ES2634325T3 - Nuevo compuesto útil para el tratamiento de enfermedades degenerativas e inflamatorias - Google Patents

Abstract

Un compuesto de acuerdo con la Fórmula I:**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento, prevención o profilaxis de osteoartritis, enfermedad alérgica de las vías respiratorias o enfermedades intestinales inflamatorias.

Description

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DESCRIPCION

Nuevo compuesto util para el tratamiento de enfermedades degenerativas e inflamatorias Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un compuesto que es un inhibidor de JAK, para su uso en el tratamiento, la prevencion o la profilaxis de la osteoartritis, la enfermedad alergica de las vfas respiratorias o las enfermedades intestinales inflamatorias opcionalmente en combinacion con un agente terapeutico adicional.

Las cinasas Janus (JAK) son tirosina cinasas citoplasmicas que transducen la senalizacion de citocinas de los receptores de membrana a los factores de transcripcion STAT. Se describen cuatro miembros de la familia JAK, JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2. Tras la union de la citocina a su receptor, los miembros de la familia JAK experimentan la auto- y/o la transfosforilacion entre sf, seguidas de la fosforilacion de las STAT que posteriormente migran al nucleo para modular la transcripcion. La transduccion de senales intracelulares de JAK-STAT proporciona interferones, la mayona de interleucinas, asf como tambien una diversidad de citocinas y factores endocrinos tales como EPO, TPO, GH, OSM, LIF, CNTIF, GM-CSF y PRL (Vainchenker W. y col. (2008).

La combinacion de la investigacion de modelos geneticos y de inhibidores de JAK de molecula pequena revelo el potencial terapeutico de diversos JAK. JAK3 se valida por medio de la genetica del raton y del ser humano como una diana de inmunosupresion (O'Shea J. y col. (2004)). Se sometieron a desarrollo clmico de manera satisfactoria inhibidores JAK3, inicialmente para el rechazo del trasplante de organos pero posteriormente tambien en otras indicaciones inmunoinflamatorias tales como la artritis reumatoide (AR), la psoriasis y la enfermedad de Crohn (
http://clinicaltrials.gov/).

TYK2 es una diana potencial para enfermedades inmunoinflamatorias, siendo validada por la genetica humana y estudios de inactivacion genica en ratones (Levy D. y Loomis C. (2007)).

JAK1 es una nueva diana en el area de enfermedades inmunoinflamatorias. JAK1 heterodimeriza con las otras JAK para transducir la senalizacion proinflamatoria accionada por citocinas. Por tanto, cabe esperar que la inhibicion de JAK1 y/u otras JAK constituya una ventaja terapeutica para una gama de enfermedades inflamatorias asf como tambien para otras enfermedades accionadas por la transduccion de senales mediadas por JAK.

Antecedentes de la invencion

La degeneracion del cartflago es la evidencia patologica de diversas enfermedades, entre las cuales la artritis reumatoide y la osteoartritis son las mas prominentes. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad cronica degenerativa de las articulaciones, caracterizada por la inflamacion y la destruccion de las estructuras de la articulacion. Cuando no se controla la enfermedad, conduce a una discapacidad sustancial y a dolor debido a la perdida de funcionalidad de la articulacion e incluso a la muerte prematura. El objetivo de la terapia de la AR, por tanto, es no solo ralentizar la enfermedad sino tambien lograr la remision con el fin de detener la destruccion de la articulacion. Ademas de la gravedad del desenlace de la enfermedad, la elevada prevalencia de la AR (~ un 0,8 % de los adultos se ven afectados en todo el mundo) se traduce en un elevado impacto socio-economico. (Para revisiones sobre la AR, se hace referencia a Smolen y Steiner (2003); Lee y Weinblatt (2001); Choy y Panavi (2001); O'Dell (2004) y Firestein (2003)).

La osteoartritis (tambien denominada OA, o artritis de uso o desgaste normal) es la forma mas comun de artritis y se caracteriza por perdida del cartflago articular, con frecuencia asociada a la hipertrofia del hueso y el dolor. Para una revision amplia de la osteoartritis, se remite a Wieland y col. (2005).

La osteoartritis es diffcil de tratar. Actualmente, no existe cura disponible y el tratamiento se centra en el alivio del dolor y la prevencion de la deformacion de la articulacion afectada. Los tratamientos comunes incluyen el uso de farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). Aunque los complementos dieteticos, tales como la condroitina y el sulfato de glucosamina, se han constatado como opciones seguras y eficaces para el tratamiento de la osteoartritis, un ensayo clmico reciente revelo que ninguno de los dos tratamientos reduce el dolor asociado a la osteoartritis. (Clegg y col., 2006). Tomados juntos, no existen farmacos osteoartnticos de modificacion de la enfermedad.

La simulacion de los procesos anabolicos, los procesos catabolicos de bloqueo o una combinacion de estos dos, pueden dar como resultado la estabilizacion del cartflago, y quizas incluso la reversion del dano, y por tanto previenen el avance posterior de la enfermedad. Diversos agentes de estimulacion pueden favorecer la estimulacion anabolica de los condrocitos. El factor-I de crecimiento de tipo insulina (IGF-I) es el factor de crecimiento anabolico predominante en el fluido sinovial y estimula la smtesis por un lado de proteoglucanos y por otro, del colageno. Tambien se ha mostrado que los miembros de la familia de protema morfogenica osea (BMP), en concreto BMP2, BMP4, BMP6 y BMP7, y los miembros del factor-p de crecimiento de transformacion en humanos (TGF-P) pueden inducir la estimulacion anabolica de los condrocitos (Chubinskaya y Kuettner, 2003). Se ha identificado recientemente un compuesto que induce la estimulacion anabolica de los condrocitos (documento US 6.500.854; documento EP 1 391 211). Sin embargo, la mayona de estos compuestos muestran diversos efectos secundarios y,

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por consiguiente, existe una fuerte necesidad de compuestos que estimulen la diferenciacion de los condrocitos sin estos efectos secundarios.

Vandeghinste y col. (documento WO 2005/124342) descubrieron la JAK1 como diana cuya inhibicion podna tener relevancia terapeutica para diversas enfermedades incluyendo la OA. La JAK1 pertenece a la familia de cinasas Janus (JAK) de tirosina cinasas citoplasmicas, implicadas en la transduccion de senales intracelulares mediada por receptores de citocinas. La familia JAK consiste en 4 miembros: JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2. Las JAK se reclutan a receptores de citocinas, tras la union de la citocina, seguido de la heterodimerizacion del receptor de citocinas y una subunidad del receptor compartida (cadena gamma-c comun, gp130). Despues, se activan las JAK por medio de auto- y/o transfosforilacion por medio de otra JAK, dando como resultado la fosforilacion de los receptores y el reclutamiento y la fosforilacion de los miembros del transductor de senales y el activador de transcripcion (STAT). Los STAT fosforilados se dimerizan y experimentan traslocacion al nucleo, en el que se unen a regiones potenciadoras de los genes sensibles a las citocinas. El estudio de inactivacion del gen de JAK1 en ratones demostro que la JAK1 desempena funciones esenciales y no redundantes durante el desarrollo: los ratones JAK1 -/- murieron 24 horas despues del nacimiento y el desarrollo de linfocitos se vio gravemente alterado. Ademas, las celulas JAK1 -/- no fueron reactivas, o fueron menos reactivas, a las citocinas que usan receptores de citocinas de clase II, receptores de citocinas que usan la subunidad gamma-c para la senalizacion y la familia de receptores de citocinas que usan la subunidad gp130 para la senalizacion (Rodig y col., 1998).

Se han implicado diversos grupos en la senalizacion de JAK-STAT en la biologfa de los condrocitos. Li y col. (2001) demostraron que la oncostatina M induce la expresion de los genes de MMP y TIMP3 en los condrocitos primarios por medio de la activacion de las vfas de senalizacion de JAK/STAT y MAPK. Osaki y col. (2003) demostraron que la inhibicion del colageno II mediada por interferon-gamma en los condrocitos implica la senalizacion de JAK-STAT. IL1-beta induce el catabolismo de cartflago por medio de la reduccion de la expresion de los componentes de la matriz, y por medio de la induccion de la expresion de colagenasas y de sintasa de oxido mtrico inducible (NOS2), que actua como mediador en la produccion de oxido de nftrico (NO). Otero y col. (2005) demostraron que la leptina y IL1-beta indudan de forma sinergica la produccion de NO o la expresion del ARNm de NOS2 en los condrocitos, y que se bloquea por medio de un inhibidor de JAK. Legendre y col. (2003) demostraron que IL6/receptor IL6 induda la regulacion negativa del colageno II de genes de matriz espedficos de cartflago, el nucleo de agrecan y la protema de union en condrocitos articulares bovinos, y que esto estaba mediado por la senalizacion de JAK/STAT. Por tanto, estas observaciones indican un papel de la actividad de JAK cinasa en la homeostasis del cartflago y oportunidades terapeuticas para los inhibidores de las cinasas JAK.

Los miembros de la familia JAK se han visto implicados en afecciones adicionales que incluyen trastornos mieloproliferativos (O'Sullivan y col., 2007, Mol. Immunol. 44 (10):2497-506), en los que se han identificado mutaciones en JAK2. Esto indica que los inhibidores de JAK, en particular de JAK2, tambien pueden servir de utilidad en el tratamiento de trastornos mieloproliferativos. Adicionalmente, la familia JAK, en particular, JAK1, JAK2 y JAK3, se han vinculado al cancer, en particular a las leucemias, por ejemplo, la leucemia mieloide aguda (O'Sullivan y col., 2007, Mol Immunol. 44(10):2497-506; Xiang y col., 2008, "Identification of somatic JAK1 mutations in patients with acute myeloid leukemia" Blood First Edition Paper, prepublicado en la red el 6 de diciembre de 2007; dOi 10.1182/blood-2008) y leucemia linfoblastica aguda (Mullighan y col., 2009) o tumores solidos por ejemplo leiomiosarcoma uterino (Constantinescu y col., 2007, Trends in Biochemical Sciences 33(3): 122-l3l), cancer de prostata (Tam y col., 2007, British Journal of Cancer, 87, 378-383). Estos resultados indican que los inhibidores de JAK, en particular de JAK1 y JAK2, pueden tambien presentar utilidad en el tratamiento del cancer (leucemias y tumores solidos por ejemplo leiomiosarcoma uterino, cancer de prostata).

Se ha establecido un vinculo con enfermedades autoinmunitarias para JAK3 y Tyk2. Las mutaciones de JAK3, pero tambien en la cadena del receptor gamma-c de componentes de senalizacion aguas arriba y el receptor IL7 representan, todas juntas, aproximadamente un 70 % de los casos de inmunodeficiencia combinada grave humana (O'Shea y col., 2004). Notese que JAK1 coopera con JAK3 en la transduccion de senales a partir de la cadena del receptor gamma-c. Se observan polimorfismos de Tyk2 en el lupus sistemico eritematoso (LES) (O'Sullivan y col., 2007, Mol Immunol. 44(10):2497-506). Ademas, la direccion a la familia JAK puede proporcionar una oportunidad terapeutica en el area de la inmunoinflamacion.

El documento WO 2009/017954 desvela [1,2,4]triazolo[1,5-a]piridinas sustituidas como inhibidores de JAK2.

Las terapias actuales no son satisfactorias y por tanto sigue siendo necesario identificar compuestos adicionales que puedan usarse en el tratamiento de afecciones inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican el deterioro de la renovacion del cartflago y/o malformaciones congenitas del cartflago. Por tanto, la presente invencion proporciona un compuesto para su uso en el tratamiento, la prevencion o la profilaxis de la osteoartritis, la enfermedad alergica de las vfas respiratorias o las enfermedades intestinales inflamatorias. En particular, el compuesto presenta elevada potencia y selectividad para JAK1 con respecto a otros miembros de la familia JAK ademas de la diana cinasa 385 y las dianas no cinasas. Adicionalmente, los datos indican que el compuesto tiene un buen margen de seguridad. Por tanto, se concluye que la presente invencion ofrece una nueva oportunidad para el tratamiento de enfermedades mediadas por JAK1, en particular la osteoartritis, la enfermedad alergica de las vfas respiratorias y las enfermedades intestinales inflamatorias.

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La presente invencion tambien proporciona el uso del compuesto de la invencion en la preparacion de un medicamento para el tratamiento de estas enfermedades y afecciones.

Sumario de la invencion

La presente invencion se basa en el descubrimiento de que los inhibidores de JAK, en particular de JAK1, son utiles para el tratamiento de afecciones inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican el deterioro de la renovacion del cartflago o malformaciones congenitas del cartflago.

En consecuencia, en un primer aspecto de la invencion, se desvela un compuesto de la invencion que tiene la Formula I:

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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento, la prevencion o la proliferacion de la osteoartritis, la enfermedad alergica de las vfas respiratorias o las enfermedades intestinales inflamatorias.

El compuesto de la invencion es un nuevo inhibidor de JAK que presenta una elevada potencia y selectividad para JAK1 con respecto a otros miembros de la familia JAK y dianas cinasa 385 y no cinasa, asf como tambien muestra un buen margen de seguridad. El uso de un compuesto con este perfil puede dar como resultado ventajas en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, en particular la osteoartritis, la enfermedad alergica de las vfas respiratorias o las enfermedades intestinales inflamatorias, debido a una menor incidencia de los efectos colaterales.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona el compuesto de formula (I) en combinacion con un agente terapeutico adicional en el que el agente terapeutico adicional es un agente para el tratamiento de afecciones inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades proliferativas, el rechazo a trasplantes, enfermedades que implica el deterioro de la renovacion del cartflago o malformaciones congenitas del cartflago.

En un aspecto adicional, la presente divulgacion proporciona el compuesto de la invencion para su uso en el tratamiento o la prevencion de una afeccion seleccionada entre las enumeradas en el presente documento, tales como la osteoartritis, la enfermedad alergica de las vfas respiratorias, las enfermedades intestinales inflamatorias, que pueden estar asociadas a la actividad aberrante de JAK. En un aspecto espedfico, la presente divulgacion proporciona el compuesto de la invencion para su uso en el tratamiento o la prevencion de afecciones que se enumeran en el presente documento tales como la osteoartritis, la enfermedad alergica de las vfas respiratorias, las enfermedades intestinales inflamatorias, que se asocian a la actividad aberrante de JAK1.

En un aspecto adicional, la presente divulgacion proporciona el compuesto de la invencion para su uso en el tratamiento o la prevencion de una afeccion enumerada en el presente documento, tal como la osteoartritis, la enfermedad alergica de las vfas respiratorias, las enfermedades intestinales inflamatorias, es decir una relacion causal con la actividad anormal de jAk. En una realizacion espedfica la actividad anormal de JAK es la actividad anormal de JAK1.

En aspectos adicionales, la presente divulgacion proporciona procedimientos para la smtesis del compuesto de la invencion, con protocolos y vfas de smtesis representativos desvelados mas adelante en el presente documento.

En consecuencia, es un objeto principal de la presente invencion proporcionar un compuesto que puede tratar o aliviar afecciones o enfermedades o smtomas de las mismas que se enumeran en el presente documento, tales como la osteoartritis, la enfermedad alergica de las vfas respiratorias, las enfermedades intestinales inflamatorias, que pueden relacionarse causalmente con la actividad de JAK. En particular la enfermedad o afeccion puede relacionarse causalmente con la actividad de JAK1.

Otros objetos y ventajas resultaran evidentes para los expertos en la materia a partir de la consideracion de la descripcion detallada adjunta.

Descripcion detallada de la invencion Definiciones

Los siguientes terminos pretenden tener los significados que se presentan a continuacion y son utiles para la comprension de la descripcion y el alcance pretendido de la presente invencion.

5 Cuando se describe la invencion, que puede incluir compuestos, composiciones farmaceuticas que contienen dichos compuestos y procedimientos de uso de dichos compuestos y composiciones, los siguientes terminos, si estan presentes, tienen los siguientes significados, a menos que se indique lo contrario.

Los artfculos "un" y "una" se pueden usar en el presente documento para hacer referencia a uno o mas de un (es decir, al menos uno) de los objetos gramaticales del artfculo. A modo de ejemplo, "un analogo" significa un analogo o 10 mas de un analogo.

"Farmaceuticamente aceptable" significa aprobado o susceptible de aprobacion por una agencia reguladora de un gobierno federal o de un estado o la agencia correspondiente en pafses diferentes a los Estados Unidos, o que se enumera en la Farmacopea de los EE.UU. u otro compendio farmaceutico reconocido para su uso en animales, y mas en particular, en seres humanos.

15 "Sal farmaceuticamente aceptable" se refiera a una sal del compuesto de la invencion que es farmaceuticamente aceptable y que posee la actividad farmaceutica deseada del compuesto parental. En particular, dichas sales no son toxicas y pueden ser sales de adicion de acido organico o inorganico y sales de adicion de base. Espedficamente, dichas sales incluyen: (1) sales de adicion de acido, formadas con acidos inorganicos tales como acido clorhndrico, acido bromhudrico, acido sulfurico, acido mtrico, acido fosforico, y similares; o formadas con acidos organicos tales 20 como acido acetico, acido propionico, acido hexanoico, acido ciclopentanopropionico, acido glicolico, acido piruvico, acido lactico, acido malonico, acido sucdnico, acido malico, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido dtrico, acido benzoico, acido 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, acido cinamico, acido mandelico, acido metanosulfonico, acido etanosulfonico, acido 1,2-etano-disulfonico, acido 2-hidroxietanosulfonico, acido bencenosulfonico, acido 4- clorobencenosulfonico, acido 2-naftalenosulfonico, acido 4-toluensulfonico, acido canforsulfonico, acido 425 metilbiciclo[2.2.2]oct-2-en-1-carboxflico, acido glucoheptonico, acido 3-fenilpropionico, acido trimetilacetico, acido butilacetico terciario, acido lauril sulfurico, acido gluconico, acido glutamico, acido hidroxinaftoico, acido salidlico, acido estearico, acido muconico y similares; o (2) sales formadas cuando un proton acido presente en el compuesto parental bien es sustituido por un ion metalico, por ejemplo, un ion de metal alcalino, un ion alcalino terreo, o un ion de aluminio; o se coordina con una base organica tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, N- 30 metilglucamina y similares. Sales adicionales incluyen, a modo de ejemplo unicamente, sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio, tetraalquilamonio, y similares; y cuando el compuesto contiene funcionalidad basica, sales de acidos inorganico u organicos no toxicas, tales como clorhidrato, bromhidrato, tartrato, mesilato, acetato, maleato, oxalato y similares. La expresion "cation farmaceuticamente aceptable" se refiere a un contra-ion cationico aceptable de un grupo funcional acido. Dichos cationes se ejemplifican por medio de cationes de sodio, potasio, calcio, 35 magnesio, amonio, tetraalquilamonio y similares.

