EA020111B1 - CYCLOPROPANECARBOXYLIC ACID {5-[4-(3,3-DIMETYL-AZETIDINE-l-CARBONYL)PHENYL]-[l,2,4]TRIAZOLO[l,5-a]PYRIDIN-2-YL}AMIDE - Google Patents

CYCLOPROPANECARBOXYLIC ACID {5-[4-(3,3-DIMETYL-AZETIDINE-l-CARBONYL)PHENYL]-[l,2,4]TRIAZOLO[l,5-a]PYRIDIN-2-YL}AMIDE Download PDF

Info

Publication number
EA020111B1
EA020111B1 EA201270076A EA201270076A EA020111B1 EA 020111 B1 EA020111 B1 EA 020111B1 EA 201270076 A EA201270076 A EA 201270076A EA 201270076 A EA201270076 A EA 201270076A EA 020111 B1 EA020111 B1 EA 020111B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
compound
diseases
cartilage tissue
compounds
acid
Prior art date
Application number
EA201270076A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
EA201270076A1 (en
Inventor
Кристель Жанн Мари Мене
Хавьер Блан
Original Assignee
Галапагос Нв
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Галапагос Нв filed Critical Галапагос Нв
Publication of EA201270076A1 publication Critical patent/EA201270076A1/en
Publication of EA020111B1 publication Critical patent/EA020111B1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Thiazole And Isothizaole Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Cyclopropanecarboxylic acid {5-[4-(3,3-dimethyl-azetidine-l-carbonyl)phenyl]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pyridin-2-yl}amide is disclosed represented by a structural formula (I). This compound may be prepared as a pharmaceutical composition, and may be used for the prevention and treatment of a variety of conditions in mammals including humans, including by way of non- limiting example, inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplantation rejection, diseases involving impairment of cartilage turnover, congenital cartilage malformations, and/or diseases associated with hypersecretion of IL6.

Description

Настоящее изобретение относится к соединению, которое является ингибитором 1ЛК, семейству тирозинкиназ, участвующих в воспалительных состояниях, аутоиммунных заболеваниях, пролиферативных заболеваниях, отторжении трансплантата, заболеваниях, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденные пороки развития хрящевой ткани и/или заболевания, связанные с гиперсекрецией 1Ьб. В настоящем изобретении также предоставлены способы получения данного соединения, фармацевтические композиции, содержащие данное соединение, и способы предупреждения и/или лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжений трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ьб, путем введения соединения данного изобретения.

Янус-киназы (ТАК) представляют собой цитоплазматические тирозинкиназы, передающие цитокиновый сигнал от мембранных рецепторов к факторам транскрипции 8ТАТ. Описано четыре члена семейства 1АК: 1АК1, 1АК2, 1АК3 и ΤΥΚ2. При связывании цитокина со своим рецептором члены семейства 1АК ауто- и/или трансфосфорилируют друг друга с последующим фосфорилированием 8ТАТ, которые затем мигрируют в ядро для модулирования транскрипции. Внутриклеточная передача сигнала 1АК8ТАТ обеспечивается интерферонами, большинством интерлейкинов, а также множеством цитокинов и эндокринных факторов, таких как ЕРО, ТРО, ОН, О8М, ЫЕ, СЫТЕ, 6М-С8Е и РКЬ (Уатсйепкет XV. с1 а1. (2008)).

Генетические модели в сочетании и исследованием малых молекул ингибиторов 1АК выявили терапевтический потенциал нескольких 1АК. При помощи генетики мышей и людей подтверждено, что 1АК3 является иммуносуппрессорной мишенью (О'811са 1. с1 а1. (2004)). Ингибиторы 1АК3 были успешно приняты в клиническую разработку, первоначально для случаев отторжения трансплантата органов, но впоследствии также и для других иммуновоспалительных показаний, таких как ревматоидный артрит (КА), псориаз и болезнь Крона (Ййр://с11шса11пак.доу/).

ТУК2 представляет собой возможную мишень в случае иммуновоспалительных заболеваний, что подтверждено методом генетики человека и исследованиями нокаутных мышей (Ьеуу Ό. Апб Ьоошщ С. (2007)).

1АК1 представляет собой новую мишень в области иммуновоспалительных заболеваний. 1АК1 гетеродимеризуется с другими 1АК для передачи сигнала от провоспалительных цитокинов. Следовательно, ожидается, что ингибирование 1АК1 и/или других 1АК окажет благоприятное терапевтическое воздействие в случае ряда воспалительных состояний, а также других заболеваний, передающихся путем 1АК-опосредованной передачи сигнала.

Предпосылки к созданию изобретения

Дегенерация хряща является признаком различных заболеваний, среди которых наиболее известными являются ревматоидный артрит и остеоартрит. Ревматоидный артрит (КА) представляет собой хроническое дегенеративное поражение сустава, характеризуемое воспалением и разрушением структур сустава. Если не лечить данное заболевание, это приводит к значительной недееспособности и боли вследствие потери функций сустава и даже к преждевременной смерти. Таким образом, целью терапии КА является не только замедлить развитие болезни, но добиться ремиссии, чтобы остановить разрушение сустава. Вследствие тяжести последствий данного заболевания широкое распространение КА (приблизительно 0,8% взрослых поражены по всему миру) означает большое социоэкономическое воздействие (в отношении обзоров по КА авторы изобретения ссылаются на 8шо1еи апб 81етет (2003); Ьее апб УетЫаН (2001); Сйоу апб Рапау1 (2001); О'1)е11 (2004) и Енсйет (2003)).

Остеоартрит (называемый также ОА, или артрит, обусловленный изнашиванием) представляет собой наиболее распространенную форму артрита и характеризуется потерей суставного хряща, зачастую связанную с гипертрофией кости и болью. В отношении исчерпывающего обзора по остеоартриту авторы изобретения обращаются к V^е1апб е1 а1. (2005).

Остеоартрит с трудом поддается лечению. В настоящее время отсутствуют надежные методы лечения и лечение направлено на облегчение боли и предупреждение деформации пораженного сустава. Общепринятые методы лечения включают в себя использование нестероидных и противовоспалительных лекарственных препаратов (Ν8ΛΙΩ). Несмотря на то что для лечения остеоартрита рекомендуют пищевые добавки, такие как хондроитин и сульфат глюкозамина, в ходе недавнего клинического исследования было выяснено, что оба метода лечения не уменьшают боль, связанную с остеоартритом (С1едд е1 а1., 200б). В целом, доступные лекарственные средства, корректирующие заболевание остеоартритом, отсутствуют.

Стимуляция анаболических процессов, блокирование катаболических процессов или сочетание двух этих процессов может привести к стабилизации сустава и, возможно, даже реверсии поражения и, следовательно, предупреждает дальнейшее развитие данного заболевания. Анаболическая стимуляция хондроцитов может стимулироваться различными спусковыми механизмами. Инсулиноподобный фактор роста-1 (ΙΟΕ-Ι) является доминирующим анаболическим фактором роста в синовиальной жидкости и стимулирует синтез как протеогликанов, так и коллагена. Кроме того, было показано, что члены семей

- 1 020111 ства морфогенетических белков костей (ВМР), а именно ВМР2, ВМР4, ВМРб и ВМР7, и члены семейства трансформирующих факторов роста человека-β (ТОР-β) способны вызывать анаболическую стимуляцию хондроцитов (СйиЫиккауа аиб Киейиег, 2003). Недавно было идентифицировано соединение, вызывающее анаболическую стимуляцию хондроцитов (патент США № 6500854; ЕР 1391211). Однако для большинства из этих соединений проявляются серьезные побочные эффекты и, следовательно, существует значительная необходимость в соединениях, стимулирующих дифференциацию хондроцитов без этих побочных эффектов.

УанбедН|Н81е е! а1. (^О 2005/124342) обнаружили, что 1АК1 представляет собой мишень, ингибирование которой может иметь терапевтическое значение в случае нескольких заболеваний, включая ОА. 1АК1 принадлежит к семейству Янус-киназ (1АК) цитоплазматических тирозинкиназ, участвующих в опосредованной цитокиновыми рецепторами внутриклеточной передаче сигнала. Семейство 1АК состоит из 4 членов: 1АК1, 1АК2, 1АК3 и ТУК2. 1АК вовлекаются в цитокиновые рецепторы при связывании с цитокином с последующей гетеродимеризацией цитокинового рецептора и совместно используемой рецепторной субъединицы (общая цепь гамма-с, др130). Затем 1АК активируются путем ауто- и/или трансфосфорилирования другой 1АК, что приводит к фосфорилированию рецепторов и рекрутингу и фосфорилированию членов передатчиков сигнала и активатора транскрипции (8ТАТ). Фосфорилированные 8ТАТ димеризуются и перемещаются в ядро, где они связываются с энхансерными областями цитокин-респонсивных генов. Нокаут гена 1АК1 у мышей показал, что 1АК1 играет существенные и неизбыточные роли в процессе развития: 1АК1-/-мышей умерли в течение 24 ч после рождения и развитие лимфоцитов было сильно нарушено. Более того, клетки 1АК1-/- не были или были менее реакционноспособны по отношению к цитокинам, чем в случае использования цитокиновых рецепторов II класса, цитокиновых рецепторов, использующих субъединицу гамма-с для передачи сигнала, и семейства цитокиновых рецепторов, использующих субъединицу др130 для передачи сигнала (ВоФд е! а1., 1998.)

Различные группы подразумевали передачу сигнала 1АК-8ТАТ в биологии хондроцитов. Ь1 е! а1. (2001) показали, что онкостатин М вызывает экспрессию генов ММР и Т1МР3 в первичных хондроцитах за счет активации путей передачи сигнала 1АК/8ТАТ и МАРК. Окак1 е! а1. (2003) показали, что опосредованное интерфероном-гамма ингибирование коллагена II в хондроцитах включает в себя передачу сигнала 1АК-8ТАТ. ΓΕ1-β вызывает катаболизм хряща за счет снижения экспрессии компонентов матрикса и за счет экспрессии коллагеназ и индуцируемой синтазы оксида азота (N082), которая опосредует образование оксида азота (N0). О!его е! а1., (2005) показали, что лептин и ΓΕ1-β синергитически вызывают образование N0 или экспрессию N082 мРНК в хондроцитах и что она блокируется ингибитором 1АК. Ьедеибге е! а1. (2003) показали, что рецептор ГЬб/ГЬб вызывает даунрегуляцию хрящ-специфичных матриксных генов коллагена II, ядра аггрекана и связывающего белка в суставных хондроцитах быка и что это опосредуется передачей сигнала 1АК/8ТАТ. Следовательно, данные наблюдения предполагают роль активности 1АК-киназы в гомеостазе хряща и терапевтические возможности для ингибиторов 1АКкиназ.

Члены семейства 1АК участвовали в дополнительных состояниях, включающих в себя миелопролиферативные нарушения (О'8иШуаи е! а1., 2007, Мо1. Iттиио1. 44(10):2497-506), для которых были определены мутации в 1АК2. Это указывает на то, что ингибиторы 1АК, в частности 1АК2, также могут быть использованы при лечении миелопролиферативных нарушений. Кроме того, семейство 1АК, в частности 1АК1, связано с различными видами рака, в частности различными видами лейкоза, например острым миелоидным лейкозом (О'8иШуаи е! а1., 2007, Мо1. Iттиио1. 44 (10) :2497-506; Х1аид е! а1., 2008, Иеиййсайои о£ котайс 1АК1 ти1айоик т райеи!к \\Й11 аси!е туе1о1б 1еикет1а В1ооб Ρίτκ! Ебйюи Рарег, ргериЫщйеб оийие ЭесетЬег 26, 2007; ЭО! 10.1182/Ь1ооб-2007-05-090308) и острым лимфобластическим лейкозом (МиШдйаи е! а1., 2009), или солидными опухолями, например лейомиосаркомой матки (СоиКаийиекси е! а1., 2007, Тгеибк т Вюсйет1са1 8с1еисек 33(3): 122-131), раком предстательной железы (Тат е! а1., 2007, Впйкй 1оигиа1 о£ Саисег, 97, 378-383). Эти результаты указывают на то, что ингибиторы 1АК, в частности 1АК1 и/или 1АК2, могут также быть использованы при лечении различных видов рака (лейкозов и солидных опухолей, например лейомиосаркомы матки, рака предстательной железы).

Кроме того, болезнь Кастлмана, множественная миелома, мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, псориаз и саркома Капоши, по-видимому, происходят вследствие гиперсекреции цитокина ГЕ-6, биологические эффекты которого опосредуются внутриклеточной передачей сигнала 1АК-8ТАТ (Те!кир Nака, №п1иго №кЫто!о аиб Табатйки КзкНипоЮ. ΛτίΗτίΙΐδ Век 2002, 4 (кирр1 3): 8233-8242). Эти результаты указывают на то, что ингибиторы 1АК могут также быть использованы при лечении указанных заболеваний.

Для 1АК3 и Тук2 была установлена связь с аутоиммунными заболеваниями. Мутации в 1АК3, а также в верхних компонентах передачи сигнала цепи гамма-с рецептора и ГЕ7 составляют в сумме приблизительно 70% случаев тяжелого комбинированного иммунодефицита. Следует отметить, что 1АК1 сотрудничает с 1АК3 в передаче сигналов от цепи гамма-с рецептора. Полиморфизм Тук2 заметен в системной красной волчанке (8ЬЕ) (О'8иШуаи е! а1., 2007, Мо1. Iттиио1. 44(10):2497-506). Поэтому избрание мишенью семейства 1АК может предоставить терапевтическую возможность в области иммуновос

- 2 020111 палительных заболеваний.

Существующие в настоящее время терапевтические методы лечения не являются удовлетворительными и, следовательно, сохраняется необходимость в получении других соединений, которые могут быть полезны при лечении воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжений трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ьб. Таким образом, в настоящем изобретении предоставлено соединение, способы его получения и фармацевтические композиции, содержащие соединение настоящего изобретения совместно с подходящим фармацевтическим носителем. В частности, данное соединение проявляет высокую эффективность и селективность в отношении 1ΆΚ1 по сравнению с другими членами семейства 1ΛΚ, помимо 385 киназы и некиназных мишеней. Кроме того, данные указывают на то, что данное соединение обладает хорошими пределами безопасности. Поэтому сделан вывод о том, что в настоящем изобретении предложена новая возможность лечения заболеваний, опосредованных 1ΆΚ1, в частности воспалительных заболеваний, таких как 8ЬЕ (системная красная волчанка) и КА.

Кроме того, в настоящем изобретении предоставлено использование соединения изобретения для получения лекарственного средства для лечения данных заболеваний и состояний.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение основано на открытии того факта, что ингибиторы 1АК, в частности 1АК1, применимы для лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжений трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ьб. В настоящем изобретении также предоставлены способы получения данных соединений, фармацевтические композиции, содержащие данные соединения, и способы лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжений трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков хрящевой ткани и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ьб, при введении соединения данного изобретения.

Соответственно в первом аспекте изобретения описано соединение данного изобретения, имеющее формулу I

о N

Соединение изобретения представляет собой новый ингибитор 1АК, проявляющий высокую эффективность и селективность в отношении 1АК1 по сравнению с другими членами семейства 1АК, помимо 385 киназы и некиназных мишеней, а также обладает хорошими пределами безопасности. Использование соединения с таким профилем может привести к преимуществам при лечении воспалительных заболеваний, в частности 8ЬЕ и КА, благодаря низкому проценту неспецифичных эффектов.

В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлены фармацевтические композиции, содержащие соединение данного изобретения, и фармацевтический носитель, эксципиент или разбавитель. Кроме того, соединение данного изобретения, применимое в фармацевтических композициях и описанных в данном описании способах лечения, является фармацевтически приемлемым согласно получению и использованию. В данном аспекте изобретения фармацевтическая композиция может также содержать дополнительные активные ингредиенты, подходящие для использования в сочетании с соединением данного изобретения.

В следующем аспекте изобретения в данном изобретении предоставлен способ лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного состоянием из числа перечисленных в настоящем описании и, в частности, таким состоянием, которое может быть связано с аберрантной активностью 1АК, например воспалительными состояниями, аутоиммунными заболеваниями, пролиферативными заболеваниями, отторжениями трансплантата, заболеваниями, включающими в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденными пороками развития хрящевой ткани и/или заболеваниями, связанными с гиперсекрецией 1Ьб, при этом данный способ включает в себя введение терапевтически эффективного количества соединения данного изобретения или одной или более раскрытых в описании фармацевтических композиций. В конкретном аспекте в данном изобретении предоставлен способ лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного состоянием, которое может быть связано с аберрантной активностью 1АК, в частности воспалительными состояниями, пролиферативными заболеваниями и заболеваниями, включающими в себя ухудшение обновления хрящевой ткани.

В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлено соединение данного изобретения,

- 3 020111 предназначенное для лечения или предупреждения состояния из числа перечисленных в настоящем описании, в частности таких состояний, которые могут быть связаны с аберрантной активностью 1ЛК, такие как воспалительные состояния, аутоиммунные заболевания, пролиферативные заболевания, отторжения трансплантата, заболевания, включающие в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденные пороки развития хрящевой ткани и/или заболевания, связанные с гиперсекрецией 1Ьб. В конкретном аспекте в настоящем изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения или предупреждения состояния, связанного с аберрантной активностью 1ЛК1, в частности воспалительных состояний, пролиферативных заболеваний и заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани.

В еще одном аспекте, связанном со способом лечения, в данном изобретении предоставлен способ лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного состоянием, причинно связанным с описанной в данном описании аномальной активностью 1ЛК, при этом данный способ включает в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций, или соединения данного изобретения. В конкретном варианте осуществления аномальная активность 1ЛК представляет собой аномальную активность 1ЛК1.

В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения или предупреждения состояния, причинно связанного с аномальной активностью 1ЛК. В конкретном варианте осуществления аномальная активность 1ЛК представляет собой аномальную активность 1ЛК1.

В дополнительных аспектах в данном изобретении предоставлены способы синтеза соединения изобретения, при этом репрезентативные методики и пути синтеза описаны в данном описании далее.

Соответственно главной целью данного изобретения является предоставление соединения, способного модифицировать активность 1ЛК и, таким образом, предупреждать или излечивать любые состояния, которые могут быть причинно связаны с ней. В частности, любые состояния, которые могут быть причинно связаны с активностью 1ЛК1.

Следующей целью настоящего изобретения является предоставление соединения, способного лечить или облегчать состояния или заболевания либо их симптомы, такие как воспалительные состояния, аутоиммунные заболевания, пролиферативные заболевания, отторжения трансплантата, заболевания, включающие в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденные пороки развития хрящевой ткани и/или заболевания, связанные с гиперсекрецией 1Ьб, которые могут быть причинно связаны с активностью 1ЛК. В частности, любое заболевание или состояние, которое может быть причинно связано с активностью 1ЛК1.

Еще одной целью данного изобретения является предоставление фармацевтических композиций, которые могут быть использованы для лечения или предупреждения множества болезненных состояний, включая заболевания, связанные с активностью 1ЛК, такие как воспалительные состояния, аутоиммунные заболевания, пролиферативные заболевания, отторжения трансплантата, заболевания, включающие в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденные пороки развития хрящевой ткани и/или заболевания, связанные с гиперсекрецией 1Ьб. В частности, состояния, связанные с активностью 1ЛК1.

