KR101712561B1

KR101712561B1 - 퇴행성 및 염증성 질병의 치료에 유용한 신규 화합물

Info

Publication number: KR101712561B1
Application number: KR1020127002060A
Authority: KR
Inventors: 크리스텔 장 마리 메네트; 자비에 브랑크
Original assignee: 갈라파고스 엔.브이.
Priority date: 2009-06-26
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2017-03-06
Also published as: ME01916B; MA33447B1; ES2634325T3; CA2765988C; IL216618A0; WO2010149771A1; HRP20141057T1; SI2792677T1; HRP20171024T1; CA2765988A1; ZA201109502B; ES2519170T3; RS53617B1; JP2012530767A; CR20110673A; PT2445912E; AU2010264635A1; EA020111B1; TWI469981B; US9505754B2

Abstract

하기 화학식 I로 나타내는 화학식을 갖는 화합물 I을 개시한다:
[화학식 I]

상기 화합물을 약학 조성물로서 제조할 수 있고, 인간을 포함한 포유동물에게서 다양한 병, 예를 들어 비 제한적으로 염증성 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 전환의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형 및/또는 IL6의 과다분비와 관련된 질병의 예방 및 치료에 사용할 수 있다.

Description

퇴행성 및 염증성 질병의 치료에 유용한 신규 화합물{NOVEL COMPOUND USEFUL FOR THE TREATMENT OF DEGENERATIVE AND INFLAMMATORY DISEASES}

본 발명은 염증성 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 전환의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형 및/또는 IL6의 과다분비와 관련된 질병에 관여하는 타이로신 키나제의 패밀리인 JAK의 억제제인 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 화합물의 제조 방법, 상기 화합물을 포함하는 약학 조성물, 및 본 발명의 화합물을 투여함으로써 염증성 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 전환의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형 및/또는 IL6의 과다분비와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.

야누스 키나제(JAK)는 막 수용체로부터 STAT 전사 인자로의 사이토킨 신호전달을 도입하는 세포질 타이로신 키나제이다. 4 개의 JAK 과 구성원, JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2가 개시되어 있다. 상기 사이토킨이 그의 수용체에 결합 시, JAK 과 구성원들은 서로 자기- 및/또는 트랜스인산화한 다음, STAT의 인산화에 이어서 핵으로 이동하여 전사를 조절한다. JAK-STAT 세포 내 신호 전달은 인터페론, 대부분의 인터류킨 뿐만 아니라 다양한 사이토킨 및 내분비 인자들, 예를 들어 EPO, TPO, GH, OSM, LIF, CNTF, GM-CSF, PRL을 조작한다(Vainchenker W. et al.(2008)).

유전자 모델 및 소 분자 JAK 억제제의 조합 연구는 여러 JAK의 치료 가능성을 밝혔다. JAK3는 면역-억제 표적으로서 마우스 및 인간 유전학에 의해 확인된다(O'Shea J. et al.(2004)). JAK3 억제제는 초기에 기관 이식펀 거부에 대해서, 그러나 나중에는 또한 다른 면역-염증성 징후, 예를 들어 류머티스성 관절염(RA), 건선 및 크론병에 대해 성공적으로 임상 개발되었다(http://clinicaltrials.gov/).

TYK2는 면역-염증성 질병에 대한 잠재적인 표적이며, 인간 유전학 및 마우스 녹-아웃 연구에 의해 확인된다(Levy D. and Loomis C.(2007)).

JAK1은 면역-염증성 질병 분야에서 신규의 표적이다. JAK1은 다른 JAK와 이종이량체화하여 사이토킨-유발된 염증-전 신호전달을 도입한다. 따라서, JAK1 및/또는 다른 JAK의 억제는 일련의 염증성 질병뿐만 아니라 JAK-매개된 신호 전달에 의해 유발되는 다른 질병들에 대해 치료 이점을 갖는 것으로 예상된다.

연골의 퇴행은 다양한 질병들의 특징이며, 상기 질병 중에서도 류머티스성 관절염 및 골관절염이 가장 두드러진다. 류머티스성 관절염(RA)은 염증 및 관절 구조의 파괴를 특징으로 하는, 만성적인 관절 퇴행성 질병이다. 상기 질병이 억제되지 않으면, 관절 기능의 상실로 인해 실질적인 불구 및 통증 및 심지어 조기 사망에 이르게 된다. 따라서 RA 치료의 목적은 상기 질병을 늦추는 것이 아니라 관절 파괴를 멈추기 위해 질병을 소실시키는 것이다. 상기 질병 과정의 중증도 이외에, RA의 높은 유병률(세계적으로 성인의 약 0.8%가 앓고 있다)은 높은 사회-경제적 영향을 의미한다(RA에 대한 고찰에 대해서 하기 문헌들을 참조한다: Smolen and Steiner(2003); Lee and Weinblatt(2001); Choy and Panayi(2001); O'Dell(2004) and Firestein(2003)).

골관절염(또한 OA, 또는 마모 관절염으로도 지칭된다)은 가장 통상적인 형태의 관절염이며 관절 연골의 상실을 특징으로 하고, 종종 뼈의 비대 및 통증과 연관된다. 골관절염에 대한 광범위한 고찰에 대해서 문헌[Wieland et al., 2005]을 참조한다.

골관절염은 치료하기가 어렵다. 현재, 완치는 가능하지 않으며 치료는 통증의 완화 및 감염된 관절이 불구가 되는 것을 막는데 초점을 두고 있다. 통상적인 치료는 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID)의 사용을 포함한다. 콘드로이친 및 글루코사민과 같은 건강기능식품들이 골관절염의 치료에 안전하고 유효한 옵션으로서 주장되었지만, 최근의 임상 시험은 상기 둘 모두의 치료가 골관절염과 관련된 통증을 감소시키지 못함을 밝혔다(Clegg et al., 2006). 종합해보면, 질병 개질 골관절염 약물들을 입수할 수 없다.

동화 과정의 자극, 이화 과정의 차단, 또는 이들 둘의 조합은 연골의 안정화, 및 추정 상 심지어 상기 손상의 역전을 생성시키고, 따라서 상기 질병의 추가적인 진행을 방지할 수도 있다. 다양한 촉발제들이 연골세포의 동화과정 자극을 자극할 수 있다. 인슐린 유사 성장 인자-I(IGF-I)은 활액 중에서 우세한 동화과정 성장 인자이며 프로테오글리칸 및 콜라겐 모두의 합성을 자극한다. 또한 골 형성단백질(BMP) 패밀리의 구성원들, 현저하게는 BMP2, BMP4, BMP6 및 BMP7, 및 인간 형질전환 성장 인자-β(TGF-β) 패밀리의 구성원들이 연골세포 동화과정 자극을 유도할 수 있는 것으로 나타났다(Chubinskaya and Kuettner, 2003). 최근에 연골세포의 동화과정 자극을 유도하는 화합물이 동정되었다(US 6,500,854; EP 1 391 211). 그러나, 이들 화합물 중 대부분은 심한 부작용들을 나타내며, 결과적으로 이러한 부작용 없이 연골세포 분화를 자극하는 화합물이 대단히 필요하다.

반데그힌스테(Vandeghinste) 등(WO 2005/124342)은 억제가 OA를 포함한 여러 질병에 대해 치료학적 관련성을 가질 수도 있는 표적으로서 JAK1을 발견하였다. JAK1은 사이토킨 수용체-매개된 세포 내 신호 전달에 관련된, 세포질 타이로신 키나제의 야누스 키나제(JAK) 패밀리에 속한다. 상기 JAK 패밀리는 4 개의 구성원, 즉 JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2로 이루어진다. JAK는 사이토킨 수용체로 모이고, 상기 사이토킨에 결합 시, 상기 사이토킨 수용체와 공유된 수용체 서브유닛(공통 감마-c 쇄 gp130)의 이종 이량화가 수행된다. 이어서 JAK는 또 다른 JAK에 의해 자기- 및/또는 트랜스인산화에 의해 활성화되어, 상기 수용체들의 인산화, 및 전사의 신호 전달자 및 활성화제(STAT)의 구성원들의 모집 및 인산화를 발생시킨다. 인산화된 STAT는 이량화되고 핵에 전위되어 사이토킨-반응성 유전자의 인헨서 영역에 결합한다. 마우스에서 JAK1 유전자의 녹아웃은 JAK1이 발생 중 필수적이고 필요한 역할을 한다는 것을 입증하였다, 즉 JAK1 -/- 마우스는 출생 후 24 시간 내에 죽고 림프구 발생이 심각하게 손상되었다. 더욱이, JAK1 -/- 세포는 II 부류 사이토킨 수용체, 신호전달을 위해 감마-c 서브유닛을 사용하는 사이토킨 수용체 및 신호전달을 위해 gp130 서브유닛을 사용하는 사이노킨 수용체 과를 사용하는 사이토킨들에 반응성이 아니거나 덜 반응성이었다(Rodig et al., 1998).

다양한 그룹들이 연골세포 생물학에서 JAK-STAT 신호에 연루되었다. 리(Lie) 등(2001)은 온코스타틴 M이 JAK/STAT 및 MAPK 신호전달 경로의 활성화에 의해 1차 연골세포에서 MMP 및 TIMP3 유전자 발현을 유도함을 보였다. 오사키(Osaki) 등(2003)은 연골세포에서 콜라겐 II의 인터페론-감마 매개된 억제가 JAK-STAT 신호 전달을 수반함을 보였다. IL1-베타는 기질 성분의 발현을 감소시키고 콜라게나제 및 유도 가능한 산화 질소 신타제(NOS2)(산화 질소(NO)의 생산을 매개한다)의 발현을 유도함으로써 연골 이화작용을 유도한다. 오테로(Otero) 등(2005)은 렙틴 및 IL1-베타가 연골세포에서 NO 생산 및 NOS2 mRNA의 발현을 상승적으로 유도하고 이는 JAK 억제제에 의해 차단됨을 보였다. 레젠드레(Legendre) 등(2003)은 IL6/IL6 수용체가 소 관절 연골세포에서 연골-특이적 기질 유전자 콜라겐 II, 아그레칸 코어 및 링크 단백질의 하향조절을 유도하고, 이는 JAK/STAT 신호 전달에 의해 매개됨을 보였다. 따라서, 이러한 관찰들은 연골 항상성에서 JAK 키나제 활성에 대한 역할 및 JAK 키나제 억제제의 치료 기회를 암시한다.

JAK 과 구성원들은 골수증식성 질환을 포함한 추가적인 병들에 연루되었으며(O'Sullivan et al, 2007, Mol Immunol. 44(10):2497-506), 여기에서 JAK2의 돌연변이가 확인되었다. 이는 JAK, 특히 JAK2의 억제제가 또한 골수증식성 질환의 치료에 사용될 수도 있음을 가리킨다. 또한, JAK 과, 특히 JAK1, JAK2 및 JAK3는 암, 특히 백혈병, 예를 들어 급성 골수성 백혈병(O'Sullivan et al, 2007, Mol Immunol. 44(10):2497-506; Xiang et al., 2008, "급성 골수성 백혈병 환자에서 체세포 JAK1 돌연변이의 확인" Blood First Edition Paper, prepublished online December 26, 2007; DIO 10.1182/blood-2007-05-090308) 및 급성 림프모구성 백혈병(Mullighan et al, 2009) 또는 고형 종양, 예를 들어 자궁 평활근육종(Constantinescu et al., 2007, Trends in Biochemical Sciences 33(3):122-131), 전립선 암(Tam et al., 2007, British Journal of Cancer, 97, 378-383)과 관련지어져 왔다. 이러한 결과들은 JAK, 특히 JAK1 및/또는 JAK2의 억제제가 또한 암(백혈병 및 고형 종양, 예를 들어 자궁 평활근육종, 전립선암)의 치료에 유용성을 가질 수도 있음을 가리킨다.

또한, 캐슬만씨 병, 다발성 골수종, 사구체간질 증식성 사구체신염, 건선 및 카포시 육종은 사이토킨 IL-6의 과다분비로 인한 듯하며, 그의 생물학적 효과는 세포 내 JAK-STAT 신호에 의해 매개된다(Tetsuji Naka, Norihiro Nishimoto and Tadamitsu Kishimoto, Arthritis Res 2002, 4(suppl 3):S233-S242). 상기 결과는 JKA의 억제제가 또한 상기 질병의 치료에서도 유용성을 발견할 수 있음을 나타낸다.

자가면역 질병과의 연계성이 JAK3 및 Tyk2에 대해서 확립되었다. JAK3뿐만 아니라 상향 신호전달 성분 감마-c 수용체 쇄 및 IL7 수용체의 돌연변이는 합해서 인간 중증복합면역결핍증 사례의 약 70%에 달하는 것으로 생각된다('Oshea et al., 2004). JAK1은 감마-c 수용체 쇄로부터의 신호 전달에서 JAK3와 협력함에 주목한다. Tyk2 다형성이 전신 홍반성 루프스(SLE)에서 나타난다(O'Sullivan et al., 2007, Mol Immunol. 44(10):2497-506). 따라서, 상기 JAK 과의 표적화는 면역-염증 분야에 치료 기회를 제공할 수도 있다.

현행 요법들은 만족스럽지 않으며 따라서 염증성 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 전환의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형 및/또는 IL6의 과다분비와 관련된 질병의 치료에 유용할 수 있는 추가의 화합물들을 동정할 필요가 여전히 존재한다.

따라서 본 발명은 화합물, 그의 제조 방법 및 본 발명의 화합물을 적합한 약학 담체와 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특히, 상기 화합물은 385 키나제 및 비-키나제 표적 이외에 다른 JAK 과 구성원들에 비해 JAK1에 대해 높은 효능 및 선택성을 나타낸다. 또한, 데이터는 상기 화합물이 양호한 안전성 여유를 가짐을 가리킨다. 따라서 본 발명은 JAK1 매개된 질병, 특히 염증성 질병, 예를 들어 SLE(전신 홍반성 루푸스) 및 RA의 치료에 대해 새로운 기회를 제공한다는 결론을 내린다.

본 발명은 또한 상기 질병 및 병의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명 화합물의 용도를 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 JAK, 특히 JAK1의 억제제가 염증성 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 전환의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형 및/또는 IL6의 과다분비와 관련된 질병의 치료에 유용하다는 발견에 근거한다. 본 발명은 또한 상기 화합물의 제조 방법, 상기 화합물을 포함하는 약학 조성물, 및 본 발명의 화합물을 투여함으로써 염증성 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 전환의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형 및/또는 IL6의 과다분비와 관련된 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 태양에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 제공한다:

[화학식 I]

본 발명의 화합물은 양호한 안전성 여유를 나타낼 뿐만 아니라 다른 JAK 과 구성원 및 385 키나제 및 비-키나제 표적에 비해 JAK1에 대해 높은 효능 및 선택성을 나타내는 JAK의 신규의 억제제이다. 이러한 프로파일을 갖는 화합물의 사용은 더 낮은 표적 외 효과의 발생으로 인해 염증성 질병, 특히 SLE 및 RA의 치료에 유리할 수 있다.

추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 및 약학적 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 더욱이, 본 발명에 개시된 약학 조성물 및 치료 방법에 유용한, 본 발명의 화합물은 제조 및 사용 시 약학적으로 허용 가능하다. 본 발명의 상기 태양에서, 상기 약학 조성물은 본 발명의 화합물과 함께 사용하기에 적합한 추가의 유효 성분을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 나열된 병들 중 하나, 및 특히 이상 JAK 활성과 관련될 수도 있는 바와 같은 병, 예를 들어 염증성 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 전환의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형 및 IL6의 과다분비와 관련된 질병에 걸리기 쉽거나 또는 이에 걸린 포유동물의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료 유효량의 본 발명의 화합물, 또는본 발명에 개시된 바와 같은 약학 조성물들 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 구체적인 실시태양에서 본 발명은 이상 JAK1 활성과 관련될 수도 있는 병, 특히 염증성 병, 증식성 질병 및 연골 전환의 장애를 수반하는 질병에 걸리기 쉽거나 또는 이에 걸린 포유동물의 치료 방법을 제공한다.

추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 나열된 것들 중에서 선택된 병, 특히 이상 JAK 활성과 관련될 수도 있는 바와 같은 병, 예를 들어 염증성 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 전환의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형 및 IL6의 과다분비와 관련된 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 구체적인 실시태양에서 본 발명은 이상 JAK1 활성과 관련될 수도 있는 병, 특히 염증성 병, 증식성 질병 및 연골 전환의 장애를 수반하는 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다.

더욱 또 다른 치료 방법 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 이상 JAK 활성과 인과 관계로 관련된 병에 걸리기 쉽거나 또는 이에 걸린 포유동물의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효한 병-치료 또는 병-예방 량의 본 발명에 개시된 본 발명의 약학 조성물 또는 화합물을 투여함을 포함한다. 구체적인 태양에서 상기 이상 JAK 활성은 이상 JAK1 활성이다.

추가의 태양에서, 본 발명은 이상 JAK 활성과 인과 관계로 관련된 병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 구체적인 태양에서 상기 이상 JAK 활성은 이상 JAK1 활성이다.

추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명에서 나중에 개시되는 전형적인 합성 프로토콜 및 경로에 의해 본 발명의 화합물을 합성하는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명의 주목적은 JAK의 활성을 개질시키고 따라서 이에 대해 인과 관계로 관련될 수도 있는 임의의 질병, 특히 JAK1의 활성과 인과 관계로 관련될 수도 있는 임의의 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 JAK의 활성과 인과 관계로 관련될 수도 있는 염증성 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 전환의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형 및 IL6의 과다분비와 관련된 질병과 같은 질병, 특히 JAK1의 활성과 인과 관계로 관련될 수도 있는 질병 또는 이의 증상을 치료 또는 완화할 수 있는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 더욱 추가의 목적은 JAK 활성과 관련된 질병을 포함한 다양한 질병 상태, 예를 들어 염증성 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 전환의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형 및 IL6의 과다분비와 관련된 질병, 특히 JAK1 활성과 관련된 병의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

다른 목적들 및 이점들은 계속되는 상세한 설명의 고려로부터 당해 분야의 숙련가들에게 자명해질 것이다.

본 발명은 JAK 억제제인 화합물을 투여함으로써 염증성 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 전환의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형 및/또는 IL6의 과다분비와 관련된 질병의 치료 또는 치료하는 방법을 제공하는데 유용한 효과가 있다.

정의

하기의 용어들은 하기에 함께 제공된 의미들을 가짐을 의미하며 본 발명의 설명 및 의도하는 범위를 이해하는데 유용하다.

화합물, 상기와 같은 화합물을 함유하는 약학 조성물 및 상기와 같은 화합물 및 조성물을 사용하는 방법을 포함할 수 있는 본 발명을 개시할 때, 하기의 용어들(존재하는 경우)은 달리 나타내지 않는 한 하기의 의미들을 갖는다. 하기에 정의된 부분들 중 임의의 것은 본 발명에 개시될 때 다양한 치환체들로 치환될 수 있으며, 각각의 정의는 하기에 나타낸 바와 같은 그의 범위 내에 상기와 같은 치환된 부분들을 포함하고자 함은 또한 물론이다. 달리 나타내지 않는 한, "치환된"이란 용어는 하기에 나타낸 바와 같이 정의되어야 한다. 또한 "그룹" 및 "라디칼"이란 용어는 본 발명에 사용 시 호환적으로 간주할 수 있음은 물론이다.

"하나의"란 관사는 본 발명에서 상기 관사의 문법적 목적어 중 하나 또는 하나보다 많음(즉 하나 이상)을 지칭하는데 사용될 수 있다. 예로서 "하나의 동족체"는 하나 또는 하나보다 많은 동족체를 의미한다.

'약학적으로 허용가능한'은 연방 또는 주 정부의 규제 기관 또는 미국 이외 국가의 해당 기관에 의해 승인되거나 승인될 수 있음, 또는 동물, 및 보다 특히 인간용으로 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 나열됨을 의미한다.