"Vehfculos farmaceuticamente aceptable" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vedculo con el que se administra el compuesto de la invencion.

"Solvato" se refiere a formas del compuesto que se asocian a un disolvente, normalmente por medio de reaccion de solvolisis. La asociacion ffsica incluye el enlace de hidrogeno. Los disolventes convencionales incluyen agua, etanol, 40 acido acetico y similares. Los compuestos de la invencion se pueden preparar, por ejemplo, en forma cristalina y se pueden solvatar o hidratar. Los solvatos apropiados incluyen solvatos farmaceuticamente aceptables, tales como hidratos, y ademas incluyen tanto solvatos estequiometricos como solvatos no estequiometricos. En algunos casos el solvato es susceptible de aislamiento, por ejemplo cuando se incorporan una o mas moleculas de disolvente a la estructura reticular del cristal del solido cristalino. "Solvato" abarca tanto solvatos de fase de disolucion como 45 solvatos susceptibles de aislamiento. Los solvatos representativos incluyen hidratos, etanolatos y metanolatos.

"Sujeto" incluye los seres humanos. Las expresiones "ser humano", "paciente" y "sujeto" se usan de manera intercambiable en el presente documento.

"Cantidad terapeuticamente eficaz" significa la cantidad de un compuesto que, cuando se administra a un sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para realizar dicho tratamiento para la enfermedad. La "cantidad 50 terapeuticamente eficaz" puede variar dependiendo del compuesto, el trastorno y su gravedad, y la edad, peso, etc., del sujeto que se trata.

"Prevenir" o "prevencion" se refiere a una reduccion del riesgo de adquirir o desarrollar una enfermedad o trastorno (es decir, provocar que al menos uno de los smtomas clmicos de la enfermedad no se desarrolle en un sujeto que puede estar expuesto a un agente causante de la enfermedad, o predispuesto a la enfermedad antes de la aparicion 55 de la enfermedad).

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El termino "profilaxis" esta relacionado con la "prevencion" y se refiere a una medida o procedimiento cuya finalidad es prevenir, en lugar de tratar o curar la enfermedad. Los ejemplos no limitantes de medidas profilacticas pueden incluir la administracion de vacunas; la administracion de heparina de bajo peso molecular a pacientes hospitalarios con riesgo de trombosis debido, por ejemplo, a la inmovilizacion; y la administracion de agente antimalaricos tales como cloroquina, antes de una visita a una region geografica en la cual la malaria es endemica o el riesgo de contraer malaria es elevado.

"Tratar" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno se refiere, en una realizacion, a la mejora de la enfermedad o trastorno (es decir, detener la enfermedad o reducir la manifestacion, alcance o gravedad de al menos uno de sus smtomas clmicos). En otra realizacion, "tratar" o "tratamiento" se refieren a mejorar al menos un parametro ffsico, que no resulta discernible por parte del sujeto. En otra realizacion, "tratar" o "tratamiento" se refieren a modular la enfermedad o trastorno bien de forma ffsica (por ejemplo, estabilizacion de un smtoma discernible), de forma fisiologica (por ejemplo, estabilizacion de un parametro ffsico), o ambas. En otra realizacion, "tratar" o "tratamiento" se refiere a ralentizar el avance de la enfermedad.

Como se usa en el presente documento, la expresion "trastorno o trastornos inflamatorios" se refiere al grupo de trastornos que incluyen, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis idiopatica juvenil, psoriasis, enfermedades respiratorias alergicas (por ejemplo, asma, rinitis), enfermedades intestinales inflamatorias (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis), patologfas inducidos por endotoxinas (por ejemplo, complicaciones tras revascularizacion quirurgica o estados cronicos de endotoxinas que contribuyen por ejemplo a insuficiencia cardfaca cronica), y enfermedades relacionadas que afectan al carfflago, tales como las que afectan a las articulaciones. En particular, la expresion se refiere a artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedades respiratorias alergicas (por ejemplo, asma) y enfermedades intestinales inflamatorias.

Como se usa en el presente documento, la expresion "enfermedad o enfermedades autoinmunitarias" se refiere al grupo de enfermedades que incluye enfermedades obstructivas de las vfas respiratorias, incluyendo trastornos tales como EPOC, asma (por ejemplo, asma intrrnseco, asma extrrnseco, asma de polvo, asma infantil), particularmente el asma cronica o inveterada (por ejemplo, asma taroffa e hipersensibilidad de las vfas respiratorias), bronquitis, incluyendo asma bronquial, lupus sistemico eritematoso (LES), esclerosis multiple, diabetes mellitus de tipo I y complicaciones asociadas a la misma, eccema atopico (dermatitis atopica), dermatitis de contacto y dermatitis eccematosa, enfermedad intestinal inflamatoria (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), ateroesclerosis y esclerosis lateral amiotrofica. En particular, la expresion se refiere a EPOC, asma, lupus sistemico eritematoso, diabetes mellitus de tipo I y enfermedad intestinal inflamatoria.

Como se usa en el presente documento, la expresion "enfermedad o enfermedades proliferativas" se refiere a trastornos tales como el cancer (por ejemplo, leiomiosarcoma uterino o cancer de prostata), trastornos mieloproliferativos (por ejemplo, policitemia verdadera, trombocitosis esencial y mielofibrosis), leucemia (por ejemplo, leucemia mieloide aguda y leucemia linfoblastica aguda), mieloma multiple, psoriasis, reestenosis, esclerodermitis o fibrosis. En particular, la expresion se refiere a cancer, leucemia, mieloma multiple y psoriasis.

Como se usa en el presente documento, el termino "cancer" se refiere a proliferacion celular maligna o benigna en la piel u organos corporales, por ejemplo pero sin limitarse al cancer de, mama, prostata, pulmon, rinon, pancreas, estomago o intestino. El cancer tiende a infiltrarse en el interior del tejido adyacente y a dispersarse (metastasis) hasta organos distantes, por ejemplo en huesos, hffgado, pulmon o cerebro. Como se usa en el presente documento, el termino cancer incluye tanto tipos celulares tumorales metastasicos, tales como pero sin limitarse a, melanoma, linfoma, leucemia, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y mastocitoma como tipos de carcinomas tisulares, tales como pero sin limitarse a, cancer colorrectal, cancer de prostata, cancer de pulmon de celulas pequenas y cancer de pulmon de celulas que no son pequenas, cancer de mana, cancer de pancreas, cancer de vejiga, cancer renal, cancer gastrico, glioblastoma, cancer de hffgado primario, cancer de ovarios, cancer de prostata y leiomiosarcoma uterino.

Como se usa en el presente documento, el termino "leucemia" se refiere a enfermedades neoplasicas de la sangre y de los organos que forman la sangre. Dichas enfermedades pueden provocar disfuncion del sistema inmunitario y de la medula osea, que convierte al hospedador en altamente susceptible a la infeccion y a hemorragias. En particular, el termino leucemia se refiere a la leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia linfoblastica aguda (LLA).

Como se usa en el presente documento, la expresion "rechazo de trasplante" se refiere al rechazo de celulas agudo o cronico, a alo- o xeno-injertos de tejido o de organos solidos de, por ejemplo, isletas pancreaticas, hemocitoblastos, medula osea, piel, musculo, tejido de la cornea, tejido neuronal, corazon, pulmon, corazon-pulmon combinado, rinon, hffgado, intestino, pancreas, traquea o esofago, o enfermedades de injerto contra huesped.

Como se usa en el presente documento, la expresion "enfermedades que implican el deterioro de la renovacion del carfflago" incluye trastornos tales como osteoartritis, artritis psoriasica, artritis reumatoide juvenil, artritis de Gouty, artritis septica o infecciosa, artritis reactiva, distrofia simpatica de reflejos, algodistrofia, smdrome de Tietze o condritis costal, fibromialgia, osteocondritis, artritis neurogenica o neuropatica, artropaffa, formas endemicas de artritis tales como osteoartritis deformans endemica, enfermedad de Mseleni y enfermedad de Handigou; degeneracion resultante de fibromialgia, lupus sistemico eritematoso, escleroderma y espondilitis anquilosante.

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Como se usa en el presente documento, la expresion "malformacion o malformaciones congenitas de cartMago" incluyen trastornos tales como condrolisis hereditaria, condrodisplasias y pseudocondrodisplasias, en particular, pero sin limitacion, microtia, anotia, condrodisplasia metafiseal y trastornos relacionados.

Como se usa en el presente documento, el termino "JAK" se refiere a la familia de cinasas Janus (JAK) que son tirosina cinasas citoplasmicas que producen la transduccion la senalizacion de citocinas desde los receptores de membrana hasta los factores de transcripcion de STAT. Se describen cuatro miembros de la familia jAk, JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2 y el termino JAK puede hace referencia a todos los miembros de la familia JAK de forma colectiva o a uno o mas miembros de la familia JAK como indique el contexto.

"Compuesto o compuestos de la invencion", y expresiones equivalentes, significan el compuesto de Formula que se describe en el presente documento, cuya expresion incluye sales farmaceuticamente aceptables, y los solvatos, por ejemplo, hidratos, y los solvatos de las sales farmaceuticamente aceptables cuando el contexto lo permita. Similarmente, la referencia a intermedios, tanto si se reivindican en sf mismos como si no, significa sus sales y sus solvatos, cuando el contexto lo permita.

Cuando se hace referencia a intervalos en el presente documento, por ejemplo pero sin limitacion, alquilo C1-C8, la cita de un intervalo debena considerarse una representacion de cada miembro de dicho intervalo.

Como se usa en el presente documento, la expresion "variante isotopica" se refiere a un compuesto que contiene proporciones de isotopos no naturales en uno o mas atomos que constituyen dicho compuesto. Por ejemplo, una "variante isotopica" de un compuesto puede contener uno o mas isotopos no radiactivos, tales como por ejemplo, deuterio (2H o D), carbono-13 (13C), nitrogeno-15 (15N) o similares. Debe entenderse que, en un compuesto en el que se lleva a cabo dicha sustitucion isotopica, los siguientes atomos, cuando se encuentran presentes, pueden variar, de manera que, por ejemplo, cualquier hidrogeno puede ser 2H/D, cualquier carbono puede ser 13C, o cualquier nitrogeno puede ser 15N, y la presencia y ubicacion de dichos atomos puede venir determinada por la experiencia de la tecnica. De igual forma, la invencion puede incluir la preparacion de variantes isotopicas con radioisotopos, por ejemplo, cuando los compuestos resultantes se puedan usar para estudios de distribucion de farmaco y/o tejido de sustrato. Los isotopos radioactivos de tritio, es decir, 3H, y carbono-14, es decir 14C, son particularmente utiles para este fin, a la vista de su facilidad de incorporacion y procedimientos sencillos de deteccion. Ademas, se pueden preparar los compuestos que estan sustituidos con isotopos que emiten positrones, tales como 11C, 18F, 15O y 13N, y sena utiles en los estudios de Topograffa de Emision de Positrones (PET) para examinar la ocupacion del receptor de sustrato.

Se pretende que todas las variantes isotopicas del compuesto que se proporciona en el presente documento, radiactivas o no, queden incluidas dentro del alcance de la invencion.

Los estereoisomeros que no son imagenes especulares uno de otro se denominan "diastereoisomeros" y aquellos que son imagenes especulares que no se pueden superponer entre sf se denominan "enantiomeros". Cuando un compuesto tiene un centro asimetrico, por ejemplo, se una a cuatro grupos diferentes, es posible un par de enantiomeros. Un enantiomero se puede caracterizar por medio de la configuracion absoluta de su centro asimetrico y se describe por medio de las reglas de secuenciacion R y S de Cahn y Prelog, o por medio de la manera en la que la molecula rota el plano de luz polarizada y se designa como dextrorrotatorio o levorrotatorio (es decir, como isomeros-(+) o (-), respectivamente). Puede existir un compuesto quiral en forma de enantiomero individual o en forma de sus mezclas. Una mezcla que contiene proporciones iguales de enantiomeros se denomina "mezcla racemica".

Los "tautomeros" se refieren a compuestos que son formas intercambiables de una estructura de compuesto particular, y que vanan en el desplazamiento de los atomos de hidrogeno y los electrones. De este modo, dos estructuras pueden estar en equilibrio a traves del movimiento de los electrones ny un atomo (normalmente H). Por ejemplo, los enoles y las cetonas son tautomeros ya que se interconvierten de forma rapida por medio de tratamiento bien con un acido o bien con una base. Otro ejemplo de tautomena son las formas aci- y nitro- de fenilnitrometano, que se forman de igual manera por medio de tratamiento con un acido o una base.

Las formas tautomericas pueden ser relevantes para lograr la reactividad qmmica optima y la actividad biologica de un compuesto de interes.

El compuesto de la invencion puede poseer uno o mas centros asimetricos; dichos compuestos pueden por tanto producirse en forma de estereoisomeros (R) o (S) individuales o en forma de sus mezclas.

A menos que se indique lo contrario, se pretende que la descripcion o nomenclatura de un compuesto particular en la memoria descriptiva y las reivindicaciones incluyan tanto los enantiomeros individuales como las mezclas, racemicas o de cualquier otro tipo, del mismo. Los procedimientos para la determinacion de la estereoqmmica y la separacion de estereoisomeros son bien conocidos en la tecnica.

EL COMPUESTO

La presente invencion se basa en el descubrimiento de que los inhibidores de JAK son utiles para el tratamiento de afecciones inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican el deterioro de la renovacion del cartflago o malformaciones congenitas del cartflago. El 5 presente compuesto es un inhibidor de los miembros de la familia JAK; espedficamente inhibe la actividad de JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2. En particular, inhibe la actividad de JAK1.

En consecuencia, en un primer aspecto de la invencion, se desvela un compuesto de la invencion que tiene una Formula I:

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10 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento, la prevencion o la proliferacion de la osteoartritis, la enfermedad alergica de las vfas respiratorias o las enfermedades intestinales inflamatorias.

El compuesto de la invencion es {5-[4-(3,3-dimetil-azetidin-1-carbonil)-fenil]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il}-amida de acido ciclopropanocarboxflico.

En una realizacion, el compuesto de la invencion no es una variante isotopica.

15 En un aspecto, el compuesto de la invencion esta presente como base libre.

En un aspecto, el compuesto de la invencion es una sal farmaceuticamente aceptable.

En un aspecto, el compuesto de la invencion es un solvato del compuesto.

En un aspecto, el compuesto de la invencion es un solvato de una sal farmaceuticamente aceptable del compuesto.

PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO

20 Se puede usar el compuesto de la invencion como agente terapeutico para el tratamiento de afecciones en mairnferos que estan causalmente relacionados o que se pueden atribuir a la actividad aberrante de JAK. En particular, afecciones relacionados con la actividad aberrante de JAK1. En consecuencia, en un aspecto la presente invencion proporciona el compuesto de la invencion para su uso en el tratamiento, la prevencion o la profilaxis de la osteoartritis, la enfermedad alergica de las vfas respiratorias (por ejemplo, asma) y las enfermedades inflamatorias 25 intestinales.

En un aspecto adicional la presente invencion proporciona el compuesto dela invencion, para su uso en combinacion con un agente terapeutico adicional.

Un regimen particular del presente uso comprende la administracion a un sujeto que padece osteoartritis, la enfermedad alergica de las vfas respiratorias o enfermedades inflamatorias intestinales una cantidad eficaz del 30 compuesto de la invencion durante un penodo de tiempo suficiente para reducir el nivel de inflamacion en el sujeto, y preferentemente terminar, los procesos responsables de dicha inflamacion.

Un regimen particular adicional del presente procedimiento comprende la administracion a un sujeto que padece enfermedades que implican el deterioro de la renovacion del cartflago (por ejemplo, osteoartritis) de una cantidad eficaz del compuesto de la invencion durante un penodo de tiempo suficiente para reducir y, preferentemente, 35 terminar los procesos de auto-perpetuacion responsables de dicha degradacion. Una realizacion particular del procedimiento comprende administrar una cantidad eficaz del compuesto de la invencion a un paciente sujeto que padece o que es susceptible de desarrollar osteoartritis, durante un penodo de tiempo suficiente para reducir o prevenir, respectivamente, la degradacion de cartflago en las articulaciones de dicho paciente y, preferentemente, terminar los procesos de auto-perpetuacion responsables de dicha degradacion. En una realizacion particular, dicho 40 compuesto puede presentar propiedades anabolicas y/o anti-catabolicas de cartflago.

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Los niveles de dosis de inyeccion vanan de aproximadamente 0,1 mg/kg a al menos 10 mg/kg/hora, todo durante aproximadamente 1 a aproximadamente 120 horas y especialmente de 24 a 96 horas. Tambien se puede administra una inyeccion intravenosa embolada de pre-carga de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o mas, para lograr los niveles estacionarios adecuados. No se espera que la dosis total maxima supere aproximadamente 2 g/dfa para un paciente humano de 40 a 80 kg.

Para la prevencion y/o tratamiento de afecciones a largo plazo, tales como afecciones degenerativas, normalmente el regimen de tratamiento se amplfa durante muchos meses o anos, de manera que se prefiere la dosificacion oral por motivos de comodidad y tolerancia por parte del paciente. Con la dosificacion oral, una a cinco y especialmente dos a cuatro y normalmente tres dosis orales al dfa son regfmenes representativos. Usando estos patrones de dosificacion, cada dosis proporciona de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de compuesto de la invencion, proporcionando cada dosis particular de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg y especialmente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mg/kg.