Другие цели и преимущества будут очевидны специалистам в данной области из рассмотрения последующего подробного описания.

Подробное описание изобретения

Определения.

Подразумевается, что следующие термины имеют приведенные ниже значения и полезны для понимания описания и предусмотренных рамок настоящего изобретения.

При описании данного изобретения, которое может включать в себя соединения, фармацевтические композиции, содержащие подобные соединения и способы применения подобных соединений и композиций, следующие термины, в случае их наличия, имеют следующие значения, если не указано иначе. Следует также понимать, что при описании в настоящем описании любая из определенных ниже групп может быть замещена рядом заместителей и что подразумевается, что соответствующие определения включают в себя подобные замещенные группы в свои рамки, установленные ниже. Если не указано иначе, термин замещенный следует определять, как установлено далее. Кроме того, следует понимать, что при использовании в настоящем описании термины группы и радикалы можно считать взаимозаменяемыми.

Фармацевтически приемлемый означает принятый или могущий быть принятым регулирующим ведомством федерального или государственного правительства либо соответствующим ведомством в странах, отличных от Соединенных Штатов, или тот, который перечислен в фармакопее США или других общепринятых фармакопеях для использования для животных, а более конкретно, для людей.

Фармацевтически приемлемая соль относится к соли соединения данного изобретения, которая является фармацевтически приемлемой и которая обладает требуемой фармакологической активностью исходного соединения. В частности, подобные соли не являются токсичными, могут представлять собой соли присоединения неорганических или органических кислот и соли присоединения оснований. Конкретно, подобные соли включают в себя (1) соли присоединения кислоты, полученные с неорганически

- 4 020111 ми кислотами, такими как хлористо-водородная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.д.; или полученные с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, пропионовая кислота, капроевая кислота, циклопентанпропионовая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота, молочная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, 3-(4-гидроксибензоил)бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, 1,2-этандисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 4-хлорбензолсульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 4толуолсульфоновая кислота, камфорсульфоновая кислота, 4-метилбицикло[2.2.2]окт-2-ен-1-карбоновая кислота, глюкогептоновая кислота, 3-фенилпропионовая кислота, триметилуксусная кислота, третбутилуксусная кислота, лаурилсерная кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, гидроксинафтойная кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, муконовая кислота и так далее; или (2) соли, образованные в том случае, когда кислый протон, имеющийся в исходном соединении, либо замещен ионом металла, например ионом щелочного металла, ионом щелочно-земельного металла, или ионом алюминия; или координирован с органическим основанием, таким как этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, Ν-метилглюкамин и т.д. Кроме того, соли включают в себя, только в качестве примера, соли натрия, калия, кальция, магния, аммония, тетраалкиламмония и так далее; а в случае, когда соединение содержит основную функциональную группу, соли нетоксичных органических или неорганических кислот, такие как гидрохлорид, гидробромид, тартрат, мезилат, ацетат, малеат, оксалат и т.д. Термин фармацевтически приемлемый катион относится к приемлемому катионному противоиону кислотной функциональной группы. Примерами подобных катионов являются катионы натрия, калия, кальция, магния, аммония, тетраалкиламмония и т.д.

Фармацевтически приемлемый разбавитель относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю, с которым вводят соединение данного изобретения.

Пролекарства относятся к соединениям, включая производные соединений данного изобретения, которые содержат отщепляемые группы и в результате сольволиза или в физиологических условиях превращаются в соединения данного изобретения, которые фармацевтически активны ίη νίνο. Подобные примеры включают в себя, но не ограничиваются производными холинового эфира и т.д., Νалкилмормолинового эфира и т.д.

Сольват относится к формам соединения, которые ассоциированы с растворителем, обычно по реакции сольволиза.

Данная физическая ассоциация включает в себя связывание за счет водородных связей. Обычные растворители включают в себя воду, этанол, уксусную кислоту и т.д. Соединения данного изобретения могут быть получены, например, в кристаллической форме и могут быть сольватированы или гидратированы. Подходящие сольваты включают в себя фармацевтически приемлемые сольваты, такие как гидраты, а также включают в себя как стехиометрические сольваты, так и нестехиометрические сольваты. В некоторых случаях сольват может быть выделен, например, когда одна или более молекул растворителя входят в кристаллическую решетку кристаллического твердого вещества. Сольват включает в себя как фазу в растворе, так и выделяемые сольваты. Представительные сольваты включают в себя гидраты, этаноляты и метаноляты.

Субъект включает в себя людей. Термины человек, пациент и субъект используются в настоящем описании взаимозаменяемо.

Терапевтически эффективное количество означает количество соединения, которого при введении субъекту для лечения заболевания достаточно для осуществления подобного лечения данного заболевания. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от соединения, заболевания и его тяжести и возраста, массы и т.д., подлежащего лечению субъекта.

Предупреждающий или предупреждение относится к снижению риска получения или развития заболевания или нарушения (то есть приведение к тому, что по меньшей мере один из клинических симптомов заболевания не развивается у субъекта, который может подвергаться действию вызывающего заболевание агента или предрасположен к заболеванию до начала заболевания).

Термин профилактика относится к предупреждению и относится к мере или процедуре, целью которой является предупреждение, а не лечение или излечение от заболевания. Неограничивающие примеры профилактических мер могут включать в себя введение вакцин, введение низкомолекулярного гепарина находящимся в стационаре пациентам, подвергающимся риску получить тромбоз, например, вследствие обездвиживания, и введение противомалярийного агента, такого как хлорохин, перед визитом в географический регион, в котором малярия является эндемической, или где высок риск контакта с малярией.

Лечащий или лечение любого заболевания или нарушения относится в одном из вариантов осуществления к облегчения данного заболевания или нарушения (то есть остановке заболевания или проявления, степени или тяжести по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В другом варианте осуществления лечащий или лечение относится к облегчению по меньшей мере одного физического параметра, который может быть незаметен для субъекта. В еще одном варианте осуществле

- 5 020111 ния лечащий или лечение относится к модулированию заболевания или нарушения, либо физически (например, стабилизация заметного симптома), физиологически (например, стабилизация физического параметра), или и того, и другого. В следующем варианте осуществления лечащий или лечение относится к замедлению развития заболевания.

Используемый в настоящем описании термин воспалительное состояние(состояния) относится к группе состояний, включающих в себя ревматоидный артрит, остеоартрит, юношеский идиопатический артрит, псориаз, аллергическое заболевание дыхательных путей (например, астма, ринит), воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона, колит), вызванные эндотоксинами болезненные состояния (например, осложнения после аортокоронарного шунтирования или хронические эндотоксические состояния, приводящие, например, к хронической сердечной недостаточности) и родственные заболевания с участием хрящей, такие как заболевания суставов. В частности, данный термин относится к ревматоидному артриту, остеоартриту, аллергическому заболеванию дыхательных путей (например, астме) и воспалительным заболеваниям кишечника.

Используемый в настоящем описании термин аутоиммунное заболевание(заболевания) относится к группе заболеваний, включающих в себя обструктивное заболевание дыхательных путей, включая такие состояния, как СОРИ, астму (например, наследственную бронхиальную астму, пылевую астму, детскую астму), в особенности хроническую или застарелую астму (например, позднюю астму, или гиперреактивность дыхательных путей), бронхит, включая бронхиальную астму, системную красную волчанку (8ЬЕ), рассеянный склероз, сахарный диабет I типа и связанные с ним осложнения, эндогенную экзему (атопический дерматит), контактный дерматит и другие экзематозные дерматиты, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона и неспецифический язвенный колит), атеросклероз и боковой амиотрофический склероз. В частности, данный термин относится к СОРИ, астме, системной красной волчанке, сахарному диабету I типа и воспалительному заболеванию кишечника.

Используемый в настоящем описании термин пролиферативное заболевание(заболевания) относится к таким состояниям, как рак (например, лейомиосаркома матки или рак предстательной железы), миелопролиферативные нарушения (например, истинная полицитемия, эссенциальный тромбоцитоз и миелофиброз), лейкоз (например, острый миелоидный лейкоз и острый лимфобластический лейкоз), множественная миелома, псориаз, рестеноз, склеродермит или фиброз. В особенности данный термин относится к раку, лейкозу, множественной миеломе и псориазу.

Используемый в настоящем описании термин рак относится к злокачественному или доброкачественному разрастанию клеток на коже или в органах тела, например, но без ограничения, груди, предстательной железы, легких, почке, поджелудочной железы, желудка или кишечника. Рак имеет тенденцию к проникновению в соседнюю ткань и распространению (метастазированию) в отдаленные органы, например кости, печень, легкие или мозг. Используемый в настоящем описании термин рак включает в себя как метастатические типы опухолевых клеток, такие как меланома, лимфома, лейкемия, фибросаркома, рабдомиосаркома и мастоцитома, и типы тканевой карциномы, такие как, но не ограниченные, колоректальным раком, раком предстательной железы, мелкоклеточным раком легких и немелкоклеточным раком легких, раком груди, раком поджелудочной железы, раком мочевого пузыря, раком почки, раком желудка, глиобластомой, первичным раком печени, раком яичника, раком предстательной железы и лейомиосаркомой матки.

Используемый в настоящем описании термин лейкоз относится к неопластическим заболеваниям крови и кроветворных органов. Подобные заболевания могут привести к дисфункции костного мозга и иммунной системы, что сделает реципиента крайне восприимчивым к инфекции и кровотечению. В особенности термин лейкоз относится к острому миелоидному лейкозу (АМЬ) и острому лимфобластическому лейкозу (АЬЬ).

Используемый в настоящем описании термин отторжение трансплантата относится к острому или хроническому отторжению алло- или ксенотрансплантатов, или клеток, ткани или солидных органов, например панкреатических островков, стволовых клеток, костного мозга, кожи, мышцы, корнеальной ткани, нейронной ткани, сердца, легких, объединенных сердца-легких, почки, печени, кишечника, поджелудочной железы, трахеи или пищевода, или заболеваний трансплантат против хозяина.

Используемый в настоящем описании термин заболевания, включающие в себя ухудшение обновления хрящевой ткани включает в себя такие состояния, как остеоартрит, псориатический артрит, юношеский ревматоидный артрит, подагрический артрит, септический, или инфекционный артрит, реактивный артрит, рефлекторная симпатическая дистрофия, альгодистрофия, синдром Титце, или реберный хондрит, фибромиалгия, остеохондрит, нейрогенный, или нейропатический артрит, артропатия, эндемические формы артрита типа деформирующего эндемического остеоартроза, болезнь Мселени и болезнь Хандигоду; дегенерация, возникающая вследствие фибромиалгии, системной красной волчанки, склеродермии и анкилозирующего спондилоартрита.

Используемый в настоящем описании термин врожденный порок(и) хряща включает в себя такие состояния, как наследственный хондролиз, хондродисплазия и псевдохондродисплазия, в частности, но без ограничения, микротию, анотию, метафизарную хондродисплазию и родственные нарушения.

Используемый в настоящем описании термин заболевание(я), связанные с гиперсекрецией 1Ьб включает в себя такие состояния, как болезнь Кастлмана, множественная миелома, псориаз, саркома Капоши и/или мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит.

Используемый в настоящем описании термин 1АК относится к семейству янус-киназ (ТАК), которые представляют собой цитоплазматические тирозинкиназы, передающие цитокиновый сигнал от мембранных рецепторов к факторам транскрипции 8ТАТ. Описаны четыре члена семейства 1АК: 1АК1, 1АК2, 1АК3 и ТУК2, и термин 1АК может относиться ко всем членам семейства 1АК вместе или к одному или более членам семейства 1АК, как указано в контексте.

Подразумевается, что соединение(я) изобретения и эквивалентные выражения включают в себя соединение описанной в данном описании формулы, при этом данное выражение включает в себя фармацевтически приемлемые соли и сольваты, например гидраты и сольваты фармацевтически приемлемых солей, где это позволяет контекст. Аналогичным образом, подразумевается, что ссылка на промежуточные соединения, вне зависимости от того, заявлены ли они сами, включает в себя их соли и сольваты, где это позволяет контекст.

Когда в настоящем описании ссылаются на интервалы, например, но без ограничения, С1 -С8 алкил, цитирование интервала следует считать представлением каждого члена указанного интервала.

Другие производные соединений данного изобретения обладают активностью как в форме своих кислот, так и формах производных кислот, но в форме кислотной чувствительной формы часто проявляют преимущества растворимости, совместимости с тканями или замедленного высвобождения в организме млекопитающего (смотрите Виибдагб, Н., Эемдп о£ Ргобгидз, р. 7-9, 21-24, Е18еу1ег, АшЦегбаш 1985). Пролекарства включают в себя производные кислот, которые хорошо известны практикующим специалистам в данной области, например, такие как сложные эфиры, полученные реакцией исходной кислоты с подходящим спиртом, или амиды, полученные реакцией соединения исходной кислоты с замещенным или незамещенным амином, или ангидриды кислот, или смешанные ангидриды. Особенно полезными пролекарствами являются простые алифатические или ароматические сложные эфиры, амиды и ангидриды, полученные из кислотных групп, являющихся боковыми в соединениях данного изобретения. В некоторых случаях желательно получить пролекарства типа двойных сложных эфиров, такие как (ацилокси)алкиловые сложные эфиры или ((алкоксикарбонил)окси)алкиловые сложные эфиры. В частности, подобные пролекарства представляют собой С1-С8 алкил, С2-С8 алкенил, арил, С7-С12 замещенный арил и С7-С12 арилалкиловые сложные эфиры соединений данного изобретения.

Используемый в настоящем описании термин изотопный вариант относится к соединению, содержащему искусственные процентные доли изотопов одного или более атомов, которые составляют подобное соединение. Например, изотопный вариант соединения может содержать один или более нерадиоактивных изотопов, например, таких как дейтерий (2Н или И), углерода-13 (13С), азота-15 (15Ν) или т.п. Будет понятно, что в соединении, в котором осуществлено подобное изотопное замещение, следующие атомы, в случае, когда они присутствуют, могут изменяться так, что, например, любой атом водорода может представлять собой 2Н/И, любой атом углерода может представлять собой 13С или любой атом азота может представлять собой 15Ν, и что наличие и расположение подобных атомов можно определить в пределах квалификации в данной области техники. Аналогичным образом, изобретение может включать в себя получение изотопных вариантов с радиоизотопами, например, в случае, когда полученные соединения могут быть использованы для исследований распределения лекарственного средства и/или субстрата в тканях. Для данной цели особенно полезны радиоактивные изотопы тритий, то есть 3Н, и углерод-14, то есть 14С, ввиду простоты их введения и простых способов определения. Кроме того, можно получить соединения, которые замещены изотопами, излучающими позитроны, такими как ПС, 18Е, 15О и 13Ν, и применимы в исследованиях методом позитрон-эмиссионной томографии (РЕТ) для изучения занятости рецепторов субстрата.

Подразумевается, что все изотопные варианты предоставленных в настоящем описании соединений, вне зависимости от того, являются ли они радиоактивными или нет, входят в объем данного изобретения.

Стереоизомеры, которые не являются зеркальными отображениями друг друга, называются диастереомерами, а стереоизомеры, являющиеся взаимно несовмещающимися зеркальными отображениями друг друга, называются энантиомерами. Если в соединении имеется асимметрический центр, например он связан с четырьмя различными группами, возможно наличие пары энантиомеров. Энантиомер можно охарактеризовать абсолютной конфигурацией его асимметрического центра и описать при помощи правил Я- и ^-последовательности Канна и Прелога или характера вращения данной молекулой плоскости поляризованного света и обозначить ее как правовращающую или левовращающую (то есть как (+)- или (-)-изомеры соответственно). Хиральное соединение может существовать либо в виде индивидуального энантиомера, либо в виде их смеси. Смесь, содержащая равные количества энантиомеров, называют рацемической смесью.

Таутомеры относятся к соединениям, которые представляют собой взаимопревращающиеся формы структуры конкретного соединения и которые отличаются расположением атомов водорода и электронов. Так, в результате перемещения электронов и какого-либо атома (обычно Н) в равновесии могут находиться две структуры. Например, енолы и кетоны являются таутомерами, поскольку они быстро

- 7 020111 превращаются друг в друга при обработке их либо кислотой, либо основанием. Другим примером таутомерии являются аци- и нитро-формы фенилнитрометана, которые получаются аналогичным образом при обработке кислотой или основанием.

Таутомерные формы могут иметь отношение к достижению оптимальной химической реакционноспособности и биологической активности рассматриваемого соединения.

Соединение данного изобретения может содержать один или более асимметрических центров; поэтому подобные соединения можно получить в виде индивидуальных (К)- или (8)-стереоизомеров либо в виде их смесей.

Если не указано иначе, подразумевается, что описание или название конкретного соединения в описании и формуле изобретения включает в себя индивидуальные энантиомеры и смеси, рацемические или другие. Методы определения стереохимической структуры и разделения стереоизомеров хорошо известны в данной области техники.

Соединение.

Настоящее изобретение основано на том факте, что ингибиторы 1ЛК применимы для лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжении трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков хрящевой ткани и заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ьб. Кроме того, в настоящем изобретении предоставлены способы получения данного соединения, фармацевтические композиции, содержащие данное соединение, и способы лечения заболеваний, включающих в себя разрушение хряща, разрушение костей и/или суставов, и/или воспаление, путем введения соединения данного изобретения. Настоящее соединение является ингибитором членов семейства 1ЛК, конкретно, оно ингибирует активность 1ЛК1, 1ЛК2, 1ЛК3 и ΤΥΚ2. В частности, оно ингибирует активность 1ЛК1.

Соответственно в первом аспекте данного изобретения описано соединение изобретения, имеющее формулу I

I

Соединение данного изобретения представляет собой {5-[4-(3,3-диметилазетидин-1карбонил)фенил]-[1,2,4]триазол[1,5-а]пиридин-2-ил}амид циклопропанкарбоновой кислоты.

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения не является изотопным вариантом.

В одном из аспектов соединение данного изобретения находится в форме свободного основания.

В одном из аспектов соединение данного изобретения представляет собой фармацевтически приемлемую соль.

В одном из аспектов соединение данного изобретения представляет собой сольват данного соединения.

В одном из аспектов соединение данного изобретения представляет собой сольват фармацевтически приемлемой соли данного соединения.

В некоторых аспектах в настоящем изобретении предоставлены пролекарства и производные соединения согласно приведенной выше формуле. Пролекарства представляют собой производные соединений данного изобретения, которые содержат метаболически отщепляемые группы, и в результате сольволиза или в физиологических условиях превращаются в соединения данного изобретения, которые фармацевтически активны ίη νίνο. Подобные примеры включают в себя, но не ограничиваются сложноэфирными производными холина, сложными эфирами Ν-алкилморфолина и т.д.