'약학적으로 허용 가능한 염'은 약학적으로 허용 가능하고 모 화합물의 목적하는 약물 활성을 갖는 본 발명 화합물의 염을 지칭한다. 특히, 상기와 같은 염은 무독성이며 무기 또는 유기 산 부가염 및 염기 부가염일 수 있다. 구체적으로, 상기와 같은 염은 (1) 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화 수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나, 또는 유기산, 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 사이클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄-다이설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄포설폰산, 4-메틸바이사이클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트라이메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산 등으로 형성된 산 부가염; 또는 (2) 모 화합물 중에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알칼리 토 이온, 또는 알루미늄 이온에 의해 치환되거나, 또는 유기 염기, 예를 들어 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트라이에탄올아민, N-메틸글루카민 등과 배위하는 경우 형성되는 염을 포함한다. 염은 단지 예로서 나트륨 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 등; 및 상기 화합물이 염기성 작용기를 함유하는 경우, 무독성 유기 또는 무기산의 염, 예를 들어 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 타르트레이트, 메실레이트, 아세테이트, 말리에이트, 옥살레이트 등을 추가로 포함한다. "약학적으로 허용 가능한 양이온"이란 용어는 산성 작용기의 허용 가능한 양이온성 대이온을 지칭한다. 상기와 같은 양이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 양이온 등으로 예시된다.

'약학적으로 허용 가능한 비히클'은 본 발명의 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 담체를 지칭한다.

'전구약물'은 절단 가능한 그룹을 가지며 가용매 분해에 의해 또는 생리학적 조건 하에서 생체 내에서 약학적으로 활성인 본 발명의 화합물로 되는, 본 발명 화합물의 유도체를 포함한 화합물을 지칭한다. 상기와 같은 예로는 비 제한적으로 콜린 에스터 유도체 등, N-알킬모폴린 에스터 등이 있다.

'용매화물'은 대개 가용매 분해 반응에 의해, 용매와 회합되는 화합물의 형태를 지칭한다. 상기 물리적인 회합은 수소 결합을 포함한다. 통상적인 용매로는 물, 에탄올, 아세트산 등을 포함한다. 본 발명의 화합물을 예를 들어 결정성 형태로 제조할 수 있으며 용매화 또는 수화시킬 수 있다. 적합한 용매화물은 약학적으로 허용 가능함 용매화물, 예를 들어 수화물을 포함하며, 화학량론적 용매화물 및 비-화학량론적 용매화물 모두를 추가로 포함한다. 몇몇 경우에 상기 용매화물은, 예를 들어 하나 이상의 용매 분자가 결정성 고체의 결정 격자 중에 결합된 경우 단리가 가능할 것이다. '용매화물'은 용액상 및 단리 가능한 용매화물 모두를 포함한다. 전형적인 용매화물은 수화물, 에탄올레이트 및 메탄올레이트를 포함한다.

'피실험자'는 인간을 포함한다. '인간', '환자' 및 '피실험자'란 용어는 본 발명에서 호환적으로 사용된다.

'치료 유효량'은 질병의 치료를 위해 환자에게 투여 시 상기 질병에 대해 상기와 같은 치료를 수행하기에 충분한 본 발명 화합물의 양을 의미한다. "치료 유효량"은 상기 화합물, 질병 및 그의 중증도, 및 치료하려는 환자의 연령, 체중 등에 따라 변할 수 있다.

'예방하다' 또는 '예방'은 질병 또는 질환이 초래되거나 발병할 위험의 감소(즉 질병 유발제에 노출되거나 질병의 발병에 앞서 상기 질병에 걸리기 쉬울 수 있는 환자에게서 상기 질병의 임상적 증상들 중 하나 이상이 발생하지 않게 함)를 지칭한다.

'예방학'이란 용어는 '예방'과 관련이 있으며, 질병을 치료 또는 치유하는 것이기 보다는, 예방을 목적으로 하는 수단 또는 시술을 지칭한다. 예방학적 수단의 비 제한적인 예로 백신의 투여; 예를 들어 고정화로 인한 혈전증의 위험이 있는 환자에게 저 분자량 헤파린의 투여; 및 말라리아가 유행하는 지역 또는 말라리아 접촉 위험이 높은 지역을 방문하기에 앞서, 항말라리아제, 예를 들어 클로로퀸의 투여가 있을 수 있다.

임의의 질병 또는 질환을 '치료하는' 또는 '치료'는 하나의 실시태양에서 상기 질병 또는 질환의 개선(즉 상기 질병을 억제하거나 그의 임상적 증상들 중 하나 이상의 표시, 정도 또는 중증도를 감소시킴)을 지칭한다. 또 다른 실시태양에서 '치료하는' 또는 '치료'는 환자가 분간할 수 없을 수도 있는 하나 이상의 신체 매개변수의 개선을 지칭한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, '치료하는' 또는 '치료'는 상기 질병 또는 질환을 신체적으로(예를 들어 분간할 수 있는 증상의 안정화), 생리학적으로(예를 들어 신체 매개변수의 안정화), 또는 이둘 모두로 조절함을 지칭한다. 추가의 실시태양에서, "치료하는" 또는 "치료"는 상기 질병의 진행을 늦추는 것에 관한 것이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, '염증을 수반하는 병(들)'이란 용어는 류머티스성 관절염, 골관절염, 소아특발성 관절염, 건선, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식, 비염), 염증성 장 질병(예를 들어 크론병, 대장염), 내독소-유발된 질병 상태(예를 들어 우회술 후 합병증 또는 예를 들어 만성 심부전의 원인이 되는 만성 내독소 상태), 및 연골, 예를 들어 관절의 연골을 포함하는 관련된 질병을 포함한 병의 그룹을 지칭한다. 특히 상기 용어는 류머티스성 관절염, 골관절염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식) 및 염증성 장 질병을 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같이 '면역 반응을 수반하는 병(들)' 또는 '자가면역 병'이란 용어는 호환적으로 사용되며 폐쇄성 기도 질병을 포함하는 질병의 그룹, 예를 들어 COPD, 천식(예를 들어 내인성 천식, 외인성 천식, 먼지 천식, 유아 천식), 특히 만성 또는 고질 친식(예를 들어 말기 천식 및 기도 고반응성), 기관지염, 예를 들어 기관지 천식, 전신 홍반성 루프스(SLE), 다발성 경화증, I형 당뇨병 및 이와 관련된 합병증, 아토피성 습진(아토피성 피부염), 접촉 피부염 및 추가적인 습진 피부염, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염), 동맥경화증 및 근위축성 측삭 경화증과 같은 병을 지칭한다. 특히 상기 용어는 COPD, 천식, 전신 홍반성 루프스, I형 당뇨병 및 염증성 장 질병을 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같이 '증식성 질병(들)'이란 용어는 암(예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선 암), 골수증식성 질환, 특히 Re JAK2 활성화 돌연변이라 명명되는 질환(적혈구 증가증, 본태성 혈소판증가증, 및 골수섬유증을 갖는 골수 화생), 백혈병(예를 들어 급성 골수성 백혈병 및 급성 림프모구성 백혈병), 다발성 골수종, 건선, 재협착증, 경화성피부염 또는 섬유증과 같은 병을 지칭한다. 특히 상기 용어는 암, 백혈병, 다발성 골수종 및 건선을 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같이 '암'이란 용어는 피부 또는 신체 기관, 예를 들어 비 제한적으로 유방, 전립선, 폐, 신장, 췌장, 위 또는 장 세포의 악성 또는 양성 성장을 지칭한다. 암은 인접한 조직 내로 침투하고 원위 기관, 예를 들어 뼈, 간, 폐 또는 뇌로 확산(전이)하는 성향이 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이 암이란 용어는 전이성 루머 세포 유형, 예를 들어 비 제한적으로 흑색종, 림프종, 백혈병, 섬유육종, 횡문근육종, 및 비만세포종과, 조직 암종의 유형, 예를 들어 비 제한적으로 결장직장암, 전립선암, 소 세포 폐암 및 비 소 세포 폐암, 유방암, 췌장암, 방광암, 신장암, 위암, 교모세포종, 원발성 간암, 난소암, 전립선암 및 자궁 평활근육종을 모두 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같이 '백혈병'이란 용어는 혈액 및 혈액 형성 기관의 신생물형성 질병을 지칭한다. 상기와 같은 질병은 골수 및 면역 체계 기능장애를 유발할 수 있으며, 이는 숙주를 감염 및 출혈에 민감하게 한다. 특히 백혈병이란 용어는 급성 골수성 백혈병(AML) 및 급성 림프모구성 백혈병(ALL)을 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같이 '이식 거부'란 용어는 세포, 조직 또는 고형 기관, 예를 들어 이자섬, 줄기 세포, 골수, 피부, 근육, 각막 조직, 신경 조직, 심장, 폐, 결합된 심장-폐, 신장, 간, 장, 췌장, 기관 또는 식도의 동종- 또는 이종이식편의 급성 또는 만성 거부, 또는 이식편 대 숙주병을 지칭한다.

본 발명에 사용된 바와 같이 '연골 전환의 장애를 수반하는 질병'이란 용어는 골관절염, 건선성 관절염, 청소년 류머티스성 관절염, 통풍성 관절염, 패혈성 또는 감염성 관절염, 반응성 관절염, 복합 부위 통증 증후군, 반사성 교감신경 위축증, 티지 증후군 또는 늑연골염, 섬유근육통, 골연골염, 신경성 또는 신경병성 관절염, 관절증, 변형성 골관절염 풍토병과 같은 풍토성 형태의 관절염, 므셀리니병 및 한디고두병; 섬유근육통, 전신 홍반성 루프스, 경화증 및 강직성 척추염으로부터 발생하는 퇴행과 같은 병을 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같이 '선천성 연골 기형(들)'이란 용어는 유전성 연골분해, 연골 형성 이상증 및 의사 연골 형성 이상증과 같은 병, 특히 비 제한적으로 소이증, 무이증, 골간단 연골 형성 이상증, 및 관련된 질환들을 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같이 'IL6의 과다분비와 관련된 질병(들)'이란 용어는 캐슬만씨 병, 다발성 골수종, 건선, 카포시 육종 및/또는 사구체간질 증식성 사구체신염과 같은 병을 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같이 'JAK'란 용어는 막 수용체로부터 STAT 전사 인자로의 사이토킨 신호전달을 도입하는 세포질 타이로신 키나제인 야누스 키나제(JAK) 과에 관한 것이다. 4 개의 JAK 과 구성원, JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2가 개시되어 있으며 상기 JAK란 용어는 모든 JAK 과 구성원들을 집합적으로 또는 내용상 가리키는 바와 같은 상기 JAK 과 구성원들 중 하나 이상을 지칭할 수도 있다.

'본 발명의 화합물(들)' 및 동등한 표현은 본 발명에서 앞서 개시된 바와 같은 화학식(들)의 화합물을 포함함을 의미하며, 그 표현은 전구약물, 약학적으로 허용 가능한 염, 및 용매화물, 예를 들어 수화물, 및 상기 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물(내용상 그렇게 허용하는 경우)을 포함한다. 유사하게, 중간체에 대한 언급은, 그 자체가 청구되었는지의 여부와 관계없이, 그의 염 및 용매화물(내용상 그렇게 허용하는 경우)을 포함함을 의미한다.

범위를 본 발명에서 언급하는 경우, 예를 들어 비 제한적으로 C₁-C₈ 알킬을 언급하는 경우, 상기 범위의 인용은 상기 범위의 각 구성원의 표시를 고려해야 한다.

본 발명 화합물의 다른 유도체들은 그들의 산 및 산 유도체 형태 모두에서 활성을 가질 수 있으나, 산 민감성 형태에서는 종종 용해도의 이점, 조직 적합성, 또는 포유동물 유기체에서 지연된 방출을 제공한다(문헌[Bundgard, H., Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985]을 참조하시오). 전구약물은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 산 유도체, 예를 들어 모 산과 적합한 알콜과의 반응에 의해 제조된 에스터, 또는 모 산 화합물과 치환되거나 치환되지 않은 아민과의 반응에 의해 제조된 아미드, 또는 산 무수물, 또는 혼합된 무수물을 포함한다. 본 발명의 화합물에 펜던트인 산 그룹으로부터 유도된 간단한 지방족 또는 방향족 에스터, 아미드 및 무수물이 특히 유용한 전구약물이다. 일부의 경우, 이중 에스터 유형 전구약물, 예를 들어 (아실옥시)알킬 에스터 또는 ((알콕시카보닐)옥시)알킬에스터를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정의 상기와 같은 전구약물은 본 발명 화합물의 C₁ 내지 C₈ 알킬, C₂-C₈ 알케닐, 아릴, C₇-C₁₂ 치환된 아릴, 및 C₇-C₁₂ 아릴알킬 에스터이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, '동위원소 변체'란 용어는 화합물을 구성하는 원자들 중 하나 이상에 부자연한 비율의 동위원소를 함유하는 상기와 같은 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 화합물의 '동위원소 변체'는 하나 이상의 비-방사성 동위원소, 예를 들어 중수소(²H 또는 D), 탄소-13(¹³C), 질소-15(¹⁵N) 등을 함유할 수 있다. 상기와 같은 동위원소 치환이 이루어진 화합물에서, 하기의 원자들(존재하는 경우)은, 예를 들어 임의의 수소가 ²H/D이거나, 임의의 탄소가 ¹³C이거나, 또는 임의의 질소가 ¹⁵N일 수 있고 상기와 같은 원자의 존재 및 치환이 당해 분야의 기술 내에서 측정될 수 있도록 다양할 수 있음을 이해할 것이다. 마찬가지로, 본 발명은 방사성 동위원소를 갖는 동위원소 변체의 제조를, 예를 들어 생성 화합물이 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구에 사용될 수 있는 경우, 포함할 수 있다. 상기 방사성 동위원소 삼중수소, 즉 ³H 및 탄소-14, 즉 ¹⁴C는 그들의 결합 용이성 및 용이한 검출 수단에 비추어 상기 목적에 특히 유용하다. 더욱이, 양전자 방출 동위원소, 예를 들어 ¹¹C, ¹⁸F, ¹⁵O 및 ¹³N으로 치환되고 기질 수용체 점유를 검사하기 위한 양전자 단층촬영(PET) 연구에 유용한 화합물들을 제조할 수 있다.

본 발명에 제공된 본 발명 화합물의 모든 동위원소 변체들을, 방사성이든 아니든, 본 발명의 범위 내에 포함하고자 한다.

서로 거울상이 아닌 입체이성체를 '부분입체이성체'라 칭하며, 서로 겹쳐질 수 없는 거울상인 것들은 '거울상 이성체'라 칭한다. 화합물이 비대칭 중심을 갖는 경우, 예를 들어 4 개의 상이한 그룹들에 결합하는 경우, 한 쌍의 거울상 이성체가 가능하다. 거울상 이성체는 그의 비대칭 중심의 절대 형태를 특징으로 할 수 있으며 칸과 프레로그의 R- 및 S-서열화 규칙에 의해서, 또는 상기 분자가 편광된 빛의 면을 회전하는 방식에 의해 우선성 또는 좌선성(즉 각각 (+) 또는 (-)-이성체)으로 표시하여 개시된다. 키랄 화합물이 개별적인 거울상 이성체로서 또는 그의 혼합물로서 존재할 수 있다. 같은 비율의 거울상 이성체들을 함유하는 혼합물을 '라세미 혼합물'이라 칭한다.

'토오토머'는 모 화합물 구조의 호환 가능한 형태이고 수소 원자 및 전자의 치환이 다양한 화합물을 지칭한다. 따라서, 2 개의 구조가 π 전자 및 원자(대개 H)를 통해 평형일 수 있다. 예를 들어, 에놀 및 케톤은 산이나 염기에 의한 처리에 의해 신속히 상호전환되므로 토오토머이다. 토오토머화의 또 다른 예는 페닐나이트로메탄의 액시- 및 나이트로-형태이며, 이는 마찬가지로 산 또는 염기에 의한 처리에 의해 형성된다.

토오토머 형태는 관심 화합물의 최적의 화학적 안정성 및 생물학적 안정성의 획득과 관련이 있을 수 있다.

본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 가질 수 있으며; 따라서 상기와 같은 화합물을 개별적인 (R)- 또는 (S)-입체이성체로서 또는 이들의 혼합물로서 생성시킬 수 있다.

달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구의 범위의 특정 화합물에 대한 설명 및 명명은 라세미 또는 달리 그의 개별적인 거울상 이성체 및 혼합물을 모두 포함함을 의미한다. 입체화학의 측정 및 입체이성체의 분리 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

화합물

본 발명은 JAK의 억제제가 염증성 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 전환의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형 및 IL6의 과다분비와 관련된 질병의 치료에 유용하다는 발견에 근거한다. 본 발명은 또한 상기 화합물의 제조 방법, 상기 화합물을 포함하는 약학 조성물, 및 본 발명의 화합물을 투여함으로써 연골 퇴화, 골 및/또는 관절 퇴화 및/또는 염증을 수반하는 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 화합물은 JAK 과의 구성원들의 억제제이며; 구체적으로 상기 화합물은 JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2의 활성을 억제한다. 특히 상기 화합물은 JAK1의 활성을 억제한다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 태양에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 개시한다:

[화학식 I]

본 발명의 화합물은 사이클로프로판카복실산 {5-[4-(3,3-다이메틸-아제티딘-1-카보닐)-페닐]-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-2-일}-아미드이다.

하나의 태양에서 본 발명의 화합물은 동위원소 변체가 아니다.

하나의 태양에서 본 발명의 화합물은 유리 염기로서 존재한다.

하나의 태양에서 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염이다.

하나의 태양에서 본 발명의 화합물은 상기 화합물의 용매화물이다.

하나의 태양에서 본 발명의 화합물은 상기 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물이다.

몇몇 태양에서, 본 발명은 상기 화학식들에 따른 본 발명 화합물의 전구 약물 및 유도체를 제공한다. 전구 약물은 대사적으로 절단 가능한 그룹을 가지며 가용매 분해에 의해 또는 생리학적 조건 하에서 생체 내에서 약학적으로 활성인 본 발명의 화합물로 되는, 본 발명 화합물의 유도체이다. 상기와 같은 예로는 비 제한적으로 콜린 에스터 유도체 등, N-알킬모폴린 에스터 등이 있다.

본 발명 화합물의 다른 유도체들은 그들의 산 및 산 유도체 형태 모두에서 활성을 가지나, 산 민감성 형태는 종종 포유동물 유기체에서 용해도 이점, 조직 적합성 또는 지연된 방출을 제공한다(문헌[Bundgard, H., Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985] 참조). 전구 약물은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 산 유도체, 예를 들어 모 산과 적합한 알콜과의 반응에 의해 제조된 에스터, 또는 모 산 화합물과 치환되거나 치환되지 않은 아민과의 반응에 의해 제조된 아미드, 또는 산 무수물, 또는 혼합된 무수물을 포함한다. 본 발명의 화합물에 펜던트인 산 그룹으로부터 유도된 간단한 지방족 또는 방향족 에스터, 아미드 및 무수물이 특히 바람직한 전구 약물이다. 일부의 경우, 이중 에스터 유형 전구 약물, 예를 들어 (아실옥시)알킬 에스터 또는 ((알콕시카보닐)옥시)알킬에스터를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명 화합물의 C₁ 내지 C₈ 알킬, C₂-C₈ 알케닐, 아릴, C₇-C₁₂ 치환된 아릴, 및 C₇-C₁₂ 아릴알킬 에스터가 특히 유용하다.

약학 조성물

본 발명의 화합물은 약제로서 사용될 때, 전형적으로는 약학 조성물의 형태로 투여된다. 상기와 같은 조성물을 제약 분야에 널리 공지된 방식으로 제조할 수 있으며, 상기 조성물은 하나 이상의 활성 화합물을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 화합물을 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 실제로 투여되는 상기 화합물의 양을 전형적으로는 관련 환경, 예를 들어 치료하려는 병, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물, 개인 환자의 연령, 체중 및 반응, 상기 환자 증상의 중증도 등에 비추어 의사가 결정할 것이다.

