способом введения и выступает в качестве контрольной группы, получающей разбавитель.

Цель данного исследования заключается в определении минимальной дозы, которая приводит к отсутствию идентифицируемых неблагоприятных подобных эффектов (отсутствует наблюдаемый уровень неблагоприятного воздействия - NОΛЕ^).

Пример 4.9. Гепатоцитарная стабильность.

Модели для оценки метаболического очищения гепатоцитов описаны МсСтпйу е! а1. Игид Ме!аЬо11кт аиб Ищрокйюи 2008, 32, 11, 1247.

Специалистам в данной области будет понятно, что предшествующие описания по своей природе служат в качестве примеров и разъяснений и в указанном виде предназначены для иллюстрации данного изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления. В ходе стандартного проведения экспериментов специалист увидит очевидные модификации и изменения, которые можно сделать, не выходя за рамки данного изобретения. Таким образом, подразумевается, что данное изобретение определено не приведенным выше описанием, а следующей формулой изобретения и ее эквивалентами.

- 32 020111

Ссылки.

АгдИез	ЛИ, Ьорег-Зогхапо РЛ. (1998)	СаЪаЬоНс
р гοίη £ Xаттаϋ огу	суЬокхпез. Сигг Ορίη	С11П ЫиСг	МеЬаЬ Саге.
1:245-51.
ВизЬ	КА,	Рагтег КМ, Иа1кег ЛЗ, КтгкЬат	ВИ	. (2002)
Ведисехоп	о£	ίοίηΐ 1п£1аттаЬ1оп апд	Ьоле егозхоп	ίη гас
ад] тгапь	агСЬгхСгз Ьу ЪгеаЬтепЪ νίύΐι	1пЬег1еик1п·	-17	гесерЬог

1дС1 Рс Сизгоп. ргоРехп. АгЬЬгхЫэ ЕЬеит. 46: 802-5.

СЬоу ЕН, Рапау! 05. (2001). N Епд1 Л Мед. 344; 907-16.

СЬиЬгпзкауа 5 апд Киееьпег КЕ (2003) . Неди1аЫоп о£ озьеодепхс ρτοΐβίηβ Ьу сЬопдгосуЬез. ТЬе 1пСегпаЬ1Опа1 ]оигпа1 о£ ЫосЪетпхзСгу & се11 Ыо1оду 35(9)1323-1340.

С1едд 00 еГ а1. (2006) N Епд1 Л Мед. 2006 354:795-808.

С51исозаш1пе, сЬопдгохЪхп зи1£а£е, апд СЬе £νο ίη сотЬ1па£1оп £ог ра1п£и1 клее озСеоагСЬгхМз.

СопзСапСхпезси еЪ а1., 2007, Тгепдз ίη В1ос11ет1са1

Зсхепсез 33(3): 122-131.

Г1ге2Се1П 03. (2003). ИаС/ИГё. 423:356-61.

Сегоп е£ а1. (2008) δθίβοΐιΐνβ 1пЫЬШоп о£ ЛАК2-дх1Уеп егуЫагохд д1££егепЫа1:1оп о£ роХусуСЬетха уезга ргодепХсогз Сапсег Се11 13 (4), 321-30.

1р е£ аХ. (2006) 1пЪег1еик1п (1Ъ)-4 апд 1Б-ХЗ ир-гедиХасе топосуСе сЬетоаЬЬгасЬапЬ рго£е1п-1 ехргезехоп ίη Питал ЬгопсЫаХ ер1ЪЬеИа1 сеХХз: ίηνοίνβπιβηΐζ о£ р38 тхЪодепасЫуаСед ргоье1п кхпазе, ех£гасе1ХиХаг з1дпаХ-геди1аЬед к1лазе 1/2 апд Лапиз к1пазе-2 ЬиС по£ с-Лип ЫН2-£егт1паХ к1пазе 1/2 81дпа111пд раСЬадауз, С11п. Ехр. 1ттип, 162-172.

Лои ΙΜ, йЫаи АЪ, СЬеп 8Υ, И апд СК, ЗЫеЬ ОБ, Тза! СЗ, Ии

- 33 020111

СЬ. (2005) ТкготЬозропЛп 1 аз ап β££θοΐ:ίνβ депе ЫтегареиСдс зЪгабеду ίη со11адеп-1п<1исес1 ахекгЗХгз. Агбкг1С13 Екеит. 52:339-44.

КасЫд^ап Ьм. (2006) СоИадеп апП1Ьос1у-1пс1исед. агсЬгхЫз, ИаЪиге РгоСосо1з 2512-2516.

КИасЫдгап, Ь. М. СоИадеп апС1Ьо0у-1п0исе<2 аг£Ьг1С1е. (2006) КГа^иге Рхо£осо1е 1, 2512-6.