Другие производные соединения данного изобретения обладают активностью как в форме их кислот, так и производных кислот, но форма быстро реагирующей кислоты часто проявляет преимущества в отношении растворимости, совместимости с тканями или замедленного высвобождения в организме млекопитающего (см. Випбдагб, Η., Ωοδίβη оГ Ргобгидк, р. 7-9, 21-24, ЕКсуюг. Лтйегбат 1985). Пролекарства включают в себя производные кислот, которые хорошо известны специалистам, практикующим в данной области, например, такие как сложные эфиры, полученные реакцией исходной кислоты с подходящим спиртом, или амиды, полученные реакцией соединения исходной кислоты с замещенным или незамещенным амином, или ангидриды кислот, или смешанные ангидриды. Предпочтительными пролекарствами являются простые алифатические или ароматические сложные эфиры, амиды и ангидриды, полученные из кислотных групп, являющихся боковыми в соединениях данного изобретения. В некоторых случаях желательно получить пролекарства типа двойных сложных эфиров, такие как (ацилокси)алкиловые сложные эфиры или ((алкоксикарбонил)окси)алкиловые сложные эфиры. В особенности

- 8 020111 полезны С1 до С8 алкил, С2-С8 алкенил, арил, С7-С12 замещенный арил и С7-С12 арилалкиловые сложные эфиры соединений данного изобретения.

Фармацевтические композиции.

При использовании в качестве фармацевтического средства соединение данного изобретения обычно вводят в виде фармацевтической композиции. Подобные композиции можно получить способом, который хорошо известен в области фармацевтики и содержит по меньшей мере одно активное соединение. Как правило, соединение данного изобретения вводят в фармацевтически эффективном количестве. Реально вводимое количество соединения обычно будет определяться врачом, принимая во внимание относящиеся к делу обстоятельства, включая подлежащее лечению состояние, выбранный способ введения, реальное вводимое соединение, возраст, вес и реакцию индивидуального пациента, тяжесть симптомов пациента и т.д.

Фармацевтические композиции данного изобретения можно вводить рядом способов, включая пероральный, ректальный, чрескожный, подкожный, внутрисуставной, внутривенный, внутримышечный и интраназальный. В зависимости от предназначенного способа доставки из соединения данного изобретения предпочтительно составляют препарат либо в виде инъекции, либо пероральных композиций, либо в виде мазей, в виде лосьонов, либо в виде пластырей, все из которых предназначены для чрескожного введения.

Композиции для перорального введения могут принимать форму нефасованных жидких растворов или суспензий ,или нефасованных порошков. Однако более общепринятым является предоставление композиций в виде разовых дозированных форм для облегчения точной дозировки. Термин разовая дозированная форма относится к физически дискретным единицам, которые подходят в качестве единичных доз для субъектов, являющихся людьми, и других млекопитающих, при этом каждая единица содержит заранее определенное количество активного вещества, рассчитанное для оказания требуемого терапевтического эффекта, в сочетании с подходящим фармацевтическим эксципиентом, разбавителем или носителем. Типичные разовые дозированные формы включают в себя предварительно заполненные, предварительно отмеренные ампулы или шприцы с жидкими композициями, или пилюли, таблетки, капсулы или т.п. в случае твердых композиций. В подобных композициях соединение данного изобретения обычно является минорным компонентом (от около 0,1 до около 50 мас.% или предпочтительно от около 1 до около 40 мас.%), при этом остаток представляет собой различные разбавители или носители или технологические вспомогательные вещества, полезные для получения требуемой дозированной формы.

Жидкие формы, подходящие для перорального введения, могут включать в себя подходящий водный или неводный разбавитель с буферными веществами, суспендирующими и диспергирующими агентами, красителями, вкусовыми веществами и т.д. Твердые формы могут включать в себя, например, любой из следующих ингредиентов или соединений, имеющих аналогичную природу: связывающее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая смола или желатин, эксципиент, такой как крахмал или лактоза, разрыхляющий агент, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал, смазывающее вещество, такое как стеарат магния, глидант, такой как коллоидная двуокись кремния, подслащивающее вещество, такое как сахароза или сахарин, или вкусовой агент, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновое вкусовое вещество.

Основу композиций для инъекций обычно составляет инъецируемый стерильный физиологический раствор, или физиологический раствор с фосфатным буфером, или другие инъецируемые носители, известные в данной области. Как и раньше, активное соединение в подобных композициях обычно представляет собой минорный компонент, часто составляющий от около 0,05 до 10 мас.%, при этом остаток является инъецируемым носителем и т.д.

Чрескожные композиции обычно составляют в виде местной мази или крема, содержащего активный ингредиент(ы), обычно в количестве, изменяющемся в интервале от около 0,01 до около 20 мас.%, предпочтительно от около 0,1 до около 20 мас.%, предпочтительно от около 0,1 до около 10 мас.% и более предпочтительно от около 0,5 до около 15 мас.%. При составлении препарата в виде мази активные ингредиенты будут обычно соединены либо с парафиновой, либо несмешивающейся с водой основой мази. Альтернативным образом, из активных ингредиентов можно составить препарат в виде крема, например с кремовой основой масло-в-воде. Такие чрескожные препараты хорошо известны в данной области и, как правило, содержат дополнительные ингредиенты для повышения кожного проникновения или устойчивости активных ингредиентов препарата. Все подобные известные чрескожные препараты и ингредиенты включены в объем данного изобретения.

Соединение данного изобретения можно также вводить путем чрескожного приспособления. Соответственно чрескожное введение можно осуществить с использованием пластыря либо типа резервуара, либо пористой мембраны, или ряда твердых матриц.

Описанные выше компоненты для вводимых перорально, путем инъекций или вводимых местно композиций являются лишь репрезентативными. Другие вещества, а также методики обработки и т.п. изложены в 8 части Кешшд1оп'8 Рйаттасеийса1 8аспсс5. 17411 οάίΐίοη. 1985, Маск РиЫйЫид Сотрапу, Еайои, Репину 1уаша, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.

Соединение данного изобретения можно также вводить в виде форм замедленного высвобождения

- 9 020111 или систем доставки лекарственных препаратов с замедленным высвобождением. Описание репрезентативных веществ для замедленного высвобождения можно найти в Кеттд1ои'8 Рйагтасеийса1 Баеисек.

Следующие примеры препаратов иллюстрируют репрезентативные фармацевтические композиции, которые можно получить согласно данному изобретению. Однако настоящее изобретение не ограничено следующими фармацевтическими композициями.

Препарат 1. Таблетки.

Соединение данного изобретения можно смешивать в виде сухого порошка со связывающим веществом из сухого желатина в массовом соотношении приблизительно 1:2. В качестве смазывающего вещества можно добавить минорное количество стеарата магния. Из данной смеси можно сформовать таблетки по 240-270 мг (80-90 мг активного амидного соединения на таблетку) при помощи таблеточного пресса.

Препарат 2. Капсулы.

Соединение данного изобретения можно смешивать в виде сухого порошка с разбавителем из крахмала в массовом соотношении приблизительно 1:1. Данной смесью можно заполнить капсулы по 250 мг (125 мг активного амидного соединения на капсулу).

Препарат 3. Жидкость.

Соединение данного изобретения (125 мг) можно смешать с сахарозой (1,75 г) и ксантановой смолой (4 мг) и полученную смесь можно перемешать, пропустить через сито № 10 меш США, а затем смешать с предварительно приготовленным раствором микрокристаллической целлюлозы и карбоксиметилцеллюлозы натрия (11:89, 50 мг) в воде. Бензоат натрия (10 мг), вкусовое вещество и краситель можно разбавить водой и прибавить при перемешивании. После этого при перемешивании можно добавить достаточное количество воды. Затем можно добавить достаточное количество воды для получения общего объема 5 мл.

Препарат 4. Таблетки.

Соединение данного изобретения можно смешивать в виде сухого порошка со связывающим веществом из сухого желатина в массовом соотношении приблизительно 1:2. В качестве смазывающего вещества можно добавить минорное количество стеарата магния. Данную смесь формуют в таблетки по 450900 мг (150-300 мг активного амидного соединения) при помощи таблеточного пресса.

Препарат 5. Инъекция.

Соединение данного изобретения можно растворить или суспендировать в забуференной стерильной солевой водной среде для инъекций в концентрации приблизительно 5 мг/мл.

Препарат 6. Местно.

Стеариловый спирт (250 г) и белый петролатум (250 г) можно расплавить примерно при 75°С, а затем можно прибавить смесь соединения данного изобретения (50 г), метилпарабен (0,25 г), пропилпарабен (0,15 г), лаурилсульфат натрия (10 г) и пропиленгликоль (120 г), растворенные в воде (около 370 г), и можно перемешивать полученную смесь, пока она не затвердеет.

Способы лечения.

Соединение данного изобретения можно использовать в качестве терапевтического агента для лечения состояний у млекопитающих, которые причинно связаны, или относятся к аберрантной активности 1ЛК. В частности, состояния относятся к аберрантной активности 1АК1. Соответственно соединение и фармацевтические композиции данного изобретения находят применение в качестве терапевтических средств для предупреждения и/или лечения воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжений трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков хрящевой ткани и заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ь6, у млекопитающих, включая людей.

В дополнительных аспектах способа лечения в данном изобретении предоставлены способы лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного воспалительным состоянием. Данный способ включает в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций или соединений данного изобретения. В конкретном варианте осуществления воспалительное состояние выбирают из ревматоидного артрита, остеоартрита, аллергического заболевания дыхательных путей (например, астмы) и воспалительных заболеваний кишечника.

В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения, предупреждения или профилактики воспалительного состояния. В конкретном варианте осуществления воспалительное состояние выбирают из ревматоидного артрита, остеоартрита, аллергического заболевания дыхательных путей (например, астмы) и воспалительных заболеваний кишечника.

В дополнительных аспектах способа лечения в данном изобретении предоставлены способы лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного аутоиммунным заболеванием. Данные способы включают в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций или соединений данного изобретения. В конкретном способе осуществления аутоиммунное заболевание выбирают из СОРИ, астмы, сис

- 10 020111 темной красной волчанки, сахарного диабета I типа и воспалительного заболевания кишечника.

В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения, предупреждения или профилактики аутоиммунного заболевания. В конкретном способе осуществления аутоиммунное заболевание выбирают из СОРЭ. астмы, системной красной волчанки, сахарного диабета I типа и воспалительного заболевания кишечника.

В следующих аспектах способа лечения в данном изобретении предоставлены способы лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного пролиферативным заболеванием, в частности раком (например, солидными опухолями, такими как лейомиосаркома матки или рак предстательной железы), лейкозом (например, ЛМЬ или ЛЬЬ), множественной миеломой и/или псориазом. Данные способы включают в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций или соединений данного изобретения.

В следующем аспекте в настоящем изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения, предупреждения или профилактики пролиферативного заболевания, в частности рака (например, солидных опухолей, таких как лейомиосаркома матки или рак предстательной железы), лейкоза (например, ЛМЬ или ЛЬЬ), множественной миеломы и/или псориаза.

В следующих аспектах способа лечения в данном изобретении предоставлены способы лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного отторжением трансплантата. Данные способы включают в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций или соединений данного изобретения. В конкретном варианте осуществления в данном изобретении предоставлены способы лечения отторжения трансплантата органа.

В аспекте способа лечения в данном изобретении предоставлен способ лечения, предупреждения или профилактики млекопитающего, восприимчивого или пораженного заболеванием, включающим в себя ухудшение обновления хрящевой ткани. Данные способы включают в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций или соединений данного изобретения.

В другом аспекте в данном изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения, предупреждения или профилактики заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани.

Кроме того, в настоящем изобретении предоставлен способ лечения врожденных пороков развития хрящевой ткани. Данные способы включают в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций или соединений данного изобретения.

В другом аспекте в данном изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения, предупреждения или профилактики врожденных пороков развития хрящевой ткани.

В следующем аспекте способов лечения в данном изобретении предоставлены способы лечения млекопитающего, восприимчивого или пораженного заболеваниями, связанными с гиперсекрецией 1Ьб, в частности болезнью Кастлмана или мезангиальным пролиферативным гломерулонефритом. Данные способы включают в себя введение эффективного для лечения состояния или предупреждения состояния количества одной или более описанных здесь фармацевтических композиций или соединений данного изобретения.

В следующем аспекте в данном изобретении предоставлено соединение данного изобретения, предназначенное для лечения, предупреждения или профилактики заболеваний, связанных с гиперсекрецией 1Ьб, в частности болезни Кастлмана или мезангиального пролиферативного гломерулонефрита.

В качестве следующего аспекта изобретения предоставлено соединение данного изобретения для использования в качестве фармацевтического средства, в особенности при лечении или предупреждении вышеупомянутых состояний и заболеваний. Кроме того, в настоящем описании предоставлено использование соединения для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения одного из упомянутых выше состояний и заболеваний.

Особый режим настоящего способа включает в себя введение субъекту, страдающему воспалительным состоянием, эффективного количества соединения данного изобретения в течение периода времени, достаточного для снижения степени воспаления у субъекта и предпочтительно прекращения процессов, ответственных за указанное воспаление. Особый вариант осуществления данного способа включает в себя введение эффективного количества соединения данного изобретения рассматриваемому пациенту, страдающему или восприимчивому к развитию ревматоидного артрита, в течение периода времени, которого достаточно соответственно для снижения или предупреждения воспаления в суставах указанного пациента, а предпочтительно для прекращения процессов, ответственных за указанное воспаление.

Следующий особый режим настоящего способа включает в себя введение субъекту, страдающему заболеваниями, включающими в себя ухудшение обновления хрящевой ткани (например, остеоартрит), эффективного количества соединения данного изобретения в течение периода времени, достаточного для

- 11 020111 снижения, а предпочтительно прекращения самоподдерживающихся процессов, ответственных за указанное разрушение. Конкретный вариант осуществления данного способа включает в себя введение эффективного количества соединения данного изобретения субъекту пациенту, страдающему или восприимчивому к развитию остеоартрита, в течение периода времени, которого достаточно соответственно для снижения или предупреждения разрушения суставов указанного пациента, а предпочтительно для прекращения самоподдерживающихся процессов, ответственных за указанное разрушение. В конкретном варианте осуществления указанное соединение может проявлять анаболические и/или антианаболические свойства в отношении хрящевой ткани.

Концентрация дозы для инъекции изменяется в интервале от около 0,1 по меньшей мере до 10 мг/кг/ч, значительно в пользу интервала от около 1 до около 120 ч и особенно от 24 до 96 ч. Для достижения соответствующих концентраций стационарного состояния можно также вводить предварительно наполненный болюс, содержащий от около 0,1 до около 10 мг/кг или более. Ожидается, что максимальная общая доза не превысит примерно 2 г/день для пациентов массой от 40 до 80 кг, являющихся людьми.

Для предупреждения и/или лечения продолжительных состояний, таких как дегенеративные состояния, режим лечения обычно продолжается в течение многих месяцев или лет, так что в целях удобства и переносимости пациента предпочтительной является пероральная доза. В случае перорального дозирования репрезентативными режимами являются от одной до пяти, а в особенности от двух до четырех, и обычно три пероральные дозы в день. При использовании данных схем дозирования каждая доза предоставляет от около 0,01 до около 20 мг/кг соединения данного изобретения, при этом каждая из конкретных доз предоставляет от около 0,1 до около 10 мг/кг, а в особенности от около 1 до около 5 мг/кг.

Чрескожные дозы обычно выбирают для получения похожей или более низкой концентрации в крови, чем концентрации, которые достигаются при использовании инъецируемых доз.

В случае использования для предупреждения начала воспалительного состояния соединение данного изобретения будут вводить пациенту, имеющему риск развития данного состояния, обычно по совету и под наблюдением врача в описанных выше концентрациях дозировок. Как правило, в число пациентов, имеющих риск развития конкретного состояния, входят пациенты, в семейном анамнезе которых имеется данное состояние, или пациенты, для которых по данным генетического тестирования или скрининга была установлена особая восприимчивость к развитию данного состояния.

Соединение данного изобретения можно вводить в виде единственного активного агента или его можно вводить в сочетании с другими терапевтическими агентами, включая другие соединения, которые проявляют аналогичную или похожую терапевтическую активность и для которых установлена безопасность и эффективность в случае подобного комбинированного введения. В конкретном варианте осуществления совместное введении двух (или более) агентов допускает использование значительно более малых доз каждого из них, что снижает, таким образом, наблюдаемые подобные эффекты.

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения воспалительного состояния; конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются иммунорегуляторными агентами, например азатиоприном, кортикостероидами (например, преднизолоном, или дексаметазоном), циклофосфамидом, циклоспорином А, такролимусом, микофенолятмофетилом, муромонабом-СБ3 (ОКТ3, например, Ог11юсо1опс®). АТС, аспирином, ацетаминопрофеном, ибупрофеном, напроксеном и пироксикамом.

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения артрита (например, ревматоидного артрита); конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются анальгетиками, нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами (Ν8ΑΙΌ8), стероидами, синтетическими ΌΜΑΚΌ8 (например, но без ограничения, метотрексатом, лефлуномидом, сульфазалазином, ауранофином, ауротиомалатом натрия, пеницилламином, хлоррохином, гилроксихлорохином, азатиоприном и циклоспорином) и биологическими ΌΜΑΚΌ8 (например, но без ограничения, инфликсимабом, этанерсептом, адалиммабом, ритуксимабом и абатасептом).

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения пролиферативных нарушений; конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются метотрексатом, лейковорином, адриамицином, пренизоном, блеомицином, циклофосфамидом, 5-фторурацилом, паклитакселом, доцетакселем, винкристином, винбластином, винорельбином, доксорубицином, тамоксифеном, торемифеном, мегестролацетатом, анастрозолом, госерелином, анти-НЕК2 моноклональным антителом (например, Нетсерйи™), капецитабином, гидрохлоридом рабоксифена, ингибиторами ЕОЕВ (например, 1те88а®, Татсеуа™, ЕгЬйих™), ингибиторами УЕОЕ (например, Ауайш™), ингибиторами протеасом (например, Уе1сабе™), Сйуес® и ингибиторами 115р90 (например, 17-ААС). Кроме того, соединение данного изобретения вводят совместно с другими терапевтическими средствами, включающими в себя, но не ограниченными, лучевую терапию или хирургию. В конкретном варианте осуществления пролиферативное нарушение выбирают из рака, миелопролиферативного заболевания или лейкоза.

- 12 020111

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения аутоиммунных заболеваний; конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются глюкокортикоидами, цитостатическими агентами (например, аналогами пурина), алкилирующими агентами (например, азотистыми ипритами (циклофосфамид), нитрозомочевинами, соединениями платины и другими), антиметаболитами (например, метотрексатом, азатиоприном и меркаптопурином), цитотоксическими антибиотиками (например, дактиномицином, антрациклинами, митомицином С, блеомицином и митрамицином), антителами (например, антиСЭ20, анти-СЭ25. или анти-СЭЗ (ОТК3) моноклональными антителами, А1дат® и Тйутод1оЬи1те®), циклоспорином, такролимусом, рапамицином (сиролимусом), интерферонами (например, ΙΕΝ-β), ΤΝΒсвязывающими белками (например, инфликсимабом (Кетюабе™), этанерсептом (ЕиЬге1™) или адалимумабом (Нгтига™)), микофенолятом, финголимодом и мириоцином.