본 발명의 약학 조성물을 다양한 경로, 예를 들어 경구, 직장, 피 내, 피 하, 관절 내, 정맥 내, 근육 내 및 비 내로 투여할 수 있다. 의도하는 전달 경로에 따라, 본 발명의 화합물을 바람직하게는 주사가능한 또는 경구 조성물로서 또는 연고로서, 로션으로서, 또는 경피 투여용 패치로서 제형화할 수 있다.

경구 투여용 조성물은 벌크 액체 용액 또는 현탁액, 또는 벌크 분말의 형태를 취할 수 있다. 그러나 보다 통상적으로 상기 조성물은 정확한 투약을 용이하게 하기 위해 단위 투여형으로 제공된다. "단위 투여형"이란 용어는 인간 환자 및 다른 포유동물에게 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위들을 지칭하며, 각 단위는 적합한 약학 부형제와 함께, 목적하는 치료 효과를 생성시키도록 계산된 소정 량의 활성 물질을 함유한다. 전형적인 단위 투여형은 액체 조성물의 이미 충전된, 미리 측정된 앰풀 또는 주사기, 또는 고체 조성물의 경우에 환제, 정제, 캡슐 등을 포함한다. 상기와 같은 조성물에서, 퓨란설폰산 화합물은 대개 소량 성분(약 0.1 내지 약 50 중량% 또는 바람직하게는 약 1 내지 약 40 중량%)이며 나머지는 목적하는 투여형을 형성시키는데 도움이 되는 다양한 비히클 또는 담체 및 가공 보조제들이다.

경구 투여에 적합한 액체 형태는 완충제, 현탁 및 분배제, 착색제, 풍미제 등과 함께 적합한 수성 또는 비 수성 비히클을 포함할 수 있다. 고체 형태는 예를 들어 하기의 성분들, 또는 유사한 성질의 화합물들 중 어느 하나를 포함할 수 있다: 결합제, 예를 들어 미정질 셀룰로스, 트라가칸트 또는 젤라틴 검; 부형제, 예를 들어 전분 또는 락토오스, 붕해제, 예를 들어 알긴산, 프리모젤, 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트; 윤활제, 예를 들어 콜로이드성 이산화 규소; 감미제, 예를 들어 슈크로스 또는 사카린; 또는 풍미제, 예를 들어 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 풍미제.

주사 가능한 조성물은 전형적으로는 주사 가능한 멸균 염수 또는 포스페이트-완충 염수 또는 당해 분야에 공지된 다른 주사 가능한 담체를 기본으로 한다. 이전과 같이, 상기와 같은 조성물 중의 활성 화합물은 전형적으로는 소량 성분이며, 종종 약 0.05 내지 10 중량%이고 나머지는 상기 주사 가능한 담체 등이다.

경피 조성물은 전형적으로는 활성 성분(들)을, 일반적으로 약 0.01 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10 중량%, 및 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 약 15 중량% 범위의 양으로 함유하는 국소 연고 또는 크림으로서 제형화된다. 연고로서 제형화 시, 상기 활성 성분들을 전형적으로는 파라핀 또는 수-혼화성 연고 베이스와 배합할 것이다. 한편으로, 상기 활성 성분을 예를 들어 수중 유적형 크림 베이스와 함께 크림으로 제형화할 수 있다. 상기와 같은 경피 제형은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 일반적으로 상기 활성 성분 또는 제형의 피부 침투 안정성을 향상시키기 위한 추가의 성분들을 포함한다. 모든 상기와 같은 공지된 경피 제형 및 성분은 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명의 화합물을 또한 경피 장치에 의해 투여할 수 있다. 따라서, 경피 투여를 저장소나 다공성 멤브레인 유형, 또는 고체 기질 종류의 패치를 사용하여 수행할 수 있다.

경구 투여가능하거나, 주사 가능하거나 또는 국소 투여 가능한 조성물에 대해 상술한 성분들은 단지 전형적인 것이다. 다른 물질들뿐만 아니라 가공 기법 등이 문헌[Part 8 of Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania](본 발명에 참고로 인용된다)에 나열되어 있다.

본 발명의 화합물을 또한 서방성 형태로 또는 서방성 약물 전달 시스템으로부터 투여할 수 있다. 전형적인 서방성 물질에 대한 설명을 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]에서 찾을 수 있다.

하기의 제형예들은 본 발명에 따라 제조될 수 있는 전형적인 약학 조성물을 예시한다. 그러나, 본 발명은 하기의 약학 조성물들로 제한되지 않는다.

제형 1 - 정제

본 발명의 화합물을 무수 젤라틴 결합제와 적합한 1:2 중량비로 건조 분말로서 혼합할 수 있다. 소량의 마그네슘 스테아레이트를 윤활제로서 첨가한다. 상기 혼합물은 정제 프레스에서 240 내지 270 ㎎ 정제(정제당 80 내지 90 ㎎의 활성 아미드 화합물)로 형성된다.

제형 2 - 캡슐

본 발명의 화합물을 전분 희석제와 적합한 1:1 중량비로 건조 분말로서 혼합할 수 있다. 상기 혼합물을 250 ㎎ 캡슐(캡슐당 125 ㎎의 활성 아미드 화합물)에 충전한다.

제형 3 - 액체

본 발명의 화합물(125 ㎎)을 슈크로스(1.75 g) 및 잔탄 검(4 ㎎)과 함께 혼합하고 생성 혼합물을 블렌딩하고, 10 번 메쉬 U.S. 체에 통과시키고, 이어서 앞서 제조된 수중 미정질 셀룰로스 및 나트륨 카복시메틸 셀룰로스의 용액(11:89, 50 ㎎)과 혼합한다. 나트륨 벤조에이트(10 ㎎), 풍미제 및 착색제를 물로 희석하고 교반하면서 첨가한다. 이어서 충분한 물을 가하여 5 ㎖의 전체 부피를 생성시킬 수 있다.

제형 4 - 정제

본 발명의 화합물을 무수 젤라틴 결합제와 적합한 1:2 중량비로 건조 분말로서 혼합할 수 있다. 소량의 마그네슘 스테아레이트를 윤활제로서 첨가한다. 상기 혼합물은 정제 프레스에서 450 내지 900 ㎎ 정제(150 내지 300 ㎎의 활성 아미드 화합물)로 형성된다.

제형 5 - 주사

본 발명의 화합물을 완충된 멸균 염수 주사 가능한 수성 매질에 대략 5 ㎎/㎖의 농도로 용해하거나 현탁할 수 있다.

제형 6 - 국소

스테아릴 알콜(250 g) 및 백색 바셀린(250 g)을 약 75 ℃에서 용융시키고 이어서 물(약 370 g)에 용해된 본 발명의 화합물(50 g) 메틸파라벤(0.25 g), 프로필파라벤(0.15 g), 나트륨 라우릴 설페이트(10 g), 및 프로필렌 글리콜(120 g)의 혼합물을 가할 수 있으며 생성 혼합물을 응고시까지 교반할 수 있다.

치료 방법

본 발명의 화합물을 JAK의 이상 활성과 인과 관계로 관련되거나 이에 기인할 수 있는 포유동물의 병, 특히 JAK1의 이상 활성과 관련된 병의 치료를 위한 치료제로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물 및 본 발명의 약학 조성물은 인간을 포함한 포유동물에게서 염증성 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 전환의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형 및 IL6의 과다분비와 관련된 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 치료제로서 사용된다.

추가의 치료 방법 태양에서, 본 발명은 염증성 질병에 걸리기 쉽거나 또는 이에 걸린 포유동물의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효한 병-치료 또는 병-예방 량의 본 발명에 개시된 약학 조성물 또는 화합물들 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 구체적인 실시태양에서, 상기 염증성 질병은 류마티스성 관절염, 골관절염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식) 및 염증성 장 질병 중에서 선택된다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 염증성 질병의 치료, 방지 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 구체적인 태양에서, 상기 염증성 질병은 류마티스성 관절염, 골관절염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식) 및 염증성 장 질병 중에서 선택된다.

추가의 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 자가면역 질병에 걸리기 쉽거나 또는 이에 걸린 포유동물의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효한 병-치료 또는 병-예방 량의 본 발명에 개시된 약학 조성물 또는 화합물들 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 구체적인 실시태양에서, 상기 자가면역 질병은 COPD, 천식, 전신 홍반성 루푸스, I형 당뇨병 및 염증성 장 질병 중에서 선택된다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 자가면역 질병의 치료, 방지 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 구체적인 태양에서, 상기 자가면역 질병은 COPD, 천식, 전신 홍반성 루푸스, I형 당뇨병 및 염증성 장 질병 중에서 선택된다.

추가의 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 증식성 질병, 특히 암(예를 들어 고형 종양, 예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선 암), 백혈병(예를 들어 AML 또는 ALL), 다발성 골수종 및/또는 건선에 걸리기 쉽거나 또는 이에 걸린 포유동물의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효한 병-치료 또는 병-예방 량의 본 발명에 개시된 약학 조성물들 중 하나 이상 또는 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 증식성 질병, 특히 암(예를 들어 고형 종양, 예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선암), 백혈병(예를 들어 AML 또는 ALL), 다발성 골수종 및/또는 건선의 치료, 방지 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다.

추가의 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 이식 거부에 걸리기 쉽거나 또는 이에 걸린 포유동물의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효한 병-치료 또는 병-예방 량의 본 발명에 개시된 약학 조성물들 중 하나 이상 또는 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다. 구체적인 실시태양에서, 본 발명은 기관 이식편 거부의 치료 방법을 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 이식 거부의 치료, 방지 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 구체적인 실시태양에서, 본 발명은 기관 이식편 거부의 치료 방법을 제공한다.

치료 방법의 태양에서, 본 발명은 연골 전환의 장애를 수반하는 질병에 걸리기 쉽거나 또는 이에 걸린 포유동물의 치료, 방지 또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효한 병-치료 또는 병-예방 량의 본 발명에 개시된 약학 조성물들 중 하나 이상 또는 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 연골 전환의 장애를 수반하는 질병의 치료, 방지 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다.

본 발명은 또한 선천성 연골 기형의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효한 병-치료 또는 병-예방 량의 본 발명에 개시된 약학 조성물들 중 하나 이상 또는 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 선천성 연골 기형의 치료, 방지 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다.

추가의 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 IL6의 과다분비와 관련된 질병, 특히 캐슬만씨 병 또는 사구체간질 증식성 사구체신염에 걸리기 쉽거나 또는 이에 걸린 포유동물의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효한 병-치료 또는 병-예방 량의 본 발명에 개시된 약학 조성물들 중 하나 이상 또는 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다.

또 다른 태양에서 본 발명은 IL6의 과다분비와 관련된 질병, 특히 캐슬만씨 병 또는 사구체간질 증식성 사구체신염의 치료, 방지 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다.

본 발명의 추가의 태양으로서 특히 상기 언급한 병 및 질병들의 치료 또는 예방에서 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 또한 상기 언급한 병 및 질병들 중 하나의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서 본 발명 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명 방법의 특정 섭생은 염증을 수반하는 질병을 앓고 있는 환자에게 상기 환자에게서 염증 수준을 감소시키고, 바람직하게는 상기 염증의 원인이 되는 과정을 종결시키기에 충분한 기간 동안 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다. 상기 방법의 특정 실시태양은 류마티스성 관절염을 앓고 있거나 또는 상기 질병이 발병되기 쉬운 환자에게 상기 환자의 관절 중의 염증을 각각 감소 또는 예방하고, 바람직하게는 상기 염증의 원인이 되는 과정을 종결시키기에 충분한 기간 동안 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다.

본 발명 방법의 추가의 특정 섭생은 연골 전환의 장애를 수반하는 질병(예를 들어 골관절염)을 앓고 있는 환자에게 상기 퇴화의 원인이 되는 저절로-계속되는 과정을 감소시키고 바람직하게는 종결시키기에 충분한 기간 동안 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다. 상기 방법의 특정 실시태양은 골관절염을 앓고 있거나 또는 상기 질병이 발병되기 쉬운 환자에게 상기 환자의 관절 중의 연골 퇴화를 각각 감소 또는 예방하고, 바람직하게는 상기 퇴화의 원인이 되는 과정을 종결시키기에 충분한 기간 동안 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다. 특정 실시태양에서 상기 화합물은 연골 동화작용 및/또는 항-이화작용 성질을 나타낸다.

주사 용량 수준은 전부 약 1 내지 약 120 시간 및 특히 24 내지 96 시간 동안 약 0.1 내지 10 ㎎/㎏/시간 이상의 범위이다. 적합한 정상 상태 수준을 성취하기 위해서 또한 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏ 이상의 프리로딩(preloading) 일시주사를 투여할 수 있다. 상기 최대 전체 용량은 40 내지 80 ㎏ 인간 환자의 경우 약 2 g/일을 초과하지 않을 것으로 예상된다.

장기적인 병, 예를 들어 퇴행성 병의 예방 및/또는 치료를 위해서, 상기 치료 섭생을 대개는 수 개월 또는 수년 이상 연장하며, 따라서 경구 투여가 환자의 편리성 및 허용성을 위해 바람직하다. 경구 투여의 경우, 하루에 1 내지 5 회 및 특히 2 내지 4 회 및 전형적으로 3 회 경구 용량이 전형적인 섭생이다. 상기 투여 패턴을 사용하는 경우, 각 용량은 약 0.01 내지 약 20 ㎎/㎏의 본 발명의 화합물을 제공하며, 특정 용량은 각각 약 0.1 내지 약 10 ㎎/㎏ 및 특히 약 1 내지 약 5 ㎎/㎏을 제공한다.

주사 용량을 사용하여 성취되는 경우와 유사하거나 이보다 낮은 혈액 수준을 제공하기 위해 일반적으로 경피 용량이 선택된다.

염증성 병의 발병을 예방하기 위해 사용되는 경우, 본 발명의 화합물을 상기 병의 발병 위험이 있는 환자에게, 전형적으로는 의사의 조언 및 관리 하에, 상술한 투여량 수준으로 투여할 것이다. 특정 병의 발병 위험이 있는 환자는 상기 병의 가족력이 있는 환자, 또는 유전자 시험 또는 선별에 의해 상기 병이 발병하기 특히 쉬운 것으로 확인된 환자를 포함한다.

본 발명의 화합물을 유일한 활성제로서 투여하거나 또는 다른 치료제들, 예를 들어 동일하거나 유사한 치료 활성을 나타내고 병행 투여에 대해 안전하고 효능 있는 것으로 결정된 다른 화합물들과 함께 투여할 수 있다. 특정 실시태양에서, 2 개(또는 그 이상) 작용제의 동시 투여는 각각을 현저하게 더 낮은 용량으로 사용할 수 있게 하며, 따라서 나타나는 부작용들이 감소된다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 염증을 수반하는 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며; 특정 작용제는 비 제한적으로 면역조절제, 예를 들어 아자티오프린, 코르티코스테로이드(예를 들어 프레드니솔론 또는 덱사메타손), 사이클로포스파미드, 사이클로스포린 A, 타크로리무스, 마이코페놀레이트 모페틸, 뮤로모납-CD3(OKT-3, 예를 들어 오쏘콜론(등록상표)), ATG, 아스피린, 아세트아미노펜, 이부프로펜, 나프톡센 및 피록시캄을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 관절염(예를 들어 류머티스성 관절염)의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며; 특정 작용제는 비 제한적으로 진통제, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 스테로이드, 합성 DMARDS(예를 들어 비 제한적으로 메토트렉세이트, 레플루노미드, 설파살라진, 아우라노핀, 나트륨 아우로티오말레이트, 페니실라민, 클로로퀸, 하이드록시클로로퀸, 아자티오프린, 및 시클로스포린) 및 생물학적 DMARDS(예를 들어 비 제한적으로 인플릭시맵, 에타너셉트, 아달리뮤맵, 리툭시맵 및 아바타셉트)를 포함한다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 증식성 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 또 다른 치료제와 함께 투여하며; 특정 작용제로는 비 제한적으로 메토트렉세이트, 류코보린, 아드리아마이신, 프레니손, 블레오마이신, 사이클로포스파미드, 5-플루오로유라실, 패클리탁셀, 도세탁셀, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 독소루비신, 타목시펜, 토레미펜, 메제스트롤 아세테이트, 아나스트로졸, 고세렐린, 항-HER2 단클론 항체(예를 들어 허셉틴^TM), 카페시타빈, 랄록시펜 하이드로클로라이드, EGFR 억제제(예를 들어 이레사(등록상표), 타세바^TM, 에르비툭스^TM), VEGF 억제제(예를 들어 아바스틴^TM), 프로테아솜 억제제(예를 들어 벨케이드^TM), 글리벡(등록상표) 또는 hsp90 억제제(예를 들어 17-AAG)가 있다. 또한, 본 발명의 화합물을 다른 요법들, 예를 들어 비 제한적으로 방사선요법 또는 수술과 함께 투여할 수도 있다. 특정 실시태양에서 상기 증식성 질환은 암, 골수증식성 질병 및 백혈병 중에서 선택된다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 자가면역 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정 작용제로는 비 제한적으로 글루코코르티코이드, 세포증식억제제(예를 들어 퓨린 동족체), 알킬화제(예를 들어 질소 머스타드(사이클로포스파미드), 나이트로소유레아, 백금 화합물 및 다른 것들), 대사길항물질(예를 들어 메토트렉세이트, 아자티오프린 및 머캅토퓨린), 세포독성 항생제(예를 들어 닥티노마이신 안트라사이클린, 마이토마이신 C, 블레오마이신 및 미트라마이신), 항체(예를 들어 항-CD20, 항-CD25 또는 항-CD3(OTK3) 단클론 항체, 아트감(등록상표) 및 타이모글로불린(등록상표)), 사이클로스포린, 타크로리무스, 라파마이신(시로리무스), 인터페론(예를 들어 IFN-β), TNF 결합 단백질(예를 들어 인플릭시맵(레미케이드), 에타너셉트(엔브렐), 또는 아달리뮤맵(휴미라)), 마이코페놀레이트, 핑고리모드, 마이리오신이 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 이식 거부의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정 작용제로는 비 제한적으로 칼시뉴린 억제제(예를 들어 사이클로스포린 또는 타크로리무스(FK506)), mTOR 억제제(예를 들어 시로리무스, 에베로리무스), 증식 억제제(예를 들어 아자티오프린, 마이코페놀산), 코르티코스테로이드(예를 들어 프레드니솔론, 하이드로코르티손), 항체(예를 들어 단클론 항-IL-2Rα 수용체 항체, 바실릭시맵, 다클리주맵), 다클론 항-T-세포 항체(예를 들어 항-흉선세포 글로불린(ATG), 항-림프구 글로불린(ALG))가 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 천식 및/또는 비염 및/또는 COPD의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정 작용제로는 비 제한적으로 베타₂-아드레날린수용체 작용물질(예를 들어 살부타몰, 레발부테롤, 터부탈린 및 비톨테롤), 에피네프린(흡입 또는 정제), 항콜린제(예를 들어 이프라트로피움 브로마이드), 글루코코르티코이드(경구 또는 흡입), 장시간-작용 베타₂-작용물질(예를 들어 살메테롤, 포모테롤, 밤부테롤, 및 서방성 경구 알부테롤), 흡입 스테로이드와 장시간-작용 기관지확장제의 조합(예를 들어 플루티카손/살메테롤, 부데소니드/포모테롤), 류코트리엔 길항물질 및 합성 억제제(예를 들어 몬테류카스트, 자피르류카스트 및 질류톤), 매개체 방출 억제제(예를 들어 크로모글리케이트 및 케토티펜), IgE 반응의 생물학적 조절제(예를 들어 오말리주맵), 항히스타민제(예를 들어 세테리진, 신나리진, 펙소페나딘), 혈관수축제(예를 들어 옥시메타졸린, 자일로메타졸린, 나파졸린 및 트라마졸린)가 있다.