КисПасг еС а1. (2008) ТЬе σΑΚ-З епЫЫСог СР-690550 хз а роЪепЪ ап^1-1п£1аттаСогу адепб ίη а тиххпе тоде1 о£ ри1топагу еозхп-ОрЬИха, Еиг 3 Ркахтасо 154-161.

Ьее ϋΜ, ИехпЫаЬЪ МЕ (2001). ЬапсеС. 358: 903-11.

Ьедепдге Р, ОисШха <1, Ридо1 θ’-Р, Воддапо^хсг Р. (2003) ЗАК/2ТАТ ЬиЪ ηοΐ: ЕЕК1/ЕЕК2 раЪЬюау тесИакез хп1зег1еик1пд (1Ь)6/зо1иЫе ΙΙι-бЕ 6о^п-геди1аЫоп о£ Суре II соИадеп, аддгесап соге, апд Ипк рхоЪехп £гапзсг1р1:1оп ίη ахС1си1аг скопскгосуЬез. σ ΒίοΙ Скет. 278(5)2903-2912.

Ы КЗ, 0екпа<1е Е, га£аги11ак М. (2001) ОпсозСаЫп М1пЗисес1 таСГ1х те^аНоргоСехпазе ап<5 £1ззие хпЬхЫСог о£ теЪаНоргобехпазе-З депез ехрхезз1оп ίη скопдхосубез гедиххез дапиз к1пазе/8ТАТ вхдпаИпд ра^киау. (2001) 3 1ттипо1 166:34913498 .

Ып Н8, Ни СУ, Скап ΗΥ, Ыем ΥΥ, Ниапд НР, Ьерезскеих Ь, ВазЫапеШ Е, Вагоп В, Εβνβάί С, С1етеп£-Ьасхохх Р. (2007) Апсх-гкеитасхе асб1У1Мез о£ кхзкопе (йеасеСуЗазе (ЮАС) хпЫЫЬогз ίη νίνο ίη со11адеп-1пс1исе0 агЪИгд.Ъх5 ίη годепСз. Вг Л Ркагтасо1. Арг; 150 (7):829-31.

МиШдкап СС, гкапд 3, Нагуеу ЕС, СоШпз-ипЗехадоод ЗЕ, 8ски1тап ВА, ΡΗΐΙΙίρε ЬА, Тазхап 8К, Ьок МЬ, 8и X, Ыи И, Ώβνί<^3 М, АС1аз 8Е, Скеп Ι-М, С1х££огс! КЗ, Сегкахс! 02, СагхоИ КЬ, Ееатап ОН, бтхьк м, Ооупгпд ЗЕ, Нипдег 5Р иЩтапе СЬ; (2009) ЗАК тиЪаМопв ίη И1дк-Г1зк ск11с1Ьоос1 асиЬе 1утркоЫазС1с 1еикет1а, ΡΝΑ8 Мау 22. [Публикация на стадии печати.]

Н1а1з еб а1. (2008) Моизе Мос1е1з о£ АНехдхс Азъкгпа: Аси£е апс! Скгопхс АНегдеп СкаИепде, Охзеазе Μοάβΐβ & Мескапгзтз, 213-220.

Νί31Ίίά3 К, Кот1уатпа Т, Мхуагака 3, 8кеп ΖΝ, РихитаГзи Т,

- 34 020111

Βοΐ Η, ΥοδΠΐάβ А, Уатапа Л, Уататига Μ, Ытпоттуа У, 1поие Η, АзаЬага Η. (2004) Ηίδϋοηβ 0еасеСу1азе хпЫЫСог зирргеззтоп о£ аиСоапЫЬоЗу-тесИаЬей агСЬгтШе ΐη πιΐοβ νΐ3 геди1аСтоп о£ р161МК4а апс1 р21 (КАР1/С1р1) ехргезехоп.

АгСЪг±С1в ВЬешп. 10: 3365-76.

О'ЗЬеа, Л, Л., Рези, М., Вогте, ϋ-С-, СЬапдеИап, Р.5., ИаСиге Ββνΐβνδ, 2004, 555-564.

О*Бе11 ЛК. (2004) ТЬегареиСтс зСгаСедгез £ог гЬеигпаСогд ахСЬг1С13. N Епд1 Л МеЗ. 350(25):2591-602.