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения отторжения трансплантата; конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются ингибиторами кальцинеурина (например, циклоспорином или такролимусом (ЕК506)), ингибиторами тТОВ (например, сиролимусом, эверолимусом), антипролиферативными кортикостероидами (например, преднизолоном, гидрокортизоном), антителами (например, моноклональными антителами к анти-1Ь-2Ва рецептору, базиликсимабом, даклизумабом), поликлональными анти-Т-клеточными антителами (например, анти-тимоцитарным глобулином (АТС), антилимфоцитарным глобулином (АЬС)).

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения астмы и/или ринита и/или СОРЭ; конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются: агонистами в2-адренорецепторов (например, салбутамолом, левалбутеролом, тербуталином и битолтеролом), эпинефрином (в виде ингаляции или таблеток), антихолинергическими средствами (например, ипратропиумбромидом), глюкокортикоидами (пероральными или вводимыми путем ингаляциями), в2-антагонистами длительного действия (например, салметеролом, формотеролом, бамбутеролом и пероральным альбутеролом замедленного высвобождения), сочетанием вводимых путем ингаляции стероидов и бронходилататорами длительного действия (например, флутиказоном/салметеролом, бутезонидом/формотеролом), антагонистами и ингибиторами синтеза лейкотриена (например, монтелукастом, зафирлукастом и зилейтоном), ингибиторами высвобождения медиаторов (например, кромогликатом и кетонифеном), биологическими регуляторами отклика 1дЕ (например, омализумабом), антигистаминными препаратами (например, цетеризином, циннаризином, фексофенадином) и вазоконстрикторами (например, оксиметазолином, ксилометазолином, нафазолином и трамазолином).

Кроме того, соединение данного изобретения можно вводить в сочетании с неотложными терапевтическими средствами в случае астмы и/или СОРЭ, при этом подобные виды терапии включают в себя введение кислорода или кислородно-гелиевой смеси, распыленный сальбутамол или тербуталин (необязательно в сочетании с антихолинергическими препаратами (например, ипратропием)), системные стероиды (пероральные, или внутривенные, например преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, дексаметазон или гидрокортизон), внутривенный сальбутамол, непрецифические β-агонисты, вводимые путем инъекции или ингаляции (например, эпинефрин, изоэтарин, изопротеренол, метапротеренол), антихолинергические средства (внутривенно или распыленные, например гликопирролат, атропин, ипратропий), метилксантины (теофиллин, аминофиллин, бамифиллин), ингаляционные анестетики, обладающие бронходилатирующим эффектов (например, изофлуран, галотан, энфлуран), кетамин и внутривенный сульфат магния.

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения воспалительной болезни кишечника (ΙΒΌ); конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются глюкокортикоидами (например, преднизоном, будезонидом), синтетическими модифицирующими заболевание иммуномодулирующими агентами (например, метотрексатом, лефлуномидом, сульфазалазином, мезалазином, азатиоприном, 6меркаптопурином и циклоспорином) и биологическими модифицирующими заболевание иммуномодулирующими агентами (например, адалимумабом, ритуксимабом и абатасептом).

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим терапевтически агентом для лечения и/или предупреждения системной красной волчанки; конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются модифицирующими заболевание противоревматическими лекарственными средствами (ΌΜΑΚΌ), такими как антималярийные препараты (например, плаквенил, гидроксихлорохин), иммунодепрессантами (например, метотрексат и азатиоприн), циклофосфамидом и микофеноловой кислотой; иммуносуппрессивными лекарственными средствами и анальгетиками, такими как нестероидные противовоспалительные лекарственными препаратами, опиаты (например, декстропропоксифен и ко-кодамол), опиоиды (например, гидрокодон, оксикодон, Μ8 Соийи или метадон) и содержащим фентанил чрескожным пластырем Дюрогезик.

В одном из вариантов осуществления соединение данного изобретения вводят совместно с другим

- 13 020111 терапевтическим агентом для лечения и/или предупреждения псориаза; конкретные агенты включают в себя, но не ограничиваются местными видами лечения, такими как растворы для погружения, увлажняющие кремы, лечебные кремы и мази, содержащие каменноугольный деготь, дитранол (антралин), кортикостероиды типа дезоксиметазона (Τορίεοή™), флуоцинонид, аналоги витамина Ό3 (например, кальципотриол), ретиноиды арганового масла (этретинат, ацитретин, тазаротен), системные курсы лечения, такие как метотрексат, циклоспорин, ретиноиды, тиогуанин, гидроксимочевина, сульфалазин, микофенолятмофетил, азатиоприн, такролимус, эфиры фумаровой кислоты или биопрепараты, такие как Лтсбус™. Ншшга™, Веткабе™, Карйуа™ и устекинумаб (блокатор 1Ь-12 и 1Ь-23). Кроме того, соединение данного изобретения можно вводить в сочетании с другими видами терапии, включающими в себя, но не ограниченными фототерапией или фотохимиотерапией (например, псорален и фототерапия ультрафиолетовыми лучами диапазона А (РИУЛ)).

В совместное введение входят любые способы доставки пациенту двух или более терапевтических агентов как части одного и того же режима лечения, как будет очевидно специалисту в данной области. Несмотря на то что два или более агентов можно вводить одновременно в виде одного препарата, это не существенно. Данные агенты можно вводить в составе различных препаратов и в разное время.

Общие методики синтеза

Общее.

Соединение данного изобретения можно получить из легко доступных исходных веществ с использованием следующих общих способов и методик. Понятно, что в случае, когда приведены типичные или предпочтительные условия способа (например, температура реакции, продолжительность, молярные соотношения реагентов, растворители, давление т.д.), можно также использовать другие условия способа, если не установлено иначе. Оптимальные условия реакции могут изменяться в зависимости от конкретных используемых реагентов или растворителя, но специалист в данной области может определить такие условия путем стандартных способов оптимизации.

Кроме того, для специалистов в данной области будет очевидно, что могут потребоваться стандартные защитные группы, чтобы предотвратить протекание нежелательных реакций с участием некоторых функциональных групп. Выбор подходящей защитной группы для конкретной функциональной группы, а также подходящих условий для защиты и снятия защиты хорошо известен в данной области. Например, многочисленные защитные группы и их введение и удаление описаны у Τ.^. Сгееи апб Р.С.М. \УиК Ргокейуе Сгоирк ίη Огдаше 8уййек1к, \УПеу, Ыете Уогк, 1991 и в приведенных там ссылках.

Следующие способы представлены подробно в отношении получения репрезентативных бициклогетероарилов, которые были перечислены в настоящем описании ранее. Специалист в области органического синтеза может получить соединение данного изобретения из известных или коммерчески доступных исходных веществ и реагентов.

Все реагенты были технического качества и использовались без дополнительной очистки, если не установлено иначе. В реакциях, проводимых в атмосфере инертного газа, использовали коммерчески доступные безводные растворители. Во всех остальных случаях использовали растворители, чистые для анализа, если не указано иначе. Колоночную хроматографию осуществляли на силикагеле 60 (35-70 мкм). Тонкослойную хроматографию проводили на пластинах с предварительно нанесенным силикагелем Е-254 (толщина 0,25 мм). Спектры 1Н-ЯМР регистрировали на спектрометре Вгикег ΌΡΧ 400 (400 МГц). Химические сдвиги (δ) в спектрах Ή-ЯМР приведены в миллионных долях (м.д.) относительно тетраметилсилана (δ 0,00) или пика остаточного протона соответствующего растворителя, то есть СНС13 (δ 7,27) в качестве внутреннего стандарта. Мультиплетность приведена в виде синглета (с), дублета (д), триплета (т), квадруплета (кв), мультиплета (м) и уширенного сигнала (уш). Константы спин-спинового взаимодействия (1) приведены в Гц. Масс-спектры с электроспреевой ионизацией регистрировали на спектрометре Мкготакк р1а1Гогт ЬС/М8. Колонка, используемая для всех анализов методом ВЭЖХ: \Уа1егк Лецийу ИРЬС ВЕН С18 1,7 мкм, 2,1 мм Шх50 мм Ь (№ партии 186002350).

Препаративная ВЭЖХ: \Уа1егк ХВпбде Ргер С18 5 мкм ΟΌΒ 19 мм Шх100 мм Ь (№ партии 186002978). Все методы проводили с использованием градиентов МеСЫ/Н2О. В Н2О содержалась либо 0,1% ТФА, либо 0,1% ΝΗ3.

- 14 020111

Следующее представляет собой список сокращений, используемых в экспериментальной части:

БСМ Хлористый метилен ΠΐΡΕΑ Ν,Ν-диизопропилэтиламин МеСЫ Ацетонитрил ВОС Трет-бутоксикарбонил ДМФА N,N-диметилформамид Кат. Каталитическое количество ТФА Трифторуксусная кислота ТГФ Тетрагидрофуран ЯМР Ядерный магнитный резонанс ДМСО Диметилсульфоксид жх-мс Хроматомасс-спектрометрия М.д. Миллионная доля Ρά/С Палладий на активированном угле 10% РМВ Пара-метоксибензил РуВОР Гексафторборат бензотриазол-1илокситрис(пирролидин)фосфония ЕбОАс Этилацетат АРС1 Химическая ионизация при атмосферном давлении ке Время удерживания с синглет ущ С Уширенный синглет м мультиплет мин минута Мл миллилитр мкл микролитр г грамм мг миллиграмм РйС12дрр£ [1,1'-бис(дифенилфосфин)ферроцен]дихлорпалладий(II) ТЕА Триэтиламин ММР Матричная металлопротеиназа ЫНАС Нормальные хондроциты суставного хряща человека зЬрнк Малые РНК, образующие шпильки РНК Рибонуклеиновая кислота Αά-θίΡΗΚ Кодированная аденовирусом είΡΗΚ РВЗТ Физиологический раствор с фосфатным буфером, содержащий Тмееп 3,2 мМ Ма2НРО4, 0,5 мМ КН2РО4, 1,3 мМ КС1,135 мМ ЫаС1,0,05% Τν/еел 20, рН 7,4 АРМА Ацетат 4-аминофенилртути ЮМЕМ Минимальная питательная среда Игла, модифицированная Далбекко ЕВЗ Плодная бычья сыворотка ИСАЕ Клеточный рецептор аденовируса человека 3-ΜΟΙ Множественность инфекции, равная 3 άΝΤΡ Дезоксирибонуклеозидтрифосфат ОРСК Количественная полимеразно-цепная реакция кДНК Комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота ΟΑΡϋΗ Глицеральдегид фосфатдегидрогеназа

- 15 020111

Синтез соединения изобретения

Соединение согласно данному изобретению можно получить согласно следующей схеме. Общий способ синтеза.

Схема

ΝΗ-,ΟΗ.ΗΟΙ 'Ργ2ΝΕΙ ЕЮН/МеОН Δ

-Ι.Κεοα,Ε^Ν 2. ΝΙ-Ц/МеОН

ΟΗ3ΟΝ, 20 °С [ 20 °С

Аг (5)

ОН

Аг—В7

ОН

в которой Аг представляет собой фенил-Ы-гетероциклоалкил, Ь1 является -СО- и гетероциклоалкильная группа необязательно замещена.

Общее.

1.1.1. 1-(б-Бромпиридин-2-ил)-3-карбэтокситиомочевина (2)

(2)

К раствору 2-амино-б-бромпиридина (1) (253,8 г, 1,4б7 моль) в Ό0Μ (2,5 л), охлажденного до 5°С, прибавляют по каплям этоксикарбонилизотиоцианат (173,0 мл, 1,4б7 моль) в течение 15 мин. Затем реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры (20°С) и перемешивают в течение 1б ч. В результате упаривания в вакууме получают твердое вещество, которое можно выделить фильтрованием, тщательно промывают петролейным эфиром (3хб00 мл) и сушат на воздухе, получая (2). Данную тиомочевину можно использовать на следующей стадии как таковую без какой-либо очистки. 'Η (400 МГц, ΟΌΟ13) δ 12,03 (1Н, уш.с, ΝΗ), 8,81 (1Н, д, 1=7,8 Гц, Н-3), 8,15 (1Н, уш.с, ΝΗ), 7,б0 (1Н, т, 1=8,0 Гц, Н-4), 7,32 (1Н, дд, 1=7,7 и 0,б Гц, Н-5), 4,31 (2Н, кв, 1=7,1 Гц, СН2), 1,35 (3Н, т, 1=7,1 Гц, СН3).

1.1.2. 5-Бром-[1,2,4]триазол[1,5-а]пиридин-2-иламин (3)

К суспензии гидрохлорида гидроксиламина (101,8 г, 1,4б5 моль) в смеси ЕЮН/МеОН (1:1, 900 мл) прибавляют Ν,Ν-диизопропилэтиламин (145,3 мл, 0,879 моль) и перемешивают смесь при комнатной температуре (20°С) в течение 1 ч. После этого прибавляют 1-(б-бромпиридин-2-ил)-3карбэтокситиомочевину (2) (89,0 г, 0,293 моль) и смесь медленно нагревают до кипения с обратным холодильником (примечание: для гашения выделяющегося Н2§ необходима поглотительная трубка с хлорной известью). После 3 ч при кипении с обратным холодильником смесь оставляют охлаждаться и фильтруют, выделяя выпавший осадок.

Дополнительное количество продукта выделяют в результате упаривания фильтрата в вакууме, добавления Н2О (250 мл) и фильтрования. Объединенные осадки последовательно промывают Н2О (250 мл), ЕЮН/МеОН (1:1, 250 мл) и ЕьО (250 мл), затем сушат в вакууме, получая производное триазолпиридина (3) в виде твердого вещества. Данное соединение можно использовать на следующей стадии как таковое без какой-либо очистки. 'Н (400 МГц, ДМСО-бб) δ 7,43-7,34 (2Н, м, 2хароматический Н), 7,24 (1Н, дд, 1=б,8 и 1,8 Гц, ароматический Н), б,30 (2Н, уш, N^0; т/ζ 213/215 (1:1, М+Н4, 100%).

1.1.3. (5-Бром-[1,2,4]триазол[1,5-а]пиридин-2-ил)амид циклопропанкарбоновой кислоты (4)

К раствору 2-аминотриазолпиридина (3) (7,10 г, 33,3 ммоль) в сухом ί.Ή3ί’Ν (150 мл) при 5°С добавляют Εΐ3Ν (11,б мл, 83,3 ммоль), после чего добавляют циклопропанкарбонилхлорид (83,3 ммоль). Затем реакционную смесь оставляют нагреваться до температуры окружающей среды и перемешивают до тех пор, пока не израсходуется все исходное вещество (3). При необходимости, для гарантии полного протекания реакции добавляют еще Εΐ3Ν (4,б4 мл, 33,3 ммоль) и циклопропанкарбонилхлорид (33,3 ммоль). После выпаривания растворителя в вакууме полученный остаток обрабатывают 7н. раствором аммиака в метаноле (50 мл) и перемешивают при температуре окружающей среды (в течение 1-1б ч) для гидролиза какого-либо продукта бис-ацилирования. Выделение продукта проводят, удаляя летучие ве

- 1б 020111 щества в вакууме с последующим растиранием в ЕьО (50 мл). Осадки выделяют фильтрованием, промывают Н2О (2x50 мл), ацетоном (50 мл) и Е12О (50 мл), затем сушат в вакууме, получая требуемое бромпромежуточное соединение (4).

Методика синтеза для получения соединения данного изобретения.

Соединение 1.

Стадия 1. Сочетание по Сузуки

К раствору (5-бром-[1,2,4]триазол[1,5-а]пиридин-2-ил)амида циклопропанкарбоновой кислоты (промежуточное соединение 4, 5 г, 0,018 моль) в смеси 1,4-диоксан/вода (5:1) добавляли 4карбоксифенилбороновую кислоту (3,5 г, 0,021 моль). К раствору добавляли К2СО3 (5,0 г, 0,036 моль) и РбСЕбррГ (5%). После этого полученную смесь нагревали традиционным нагреванием на масляной бане при 90°С в течение 16 ч. Добавляли 1 М раствор НС1, и в кислом растворе образовывался осадок. Данный осадок отфильтровывали, сушили в вакууме, получая указанное в заголовке соединение, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Стадия 2. {5-[4-(3,3-Диметилазетидин-1-карбонил)фенил]-[1,2,4]триазол[1,5-а]пиридин-2-ил}амид циклопропанкарбоновой кислоты (соединение 1)

К раствору 4-[2-(циклопропанкарбониламино)-[1,2,4]триазол[1,5-а]пиридин-5-ил]бензойной кислоты (4 г, 0,012 моль) в ОСМ (150 мл) добавляли ΕΌΟ (3,59 г, 0,019 моль), НОВ! (2,53 г, 0,019 моль) и ΌΙРЕА (4,48 мл) при комнатной температуре. Полученную смесь перемешивали в течение 10 мин при комнатной температуре. К раствору добавляли гидрохлоридную соль диметилазетидина (1,64 г, 0,013 моль) и перемешивали смесь в течение 16 ч. К реакционной смеси добавляли воду. Органический слой отделяли и промывали 2н. раствором ЫаОН, 2н. раствором НС1 и водой. Органическую фазу сушили над Мд§О4, фильтровали и упаривали в вакууме. В результате очистки методом флэш-хроматографии (элюент: от смеси 1:1 петролейный эфир/ЕЮАс до чистого Е(ОАс) получали {5-[4-(3,3-диметилазетидин-1карбонил)фенил]-[1,2,4]триазол[1,5-а]пиридин-2-ил}амид циклопропанкарбоновой кислоты.

Соединение данного изобретения, которое было получено или которое можно получить согласно описанному здесь способу синтеза, приведено ниже в табл. I. Спектральные данные ЯМР соединения изобретения представлены в табл. ΙΙ.

Таблица I Данные масс-спектрометрии соединения изобретения

№ соед. Структура Название М МС опр. 1 Н ° {5- [4- (3,3диме тилаз етидин-1карбонил)фенил][1,2,4]триазол[1,5а]пиридин-2 -ил}амид циклопропанкарбоновой кислоты 389,46 390,0

Таблица II

Данные ЯМР соединения изобретения

- 17 020111

№ соед. Данные ЯМР (δ) 1 Рн, ДМСО-ЦЦ 11,01 (1Н, уш, ΝΗ) , 8,08 (2Н, д, АгН), 7,79 (2Н, д, АгН), 7,73 (1Н, д, АгН), 7,72 (1Н, с, АГН) , 7,35 (1Н, дд, АгН), 4,04 (2Н, УШ, СН2) , 3,77 (2Н, уш, СН2), 2,02 (1Н, уш, СН) , 1,27 (6Н, с, 2хСН3) , 0,81 (4Н, м, 2хСН2) .

Биологические примеры. Пример 1. Анализ ίη νίΐΓΟ. Пример 1.1. Анализ ингибирования 1ЛК1.