Generalmente, las dosis transdermicas se seleccionan para proporcionar niveles en sangre similares o mas bajos que los que se consiguen usando dosis de inyeccion.

Cuando se usa para prevenir la aparicion de la osteoartritis, la enfermedad alergica de las vfas respiratorias o enfermedades inflamatorias intestinales, el compuesto de la invencion se administra a un paciente con riesgo de desarrollar la afeccion, normalmente bajo el consejo y supervision de un medico, en los niveles de dosificacion descritos anteriormente. Generalmente, los pacientes con riesgo de desarrollar un trastorno particular incluyen los que tienen un historial familiar de la afeccion, o los que se han identificado por medio de ensayo genetico o exploracion como particularmente susceptibles de desarrollar la afeccion.

El compuesto de la invencion se puede administrar como el unico agente activo o se puede administrar en combinacion con otros agentes terapeuticos, incluyendo otros compuestos que demuestran la misma actividad terapeutica o similar, y que se determina que son seguros y eficaces para dicha administracion combinada. En una realizacion espedfica, la coadministracion de dos agentes (o mas) permite el uso de dosis significativamente mas bajas de cada uno, reduciendo de este modo los efectos secundarios observados.

En una realizacion, el compuesto de la invencion se coadministra con otro agente terapeutico para el tratamiento y/o la prevencion de afecciones inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican el deterioro de la renovacion del cartflago o malformaciones congenitas del cartflago.

En una realizacion, se coadministra el compuesto de la invencion con otro agente terapeutico en la que el agente terapeutico adicional es un agente para el tratamiento y/o prevencion de una afeccion inflamatoria; los agentes particulares incluyen, pero sin limitarse a, agentes inmunorreguladores, por ejemplo, azatioprina, corticoesteroides (por ejemplo, prednisolona o dexametasona), ciclofosfamida, ciclosporina A, tacrolimus, micofenolato de mofetilo, muromonab-CD3 (OKT3, por ejemplo Orthocolone®), ATG, aspirina, acetaminofeno, ibuprofeno, naproxeno y piroxicam.

En una realizacion, el compuesto de la invencion se coadministra con otro agente terapeutico en la que el agente terapeutico adicional es un agente para el tratamiento y/o prevencion de la artritis (por ejemplo, artritis reumatoide); los agentes particulares incluyen, pero sin limitarse a, analgesicos, farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), esteroides, FARME sinteticos (por ejemplo pero sin limitacion metotrexato, leflunomida, sulfasalazina, auranofin, aurotiomalato de sodio, penicilamina, cloroquina, hidroxicloroquina, azatioprina y ciclosporina) y FARME biologicos (por ejemplo pero sin limitacion Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Rituximab y Abatacept).

En una realizacion, el compuesto de la invencion se coadministra con otro agente terapeutico en la que el agente terapeutico adicional es un agente para el tratamiento y/o prevencion de trastornos proliferativos; los agentes particulares incluyen, pero sin limitarse a,: metotrexato, leucovorina, adriamicina, prednisona, bleomicina, ciclofosfamida, 5-fluoracilo, paclitaxel, docetaxel, vincristina, vinblastina, vinorelbina, doxorubicina, tamoxifeno, toremifeno, acetato de megestrol, anastrozol, goserelina, anticuerpo monoclonal anti-HER2 (por ejemplo HerceptinTM), capecitabina, clorhidrato de raloxifeno, inhibidores de EGFR (por ejemplo, Iressa®, Tarceva™, ErbituxTM), inhibidores de VEGF (por ejemplo, AvastinTM), inhibidores de proteosoma (por ejemplo, VelcadeTM), Glivec® e inhibidores de hsp90 (por ejemplo, 17-AAG). Adicionalmente, se puede administrar un compuesto de la invencion en combinacion con otras terapias incluyendo, pero sin limitarse a, radioterapia o cirugfa. En una realizacion espedfica, el trastorno proliferativo se selecciona entre cancer, enfermedad proliferativa o leucemia.

En una realizacion, el compuesto de la invencion se coadministra con otro agente terapeutico en la que el agente terapeutico adicional es un agente para el tratamiento y/o prevencion de enfermedades autoinmunitarias; los agentes particulares incluyen, pero sin limitarse a,: glucocorticoides, agentes citostaticos (por ejemplo, analogos de purina), agentes alquilantes (por ejemplo, mostazas nitrogenadas (ciclofosfamida), nitrosoureas, compuestos de platino y otros), antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, azatioprina y mercaptopurina), antibioticos citotoxicos (por ejemplo, antraciclinas de dactinomicina, mitomicina C, bleomicina y mitramicina), anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-CD20, anti-CD25 o anti-CD3 (OTK3), Atgam® y Thymoglobuline®), ciclosporina,

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tacrolimus, rapamicina (sirolimus), interferones (por ejemplo, IFN-P), protemas de union de TNF (por ejemplo, infliximab (Ramicade®), etanercept (EnbrelTM) o adalimumab (HumiraTM)), micofenolato, Fingolimod y Myriocin.

En una realizacion, el compuesto de la invencion se coadministra con otro agente terapeutico en la que el agente terapeutico adicional es un agente para el tratamiento y/o prevencion del rechazo de trasplantes; los agentes particulares incluyen, pero sin limitarse a: inhibidores de calcineurina (por ejemplo, ciclosporina o tacrolimus (FK506)), inhibidores de mTOR (por ejemplo, sirolimus, everolimus), agentes antiproliferativos (por ejemplo, azatioprina, acido micofenolico), corticoesteroides (por ejemplo, prednisolona, hidrocortisona), anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales del receptor anti-IL-2Ra, basiliximab, daclizumab), anticuerpos policlonales de celulas anti-T (por ejemplo, globulina antitimocito (ATG), globulina antilinfocito (ALG)).

En una realizacion, el compuesto de la invencion se coadministra con otro agente terapeutico en la que el agente terapeutico adicional es un agente para el tratamiento y/o prevencion del asma y/o rinitis y/o EPOC; los agentes particulares incluyen, pero sin limitarse a: agonistas del adrenorreceptor beta2 (por ejemplo, salbutamol, levalbuterol, terbutalina y bitolterol), epinefrina (inhalada o en comprimidos), anticolinergicos (por ejemplo, bromuro de ipratropio), glucocorticoides (orales o inhalados), agonistas P2 de accion prolongada (por ejemplo, salmeterol, formoterol, bambuterol, y albuterol oral de liberacion retardada), combinaciones de esteroides inhalados y broncodilatadores de accion prolongada (por ejemplo, fluticasona/salmeterol, budesonida/formoterol), antagonistas de leucotrieno e inhibidores de smtesis (por ejemplo, montelukast, zafirlukast y zileuton), inhibidores de la liberacion de mediador (por ejemplo, cromoglicato y ketotifeno), reguladores biologicos de la respuesta de IgE (por ejemplo, omalizumab), antihistaminas (por ejemplo, cetirizina, cinarizina, fexofenadina) y vasoconstrictores (por ejemplo, oximetazolina, xilometazolina, nafazolina y tramazolina).

Adicionalmente, el compuesto de la invencion se puede administrar en combinacion con terapias de emergencia para el asma y/o EPOC, terapias que incluyen la administracion de oxfgeno o heliox, salbutamol nebulizado o terbutalina (opcionalmente combinada con un anticolinergico (por ejemplo, ipratropio)), esteroides sistemicos (orales o intravenosos, por ejemplo, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona o hidrocortisona), salbutamol intravenoso, beta-agonistas no espedficos, inyectados o inhalados (por ejemplo, epinefrina, isoetarina, isoproterenol, metaproterenol), anticolinergicos (IV o nebulizados, por ejemplo, glucopirrolato, atropina, ipratropio), metilxantinas (teofilina, aminofilina, bamifilina), anestesicos de inhalacion que tienen un efecto broncodilatador (por ejemplo, isoflurano, halotano, enflurano), ketamina, y sulfato de magnesio intravenoso.

En una realizacion, el compuesto de la invencion se coadministra con otro agente terapeutico en la que el agente terapeutico adicional es un agente para el tratamiento y/o prevencion de enfermedad del intestino irritable (EII); los agentes particulares incluyen, pero sin limitarse a: glucocorticoides (por ejemplo, prednisona, budesonida), agentes sinteticos inmunomoduladores que modifican la enfermedad (por ejemplo, metotrexato, leflunomida, sulfasalazina, mesalazina, azatioprina, 6-mercaptopurina y ciclosporina) y agentes inmunomoduladores biologicos que modifican la enfermedad (infliximab, adalimumab, rituximab y abatacept).

En una realizacion, se coadministra el compuesto de la invencion con otro agente terapeutico en la que el agente terapeutico adicional es un agente para el tratamiento y/o prevencion de lupus sistemico eritematoso; los agentes particulares incluyen, pero sin limitarse a: farmacos anti-reuma de modificacion de enfermedad (FARME) tales como antimalaricos (por ejemplo, plaquenilo, hidroxicloroquina), inmunosupresores (por ejemplo, metotrexato y azatioprina), ciclofosfamida y acido micofenolico; farmacos inmunosupresores y analgesicos, tales como farmacos antiinflamatorios no esteroideos, opiatos (por ejemplo, dextropropoxifeno y co-codamol), opioides (por ejemplo, hidrocodona, oxicodona, MS Contin o metadona) y el parche transdermico de fentanilo Duragesic.

En una realizacion, el compuesto de la invencion se coadministra con otro agente terapeutico en la que el agente terapeutico adicional es un agente para el tratamiento y/o prevencion de la psoriasis; los agentes particulares incluyen, pero sin limitarse a: tratamientos topicos tales como soluciones para bano, humectantes, cremas medicadas y pomadas que contienen alquitran de hulla, ditranol (antralina), corticoesteroides tales como desoximetasona (Topicort™), fluocinonida, analogos de vitamina D3 (por ejemplo, calcipotriol), aceite de argan y retinoides (etretinato, acitretina, tazaroteno), tratamientos sistemicos tales como metotrexato, ciclosporina, retinoides, tioguanida, hidroxiurea, sulfasalazina, micofenolato de mofetilo, azatioprina, tacrolimus, esteres de acido fumarico o sustancias biologicas tales como Amevive™, Enbrel™, Humira™, Remicade™, Raptiva™ y ustequinumab (un agente de bloqueo de IL-12 y IL-23). Adicionalmente, se puede administrar un compuesto de la invencion en combinacion con otras terapias incluyendo, pero sin limitarse a, fototerapia, o fotoquimioterapia (por ejemplo, psoraleno y fototerapia ultravioleta A (PUVA)).

Por coadministracion se incluye cualquier medio de administracion de dos o mas agentes terapeuticos al paciente como parte de dicho regimen de tratamiento, como resultara evidente para el experto. Mientras que se pueden administrar dos o mas agentes de forma simultanea en una formulacion individual, esto no es esencial. Los agentes se pueden administrar en diferentes formulaciones y en diferentes momentos.

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PROCEDIMIENTOS GENERALES DE SINTESIS

General

Se puede preparar el compuesto de la invencion a partir de materiales de partida facilmente disponibles usando los siguientes metodos y procedimientos generales. Se apreciara que cuando se proporcionan condiciones de procedimiento preferidas (es decir, temperatures de reaccion, tiempos, proporciones molares de reaccionantes, disolventes, presiones, etc.), tambien se pueden usar otras condiciones de procedimiento a menos que se afirme lo contrario. Las condiciones de reaccion optimas pueden variar con los reaccionantes particulares o el disolvente usado, pero dichas condiciones se pueden determinar por parte de un experto en la materia por medio de procedimientos rutinarios de optimizacion.

Adicionalmente, como resultara evidente para los expertos en la materia, pueden ser necesarios grupos protectores convencionales para evitar que determinados grupos funcionales experimenten reacciones no deseadas. La eleccion de un grupo protector apropiado para un grupo funcional particular, asf como tambien las condiciones apropiadas para la proteccion y desproteccion, tambien son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se describen numerosos grupos, y su introduccion y retirada, en T. W. Greene y P. G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Segunda Edicion, Wiley, Nueva York, 1991, y las referencias citadas en el mismo.

Los siguientes procedimientos se presentan con detalles en cuanto a la preparacion del compuesto de la invencion. El compuesto de la invencion puede prepararse a partir de materiales de partida y reactivos conocidos y disponibles en el mercado por un experto en la materia de la smtesis organica.

Todos los reactivos fueron de calidad comercial y se usaron tal y como se recibieron sin purificacion adicional, a menos que se afirme lo contrario. Se usaron disolventes anhidros disponibles en el mercado para las reacciones realizadas en atmosfera inerte. Se usaron disolventes de calidad de reactivo en el resto de casos, a menos que se especifique lo contrario. Se realizo cromatograffa en columna sobre gel de sflice 60 (35-70 pm). Se realizo cromatograffa en capa fina usando placas F-254 de gel de sflice pre-revestidas (espesor de 0,25 mm). Se registro el espectro RMN 1H en un espectrometro de Bruker DPX 400 rMn (400 MHz). Se registraron los desplazamientos qmmicos (8) para el espectro de RMN 1H en partes por millon (ppm) con respecto a tetrametilsilano (8 0,00) o el pico de disolvente residual apropiado, es decir, CHCh (8 7,27), como referencia interna. Se proporcionan las multiplicidades en forma de singulete (s), doblete (d), triplete (t), cuartete (c), multiplete (m) y ancho (a). Se proporcionan las constantes de acoplamiento (J) en Hz. Se obtuvieron espectros EM de electronebulizacion en un espectrometro CL/EM de plataforma de Micromass. Columnas usadas para todos los analisis de CLEM: Waster Acquity UPLC BEH C18 1,7 pm, 2,1 mm de DI x 50 mm de L (Parte N.° 186002350)). HPLC de preparacion: Waters XBridge Prep C18 5 pm de ODB 19 mm de DI x 100 mm L (Parte N.° 186002978). Todos los procedimientos usan gradientes de MeCN/H2O. El H2O contiene o bien TFA al 0,1 % o NH3 al 0,1 %.

A continuacion se presenta un listado de las abreviaturas usadas en la seccion experimental:

DCM

Diclorometano

DiPEA

W,W-diisopropiletilamina

MeCN

Acetonitrilo

BOC

terc-Butiloxi-carbonilo

MF

W,W-dimetilformamida

Cat.

Cantidad catalffica

TFA

Acido trifluoroacetico

THF

Tetrahidrofurano

RMN

Resonancia Magnetica Nuclear

DMSO

Dimetilsulfoxido

CL-EM

Cromatograffa Lfquida - Espectrometffa de Masas

Ppm

partes por millon

Pd/C

Paladio al 10 % sobre Carbono

PMB

Para-metoxi-bencilo

PyBOP

hexafluroborato de benzotriazol-1-il-oxi-tri-pirrolidino-fosfonio

EtOAc

acetato de etilo

APCl

ionizacion qmmica a presion atmosferica

Rt

tiempo de retencion

s

singulete

(continuacion)

s a

singulete ancho

m

multiplete

min

minuto

ml

mililitro

Ml

microlitro

g

gramo

mg

miligramo

PdCl2dppf

[1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno] dicloroplatino (II)

TEA

Trietilamina

MMP

Metalo Proteinasa de Matriz

NHAC

Condrocitos Articulares Humanos Normales

ARNhc

ARN de horquilla corto

ARN

Acido ribonucleico

Ad-ARNip

ANRip codificado en adenovirus

PBST

Solucion salina tamponada con fosfato con Tween Na2HPO4 3,2 mM, KH2PO4 0,5 mM, KCl 1,3 mM, NaCl 135 mM, Tween 20 al 0,05%, pH 7,4

APMA

acetato 4-aminofenilmercurico

DMEM

Medio Eagle Modificado por Dulbecco

FBS

Suero bovino fetal

hCAR

receptor de adenovirus celular humano

3-MOI

multiplicidad de infeccion de 3

dNTP

trifosfato de desoxirribonucleosido

QPCR

reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa

ADNc

acido desoxirribonucleico de copia

GAPDH

gliceraldehndo fosfato deshidrogenasa

Preparacion sintetica del compuesto de la invencion

El compuesto de acuerdo con la invencion se puede producir de acuerdo con el siguiente esquema.

Procedimiento de sfntesis general

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Esquema I

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NH2OH.HCI

'PrzNEt

EtOH/MeOH

A

imagen4

1. RCOCI, Et3N CHjCN, 20 °C

2. NH3 / MeOH 20 “C

imagen5

en el que Ar representa 4-(3,3-dimetil-azetidin-1-carbonil)-fenilo.

General

1.1.1 1-(6-Bromo-piridin-2-il)-3-carboetoxi-tiourea (2)

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Se anade isotiocianato de etoxicarbonilo (173,0 ml, 1,467 mol) gota a gota a una solucion de 2-amino-65 bromopiridina (1) (253,8 g, 1,467 mol) en DCM (2,5 l) enfriada hasta 5 °C, durante 15 min. Posteriormente se permite el calentamiento de la mezcla de reaccion a temperature ambiente (20 °C) y se agita durante 16 h La evaporacion al vado proporciona un solido que se puede recoger por medio de filtracion, se lava minuciosamente con gasolina (600 ml, 3 veces) y se seca al aire para permitir la obtencion de (2). Se puede usar la tiourea tal cual para la siguiente etapa sin purificacion adicional. 1H (400 MHz, CDCh) 8 12,03 (1H, s a, NH), 8,81 (1H, d, J 7,8 Hz, H-3), 8 10 15 (1H, s a, NH), 7,60 (1H, t, J 8,0 Hz, H-4), 7,32 (1H, dd, J 7,7 y 0,6 Hz, H-5), 4,31 (2H, c, J 7,1 Hz, CH2), 1,35 (3H,

t, J7,1 Hz, CH3).