또한, 본 발명의 화합물을 천식 및/또는 COPD를 위한 응급 치료와 함께 투여할 수 있으며, 상기와 같은 요법으로는 산소 또는 헬리옥스 투여, 분무된 살부타몰 또는 터부탈린(항콜린제(예를 들어 이프라트로피움), 전신 스테로이드(경구 또는 정맥 내, 예를 들어 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 또는 하이드로코르티손), 정맥 내 살부타몰, 비특이성 베타-작용물질, 주입 또는 흡입된(예를 들어 에피네프린, 아이소에타린, 아이소프로테레놀, 메타프로테레놀), 항콜린제(IV 또는 분무된, 예를 들어 글리코피롤레이트, 아트로핀, 이프라트로피움), 메틸잔틴(테오필린, 아미노필린, 바미필린), 기관지확장 효과를 갖는 흡입 마취제(예를 들어 아이소플루란, 할로탄, 엔플루란), 케타민, 정맥 내 황산 마그네슘과 임의로 배합된)이 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 자극성 장 질병(IBD)의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며; 특정 작용제로는 비 제한적으로 글루코코르티코이드(예를 들어 프레드니손, 부데소니드) 합성 질병 개질성, 면역조절제(예를 들어 메토트렉세이트, 레플루노미드, 설파살라진, 메살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린 및 사이클로스포린) 및 생물학적 질병 개질성, 면역조절제(인플릭시맵, 아달리뮤맵, 리툭시맵 및 아바타셉트)가 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 전신 홍반성 루푸스의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며; 특정 작용제로는 비 제한적으로 질병-개질성 항류머티스성 약물(DMARD), 예를 들어 항말라리아제(예를 들어 플라퀘닐, 하이드록시클로로퀸), 면역억제제(예를 들어 메토트렉세이트 및 아자티오프린), 사이클로포스파미드 및 마이코페놀산; 면역억제성 약물 및 진통제, 예를 들어 비스테로이드성 소염 약물, 아편제(예를 들어 덱스트로프로폭시펜 및 코-코다몰), 아편양제제(예를 들어 하이드로코돈, 옥시코돈, MS 콘틴, 또는 메타돈) 및 펜타닐 듀라제식 경피 패치가 있다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 건선의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정 작용제로는 비 제한적으로 국소 치료제, 예를 들어 콜타르, 다이트라놀(안트랄린), 코르티코스테로이드형 데속시메타손(토피코트), 플루코시노니드, 비타민 D₃ 동족체(예를 들어 칼시포트리올), 아르간 오일 및 레티노이드(에트레티네이트, 아시트레틴, 타자로텐), 전신 치료제, 예를 들어 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 레티노이드, 티오구아닌, 하이드록시유레아, 설파살라진, 마이코페놀레이트 모페틸, 아자티오프린, 타크로리무스, 퓨마르산 에스터 또는 생물학적 약제, 예를 들어 아메비브, 엔브렐, 휴미라, 레미케이드, 랩티바 및 유스테키뮤맵(IL-12 및 IL-23 차단제)을 함유하는 입욕 용액, 보습제, 약물첨가 크림 및 연고가 있다. 또한, 본 발명의 화합물을 다른 요법들, 예를 들어 비 제한적으로 광선치료, 또는 광화학요법(예를 들어 프소랄렌 및 자외선 A 광선치료(PUVA))과 함께 투여할 수 있다.

동시 투여는 숙련가에게 자명한 바와 같이, 2 개 이상의 치료제를 동일한 치료 섭생의 부분으로서 환자에게 전달하는 임의의 수단을 포함한다. 2 개 이상의 작용제들을 단일 제형으로 동시에 투여할 수도 있지만, 이는 필수적인 것은 아니다. 상기 작용제들을 상이한 제형 및 상이한 시간으로 투여할 수 있다.

일반적인 합성 과정

일반적인 사항

본 발명의 화합물들을 하기의 일반적인 방법 및 과정을 사용하여 쉽게 입수할 수 있는 출발 물질로부터 제조할 수 있다. 전형적이거나 바람직한 공정 조건들(즉 반응 온도, 시간, 반응물들의 몰 비, 용매, 압력 등)이 주어지는 경우, 달리 나타내지 않는 한 다른 공정 조건들도 또한 사용할 수 있음을 알 것이다. 최적 반응 조건은 사용되는 특정 반응물 또는 용매에 따라 변할 수 있지만, 상기와 같은 조건들은 통상적인 최적화 과정에 의해 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다.

또한, 당해 분야의 숙련가들에게 자명한 바와 같이, 몇몇 작용기들이 바람직하지 못한 반응을 겪지 않기 위해서 통상적인 보호 그룹들이 필요할 수 있다. 적합한 보호 및 탈보호 조건들뿐만 아니라 특정 작용기들에 적합한 보호 그룹의 선택은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 다수의 보호 그룹들, 및 이들의 도입 및 제거가 문헌[T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Wiley, New York, 1991] 및 이 중에 인용된 참고문헌들에 개시되어 있다.

하기의 방법들을 상기 본 발명에 나타낸 전형적인 바이사이클로헤테로아릴들의 제조에 대한 상세한 설명과 함께 제공한다. 본 발명의 화합물을 유기 합성 분야의 숙련가에 의해, 공지되거나 상업적으로 입수할 수 있는 출발 물질로부터 제조할 수 있다.

모든 시약들은 상업적인 등급이며 달리 나타내지 않는 한 추가의 정제 없이 제공받은 대로 사용되었다. 상업적으로 입수할 수 있는 무수 용매들을 불활성 분위기 하에서 수행된 반응들에 대해 사용하였다. 시약 등급 용매를, 달리 나타내지 않는 한, 모든 다른 경우들에 사용하였다. 컬럼 크로마토그래피를 실리카젤 60(35-70 ㎛) 상에서 수행하였다. 박층 크로마토그래피를 예비 코팅된 실리카젤 F-254 플레이트(두께 0.25 ㎜)를 사용하여 수행하였다. ¹H NMR 스펙트럼을 브루커 DPX 400 NMR 광도계(400 MHz) 상에 기록하였다. ¹H NMR 스펙트럼에 대한 화학 이동(δ)은 내부 기준으로서 테트라메틸실란(δ 0.00) 또는 적합한 잔류 용매 피크, 즉 CHCl₃(δ 7.27)에 대한 ppm으로 기록한다. 중복성을 단일선(s), 이중선(d), 삼중선(t), 사중선(q), 다중선(m) 및 브로드(br)로서 제공한다. 커플링 상수(J)를 Hz로 제공한다. 전기분무 MS 스펙트럼을 마이크로매스 플랫폼 LC/MS 광도계 상에서 획득하였다. 모든 LCMS 분석에 대해 사용된 컬럼: 워터스 액퀴티(Waters Acquity) UPLC BEH C18 1.7 ㎛, 2.1 ㎜ ID x 50 ㎜ L(파트 No. 186002350). 예비 HPLC: 워터스 XBridge Prep C18 5 ㎛ ODB 19 ㎜ ID x 100 ㎜ L(파트 No. 186002978). 상기 방법들은 모두 MeCN/H₂O 구배를 사용한다. H₂O는 0.1% TFA 또는 0.1% NH₃를 함유한다.

하기는 실험 부분에 사용된 약어의 목록이다:

본 발명 화합물의 합성적 제조

본 발명에 따른 화합물을 하기 반응식에 따라 제조할 수 있다.

일반적인 합성 방법

[반응식 1]

상기에서,

Ar은 페닐-L1-헤테로사이클로알킬을 나타내고, 이때 L1은 -CO-이고, 상기 헤테로사이클로알킬 그룹은 임의로 치환된다.

일반적인 내용

1.1.1. 1-(6-브로모-피리딘-2-일)-3-카보에톡시-티오유레아(2)

5 ℃로 냉각된 DCM(2.5 L) 중의 2-아미노-6-브로모피리딘(1)(253.8 g, 1.467 몰)의 용액에 15 분에 걸쳐 에톡시카보닐 아이소티오시아네이트(173.0 ㎖, 1.467 몰)를 적가하였다. 이어서 상기 반응 혼합물을 실온(20 ℃)으로 가온되게 하고 16 시간 동안 교반하였다. 진공 하에서 증발시켜 고체를 제공하고 이를 여과에 의해 수거하고, 가솔린(3 x 600 ㎖)으로 철저히 세척하고 공기 건조시켜 (2)를 제공하였다. 상기 티오유레아를 임의의 정제 없이 다음 단계에 그대로 사용하였다. ^lH (400 MHz, CDCh) δ 12.03 (1H, br s, NH), 8.81 (1H, d, J 7.8 Hz, H-3), 8.15 (1H, br s, NH), 7.60 (1H, t, J 8.0 Hz, H-4), 7.32 (1H, dd, J 7.7 and 0.6 Hz, H-5), 4.31 (2H, q, J7 .1 Hz, CH2) , 1.35 (3H, t, J7 .1 Hz, CH3) .

1.1.2. 5-브로모-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-2-일아민(3)

EtOH/MeOH(1:1, 900 ㎖) 중의 하이드록실아민 하이드로클로라이드(101.8 g, 1.465 mol)의 현탁액에 N,N-다이아이소프로필에틸아민(145.3 ㎖, 0.879 몰)을 가하고 상기 혼합물을 실온(20 ℃)에서 1 시간 동안 교반하였다. 이어서 1-(6-브로모-피리딘-2-일)-3-카보에톡시-티오유레아(2)(89.0 g, 0.293 몰)를 가하고 상기 혼합물을 서서히 가열 환류시켰다(주: 방출되는 H₂S를 소멸시키기 위해서 표백 세척기가 필요하다). 환류 하에서 3 시간 후에, 상기 혼합물을 냉각되게 하고 여과하여 침전된 고체를 수거하였다. 추가의 생성물을 상기 여액의 진공 증발, H₂O(250 ㎖)의 첨가 및 여과에 의해 수거하였다. 합한 고체를 H₂O(250 ㎖), EtOH/MeOH(1:1, 250 ㎖) 및 Et₂O(250 ㎖)로 연속적으로 세척하고, 이어서 진공 하에서 건조시켜 고체로서 트라이아졸로피리딘 유도체(3)를 제공하였다. 상기 화합물을 임의의 정제 없이 다음 단계에 그대로 사용하였다. ^lH (400 MHz, DMSO- d6 ) δ 7.43-7.34 (2H, m, 2 x aromatic-H), 7.24 (1H, dd, J6 .8 and 1.8 Hz, aromatic-H), 6.30 (2H, br, NH2) ; m/z 213/215 (1:1, M+H⁺, 100%).

1.1.3. 사이클로프로판카복실산 (5-브로모-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-2-일)-아미드(4):

5 ℃에서 무수 CH₃CN(150 ㎖) 중의 2-아미노-트라이아졸로피리딘(3)(7.10 g, 33.3 밀리몰)의 용액에 Et₃N(11.6 ㎖, 83.3 밀리몰)에 이어서 사이클로프로판카보닐 클로라이드(83.3 밀리몰)를 가하였다. 이어서 상기 반응 혼합물을 주변 온도로 가온되게 하고 모든 출발 물질(3)이 소모될 때까지 교반하였다. 경우에 따라, 추가의 Et₃N(4.64 ㎖, 33.3 밀리몰) 및 산 클로라이드(33.3 밀리몰)를 가하여 반응을 완료시켰다. 진공 하에서 용매를 증발시킨 다음 생성된 잔사를 7N 메탄올 암모니아 용액(50 ㎖)으로 처리하고 주변 온도에서 1 시간 내지 16 시간 동안 교반하여 임의의 비스-아실화된 생성물을 가수분해시켰다. 진공 하에서 휘발성 물질을 제거한 다음 Et₂O(50 ㎖)로 연마하여 생성물을 단리시켰다. 상기 고체를 여과에 의해 수거하고, H₂O(2 x 50 ㎖), 아세톤(50 ㎖) 및 Et₂O(50 ㎖)로 세척한 다음, 진공 하에서 건조시켜 목적하는 아실 중간체(4)를 제공하였다.

본 발명 화합물의 제조를 위한 합성 과정

화합물 1

단계 1: 스즈키 커플링

4-카복시페닐보론산(3.5 g, 0.021 mol)을 1,4-다이옥산/물(5:1) 중의 사이클로프로판카복실산 (5-브로모-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-2-일)-아미드(중간체 4, 5 g, 0.018 mol)의 용액에 가하였다. K₂CO₃(5.0 g, 0.036 mol) 및 PdCl₂dppf(5%)를 상기 용액에 가하였다. 이어서 생성 혼합물을 오일 욕 중에서 90 ℃에서 16 시간 동안 전통적인 가열에 의해 가열하였다. 1M HCl 용액을 가하고 침전물이 상기 산성 용액 중에 형성되었다. 상기 침전물을 여과하고, 진공 하에서 건조시켜 표제 화합물을 제공하고 이를 추가의 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

단계 2: 사이클로프로판카복실산 {5-[4-(3,3-다이메틸-아제티딘-1-카보닐)-페닐]-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-2-일}-아미드(화합물 1)

EDCl(3.59 g, 0.019 mol), HOBt(2.53 g, 0.019 mol) 및 DIPEA(4.48 ㎖)를 실온에서 DCM(150 ㎖) 중의 4-[2-(사이클로프로판카보닐아미노)-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-5-일]-벤조산(4 g, 0.012 mol)의 용액에 가하였다. 생성 혼합물을 실온에서 10 분간 교반하였다. 다이메틸아제티딘 하이드로클로라이드 염(1.64 g, 0.013 mol)을 상기 용액에 가하고 상기 반응물을 16 시간 동안 교반한다. 물을 상기 반응 혼합물에 가하였다. 유기층을 분리시키고 2N NaOH 용액, 2N HCl 용액 및 물로 세척하였다. 유기상을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고 진공 하에서 증발시켰다. 플래시 크로마토그래피(용출제: 1:1 석유/EtOAc에서 순수한 EtOAc로)에 의해 정제시켜 사이클로프로판카복실산 {5-[4-(3,3-다이메틸-아제티딘-1-카보닐)-페닐]-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-2-일}-아미드를 제공하였다.

본 발명에 개시된 합성 방법에 따라 제조되었거나 제조될 수 있는 본 발명의 화합물을 하기 표 1에 나타낸다. 본 발명 화합물의 NMR 스펙트럼 데이터를 표 2에 제공한다.

생물학적 실시예

실시예 1 - 시험관 내 분석

실시예 1.1 JAK1 억제 분석

재조합 인간 JAK1(촉매 도메인, 아미노산 866-1154; 카탈로그 번호 PV4774)을 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 구입하였다. 1 ng의 JAK1을 백색 384 루미노트랙(Luminotrac) 200 플레이트(Greiner, 카탈로그 번호 781075) 중에서, 총 20 ㎕의 부피로, 4 ㎕ 시험 화합물 또는 비히클(DMSO, 1% 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에 키나제 반응 완충액(25 mM MOPS pH 6.8, 0.016% 브리즈(Brij)-35, 8.33 mM MgCl₂, 3.33 mM DTT, 7 μM ATP) 중의 20 nM 유라이트(Ulight)-JAK1(tyr 1023) 펩타이드(Perkin Elmer 카탈로그 번호 TRF0121)와 함께 배양하였다. 실온에서 60 분 후에, 20 ㎕/웰의 검출 혼합물(1x 검출 완충제(Perkin Elmer, 카탈로그 번호 CR97-100C), 0.5 nM 유로피움(Europium)-항-포스포타이로신(PT66)(Perkin Elmer, 카탈로그 번호 AD0068), 10 mM EDTA)을 가하여 반응을 중지시켰다. 엔비젼(Envision)을 사용하여 320 ㎚의 여기 및 615 ㎚에서 방출로 정보판독을 수행한다(Perkin Elmer). 비히클의 존재 하에서 획득한 상대 형광 단위(RFU)로부터 양성 대조군 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재 하에서 획득한 RFU를 감하여 키나제 활성을 계산하였다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정하였다:

억제 퍼센트 = ((시험 화합물이 존재하는 샘플에 대해 측정된 RFU - 양성 대조군 억제제를 갖는 샘플에 대해 측정된 RFU)/(비히클 존재 하에서 측정된 RFU - 양성 대조군 억제제를 갖는 샘플에 대해 측정된 RFU)) x 100.

상기 JAK1 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 상기 화합물에 대한 IC₅₀의 계산이 가능하도록 상기 화합물들에 대한 일련의 용량 희석물을 제조하였다. 각각의 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 1/5의 일련의 희석, 8 개의 점(20 μM - 4 μM - 800 nM - 160 nM - 32 nM - 6.4 nM - 1.28 nM - 0.26 nM)에서 1% DMSO의 최종 농도로 통상적으로 시험하였다. 상기 일련의 화합물의 효능이 증가할 때, 더 희석하고/하거나 최고 농도를 낮춘다(예를 들어 5 μM, 1 μM). 상기 데이터를 상기 분석으로부터의 평균 IC₅₀ ± 상기 평균의 표준 오차로서 나타낸다.

화합물의 JAK1 IC₅₀ 값
화합물 #	JAK1 ( nM )
1	6.6 ± 0.7

실시예 1.2 JAK1 Ki 측정 분석

Ki의 측정을 위해서, 상이한 양들의 억제제를 상기 효소와 혼합하고 효소 반응을 ATP 농도의 함수로서 추적하였다. 상기 Ki를, 화합물 농도에 대한 Km의 이중 역수 플롯에 의해 측정하였다(Lineweaver-Burk 플롯). JAK1(Invitrogen, PV4774)을 500 ng/㎖의 최종 농도로 사용하였다. 기질은 폴리(Glu,Tyr)나트륨 염(4:1), MW 20 000 내지 50 000(Sigma, P0275)이었다. 상기 반응을 다양한 농도의 ATP 및 화합물과 함께 25 mM Hepes pH 7.5; 0.01% 트윈20, 10 mM MgCl₂ 중에서 수행하고 150 mM의 인산을 첨가하여 중지시켰다. 상기 기질 폴리GT에 통합된 포스페이트의 측정을, 상기 샘플을 필터 플레이트(수확기, Perkin Elmer 사용) 상에 로딩하고 후속 세척하여 수행하였다. 폴리GT 중의 통합된 ³⁵P를, 섬광 액체를 상기 필터 플레이트(Perkin Elmer)에 첨가한 후에 탑카운트(Topcount) 섬광 계수기에서 측정한다.

화합물 1을 상기 분석에서 시험했을 때, 6.9 nM의 Ki 값이 측정되었다.

한편으로, Ki의 측정을 위해서, 상이한 양들의 억제제를 상기 효소와 혼합하고 효소 반응을 ATP 농도의 함수로서 추적하였다. 상기 Ki를, 화합물 농도에 대한 Km의 이중 역수 플롯에 의해 측정하였다(Lineweaver-Burk 플롯). 1 ng의 JAK1(Invitrogen, PV4774)을 상기 분석에 사용하였다. 기질은 50 nM 유라이트-JAK-1(Tyr1023) 펩타이드(Perkin Elmer, TRF0121)이었다. 상기 반응을 다양한 농도의 ATP 및 화합물과 함께 25 mM MOPS pH 6.8, 0.01%, 2 mM DTT, 5 mM MgCl₂ 브리즈-35 중에서 수행하였다. 인산화된 기질을 Eu-표지된 항-포스포타이로신 항체 PT66(Perkin Elmer, AD0068)을 사용하여 측정하였다. 판독을 320 ㎚ 여기 및 615 ㎚ 및 665 ㎚ 방출로 엔비전(Perkin Elmer) 상에서 수행하였다.

화합물 1을 상기 분석에서 시험했을 때, 5.6 nM의 Ki 값이 측정되었다.