Рекомбинантную 1ЛК1 человека (каталитический домен, аминокислоты 8бб-1154; номер по каталогу РУ4774) получали от ΙηνίίΓΟ^βη. Инкубировали 1 нг 1ЛК1 с 20 нМ белка и11дк1-1ЛК1(1уг1023) (номер по каталогу Регкт Е1тег ТКЕ0121) в киназном реакционном буфере (25 мМ МОР8 рН б,8, 0,01б% Вгу35, 8,33 мМ МдС12, 3,33 мМ ЭТТ. 7 мкМ АТФ) в присутствии или в отсутствие 4 мкл, содержащих тестируемое соединение или разбавитель (ДМСО, 1% конечная концентрация) в общем объеме 20 мкл на белом планшете 384 Ьиттокас (Сгетег, номер по каталогу 781075). Через б0 мин при комнатной температуре реакции останавливали добавлением 20 мкл/лунку детекторной смеси (1хдетекторный буфер (Регкт Е1тег, номер по каталогу СК97-100С), 0,5 нМ европий-анти-фосфотирозина (РТбб) (Регкт Е1тег, номер по каталогу ЛИ00б8), 10 мМ ЭДТА). Считывание осуществляли с использованием Εηνίδίοη при возбуждении при 320 нм и определяя излучение при б15 нм (Регк1н Е1тег). Киназную активность рассчитывали, вычитая относительные единицы флуоресценции (КЕИ), полученные в присутствии положительного контрольного ингибитора (10 мкМ стауроспорин) из КЕИ, полученных в присутствии разбавителя. Способность тестируемого соединения ингибировать данную активность определяли как процент ингибировання=((КЕυ, определенные для образца в присутствии тестируемого соединения - КЕИ, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором), деленное на (КЕИ, определенные в присутствии разбавителя - КЕИ, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором)) -100.

Получали серийные разбавления дозы для соединений, что позволяет тестировать влияние дозаотклик в анализе 1ЛК1 и вычислить 1С50 для данного соединения. Каждое соединение тестировали стандартным образом при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разбавлением 1/5, 8 точек (20 мкМ-4 мкМ-800 нМ-1б0 нМ-32 нМ-б,4 нМ-1,28 нМ-0,2б нМ) при конечной концентрации 1% ДМСО. При повышении эффективности серий соединения готовят дополнительные разбавления и/или снижают верхнюю концентрацию (например, 5, 1 мкМ). Данные представлены в виде средней 1С50 из анализов±средняя квадратическая ошибка среднего значения.

Таблица ΙΙΙ Значения 1С50 соединения для ίΛΙ<1

В’ Соед. ЦАК1 (нМ) 1 6,6+0,7

Пример 1.2. Анализ на определение К1 1ЛК1.

Для определения К1 с ферментом смешивали различные количества ингибитора и следили за ферментной реакцией как функцией концентрации АТФ. К1 определяли при помощи двойного взаимного графического отображения Кт относительно концентрации соединения (график Вте\уеауег-Вигк). ДАК1 (Ιηνίίτο^η, РУ4774) использовали при конечной концентрации 500 нг/мл. Субстрат представлял собой натриевую соль Ро1у(61и,Туг) (4:1), М.м. 20000-50000 (Б1дта, Р0275). Реакцию проводили в 25 мМ Нерек рН 7,5; 0,01% Т\уеен 20, 10 мМ МдС12 при различных концентрациях АТФ и соединения и останавливали добавлением 150 мМ фосфорной кислоты. Определение включенного фосфата в Ро1у6Т субстрата осуществляли, помещая образцы на фильтрующий планшет (с использованием харвестера, Регкт Е1тег) с последующим промыванием. Включенный 33Р в Ро1уСТ определяют на сцинцилляционном счетчике Торсона! после добавления сцинцилляционной жидкости в фильтрующие планшеты (Регк1н Е1тег).

При тестировании в данном анализе соединения 1 получали значение К1, равное б,9 нМ.

Альтернативным образом, для определения К1 с ферментом смешивали различные количества ингибитора и следили за ферментной реакцией как функцией концентрации АТФ. К1 определяли при помощи двойного взаимного графического отображения Кт относительно концентрации соединения (график Ететеауег-Вигк). В данном анализе использовали 1 нг ДАК1 (ΙηνίΙΐΌ^η, РУ4774). Субстрат представлял собой 50 нМ пептида иНдН-.ТЛК-1 (Туг1023) (Регк1н Е1тег, ТКЕ0121). Реакцию проводили в 25 мМ МОР8 рН б,8, 0,01%, 2 мМ ИТТ, 5 мМ МдС12 Вгу-35 при различных концентрациях АТФ и соединения. Фосфорилированный субстрат определяли с использованием Еи-меченного антифосфотирозинового антитела РТбб (Регк1н Е1тег, ЛИ00б8). Считывание осуществляли при помощи Епуыоп (Регк1н Е1тег) при возбуждении при 320 нм и последующем излучении при б15 и бб5 нм.

- 18 020111

При тестировании в данном анализе соединения 1 получали значение К1, равное 5,6 нМ.

Пример 1.3. Анализ ингибирования 1АК2.

Рекомбинантную 1АК2 человека (каталитический домен, аминокислоты 866-1154; номер по каталогу РУ4210) получали от 1пуйгодеп. Инкубировали 0,0125 тИ 1АК2 с 25 нМ пептида и11дЬ(-ЛАК1((уг1023) (номер по каталогу Регкт Е1тег ТКР0121) в киназном реакционном буфере (41,66 мМ НЕРЕ8 рН 7,0, 0,016% Тгйоп Х-100, 12,5 мМ МдС12, 3,33 мМ ΌΤΤ, 7,5 мкМ АТФ) в присутствии или в отсутствие 4 мкл, содержащих тестируемое соединение или разбавитель (ДМСО, 1% конечная концентрация) в общем объеме 20 мкл на белом планшете 384 Ьиттойас (Стешет, номер по каталогу 781075). Через 60 мин при комнатной температуре реакции останавливали добавлением 20 мкл/лунку детекторной смеси (1хдетекторный буфер (Регкт Е1тег, номер по каталогу СК97-100С), 0,5 нМ европий-антифосфотирозина (РТ66) (Регк1и Е1тег, номер по каталогу АЭ0068). 10 мМ ЭДТА. Считывание осуществляли с использованием Епу18юп при возбуждении при 320 нм и определяя излучение при 615 нм (Регк1и Е1тег). Киназную активность рассчитывали, вычитая относительные единицы флуоресценции (КРИ), полученные в присутствии положительного контрольного ингибитора (10 мкМ стауроспорин) из КРИ, полученных в присутствии разбавителя. Способность тестируемого соединения ингибировать данную активность определяли как процент ингибирования=((КРи, определенные для образца в присутствии тестируемого соединения - КРИ, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором), деленное на (КРИ, определенные в присутствии разбавителя - КРИ, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором)) -100.

Получали серийные разбавления дозы для соединений, что позволяет тестировать влияние дозаотклик в анализе 1АК2 и вычислить 1С50 для данного соединения. Каждое соединение тестировали стандартным образом при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разбавлением 1/5, 8 точек (20 мкМ-4 мкМ-800 нМ-160 нМ-32 нМ-6,4 нМ-1,28 нМ-0,26 нМ) при конечной концентрации 1% ДМСО. При повышении эффективности серий соединения готовят дополнительные разбавления и/или снижают верхнюю концентрацию (например, 5, 1 мкМ). Данные представлены в виде средней 1С50 из анализов±средняя квадратическая ошибка среднего значения.

Таблица IV Значения 1С50 соединения для 1АК2

№ соед. ЦАК2 (нМ) 1 67±5

Пример 1.4. Анализ на определение К1 1АК2.

Для определения К1 с ферментом смешивали различные количества ингибитора и следили за ферментной реакцией как функцией концентрации АТФ. К1 определяли при помощи двойного взаимного графического отображения Кт относительно концентрации соединения (график Ьтетеауег-Вигк). В данном анализе использовали 0,025 тИ 1АК2 (1пуйгодеп, РV4210). Субстрат представлял собой натриевую соль Ро1у(С1и,Туг) (4:1), М.м. 20000-50000 (81дта, Р0275). Реакцию проводили в 10 мМ МОР8 рН 7,5, 0,5 мМ ЭДТА, 0,01% Вгу-35, 1 мМ ΌΤΤ, 15 мМ МдАс при различных концентрациях АТФ и соединения и останавливали добавлением 150 мМ фосфорной кислоты. Определение включенного фосфата в Ро1уСТ субстрата осуществляли, помещая образцы на фильтрующий планшет (с использованием харвестера, Регкт Е1тег) с последующим промыванием. Включенный 33Р в Ро1уСТ определяют на сцинцилляционном счетчике Торсоип! после добавления сцинцилляционной жидкости в фильтрующие планшеты (Регкт Е1тег).

При тестировании в данном анализе соединения 1 получали значение К1, равное 126 нМ.

Альтернативным образом, для определения К1 с ферментом смешивали различные количества ингибитора и следили за ферментной реакцией как функцией концентрации АТФ. К1 определяли при помощи двойного взаимного графического отображения Кт относительно концентрации соединения (график Ыпе^еауег-Вцгк). В данном анализе использовали 0,0125 тИ 1АК2 (1пуйтодеп, РV4210). Субстрат представлял собой 50 нМ пептида υ1ίβ1ιΙ-ΙΛΙ<-1 (Туг1023) (Регкт Е1тег, ТКР0121). Реакцию проводили в 25 мМ НЕРЕ8 рН 7,0, 0,01% Тгйоп Х-100, 2 мМ ОТТ, 7,5 мМ МдС12 при различных концентрациях АТФ и соединения. Фосфорилированный субстрат определяли с использованием Еи-меченного антифосфотирозинового антитела РТ66 (Регкт Е1тег, А00068). Считывание осуществляли при помощи Епизюп (Регкт Е1тег) при возбуждении при 320 нм и последующем излучении при 615 и 665 нм.

При тестировании в данном анализе соединения 1 получали значение К1, равное 35 нМ.

Пример 1.5. Анализ ингибирования 1АК3.

Каталитический домен рекомбинантной 1АК3 человека (аминокислоты 781-1124; номер по каталогу РV3855) получали от 1пуйгодеп. Инкубировали 0,025 МИ 1АК3 с 2,5 мкг субстрата ро1уСТ (номер по каталогу 81дта Р0275) в киназном реакционном буфере (25 мМ Тт рН 7,5, 0,5 мМ ЕСТА, 0,5 мМ NазVО4, 5 мМ Ь-глицеринфосфата, 0,01% Тгйоп Х-100, 1 мкМ нерадиоактивного АТФ, 0,25 мкКи 33Ргамма-АТФ (СЕ Неа11йсате, номер по каталогу АН9968) конечные концентрации)) в присутствии или в отсутствие 5 мкл, содержащих тестируемое соединение или разбавитель (ДМСО, 1% конечная концен

- 19 020111 трация) в общем объеме 25 мкл в полипропиленовом 9б-луночном планшете (Сгетег, У-образное дно). Через 105 мин при 30°С реакции останавливали добавлением 25 мкл/лунку 150 мМ фосфорной кислоты. Все остановленные киназные реакционные смеси переносили в предварительно промытые (75 мМ фосфорной кислотой) 9б-луночные фильтрующие планшеты (Регкш Е1тег, номер по каталогу 6005177) с использованием клеточного харвестера (Регкш Е1тег). Планшеты б раз промывали раствором 75 мМ фосфорной кислоты в количестве 300 мкл на лунку и плотно закрывали дно планшетов. Добавляли 40 мкл/лунку М1сго8С1иЗ-20, плотно закрывали верх планшетов и осуществляли считывание данных с использованием ТорсоииЗ (Регкш Е1тег). Активность киназы рассчитывали, вычитая количество подсчетов в 1 мин (срт), полученных в присутствии положительного контрольного ингибитора (10 мкМ стауроспорина), из срт, полученных в присутствии разбавителя. Способность тестируемого соединения ингибировать данную активность определяли как процент ингибирования=((срт, определенные для образца в присутствии тестируемого соединения - срт, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором), деленное на (срт, определенные в присутствии разбавителя - срт, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором)) -100.

Получали серийные разбавления дозы для соединения, что позволяет тестировать влияние дозаотклик в анализе .ΤΑΚ3 и вычислить 1С50 для данного соединения. Каждое соединение тестировали стандартным образом при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разбавлением 1/3, 8 точек (20 мкМ-б,б7 мкМ-2,22 мкМ-740 нМ-247 нМ-82 нМ-27 нМ-9 нМ) при конечной концентрации 1% ДМСО. При повышении эффективности серий соединения готовят дополнительные разбавления и/или снижают верхнюю концентрацию (например, 5, 1 мкМ). Данные представлены в виде средней 1С50 из анализов±средняя квадратическая ошибка среднего значения.

Таблица V Значения 1С50 соединения для ΙΑΚ3

№ соед. ДАКЗ (нМ) 1 408±62

Пример 1.б. Анализ на определение Κι ΙΑΚ3.

Для определения Κί с ферментом смешивали различные количества ингибитора и следили за ферментной реакцией как функцией концентрации АТФ. Κί определяли при помощи двойного взаимного графического отображения относительно концентрации соединения (график Ьтетеауег-Вигк). ίΑΚ3 (Сагпа В1О8С1еисе8, 09СВ8-0б25В) использовали при конечной концентрации 10 мг/мл. Субстрат представлял собой натриевую соль Ро1у(С1и,Туг) (4:1), М.м. 20000-50000 (81дша, Р0275). Реакцию проводили в 25 мМ Тп8 рН 7,5, 0,01% ТгПоп Х-100, 0,5 мМ ЕСТА, 2,5 мМ ΌΤΤ, 0,5 мМ Ыа3УО4, 5 мМ Ьглицеринфосфота, 10 мМ МдС12 при различных концентрациях АТФ и соединения и останавливали добавлением 150 мМ фосфорной кислоты. Определение включенного фосфата в Ро1уСТ субстрата осуществляли, помещая образцы на фильтрующий планшет (с использованием харвестера, Регкш Е1тег) с последующим промыванием. Включенный 33Р в Ро1уСТ определяют на сцинцилляционном счетчике ТорсошИ после добавления сцинцилляционной жидкости в фильтрующие планшеты (Регкш Е1тег).

При тестировании в данном анализе соединения 1 получали значение Κί, равное 188 нМ.

Пример 1.7. Анализ ингибирования ТУК.2.

Каталитический домен рекомбинантной ТУ1<2 человека (аминокислоты 871-1187; номер по каталогу 08-147) получали от Сагпа Вювшепсев. Инкубировали 5 нг ТУК.2 с 12,5 мкг субстрата ро1уСТ (номер по каталогу 81дта Р0275) в киназном реакционном буфере (25 мМ НЕРЕ8 рН 7,5, 100 мМ ЫаС1, 0,2 мМ Ыа3УО4, 0,1% №-40, 0,1 мкМ нерадиоактивного АТФ, 0,125 мкКи 33Р-гамма-АТФ (СЕ НеаИЪсаге, номер по каталогу АН99б8) конечные концентрации)) в присутствии или в отсутствие 5 мкл, содержащих тестируемое соединение или разбавитель (ДМСО, 1% конечная концентрация) в общем объеме 25 мкл в полипропиленовом 9б-луночном планшете (Сгетег, У-образное дно). Через 90 мин при 30°С реакции останавливали добавлением 25 мкл/лунку 150 мМ фосфорной кислоты. Все остановленные киназные реакционные смеси переносили в предварительно промытые (75 мМ фосфорной кислотой) 9б-луночные фильтрующие планшеты (Регкш Е1тег, номер по каталогу б005177) с использованием клеточного харвестера (Регкш Е1тег). Планшеты б раз промывали раствором 75 мМ фосфорной кислоты в количестве 300 мкл на лунку и плотно закрывали дно планшетов. Добавляли 40 мкл/лунку Мюго8СШ1-20, плотно закрывали верх планшетов и осуществляли считывание данных с использованием ТорсошИ (Регкш Е1тег). Активность киназы рассчитывали, вычитая количество подсчетов в 1 мин (срт), полученных в присутствии положительного контрольного ингибитора (10 мкМ стауроспорина), из срт, полученных в присутствии разбавителя. Способность тестируемого соединения ингибировать данную активность определяли как процент ингибирования=((срт, определенные для образца в присутствии тестируемого соединения - срт, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором), деленное на (срт, определенные в присутствии разбавителя - срт, определенные для образца с положительным контрольным ингибитором))-100.

Получали серийные разбавления дозы для соединения, что позволяет тестировать влияние доза

- 20 020111 отклик в анализе ΤΥΚ2 и вычислить 1С50 для данного соединения. Каждое соединение тестировали стандартным образом при концентрации 20 мкМ с последующим серийным разбавлением 1/3, 8 точек (20 мкМ-б,б7 мкМ-2,22 мкМ-740 нМ-247 нМ-82 нМ-27 нМ-9 нМ) при конечной концентрации 1% ДМСО. При повышении эффективности серий соединения готовят дополнительные разбавления и/или снижают верхнюю концентрацию (например, 5, 1 мкМ). Данные представлены в виде средней 1С50 из анализов±средняя квадратическая ошибка среднего значения.

Таблица VI Значения ΤΥΚ2 1С50 для соединения

№ соед. ΤΥΚ2 (нМ) 1 219±37

Пример 2. Клеточные анализы.

Пример 2.1. Анализ передачи сигнала 1АК-8ТАТ.

Клетки НеЬа выдерживали в минимальной питательной среде Игла, модифицированной Далбекко (ΌΜΕΜ), содержащей 10% инактивированной нагреванием плодной телячьей сыворотки, 100 и/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки НеЬа использовали при 70% слиянии для трансфекции. 20000 клеток в 87 мкл среды клеточной культуры быстро трансфицировали 40 нг репортера р8ТАТ1(2)люциферазы, 8 нг репортера Ьас2 в качестве внутреннего контрольного репортера и 52 нг рВ8К с использованием 0,32 мкл 1е1-РЕ1 (Ро1ур1и§) в качестве реагента трансфекции на лунку в формате 9блуночного планшета. После инкубации в течение ночи при 37°С в присутствии 10% СО2 трансфекционную среду удаляли. Добавляли 75 мкл ΌΜΕΜ и 1,5% инактивированной нагреванием плодной телячьей сыворотки. В течение б0 мин добавляли 15 мкл соединения в концентрации хб,7, а затем 10 мкл О8М человека (Рерго1есй) в конечной концентрации 33 нг/мл.

Все соединения тестировали по два раза, начиная с 20 мкМ с последующим серийным разбавлением 1/3, в целом 8 доз (20 мкМ-б,б мкМ-2,2 мкМ-740 нМ-250 нМ-82 нМ-27 нМ-9 нМ) при конечной концентрации 0,2% ДМСО.

После инкубации в течение ночи при 37°С в присутствии 10% СО2 клетки лизировали в 100 мкл лизисного буфера/лунку (РВ8, 0,9 мМ СаС12, 0,5 мМ МдС12, 5% трегалозы, 0,025% тергитола ΝΓ9. 0,15% В8А).

мкл клеточного лизата использовали для считывания активности β-галактозидазы при добавлении 180 мкл раствора (Юа1 (30 мкл О№6 4 мг/мл и 150 мкл β-галактозидазного буфера (0,0б М №2НРО4, 0,04 М NаН2РО4, 1 мМ МдС12)) в течение 20 мин. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 М №ьС.'О3. Поглощение считывали при 405 нм.

Активность люциферазы определяли при использовании 40 мкл клеточного лизата и 40 мкл 81еа4у1йе®, как описано производителем (Регкш Е1тег), при помощи Επνίβίοη (Регкт Е1тег).