1.1.2 5-Bromo-[1,2,4]triazol[1,5-a]piridin-2-ilamina (3)

imagen7

Se anade W,W-diispropiletilamina (145,3 ml, 0,879 mol) a una suspension de clorhidrato de hidroxilamina (101,8 g, 15 1,465 mol) en EtoH/MeOH (1:1, 900 ml) y la mezcla se agita a temperatura ambiente (20 °C) durante 1 h. Despues,

se anade 1-(6-bromo-piridin-2-il)-3-carboxietoxi-tiourea (2) (89,0 g, 0,293 mol) y la mezcla se calienta lentamente a reflujo (Nota: se requiere una torre de lavado de blanqueo para inactivar el H2S desprendido). Tras 3 h a reflujo, se dejar enfriar la mezcla y se filtra para recoger el solido precipitado. Se recoge el producto por medio de evaporacion al vado del filtrado, adicion de H2O (250 ml) y filtracion. Se lavaron sucesivamente los solidos combinados con H2O 20 (250 ml), EtOH/MeOH (1:1, 250 ml) y Et2O (250 ml), posteriormente se secan al vado para proporcionar el derivado

de triazolopiridina (3) en forma de un solido. Se puede usar el compuesto tal cual para la proxima etapa sin purificacion alguna. 1H (400 MHz, DMS-d6) 8 7,43-7-34 (2H, m, 2 x H aromatico), 7,24 (1H, dd, J 6,8 y 1,8 Hz, H- aromatico), 6,30 (2H, a, NH2); m/z 213/215 (1:1, M+H+, 100%).

1.1.3 Acido ciclopropanocarboxWco (5-bromo-[1,2,4]triazolo [1,5-a]piridin-2-il)-amida (4):

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imagen8

Se anade Et3N (11,6 ml, 83,3 mol) a una solucion de 2-amino-triazolopiridina (3) (7,10 mg, 33,3 mol) en CH3CN seco (150 ml) a 5 °C, seguido de cloruro de ciclopropanocarbonilo (83,3 mol). Despues, se deja calentar la mezcla de reaccion a temperatura ambiente y se agita hasta que se haya consumido todo el material de partida (3). Si se requiere, se anade Et3N (4,64 ml, 33,3 mol) y cloruro de ciclopropanocarbonilo (33,3 mol) adicionales para garantizar 30 la reaccion completa. Tras la evaporacion del disolvente al vado se trata el residuo resultante con una solucion de amornaco metanolico 7N (50 ml) y se agita a temperatura ambiente (durante 1-16 h) para hidrolizar cualquier producto bis-acilado. Se realiza el aislamiento del producto por medio de la retirada de productos volatiles al vado seguido de trituracion con Et2O (50 ml). Se recogen los solidos por medio de filtracion, se lavan con H2O (50 m, 2 vecesl), acetona (50 ml) y Et2O (50 ml), posteriormente se secan al vado para proporcionar el intermedio (4) de 35 bromo requerido.

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Procedimiento de sintesis para la preparacion del compuesto de la invencion Compuesto 1

Etapa 1: Acoplamiento de Suzuki

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Se anadio acido 4-carboxifenilboronico (3,5 g, 0,021 mol) a una solucion de (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-2- il)-amida del acido ciclopropanocarboxflico (Intermedio 4, 5 g, 0,018 mol) en 1,4-dioxano/agua (5:1). Se anadio K2CO3 (5,0 g, 0,036 mol) y PdC^dppf (5 %) a la solucion. Despues, se calento la mezcla resultante por medio de calentamiento tradicional en un bano de aceite a 90 °C durante 16 h. Se anadio una solucion de HCl 1 M y se formo un precipitado en la solucion acida. Se filtro el precipitado, se seco al vado para proporcionar el compuesto del tftulo utilizado en la siguiente etapa sin purificacion adicional.

Etapa 2: {5-[4-(3,3-dimetil-azetidin-1-carbonil)-fenil]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il}-amida del acido

ciclopropanocarboxWco (Compuesto 1).

imagen10

Se anadieron EDCl (3,59 g, 0,019 mol), HOBt (2,53 g, 0,019 mol) y DIPEA (4,48 ml) a una solucion de acido 4-[2- (ciclopropanocarbonil-amino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-5-il]benzoico (4 g, 0,012 mol) en DCM (150 ml) a temperatura ambiente. Se agito la mezcla resultante durante 10 min a temperatura ambiente. Se anadio una sal de clorhidrato de dimetilazetidina (1,64 g, 0,013 mol) a la solucion y se agito la solucion durante 16 h. Se anadio agua a la mezcla de reaccion. Se separo la fase organica y se lavo con una solucion de NaOH 2 N, solucion de HCl 2 N y agua. Se seco la fase organica sobre MgSO4, se filtro y se evaporo al vado. La purificacion por medio de cromatograffa ultrarrapida (eluyente: de gasolina/EtOAc 1:1 a EtOAc puro) proporciono {5-[4-(3,3-dimetil-azetidin-1- carbonil)-fenil]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-2-il}-amida del acido ciclopropanocarboxflico.

El compuesto de la invencion que se ha preparado o se puede preparar de acuerdo con el procedimiento de sintesis descrito en el presente documento se enumera en la Tabla I a continuacion. Los datos espectrales de RMN del compuesto de la invencion se proporcionan en la Tabla II.

5

10

15

20

25

30

Tabla I: Datos espectrales de masa del Compuesto de la invencion

Comp n.°

Estructura Nombre PM EM medida

1

H 1 /)—N Y'» y< CO 0 {5-[4-(3,3-dimetil-azetidin-1- carbonil)-fenil]-[1,2,4]triazolo[1,5- a]piridin-2-il}-amida del acido ciclopropanocarboxflico 389,46 390,0

Tabla II: Datos de RMN del Compuesto de la invencion

Comp n.°

Datos de RMN (8)

1

(1H, DMSO-d6) 11,01 (1H, a, NH), 8,08 (2H, d, ArH), 7,79 (2H, d, ArH), 7,73 (1H, d, ArH), 7,72 (1H, s, ArH), 7,35 (1H, dd, ArH), 4,04 (2H, a, CH2), 3,77 (2H, a, CH2), 2,02 (1H, a, CH), 1,27 (6H, s, 2xCHa), 0,81 (4H, m, 2XCH2)

Ejemplos Biologicos

Ejemplo 1 - ensayos in vitro

Ejemplo 1.1 Ensayo de inhibicion de JAK1

Se adquirio JAK1 recombinante humano (dominio catalftico, aminoacidos 866-1154; numero de catalogo PV4774) en Invitrogen. Se incubo 1 ng de JAK1 con peptido Ulight-JAK1 (tyr1023) 20 nM (Perkin Elmer numero de catalogo TRF0121) en tampon de reaccion de cinasa (MOPS 25 mM pH 6,8, Brii-35 al 0,016%, MgCh 8,33 mM, DTT 3,33 mM, ATP 7 |jM) con o sin 4 jl que contema compuesto de ensayo o vehuculo (DMSO, concentracion final del 1 %), en un volumen total de 20 jl, en una placa Luminotrac 200 384 blanca (Greiner, numero de catalogo 781075). Tras 60 min a temperatura ambiente, se detuvieron las reacciones por medio de la adicion de 20 jl/pocillo de mezcla de deteccion (1 x tampon de deteccion (Perkin Elmer, numero de catalogo CR97-100C), Europio-anti-fosfotirosina 0,5 nM (PT66) (Perkin Elmer, numero de catalogo AD0068), EDTA 10 mM). Se realizo la lectura usando Envision con una excitacion a 320 nm y emision de la medicion a 615 nm (Perkin Elmer). Se calculo la actividad cinasa restando las unidades de fluorescencia relativa (UFR) obtenidas en presencia de un inhibidor de control positivo (10 jM estaurosporina) de la UFR obtenida en presencia del vehuculo. Se determino la capacidad del compuesto de ensayo para inhibir esta actividad como:

Inhibicion en porcentaje = ((UFR determinada para la muestra con el compuesto de ensayo presente - UFR determinada para la muestra con el inhibidor de control positivo) dividido entre (UFR determinada en presencia del vehuculo - UFR determinada para la muestra con el inhibidor de control positivo)) * 100.

Se prepararon series de dilucion de dosis para los compuestos, permitiendo someter a ensayo los efectos de dosis- respuesta en el ensayo JAK1 y el calculo de CI50 para el compuesto. Se somete a ensayo cada compuesto sistematicamente a una concentracion de 20 jM seguido de una dilucion seriada 1/5, 8 puntos (20 jM - 4 jM - 800 nM - 160 nM -6,4 nM - 1,28 nM - 0,26 nM) en una concentracion final de DMSO del 1 %. Cuando aumenta la concentracion del compuesto en la serie, se preparan mas diluciones y/o se rebaja la concentracion superior (por ejemplo, 5 jM, 1 jM). Los datos se expresan como el valor de CI50 medio a partir de los ensayos + el error tfpico de la media.

Tabla III: Valores de CI50 de JAK1 del Compuesto

Comp n.°

JAK1 (nM)

1

6,6 + 0,7

Ejemplo 1.2 Ensayo de determinacion Ki de JAK1

Para la determinacion de Ki, se mezclaron cantidades diferentes de inhibidor con la enzima y se siguio la reaccion enzimatica como funcion de la concentracion de ATP. Se determino el valor de Ki por medio de representacion

redproca doble de Km frente a la concentracion de compuesto (representacion de Lineweaver-Burk). Se uso JAK1 (Invitrogen, PV4774) a una concentracion final de 500 ng/ml. El sustrato fue sal de Poli(Glu, Tyr)sodio (4:1), PM 20 000 - 50 000 (Sigma, P0275). Se realizo la reaccion en Hepes 25 mM pH 7,5; Tween 20 al 0,01 %, MgCl210 mM con concentraciones variables de ATP y compuesto y se detuvo por medio de la adicion de acido fosforico 150 mM. Se 5 realizo la medicion del fosfato incorporado en el sustrato poliGT colocando las muestras en una placa filtrante (usando un dispositivo de recogida, Perkin Elmer) y posterior lavado. Se midio 33P incorporado en poliGT en un contador de centelleo Topcount tras la adicion de lfquido de centelleo a las placas filtrantes (Perkin Elmer).

Cuando se sometio a ensayo el Compuesto 1 en este ensayo, se midio un valor de Ki de 6,9 mM.

Como alternativa, para la determinacion de Ki, se mezclaron diferentes cantidades de inhibidor con la enzima y se 10 siguio la reaccion enzimatica como funcion de la concentracion de ATP. Se determino el valor de Ki por medio de representacion redproca doble de Km frente a la concentracion de compuesto (representacion de Lineweaver-Burk). Se uso 1 ng de jAk1 (Invitrogen, PV4774) en el ensayo. El sustrato fue Peptido Ulight-JAK-a 50 nM (Tyr1023) (Perkin Elmer, TRF0121). Se realizo la reaccion en MOPS 25 mM, pH 6,8, al 0,01 %, DTT 2 mM, MgCh 5 mM Brij-35 con concentraciones variables de ATP y compuesto. Se midio el sustrato fosforilado usando un anticuerpo PT66 15 anti-fosfotirosina marcado con Eu (Perkin Elmer, AD0068). Se realizo la lectura en el envision (Perkin Elmer) con excitacion a 320 nm y emision seguido a 615 nm y 665 nm.

Cuando se sometio a ensayo el compuesto 1 en este ensayo, se midio un valor de Ki de 5,6 nM.

Ejemplo 1.3 Ensayo de inhibicion de JAK2

Se adquirio JAK2 recombinante humano (dominio catalftico, aminoacidos 866-1154; numero de catalogo PV4210) en 20 Invitrogen. Se incubaron 0,0125 mU de JAK2 con peptido Ulight-JAK1 (tyr1023) 25 nM (Perkin Elmer numero de catalogo TRF0121) en tampon de reaccion de cinasa (HEPES 41,66 mM pH 7,0, Triton X-100 al 0,016 %, MgCh 12,5 mM, DTT 3,33 mM, ATP 7,5 pm) con o sin 4 pl que contema compuesto de ensayo o vedculo (DMSO, concentracion final de 1 %), en un volumen total de un 20 pl, en una placa Luminotrac 200 384 blanca (Greiner, numero de catalogo 781075). Tras 60 min a temperatura ambiente, se detuvieron las reacciones por medio de la 25 adicion de 20 pl/pocillo de mezcla de deteccion (1 x tampon de deteccion (Perkin Elmer, numero de catalogo CR97- 100C), Europio-anti-fosfotirosina 0,5 nM (PT66) (Perkin Elmer, numero de catalogo AD0068), EDTA 10 mM). Se realizo la lectura usando Envision con una excitacion a 320 nm y medicion de la emision a 615 nm (Perkin Elmer). Se calculo la actividad de cinasa restando las unidades de fluorescencia relativa (UFR) obtenidas en presencia de un inhibidor de control positivo (10 pM estaurosporina) de UFR obtenida en presencia del vedculo. Se determino la 30 capacidad del compuesto de ensayo para inhibir esta actividad como:

Inhibicion en porcentaje = ((UFR determinada para la muestra con el compuesto de ensayo presente - UFR determinada para la muestra con el inhibidor de control positivo) dividido entre (UFR determinada en presencia del vedculo - UFR determinada para la muestra con el inhibidor de control positivo)) * 100.

Se prepararon series de dilucion de dosis para el compuesto, permitiendo someter a ensayo los efectos de dosis- 35 respuesta en el ensayo JAK2 y el calculo de CI50 para el compuesto. Se somete a ensayo cada compuesto sistematicamente a una concentracion de 20 pM seguido de una dilucion seriada 1/5, 8 puntos (20 pM - 4 pM - 800 nM - 160 nM - 6,4 nM - 1,28 nM - 0,26 nM) en una concentracion final de DMSO de 1 %. Cuando aumenta la concentracion del compuesto en la serie, se preparan mas diluciones y/o se rebaja la concentracion superior (por ejemplo, 5 pM, 1 pM). Los datos se expresan como el valor de CI50 medio a partir del ensayo + el error tfpico de la 40 media.

Tabla IV: Valores de CI50 de JAK2 del Compuesto

Comp n.°

JAK2 (nM)

1

67 + 5

Ejemplo 1.4 Ensayo de determinacion Ki de JAK2

Para la determinacion de Ki, se mezclaron cantidades diferentes de inhibidor con la enzima y se siguio la reaccion 45 enzimatica como funcion de la concentracion de ATP. Se determino el valor de Ki por medio de representacion redproca doble de Km frente a la concentracion de compuesto (representacion de Lineweaver-Burk). Se usaron 0,025 mU de JAK2 (Invitrogen, PV4210) en el ensayo. El sustrato fue sal de Poli(Glu, Tyr)sodio (4:1), PM 20 000 - 50 000 (Sigma, P0275). Se realizo la reaccion en mOpS 10 mM pH 7,5; EDTA 0,5 mM, Brij-35 al 0,01 %, DTT 1 mM, MgAc 15 mM con concentraciones variables de ATP y compuesto y se detuvo por medio de la adicion de acido 50 fosforico 150 mM. Se realizo la medicion de fosfato incorporado en el sustrato poliGT colocando las muestras en una placa filtrante (usando un dispositivo de recogida, Perkin Elmer) y posterior lavado. Se midio el 33P incorporado en poliGT en un contador de centelleo Topcount tras la adicion de lfquido de centelleo a las placas filtrantes (Perkin Elmer).

Cuando se sometio a ensayo el Compuesto 1 en este ensayo, se midio un valor de Ki de 126 nM.

Como alternativa, para la determinacion de Ki, se mezclaron diferentes cantidades de inhibidor con la enzima y se siguio la reaccion enzimatica como funcion de la concentracion de ATP. Se determino el valor de Ki por medio de representacion redproca doble de Km frente a la concentracion de compuesto (representacion de Lineweaver-Burk). 5 Se uso 0,0125 mU de JAK2 (Invitrogen, PV4210) en el ensayo. El sustrato fue Peptido Ulight-JAK-1 50 nM (Tyr1023) (Perkin Elmer, TRF0121). Se realizo la reaccion en HEPES 25 mM, pH 7,0, Triton X-100 al 0,01 %, dTt 2mM, MgCl2 7 mM con concentraciones variables de ATP y compuesto. Se midio el sustrato fosforilado usando un anticuerpo PT66 anti-fosfotirosina marcado con Eu (Perkin Elmer, AD0068). Se realizo la lectura en el envision (Perkin Elmer) con excitacion a 320 nm y emision seguida a 615 nm y 665 nm.

10 Cuando se sometio a ensayo el compuesto 1 en este ensayo, se midio un valor de Ki de 35 nM.

Ejemplo 1.5 Ensayo de inhibicion de JAK3

Se adquirio JAK3 recombinante humano (aminoacidos 781-1124; numero de catalogo PV3855) en Invitrogen. Se incubo 0,025 mU de JAK3 con 2,5 |jg de sustrato de poliGT (Sigma numero de catalogo P0275) en tampon de reaccion de cinasa (Tris 25 mM pH 7,5, EGTA 0,5 mM, Na3VO4 0,5 mM, g-glicerolfosfato 5 mM, Triton X-100 al 15 0,01%, ATP no radioactivo 1jM, gamma-ATP-33P 0,25 jCi (GE Healthcare, numero de catalogo AH9968)

concentraciones finales), con o sin 5 jl que contema compuesto de ensayo o vedculo (DMSO, concentracion final de 1 %), en un volumen total de un 25 jl, en una placa de 96 pocillos de polipropileno (Greiner, fondo en V). Tras 105 min a 30 °C, se detuvieron las reacciones por medio de la adicion de 25 jl/pocillo de acido fosforico 15 mM. Se transfirio toda la reaccion de cinasa terminada a placas filtrantes de 96 pocillos prelavados (acido fosforico de 20 75 mM) (Perkin Elmer numero de catalogo 6005177) usando un dispositivo de recogida de celulas (Perkin Elmer).