실시예 1.3 JAK2 억제 분석

재조합 인간 JAK2(촉매 도메인, 아미노산 866-1154; 카탈로그 번호 PV4210)을 인비트로젠으로부터 구입하였다. 0.0125 mU의 JAK2를 백색 384 루미노트랙 200 플레이트(Greiner, 카탈로그 번호 781075) 중에서, 총 20 ㎕의 부피로, 4 ㎕ 시험 화합물 또는 비히클(DMSO, 1% 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에 키나제 반응 완충액(41.66 mM HEPES pH 7.0, 0.016% 트리톤 X-100, 12.5 mM MgCl₂, 3.33 mM DTT, 7.5 μM ATP) 중의 25 nM 유라이트-JAK1(tyr 1023) 펩타이드(Perkin Elmer 카탈로그 번호 TRF0121)와 함께 배양하였다. 실온에서 60 분 후에, 20 ㎕/웰의 검출 혼합물(1x 검출 완충제(Perkin Elmer, 카탈로그 번호 CR97-100C), 0.5 nM 유로피움-항-포스포타이로신(PT66)(Perkin Elmer, 카탈로그 번호 AD0068), 10 mM EDTA)을 가하여 반응을 중지시켰다. 엔비젼을 사용하여 320 ㎚의 여기 및 615 ㎚에서 방출로 정보판독을 수행한다(Perkin Elmer). 비히클의 존재 하에서 획득한 상대 형광 단위(RFU)로부터 양성 대조군 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재 하에서 획득한 RFU를 감하여 키나제 활성을 계산하였다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정하였다:

상기 JAK2 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 상기 화합물에 대한 IC₅₀의 계산이 가능하도록 상기 화합물들에 대한 일련의 용량 희석물을 제조하였다. 각각의 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 1/5의 일련의 희석, 8 개의 점(20 μM - 4 μM - 800 nM - 160 nM - 32 nM - 6.4 nM - 1.28 nM - 0.26 nM)에서 1% DMSO의 최종 농도로 통상적으로 시험하였다. 상기 일련의 화합물의 효능이 증가할 때, 더 희석하고/하거나 최고 농도를 낮춘다(예를 들어 5 μM, 1 μM). 상기 데이터를 상기 분석으로부터의 평균 IC₅₀ ± 상기 평균의 표준 오차로서 나타낸다.

화합물의 JAK2 IC₅₀ 값
화합물 #	JAK2 ( nM )
1	67 ± 5

실시예 1.4 JAK2 Ki 측정 분석

Ki의 측정을 위해서, 상이한 양들의 억제제를 상기 효소와 혼합하고 효소 반응을 ATP 농도의 함수로서 추적하였다. 상기 Ki를, 화합물 농도에 대한 Km의 이중 역수 플롯에 의해 측정하였다(Lineweaver-Burk 플롯). 0.025 mU의 JAK2(Invitrogen, PV4210)를 상기 분석에 사용하였다. 기질은 폴리(Glu,Tyr)나트륨 염(4:1), MW 20 000 내지 50 000(Sigma, P0275)이었다. 상기 반응을 다양한 농도의 ATP 및 화합물과 함께 10 mM MOPS pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 0.01% 브리즈-35, 1 mM DTT, 15 mM MgAc 중에서 수행하고 150 mM 인산을 가하여 중지시켰다. 상기 기질 폴리GT에 통합된 포스페이트의 측정을, 상기 샘플을 필터 플레이트(수확기, Perkin Elmer 사용) 상에 로딩하고 후속 세척하여 수행하였다. 폴리GT 중의 통합된 ³⁵P를, 섬광 액체를 상기 필터 플레이트(Perkin Elmer)에 첨가한 후에 탑카운트 섬광 계수기에서 측정한다.

화합물 1을 상기 분석에서 시험했을 때, 126 nM의 Ki 값이 측정되었다.

한편으로, Ki의 측정을 위해서 상이한 양들의 억제제를 상기 효소와 혼합하고 효소 반응을 ATP 농도의 함수로서 추적하였다. 상기 Ki를, 화합물 농도에 대한 Km의 이중 역수 플롯에 의해 측정하였다(Lineweaver-Burk 플롯). 0.0125 mU의 JAK2(Invitrogen, PV4210)를 상기 분석에 사용하였다. 기질은 50 nM 유라이트-JAK-1(Tyr1023) 펩타이드(Perkin Elmer, TRF0121)이었다. 상기 반응을 다양한 농도의 ATP 및 화합물과 함께 25 mM HEPES pH 7.0, 0.01% 트리톤 X-100, 2 mM DTT, 7.5 mM MgCl₂ 중에서 수행하였다. 인산화된 기질을 Eu-표지된 항-포스포타이로신 항체 PT66(Perkin Elmer, AD0068)을 사용하여 측정하였다. 판독을 320 ㎚ 여기 및 615 ㎚ 및 665 ㎚ 방출의 엔비전(Perkin Elmer) 상에서 수행하였다.

화합물 1을 상기 분석에서 시험했을 때, 35 nM의 Ki 값이 측정되었다.

실시예 1.5 JAK3 억제 분석

재조합 인간 JAK3 촉매 도메인(아미노산 781-1124; 카탈로그 번호 PV3855)을 인비트로젠으로부터 구입하였다. 0.025 mU의 JAK3를 폴리프로필렌 96-웰 플레이트(Greiner, V-바닥) 중에서, 총 25 ㎕의 부피로, 5 ㎕ 시험 화합물 또는 비히클(DMSO, 1% 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에 키나제 반응 완충액(25 mM 트리스 pH 7.5, 0.5 mM EGTA, 0.5 mM Na3VO4, 5 mM b-글리세로포스페이트, 0.01% 트리톤 X-100, 1 μM 비-방사성 ATP, 0.25 μCi 33P-감마-ATP(GE Healthcare, 카탈로그 번호 AH9968) 최종 농도) 중의 2.5 ㎍의 폴리GT 기질(Sigma 카탈로그 번호 P0275)과 함께 배양하였다. 30 ℃에서 105 분 후에, 150 mM 인산 25 ㎕/웰을 가하여 반응을 중지시켰다. 종결된 키나제 반응물을 모두 세포 수확기(Perkin Elmer)를 사용하여, 미리 세척한(75 mM 인산) 96 웰 필터 플레이트(Perkin Elmer 카탈로그 번호 6005177)로 옮겼다. 플레이트를 웰당 300 ㎕의 75 mM 인산 용액으로 6 회 세척하고 상기 플레이트의 바닥을 밀봉시켰다. 40 ㎕/웰의 마이크로신트-20을 가하고, 상기 플레이트의 상부를 밀봉하고 탑카운트(Perkin Elmer)를 사용하여 판독을 수행하였다. 비히클의 존재 하에서 수득한 분당 카운트(cpm)로부터 양성 대조군 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재 하에서 수득한 cpm을 감하여 키나제 활성을 계산하였다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정하였다:

억제 퍼센트 = ((시험 화합물이 존재하는 샘플에 대해 측정된 cpm - 양성 대조군 억제제를 갖는 샘플에 대해 측정된 cpm)/(비히클 존재 하에서 측정된 cpm - 양성 대조군 억제제를 갖는 샘플에 대해 측정된 cpm)) x 100%.

상기 JAK3 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 각 화합물에 대한 IC₅₀의 계산이 가능하도록 상기 화합물들에 대한 일련의 용량 희석물을 제조하였다. 각각의 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 1/3의 일련의 희석, 8 개의 점(20 μM - 6.67 μM - 2.22 μM - 740 nM - 247 nM - 82 nM -27 nM - 9 nM)에서 1% DMSO의 최종 농도로 통상적으로 시험하였다. 상기 일련의 화합물의 효능이 증가했을 때, 더 희석하고/하거나 최고 농도를 낮추었다(예를 들어 5 μM, 1 μM). 상기 데이터를 상기 분석으로부터의 평균 IC₅₀ ± 상기 평균의 표준 오차로서 나타낸다.

화합물의 JAK3 IC₅₀ 값
화합물 #	JAK3 ( nM )
1	408 ± 62

실시예 1.6 JAK3 Ki 측정 분석

Ki의 측정을 위해서, 상이한 양들의 억제제를 상기 효소와 혼합하고 효소 반응을 ATP 농도의 함수로서 추적하였다. 상기 Ki를, 화합물 농도에 대한 Km의 이중 역수 플롯에 의해 측정하였다(Lineweaver-Burk 플롯). JAK3(Carna Biosciences, 09CBS-0625B)을 10 ng/㎖의 최종 농도로 사용하였다. 기질은 폴리(Glu,Tyr)나트륨 염(4:1), MW 20 000 내지 50 000(Sigma, P0275)이었다. 상기 반응을 다양한 농도의 ATP 및 화합물과 함께 25 mM 트리스 pH 7.5, 0.01% 트리톤 X-100, 0.5 mM EGTA, 2.5 mM Na₃VO₄, 5 mM b-글리세롤포스페이트, 10 mM MgCl₂ 중에서 수행하고 150 mM 인산의 첨가에 의해 중지시켰다. 상기 기질 폴리GT에 통합된 포스페이트의 측정을, 상기 샘플을 필터 플레이트(수확기, Perkin Elmer 사용) 상에 로딩하고 후속 세척하여 수행하였다. 폴리GT 중의 통합된 ³⁵P를, 섬광 액체를 상기 필터 플레이트(Perkin Elmer)에 첨가한 후에 탑카운트 섬광 계수기에서 측정한다.

화합물 1을 상기 분석에서 시험했을 때, 188 nM의 Ki 값이 측정되었다.

실시예 1.7 TYK2 억제 분석

재조합 인간 TYK2 촉매 도메인(아미노산 871-1187; 카탈로그 번호 08-147)을 카르나 바이오사이언스로부터 구입하였다. 5 ng의 TYK2를 폴리프로필렌 96-웰 플레이트(Greiner, V-바닥) 중에서, 총 25 ㎕의 부피로, 5 ㎕ 시험 화합물 또는 비히클(DMSO, 1% 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에 키나제 반응 완충액(25 mM Hepes pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.2 mM Na3VO4, 0.1% NP-40, 0.1 μM 비-방사성 ATP, 0.125 μCi 33P-감마-ATP(GE Healthcare, 카탈로그 번호 AH9968) 최종 농도) 중의 12.5 ㎍의 폴리GT 기질(Sigma 카탈로그 번호 P0275)과 함께 배양하였다. 30 ℃에서 90 분 후에, 150 mM 인산 25 ㎕/웰을 가하여 반응을 중지시켰다. 종결된 키나제 반응물을 모두 세포 수확기(Perkin Elmer)를 사용하여, 미리 세척한(75 mM 인산) 96 웰 필터 플레이트(Perkin Elmer 카탈로그 번호 6005177)로 옮겼다. 플레이트를 웰당 300 ㎕의 75 mM 인산 용액으로 6 회 세척하고 상기 플레이트의 바닥을 밀봉시켰다. 40 ㎕/웰의 마이크로신트-20을 가하고, 상기 플레이트의 상부를 밀봉하고 탑카운트(Perkin Elmer)를 사용하여 판독을 수행하였다. 비히클의 존재 하에서 수득한 분당 카운트(cpm)로부터 양성 대조군 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재 하에서 수득한 cpm을 감하여 키나제 활성을 계산하였다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정하였다:

상기 TYK2 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 각 화합물에 대한 IC₅₀의 계산이 가능하도록 상기 화합물들에 대한 일련의 용량 희석물을 제조하였다. 각각의 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 1/3의 일련의 희석, 8 개의 점(20 μM - 6.67 μM - 2.22 μM - 740 nM - 247 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM)에서 1% DMSO의 최종 농도로 통상적으로 시험하였다. 상기 일련의 화합물의 효능이 증가했을 때, 더 희석하고/하거나 최고 농도를 낮추었다(예를 들어 5 μM, 1 μM).

화합물의 TYK2 IC₅₀ 값
화합물 #	TYK2 ( nM )
1	219 ± 37

실시예 2. 세포 분석

실시예 2.1 JAK - STAT 신호전달 분석:

HeLa 세포를 10% 열 불활성화된 송아지 태아 혈청, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 유지시켰다. HeLa 세포를 70% 감염 융합률로 사용하였다. 87 ㎕ 세포 배양 배지 중의 20,000 세포를, 96-웰 플레이트 포맷으로 웰당 형질감염 시약으로서 0.32 ㎕ 제트-PEI(Polyplus)를 사용하여 40 ng pSTAT1(2)-루시페라제 리포터(Panomics), 내부 대조용 리포터로서 8 ng의 LacZ 리포터 및 52 ng의 pBSK로 일시 형질감염시켰다. 37 ℃, 10% CO₂에서 밤새 배양 후에, 형질감염 배지를 제거하였다. 75 ㎕의 DMEM + 1.5% 열 불활성화된 송아지 태아 혈청을 가하였다. 15 ㎕의 화합물을 6.7 배 농도로 60 분간 가하고 이어서 10 ㎕의 인간 OSM(Peprotech)을 33 ng/㎖의 최종 농도로 가하였다.

모든 화합물을 20 μM의 농도부터 출발하고 이어서 1/3의 일련의 희석, 총 8 개 용량(20 μM - 6.6 μM - 2.22 μM - 740 nM - 250 nM - 82 nM - 27 nM - 9 nM)에서 0.2% DMSO의 최종 농도로 중복 시험하였다.

37 ℃, 10% CO₂에서 밤새 배양 후, 세포를 100 ㎕ 용해 완충액/웰(PBS, 0.9 mM CaCl₂, 0.5 mM MgCl2, 5% 트레할로스, 0.025% 터지톨 NP9, 0.15% BSA)에 용해시켰다.

세포 용해물 40 ㎕를 사용하여, 20 분간 βGal 용액 180 ㎕(30 ㎕ ONPG 4 ㎎/㎖ + 150 ㎕ β-갈락토시다제 완충액(0.06 M Na₂HPO₄, 0.04 M NaH₂PO₄, 1 mM MgCl₂))을 가하여 β-갈락토시다제 활성을 판독하였다. 1M Na₂CO₃ 50 ㎕를 가하여 상기 반응을 중지시켰다. 405 ㎚에서 흡광도를 판독하였다.

엔비젼(Perkin Elmer) 상에서, 제조사(Perkin Elmer)에 의해 개시된 바와 같이 40 ㎕ 세포 용해물 + 40 ㎕의 스테디라이트(Steadylite)(등록상표)를 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다.

10 μM의 범-JAK 억제제를 양성 대조군(100% 억제)으로서 사용하였다. 음성 대조군으로서 0.5% DMSO(0% 억제)를 사용하였다. 상기 양성 및 음성 대조군을 사용하여 z' 및 '억제 퍼센트'(PIN) 값을 계산하였다.

억제 퍼센트 = ((비히클 존재 하에서 측정된 형광 - 시험 화합물이 존재하는 샘플에 대해 측정된 형광)/(비히클 존재 하에서 측정된 형광 - 촉발제 부재 샘플에 대해 측정된 형광)) x 100.

PIN 값을 용량-반응에서 시험된 화합물에 대해 플롯팅하고 EC₅₀ 값을 이끌어 냈다.

화합물의 STAT 신호전달 EC₅₀ 값
화합물 #	EC ₅₀ ( nM )
1	539 ± 130

실시예 2.2 OSM / IL -1β 신호전달 분석

OSM 및 IL-1β는 인간 연골육종 세포 주 SW1353에서 MMP13 수준을 상승적으로 상향조절하는 것으로 나타났다. 상기 세포를 96 웰 플레이트에 37 ℃, 5% CO₂에서 배양한 10%(v/v) FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(InVitrogen)을 함유하는 120 ㎕ 부피의 DMEM(Invitrogen)에서 15,000 세포/웰로 시딩하였다. 세포를 2% DMSO가 있는 M199 배지 중의 화합물 15 ㎕로 예비배양한 후 1 시간째에 15 ㎕ OSM 및 IL-1β로 촉발시켜 25 ng/㎖ OSM 및 1 ng/㎖ IL-1β에 도달하고, MMP13 수준을 촉발 후 48 시간째에 처리된 배지에서 측정하였다. MMP13 활성을 항체 포획 활성 분석을 사용하여 측정하였다. 이를 위해서, 384 웰 플레이트(NUNC, 460518, MaxiSorb black)를 4 ℃에서 24 시간 동안 1.5 ㎍/㎖ 항-인간 MMP13 항체(R&D Systems, MAB511) 35 ㎕로 코팅하였다. 상기 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 2 회 세척한 후에, 나머지 결합 부위를 4 ℃에서 24 시간 동안 PBS 중의 5% 무지방 분유(Santa Cruz, sc-2325, Blotto) 100 ㎕로 차단하였다. 이어서, 상기 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 2 회 세척하고 100 배 희석된 차단 완충액 중에 MMP13을 함유하는 배양 상등액의 1/10 희석액 35 ㎕를 가하고 실온에서 4 시간 동안 배양하였다. 이어서 상기 웰을 PBS + 0.05% 트윈으로 2 회 세척한 다음 1.5 mM 4-아미노페닐머큐릭 아세테이트(APMA)(Sigma, A9563) 용액 35 ㎕를 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하여 MMP13을 활성화시켰다. 상기 웰을 다시 PBS + 0.05% 트윈으로 세척하고 MMP13 기질(Biomol, P-126, OmniMMP 형광 기질) 35 ㎕를 가하였다. 37 ℃에서 24 시간 배양 후 상기 전환된 기질의 형광을 퍼킨 엘머 왈락 엔비젼(Perkin Elmer Wallac EnVision) 2102 다중표지 판독기(파장 여기: 320 ㎚, 파장 방출: 405 ㎚)에서 측정하였다.

억제 퍼센트 = ((비히클 존재 하에서 측정된 형광 - 시험 화합물이 존재하는 샘플에 대해 측정된 형광)/(비히클 존재 하에서 측정된 형광 - 촉발제 부재 샘플에 대해 측정된 형광)) x 100. 상기 데이터를 상기 분석으로부터의 평균 IC₅₀ ± 상기 평균의 표준 오차로서 나타낸다.

화합물의 MMP13 EC₅₀ 값
화합물 #	EC ₅₀ ( nM )
1	4196 ± 2370

실시예 2.3 PBL 증식 분석

인간 말초 혈액 림프구(PBL)를 IL-2로 자극하고 증식을 BrdU 결합 분석을 사용하여 측정하였다. 상기 PBL을 먼저 72 시간 동안 PHA로 자극하여 IL-2 수용체를 유도하고, 24 시간 동안 굶겨 세포증식을 중단시킨 다음 추가로 72 시간(24 시간 BrdU 표지화 포함) 동안 IL-2 자극하였다. 세포를 시험 화합물과 함께 1 시간 예비배양한 후에 IL-2를 첨가하였다. 세포를 10%(v/v) FBS를 함유하는 RPMI 1640 중에서 배양하였다.

실시예 2.4 전혈 분석( WBA )

2.4.1 IFNα 자극 프로토콜

생체 내에서 JAK1 또는 JAK2-의존성 신호전달 경로를 억제하는 시험 화합물의 효능을 예측하기 위해서, 생리학적으로 관련된 시험관 내 분석을 인간 전혈을 사용하여 개발하였다. 상기 WBA 분석에서, 사전동의를 구한 인간 지원자로부터 채혈한 혈액을 생체 외에서 화합물(1 시간)로 처리하고 후속적으로 인터페론 α(IFNα, JAK1 의존성 경로)로 30 분간 또는 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF, JAK2 의존성 경로)로 2 시간 동안 자극하였다.

2.4.1.1 포스포-STAT1 분석

IFNα 자극을 위해서, 백혈구 추출물 중의 IFNα에 의한 전사 1의 신호 전달자 및 활성화제(pSTAT1)의 인산화의 증가를 pSTAT1 ELISA 분석을 사용하여 측정하였다. 인터페론 알파(IFNα) 촉발 후 전사 1의 신호 전달자 및 활성화제(STAT1)의 인산화는 JAK1-매개된 사건이다. JAK1-의존성 신호전달 경로를 억제하는 화합물의 능력을 평가하기 위해, 세포 추출물 중의 포스포-STAT1 수준을 측정하는데 사용된 포스포-STAT1 분석을 개발하였다.

사전동의를 구한 인간 지원자로부터 채혈한 인간 전혈을 생체 외에서 화합물(1 시간)로 처리하고 IFNα로 30 분간 후속 자극하였다. 백혈구 추출물 중의 IFNα에 의한 STAT1의 인산화의 증가를 포스포-STAT1 ELISA를 사용하여 측정하였다.

ACK 용해 완충제는 0.15 M NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA로 이루어졌다. 상기 완충제의 pH는 7.3이었다.