Овак1 М, Тап Ь, СЬоу ВК, УозЫйа У, СЬеаН КЗЕ, Аигоп РЕ, СоМгхпд МВ. (2003) ТЪе ТАТА-сопаСхптпд соге рготоСег о£ сНе Суре II соИадеп депе (СОБ2А1) 13 СНе СагдеС о£ 1пСег£егопдатта-тесИаСеб. хпЫЫСтоп ΐη Питан сНопйгосуСев: гедитгетепС £οχ 5ТАТ1 а1рПа, ЛАК1 апд ЛАК2. ВгосЬет Л 369:103-115.

ОзСе Ь еС а1., ЕСТС Моп£геа1 2007: А Ь1дЬ СЬгоидЬриС теСЬой о£ теазигхпд Ьопе агсЬ1СесСига1 сНвСигЬапсе ΐη а тигхпе С1А πϊΦάβΙ Ъу ттсго-СТ тогрЬотеСгу.

ОСего М, Ьадо К, Ьадо Е, Сотег Κθΐηο ЛЛ, биаИИо О. (2005) ЗгдпаШпд расЬиау ΐηνοίνβά ΐη ηΐπτΐο οχΐάβ вупсЬаве Суре II ас£1УаС1оп ΐη. сЬопдгосуСез: зупегдхзСхс е££есС о£ 1ерС1п νίϋΠ тпСег1еик1п-1. АгСЬгхСхв КезеагсЬ & ТНегару 7;В581К591.

Реппа еС а1. (2002) ЛАК-ЗТАТ зтдпаИпд ΐη азСЬта Л. СИп.

ТтгееС. 1279. ВаИ ЬС, ВоиЬепо££ К. (2004) ВЬеитпаСогд сасЬехта: ше£аЬо11с аЬпогта11С1ез, тпесНапхзтз апс1 ΐη£θΓνβη£ΐοηδ. КЬеитаСо1оду; 10:1219-23.

ВосНд 8Л, Мегаг МА, ИЫСе ЛМ, Ьатре РА, В11еу ЛК, АгСЬиг СБ, Ктпд КЬ, ЗЬееЬап КСР, Υΐη Ъ, Реппхса Б, ЛоЬпзоп ЕМ, ЗсЬге1Ьег НБ. (1998) БтегирЫоп о£ СЬе Лак1 депе детопвСгаСез оЬИдаСогу апд попгеЛипйапС. го1ез о£ СНе ^акз ΐη суСокхпетпс5исе0 Ыо1одтс гезропзез Се11 93: 373-383. 8а1уеттп1 ϋ,

Маггоп Е, Бидо Ь, Зеггахпо I, Бе Загго А, СариСх АР, Сиггосгеа 3. (2001) АтеИогаШоп о£ ^οΐηο сНзеазе ΐη а гас тоЛе1 о£ со11адеп-1п0исед агСЬгхСтз Ьу М40403, а еирегоххЛе сНатпиСазе т1теС1с. АгСНгтСтз ВНеит. 44:2909-21.

ЗНе1Соп ВЬ, геПег Л, Но МН, Ропв Л, КозепСЬа! А. (2005)

- 35 020111

Ыехлге дго>гЫ1 £ас£от тесИаРез ЬурегаХдезха апд сасЪехха ϊη аи£о1ттипе агЫигхЫз. Рахп. 116:8-16.

Зхте ΝΑ е£ а1., (2004) ТагдеЪхпд оз£еос1аз££ «г±Ы1 го1едгопхс асхс! ргемепЪз Ьопе сЗез£гис£хоп ίη со11адеп-хпйисе<1 агРИгхМз, АгРИгхРхз КЬеитп. 50 2338-2346.

Зхтз ΝΑ, Сгееп σκ, С1а££ М, ЗсИИсе 3, МагШп и,

СШезрхе МТ, Котае Е. (2004) ТагдеЪхпд озЬеос1аз£з νί£1ι го1е<5гопхс асхд ρΓβνβη£.3 Ьопе ёезСгисРхоп ίη со11адеп-хпс1исед агРЬгхРхз. АгРЬ.г1Ыз КЬеит. , 50: 2338-46.

5то1еп ТЗ, ЗЬехпег С. (2003). Ыа£ Κθν Огид ϋί3θον. 2: 47388.

Тагп, Ь., Мс01упп, Ь.М., Тгаупог, Р., МикЬегэее, К.,

ВагЫеРР, .Ι.Μ.3., Едздагйз, Т. (2007) ВгхЬхзЬ Тоигпа1 о£ Сапсег,

97, 378-383.

ТеРзиз! Ыака, ЫогхЬхго ЫхзЫтоРо апй ТаДапиЛэи КхзЫтого,

АгРЪгхЫз Кез 2002, 4 (зирр1 3):3233-3242. Иа1зт1Ы1 АЬаЗ Ь,

КеЪаухаз Ц, ВоиЬепо££ В. (2004) Титог песгозхз £ас£ог-а1рЬа ргосЗисРхоп 13 аззосхаТед νίϋΗ 1езз Ьоб.у се11 тазз хп «отеп адхСЬ гЬеитаРохЦ агРЬгхРхз. Т ВкеитаЬо1.; 31:23-9. Иегпхд еЬ а1.