Se lavaron las placas 6 veces con 300 jl por pocillo de una solucion de acido fosforico de 75 mM y se sello la parte inferior de las placas. Se anadieron 40 jl/pocillo de Microscint-20, se sello la parte superior de las placas y se realizo la lectura usando un Topcount (Perkin Elmer). Se calculo la actividad de cinasa restando los conteos por minuto (cpm) obtenidos en presencia de un inhibidor de control positivo (estaurosporina 10 jM) de cpm obtenido en 25 presencia del vedculo. Se determino la capacidad del compuesto de ensayo para inhibir esta actividad como:

Inhibicion en porcentaje = ((cpm determinado para la muestra con el compuesto de ensayo presente - cpm determinado para la muestra con el inhibidor de control positivo) dividido entre (cpm determinado en presencia del vedculo - cpm determinado para la muestra con el inhibidor de control positivo)) * 100.

Se prepararon series de dilucion de dosis para el compuesto, permitiendo someter a ensayo los efectos de dosis- 30 respuesta en el ensayo JAK3 y el calculo de CI50 para el compuesto. Se somete a ensayo cada compuesto sistematicamente a una concentracion de 20 jM seguido de una dilucion seriada 1/3, 8 puntos (20 jM - 6,67 jM - 2,22 jM - 740 nM - 247 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM) en una concentracion final de DMSO del 1 %. Cuando aumenta la concentracion del compuesto en la serie, se preparan mas diluciones y/o se rebaja la concentracion superior (por ejemplo, 5 jM, 1 jM). Los datos se expresan como el valor de CI50 medio a partir del ensayo + el error tfpico de la 35 media.

Tabla V: Valores de CI50 de JAK3 del Compuesto

Comp n.°

JAK3 (nM)

1

408 + 62

Ejemplo 1.6 Ensayo de determinacion de Ki de JAK3

Para la determinacion de Ki, se mezclaron cantidades diferentes de inhibidor con la enzima y se siguio la reaccion 40 enzimatica como funcion de la concentracion de ATP. Se determino el valor de Ki por medio de representacion redproca doble de Km frente a la concentracion de compuesto (representacion de Lineweaver-Burk). Se uso JAK3 (Carna Biosciences, 09CBS-0625B) a una concentracion final de 10 ng/ml. El sustrato fue sal de Poli(Glu, Tyr)sodio (4:1), PM 20 000 - 50 000 (Sigma, P0275). Se realizo la reaccion en Tris 25 mM pH 7,5; Triton X-100 al 0,01 %, EgTa 0,5 mM, DTT 2,5 mM, Na3VO4 0,5 mM, b-glicerolfosfato 5 mM, MgCh 10 mM con concentraciones variables 45 de ATP y compuesto y se detuvo por medio de la adicion de acido fosforico 150 mM. Se realizo la medicion de fosfato incorporado en el sustrato poliGT colocando las muestras en una placa filtrante (usando un dispositivo de recogida, Perkin Elmer) y posterior lavado. Se midio el 33P incorporado en poliGT en un contador de centelleo Topcount tras la adicion de lfquido de centelleo a las placas filtrantes (Perkin Elmer).

Cuando se sometio a ensayo el Compuesto 1, se midio un valor de Ki de 188 nM.

50 Ejemplo 1.7 Ensayo de inhibicion de TYK2

Se adquirio dominio catalttico de TYK2 recombinante humano (aminoacidos 871-1187; numero de catalogo 08-147) en Carna biosciences. Se incubaron 5 ng de TYK2 con 12,5 jg de sustrato de poliGT (Sigma numero de catalogo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

P0275) en tampon de reaccion de cinasa (Hepes 25 mM pH 7,5, NaCI 100 mM, Na3VO4 02 mM, NP-40 al 0,1 %, ATP no radioactivo 0,1 pM, gamma-ATp-33P 0,125 pCi (GE Healthcare, numero de catalogo AH9968) concentraciones finales), con o sin 5 pl que contema compuesto de ensayo o vehnculo (DMSO, concentracion final de 1 %), en un volumen total de un 25 pl, en una placa de 96 pocillos de poliproileno (Greiner, V-bottom). Tras 90 min a 30 °C, se detuvieron las reacciones por medio de la adicion de 25 pl/pocillo de acido fosforico 150 mM. Se transfirio toda la reaccion de cinasa terminada a placas filtrantes de 96 pocillos pre-lavadas (acido fosforico de 75 mM) (Perkin Elmer numero de catalogo 6005177) usando un dispositivo de recogida de celulas (Perkin Elmer). Se lavaron las placas 6 veces con 300 pl por pocillo de una solucion de acido fosforico de 75 mM y se sello la parte inferior de las placas. Se anadieron 40 pl/pocillo de Microscint-20, se sello la parte superior de las placas y se realizo la lectura usando un Topcount (Perkin Elmer). Se calculo la actividad de cinasa restando los conteos por minuto (cpm) obtenidos en presencia de un inhibidor de control positivo (10 pM estaurosporina) de cpm obtenido en presencia del vehnculo. Se determino la capacidad del compuesto de ensayo para inhibir esta actividad como:

Inhibicion en porcentaje = ((cpm determinado para la muestra con el compuesto de ensayo presente - cpm determinado para la muestra con el inhibidor de control positivo) dividido entre (cpm determinado en presencia del vehnculo - cpm determinado para la muestra con el inhibidor de control positivo)) * 100.

Se prepararon series de dilucion de dosis para los compuestos, permitiendo someter a ensayo los efectos de dosis- respuesta en el ensayo TYK2 y el calculo de CI50 para el compuesto. Se somete a ensayo cada compuesto sistematicamente a una concentracion de 20 pM seguido de una dilucion seriada 1/3, 8 puntos (20 pM - 6,67 pM - 2,22 pM - 740 nM - 247 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM) en una concentracion final de DMSO de 1 %. Cuando aumenta la concentracion del compuesto en la serie, se preparan mas diluciones y/o se rebaja la concentracion superior (por ejemplo, 5 pM, 1 pM).

Tabla VI: Valores de CI50 de TYK2 del Compuesto

Comp n.°

TYK2 (nM)

1

219 + 37

Ejemplo 2. Ensayos celulares

Ejemplo 2.1. Ensayo de senalizacion de JAK-STAT:

Se mantuvieron celulas HeLa en Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) que contema un 10 % de suero de ternero fetal inactivado termicamente de 10 %, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. Se usaron las celulas HeLa a una confluencia del 70 % para la transfeccion. Se sometieron a transfeccion de manera transitoria 20.000 celulas en un medio de cultivo celular de 87 pl con 40 ng de indicador de pSTAT1(2)-luciferasa (Panomics), 8 ng de indicador LacZ como indicador de control interno y 52 ng de pBSK usando 0,32 pl de Jet-PEI (Polypus) como reactivo de transfeccion por pocillo en un formato de placa de 96 pocillos. Tras incubacion durante la noche a 37 °C, 10 % de CO2, se retiro el medio de transfeccion, se anadieron 75 pl de DMEM + 1,5 % de suero de ternero inactivado termicamente. Se anadieron 15 pl de compuesto a una concentracion de 6,7 veces durante 60 min y posteriormente se 10 pl de OSM humano (Peprotech) a 33 ng/ml de concentracion final.

Se sometieron a ensayo todos los compuestos por duplicado comenzando desde 20 pM seguido por una dilucion seriada de 1/3, 8 dosis en total (20 pM - 6,6 pM - 2,2 pM - 740 nM - 250 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM) en una concentracion final de DMSO al 0,2 %.

Tras la incubacion durante la noche a 37 °C, 10 % de CO2, se sometieron las celulas a lisis en tampon de lisis de 100 pl/pocillo (PBS, CaCl2 0,9 mM, MgCh 0,5 mM, Trehalosa al 5 %, Tergitol NP9 al 0,025 %, BSA al 0,15 %).

Se usaron 40 pl de lisado celular para leer la actividad de p-galactosidasa por medio de la adicion de 180 pl de solucion de pGal (30 pl de ONPG 4 mg/ml + 150 pl de tampon de p-galactosidasa (Na2HPO4 0,06 M, NaH2PO4 0,04 M, MgCl2 1 mM)) durante 20 min Se detuvo la reaccion por medio de la adicion de 50 pl de Na2CO3 1M. Se leyo la absorbancia a 405 nm.

Se midio la actividad de luciferasa usando 40 pl de lisado celular mas 40 pl de Steadlyte® como se describe por el fabricante (Perkin Elmer), en el Envision (Perkin Elmer).

Se usaron 10 pM de inhibidor de pan-JAK como control positivo (inhibicion de 100 %). Como control negativo, se uso DMSO al 0,5 % (inhibicion de 0 %). Se usaron controles positivo y negativo para calcular los valores de z' y "porcentaje de inhibicion" (PIN).

Inhibicion en porcentaje = ((fluorescencia determinada en presencia del vehnculo - fluorescencia determinada para la muestra con el compuesto de ensayo presente) dividido entre (fluorescencia determinada en presencia del vehnculo - fluorescencia determinada para la muestra sin estimulacion))*100

Se representaron los valores de PIN para los compuestos sometidos a ensayo en dosis-respuesta y se derivaron los valores de CE50.

Tabla VII: Valores de CI50 de senalizacion de STAT del Compuesto

Comp n.°

CE50 (nM)

1

539 + 130

5 Ejemplo 2.2. Ensayo de senalizacion de OSMIL-ip

Se observo que OSM y IL-ip sobre-regulaban de forma sinergica los niveles de MMP13 en estirpes celulares de condrosarcoma humano SW1353. Se sembraron las celulas en placas de 96 pocillos a 15.000 celulas/pocillo en un volumen de 120 pl DMEM (Invitrogen) que contema FBS al 10 % (v/v) y penicilina al 1 %/estreptomicina (Invitrogen) incubado a 37 °C, 5 % de CO2. Se preincubaron las celulas con 15 pl de compuesto en medio M199 con DMSO al 10 2 % 1 h antes de la estimulacion con 15 pl de OSM y IL-1 p para alcanzar 25 ng/ml de OSM y 1 ng/ml de IL-1 p, y se

midieron los niveles de MMP13 en medio acondicionado 48 h tras la estimulacion. Se midio la actividad de MMP13 usando un ensayo de actividad de captura de anticuerpos. Para este fin, se revistieron placas de 384 pocillos (NUNC, 460518, negro de MaxiSorb) con 35 pl de una solucion de anticuerpo MMP13 anti-humano 1,5 pg/ml (R&D Systems, MAB511) durante 24 h a 4 °C. Tras el lavado de los pocillos 2 veces con PBS + Tween al 0,05 %, se 15 bloquearon los sitios de union restantes con 100 pl de leche en polvo desnatada al 5 % (Santa Cruz, sc-2325, Blotto) en PBS durante 24 h a 4 °C. A continuacion, se lavaron los pocillos 2 veces con PBS + Tween al 0,05% y se anadieron 35 pl de dilucion 1/10 de sobrenadante de cultivo que contema MMP13 en un tampon de bloqueo diluido 100 veces y se incubo durante 4 h a temperatura ambiente. A continuacion, se lavaron los pocillos dos veces con PBS + Tween al 0,05% seguido de activacion de MMP13 por medio de adicion de 35 pl de solucion de acetato 20 aminofenilmercurico 1,5 mM (APMA) (Sigma, A9563) e incubacion a 37 °C durante 1 h Se lavaron los pocillos de nuevo con PBS + Tween 0,05 % y se anadieron 35 pl de sustrato MMP13 (Blomol, P-126, sustrato fluorogenico OmniMMP). Tras la incubacion durante 24 horas a 37 °C se midio la fluorescencia del sustrato convertido en un Perkin Elmer Wallac Envision 2102 Multilabel Reader (longitud de onda de excitacion: 320 nm, longitud de onda de emision: 405 nm)

25 Inhibicion en porcentaje = ((fluorescencia determinada en presencia del vehfculo - fluorescencia determinada para la muestra con el compuesto de ensayo presente) dividido entre (fluorescencia determinada en presencia del vehfculo - fluorescencia determinada para la muestra sin estimulacion))*100. Los datos se expresan como CE50 medio de los ensayos + error tfpico de la media. 30 * * * * 35 * * * * 40 * * * * 45

Tabla VIII: Valores de CI50 de MMP13 del Compuesto

Comp n.°

CE50 (nM)

1

4196+2370

30

Ejemplo 2.3. Ensayo de proliferacion de PBL

Se estimulan linfocitos sangumeos perifericos humanos (PBL) con IL-2 y se mide la proliferacion usando un ensayo

de incorporacion de BrdU. En primer lugar, se estimula el PBL durante 72 h con PHA para inducir el receptor IL-2, de

prolongo durante 24 h para detener la proliferacion celular seguido de estimulacion de IL-2 durante otras 72 h

35 (incluyendo 24 h de marcaje BrdU). Se pre-incubaron las celulas con compuestos de ensayo 1 h antes de la adicion

de IL-2. Se sometieron las celulas a cultivo en RPMI 1640 que contema pBs al 10 % (v/v).

Ejemplo 2.4. Ensayos en sangre completa (WBA, por sus siglas en ingles)

2.4.1. Protocolo de estimulacion con IFNa

Para predecir la selectividad de los compuestos de ensayo para inhibir JAK1 sobre los mecanismos de senalizacion

40 dependientes de JAK2 in vivo, se desarrollo un modelo in vitro fisiologicamente relevante usando sangre humana.

En el ensayo WBA, se extrajo sangre de voluntarios humanos con consentimiento informado, se trato ex vivo con

compuesto (1 h) y posteriormente se estimulo durante 30 min con interferon a (IFNa, mecanismo dependiente de

JAK1) o durante 2 h con factor de estimulacion de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF, mecanismo

dependiente de JAK2).

45 2.4.1.1 Ensayo de fosfo-STAT1

Para la estimulacion con IFNa, se midio el aumento de la fosforilacion de Transductores de Senal y Activadores de Transcripcion 1 (pSTAT1) por IFNa en extractos celulares de leucocitos usando un ensayo de ELISA pSTAT1. La

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

fosforilacion del Transductor de Senal y Activador de Transcripcion 1 (STAT1) tras la estimulacion con interferon alfa (IFNa) es un evento mediado por JAK1. El ensayo de fosfo-STAT1, que se uso para medir los niveles de fosfo- STAT1 en extractos celulares, se desarrollo para evaluar la capacidad de un compuesto para inhibir los mecanismos de senalizacion dependientes de JAK1.

Se trato ex vivo sangre humana, extrafda a voluntarios con consentimiento informado, con el compuesto (1 h) y posteriormente se estimulo durante 30 min con IFNa. Se midio el aumento de la fosforilacion de STAT1 por el IFNa en extractos celulares de leucocitos usando ELISA fosfo-STAT1.

El tampon de lisis ACK consistio en NH4Cl 0,15 M, KHCO310 mM, EDTA 0,1 mM. El pH del tampon fue de 7,3.

Se diluyo 10 veces un concentrado de tampon de lisis celular x 10 (parte del kit de ELISA intercalado PathScan Phospho-STAT1 (Tyr701) de Cell Signalling) en H2O. Se anadieron inhibidores de proteinasa al tampon antes de su uso.

Se disolvieron 20 |jg de IFNa en 40 jl de H2O para obtener una solucion madre 500 jg/ml. Se almaceno la solucion madre a -20 °C.

Se preparo una serie de dilucion de 3 veces del compuesto en DMSO (concentracion mas elevada: 10 mM). Despues, se diluyo el compuesto de forma adicional en el medio (factor de dilucion dependiente de la concentracion final de compuesto deseada).

2.4.1.1. Incubacion de sangre con compuesto y estimulacion con IFNa

Se recogio sangre humana en tubos tratados con heparina. Se dividio la sangre en alfcuotas de 392 jl. Despues, se anadieron 4 jl de dilucion de compuesto a cada alfcuota y se incubaron las muestras de sangre durante 1 h a 37 °C. Se diluyo la solucion madre de IFNa 1000 veces en medio de RPMI para obtener una solucion de trabajo de 500 ng/ml. Se anadieron 4 jl de solucion de trabajo de 500 ng/ml a las muestras de sangre (concentracion final de IFNa: 5 ng/ml). Se incubaron las muestras a 37 °C durante 30 min.

2.4.1.1.2 Preparacion de extractos celulares

Al final del penodo de estimulacion, se anadieron 7,6 ml de tampon ACK a las muestras de sangre para producir la lisis de los eritrocitos. Se mezclaron las muestras invirtiendo los tubos cinco veces y se incubo la reaccion en hielo durante 5 min La lisis de RBC debena ser evidente durante esta incubacion. Se aglomeraron las celulas por medio de centrifugacion a 300 g, 4 °C durante 7 min y se retiro el sobrenadante. Se anadieron 10 ml de PBS a cada tubo y se resuspendio el sedimento celular. Se centrifugaron las muestras de nuevo durante 7 min a 300 g, 4 °C. Se retiro el sobrenadante y se resuspendio el microgranulo en 500 jl de 1 x PBS. Despues, se transfirio la suspension celular a un tubo de microcentnfuga limpio de 1,5 ml. Se sometieron las celulas a formacion de microgranulos por medio de centrifugacion a 700 g durante 5 min a 4 °C. Se retiro el sobrenadante y se disolvio el microgranulo en 150 jl de tampon de lisis celular. Se incubaron las celulas en hielo durante 15 min Despues de eso, se almacenaron las celulas a -80 °C hasta el procesamiento posterior.

2.4.1.1.3 Medicion de la fosforilacion de STAT1 por medio de ELISA

Se uso el kit Pathscan Phopho-STAT1 (Tyr701) Sandwich ELISA de Cell Siganlling (N.° de Cat. n.°7234) para determinar los niveles de Fosfo-STAT1.

Se descongelaron extractos celulares en hielo. Se centrifugaron los tubos durante 5 min a 16.000 g, 4 °C y se recogieron los lisados aclarados. Al mismo tiempo, se equilibraron tiras de micropocillos procedentes del kit a temperatura ambiente y se preparo tampon de lavado por medio de dilucion de 20 x tampon de lavado en H2O. Se diluyeron las muestras 2 veces en diluyente de muestra y se anadieron 100 jl a las tiras de micropocillos. Se incubaron las tiras durante la noche a 4 °C.