мкМ ингибитора раи-1АК использовали в качестве положительного контроля (100% ингибирования). В качестве отрицательного контроля использовали 0,5% ДМСО (0% ингибирования). Положительный и отрицательный контроль использовали для расчета значений ζ' и ''процента ингибирования (ΗΝ).

Процент ингибирования=((флуоресценция, определенная в присутствии разбавителя - флуоресценция, определенная для образца в присутствии тестируемого соединения), поделить на (флуоресценцию, определенную в присутствии разбавителя флуоресценция, определенную для образца в отсутствие триггера))-100.

Значения ΓΙΝ наносили на график для тестированных соединений в виде зависимости доза-отклик и получали значения ЕС50.

Таблица VII

Значения ЕС50 соединения при передаче сигнала 8ТАТ

№ соед. ЕСзо (нМ) 1 539±130

Пример 2.2. Анализ передачи сигнала О8МЛЬ-1в.

Было показано, что О8М и ГЬ-1 β проявляют синергетическую апрегуляцию уровня ММР13 в клеточной линии хондросаркомы человека 8А11353. Клетки высевали в 9б-луночные планшеты в количестве 15000 клеток/лунку в объеме 120 мкл ЭМЕМ (ШуИгодеи), содержащей 10% (об./об.) БВ8 и 1% смеси пенициллин/стрептомицин (Шуйгодеи), инкубируемой при 37°С и 5% СО2. Клетки предварительно инкубировали в присутствии 15 мкл соединения в среде М199, содержащей 2% ДМСО в течение 1 ч перед запуском при помощи 15 мкл О8М и ЕБ-1в, достигая 25 нг/мл О8М и 1 нг/мл ГБ-1 β, и определяли концентрацию ММР13 в кондиционированной среде в течение 48 ч после запуска. Активность ММР13 определяли с использованием анализа активности захвата антитела. Для этого на 384-луночные планшеты (ΝϋΝ^ 4б0518 Мах18огЬ черный) наносили покрытие 35 мкл 1,5 мкг/мл раствора анти-человеческого антитела ММР13 (Β&Ό 8у51ет5, МАВ511) в течение 24 ч при 4°С. После промывания лунок 2 раза смесью РВ8 и 0,05% Тгееи оставшиеся сайты связывания блокировали 100 мкл 5% нежирного сухого моло

- 21 020111 ка (8айа Сгих. 50-2325. Βίοΐΐο) в РВ8 в течение 24 ч при 4°С. Затем лунки промывали 2 раза смесью РВ8 и 0,05% Ттеееп и добавляли 35 мкл супернатанта культуры в разбавлении 1/10, содержащего ММР13 в блокирующем буфере со 100-кратным разбавлением, и инкубировали в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем лунки дважды промывали смесью РВ8 и 0,05% Ттеееп с последующей активацией ММР13 при добавлении 35 мкл 1,5 мМ ацетата 4-аминофенилртути (АРМА) (81дта, А9563) и инкубировании при 37°С в течение 1 ч. Лунки вновь промывали смесью РВ8 и 0,05% Ттеееп и добавляли 35 мкл субстрата ММР13 (В1ото1, Р-126, флуорогенный субстрат ОтшММР). После инкубирования в течение 24 ч при 37°С определяли флуоресценцию трансформированного субстрата при помощи приборасчетчика Регк1п Е1тег \Уа11ас Εηνίδίοη 2102 Ми1111аЬе1 Веабег (длина волны возбуждающего света: 320 нм, длина волны излучаемого света: 405 нм).

Процент ингибирования=((флуоресценция, определенная в присутствии разбавителя - флуоресценция, определенная для образца в присутствии тестируемого соединения), поделить на (флуоресценцию, определенную в присутствии разбавителя флуоресценция, определенную для образца в отсутствие триггера))-100.

Данные выражены в виде среднего ЕС50 из анализов±средняя квадратическая ошибка среднего значения.

Таблица VIII Значения ЕС50 ММР13 соединения

№ соед. ес50 (нМ) 1 4196±2370

Пример 2.3. Анализ пролиферации РВЬ.

Лимфоциты периферической крови человека (РВЬ) стимулировали 1Ь-2 и определяли пролиферацию с использованием анализа на встраивание ВгйИ. Сначала РВЬ стимулировали в течение 72 ч РНА для индуцирования рецептора 1Ь-2, выдерживали без питания в течение 24 ч, чтобы остановить пролиферацию клеток, затем стимулировали 1Ь-2 еще в течение 72 ч (включая 24-часовое введение метки в ВгбИ). Клетки преинкубировали с тестируемыми соединениями в течение 1 ч перед добавлением 1Ь-2. Клетки выращивали в РРМ1 1640, содержащей 10% (об./об.) ЕВ8.

Пример 2.4. Анализ цельной крови (\УВА).

2.4.1. Протокол стимуляции ΙΕΝα.

Для прогноза селективности тестируемых соединений в отношении ингибирования 1АК1- по сравнению с 1АК2-зависимыми путями передачи сигнала ίη νίνο была создана физиологически релевантная модель ίη νίίτο с использованием цельной крови человека. В анализе \УВА кровь, взятую у людейдобровольцев, давших информированное согласие, обрабатывали ех νίνο соединением (11), а затем стимулировали либо в течение 30 мин интерфероном (ΙΕΝα, 1АК1-зависимый путь передачи сигнала), либо в течение 2 ч гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (6М-С8Р, 1АК2зависимый путь передачи сигнала).

2.4.1.1. Анализ фосфо-8ТАТ1.

При стимуляции ΙΕΝα увеличение фосфорилирования передатчиков сигнала и активаторов транскрипции 1 (р8ТАТ1) под действием ΙΕΝα в экстрактах белых кровяных клеток определяли при помощи анализа р8ТАТ1 ЕЫ8А. Фосфорилирование передатчика сигнала и активаторов транскрипции 1 (8ТАТ1) после инициирования интерфероном альфа (ΙΕΝα) представляет собой 1АК1-опосредованное событие. Анализ фосфо-8ТАТ1, который использовали для определения уровня фосфо-8ТАТ1 в экстрактах клеток, разрабатывали для того, чтобы оценить способность соединения ингибировать 1АК1-зависимые пути передачи сигнала.

Цельную человеческую кровь, взятую у людей-добровольцев, давших информированное согласие, обрабатывали ех νίνο соединением (11), а затем стимулировали в течение 30 мин ΙΕΝα. Увеличение фосфорилирования 8ТАТ1 под действием ΙΕΝα в экстрактах белых кровяных клеток определяли при помощи анализа фосфо-8ТАТ1 ЕЫ8А.

АСК-лизисный буфер включал в себя 0,15 М ИН4С1, 10 мМ КНСО3, 0,1 мМ ЭДТА. рН буфера составлял 7,3.

10-кратный концентрат клеточного лизисного буфера (часть набора для иммуноферментного анализ ЕЫ8А сэндвич-типа Ра1118сан Р1ю5р1ю-8ТАТ1 (Туг701) от Се11 δί^ηπΕη^) разбавляли в 10 раз Н2О. Перед использованием в буфер добавляли ингибиторы протеиназы.

мкг ΙΕΝα растворяли в 40 мкл Н2О, получая 500 мкг/мл исходного раствора. Данный исходный раствор хранили при -20°С.

Готовили 3-кратные серийные разбавления соединения в ДМСО (максимальная концентрация: 10 мМ). Затем данное соединение дополнительно разбавляли средой (фактор разбавления зависит от требуемой конечной концентрации соединения).

2.4.1.1.1. Инкубирование крови с соединением и стимуляция ΙΕΝα.

Человеческую кровь собирали в гепаринизированные пробирки. Данную кровь делили на аликвоты

- 22 020111 по 392 мкл. Затем к каждой аликвоте добавляли 4 мкл разбавления соединения и инкубировали пробы крови в течение 1 ч при 37°С. Исходный раствор ΙΡΝα разбавляли в 1000 раз средой КРМ1, получая 500 нг/мл рабочего раствора. К пробам крови добавляли 4 мкл 500 нг/мл рабочего раствора (конечная концентрация ΙΡΝη: 5 нг/мл). Пробы инкубировали при 37°С в течение 30 мин.

2.4.1.1.2. Получение экстрактов клеток.

В конце периода стимуляции к пробам крови добавляли 7,6 мл буфера АСК для лизирования красных кровяных клеток. Пробы перемешивали, переворачивая пробирки пять раз, и инкубировали реакционную смесь на льду в течение 5 мин. В процессе данного инкубирования лизис ВВС должен был быть очевидным. Клетки осаждали центрифугированием при 300 д, 4°С в течение 7 мин и удаляли супернатант. В каждую пробирку добавляли 10 мл 1хРВ8 и повторно суспендировали осадок после центрифугирования. Пробы вновь центрифугировали при 300 д, 4°С. Супернатант удаляли и вновь суспендировали осадок после центрифугирования в 500 мкл 1хРВ8. Затем клеточную суспензию переносили в чистую пробирку для микроцентрифугирования на 1,5 мл. Клетки осаждали центрифугированием при 700 д в течение 5 мин при 4°С. Супернатант удаляли и растворяли осадок в 150 мкл клеточного лизисного буфера. Пробы инкубировали на льду в течение 15 мин. После этого пробы хранили при -80°С до дальнейшей обработки.

2.4.1.1.3. Определение фосфорилирования 8ТАТ1 методом ЕЫ8А.

Для определения уровня фосфо-8ТАТ1 использовали набор для иммуноферментного анализ ЕЫ8Л сэндвич-типа РаИ8саи Р1ю5р1ю-8ТЛТ1 (Туг701) от Се11 81диа11ид (по каталогу № 7234).

Экстракты клеток размораживали на льду. Пробирки цетрифугировали в течение 5 мин при 16000 д, 4°С и получали просветленные лизаты. В то же время микролуночные полоски из набора приводили в равновесие при комнатной температуре и готовили промывной буфер, разбавляя промывной буфер 20хН2О. Пробы разбавляли в 2 раза разбавителем проб и добавляли 100 мкл в микролуночные полоски. Полоски инкубировали в течение ночи при 4°С.

На следующий день лунки 3 раза промывали промывным буфером. В лунки добавляли 100 мкл детекторного антитела. Полоски инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Затем лунки снова 3 раза промывали промывным буфером. В каждую лунку добавляли 100 мкл НВР-связанного вторичного антитела и инкубировали пробы при 37°С. Через 30 мин лунки снова промывали 3 раза и во все лунки добавляли 100 мкл субстрата ТМВ. Когда цвет проб изменялся на синий, для остановки реакции добавляли 100 мкл 8ТОР-раствора. Поглощение измеряли при 450 нм.

2.4.1.2. ЕЫ8А 1Ь-8.

При стимуляции ОМ-С8Р повышение концентрации интерлейкина-8 (1Ь-8) в плазме крови определяли при помощи анализа 1Ь-8 методом ЕЬ18А. Индуцированная экспрессия 1Ь-8 гранулоцитарномакрофагальным колониестимулирующим фактором (ОМ-С8Р) представляет собой 1АК2опосредованное событие. ЕЬ18А 1Ь-8, который можно использовать для определения концентрации 1Ь-8 в образцах плазмы, разрабатывали для того, чтобы оценить способность соединения ингибировать 1АК2зависимые пути передачи сигнала.

Цельную человеческую кровь, взятую у людей-добровольцев, давших информированное согласие, обрабатывали ех νίνο соединением (1и), а затем стимулировали в течение 2 ч ОМ-С8Р. Увеличение концентрации 1Ь-8 в плазме крови определяли методом ЕЬ18А 1Ь-8.

мкг ОМ-С8Р растворяли в 100 мкл Н2О, получая 100 мкг/мл исходного раствора. Данный исходный раствор хранили при -20°С.

Готовили 3-кратные серийные разбавления тестируемого соединения в ДМСО (максимальная концентрация: 10 мМ). Затем данное соединение дополнительно разбавляли средой (фактор разбавления зависит от требуемой конечной концентрации соединения).

2.4.1.2.1. Инкубирование крови с соединением и стимуляция ОМ-С8Р.

Человеческую кровь собирали в гепаринизированные пробирки. Данную кровь делили на аликвоты по 245 мкл. Затем к каждой аликвоте добавляли 2,5 мкл разбавления соединения и инкубировали пробы крови в течение 1 ч при 37°С. Исходный раствор ОМ-С8Р разбавляли в 100 раз средой ВРМ1, получая 1 мкг/мл рабочего раствора. К пробам крови добавляли 2,5 мкл 1 мкг/мл рабочего раствора (конечная концентрация ОМ-С8Р: 10 нг/мл). Пробы инкубировали при 37°С в течение 2 ч.

2.4.1.2.2. Получение образцов плазмы.

Пробы центрифугировали в течение 15 мин при 1000 д, 4°С.

Получали 100 мкл плазмы и хранили при -80°С до дальнейшего использования.

2.4.1.2.3. Определение концентрации 1Ь-8 методом ЕЫ8А.

Для определения концентрации 1Ь-8 использовали набор для хемилюминесцентного иммуноферментного анализа 1Ь-8 человека от Β&Ό 8у51ет5 (по каталогу № 08000В).

Промывной буфер готовили, разбавляя промывной буфер 10хН2О. Рабочий О1о-реагент получали, добавляя 1 часть О1о-реагента 1 к 2 частям О1о-реагента В в течение от 15 мин до 4 ч перед использованием.

В каждую лунку добавляли 100 мкл разбавителя анализа ΚΟΙ-86. После этого добавляли 50 мкл об

- 23 020111 разца (плазмы). ЕЬ18А-планшет инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре, 500 об/мин. Все лунки 4 раза промывали промывным буфером и в каждую лунку добавляли 200 мкл конъюгата 1Ь-8. После инкубирования в течение 3 ч при комнатной температуре лунки 4 раза промывали промывным буфером и добавляли в каждую лунку 100 мкл рабочего С1о-реагента. ЕЬ18А-планшет инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре (защищали от света). Измеряли люминесценцию (время считывания 0,5 с/лунку).

2.4.1.4. Результаты.

р1С50 соединения 1 при ингибировании ΙΝΡα-вызванного повышения концентрации р8ТАТ1 составило 6,32±0,07 (8ЕМ), тогда как р1С50 при ингибировании СМ-С8Г-вызванного повышения 1Ь-8 составило 4,87±0,13 (8ЕМ) (результаты получены при использовании 6 доноров крови). Это показывает, что соединение 1 в 28 раз более селективно в отношении 1АК1-пути. чем в отношении 1АК2-пути. Следовательно, в клеточном окружении понятно, что соединение 1 проявляет селективность в отношении 1АК1 по сравнению с 1АК2. По-видимому, соединение 1 проявляет большую селективность в отношении 1АК1, чем в отношении 1АК2, по сравнению с известными структурно родственными соединениями или другими известными ингибиторами 1АК.

2.4.1.3. Обработка данных лечения и результаты.

С целью дальнейшего уточнения результатов данные ингибирования индукции фосфо-8ТАТ1 под действием ΙΝΡα в экстрактах клеток или ингибирования индукции 1Ь-8 под действием СМ-С8Р в плазме наносили на график относительно концентрации соединения и получали значения 1С50 при использовании программного обеспечения СгарНраб. Данные сохранялись, если Я2 превышал 0,8 и наклон горба был меньше 3, и сохраняли только тех доноров, для которых в обоих анализах получали достоверные данные.

Например, при представлении в данный дополнительный протокол анализа данных определенная р1С50 соединения 1 в случае ингибирования вызванного ΙΝΡα повышения концентрации р8ТАТ1 составляла 6,21±0,09 (8ЕМ), тогда как р1С50 в случае ингибирования 6М-С8Р-вызванного повышения 1Ь-8 составило 4,97±0,14 (8ЕМ) (результаты получены при использовании 6 доноров крови). Это подтверждает то, что соединение 1 в 17,6 раз более селективно в отношении 1АК1-пути, чем в отношении 1АК2-пути. Следовательно, в клеточном окружении понятно, что соединение 1 проявляет селективность в отношении 1АК1 по сравнению с 1АК2. По-видимому, соединение 1 проявляет большую селективность в отношении 1АК1, чем в отношении 1АК2, по сравнению с известными структурно родственными соединениями или другими известными ингибиторами 1АК.

2.4.2. Протокол стимуляции 1Ь-6.

Для установления селективности соединения в отношении 1АК1 по сравнению с 1АК2 был также проведен проточный цитометрический анализ ех νίνο с использованием человеческой цельной крови. Таким образом, кровь брали у людей-добровольцев, давших информированное согласие. После этого кровь приводили в равновесие в течение 30 мин при 37°С при осторожном качании, затем отбирали аликвоты в пробирки Эппендорфа. Добавляли соединение в различной концентрации и инкубировали при 37°С в течение 30 мин, а затем стимулировали в течение 20 мин при 37°С при осторожном качании интерлейкином 6 (1Ь-6) для стимуляции 1АК1-зависимого пути или СМ-С8Р для стимуляции 1АК2зависимого пути. После этого проводили оценку фосфо-8ТАТ1 и фосфо-8ТАТ5 при использовании анализа РАС8.

2.4.2.1. Анализы фосфо-8ТАТ1.

В случае 1Ь-6-стимулированного увеличения фосфорилирования переносчиков сигнала и активаторов транскрипции 1 (р8ТАТ1) в белой кровяной клетке человеческую цельную кровь, полученную у людей-добровольцев, которые дали информированное согласие, обрабатывали ех νίνο соединением в течение 30 мин, а затем стимулировали в течение 20 мин 1Ь-6. Увеличение фосфорилирования 8ТАТ1 под действием 1Ь-6 в лимфоцитах определяли с использованием анти-фосфо-8ТАТ1 антитела при помощи РАС8.

5-кратный буфер Ьу8е/Г1х (ΒΌ ΡΙιοΜΙολν, по каталогу № 558049) разбавляли в 5 раз дистиллированной водой и предварительно нагревали при 37°С. Оставшийся разбавленный Ьуке/Нх буфер отбрасывали.

мкг гЫЬ-6 (Я&Э 8у51ет5, по каталогу № 206-1Я) растворяли в 1 мл РВ8 0,1% В8А, получая 10 мкг/мл исходного раствора. Данный исходный раствор хранили в виде аликвот при -80°С.

Готовили 3-кратное серийное разбавление соединения в ДМСО (10 мМ исходного раствора). В образцы, обработанные контрольным веществом, добавляли ДМСО вместо соединения. Все образцы инкубировали при 1% конечной концентрации ДМСО.

2.4.2.1.1. Инкубирование крови с соединением и стимуляция действием 1Ь-6.

Человеческую кровь собирали в гепаринизированные пробирки. Данную кровь делили на аликвоты по 148,5 мкл. Затем к каждой аликвоте добавляли 1,5 мкл разбавления соединения и инкубировали пробы крови в течение 30 мин при 37°С при осторожном качании. К пробам крови добавляли исходный раствор 1Ь-6 (1,5 мкл) (конечная концентрация 10 нг/мл) и инкубировали пробы при 37°С в течение 20 мин

- 24 020111 при осторожном качании.

2.4.2.1.2. Препарат белых кровяных клеток и введение метки СЭ4.