(2008) ЕЕГхсасу о£ ΤΟΙ 01348, а 3θ1θο£ίνθ ЛАК2 хпЫЫРог, хп егеаьтепь о£ а тпиг1пе πιοάβΐ о£ ТАК2Уб17Г-1пс1исед ро1усуСЬетп1а νβΓθ, Сапсег Се11 13(4), 311-320.

Нхе1апс1 НА, МхсИаеНз М, КхгзсЬЬаит ВТ, Кис1о1рЫ КА.

(2005). Ыа£ Κ€ν Егид ϋίβοον. 4:331-44. ОзСеоаг£кг1£1з - ап ипРгеаъаЫе Зхзеазе?

Ихгрг ер а1. (2007) Моизе Моде1з о£ 1п£1атта£огу Воие1

Юхзеазе, Аймапсед Бгид ϋβϋνβΓγ Κθνίθν/β, 1073-1083.

МсСхппхРу, Ώ.Ρ. (2004) Ема1иаС1оп о£ £гезЬ апд сгуоргезегуей ЬераЪосуЪез аз хп νϊϋΓΟ дгид теЬаЬоНзт ϋοοίβ £ог Ске ргесИсСхоп о£ теСаЬоНс с!еагапсе. Бгид МеЬаЬоМзт апс! Ώχ3ρο3ίΐ;ίοη, 32, 11, 1247.

Все публикации, включая, но не ограничиваясь, патентами и патентными заявками, цитированные в данном описании, включены в настоящее описание ссылкой, как будто каждую отдельную публикацию конкретно и отдельно указывали как включенную в настоящее описание в виде полностью приведенной ссылки.

Из приведенного выше описания специалистам в данной области придут в голову различные модификации и изменения в композициях и способах данного изобретения. Подразумевается, что все подобные модификации, попадающие в рамки прилагаемой

Claims (11)

1. формулы изобретения, включены в нее.

   Следует понять, что такие факторы, как способность различных соединений к дифференциальной клеточной проницаемости, могут способствовать расхождению между активностью соединений в биохимических т у1уо и клеточных анализах.

   По меньшей мере, некоторые из химических названий соединений изобретения, приведенных и представленных в данном изобретении, могли быть получены в автоматическом базисе при помощи коммерчески доступной компьютерной программы названий химических соединений и не были независимо проверены. Репрезентативные программы, осуществляющие данную функцию, включают в себя компьютерную программу по присваиванию названий Ьехюйет, поставляемую Ореп Еуе 8ойуаге, 1пс., и компьютерную программу Аи1опот 8оП\уаге, поставляемую МОЙ, 1пс. В том случае, когда указанное химическое название и изображенная химическая структура различаются, контроль будет осуществляться по изображенной структуре.

   Приведенные в настоящем описании химические структуры были получены либо при помощи СйетЭгау®, либо ^^©/□КАХУ. Любая свободная валентность, возникающая у атома углерода, кислорода или азота в приведенных здесь структурах, указывает на наличие атома водорода. В случае, когда в структуре имеется хиральный центр, но для данного хирального центра не приведено конкретное стереохимическое описание, в структуру входят оба энантиомера, связанные с данной хиральной структурой.

   - 36 020111

   1. Соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически эффективное количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1.
3. 3. Фармацевтическая композиция по п.2, содержащая дополнительный терапевтический агент, где дополнительный терапевтический агент представляет собой агент для лечения, предупреждения или профилактики воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани, и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией Ш6.
4. 4. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1 для получения лекарственного средства.
5. 5. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1 в качестве лекарст венного средства.
6. 6. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1 для лечения, предупреждения и/или профилактики воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани, и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией Ш6.
7. 7. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1 для получения лекарственного средства для лечения, предупреждения и/или профилактики воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани, и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией Ш6.
8. 8. Способ лечения или профилактики воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани, и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией Ш6. при этом указанный способ включает в себя введение эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1, 4 или 5 или фармацевтической композиции по п.2.
9. 9. Способ по п.8, в котором воспалительное состояние представляет собой ревматоидный артрит.
10. 10. Способ по п.8, в котором состояние или заболевание включает в себя воспаление.
11. 11. Способ по п.8, где соединение по п.1 вводят в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом, где дополнительный терапевтический агент представляет собой агент для лечения, предупреждения или профилактики воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани, и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией Ш6.

    4^)