Al dfa siguiente, se lavaron las tiras 3 veces con tampon de lavado. Se anadieron 100 jl de anticuerpo de deteccion a los pocillos. Se incubaron las tiras a 37 °C durante 1 h. Despues, se lavaron los pocillos 3 veces con tampon de lavado de nuevo. Se anadieron 100 jl de anticuerpo secundario con union de HRP a cada pocillo y se incubaron las muestras a 37 °C. Trascurridos 30 min se lavaron los pocillos 3 veces de nuevo y se anadieron 100 jl de sustrato de TMB a todos los pocillos. Cuando las muestras se volvieron azules, se anadieron 100 jl de solucion STOP para detener la reaccion. Se midio la absorbancia a 450 nm.

2.4.1.2. ELISA deIL-8

Para la estimulacion de GM-CSF, se midio el aumento de los niveles de interleucina-8 (IL-8) en plasma usando un ensayo ELISA IL-8. La expresion de interleucina 8 (IL-8) inducida por factor estimulador de colonias de macrofagos de granulocito (GM-CSF) es un evento mediado por JAK2. Se desarrollo ELISA IL-8, que se puede usar para medir los niveles de IL-8 en muestras de plasma, para evaluar la capacidad del compuesto para inhibir los mecanismos de senalizacion dependientes de JAK2.

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Se trato ex vivo sangre humana, ex^da a voluntarios con consentimiento, con el compuesto (1 h) y posteriormente se estimulo durante 2 h con GM-CSF. Se midio el aumento de los niveles de IL-8 en plasma usando un ensayo de ELISA IL-8.

Se disolvieron 10 jg de GM-CSF en 100 jl de H2O para obtener una solucion madre de 100 jg/ml. Se almaceno la solucion madre a -20 °C.

Se preparo una serie de dilucion de 3 veces del compuesto de ensayo en DMSO (concentracion mas elevada: 10 mM). Despues, se diluyo de manera adicional en medio (factor de dilucion dependiente de la concentracion final de compuesto deseada)

2.4.1.2.1 Incubacion de sangre con compuesto y estimulacion con GM-CSF

Se recogio sangre humana en tubos tratados con heparina. Se dividio la sangre en alfcuotas de 245 jl. Despues, se anadieron 2,5 jl de compuesto de ensayo a cada alfcuota y se incubaron las muestras de sangre durante 1 h a 37 °C. Se diluyo la solucion madre de gM-CSF 100 veces en medio de RPMI para obtener una solucion de trabajo de 1 jg/ml. Se anadieron 2,5 jl de solucion de trabajo de 1 jg/ml a las muestras de sangre (concentracion final gM- CSF: 10 ng/ml). Se incubaron las muestras a 37 °C durante 2 h.

2.4.1.2.2 Preparacion de muestras de plasma

Se centrifugaron las muestras durante 15 min a 1.000 g, 4 °C. Se recogieron 100 jl de plasma y se almacenaron a - 80 °C hasta su uso posterior.

2.4.1.2.3 Medicion de niveles de IL-8 por medio de ELISA

Se uso el kit de Inmunoensayo Quimioluminiscente de IL-8 Humana de R&D Systems (N.° de Cat. Q8000B) para determinar los niveles de IL-8.

Se preparo tampon de lavado por medio de dilucion de 10 x tampon de lavado en H2O. Se preparo reactivo de trabajo Glo por medio de la adicion de 1 parte de Reactivo Glo 1 a 2 partes de Reactivo Glo B de 15 min a 4 h antes de su uso.

Se anadieron 100 jl de RD1-86 diluyente de ensayo a cada pocillo. Despues de eso, se anadieron 50 jl de muestra (plasma). Se incubo la placa de ELISA durante 2 h a temperatura ambiente, 500 rpm. Se lavaron todos los pocillos con tampon de lavado y se anadieron 200 jl de conjugado de IL-8 a cada pocillo. Tras la incubacion durante 3 h a temperatura ambiente, se lavaron los pocillos 4 veces con tampon de lavado y se anadieron 100 jl de reactivo de trabajo Glo a cada pocillo. Se incubo la placa de ELISA durante 5 min a temperatura ambiente (protegida de la luz). Se midio la luminiscencia (tiempo de lectura 0,5 s/pocillo).

2.4.1.3. Resultados

El pCI50 del Compuesto 1 para inhibir el aumento de los niveles de pSTAT1 inducido por INFa fue de 6,32 + 0,07 (ETM), al tiempo que pCI50 para la inhibicion del aumento de IL-8 inducido por GM-CSF fue de 4,87 + 0,13 ((ETM)) (resultados obtenidos usando 6 donantes de sangre). Esto demuestra que el Compuesto 1 es 28 veces mas selectivo para la via de JAK2 frente a la via de JAK2. Por tanto, en una configuracion celular, esta claro que el Compuesto 1 presenta selectividad para JAK1 con respecto a JAK2. Parece que el compuesto 1 presenta una selectividad mayor para JAK1 y jAK2 en comparacion con los compuestos relacionados conocidos, u otros inhibidores de jAk conocidos.

2.4.1.3. Tratamiento de administracion de datos y resultados

Con el fin de refinar los resultados, se representaron la inhibicion de la induccion de fosfoSTAT1 por medio de IFNa en extractos celulares o la inhibicion de la induccion de IL-8 por parte de GM-CSF en plasma frente a la concentracion de compuesto y se extrajeron los valores de CI50 usando un software Graphpad. Se conservaron los datos si R2 era mayor de 0,8 y la pendiente de hill era menor de 3 y unicamente se conservaron los donantes para los cuales se obtuvieron datos validos para ambos ensayos.

Por ejemplo, cuando se sometieron a este protocolo de analisis de datos adicional, el valor medido de pCI50 para el Compuesto 1 para la inhibicion del aumento de los niveles de pSTAT1 inducido por INFa fue de 6,21 + 0,09 ((ETM)), mientras que pCI50 para la inhibicion del aumento de IL-8 inducido por GM-CSF fue de 4,97 + 0,14 ((ETM)) (resultados obtenidos usando 6 donantes de sangre). Esto confirma que el Compuesto 1 es 17,6 veces mas selectivo para la via de JAK1 que para la via de JAK2. Por tanto, en una configuracion celular es evidente que el Compuesto 1 presenta selectividad para JAK1 con respecto a JAK2. Parece que el Compuesto 1 presenta una selectividad mayor para JAK1 que para JAK2, en comparacion con los compuestos estructuralmente relacionados conocidos, u otros inhibidores de JAK conocidos.

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2.4.2. Protocolo de estimulacion de IL-6

Tambien se realizo un analisis de citometna de flujo para establecer la selectividad del compuesto para JAK1 con respecto a JAK2, ex vivo usando sangre humana. Por tanto, se extrajo sangre a voluntarios humanos con consentimiento informado. Posteriormente se equilibro la sangre durante 30 min a 37 °C con oscilacion moderada, posteriormente se separo en alfcuotas en tubos Eppendorf. Se anadio el compuesto a diferentes concentraciones y se incubo a 37 °C durante 30 min con agitacion moderada y posteriormente se estimulo durante 20 min a 37 °C con agitacion moderada con interleucina 6 (IL-6) para la estimulacion de la via dependiente de JAK-1 o la estimulacion de la via dependiente de GM-CSF o JAK2. Despues, se evaluaron fosfo-STATI y fosfo-STAT5 usando analisis de FACS.

2.4.2.1 Ensayos de fosfo-STATI

Para el aumento de la fosforilacion de Transductores de Senal y Activadores de Transcripcion 1 (pSTATI) estimulados por IL-6 en leucocitos, se extrajo sangre humana a voluntarios con consentimiento informado, se trato ex vivo con el compuesto durante 30 min y posteriormente se estimulo durante 20 min con IL-6. Se midio el aumento de fosforilacion de STAT1 por medio de linfocitos IL-6 usando un anticuerpo anti fosfo-STATI por medio de FACS.

Se diluyo el tampon 5 X de lisis/fijacion (BD PhosFlow, N.° de Cat. 558049) 5 veces con agua destilada y se pre- calento a 37 °C. Se descarto el tampon de lisis/fijacion diluido restante.

Se disolvieron 10 pg de rhIL-6 (R&D Systems, N.° de Cat. 206-IL) en 1 ml de PBS BSA al 0,1 % para obtener una solucion madre 10 pg/ml. Se almaceno la solucion madre en forma de alfcuotas a -80 °C.

Se prepararon series de dilucion de 3 veces del compuesto en DMSO (solucion madre 10 mM). Las muestras tratadas con el control recibieron DMSO en lugar del compuesto. Se incubaron todas las muestras con una concentracion final de DMSO al 1 %.

2.4.2.1.1. Incubacion de sangre con compuesto y estimulacion con IL-6

Se recogio sangre humana en tubos tratados con heparina. Se dividio la sangre en alfcuotas de 148 pl. Despues, se anadieron 1,5 pl de dilucion de compuesto a cada alfcuota y se incubaron las muestras de sangre durante 30 min a 37 °C con oscilacion moderada. Se anadio la solucion madre IL-6 (1,5 pl) a las muestras de sangre (concentracion final de 10 ng/ml) y se incubaron las muestras a 37 °C durante 20 min con oscilacion moderada.

2.4.2.1.2 Preparacion de muestras de leucocitos y marcaje con CD4

Al final del penodo de estimulacion, se anadieron de forma inmediata 3 ml de 1 x tampon de lisis/fijacion pre- calentado a las muestras de sangre, se sometio a agitacion con formacion de vortice brevemente y se incubo durante 15 min a 37 °C en un bano de agua con el fin de someter a lisis los eritrocitos y fijar los leucocitos, posteriormente se congelo a -80 °C hasta su uso posterior.

Para las etapas siguientes, se descongelaron los tubos a 37 °C durante aproximadamente 20 min y se centrifugaron durante 5 min a 400 g a 4 °C. Se lavo el sedimento celular con 3 ml de 1 X PBS frio, y tras la centrifugacion del microgranulo celular, se re-suspendio en 100 pl de PBS que contema BSA 3 %. Se anadieron anticuerpo anti-CD4 conjugado-FITC o anticuerpo de isotipo conjugado-FITC de control y se incubo durante 20 min a temperatura ambiente, en oscuridad.

2.4.2.1.3 Permeabilizacion de celulas y marcaje con anticuerpo anti Phospho-STATI

Tras lavar las celulas con 1 X PBS, se re-suspendio el sedimento celular en 100 pl de 1 x PBS enfriado en hielo y se anadieron 900 pl de metanol de 100 % enfriado en hielo. Despues, se incubaron las celulas a 4 °C durante 30 min para la permeabilizacion.

A continuacion, se lavaron las celulas permeabilizadas con 1 x PBS que contema BSA al 3 % y finalmente se re- suspendieron en 80 pl de 1 X PBX que contema BSA al 3 %.

Se anadieron 20 pl de anti-STAT1 de raton PE (pY701) o anticuerpo de control de isotipo IgG2aK de raton PE (BD Biosciences, N.° de Cat. 612564 y 559319, respectivamente) y se mezclo, posteriormente se incubo durante 30 min a 4 °C, en oscuridad.

Despues, se lavaron las celulas una vez con 1 x PBS y se analizaron en un citometro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences).

2.4.2.I.4. Analisis de fluorescencia en FACSCanto II

Se contaron 50 000 eventos totales y se midieron celulas positivas para Phospho-STAT1 tras colocacion sobre celulas CD4+, en la ventana del linfocito. Se analizaron los datos usando el software FACSDiva y correspondiendo al porcentaje de inhibicion de estimulacion de IL-6 calculado sobre el porcentaje de celulas positivas para fosfo-STAT1

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sobre celulas CD4+.

2.4.2.2 Ensayo de Fosfo-STAT5

Para el aumento de fosforilacion de Transductores de Senal y Activadores de Transcripcion 1 (pSTAT5) estimulados por GM-CSF en leucocitos, se extrajo sangre humana a voluntarios con consentimiento informado, se trato ex vivo con el compuesto durante 30 min y posteriormente se estimulo durante 20 min con GM-CSF. Se midio el aumento de fosforilacion de STAT5 por medio de monocitos GM-CSF usando un anticuerpo anti fosfo-STAT5 por medio de FACS.

Se diluyo el tampon 5 X de lisis/fijacion (BD PhosFlow, N.° de Cat. 558049) 5 veces con agua destilada y se pre- calento a 37 °C. Se descarto el tampon de lisis/fijacion diluido restante.

Se disolvieron 10 pg de rhGM-CSF (AbCys S.A., N.° de Cat. P300-03) en 100 pl de PBS BSA al 0,1 % para obtener una solucion madre de 100 pg/ml. Se almaceno la solucion madre en forma de alfcuotas a -80 °C.

Se prepararon series de dilucion de 3 veces del compuesto en DMSO (solucion madre 10 mM). Las muestras tratadas con el control recibieron DMSO sin ningun compuesto de ensayo. Se incubaron todas las muestras con una concentracion final de DMSO del 1 %.

2.4.2.2.I. Incubacion de sangre con compuesto y estimulacion con GM-CSF

Se recogio sangre humana en tubos tratados con heparina. Se dividio la sangre en alfcuotas de 148,5 pl. Despues, se anadieron 1,5 pl de dilucion de compuesto a cada alfcuota y se incubaron las muestras de sangre durante 30 min a 37 °C con oscilacion moderada. Se anadio la solucion madre GM-CSF (1,5 pl) a las muestras de sangre (concentracion final de 20 pg/ml) y se incubaron las muestras a 37 °C durante 20 min con oscilacion moderada.

2.4.2.2.2 Preparacion de muestras de leucocitos y marcaje con CD14

Al final del penodo de estimulacion, se anadieron de forma inmediata 3 ml de 1 x tampon de lisis/fijacion pre- calentado a las muestras de sangre, se sometio a agitacion con formacion de vortice brevemente y se incubo durante 15 min a 37 °C en un bano de agua con el fin de someter a lisis los eritrocitos y fijar los leucocitos, posteriormente se congelo a -80 °C hasta su uso posterior.

Para las etapas siguientes, se descongelaron los tubos a 37 °C durante aproximadamente 20 min y se centrifugaron durante 5 min a 400 g a 4 °C. Se lavo el sedimento celular con 3 ml de 1 X PBS frio, y tras la centrifugacion del sedimento celular, se re-suspendio en 100 pl de PBS que contema BSA 3 %. Se anadieron anticuerpo anti-CD4 de raton FITC (BD Biosciences, N.° de Cat. 345784) o anticuerpo de isotipo IgG2bK de raton FITC de control (BD Biosciences, N.° de Cat. 555057) y se incubo durante 20 min a temperatura ambiente, en oscuridad.

2.4.2.2.3 Permeabilizacion de celulas y marcaje con anticuerpo anti Phospho-STAT5

Tras lavar las celulas con 1 X PBS, se re-suspendio el sedimento celular en 100 pl de 1 x PBS enfriado en hielo y se anadieron 900 pl de metanol de 100 % enfriado en hielo. Despues, se incubaron las celulas a 4 °C durante 30 min para la permeabilizacion.

Despues, se lavaron las celulas permeabilizadas con 1 x PBS que contema BSA 3 % y finalmente se re- suspendieron en 80 pl de 1 X PBS que contema BSA 3 %.

Se anadieron 20 pl de anti-STAT5 de raton PE (pY694) o anticuerpo de control de isotipo IgG1K de raton PE (BD Biosciences, N.° de Cat. 612567 y 554680, respectivamente) y se mezclo, posteriormente se incubo durante 30 min a 4 °C, en oscuridad.

Despues, se incubaron las celulas una vez con 1 x PBS y se analizaron en un citometro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences).

2.4.2.2.4. Analisis de fluorescencia en FACSCanto II

Se contaron 50 000 eventos totales y se midieron celulas positivas Phospho-STAT5 tras colocacion sobre celulas CD14+. Se analizaron los datos usando el software FACSDiva y correspondiendo al porcentaje de inhibicion de estimulacion de GM-CSF calculado sobre el porcentaje de celulas positivas para fosfo-STAT5 sobre celulas CD14+.

2.4.2.3. Resultados

Cuando se sometio a este protocolo, se determino el porcentaje de inhibicion (PIN) obtenido a partir de la media de 3 voluntarios sanos para el compuesto de la invencion. Por ejemplo, se sometio a ensayo el Compuesto 1 y se volvio a pCl50 = 6,61 en la inhibicion de la fosforilacion de STAT1 y pCl50 = 5,37 en la inhibicion de la fosforilacion de STAT5.

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Cuando se compara el efecto del Compuesto 1 sobre STAT1 (via dependiente de JAK1) y STAT5 (via dependiente de JAK-2), se midio una selectividad de 17,6 veces para JAK1 frente a JAK2.

Ejemplo 3. Modelos in vivo

Ejemplo 3.1. Modelo AIC

3.1.1 Materiales

Se adquirio adyuvante de Freund completo (CFA) y adyuvante de Freund incompleto (IFA) en Difco. Se obtuvieron colageno de tipo II bovino (CII), lipopolisacarido (LPS) y Enbrel en Chondrex (Isle d'Abeau, Francia); Sigma (P4252, L'Isle d'Abeau, Francia), Whyett (jeringa inyectable de 25 mg, Francia), Acros Organics (Palo Alto, CA), respectivamente. Los reactivos usados fueron de calidad de reactivo y todos los disolventes fueron de calidad analftica.

3.1.2. Animales

Se obtuvieron ratas de Dark Agouti (macho, de 7-8 semanas) en Harlan Laboratories (Maison-Alfort, Francia). Se obtuvieron ratones DBA/1J (macho, 7 semanas) en Centre d'Elevage et de Reproduction JANVIER (CERJ) (Laval, Francia). Se mantuvieron las ratas y los ratones en un ciclo de 12 h de luz/oscuridad (0700-1900). Se mantuvo la temperatura en 22 °C, y se proporcionaron agua y alimenta a demanda.