10x 세포 용해 완충제 농축물(the PathScan Phospho-STAT1(Tyr701) 샌드위치 ELISA 키트의 일부, Cell Signaling으로부터)을 H₂O에서 10 배 희석하였다. 프로테이나제 억제제를 사용 전에 상기 완충제에 가하였다.

20 ㎍의 IFNα를 40 ㎕의 H₂O에 용해시켜 500 ㎍/㎖의 모액을 수득한다. 상기 모액을 -20 ℃에서 보관하였다.

상기 화합물의 일련의 3 배 희석물을 DMSO 중에서 제조하였다(최고 농도: 10 mM). 후속적으로, 상기 화합물을 배지에서 추가로 희석하였다(목적하는 최종 화합물 농도에 따른 희석 인자).

2.4.1.1.1 혈액과 화합물과의 배양 및 IFNα에 의한 자극

인간 혈액을 헤파린 처리된 튜브에 수집하였다. 상기 혈액을 392 ㎕의 분액들로 분할하였다. 그 후에, 4 ㎕의 화합물 희석물을 각 분액에 가하고 상기 혈액 샘플을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 IFNα 모액을 RPMI 배지에서 1000 배 희석하여 500 ng/㎖ 실험 용액을 수득하였다. 상기 500 ng/㎖ 실험 용액 중 4 ㎕를 상기 혈액 샘플에 가하였다(최종 농도 IFNα: 5 ng/㎖). 상기 샘플을 37 ℃에서 30 분간 배양하였다.

2.4.1.1.2 세포 추출물의 제조

상기 자극 기간의 끝에서, 7.6 ㎖의 ACK 완충제를 상기 혈액 샘플에 가하여 적혈구를 용해시켰다. 상기 튜브를 5 회 뒤집어 상기 샘플을 혼합하고 상기 반응물을 얼음 상에서 5 분간 배양하였다. 상기 RBC의 용해는 상기 배양 중 확실해야 한다. 상기 세포를 300 g, 4 ℃에서 7 분간 원심분리에 의해 펠릿화하고 상등액을 제거하였다. 10 ㎖의 1 x PBS를 각 튜브에 가하고 상기 세포 펠릿을 재현탁시켰다. 상기 샘플을 다시 300 g, 4 ℃에서 7 분간 원심분리시켰다. 상등액을 제거하고 펠릿을 500 ㎕의 1 x PBS에 재현탁시켰다. 이어서, 상기 세포 현탁액을 깨끗한 1.5 ㎖ 미세원심분리 튜브로 옮겼다. 상기 세포를 700 g, 4 ℃에서 5 분간 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 상기 상등액을 제거하고 펠릿을 150 ㎕의 세포 용해 완충제에 용해시켰다. 상기 샘플을 얼음 상에서 15 분간 배양하였다. 그 후에, 상기 샘플을 추가로 가공할 때까지 -80 ℃에서 보관하였다.

2.4.1.1.3 ELISA에 의한 STAT1 인산화의 측정

상기 패쓰스캔 포스포(Pathscan Phospho)-STAT1(Tyr701) 샌드위치 ELISA 키트(Cell Signaling)(Cat.n°:#7234)를 사용하여 포스포-STAT1 수준을 측정하였다.

상기 세포 추출물을 얼음 상에서 해동시켰다. 상기 튜브를 16,000 g, 4 ℃에서 5 분간 원심분리하고 등명해진 용해물을 수확하였다. 이러는 동안, 상기 키트로부터의 미세웰 스트립을 실온으로 평형화하고, 20 x 세척 완충제를 H₂O 중에서 희석하여 세척 완충제를 제조하였다. 샘플을 샘플 희석제 중에서 2 배 희석하고 100 ㎕를 상기 미세웰 스트립에 가하였다. 상기 스트립을 4 ℃에서 밤새 배양하였다.

다음날, 상기 웰을 세척 완충제로 3 회 세척하였다. 100 ㎕의 검출 항체를 상기 웰에 가하였다. 상기 스트립을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 이어서, 상기 웰을 세척 완충제로 다시 3 회 세척하였다. 100 ㎕의 HRP-결합된 2차 항체를 각 웰에 가하고 상기 샘플을 37 ℃에서 배양하였다. 30 분 후에, 상기 웰을 다시 3 회 세척하고 100 ㎕의 TMB 기질을 모든 웰에 가하였다. 샘플이 청색으로 변하면, 100 ㎕의 정지 용액을 가하여 상기 반응을 정지시켰다. 흡광도를 450 ㎚에서 측정하였다.

2.4.1.2 IL-8 ELISA

GM-CSF 자극을 위해서, 혈장 중 인터류킨-8(IL-8) 수준의 증가를 IL-8 ELISA 분석을 사용하여 측정한다. 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF) - 유도된 인터류킨 8(IL-8) 발현은 JAK2-매개된 사건이다. IL-8 ELISA(혈장 샘플 중 IL-8 수준의 측정에 사용할 수 있다)를 JAK2-의존성 신호전달 경로를 억제하는 화합물의 능력을 평가하기 위해 개발하였다.

사전동의를 구한 인간 지원자로부터 채혈한 인간 전혈을 생체 외에서 화합물(1 시간)로 처리하고 GM-CSF로 2 시간 동안 후속 자극하였다. 혈장 중의 IL-8 수준의 증가를 IL-8 ELISA를 사용하여 측정하였다.

10 ㎍의 GM-CSF를 100 ㎕의 H₂O에 용해시켜 100 ㎍/㎖의 모액을 수득한다. 상기 모액을 -20 ℃에서 보관하였다.

상기 시험 화합물의 일련의 3 배 희석물을 DMSO 중에서 제조하였다(최고 농도: 10 mM). 후속적으로, 상기 화합물을 배지에서 추가로 희석하였다(목적하는 최종 화합물 농도에 따른 희석 인자).

2.4.1.2.1 혈액과 화합물과의 배양 및 GM-CSF에 의한 자극

인간 혈액을 헤파린 처리된 튜브에 수집하였다. 상기 혈액을 245 ㎕의 분액들로 분할하였다. 그 후에, 2.5 ㎕의 시험 화합물 희석물을 각 분액에 가하고 상기 혈액 샘플을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 GM-CSF 모액을 RPMI 배지에서 100 배 희석하여 1 ㎍/㎖ 실험 용액을 수득하였다. 상기 1 ㎍/㎖ 실험 용액 중 2.5 ㎕를 상기 혈액 샘플에 가하였다(최종 농도 GM-CSF: 10 ng/㎖). 상기 샘플을 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다.

2.4.1.2.2 혈장 샘플의 제조

상기 샘플을 1,000 g, 4 ℃에서 15 분간 원심분리시켰다. 상기 혈장 100 ㎕를 수확하고 추가 사용시까지 -80 ℃에서 보관하였다.

2.4.1.2.3 ELISA에 의한 IL-8 수준의 측정

인간 IL-8 화학발광 면역분석 키트(R&D Systems(Cat.n°:Q8000B))를 사용하여 IL-8 수준을 측정하였다.

10x 세척 완충제를 H₂O에서 희석하여 세척 완충제를 제조하였다. 실험용 글로(glo) 시약을, 사용 전 15 분 내지 4 시간째에 1 부의 글로 시약 1을 2 부의 글로 시약 B에 첨가함으로써 제조하였다. 100 ㎕의 분석 희석제 RD1-86을 각 웰에 가한다. 그 후에, 50 ㎕의 샘플(혈장)을 가하였다. 상기 ELISA 플레이트를 실온, 500 rpm에서 2 시간 동안 배양하였다. 모든 웰을 세척 완충제로 4 회 세척하고 200 ㎕의 IL-8 접합체를 각 웰에 가하였다. 실온에서 3 시간 동안 배양 후에, 상기 웰들을 세척 완충제로 4 회 세척하고 100 ㎕의 실험 글로 시약을 각 웰에 가하였다. 상기 ELISA 플레이트를 실온에서 5 분간 배양하였다(빛으로부터 보호함). 발광을 측정하였다(0.5 s/웰 판독 시간).

2.4.1.3 결과

pSTAT1 수준의 INFα 유도된 증가를 억제하기 위한 화합물 1의 pIC₅₀은 6.32±0.07(SEM)인 반면, IL-8의 GM-CSF 유도된 증가의 억제를 위한 pIC₅₀은 4.87±0.13(SEM)이었다(6 명의 혈액 공여자를 사용하여 획득된 값). 이는 화합물 1이 상기 JAK2 경로에 대해 JAK1 경로에 28 배 더 선택성임을 입증한다. 따라서, 세포 환경에서 화합물 1이 JAK2에 비해 JAK1에 대해 선택성을 나타냄은 분명하다. 화합물 1은 공지된 구조적으로 관련된 화합물, 또는 다른 공지된 JAK 억제제에 비해 JAK2보다 JAK1에 대해 더 큰 선택성을 나타내는 것으로 보인다.

2.4.1.3 데이터 치유 처리 및 결과

상기 결과를 더욱 상세히 논하기 위해서, 세포 추출물에서 IFNα에 의한 포스포STAT1 유도의 억제 또는 혈장에서 GM-CSF에 의한 IL-8 유도의 억제를 상기 화합물 농도에 대해 플롯팅하고 IC₅₀ 값을 그래프패드(Graphpad) 소프트웨어를 사용하여 유도하였다. R²가 0.8보다 크고 언덕 기울기가 3보다 작은 경우 데이터를 유지하였으며 상기 두 분석 모두에 대해서 오직 타당한 데이터가 획득된 공여자만을 유지하였다.

예를 들어, 상기 추가의 데이터 분석 프로토콜에 따라, pSTAT1 수준의 INFα 유도된 증가를 억제하기 위한 화합물 1의 측정된 pIC₅₀은 6.21±0.09(SEM)인 반면, IL-8의 GM-CSF 유도된 증가의 억제를 위한 pIC₅₀은 4.97±0.14(SEM)이었다(6 명의 혈액 공여자를 사용하여 획득된 값). 이는 화합물 1이 상기 JAK2 경로에 대해 JAK1 경로에 17.6 배 더 선택성임을 입증한다. 따라서, 세포 환경에서 화합물 1이 JAK2에 비해 JAK1에 대해 선택성을 나타냄은 분명하다. 화합물 1은 공지된 구조적으로 관련된 화합물, 또는 다른 공지된 JAK 억제제에 비해 JAK2보다 JAK1에 대해 더 큰 선택성을 나타내는 것으로 보인다.

2.4.2 IL6-자극 프로토콜

또한, 인간 전혈을 사용하여 유식 세포측정 분석을 수행하여 생체 외에서 JAK2 화합물 선택성에 대해 JAK1을 확립시켰다. 따라서, 서면동의를 구한 인간 지원자로부터 혈액을 채혈하였다. 이어서 혈액을 서서히 흔들면서 37 ℃에서 30 분간 평형화하고, 이어서 에펜도르프 튜브에 분액화하였다. 화합물을 상이한 농도로 가하고 서서히 흔들면서 37 ℃에서 30 분간 배양하고, 후속적으로 JAK1-의존성 경로 자극의 경우 인터류킨(IL-6)으로 또는 JAK2-의존성 경로 자극의 경우 GM-CSF로, 서서히 흔들면서 37 ℃에서 20 분간 자극하였다. 이어서 포스포-STAT1 및 포스포-STAT5를 FACS 분석을 사용하여 평가하였다.

2.4.2.1 포스포-STAT1 분석

백혈구 중의 전사 1의 신호 전달자 및 활성화제(pSTAT1) 인산화의 IL-6-자극된 증가를 위해서, 서면동의를 구한 인간 지원자로부터 채혈된 인간 전혈을 생체 외에서 상기 화합물로 30 분간 처리하고 후속적으로 IL-6으로 20 분간 자극하였다. 림프구 중에서 IL-6에 의한 STAT1의 인산화의 증가를, FACS에 의해 항 포스포-STAT1 항체를 사용하여 측정하였다.

5X 라이스/픽스(Lyse/Fix) 완충제(BD PhosFlow, Cat.N°558049)를 증류수로 5 배 희석하고 37 ℃에서 예온하였다. 나머지 희석된 라이스/픽스 완충제는 버렸다.

10 ㎍의 rhIL-6(R&D Systems, Cat N°206-IL)을 1 ㎖의 PBS 0.1% BSA에 용해시켜 10 ㎍/㎖의 모액을 수득하였다. 상기 모액을 분액화하고 -80 ℃에서 보관하였다.

상기 화합물의 일련의 3배 희석물을 DMSO(10 mM 모액) 중에서 제조하엿다. 대조군 처리된 샘플은 화합물 대신에 DMSO를 수용하였다. 모든 샘플들을 1% 최종 DMSO 농도로 배양하였다.

2.4.2.1.1 혈액과 화합물과의 배양 및 IL-6에 의한 자극

인간 혈액을 헤파린 처리된 튜브에 수집하였다. 상기 혈액을 148.5 ㎕의 분액들로 분할하였다. 이어서, 1.5 ㎕의 시험 화합물 희석물을 각 혈액 분액에 가하고 상기 혈액 샘플을 서서히 흔들면서 37 ℃에서 30 분간 배양하였다. IL-6 모액(1.5 ㎕)을 상기 혈액 샘플(최종 농도 10 ng/㎖)에 가하고 샘플들을 서서히 흔들면서 37 ℃에서 20 분간 배양하였다.

2.4.2.1.2 백혈구 제조 및 CD4 표지화

상기 자극 기간의 끝에서, 3 ㎖의 1X 예온된 라이스/픽스 완충제를 상기 혈액 샘플에 바로 가하고, 적혈구를 용해시키고 백혈구를 고정시키기 위해서 간단히 와동시키고 수욕에서 37 ℃에서 15 분간 배양하고, 이어서 추가로 사용할 때까지 -80 ℃에서 동결시켰다.

다음 단계를 위해, 튜브를 대략 20 분간 37 ℃에서 해동시키고 4 ℃, 400xg에서 5 분간 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 3 ㎖의 저온 1X PBS로 세척하고, 원심분리 후에 상기 세포 펠릿을 3% BSA를 함유하는 PBS 100 ㎕에 재현탁시켰다. FITC-접합된 항-CD4 항체 또는 대조용 FITC-접합된 아이소타입 항체를 가하고 암실에서 실온에서 20 분간 배양하였다.

2.4.2.1.3 세포 투과화(permeabilization) 및 항 포스포-STAT1 항체에 의한 표지화

세포를 1X PBS로 세척한 후에, 세포 펠릿을 100 ㎕의 빙냉 1XPBS에 재현탁시키고 900 ㎕의 빙냉 100% 메탄올을 가하였다. 이어서 세포를 4 ℃에서 30 분간 투과화를 위해 배양하였다.

이어서 투과화된 세포를 3% BSA를 함유하는 1XPBS로 세척하고 최종적으로 3% BSA를 함유하는 1X PBX 80 ㎕에 재현탁시켰다.

20 ㎕의 PE 마우스 항-STAT1(pY701) 또는 PE 마우스 IgG2aκ 아이소타입 대조용 항체(BD Bioscience, 각각 Cat. N°612564 및 559319)를 가하고 혼합하고, 이어서 암실에서 4 ℃에서 30 분간 배양하였다.

이어서 세포를 1X PBS로 1 회 세척하고 FACSCanto II 유식 세포계(BD Biosciences) 상에서 분석하였다.

2.4.2.1.4 FACSanto II 상에서 형광 분석

50,000 회의 전체 사건을 카운트하고 포스포-STAT1 양성 세포를, 림프구 게이트에서 CD4+ 세포 상에서 게이트 조절 후에 측정하였다. 데이터를 FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 분석하고 IL-6 자극의 억제 백분율을 CD4+ 세포 상의 포스포-STAT1에 대한 양성 세포의 백분율에 대해 계산하였다.

2.4.2.2 포스포-STAT5 분석

백혈구 중의 전사 5의 신호 전달자 및 활성화제(pSTAT5) 인산화의 GM-CSF-자극된 증가를 위해서, 서면동의를 구한 인간 지원자로부터 채혈된 인간 전혈을 생체 외에서 상기 화합물로 30 분간 처리하고 후속적으로 GM-CSF로 20 분간 자극하였다. 단핵구 중에서 GM-CSF에 의한 STAT5의 인산화의 증가를, FACS에 의해 항 포스포-STAT5 항체를 사용하여 측정하였다.

5X 라이스/픽스 완충제(BD PhosFlow, Cat.N°558049)를 증류수로 5 배 희석하고 37 ℃에서 예온하였다. 나머지 희석된 라이스/픽스 완충제는 버렸다.

10 ㎍의 rhGM-CSF(AbCys S.A., Cat N°P300-03)를 100 ㎕의 PBS 0.1% BSA에 용해시켜 100 ㎍/㎖의 모액을 수득하였다. 상기 모액을 분액화하고 -80 ℃에서 보관하였다.

2.4.2.2.1 혈액과 화합물과의 배양 및 GM-CSF에 의한 자극

인간 혈액을 헤파린 처리된 튜브에 수집하였다. 상기 혈액을 148.5 ㎕의 분액들로 분할하였다. 이어서, 1.5 ㎕의 화합물 희석물을 각 분액에 가하고 상기 혈액 샘플을 서서히 흔들면서 37 ℃에서 30 분간 배양하였다. GM-CSF 모액(1.5 ㎕)을 상기 혈액 샘플(최종 농도 20 pg/㎖)에 가하고 샘플들을 서서히 흔들면서 37 ℃에서 20 분간 배양하였다.

2.4.2.2.2 백혈구 제조 및 CD4 표지화

다음 단계를 위해, 튜브를 대략 20 분간 37 ℃에서 해동시키고 4 ℃, 400xg에서 5 분간 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 3 ㎖의 저온 1X PBS로 세척하고, 원심분리 후에 상기 세포 펠릿을 3% BSA를 함유하는 PBS 100 ㎕에 재현탁시켰다. FITC 마우스 항-CD14 항체(BD Biosciences, Cat.N°345784) 또는 대조용 FITC 마우스 IgG2bκ 아이소타입 항체(BD Biosciences, Cat.N°555057)를 가하고 암실에서 실온에서 20 분간 배양하였다.

2.4.2.2.3 세포 투과화 및 항 포스포-STAT1 항체에 의한 표지화

세포를 1X PBS로 세척한 후에, 세포 펠릿을 100 ㎕의 빙냉 1X PBS에 재현탁시키고 900 ㎕의 빙냉 100% 메탄올을 가하였다. 이어서 세포를 4 ℃에서 30 분간 투과화를 위해 배양하였다.

20 ㎕의 PE 마우스 항-STAT5(pY694) 또는 PE 마우스 IgG1κ 아이소타입 대조용 항체(BD Bioscience, 각각 Cat. N°612567 및 554680)를 가하고 혼합하고, 이어서 암실에서 4 ℃에서 30 분간 배양하였다.

2.4.2.2.4 FACSanto II 상에서 형광 분석

50,000 회의 전체 사건을 카운트하고 포스포-STAT5 양성 세포를 CD14+ 세포 상에서 게이트 조절 후에 측정하였다. 데이터를 FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 분석하며 이는 CD14+ 세포 상의 포스포-STAT5에 대한 양성 세포의 백분율에 대해 계산된 GM-CSF 자극의 억제 백분율에 상응한다.

2.4.2.3 결과

상기 프로토콜에 따를 때, 3 명의 건강한 지원자들의 평균으로부터 획득한 억제 백분율(PIN)을 본 발명의 화합물에 대해 측정하였다. 예를 들어, 화합물 1을 시험하였으며 이는 STAT1 인산화의 억제에서 pIC₅₀ = 6.61 및 STAT5 인산화의 억제에서 pIC₅₀ = 5.37로 복귀하였다.

STAT1(JAK1-의존성 경로) 및 STAT5(JAK2-의존성 경로)에 대한 화합물 1의 영향을 비교할 때, JAK1 대 JAK2에 대해 17.6 배 선택성이 측정되었다.