В конце периода стимулирования 3 мл 1-кратного предварительно нагретого буфера Ьуке-Их мгновенно добавляли в пробы крови, недолгое время перемешивали вращением и инкубировали в течение 15 мин при 37°С на водяной бане, чтобы лизировать красные кровяные клетки и фиксировать лейкоциты, затем замораживали при -80°С до дальнейшего использования.

Для следующих стадий пробирки размораживали при 37°С в течение приблизительно 20 мин и центрифугировали в течение 5 мин при 400 д при 4°С. Осадок после центрифугирования промывали 3 мл холодного 1хРВ8 и после центрифугирования клеточный осадок повторно суспендировали в 100 мкл РВ8, содержащем 3% В8А. Добавляли НТС-конъюгированное анти-СО4 антитело или контрольное НТС-конъюгированное изотопное антитело и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, в темноте.

2.4.2.1.3. Пермеабилизация клеток и введение метки анти-фосфо-8ТАТ1 антителом.

После промывания клеток 1хРВ8 клеточный осадок повторно суспендировали в 100 мкл ледяного 1хРВ8 и добавляли 900 мкл ледяного 100%-ного метанола. Затем клетки инкубировали при 4°С в течение 30 мин для пермеабилизации.

После этого пермеабилизованные клетки промывали 1хРВ8, содержащим 3% В8А и, наконец, повторно суспендировали в 80 мкл 1хРВ8, содержащем 3% В8А.

Добавляли и перемешивали 20 мкл РЕ мышиного анти-8ТАТ1 (ρΥ701) или РЕ мышиного 1дО2аК изотопного контрольного антитела (ВО Вюкшепсек, по каталогу №№ 612564 и 559319 соответственно), затем инкубировали в течение 30 мин при 4°С в темноте.

После этого клетки однократно промывали 1хРВ8 и анализировали на проточном цитометре ЕАС8С’ап1о II (ВО Вюкшепсек).

2.4.2.1.4. Флуоресцентный анализ на ЕАС8Сап1о II.

Подсчитывали в целом 50000 событий и определяли фосфо-8ТАТ1 положительные клетки после стробирования на ΟΩ4+ клетках в лимфоцитарном гейте. Данные анализировали при помощи программного обеспечения ЕАС8О|уа, и они соответствовали проценту ингибирования стимуляции ГЬ-б, рассчитанному на процентную долю положительных клеток для фосфо-8ТАТ1 на СЭ4+ клетках.

2.4.2.2. Анализ фосфо-8ТАТ5.

В случае 6М-С8Е-стимулированного увеличения фосфорилирования переносчиков сигнала и активаторов транскрипции 5 (р8ТАТ5) в белой кровяной клетке человеческую цельную кровь, полученную у людей-добровольцев, которые дали информированное согласие, обрабатывали ех у1уо соединением в течение 30 мин, а затем стимулировали в течение 20 мин СМ-С8Е. Увеличение фосфорилирования 8ТАТ5 под действием ОМ-С8Е в моноцитах определяли с использованием анти-фосфо-8ТАТ5 антитела при помощи ЕАС8.

5-кратный буфер Ьуке/Нх (ВО РйокНоте, по каталогу № 558049) разбавляли в 5 раз дистиллированной водой и предварительно нагревали при 37°С. Оставшийся разбавленный Ьуке/Нх буфер отбрасывали.

мкг г11СМ-С’8Е (АЬСук 8. А., по каталогу № Р300-03) растворяли в 100 мкл РВ8 0,1% В8А, получая 100 мкг/мл исходного раствора. Данный исходный раствор хранили в виде аликвот при -80°С.

Готовили 3-кратное серийное разбавление соединения в ДМСО (10 мМ исходного раствора). В образцы, обработанные контрольным веществом, добавляли ДМСО вместо какого-либо тестируемого соединения. Все образцы инкубировали при 1% конечной концентрации ДМСО.

2.4.2.2.1. Инкубирование крови с соединением и стимуляция действием СМ-С8Е.

Человеческую кровь собирали в гепаринизированные пробирки. Данную кровь делили на аликвоты по 148,5 мкл. Затем к каждой аликвоте добавляли 1,5 мкл разбавления соединения и инкубировали пробы крови в течение 30 мин при 37°С при осторожном качании. К пробам крови добавляли исходный раствор СМ-С8Е (1,5 мкл) (конечная концентрация 20 пг/мл) и инкубировали пробы при 37°С в течение 20 мин при осторожном качании.

2.4.2.2.2. Препарат белых кровяных клеток и введение метки СЭ14.

В конце периода стимулирования 3 мл 1-кратного предварительно нагретого буфера Ьуке-Нх мгновенно добавляли в пробы крови, недолгое время перемешивали вращением и инкубировали в течение 15 мин при 37°С на водяной бане, чтобы лизировать красные кровяные клетки и фиксировать лейкоциты, затем замораживали при -80°С до дальнейшего использования.

Для следующих стадий пробирки размораживали при 37°С приблизительно в течение 20 мин и центрифугировали в течение 5 мин при 400 д при 4°С. Клеточный осадок промывали 3 мл холодного 1хРВ8 и после центрифугирования клеточный осадок повторно суспендировали в 100 мкл РВ8, содержащем 3% В8А. Добавляли НТС мышиное анти-СО14 антитело (ВО Вюкшепсек, по каталогу № 345784) или контрольное НТС мышиное !дС2Ы< изотопное антитело (ВО Вюкшепсек, по каталогу № 555057) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, в темноте.

2.4.2.2.3. Пермеабилизация клеток и введение метки анти-фосфо-8ТАТ5 антителом.

- 25 020111

После промывания клеток 1хРВ8 клеточный осадок повторно суспендировали в 100 мкл ледяного 1хРВ8 и добавляли 900 мкл ледяного 100%-ного метанола. Затем клетки инкубировали при 4°С в течение 30 мин для пермеабилизации.

После этого пермеабилизованные клетки промывали 1хРВ8, содержащим 3% В8А, и, наконец, повторно суспендировали в 80 мкл 1 хРВ8, содержащем 3% В8А.

Добавляли и перемешивали 20 мкл РЕ мышиного анти-8ТАТ5 (ρΥ694) или РЕ мышиного 1дС1К изотопного контрольного антитела (ВО ВЧоксЧепсек, по каталогу №№ 612567 и 554680 соответственно), затем инкубировали в течение 30 мин при 4°С в темноте.

После этого клетки однократно промывали 1хРВ8 и анализировали на проточном цитометре ЕАС8СапЧо II (ВО ВЧоксЧепсек).

2.4.2.2.4. Флуоресцентный анализ на ЕАС8Сап!о II.

Подсчитывали в целом 50000 событий и определяли фосфо-8ТАТ5 положительные клетки после стробирования на СЭ14+ клетках. Данные анализировали при помощи программного обеспечения ЕАС8О1уа, и они соответствовали проценту ингибирования стимуляции СМ-С8Е, рассчитанному на процентную долю положительных клеток для фосфо-8ТАТ5 на СЭ14+ клетках.

2.4.2.3. Результаты.

При представлении в данный протокол для соединения данного изобретения определяли процент ингибирования (РЮ), полученный из среднего значения 3 здоровых добровольцев. Например, тестировали соединение 1 и возвращались к ρ^5ο=6,61 при ингибировании 8ТАТ1 фосфорилирования и ρ^5ο=5,37 при ингибировании 8ТАТ5 фосфорилирования.

При сравнении влияния соединения 1 на 8ТАТ1 (ЧАК1-зависимый путь) и 8ТАТ5 (1АК2-зависимый путь) определяли 17,6-кратную селективность для ЧАК1 относительно ЧАК2.

Пример 3. Модели ίη νίνο.

Пример 3.1. Модель СЧА.

3.1.1. Материалы.

Полный адъювант Фрейнда (СЕА) и неполный адъювант Фрейнда (ЧЕА) приобретали у Эйсо. Коллаген коровы II типа (СП), липополисахарид (ЬР8) и энбрель приобретали у СЕопйгех (Ше й'АЬеан, Франция); 8щша (Ые й'АЬеан, Франция), \У11уе!! (25 мг шприц для инъекций, Франция) Асгок ОгдапЧск (Ра1о А1!о, СА) соответственно. Все остальные используемые реагенты были химически чистыми, и все растворители были аналитически чистыми.

3.1.2. Животные.

Крыс темного окраса агути (самцы, возраст 7-8 недель) получали из Наг1ап ЬаЬогаЧопек (МащопА1Гог1, Франция). Мышей ЭВА/1Ч (самцы, возраст 7 недель) получали из СепЧге й'Е1еуаде е! бе КергойнсЕоп ЧАКУЧЕК (СЕЮ) (Лаваль, Франция). Крыс и мышей выдерживали в 12-часовом цикле смены свет/темнота (0700-1900). Температуру поддерживали при 22°С, пищу и воду предоставляли свободно.

3.1.3. Вызванный коллагеном артрит (С'ЧА).

За один день до опыта готовили раствор СП (2 мг/мл) с содержанием 0,05 М уксусной кислоты и хранили при 4°С. Непосредственно перед иммунизацией смешивали равные объемы адъюванта ПЕА) и СП при помощи гомогенизатора в предварительно охлажденной стеклянной бутылке на водной бане со льдом. Лишний адъювант и продолжительная гомогенизация могут потребоваться, если не образуется эмульсии.

Мыши: делали инъекцию 0,1 мл эмульсии чрескожно в основание хвоста каждой мыши на 1 день, вторую бустер-дозу чрескожной инъекции (СП раствор при 1 мг/мл в СЕА 0,1 мл физиологического раствора) осуществляли на 21 день. Способ иммунизации модифицировали исходя из опубликованных способов (Οηνίά Ό. Вгапй, Кагу А. ЬаШат & ЕФгагй Е. КоНошес. Со11адеп-тйисей айЬпПк. №1!иге те!1юЙ5 2(5):1269-1275, 2007).

Крысы: делали инъекцию 0,2 мл эмульсии чрескожно в основание хвоста каждой крысе на 1 день, вторую бустер-дозу чрескожной инъекции (СП раствор при 2 мг/мл в СЕА 0,1 мл физиологического раствора) осуществляли на 9 день. Способ иммунизации модифицировали исходя из опубликованных способов (8ίηΐ5 NА е! а1, (2004) ТагдеПпд о51еос1а515 \νί!1ι хо1ейгошс асЛ ргеуеп(5 Ьопе йекЧгисПоп ш со11адепшйисей айЬгйщ, Аг!11п!15 КЬеит. 50 2338-2346; Чои е! а1., 2005).

3.1.4. Организация исследования.

Терапевтические эффекты тестируемых соединений исследовали на модели крысы или мыши СЧА. Животных разделяли случайным образом на равные группы, и в каждой группе содержалось 10 животных. Всех крыс вакцинировали на 1 день и повторно вакцинировали на 9 день. Всех мышей вакцинировали на 1 день и повторно вакцинировали на 21 день. Терапевтическое дозирование длилось с 16 по 30 день. Отрицательная контрольная группа получала разбавитель (МС 0,5%) и положительная контрольная группа - энбрель (10 мг/кг, 3 недели, к.с.). Рассматриваемое соединение обычно тестировали в виде 3 доз, например 3, 10, 30 мг/кг, р.о.

3.1.5. Клиническая оценка артрита.

Проводили оценку артрита согласно способу КЬасЫдЧап 2006, Ып е! а1. 2007 и ΝίκΗίάη е! а1. 2004.

- 26 020111

Опухание каждой из четырех лап расценивали по артритической оценке следующим образом: 0 - нет симптомов, 1 - слабая, но четко выраженная краснота одного типа суставов, такого как лодыжка, или запястье, или явная краснота и опухлость, ограниченные отдельными пальцами, вне зависимости от числа пораженных пальцев, 2 - умеренная краснота и опухлость двух или более типов суставов, 3 - сильная краснота и опухлость целой лапы, включая пальцы, 4 - максимально воспаленная конечность с вовлечением многочисленных суставов (максимальная совокупная клиническая артритическая оценка 16 на животное) (Νίδΐιίάα е) а1., 2004).

Чтобы допустить мета-анализ многочисленных исследований, значения клинической оценке нормировали следующим образом:

АИС клинической оценки (АИС оценки): площадь под кривой (АИС) с 1 по 14 день вычисляли для каждой отдельной крысы. АИС для каждого животного делили на среднюю АИС, полученную для разбавителя в исследовании, из которого получали данные относительно данного животного, и умножали на 100 (то есть АИС выражали в виде процентной доли средней АИС разбавителя на исследование).

Возрастание клинической оценки с 1 по 14 день (счет конечной точки): разницу в клинической оценке для каждого животного делили на среднюю разницу в клинической оценке, полученную для разбавителя в исследовании, из которого получали данные относительно данного животного, и умножали на 100 (то есть АИС выражали в виде процентной доли средней клинической оценки разбавителя на исследование).

3.1.6. Изменение массы тела (%) после начала артрита.

Клинически потеря массы тела связана с артритом (Ы1с11оп е) а1., 2005; АгдИск е) а1., 1998; Ка11, 2004; \ν;·ι15ΐηί11ι е) а1., 2004). Следовательно, изменение массы тела после начала артрита можно использовать в качестве неспецифической конечной точки для оценки влияния терапевтических средств на модель крысы. Изменение массы тела (%) после начала артрита можно вычислить следующим образом:

Мыши масса телз^ недель) — масса тела^5 иеДеЛ|.) масса тела(5 нелель)

Крысы масса тела(4 недедИ) — масса телар недели) χ масса тела^з недеЛн)

3.1.7. Оценка по Ларсену.

После смерти оценку по Ларсену выводили для обеих задних лапок всех крыс по меньшей мере 2 ученых. Вычисляли среднее значение данных оценок, получая одну оценку по Ларсену на крысу. Чтобы было можно провести сравнение оценок по Ларсену между исследованиями, оценку по Ларсену для каждой крысы делили на среднюю оценку по Ларсену, полученную для разбавителя в исследовании, к которому относится крыса, и умножить на 100 (то есть выражая оценку по Ларсену в виде процентной доли средней клинической оценки разбавителя на исследование). Рассчитывали и сравнивали среднюю оценку по Ларсену для различных групп, получавших лечение.

3.1.8. Рентгенологическое исследование.

Делали рентгеновские снимки задних лап каждого отдельного животного. Каждой из фотографий давали случайный слепой идентификационный номер, а тяжесть эрозии кости ранжировали при помощи двух независимых оценок системы радиологической оценки Ларсена следующим образом: 0 - нормальная с незатронутыми контурами костей и нормальным суставным пространством; 1 - легкая аномалия с одной или двумя внешними плюсневыми костями, в которых проявляется небольшая эрозия костей; 2 определенная ранняя аномалия с проявлением эрозии костей для трех-пяти внешних плюсневых костей; 3 - средняя деструктивная аномалия, при которой для всех внешних плюсневых костей, а также для любой одной или двух внутренних плюсневых костей проявляется определенная эрозия костей; 4 - тяжелая деструктивная аномалия, при которой для всех внешних плюсневых костей проявляется определенная эрозия костей и по меньшей мере один из внутренних плюсневых суставов полностью эродирован с частично сохранившимися контурами костей сустава; 5 - уродующая аномалия без контуров костей. Данная система оценок представляет собой модификацию от 5>;·ι1νοιηίπί е) а1., 2001; ВикЬ е) а1., 2002; §1т8 е) а1., 2004; 1ои е) а1., 2005.

3.1.9. Гистологический анализ.

После рентгенологического анализа задние лапки мышей фиксировали в 10% формалине с фосфатным буфером (рН 7,4), декальцинировали при помощи быстрого декальцификатора костей для высококачественного гистологического анализа (ЬаЬога)опе5 ЕигоЫо) и заливали парафином. Чтобы гарантировать исчерпывающую оценку артритических суставов, делали по меньшей мере четыре серийных среза (толщиной 5 мкм) и между каждой серией срезов делали промежутки по 100 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е). Гистологические исследования синовиального воспаления и повреждения костей и хрящевой ткани проводили двойным слепым методом. Для каждой лапки оценивали четыре параметра с использованием четырехточечной шкалы. Данные параметры представляли собой клеточную инфильтрацию, серьезность паннуса, эрозию хрящевой ткани и эрозию костей. Оценку проводили следующим образом: 1 - нормальная, 2 - легкая, 3 - умеренная, 4 - выраженная. Четыре данных оценки

- 27 020111 суммировали и представляли в виде дополнительной оценки, а именно общей оценки КА. Чтобы дать возможность сравнить гистологические отсчеты для разных исследований, общую гистологическую оценку для каждой крысы делили на среднюю общую гистологическую оценку, полученную для разбавителя в исследовании, к которому относится крыса, и умножали на 100 (то есть общую гистологическую оценку выражали в виде процентной доли средней общей гистологической оценки разбавителя на исследование). Проводили расчет и сопоставление средней общей гистологической оценки для различных групп, получавших лечение.

3.1.10. Микрокомпьютерный томографический (цСТ) анализ калканеуса (пяточной кости).

Разрушение кости, наблюдаемое при КА, происходит, главным образом, в кортикальном слое кости и может быть обнаружено методом цСТ анализа (81т§ Ν.Α. е! а1., 2004; ОЧе Ь. е! а1., ЕСТС Моп!геа1 2007). После сканирования и 3Э-объемной реконструкции пяточной кости разрушение кости определяют как число дискретных объектов, присутствующих на слайде, выделенных ίη чйсо перпендикулярно продольной оси кости. Чем больше разрушенная кость, тем больше дискретных объектов выделено. Анализируют 1000 срезов, равномерно распределенных вдоль пяточной кости (с промежутком около 10,8 мкм).

3.1.11. Результаты.

Соединение 1 тестировали в исследовании С1А на мышах в количестве 30 мг/кг и в исследовании С1А на крысах в количестве 30, 10, 3 и 1 мг/кг. Соединение 1 оказалось эффективным при всех отсчетах, осуществленных в исследовании С1А на крысах, при статистической достоверности в нескольких отсчетах, в частности значительные улучшения наблюдались для АИС клинической оценки (от 10 мг/кг), конечной клинической оценки (от 1 мг/кг), оценки по Ларсену (от 30 мг/кг) и опухания лапки (от 1 мг/кг).

Пример 3.2. Модель септического шока.

Инъекция липополисахарида (ЬР8) вызывает быстрое высвобождение растворимых рецепторов фактора некроза опухоли (Т№а) в периферию. Данную модель используют для анализа предполагаемых блокаторов высвобождения Т№ ίη νί\Ό.

Шесть самок мышей ВАЬВ/с1 (20 г) на группу лечат однократно заданными дозами, р.о. Через 30 мин делают ί.ρ. инъекцию ЬР8 (15 мкг/кг, серотип Е. Сой 0111:В4). Через 90 мин мышей подвергают эвтаназии и собирают кровь. Концентрации циркулирующего Т№а определяют при помощи коммерчески доступных наборов ЕЬ18А. В качестве контрольного противовоспалительного соединения используют дексаметазон (5 мкг/кг). Выбранные соединения тестируют при одной или многократных дозах, например 3, и/или 10, и/или 30 мг/кг, р.о.

Соединение 1 проявляло статистически достоверное снижение высвобождения ΤNΕ (>50%) при 30 мг/кг р.о.