3.1.3 Artritis inducida por colageno (AIC)

Un dfa antes del experimento, se preparo una solucion CII (2 mg/ml) con acido acetico 0,05 M y se almaceno a 4 °C. Justo antes de la inmunizacion, se mezclaron volumenes iguales de adyuvante (IFA) y CII por medio de un dispositivo de homogeneizacion en una botella de vidrio pre-enfriada en un bano de agua con hielo. Se podna requerir adyuvante extra y homogeneizacion prolongada si no se formara ninguna emulsion.

Ratones: se inyectaron 0,1 ml de emulsion por via intradermica en la base de la cola de cada raton en el dfa 1, y se realizo una segunda inyeccion intradermica de refuerzo (solucion CII a 1 mg/ml de CFA en 0,1 ml de solucion salina) en el dfa 21. Se modifico este procedimiento de inmunizacion a partir de los procedimientos publicados (David D Brand Kary A Latham y Edward R Rosloniec. Collagen-induce arthritis, Nature Methods 2 (5): 1269-1275, 2007).

Rata: se inyectaron 0,2 ml de emulsion por via intradermica en la base de la cola de cada rata en el dfa 1, y se realizo una segunda inyeccion intradermica de refuerzo (solucion CII a 2 mg/ml en CFA en 0,1 ml de solucion salina) en el dfa 9. Se modifico este procedimiento de inmunizacion a partir de los procedimientos publicados (Sims NA y col., (2004). Targeting osteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction in collagen-induce arthritis, Arthritis Rheum. 50 2338-2346; Jou y col., 2005).

3.1.4. Diseno del estudio

Se sometieron a ensayo los efectos terapeuticos de los compuestos de ensayo en el modelo de AIC en rata y raton. Se dividieron aleatoriamente los animales en grupos iguales, conteniendo cada grupo 10 animales. Se inmunizaron todas las ratas en el dfa 1 y se reforzaron en el dfa 9. Se inmunizaron todos los ratones en el dfa 1 y se reforzaron en el dfa 9. La dosificacion terapeutica duro desde el dfa 16 hasta el dfa 30. Se trato el grupo de control negativo con vehmulo (MC al 0,5 %) y el grupo de control positivo con Enbrel (10 mg/kg, 3 veces por semana, s.c.). Normalmente, se sometio a ensayo un compuesto de interes en 3 dosis, por ejemplo, 3, 10, 30 mg/kg, por via oral.

3.1.5. Evaluacion cHnica de la artritis

Se clasifico la artritis de acuerdo con el procedimiento de Khachigian 2006, Lin et al 2007 y Nishida et al 2004. Se clasifico el hinchamiento de cada una de las cuatro patas con la puntuacion artntica siguiente: 0 - sin smtomas; 1 - enrojecimiento moderado pero definitivo e hinchamiento de un tipo de articulacion tal como tobillo o muneca, o enrojecimiento aparente e hinchamiento limitado hasta dedos individuales, independientemente del numero de dedos afectados; 2 - enrojecimiento moderado e hinchamiento de dos o mas tipos de articulaciones; 3 - enrojecimiento severo e hinchamiento de toda la pata incluyendo los dedos; 4 - extremidad con inflamacion maxima con afectacion de multiples articulaciones (puntuacion maxima acumulada de artritis clmica de 16 por cada animal) (Nishida y col., 2004).

Para permitir el meta-analisis de estudios multiples se normalizaron los valores de puntuacion clmica como se muestra a continuacion:

ABC de la puntuacion cHnica (puntuacion ABC): Se calculo el area bajo la curva (ABC) desde el dfa 1 al dfa 14 para cada rata individual. Se dividio el ABC de cada animal entre la el ABC medio obtenido para el vehmulo en el estudio a partir del cual se obtuvieron los datos de ese animal y se multiplico por 100 (es decir, el ABC se expreso como porcentaje de ABC medio del vehmulo por estudio).

Aumento de puntuacion clmica desde el d^a 1 hasta el d^a 14 (puntuacion de criterio de valoracion): Se dividio la diferencia de puntuacion clmica de cada animal entre la diferencia de puntuacion clmica media obtenida para el vehffculo en el estudio a partir del cual se obtuvieron los datos para ese animal y se multiplico por 100 (es decir, la diferencia se expresa como un porcentaje de la diferencia de puntuacion clmica media para el vehffculo por estudio).

5 3.1.6 Cambio de peso corporal (%) tras la aparicion de la artritis

10

Clmicamente, la perdida de peso corporal se asocia a la artritis (Shelton y col., 2005; Argiles y col., 1998; Rall, 2004; Walsmith y col., 2004). Ademas, se podffan usar los cambios en el peso corporal tras la aparicion de artritis como criterio de valoracion no espedfico para evaluar el efecto de las sustancias terapeuticas en el modelo de ratas. Se calculo el cambio en el peso corporal (%) tras la aparicion de artritis como se muestra a continuacion:

Retorts:

_ Peso corporalf^^^ - Peso cprpprd^^^ 5;,

Peso carporal1.sejnajiIlS)

jrlOOSi

Peso carparalf^^ „ - Peso corporal [senaM ^

flc.tns: ---------------------!-----------------:--------------------------------

Pesocorporal^^^ ^

3.1.7 Puntuacion de Larsen

Se obtuvo la puntuacion de Larsen, despues de la muerte, para ambas patas posteriores de todas las ratas por parte de la menos 2 cienffficos. Se calculo la media de estas puntuaciones para obtener una puntuacion de Larsen por 15 rata. Para permitir la comparacion entre estudios de puntuaciones de Larsen, se dividio la puntuacion de Larsen de cada rata entre la puntuacion de Larsen obtenida para el vehffculo en el estudio al cual pertenece la rata y se multiplico por 100 (es decir, se expresa la puntuacion de Larsen como el porcentaje de puntuacion de Larsen media de vehffculo por estudio). Se calculo y se comparo la puntuacion de Larsen media de los diferentes grupos de tratamiento.

20 3.1.8 Radiolog'ia

Se tomaron fotograffas de rayos X de las patas posteriores de cada animal individual. Se asigno un numero de identidad aleatorio con anonimato a cada una de las fotograffas, y se puntuo la gravedad de la erosion osea por parte de dos evaluadores independientes con el sistema de puntuacion de Larsen radiologico que se muestra a continuacion: 0 - normal con contorno oseo intacto y espacio articular normal; 1 - ligera anormalidad con uno o dos 25 huesos metatarsianos exteriores que muestran ligera erosion osea; 2 - anormalidad preliminar definida con cualquiera de los tres a cinco huesos metatarsianos exteriores mostrando erosion osea; 3 - anormalidad destructiva media con todos los huesos metatarsianos exteriores asf como uno o dos de los huesos metatarsianos interiores mostrando erosiones oseas definidas; 4 -a anormalidad destructiva grave con todos los huesos metatarsianos que muestran erosion osea definida y al menos una de las articulaciones metatarsianas internas completamente 30 erosionada dejando parte del contorno oseo de la articulacion parcialmente conservada; 5 - anormalidad mutiladora sin contornos oseos. Este sistema de puntuacion es una modificacion del de Salvemini y col., 2001; Bush y col., 2002; Sims y col., 2004; Jou y col., 2005.

3.1.9 Histolog'ia

Tras los analisis radiologicos, se fijaron las patas posteriores en formol tamponado con fosfato al 10 % (pH 7,4), se 35 descalcificaron con agente de descalcificacion osea rapida para realizar la histologfa fina (Laboratories Eurobio) y se intercalaron en parafina. Para garantizar la evaluacion amplia de las articulaciones con artritis, se cortaron al menos cuatro secciones en serie (de 5 pm de espesor) y cada una de las series de secciones estaba separada por 100 pm. Se tineron las secciones con hematoxilina y eosina (HyE). Se realizaron examenes histologicos, doble ciego, para evaluar la inflamacion sinovial y el dano oseo y sobre el carfflago. En cada pata, se evaluaron cuatro parametros 40 usando una escala de cuatro puntos. Los parametros fueron infiltracion celular, gravedad de granulacion sinovial, erosion del carfflago y erosion osea. Se realizo la puntuacion como se muestra a continuacion: 1 - normal, 2 - suave, 3 - moderada, 4 - marcada. Se sumaron estas cuatro puntuaciones juntas y se representaron como una puntuacion adicional, concretamente la "puntuacion total AR". Para permitir la comparacion de las lecturas histologicas entre estudios, se dividio la puntuacion histologica total de cada rata entre la puntuacion histologica total media obtenida 45 para el vetffculo en el estudio al cual pertenece esa rata y se multiplico por 100 (es decir, se expresa la puntuacion histologica total como el porcentaje de la puntuacion histologica total media del vetffculo por estudio). Se calculo y se comparo la puntuacion histologica total media de los diferentes grupos de tratamiento.

3.1.10 Analisis de tomografia micro-computarizada (yC) de calcaneo (hueso del talon)

La degradacion osea observada en la AR tiene lugar especialmente en el hueso cortical y puede revelarse por medio 50 de analisis por pCT (Sims NA y col., 2004; Oste L y col., ECTC Montreal 2007). Tras la evaluacion y la reconstruccion de volumen 3D del calcaneo, se midio la degradacion osea como el numero de objetos discretos presentes por cada corte, se aislo por ordenador perpendicular al eje longitudinal del hueso. Cuanto mas se degrado el hueso, mas objetivos discretos se midieron. Se analizaron 1000 cortes, distribuidos de manera uniforme a lo largo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

del calcaneo (separados aproximadamente 10,8 pm).

3.1.11. Resultados

Se sometio a ensayo el Compuesto 1 en el estudio de AIC de raton a 30 mg/kg y en el estudio de AIC de rata a 30, 10, 3 y 1 mg/kg. El compuesto 1 fue eficaz en todas las lecturas realizadas en el estudio AIC de rata, con significancia estadfstica en varias de las lecturas, en particular se observaron mejoras significativas para: el ABC de la puntuacion clmica (de 10 mg/kg), la puntuacion clmica de criterio de valoracion (a partir de 1 mg/kg), la puntuacion de Larsen (desde 30 mg/kg) y el hinchamiento de las patas (desde 1 mg/kg).

Ejemplo 3.2. Modelo de choque septico

La inyeccion de lipopolisacarido (LPS) induce una liberacion rapida del factor de necrosis tumoral soluble (TNF-alfa) en la periferia. Se usa este modelo para analizar los agentes de bloqueo prospectivos de liberacion de TNF in vivo.

Se tratan seis ratones hembra BALB/cJ (20 g) por grupo con la dosis deseada de una vez, por via oral. Treinta minutos mas tarde, se inyecta LPS (15 pg/kg; serotipo E-Coli 0111:B4) por via intraperitoneal. Noventa minutos despues, se sacrifica a los ratones y se recoge la sangre. Se determinan los niveles de TNF alfa circulantes usando kits de ELISA disponibles en el mercado. Se usa dexametasona (5 pg/kg) como compuesto antiinflamatorio de referencia. Se someten a ensayo los compuestos seleccionados a una dosis o a dosis multiples, por ejemplo, 3 y/o 10 y/o 30 mg/kg, por via oral.

El Compuesto 1 presento una reduccion estadfsticamente significativa de la liberacion de TNF (> 50 %) a 30 mg/kg po.

Ejemplo 3.3. Modelo MAB

El modelo MAB permite una evaluacion rapida de la modulacion de una respuesta inflamatoria de tipo AR por medio de sustancias terapeuticas (Kachigian LM. Nature Protocols (2006) 2512-2516: Collagen antibody-induced arthritis). Se inyecta por via intravenosa un coctel de mAb a ratones DBA/J dirigidos contra colageno II. Un dfa despues, se inicia el tratamiento del compuesto (vehmulo: 10% (v/v) HPpCD). Tres dfas despues, los ratones reciben ua inyeccion de LPS por via intraperitoneal (50 pg/raton), dando como resultado la aparicion rapida de la inflamacion. Se continua el tratamiento del compuesto hasta 10 dfas despues de la inyeccion de mAb. Se lee la inflamacion por medio de medicion del hinchamiento de las patas y se registra la puntuacion clmica de cada pata. Se presenta la puntuacion acumulada clmica de artritis de las cuatro extremidades para mostrar la gravedad de la inflamacion. Se aplica un sistema de puntuacion a cada extremidad usando una escala 0-4, siendo el 4 la inflamacion mas grave.

0 Sin smtomas

1 Enrojecimiento moderado pero definitivo e hinchamiento de un tipo de articulacion tal como tobillo o muneca, o enrojecimiento aparente e hinchamiento limitado hasta dedos individuales, independientemente del numero de dedos afectados

2 Enrojecimiento moderado e hinchamiento de dos o mas tipos de articulaciones

3 Enrojecimiento severo e hinchamiento de toda la pata incluyendo los dedos

4 Extremidad con inflamacion maxima con afectacion de multiples articulaciones

Ejemplo 3.4. Modelos oncologicos

Se describen modelos in vivo para validar la eficacia de moleculas pequenas frente a enfermedades mieloproliferativas accionadas por JAK2 por parte de Wernig y col. Cancer Cell 13, 311, 2008 y Geron y col. Cancer Cell 13, 321, 2008.

Ejemplo 3.5 Modelo EII en raton

Los modelos in vitro e in vivo para validar la eficacia de moleculas pequenas frente a la EII se describen por parte de Wirtz y col., 2007.

Ejemplo 3.6 Modelo de asma en raton

Los modelos in vitro e in vivo para validar la eficacia de moleculas pequenas frente al asma se describen por Niels y col., 2008; Ip y col., 2006; Pernis y col., 2002; Kudlacz y col., 2008.

Ejemplo 4 Modelos de Seguridad, DMPK y Toxicidad

Ejemplo 4.1. Solubilidad termodinamica

Se prepara una solucion de 1 mg/ml de compuesto de ensayo en un tampon de fosfato al 0,2 M pH 7,4 o un tampon de citrato al 0,1 M pH 3,0 a temperatura ambiente en un vial de vidrio.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Se hacen rotar las muestras en un Rotator drive STR 4 (Stuart Scientific, Bibby) a una velocidad de 3,0 a temperature ambiente durante 24 h.

Trascurridas 24 h se transfieren 800 |jl de la muestra a un tubo Eppendorf y se centrifugan 5 min a 14000 rpm. Despues, se transfieren 200 jl del sobrenadante de la muestra a una placa MultiscreenR Solubility Plate (Millipore, MSSLBPC50) y se filtra el sobrenadante (33,7-40,4 kPa) con ayuda de un colector de vado al interior de una placa limpia de 96 pocillos con parte inferior con forma de V de polipropileno de Greiner (N.° de Cat. 651201). Se diluyen 5 jl del filtrado en 95 jl (F20) del mismo tampon utilizado para incubar en la placa que conterna la curva patron (Greiner, N.° de Cat. 651201).

Se prepara de nuevo la curva patron para el compuesto en DMSO partiendo de una solucion madre de DMSO 10 mM, diluida con factor 2 en DMSO (5000 jm) y posteriormente se diluye en DMSO hasta 19,5 jMN. Despues, se transfieren 3 jl de las series de dilucion desde 5000 jM hasta una mezcla de acetonitrilo-tampon de 97 jl (50/50). El intervalo de concentracion final es de 2,5 a 150 jM.

Se sella la placa con superficies de sellado (MA96RD-045,
www.kinesis.co.uk) y se miden las muestras a temperatura ambiente en CLEM (ZQ 1525 de Waters) en condiciones optimizadas usando Quanoptimize para determinar la masa apropiada de la molecula.

Se analizan las muestras en CLEM con un caudal de 1 ml/min. El disolvente A es amornaco 12 mM y el disolvente B es acetonitrilo. Se analiza la muestra por pulverizacion ionica positiva en una columna XBridge C18 3,5jM (2,1 x 30 mm), de Waters. El gradiente de disolvente tiene un tiempo total de analisis de 2 min y vana de 5 % B a 95 % de B.

Se analizan las areas con ayuda de un paquete de software Masslynx y se representan las areas de los picos de las muestras frente a la curva patron para obtener la solubilidad del compuesto.

Los valores de solubilidad se presentan en jM o jg/ml.

Ejemplo 4.2 Solubilidad acuosa

Partiendo de una solucion madre 10 mM en DMSO, se prepara una dilucion seriada del compuesto en DMSO. Se transfieren las series de dilucion a una placa Maxisorb NUNC 96 con parte inferior con forma de F (N.° de Cat. 442404) y se anade un tampon de fosfato 0,2 M pH 7,4 o tampon de citrato 0,1 M pH 3,0 a temperatura ambiente.

La concentracion final vanaba de 200 jM a 2,5 jM en 5 etapas de dilucion iguales. La concentracion final de DMSO no supero el 2 %. Se anade pireno 200 jM a los puntos de las esquinas de cada placa de 96 pocillos y sirve como punto de referencia para la calibracion del eje Z en el microscopio.

Se sellan las placas de ensayo y se incuban durante 1 h a 37 °C mientras se agitan a 230 rpm. Despues, se detectan las placas bajo un microscopio de luz blanca, dando lugar a dibujos individuales de precipitado por concentracion. Se analiza el precipitado y se convierte en un numero que se representa sobre un grafico. La primera concentracion a la que aparece el compuesto completamente disuelto es la concentracion que se notifica, sin embargo la concentracion real se encuentra en algun punto entre esta concentracion y una etapa de dilucion superior.

Se presentan los valores de solubilidad en jg/ml

Ejemplo 4.3 Union de protena plasmatica (Dialisis de Equilibrio)

Se diluye una solucion madre 10 mM del compuesto en DMSO con un factor de 5 en DMSO. Se diluye posteriormente esta solucion en plasma recien descongelado de perro, raton, rata o humano (BioReclamation INC) con una concentracion final de 10 jM y una concentracion de DMSO final del 0,5 % (5,5 jl en 1094,5 jl de plasma en una placa de 96 pocillos de PP-Masterblock (Greiner, N.°Cat. 780285).