실시예 3. 생체 내 모델

실시예 3.1 CIA 모델

3.1.1 물질

완전 프로인트 항원보강제(CFA) 및 불완전 프로인트 항원보강제(IFA)를 디프코(Difco)로부터 구입하였다. 소 콜라겐 유형 II(CII), 리포폴리사카라이드(LPS), 및 엔브렐(Enbrel)을 각각 콘드렉스(Chondrex)(Isle d'Abeau, France); 시그마( Sigma)(P4252, L'Isle d'Abeau, France), 와이예트(Whyett)(25 ㎎ 주사가능한 주사기, France), 아크로스 오가닉스(Acros Organics)(Palo Alto, CA)로부터 수득하였다. 사용된 다른 모든 시약들은 시약 등급이며 모든 용매는 분석 등급을 가졌다.

3.1.2 동물

다크 아구티 래트(수컷, 7 내지 8 주된 것)를 할란 레보라토리즈(Harlan Laboratories)(Maison-Alfort, France)로부터 수득한다. DBA/1J 마우스(수컷, 7 주된 것)를 장비에(Centre d'Elevage et de Reproduction JANVIER)(CERJ)(Laval, France)로부터 얻었다. 래트를 12 시간 명/암 주기(0700-1900)로 유지시켰다. 온도를 22 ℃에서 유지시키고, 음식과 물을 임의로 제공하였다.

3.1.3 콜라겐 유발시킨 관절염(CIA)

실험 하루 전에, CII 용액(2 ㎎/㎖)을 0.05M 아세트산으로 제조하고 4 ℃에서 보관하였다. 면역화 직전에, 동 분량의 항원보강제(IFA) 및 CII를 빙수 욕에서 예냉된 유리병 중에서 균질화기에 의해 혼합하였다. 유화액이 형성되지 않는 경우 여분의 항원보강제 및 연장된 균질화가 필요할 수도 있다.

마우스: 0.1 ㎖의 상기 유화액을 1일째에 각 마우스의 꼬리 맨 아랫부분에 피 내 주사하고, 2차 추가접종 피 내 주사(CFA 0.1 ㎖ 염수 중의 CII 용액 1 ㎎/㎖)를 21일째에 수행하였다. 상기 면역화 방법을 공개된 방법들로부터 변형시켰다(David D Brand Kary A Latham, & Edward F Rosloniec. Collagen-induced arthritis. Nature Methods 2(5):1269-1275, 2007).

래트: 0.2 ㎖의 상기 유화액을 1일째에 각 래트의 꼬리 맨 아랫부분에 피 내 주사하고, 2차 추가접종 피 내 주사(CFA 0.1 ㎖ 염수 중의 CII 용액 2 ㎎/㎖)를 9일째에 수행하였다. 상기 면역화 방법을 공개된 방법들로부터 변형시킨다(Sims NA et al., (2004) 졸레드로닉산에 의한 파골세포 표적화는 콜라겐-유발시킨 관절염에서 골 파괴를 방지한다, Arthritis Rheum. 50 2338-2346; Jou et al., 2005).

3.1.4 연구 디자인

시험 화합물의 치료 효과를 래트 또는 마우스 CIA 모델에서 시험하였다. 동물들을 동등한 그룹으로 랜덤하게 나누고 각 그룹에 10 마래의 동물을 포함시켰다. 모든 래트를 1일째에 면역화하고 9일째에 추가접종하였다. 모든 마우스를 1일째에 면역화하고 21일째에 추가접종하였다. 치료 투여를 16일부터 30일까지 지속시켰다. 음성 대조군을 비히클(MC 0.5%)로 처리하고 양성 대조군은 엔브렐(10 ㎎/㎏, 3x주, s.c.)로 처리하였다. 관심 화합물들을 전형적으로 3 회 용량, 예를 들어 3, 10, 30 ㎎/㎏, p.o로 시험하였다.

3.1.5 관절염의 임상 평가

관절염을 문헌[Khachigian 2006, Lin et al 2007] 및 [Nishida et al. 2004]의 방법에 따라 기록하였다. 4 개의 각 앞발의 종창을 하기와 같은 관절염 점수로 순위를 매겼다: 0 - 증상 없음; 1 - 관절, 예를 들어 발목 또는 손목의 한 가지 유형의 순하지만, 뚜렷한 발적 및 종창, 또는 감염된 손 발가락의 수와 상관없이, 개별적인 손 발가락으로 제한된 명백한 발적 및 종창; 2 - 관절의 2 가지 이상 유형의 보통의 발적 및 종창; 3 - 손 발가락을 포함한 전체 발의 심한 발적 및 종창; 4 - 다수의 관절을 포함한 최대로 염증을 일으킨 사지(동물당 최대의 누적 임상 관절염 점수 16)(Nishida et al., 2004).

수회 연구의 메타-분석을 허용하기 위해서, 상기 임상 점수 값들을 하기와 같이 표준화하였다:

임상 점수의 AUC(AUC 점수): 제1일부터 제14일까지 상기 곡선 아래 면적(AUC)을 각각의 개별적인 래트로부터 계산하였다. 각 동물의 AUC를, 상기 동물에 대한 데이터가 획득된 연구에서 비히클에 대해 획득된 평균 AUC로 나누고 100을 곱하였다(즉 상기 AUC를 연구에 따른 평균 비히클 AUC의 백분율로서 나타내었다).

제1일부터 제14일(종점 점수)까지의 임상 점수 증가: 각 동물에 대한 임상 점수 차이를, 상기 동물에 대한 데이터가 획득된 연구에서 비히클에 대해 획득된 평균 임상 점수 차이로 나누고 100을 곱하였다(즉 상기 차이를 연구에 따른 상기 비히클에 대한 평균 임상 점수 차이의 백분율로서 나타내었다).

3.1.6 관절염 발병 후 체중 변화(%)

임상적으로, 체중 손실은 관절염과 관련이 있다(Shelton et al., 2005; Argiles et al., 1998; Rall, 2004; Walsmith et al., 2004). 따라서, 관절염 발병 후 체중 변화를 상기 래트 모델에서 치료 효과를 평가하기 위한 불특정 종점으로서 사용할 수 있다. 상기 관절염 발병 후 체중 변화(%)를 하기와 같이 계산하였다:

마우스: (체중_(6주) - 체중_(5주))/체중_(5주) x 100%

래트: (체중_(4주) - 체중_(3주))/체중_(3주) x 100%

3.1.7 라슨(Larsen) 점수:

사후, 모든 래트의 2 개의 양 뒷발에 대한 라슨 점수가 2 명 이상의 과학자에 의해 유도되었다. 상기 점수의 평균을 계산하여 래트 당 하나의 라슨 점수를 구하였다. 상기 라슨 점수의 연구 간 비교를 위해서, 상기 각 래트의 라슨 점수를 상기 래트가 속한 연구에서 비히클에 대해 획득한 평균 라슨 점수로 나누고 100을 곱하였다(즉 상기 라슨 점수를 연구 당 평균 비히클 라슨 점수의 백분율로서 나타낸다). 상기 상이한 처리 그룹들의 평균 라슨 점수를 계산하고 비교하였다.

3.1.8 방사선학

X-선 사진을 각각의 개별적인 동물의 뒷발로부터 촬영하였다. 랜덤한 블라인드 확인 번호를 각 사진에 할당하고, 골 미란의 중증도를 하기와 같이 방사선학적 라르센 득점 시스템을 사용한 2 개의 독립적인 점수에 의해 등급을 매겼다: 0 - 완전한 골 윤곽과 정상적인 관절 공간을 갖는 정상적인 상태; 1 - 임의의 하나 또는 2 개의 가벼운 골 미란을 나타내는 외부 척골을 갖는 약간 비정상적인 상태; 2 - 임의의 3 내지 5 개의 골 미란을 나타내는 외부 척골을 갖는 뚜렷한 초기 비정상적인 상태; 3 - 임의의 하나 또는 2 개의 뚜렷한 골 미란을 나타내는 외부 척골뿐만 아니라 모든 외부 척골을 갖는 중간 파괴적인 비정상 상태; 4 - 뚜렷한 골 미란을 나타내는 모든 척골 및 하나 이상의 완전히 미란되어 부분적으로 보존된 일부 골 관절 윤곽을 남기는 내부 척골 관절을 갖는 중증의 파괴적인 비정상 상태; 5 - 골 윤곽이 없는 절단 비정상 상태. 상기 득점 시스템은 문헌[Salvemini et al., 2001; Bush et al., 2002; Sims et al., 2004; Jou et al., 2005]의 변형이다.

3.1.9 조직학

방사선학 분석 후, 마우스의 뒷발을 10% 포스페이트-완충된 포르말린(pH 7.4)에 고정시키고, 미세 조직학을 위해 빠른 골 칼슘제거제(Laboratories Eurobio)로 칼슘을 제거하고 파라핀에 묻었다. 상기 관절염 관절의 광범위한 평가를 확실히 하기 위해서, 4 개 이상의 일련의 구획(5 ㎛ 두께)을 절단하고 일련의 각 구획들의 사이를 100 ㎛로 하였다. 상기 구획들을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 활액 염증 및 뼈 및 연골 손상에 대한 조직학적 검사를 이중 맹검법으로 수행하였다. 각각의 발에서, 4 개의 매개변수를 4-점 등급으로 평가하였다. 상기 매개변수들은 세포 침윤, 판누스 중증도, 연골 미란 및 골 미란이었다. 득점을 하기와 같이 수행하였다: 1 - 정상, 2 - 순함, 3 - 보통, 4 - 현저함. 이들 4 개의 점수를 합산하고 추가적인 점수, 즉 'RA 총점'으로 나타내었다. 상기 조직학 정보판독의 연구간 비교를 위해서, 상기 각 래트의 전체 조직학 점수를 상기 래트가 속한 연구에서 비히클에 대해 획득한 평균 전체 조직학 점수로 나누고 100을 곱하였다(즉 상기 전체 조직학 점수를 연구 당 평균 비히클 전체 조직학 점수의 백분율로서 나타낸다). 상기 상이한 처리 그룹들의 평균 전체 조직학 점수를 계산하고 비교하였다.

3.1.10 종골(발꿈치 뼈)의 미세 컴퓨터 단층촬영(μCT) 분석

RA에서 관찰된 골 퇴화는 특히 겉질 뼈에서 발생하며 μCT 분석에 의해 밝힐 수 있다(Sims NA et al., 2004; Oste L et al., ECTC Montreal 2007). 상기 종골의 스캐닝 및 3D 재건 후에, 골 퇴화를 상기 뼈의 종 방향 축에 수직으로 인실리코 단리한, 슬라이드당 존재하는 구별되는 물체의 수로서 측정하였다. 퇴화된 뼈가 많을수록, 측정되는 구별되는 물체가 많다. 상기 종골을 따라 고르게 분포된(약 10.8 ㎛로 이격됨) 1000 개의 슬라이스를 분석한다.

3.1.11 결과

화합물 1을 마우스 CIA 연구에서 30 ㎎/㎏ 및 래트 CIA 연구에서 30, 10, 3 및 1 ㎎/㎏으로 시험하였다. 화합물 1은 상기 래트 CIA 연구에서 수행된 모든 정보판독에서 효능이 있었으며, 상기 정보판독 중 여러 개에서 통계학적 유의수준을 갖는다, 특히 하기에 대해 현저한 개선이 나타났다: 상기 임상 점수(10 ㎎/㎏으로부터), 종점 임상 점수(1 ㎎/㎏으로부터), 라슨 점수(30 ㎎/㎏으로부터) 및 앞발 팽창(1 ㎎/㎏)으로부터의 AUC.

실시예 3.2 패혈증 쇼크 모델

리포폴리사카라이드(LPS)의 주사는 용해성 종양 괴사 인자(TNF-α)의 말초 혈관 내로의 빠른 방출을 유도한다. 상기 모델을 사용하여 생체 내 TNF 방출의 가망 있는 차단제들을 분석한다.

그룹당 6 마리의 BALB/cJ 암컷 마우스(20 g)를 1 회 목적하는 용량으로 처리한다, po. 30 분 후에, LPS(15 ㎍/㎏; 이 콜라이 혈청형 0111:B4)를 ip 주사한다. 90 분 후에, 마우스를 안락사시키고 채혈한다. 순환하는 TNF 알파 수준을 상업적으로 입수할 수 있는 ELISA 키트를 사용하여 측정한다. 덱사메타손(5 ㎍/㎏)을 표준 소염 화합물로서 사용한다. 선택된 화합물들을 1 회 또는 수 회 용량, 예를 들어 3 및/또는 10 및/또는 30 ㎎/㎏, po에서 시험한다.

화합물 1은 30 ㎎/㎏, po에서 통계학적으로 유의수준의 TNF 방출 감소(>50%)를 나타내었다.

실시예 3.3 MAB 모델

상기 MAB 모델은 치료제에 의한 RA-형 염증 반응의 변화에 대한 빠른 평가를 허용한다(Kachigian LM. Nature Protocols(2006) 2512-2516: 콜라겐 항체-유발된 관절염). DBA/J 마우스에게 콜라겐 II에 대한 mAb의 칵테일을 iv 주사하였다. 1일 후에, 화합물 처리를 개시하였다(비히클: 10% (v/v) HPβCD). 3일 후에, 마우스에게 LPS(50 ㎍/마우스)를 ip 주사하여, 염증을 빨리 발병시켰다. 상기 mAb 주사 후 10일까지 화합물 처리를 계속하였다. 앞발 종창을 측정하고 각 발의 임상 점수를 기록하여 염증을 판독하였다. 사지의 누적된 임상 관절염 점수로 염증의 중증도를 나타내었다. 득점 시스템을 0 내지 4의 등급으로 각 수족에 적용하며, 이때 4는 가장 심한 염증이다.

0 증상 없음

1 관절, 예를 들어 발목 또는 손목의 한 가지 유형의 순하지만, 뚜렷한 발적 및 종창, 또는 감염된 손 발가락의 수와 상관없이, 개별적인 손 발가락으로 제한된 명백한 발적 및 종창

2 관절의 2 가지 이상 유형의 보통의 발적 및 종창

3 손 발가락을 포함한 전체 발의 심한 발적 및 종창

4 다수의 관절을 포함한 최대로 염증을 일으킨 사지.

실시예 3.4 종양학 모델

JAK2-유발된 골수증식성 질병에 대한 소 분자들의 효능을 확인하기 위한 시험관 내 및 생체 내 모델이 문헌[Wernig et al. Cancer Cell 13, 311, 2008] 및 [Geron et al. Cancer Cell 13, 321, 2008]에 개시되어 있다.

실시예 3.5 마우스 IBD 모델

IBD에 대한 소 분자들의 효능을 확인하기 위한 시험관 내 및 생체 내 모델이 문헌[Wirtz et al. 2007]에 개시되어 있다.

실시예 3.6 마우스 천식 모델

천식에 대한 소 분자들의 효능을 확인하기 위한 시험관 내 및 생체 내 모델이 문헌[Nials et al., 2008; Ip et al. 2006; Pernis et al., 2002; Kudlacz et al., 2008]에 개시되어 있다.

실시예 4: 독성, DMPK 및 안전성 모델

실시예 4.1 열역학적 용해도

시험 화합물 1 ㎎/㎖의 용액을 유리 바이알 중에서 실온에서 0.2M 포스페이트 완충액 pH 7.4 또는 0.1M 시트레이트 완충액 pH 3.0 중에서 제조한다.

상기 샘플을 실온에서 24 시간 동안 3.0의 속도로 로테이터(Rotator) 구동 STR 4(Stuart Scientific, Bibby)에서 회전시킨다.

24 시간 후에, 상기 샘플 800 ㎕를 에펜도르프 튜브로 옮기고 14000 rpm에서 5 분간 원심분리한다. 이어서 상기 샘플의 상등액 200 ㎕를 멀티스크린R 용해도 플레이트(Millipore, MSSLBPC50)로 옮기고 상기 상등액을 진공 다기관의 도움으로 깨끗한 그레이너(Greiner) 폴리프로필렌 V-바닥 96 웰 플레이트(Cat no. 651201) 내로 여과한다(10 내지 12" Hg). 상기 여액 5 ㎕를 상기 사용된 것과 동일한 완충액 95 ㎕(F20)로 희석하여 표준 곡선을 포함하는 플레이트에서 배양한다(Greiner, Cat no. 651201).

상기 화합물에 대한 표준 곡선을 DMSO(500 μM) 중의 10 mM DMSO 모액 희석된 인자 2로부터 출발하고 이어서 DMSO 중에서 19.5 μM까지 추가로 희석하여 DMSO 중에서 새로 작성한다. 이어서 5000 μM로부터의 일련의 희석액 3 ㎕를 97 ㎕의 아세토나이트릴-완충액 혼합물(50/50)로 옮긴다. 최종 농도 범위는 2.5 내지 150 μM이었다.

상기 플레이트를 밀봉 매트(MA96RD-04S, www.kinesis.co.kr)로 밀봉하고 샘플들을 콴옵티마이즈(Quanoptimize)를 사용하여 최적화된 조건 하에 LCMS(Waters로부터 ZQ 1525) 상에서 실온에서 측정하여 상기 분자의 적합한 질량을 측정한다.

상기 샘플들을 1 ㎖/분의 유속으로 LCMS 상에서 분석한다. 용매 A는 15 mM 암모니아이고 용매 B는 아세토나이트릴이다. 상기 샘플을 XBridge C18 3.5 μM(2.1 x 30 ㎜) 컬럼(Waters로부터) 상에서 양 이온 분무 하에 실행한다. 용매 구배는 2 분의 총 실행 시간을 가지며 5% B에서부터 95% B의 범위이다.

피크 면적을 Masslynx 소프트웨어 패키지의 도움으로 분석하고 상기 샘플들의 피크 면적을 상기 표준 곡선에 대해 플롯팅하여 상기 화합물의 용해도를 획득한다.

용해도 값을 μM 또는 ㎍/㎖로 기록한다.

실시예 4.2 수용해도

DMSO 중에서 10 mM 모액으로부터 출발하여, 상기 화합물의 일련의 희석액을 DMSO 중에서 제조한다. 상기 일련의 희석액을 96 NUNC Maxisorb 플레이트 F-바닥(Cat no. 442404)으로 옮기고 실온에서 0.2M 포스페이트 완충액 pH 7.4 또는 0.1M 시트레이트 완충액 pH 3.0을 가한다.

최종 농도는 5 회의 동등한 희석 단계로 200 μM에서부터 2.5 μM까지의 범위이다. 최종 DMSO 농도는 2%를 초과하지 않는다. 200 μM 파이렌을 상기 각각의 96 웰 플레이트의 모서리 점들에 가하며 이는 현미경 상에서 Z-축의 눈금화를 위한 기준 점으로서 작용한다.

상기 분석 플레이트를 밀봉하고 230 rpm에서 진탕하면서 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. 이어서 상기 플레이트를 백색광 현미경 하에서 스캐닝하여, 농도당 침전물의 개별적인 그림을 제공한다. 상기 침전물을 분석하고 이를 그래프 상에 플롯팅된 숫자로 전환하였다. 상기 화합물이 완전히 용해된 것으로 보이는 첫 번째 농도를 기록하나, 진정한 농도는 상기 농도와 더 높은 하나의 희석 단계 사이의 어딘 가에 놓인다.

용해도 값을 ㎍/㎖로 기록한다.

실시예 4.3 혈장 단백질 결합(평형 투석)

DMSO 중의 10 mM 화합물 모액을 DMSO 중에서 인자 5로 희석한다. 상기 용액을 새로 해동된 인간, 래트, 마우스 또는 개 혈장(BioReclamation INC) 중에서 10 μM의 최종 농도 및 0.5%의 최종 DMSO 농도(PP-Masterblock 95 웰(Greiner, Cat no. 780285) 중의 1094.5 ㎕ 혈장 중 5.5 ㎕)로 추가 희석한다.

삽입물을 갖는 피어스 레드 디바이스(Pierce Red Device) 플레이트(ThermoScientific, Cat no. 89809)를 제조하고 완충액 챔버 중의 PBS 750 ㎕ 및 혈장 챔버 중의 상기 첨가된(spiked) 혈장 500 ㎕로 채운다. 상기 플레이트를 230 rpm에서 진탕하면서 37 ℃에서 4 시간 동안 배양한다. 배양 후, 상기 두 챔버 모두의 120 ㎕를 96-웰 환저, PP 깊은-웰 플레이트(Nunc, Cat no. 278743) 중의 360 ㎕ 아세토나이트릴로 옮기고 알루미늄 호일 뚜껑으로 밀봉한다. 상기 샘플들을 혼합하고 30 분간 얼음 상에 둔다. 이어서 상기 플레이트를 4 ℃에서 1200 rcf에서 30 분 원심분리하고 상등액을 LCMS 상에서 분석을 위해 96 v-바닥 PP 플레이트(Greiner, 651201)로 옮긴다.

상기 플레이트를 www.kinesis.co.uk의 밀봉 매트(MA96RD-04S)로 밀봉하고 샘플들을 콴옵티마이즈를 사용하여 최적화된 조건 하에 LCMS(Waters로부터 ZQ 1525) 상에서 실온에서 측정하여 상기 분자의 적합한 질량을 측정한다.

상기 완충액 챔버 및 혈장 챔버 중의 상기 화합물로부터의 피크 면적은 100% 화합물인 것으로 간주한다. 혈장에 결합된 퍼센트를 상기 결과로부터 획득하고 이를 혈장에 결합된 퍼센트로서 LIMS에 보고한다.

PBS에 대한 최종 시험 농도의 화합물의 용해도를 현미경으로 검사하며 이는 침전의 관측 유무를 나타낸다.

실시예 4.4 QT 연장을 위한 의무

QT 연장에 대한 가능성을 hERG 패치 클램프 분석에서 평가한다.

4.4.1 통상적인 전-세포 패치-클램프

전-세포 패치-클램프 기록을 펄스(Pulse) v8.77 소프트웨어(HEKA)에 의해 조절되는 EPC10 증폭기를 사용하여 수행한다. 일련의 저항은 전형적으로는 10 MΩ 미만이고 60% 초과까지 보정되며, 기록들을 누락하지 않는다. 전극은 GC150TF 피펫 유리(Harvard)로부터 제작되며, 저항은 2 내지 3 MΩ이다.

외부 욕 용액은 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 5 mM 글루코스, 10 mM HEPES, pH 7.4를 함유한다.

내부 패치 피펫 용액은 100 mM K 글루코네이트, 20 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM Na₂ATP, 2 mM 글루타치온, 11 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.2를 함유한다.

약물들을 바이오로직 MEV-9/EVH-9 고속 관류 시스템을 사용하여 관류한다.

모든 기록을 hERG 채널을 안정하게 발현하는 HEK293 세포 상에서 수행한다. 세포를 2 개의 백금 막대(Goodfellow)를 사용하여 기록 챔버 중에 고정시킨 12 ㎜ 둥근 커버슬립(German glass, Bellco) 상에서 배양한다. hERG 전류를 1000 분 동안 +40 mV로의 활성화 펄스에 이어서 2000 분간 -50 mV로의 꼬리 전류 펄스를 사용하여 발생시키며, 유지 포텐셜은 -80 mV이었다. 펄스를 매 20 초마다 적용하고 모든 실험을 실온에서 수행한다.

4.4.2 데이터 분석

IC₅₀ 및 IC₂₀ 값을 시험된 각 화합물들에 대해 계산한다. 상기 래트 CIA 모델로부터 획득된 결과에 의해 측정된 바와 같은 관련된 치료 용량에서 수득한 시험 화합물의 IC₂₀과 결합되지 않은 C_max 농도 간의 차이 배수를 계산한다.

농도 반응 곡선에 대해서, 피크 꼬리 전류 진폭을 -50 mV까지의 전압 단계 동안 측정한다. 농도-반응 데이터의 곡선-대입을 하기식을 사용하여 수행한다:

y = a + [(b - a)/(1 + 10^((logc-x)d)]

상기 식에서, a는 최소 반응이고, b는 최대 반응이며, d는 경사면 기울기이고, 상기 식을 사용하여 IC₅₀(이때 y = 50이고 c는 IC₅₀ 값이다) 및 IC₂₀(이때 y = 20이고 c는 IC₂₀ 값이다)를 모두 계산할 수 있다. 그래프패드(등록상표) 프리즘(등록상표)(Graphpad(등록상표) Software Inc.) 소프트웨어를 모든 곡선 대입에 사용한다. 100 배 이상의 차이는 QT 연장에 대해 낮은 가능성을 가리킨다.

실시예 4.5 마이크로솜 안정성

DMSO 중의 10 mM 화합물 모액을 96 깊은 웰 플레이트(Greiner, Cat no. 780285) 중의 182 mM 포스페이트 완충액 pH 7.4로 1000 배 희석하고 37 ℃에서 예비 배양하였다.

40 ㎕의 탈이온수를 폴리프로필렌 매트릭스 2D 바코드 표지된 보관 튜브(Thermo Scientific)의 웰에 가하고 37 ℃에서 예비배양하였다.

글루코스-6-포스페이트-데하이드로게나제(G6PDH) 실행 모액을 182 mM 포스페이트 완충액 pH 7.4 중에서 제조하고 사용 전에 얼음 상에 두었다. MgCl2, 글루코스-6-포스페이트 및 NADP+를 함유하는 보조-인자를 탈이온수 중에서 제조하고 사용 전에 얼음 상에 두었다.

관심 종(인간, 마우스, 래트, 개)의 간 마이크로솜(Xenotech)을 함유하는 최종 실행 용액, 앞서 개시된 G6PDH 및 보조-인자를 제조하고 상기 혼합물을 실온에서 20 분 이하로 배양하였다.

30 ㎕의 상기 예비-배양된 화합물 희석액을 상기 매트릭스 튜브 중의 예열된 물 40 ㎕에 가하고 30 ㎕의 상기 마이크로솜 혼합물을 가하였다. 최종 반응 농도는 3 μM 화합물, 1 ㎎ 마이크로솜, 0.4 U/㎖ GDPDH, 3.3 mM MgCl₂, 3.3 mM 글루코스-6-포스페이트 및 1.3 mM NADP+이었다.

0 시간째에 남아있는 화합물의 퍼센트를 측정하기 위해서 상기 마이크로솜 혼합물 첨가 전에 MeOH 또는 ACN을 상기 웰에 가하였다(1:1). 상기 플레이트를 매트릭스 세프라 실즈(Matrix Sepra seals)TM(Matrix, Cat. No. 4464)으로 밀봉하고 수 초간 진탕시켜 모든 화합물들이 완전히 혼합되게 한다.

중지되지 않은 샘플들을 37 ℃, 300 rpm에서 배양하고 1 시간 배양 후에 상기 반응을 MeOH 또는 ACN(1:1)으로 중지시켰다.

상기 반응을 중지시킨 후에 상기 샘플들을 혼합하고 30 분간 얼음 상에 두어 단백질을 침전시켰다. 이어서 상기 플레이트를 4 ℃, 1200 rcf에서 30 분 원심분리하고 상등액을 LCMS 상에서 분석을 위해 96 v-바닥 PP 플레이트(Greiner, 651201)로 옮겼다.

상기 플레이트를 www.kinesis.co.uk의 밀봉 매트(MA96RD-04S)로 밀봉하고 샘플들을 콴옵티마이즈를 사용하여 최적화된 조건 하에 LCMS(Waters로부터 ZQ 1525) 상에서 실온에서 측정하여 상기 모 분자의 적합한 질량을 측정하였다.

상기 샘플들을 1 ㎖/분의 유속으로 LCMS 상에서 분석하였다. 용매 A는 15 mM 암모니아이고 용매 B는 사용된 중지 용액에 따라 메탄올 또는 아세토나이트릴이었다. 상기 샘플을 XBridge C18 3.5 μM(2.1 x 30 ㎜) 컬럼(Waters로부터) 상에서 양 이온 분무 하에 실행하였다. 용매 구배는 2 분의 총 실행 시간을 가지며 5% B에서부터 95% B의 범위이다.

0 시간째에 상기 모 화합물로부터의 피크 면적은 100% 화합물인 것으로 간주하였다. 1 시간 배양 후에 남아있는 퍼센트를 0 시간째로부터 계산하고 남아있는 퍼센트로서 계산하였다. 완충액에 대한 최종 시험 농도의 화합물의 용해도를 현미경으로 검사하고 결과를 기록한다.

마이크로솜 안정성에 대한 데이터를 60 분 후에 남아있는 화합물의 총량의 퍼센트로서 나타낸다.

마이크로솜 안정성
화합물#	인간	래트
1	76 내지 100%	76 내지 100%

실시예 4.6 Caco2 침투성

양방향 Caco-2 분석을 하기 개시하는 바와 같이 수행하였다. Caco-2 세포를 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐(ECACC, cat 86010202)로부터 수득하고 24-웰 트랜스웰 플레이트(Fisher TKT-545-020B)에서 21일 세포 배양 후 사용하였다.

2 x 10⁵ 세포/웰을 DMEM + GlutaMAX1 + 1% NEAA + 10% FBS(FetalClone II) + 1% Pen/Strep으로 이루어진 도말 배지에 시딩하였다. 상기 배지를 매 2 내지 3일마다 교환하였다.

시험 및 비교 화합물(프로프라놀올 및 로다민123 또는 빈블라스틴, 모두 Sigma로부터 구입하였다)을 25 mM HEPES(pH 7.4)를 함유하는 행크의 균형 염 용액 중에서 제조하고 상기 트랜스웰 플레이트 조립체의 정점(125 ㎕) 또는 기저측면(600 ㎕) 챔버에 0.25%의 최종 DMSO 농도로 10 μM의 농도로 가하였다.

50 μM 루시퍼 옐로우(Sigma)를 모든 웰 중의 공여 완충액에 가하여 루시퍼 옐로우 침투를 모니터함으로써 상기 세포층의 보전을 평가하였다. 루시퍼 옐로우(LY)는 친지성 장벽을 자유롭게 침투할 수 없기 때문에, 높은 정도의 LY 수송은 상기 세포층의 불량한 보전을 가리킨다.

150 rpm에서 궤도 진탕기에서 진탕시키면서 37 ℃에서 1 시간 배양 후에, 70 ㎕ 분액을 상기 정점(A) 및 기저(B) 챔버 모두로부터 취하고 96 웰 플레이트 중의 분석학적 내부 표준(0.5 μM 카바마제핀)을 함유하는 50:50 아세토나이트릴:수 용액 100 ㎕에 가하였다.

루시퍼 옐로우를, 기저측면 및 정점 면으로부터의 150 ㎕의 액체를 함유하는 깨끗한 96 웰 플레이트 중의 스펙트라맥스 제미니(Spectramax Gemini) XS(Ex 426 ㎚ 및 Em 538 ㎚)로 측정하였다.

상기 샘플 중의 화합물 농도를 고성능 액체-크로마토그래피/질량 분광학(LC-MS/MS)에 의해 측정하였다.

겉보기 침투성(P_app) 값을 하기의 관계로부터 계산하였다:

P_app = [화합물]_{최종 수용체} x V_수용체/([화합물]_{초기 공여체} x V_공여체)/T_inc x V_공여체/표면적 x 60 x 10^-6 ㎝/s

V = 챔버 부피

T_inc = 배양 시간

표면적 = 0.33 ㎠

상기 정점 세포 표면으로부터 능동 배출의 표시로서, 배출비를 P_appB>A/P_appA>B의 비를 사용하여 계산하였다.

하기의 분석 허용 기준을 사용하였다:

프로프라놀올: P_app(A>B) 값 ≥ 20(x10^-6 ㎝/s)

로다민 123 또는 빈블라스틴: P_app(A>B) 값 < 5(x10^-6 ㎝/s)(이때 배출비 ≥5).

루시퍼 옐로우 침투성: ≤100 ㎚/s

Caco2 배출율
화합물#	Papp A>B (x10-6 ㎝/초)	배출비
1	7.8±0.8	6.1±0.6

실시예 4.7 약동학 연구

4.7.1 설치류에서 약동학 연구

화합물을 정맥 내 경로의 경우 PEG200/생리식염수 또는 PEG400/DMSO/생리식염수 혼합물 중에서, 경구 경로의 경우 0.5% 메틸셀룰로스 또는 10 내지 30% 하이드록실프로필-β-사이클로덱스트린 pH 3 또는 pH 7.4 중에서 제형화한다. 시험 화합물을 단일의 식도 위관영양으로서 5 내지 10 ㎎/㎏으로 경구 투여하고 미정맥을 통한 일시주사로서 1 ㎎/㎏으로 정맥 내 투여한다. 각 그룹은 3 마리의 래트로 이루어진다. 혈액 샘플을 캐뉼러 삽입한 래트를 사용하여 경정맥을 통해서 또는 항응고제로서 리튬 헤파린을 사용하여 후-안구 동에서 하기 범위의 시점으로 채혈한다: 0.05 내지 8 시간(정맥 내 경로), 및 0.25 내지 6 또는 24 시간(경구 경로). 전혈 샘플을 5000 rpm에서 10 분간 원심분리하고 생성되는 혈장 샘플을 분석시까지 -20 ℃에서 보관한다.

4.7.2 개에서 약동학 연구

화합물을 정맥 내 경로의 경우 PEG200/생리식염수 혼합물 중에서, 경구 경로의 경우 0.5% 메틸셀룰로스 또는 PEG400/하이드록실프로필-β-사이클로덱스트린 혼합물(시트르산으로 pH 2 내지 3으로 산성화시킴) 중에서 제형화한다. 시험 화합물을 위관 영양을 통해 5 내지 30 ㎎/㎏으로 경구 투여하고 미정맥을 통한 일시주사 또는 10 분 주입으로서 1 ㎎/㎏으로 정맥 내 투여한다. 각 그룹은 3 마리의 수컷 또는 암컷 비글 개로 이루어진다. 혈액 샘플을, 경정맥을 통해서 항응고제로서 리튬 헤파린을 사용하여, 투여 후 0.083 내지 24 시간째의 시점에서 채혈한다. 전혈 샘플을 5000 rpm에서 10 분간 원심분리하고 생성되는 혈장 샘플을 분석시까지 -20 ℃에서 보관한다.

4.7.3 혈장 중의 화합물 수준의 정량화

각 시험 화합물의 혈장 농도를 LC-MS/MS 방법에 의해 측정하며 여기에서 질량 분광계를 양의 전기분무 방식으로 작동시켰다.

4.7.4 약동학적 매개변수의 측정

약동학적 매개변수를 윈논린(Winnonlin)(등록상표)(Pharsight(등록상표), United States)을 사용하여 계산한다.

실시예 4.8 7-일 래트 독성 연구

시험 화합물을 사용한 7-일 경구 독성 연구를 스프래그-다우리 수컷 래트에서, 100, 300 및 500 ㎎/㎏/일의 1일 용량으로, 위관영양에 의해, 5 ㎖/㎏/일의 일정한 투여량-부피로 상기 래트의 독성 가능성 및 독성동태학을 평가한다.

상기 시험 화합물을 정제 수 중의 30%(v/v) HPβCD 중에서 제형화한다. 각각의 그룹은 5 마리의 주 수컷 래트뿐만 아니라 독성동태학을 위한 3 마리의 보조 동물을 포함하였다. 네 번째 그룹에게 오직 수 중의 30%(v/v) HPβCD를, 동일한 회수, 투여량 부피로, 동일한 투여 경로에 의해 제공하며, 이는 비히클 대조군으로서 작용한다.

상기 연구의 목적은 부작용이 확인되지 않는 최저 용량을 측정하는 것이다(관찰할 수 있는 부작용 수준이 없음 - NOAEL).

실시예 4.9 간세포 안정성

간세포에서 대사 제거를 평가하기 위한 모델이 문헌[McGinnity et al. Drug Metabolism and Disposition 2008, 32, 11, 1247]에 개시되어 있다.

당해 분야의 숙련가들은 상기 설명이 사실상 예시적이고 설명적이며, 본 발명 및 그의 바람직한 실시태양들을 예시하고자 하는 것임을 알 것이다. 통상적인 실험을 통해, 숙련가는 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 수행될 수 있는 자명한 변경 및 변화들을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명을 상기 설명에 의해서가 아니라, 하기 청구의 범위 및 이의 등가물에 의해서 한정하고자 한다.

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비 제한적으로 본 명세서에 인용된 특허 및 특허 출원들을 포함하여 모든 공보들은, 각각의 개별적인 공보가 충분히 나열된 바와 같이 본 발명에 인용됨을 구체적이고 개별적으로 가리키는 것처럼 본 발명에 참고로 인용된다.

상기 설명으로부터, 본 발명의 조성물 및 방법의 다양한 변경 및 변화가 당해 분야의 숙련가들에게 떠오를 것이다. 첨부된 청구의 범위 내에 있는 모든 상기와 같은 변경들을 상기 중에 포함시키고자 한다.

다양한 화합물들의 차별적인 세포 침투 능력과 같은 인자들이 시험관 내 생화학 및 세포 분석에서 상기 화합물들의 활성 간의 불일치에 원인이 될 수 있음은 물론이다.

본 출원에 제공되고 나열된 바와 같은 본 발명 화합물들의 화학 명칭 중 적어도 일부는 상업적으로 입수할 수 있는 화학 명명 소프트웨어 프로그램의 사용에 의해 자동적으로 생성될 수도 있다. 상기 기능을 수행하는 전형적인 프로그램은 오픈 아이 소프트웨어 인코포레이티드(Open Eye Software, Inc.)에 의해 판매되는 렉시켐(Lexichem) 명명 도구 및 MDL 인코포레이티드에 의해 판매되는 오토놈(Autonom) 소프트웨어 도구를 포함한다. 상기 나타낸 화학명 및 도시된 구조가 상이한 경우, 상기 도시된 구조는 조절될 것이다.

본 발명에 나타낸 화학 구조는 ChemDraw(등록상표) 또는 ISIS(등록상표)/DRAW를 사용하여 제조되었다. 본 발명의 화학식들에 나타낸 탄소, 산소 또는 질소 원자 상에 존재하는 임의의 개방 원자가는 수소 원자의 존재를 가리킨다. 화학식 중에 키랄 중심이 존재하지만 상기 키랄 중심에 대해 구체적인 입체화학을 나타내지 않은 경우, 상기 키랄 구조와 관련된 2 개의 거울상이성체가 모두 상기 구조에 포함된다.

Claims

하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 I]
약학적으로 허용 가능한 담체 및 약학적으로 유효한 양의 제 1 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는,
염증성 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 전환의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형 또는 IL6의 과다분비와 관련된 질병의 치료, 방지 또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물이며,
상기 염증성 질병은 류머티스성 관절염, 골관절염, 알러지성 기도 질병, 및 염증성 장 질병으로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
상기 증식성 질병은 암, 백혈병, 다발성 골수종 및 건선으로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
상기 연골 전환의 장애를 수반하는 질병은 골관절염, 건선성 관절염, 청소년 류머티스성 관절염, 통풍성 관절염, 패혈성 또는 감염성 관절염, 반응성 관절염, 복합 부위 통증 증후군, 반사성 교감신경 위축증, 티지 증후군 또는 늑연골염, 섬유근육통, 골연골염, 신경성 또는 신경병성 관절염, 관절증, 변형성 골관절염 풍토병, 므셀리니병 및 한디고두병, 섬유근육통, 전신 홍반성 루프스, 경화증 및 강직성 척추염으로부터 발생하는 퇴행 으로 이루어지는 군으로부터 선택되고,
상기 IL6의 과다분비와 관련된 질병은 캐슬만씨 병, 다발성 골수종, 건선, 카포시 육종, 및 사구체간질 증식성 사구체신염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
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제2항에 있어서,
상기 염증성 질병이 류마티스성 관절염, 또는 골관절염인 약학 조성물.
제9항에 있어서,
상기 염증성 질병이 류마티스성 관절염인 약학 조성물.
제9항에 있어서,
상기 염증성 질병이 골관절염인 약학 조성물.
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