Se prepara una placa Pierce Red Device con insertos (ThermoScientific, N.° de Cat. 89809) y se llena con 750 jl de PBS en la camara del tampon y 500 jl de plasma marcado en la camara del plasma. Se incuba la placa durante 4 h a 37 °C mientras se agita a 230 rpm. Tras la incubacion, se transfieren 120 jl de ambas camaras a 360 jl de acetonitrilo en placas de pocillos profundos PP, de parte inferior redondeada, de 96 pocillos (Nunc, N.° de Cat. 278743) y se sellan con un borde de papel metalizado de aluminio. Se mezclan las muestras y se colocan sobre hielo durante 30 min. Despues, se centrifuga esta placa 30 min a 1200 rcf a 4 °C y se transfiere el sobrenadante a una placa de PP de parte inferior con forma de v de 96 pocillos (Greiner, 651201) para analisis en CLEM.

Se sella la placa con superficies selladoras (MA96RD-04S) de
www.kinesis.co.uk y se miden las muestras a temperatura ambiente en un CLEM (ZQ 1525 de Waters) en condiciones optimizadas usando Quanoptimize para determinar la masa apropiada de la molecula.

Se analizan las muestras sobre CLEM con un caudal de 1 ml/min. El disolvente A era amornaco 15 mM y el disolvente B era acetonitrilo. Se analizo la muestra por pulverizacion ionica positiva en una columna XBridge C18

5

10

15

20

25

30

35

40

45

3,5pM (2,1 x 30 mm), de Waters. El gradiente de disolvente tiene un tiempo total de analisis de 2 min y vana del 5 % B al 95 % de B.

Se considera que el area de pico del compuesto en la camara de tampon y en la camara de plasma es el 100 % del compuesto. El porcentaje unido a plasma se calcula a partir de estos resultados y se presenta el LIMS en forma de porcentaje unido a plasma.

Se inspecciona la solubilidad del compuesto en la concentracion final de ensayo en PBS por medio de microscopio para indicar si se observa precipitacion o no.

Ejemplo 4.4 Propension a la prolongacion de QT

Se evalua el potencial de prolongacion de QT en el ensayo de pinzamiento zonal de hERG.

4.4.1 Pinzamiento zonal convencional de celulas completas

Se realizan registros de pinzamiento zonal de celulas completas usando un amplificador EPC10 controlado por un software Pulse v8,77 (HEKA). Normalmente, la resistencia de la serie es menor de 10 MQ y se compensa en mas de un 60 %, a los registros no se les han restado las fugas. Se fabrican los electrodos a partir de pipetas de vidrio GC150TF (Harvard).

La solucion de bano externo contiene: NaCl 135 mM, KCl 5 mM, CaCl2 1,8 mM, Glucosa 5 mM, HEPES 10 mM pH 7,4.

La solucion de pipeta de zona interna contiene: gluconato de K 100 mM, KCl 20 mM, CaCl2 1 mM, MgCh 1 mM, Na2ATP 5 mM, Glutation 2 mM, EGTA 11 mM, HEPEs 10 mM, pH 7,2.

Se someten los farmacos a perfusion usando un sistema de perfusion rapida Biologic MEV-9/EVH-9.

Se realizan todos los registros sobre celulas HEK293 que expresan canales hERG. Se someten las celulas a cultivo en cubreobjetos redondos de 12 mm (German glass, Bellco) fijados en la camara de registro usando dos rodillos de platino (Goofellow). Se evocan corrientes de hERG usando un pulso de activacion hasta + 40 mV durante 1000 ms seguido de un pulso de corriente de cola hasta -50 mV durante 2000 ms, siendo el potencial de retencion de -80 mV. Se aplican los pulsos cada 20 s y se realizan todos los experimentos a temperatura ambiente.

4.4.2 Analisis de datos

Se calculan los valores de CI50 y CI20 para cada compuesto sometido a ensayo. Se calculan la diferencia en numero entre la CI20 y las concentraciones Cmax no unidas del compuesto de ensayo obtenidas a dosis terapeuticas relevantes, como viene determinado por medio de los resultados obtenidos para el modelo AIC de rata.

Para las curvas de respuesta y concentracion, se mide la amplitud de corriente de cola maxima durante la etapa de voltaje de -50 mV. Se realiza el ajuste de la curva de concentracion-respuesta usando la ecuacion:

imagen11

en la que a es la respuesta minima, b es la respuesta maxima y d es la pendiente de Hill. Esta ecuacion se puede usar para calcular tanto la CI50 (en la que y = 50 y c es el valor de CI50) como la CI20 (en la que y = 20 y c es el valor de CI 20). Se uso un software GraphPad® Prism® (Graphpad® Software Inc.) para todo el ajuste de la curva. Una diferencia de 100 o mas indica un bajo potencial para la prolongacion de QT.

Ejemplo 4.5 Estabilidad microsomica

Se diluyo una solucion madre 10 mM de compuesto en DMSO 1000 veces en un tampon de fosfato de 182 mM pH 7,4 en una placa de 96 pocillos profundos (Greiner, N.° de Cat. 780285) y se pre-incubo a 37 °C.

Se anadieron 40 pl de agua desionizada a un pocillo de un tubo de almacenamiento marcado con codigo de barras Matrix 2D de polipropileno (Thermo Scientific) y se pre-incubaron a 37 °C.

Se preparo una solucion madre de trabajo de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G6PDH) en tampon de fosfato 182 mM pH 7,4 y se coloco sobre hielo antes de su uso. Se preparo un co-factor que contema MgCh, glucosa-6- fosfato y NADP+ en agua desionizada y se coloco sobre hielo antes de su uso.

Se preparo una solucion de trabajo final que contema microsomas de tngado (Xenotech) de G6PDH de una especie de interes (ser humano, raton, rata, perro) previamente descrita y co-factores y se incubo esta mezcla durante no mas de 20 min a temperatura ambiente.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Se anadieron 30 |jl de la dilucion de compuesto pre-calentada a 40 |jl de agua pre-calentada en tubos Matrix y se anadieron 30 jl de mezcla microsomica. Las concentraciones finales de reaccion fueron compuesto 3 jM, 1 mg de microsomias, GDPH 0,4 U/ml, MgCl2 3,3 mM, glucosa-6-fosfato 3,3 mM y NADP+ 1,3 mM.

Para medir el porcentaje restante de compuesto en el tiempo cero, se anadio MeOH o ACN (1:1) al pocillo antes de la adicion de la mezcla microsomica. Se sellaron las placas con selladores TM Matrix Sepra (Matrix. N.° de Cat. 4464) y se agitaron durante unos pocos segundos para garantizar la mezcla completa de todos los componentes.

Se incubaron las muestras que no se detuvieron a 37 °C, 300 rpm y, despues de 1 h de incubacion, se detuvo la reaccion con MeOH o ACN (1:1).

Tras detener la reaccion, se mezclaron las muestras y se colocaron sobre hielo durante 30 min para precipitar las protemas. Despues, se centrifugaron las placas 30 min a 1200 rcf a 4 °C y se transfirio el sobrenadante a una placa PP 96 con parte inferior con forma de V (Greiner, 651201) para el analisis en CLEM.

Se sellaron estas placas con superficies selladoras (MA96RD-04S) de
www.kinesis.co.uk y se midieron las muestras a temperatura ambiente en un CLEM (ZQ 1525 de Waters) en condiciones optimizadas usando Quanoptimize para determinar la masa apropiada de la molecula.

Se analizaron las muestras sobre CLEM con un caudal de 1 ml/min. El disolvente A era amomaco 15 mM y el disolvente B era metanol o acetonitrilo, dependiendo de la solucion de detencion usada. Se analizan las muestras por pulverizacion ionica positiva en una columna XBridge C18 3,5jM (2,1 x 30 mm), de Waters. El gradiente de disolvente tiene un tiempo total de analisis de 2 min y vana del 5 % B al 95 % de B.

Se considera que el area de pico del compuesto parental en el tiempo 0 es del 100 %. El porcentaje que queda tras 1 h de incubacion se calcula a partir del tiempo 0 y se calcula como porcentaje que queda. Se inspecciona la solubilidad del compuesto en la concentracion de ensayo final en el tampon, al microscopio y se presentan los resultados.

Los datos de estabilidad microsomica se expresan en forma de porcentaje de la cantidad total de compuesto que queda tras 60 min.

TABLA IX - Estabilidad microsomica

Compuesto n.°

Ser humano Rata

1

76-100 % 76-100 %

Ejemplo 4.6 Permeabilidad Caco2

Se realizaron ensayos Caco-2 bidireccionales como se describe a continuacion. Se obtuvieron celulas Caco-2 de la European Collection of Cell Cultures (ECAC, cat. 86010202) y se usaron tras un cultivo celular de 21 dfas en placas de Transwell de 24 pocillos (Fisher TKT-545-020B).

Se sembraron 2x105 celulas/pocillo en un medio de preparacion que consistfa en DMEM + GlutaMAXI + NEAA al 1 %+ FBS al 10 % (FetalClone II) + Pen/Strep al 1 %. Se modifico el medio cada 2-3 dfas.

Se prepararon compuestos de ensayo y referencia (propanolol y rodamina 123 o vinblastina, todos ellos adquiridos de Sigma) en Disolucion de Sal Equilibrada de Hank que contema 25 mM de HEPES (pH 7,4) y se anadio a la camara apical (125 jl) y basolateral (600 jl) del conjunto de la placa de Transwell a una concentracion de 10 jM con una concentracion final de DMSO del 0,25 %.

Se anadio Lucifer Yellow 50 jM (Sigma) al tampon donador en todos los pocillos para evaluar la integridad de las capas celulares por medio del control de la permeabilidad de Lucifer Yellow. Debido a que Lucifer Yellow (LY) no puede permear libremente a traves de las barreras lipofilas, un elevado grado de transporte de LY indica una pobre integridad de la capa de celulas.

Tras 1 h de incubacion a 37 °C mientras se agitaba en un agitador orbital a 150 rpm, se tomaron alfcuotas de 70 jl a partir de las camaras apical (A) y basal (B) y se anadieron a 100 jl de solucion de acetonitrilo:agua 50:50 que contema un patron interno analttico (carbamazepina 0,5 jM) en una placa de 96 pocillos.

Se midio el Lucifer Yellow con un Spectramax Gemini XS (Ex 426 nm y Em 538 nm) en una placa limpia de 96 pocillos que contema 150 jl de lfquido procedente del lado basolateral y apical.

Se midieron las concentraciones del compuesto en las muestras por medio de cromatograffa de lfquidos de alto rendimiento/espectroscopia de masas (CL-EM/EM).

Se calcularon los valores de permeabilidad aparente (Pap) a partir de la relacion:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Pap = [COmpUesto]aceptor final X Vaceptor / ([COmpUesto]donante inicial X Vdonante) / Tinc X Vdonante / area Superficial X 60 X 10-6 cm/s.

V = volumen de la camara Tinc = tiempo de incubacion Area superficial = 0,33 cm2

Se calcularon las proporciones de flujo de salida, como indicacion del flujo de salida activo desde la superficie de la celula apical, usando la proporcion de Pap B>A / Pap A>B.

Se usaron los siguientes criterios de aceptacion del ensayo:

Propanolol: valor Pap (A>B) > 20 (x10-6 cm/s)

Rodamina 123 o Vinblastina: valor de Pap (A>B) < 5 (x 10-6 cm/s) con proporcion de flujo de salida > 5. Permeabilidad de Lucifer Yellow: < 100 nm/s.

TABLA X - Tasa de salida de flujo de Caco2

T

Pap A>B (x 10-6 cm/s) Proporcion de descarga

1

7,8 + 0,8 6,1 + 0,6

Ejemplo 4.7Estudio farmacocinetico

4.7.1 Estudio farmacocinetico en roedores

Se formulan los compuestos en mezclas de PEG2000/solucion salina fisiologica o PEG400/DMSO/solucion salina fisiologica para ruta intravenosa y en metilcelulosa al 0,5 % o hidroXipropil-p-ciclodeXtrina a 10-30 % pH 3 o pH 7,4 para la via oral. Los compuestos de ensayo se dosifican por via oral en forma de alimentacion esofagica a 510 mg/kg y se dosifican por via intravenosa en forma de inyeccion intravenosa rapida con un caudal de vena de 1 mg/kg. Cada grupo consiste en 3 ratas. Se recogieron muestras de sangre bien por medio de la vena yugular usando ratas dotadas con una canula o en la cavidad retro-orbital con heparina de litio como anticoagulante en los momentos del siguiente intervalo: al 0,05 a 8 h (ruta intravenosa) y al 0,25 a 6 o 24 h (ruta oral). Se centrifugaron las muestras de sangre a 5000 rpm durante 10 min y se almacenaron las muestras de plasma resultantes a -20 °C hasta el analisis.

4.7.2. Estudio farmacocinetico en perros

Se formulan los compuestos en mezclas de PEG2000/solucion salina fisiologica para ruta intravenosa y en metilcelulosa al 0,5 % o mezclas de PEG400/hidropropil-p-ciclodeXtrina acidificada con acido cftrico hasta pH 2-3 para la via oral. Los compuestos de ensayo se dosifican por via oral en forma de alimentacion esofagica a 530 mg/kg y se dosifican por via intravenosa en forma de inyeccion intravenosa rapida o por medio de venoclisis de 10 min a traves de la vena encefalica a 1 mg/kg. Cada grupo consiste en 3 perros Beagle hembra. Se recogen muestras de sangre bien por medio de la vena yugular con heparina de litio como anti-coagulante en los momentos entre 0,083 y 24 h despues de la dosis. Se centrifugan las muestras de sangre a 5000 rpm durante 10 min y se almacenan las muestras de plasma resultantes a -20 °C hasta el analisis.

4.7.3 Cuantificacion de los niveles de compuesto en plasma

Se determinan las concentraciones de plasma de cada compuesto de ensayo por medio de un procedimiento de CLEM/EM en el que se opera el espectrometro de masas en modo de electronebulizacion positiva.

4.7.4 Determinacion de parametros farmacocineticos

Se calculan los parametros farmacocineticos usando Winnonlin® (Pharsight®, United).

Ejemplo 4.8. Estudio de toxicidad de 7 dias en ratas

Se realiza un estudio de toXicidad oral en ratas de 7 dfas con los compuestos de ensayo en ratas macho Sprague- Dawley para evaluar su potencial toXico y los parametros toXico-cineticos, a dosis diarias de 100, 300 y 500 mg/kg/dfa, por medio de alimentacion por sonda nasogastrica, a una dosis-volumen constante de 5 ml/kg/dfa.

Se formulan los compuestos de ensayo en HPpCD de 30 % (v/v) en agua pura. Cada grupo incluye 5 ratas macho principales asf como tambien 3 animales satelite para los parametros toXico-cineticos. Se proporciona HPpCD de 30 % (v/v) en agua a un cuarto grupo, con la misma frecuencia, volumen de dosificacion y por medio de la misma via de administracion, y actua como grupo de control de vehfculo.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

El objetivo del estudio es determinar la dosis mas baja que tiene como resultado la ausencia de eventos adversos (nivel de efectos adversos no observable - NOAEL).

Ejemplo 4.9 Estabilidad de hepatocitos

Se describen modelos para el aclaramiento metabolico en hepatocitos por parte de McGinnity y col. Drug Metabolism and Disposition 2008, 32, 11, 1247.

Se apreciara por parte de los expertos en la tecnica que las descripciones anteriores son a modo de ejemplo y explicativas en su naturaleza, y como se ha indicado pretenden ilustrar la invencion y sus realizaciones preferidas. A traves de la experimentacion sistematica, un experto reconocera modificaciones y variaciones evidentes. De este modo, la invencion no pretende quedar definida por la descripcion anterior, sino por las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.

REFERENCIAS

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A partir de la descripcion anterior, a los expertos en la tecnica se les ocurriran diversas modificaciones y cambios en las composiciones y procedimientos de la invencion. Se pretende que todas las modificaciones que se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas queden incluidas en el presente documento.

Debena entenderse que factores tales como la capacidad de penetracion celular diferencial de los diversos compuestos pueden contribuir a discrepancias entre la actividad de los compuestos en los ensayos celulares y bioqmmicos in vitro.

El nombre qrnmico del compuesto de la invencion como se proporciona y se explican en la presente solicitud, pueden haberse generado de manera automatica por medio del uso de un programa de software de nomenclatura qmmica disponible a nivel comercial y puede no haberse verificado de forma independiente. Los programas representativos que desempenan esta funcion incluyen la herramienta de nomenclatura Lexichem comercializada por Open Eye Software, Inc. y la herramienta Autonom Software comercializada por MDL, Inc. En el caso que el nombre qrnmico difiera de la estructura mostrada, se otorgara prioridad a la estructura representada.

Se prepararon estructuras qmmicas mostradas en el presente documento usando ya sea ChemDraw® o ISIS®/DRAW. Cualquier valencia abierta que aparezca en un atomo de carbono, oxfgeno o nitrogeno en las estructuras del presente documento indica la presencia de un atomo de hidrogeno. Cuando exista un centro quiral en la estructura, pero no se muestre ninguna estereoqmmica espedfica para dicho centro quiral, ambos enantiomeros asociados a la estructura quiral se incluyen en la estructura.

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto de acuerdo con la Formula I:

   imagen1

   o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento, prevencion o profilaxis de 5 osteoartritis, enfermedad alergica de las vfas respiratorias o enfermedades intestinales inflamatorias.
2. 2. Un compuesto segun la reivindicacion 1, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la afeccion es osteoartritis.
3. 3. Un compuesto segun la reivindicacion 1, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la afeccion es enfermedades intestinales inflamatorias.

   10 4. Un compuesto segun la reivindicacion 1, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso de

   acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el compuesto segun la reivindicacion 1, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, se administra en combinacion con un agente terapeutico adicional.
4. 5. Un compuesto segun la reivindicacion 1, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que el agente terapeutico adicional es un agente para el tratamiento, 15 prevencion o profilaxis de afecciones inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades proliferativas, rechazo de trasplantes, enfermedades que implican el deterioro de la renovacion del cartflago o malformaciones congenitas del cartflago.