Пример 3.3. Модель МАВ (модель с моноклональным антителом).

Модель МАВ дает возможность провести быструю оценку модулирования КА-подобной воспалительной реакции терапевтическими средствами (КасЫ§1ап Ь.М. №11иге Рго!осок (2006) 2512-2516: Со11адеп апЦЬойу-тйисей аг(Нг1115). Мышам ЭВА/ί делают инъекцию ί.ν. смесью тАЬ, направленных против коллагена II. Через день начинают лечение соединением (разбавитель: 10% об./об. ΗΡβί,Ό). Через три дня мыши получают ί.ρ. инъекцию ЬР8 (50 мкг/мышь), приводящую к быстрому началу воспаления. Лечение соединением продолжают в течение 10 дней после инъекции тАЬ. Воспаление определяют по измерению опухания лапки и регистрации клинической оценки каждой лапки. Представляют общие клинические оценки артрита четырех конечностей для демонстрации тяжести воспаления. Систему оценки применяют к каждой конечности с использованием шкалы 0-4, при этом 4 представляет собой наиболее тяжелое воспаление.

- Симптомы отсутствуют.

- Слабое, но отчетливое покраснение и опухание одного типа сустава, такого как лодыжка или запястье, или явное покраснение и опухание, ограниченное отдельными пальцами, вне зависимости от числа пораженных пальцев.

- Умеренное покраснение и опухание двух или более типов суставов.

- Сильное покраснение и опухание целой лапки, включая пальцы.

- Максимально воспаленная конечность с участием многочисленных суставов.

Пример 3.4. Онкологические модели.

Модели ίη νί\Ό для подтверждения эффективности малых молекул по отношению к 1АК2управляемым миелопролиферативным заболеваниям описаны Уегшд е! а1. Сапсег Се11 13, 311, 2008 и Сегоп е! а1. Сапсег Се11 13, 321, 2008.

Пример 3.5. Модель ΙΒΌ на мышах.

Модели 1п νίΙΐΌ и ш νί\Ό для подтверждения эффективности малых молекул по отношению к ΙΒΌ описаны \νίΠζ е! а1. 2007.

Пример 3.6. Модель астмы на мышах.

Модели 1п νίΙΐΌ и ш νί\Ό для подтверждения эффективности малых молекул по отношению к астме описаны №ак е! а1., 2008; Ιρ е! а1. 2006; Регшк е! а1., 2002; ΚιιάΡκζ е! а1., 2008.

Пример 4. Модели токсичности, ЭМРК и безопасности.

- 28 020111

Пример 4.1. Термодинамическая растворимость.

Готовят раствор 1 мг/мл тестируемого соединения в 0,2 М фосфатном буфере с рН 7,4 или 0,1 М цитратном буфере с рН 3,0 при комнатной температуре в стеклянном сосуде.

Образцы вращают на диске ротатора 8ТК 4 (81иай δοίοηΙίΓίο. В1ЬЬу) со скоростью 3,0 при комнатной температуре в течение 24 ч.

Через 24 ч 800 мкл образца переносят в пробирку Эппендорфа и центрифугируют в течение 5 мин при 14000 об/мин. Затем 200 мкл супернатанта образца переносят на планшет МиНйсгссп 8о1иЬ11йу Р1а1с (М1Шроге, М88ЬВРС50) и фильтруют супернатант (10-12 мм рт. ст.) при помощи вакуумной гребенки в чистый полипропиленовый 9б-луночный планшет с У-образным дном Огетег (по каталогу № 651201). 5 мкл фильтрата разбавляют 95 мкл (Г20) того же буфера, который использовали для инкубирования в планшете, содержащем калибровочную кривую (Огетег, по каталогу № б51201).

Калибровочную кривую для данного соединения делают свежеприготовленной в ДМСО, начиная от 10 мМ исходного раствора в ДМСО, разбавленного фактором 2 в ДМСО (5000 мкМ), а затем еще разбавляют ДМСО до 19,5 мкМ. Затем 3 мкл серийного разбавления, начиная с 5000 мкМ, переносят в 97 мкл смеси ацетонитрил-буфер (50/50). Конечный интервал концентрации составляет от 2,5 до 150 мкМ.

Планшет герметизируют при помощи герметизирующих пленок (МА9бКЭ-048, те^ет.к1пе818.со.ик) и измеряют образцы при комнатной температуре методом ЖХ-МС (ΖΟ 1525 от \Уа1ег5) в оптимизированных условиях с использованием ОиапорШшхе для определения соответствующей массы молекулы.

Образцы анализируют на ЖХ-МС при скорости потока 1 мл/мин. Растворитель А представляет собой 15 мМ аммиак и растворитель В представляет собой ацетонитрил. Образец проходит в условиях положительного ионного спрея на колонку ХВпбде С18 3,5 мкМ (2,1x30 мм) от \Уа1ег5. Градиент растворителя имеет общее время прохода 2 мин и изменяется от 5 до 95% В.

Анализ площади пиков проводят при помощи пакета программ МакДупх и площади пиков образцов наносят на график относительно калибровочной кривой, получая растворимость соединения.

Значения растворимости приведены в мкМ или мкг/мл.

Пример 4.2. Растворимость в воде.

Начиная от 10 мМ исходного раствора в ДМСО, готовят серийное разбавление соединения в ДМСО. Серийные разбавления переносят в 9б-луночный планшет с Р-образным дном ΝυΝί МахйогЬ (по каталогу № 442404) и добавляют 0,2 М фосфатного буфера с рН 7,4 или 0,1 М цитратного буфера с рН 3,0 при комнатной температуре.

Конечная концентрация изменяется в интервале от 200 до 2,5 мкМ за 5 одинаковых стадий разбавления. Конечная концентрация ДМСО не превышала 2%. В угловые точки каждого 9б-луночного планшета прибавляют 200 мкМ пирена, и он служит контрольной точкой для калибровки Ζ-оси в микроскопе.

Планшеты для анализа герметизируют и инкубируют в течение 1 ч при 37°С при встряхивании при 230 об/мин. После этого планшеты сканируют под микроскопом с освещением белым светом, получая отдельные картинки осадка по концентрации. Осадок анализируют и переводят в число, которое наносят на график. Первая концентрация, при которой соединение оказывается полностью растворенным, представляет собой сообщенную концентрацию, однако истинная концентрация находится где-то между данной концентрацией и концентрацией одного шага разбавления в большую сторону.

Значения растворимости приведены в мкг/мл.

Пример 4.3. Связывание с белком плазмы (равновесный диализ).

мМ исходный раствор соединения в ДМСО разбавляют фактором 5 в ДМСО. Данный раствор дополнительно разбавляют в свежеразмороженной плазме крови человека, крысы, мыши или собаки (ВюКес1атайоп ΙΝί) при конечной концентрации 10 мкМ и конечной концентрации ДМСО 0,5% (5,5 мкл в 1094,5 мкл плазмы в 9б-луночном планшете РР-МайегЫоск (Огетег, по каталогу № 780285)).

Готовят планшет с вкладышами Р1егсе Кеб Эеу1се (ТНегтоЗаепОПс. по каталогу № 89809) и заполняют 750 мкл РВ8 буферный резервуар и 500 мкл спайковой плазмы в резервуар для плазмы. Планшет инкубируют в течение 4 ч при 37°С при встряхивании при 230 об/мин. После инкубации 120 мкл содержимого обоих резервуаров переносят в 3б0 мкл ацетонитрила в 9б-луночных круглодонных, РР планшетах с глубокими лунками Щипс, по каталогу № 278743) и герметизируют крышкой из алюминиевой фольги. Образцы перемешивают и помещают на лед на 30 мин. После этого данный планшет центрифугируют в течение 30 мин при 1200 гсГ при 4°С и переносят супернатант в 9б-луночный РР планшет с Уобразным дном (Огетег, б51201) для анализа методом ЖХ-МС.

Данный планшет герметизируют герметизирующими пленками (МА9бКЭ-048) от \\л\л\\кте515.сол.1к и измеряют образцы при комнатной температуре методом ЖХ-МС (ΖΟ 1525 от \Уа1ег5) в оптимизированных условиях с использованием ОиапорОпйхе для определения соответствующей массы молекулы.

Образцы анализируют методом ЖХ-МС при скорости потока 1 мл/мин. Растворитель А представляет собой 15 мМ аммиак и растворитель В представляет собой ацетонитрил. Образец проходит в условиях положительного ионного спрея на колонку ХВпбде С18 3,5 мкМ (2,1x30 мм) от \Уа1ег5. Градиент растворителя имеет общее время прохода 2 мин и изменяется от 5 до 95% В.

- 29 020111

Считается, что площадь пика соединения в буферном резервуаре и резервуаре плазмы является 100% соединения. Процент связывания с плазмой получают из этих результатов и представляют Ь1М8 в виде процента связывания с плазмой.

Растворимость соединения при конечной тестовой концентрации в РВ8 исследуют при помощи микроскопа, чтобы показать, наблюдается ли осадок или нет.

Пример 4.4. Склонность к пролонгированию ОТ.

Возможность пролонгирования ОТ оценивают методом локальной фиксации потенциала НЕКС.

4.4.1. Локальная фиксация потенциала в целой клетке.

Регистрацию локальной фиксации потенциала в целой клетке осуществляют при использовании усилителя ЕРС10, управляемого программным обеспечением Ри1ке ν8.77 (НЕКА). Сопротивление серий обычно меньше 10 МО и компенсируется более чем на 60%, из показаний рассеяние не вычитается. Электроды изготавливают из стекла для пипеток (Нагеагб).

Внешний раствор для погружения содержит 135 мМ №С1, 5 мМ КС1, 1,8 мМ СаС12, 5 мМ глюкозы, 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,4.

Внутренний раствор раЮй-пипетки содержит 100 мМ глюконата К, 20 мМ КС1, 1 мМ СаС12, 1 мМ МдС12, 5 мМ М-ьАТР, 2 мМ глутатиона, 1 мМ ЕСТА, 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,2.

Лекарственный препараты перфузируют при помощи биологической системы быстрой перфузии МЕУ-9/ЕУН-9.

Все снятия показаний осуществляют на клетках НЕК293, стабильно экспрессирующих НЕКС каналы. Клетки выращивают в 12-мм круглых покровных стеклах (Сегтап д1акк, Ве11ео), закрепленных в регистрационной камере при помощи двух платиновых стержней (Соо6Гс11о\у). Токи НЕКС индуцируют при помощи активирующего импульса до +40 мВ в течение 1000 мс с последующим импульсом хвостового тока до -50 мВ в течение 2000 мс, при этом удерживающее напряжение составляло -80 мВ. Импульсы подавали каждые 20 с и все опыты проводили при комнатной температуре.

4.4.2. Анализ данных.

Для каждого тестируемого соединения рассчитывали значения 1С50 и 1С20. Рассчитана кратная разница между 1С20 и несвязанными Смс концентрациями тестируемого соединения, полученными при релевантных терапевтических дозах, определенных по результатам, полученным из модели С1А на крысах.

Что касается кривых зависимости концентрации от отклика, максимальную амплитуду хвостового тока измеряют при скачке напряжения до -50 мВ. Вычерчивание эмпирической кривой по данным зависимости концентрации от отклика осуществляют по уравнению у=а+[(Ь-а)/1+10а((1одс-х)ά)] где а представляет собой минимальный отклик, Ь представляет собой максимальный отклик и б является наклоном кривой, причем данное уравнение можно использовать для расчета как 1С50 (где у=50 и с представляет собой значение 1С50), так и 1С20 (где у=20 и с представляет собой значение 1С20). Для построения всех кривых использовали программное обеспечение СгарНРаб® Рпкт® (СгарНРаб® 8оП\\аге 1пе.). Разница в 100 раз или более указывает на низкий потенциал пролонгирования ОТ.

Пример 4.5. Микросомальная стабильность.

мМ исходный раствор соединения в ДМСО разбавляли в 1000 раз 182 мМ фосфатным буфером с рН 7,4 в 96-луночном планшете с глубокими лунками (Стешет, по каталогу № 780285) и преинкубировали при 37°С.

мкл деионизированной воды добавляли в лунку меченной штрих-кодом полипропиленовой пробирки для хранения Майях 2Ό (ТНегто Заепййе) и преинкубировали при 37°С.

Рабочий исходный раствор глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы (С6РЭН) готовили в 182 мМ фосфатном буфере с рН 7,4 и помещали на лед до использования. Кофактор, содержащий раствор МдС12, глюкоза-6-фосфата и NА^Ρ+, получали в деионизированной воде и помещали на лед до использования.

Получали конечный рабочий раствор, содержащий микросомы печени (Хепо1еей) рассматриваемых видов (человек, мышь, крыса, собака), описанный ранее С6РЭН, и кофакторы, и инкубировали данную смесь не более 20 мин при комнатной температуре.

К 40 мкл предварительно нагретой воды добавляли 30 мкл предварительно нагретого разбавления соединения и добавляли 30 мкл микросомальной смеси. Конечные концентрации реакции составляли 3 мкМ соединения, 1 мг микросом, 0,4 и/мл СОРЭН, 3,3 мМ МдС12, 3,3 мМ глюкозы-6-фосфата и 1,3 мМ NА^Ρ+.

Для определения процентной доли остатка соединения в нулевой период времени в лунку перед прибавлением микросомальной смеси добавляли МеОН или АСN (1:1). Планшеты герметизировали Майях 8ерга кеа1кТМ (Майях, по каталогу № 4464) и встряхивали в течение нескольких секунд, чтобы гарантировать полное смешение всех компонентов.

Образцы, реакцию в которых не останавливали, инкубируют при 37°С, 300 об/мин и через 1 ч инкубации реакцию останавливают добавлением МеОН или АСN (1:1).

После остановки реакции образцы перемешивали и помещали на лед в течение 30 мин для осаждения белков. Затем планшеты центрифугировали в течение 30 мин при 1200 геГ при 4°С и переносили супернатант в 96-луночный РР планшет с Υ-образным дном (Сгетег, 651201) на анализа методом ЖХ-МС.

- 30 020111

Данные планшеты герметизировали при помощи герметизирующих пленок (МА96КИ-048) \\л\л\\кте515.со.ик и измеряли образцы при комнатной температуре методом ЖХ-МС (ΖΟ 1525 от \Уа1ег5) в оптимизированных условиях с использованием ОиапорНп^е для определения соответствующей массы исходной молекулы.

Образцы анализировали методом ЖХ-МС при скорости потока 1 мл/мин. Растворитель А представлял собой 15 мМ аммиак и растворитель В представлял собой ацетонитрил в зависимости от используемого стоп-раствора. Образцы проходили в условиях положительного ионного спрея по колонке ХВпбде С18 3,5 мкМ (2,1х30 мм) от \Уа1ег5. Градиент растворителя имел общее время прохода 2 мин и изменялся от 5 до 95% В.

Площадь пика от исходного соединения в момент времени 0 считали за 100% остаток. Процентную долю, оставшуюся после 1 ч инкубации, рассчитывали из момента времени 0 и рассчитывали как оставшуюся процентную долю. Растворимость соединения при конечной тестовой концентрации в буферном растворе изучали под микроскопом и сообщали результаты.

Данные относительно микросомальной стабильности выражены в виде процентной доли общего количества соединения, оставшейся через б0 мин.

Таблица IX

Микросомальная стабильность

Соединение № Человек Крыса 1 76-100% 76-100%

Пример 4.б. Проницаемость Сасо2.

Двунаправленные анализы Сасо-2 проводили, как описано ниже. Клетки Сасо-2 получали в Европейской ассоциации клеточных культур (ЕСАСС, по каталогу № 8б010202) и использовали через 21 день выращивания клеток в 24-луночных планшетах Тгап5\те11 (Икйет ТКТ-545-020В).

Высевали 2х105 клеток/лунку в планшетную среду, состоящую из ОМЕМ+С1и1аМАХ1+1% ΝΕΑΑ+10% ЕВ8 (Ее!а1С1опе 11)+1% Реп/8!тер. Среду меняли каждые 2-3 дня.

Тестируемое и эталонное соединения (пропранолол и родамин 123 или винбластин, все из которых получены от 81§та) готовили в сбансированном солевом растворе Хэнкса, содержащем 25 мМ НЕРЕ8 (рН 7,4), и добавляли либо в апикальные (125 мкл), либо в базолатеральные (б00 мкл) отсеки блока планшетов Тгап5\\'е11 в концентрации 10 мкМ при конечной концентрации ДМСО, составляющей 0,25%.

В донорный буфер во всех лунках добавляли 50 мкМ люциферового желтого (81дта), чтобы оценить целостность клеточных слоев путем мониторинга проникновения люциферового желтого. Люциферовый желтый (ΕΥ) не может свободно проникнуть через липофильные барьеры, при этом высокая скорость переноса ΕΥ свидетельствует о слабой целостности клеточного слоя.

Через 1 ч инкубации при 37°С при встряхивании на орбитальной качалке при 150 об/мин как из апикальных (А), так и из базальных (В) отсеков отбирали аликвоты по 70 мкл и добавляли в раствор 100 мкл ацетонитрил:вода 50:50, содержащий аналитический внутренний стандарт (0,5 мкМ карбамазепина) в 9б-луночном планшете.

Люциферовый желтый определяли при помощи 8рес1татах Сетии Х8 (Ех 42б нм и Ет 538 нм) в чистом 9б-луночном планшете, содержащем 150 мкл жидкости с базолатеральной и апикальной сторон.

Концентрацию соединения в образцах определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС).

Значения кажущейся проницаемости (Рарр) рассчитывали по уравнению

Рарр [ О θ ДИ Η Θ НИ ё ] конечный акцепторХТГакцептор ( [СОёДИНёНИё] начальный лонорХУцонор) /ТннкХУдонор/площадь поверхностихбОхЮ'6 см/с где Тинк - продолжительность инкубации;

площадь поверхности - 0,33 см2.

Соотношения вытекания как признака активного оттока с апикальной поверхности клетки рассчитывали с использованием соотношения РаррВ>А/РаррА>В.

Использовали следующие критерии приемки анализа.

Пропанолол: значение Рарр(А>В)>20(х 10-6 см/с).

Родамин 123 или винбластин: значение Рарр(А>В)<5 (х10-6 см/с) при соотношении вытекания >5. Проницаемость люциферового желтого <100 нм/с.

Таблица Х

Скорость вытекания Сасо-2

Соединение Ν' Рарр А>В (Х1О‘6 см/с) Соотношение вытекания 1 7,8±0,8 6,1±0,6

Пример 4.7. Фармакокинетическое исследование.

4.7.1. Фармакокинетическое исследование на грызунах.

Из соединений получают препараты в смесях ПЭГ200/физиологический раствор или

- 31 020111

ПЭГ400/ДМСО/физиологический раствор для внутривенного способа введения и в 0,5% метилцеллюлозе или 10-30% гидроксипропил-β-цикло декстрине с рН 3 или 7,4 для перорального способа введения. Тестируемые соединения дозируют перорально в виде разового внутрипищеводного зонда при 5-10 мг/кг и дозируют внутривенно в виде болюса через хвостовую вену при 1 мг/кг. Каждая группа состоит из 3 крыс. Пробы крови отбирают либо из яремной вены при использовании канюлированных крыс, либо из ретро-орбитального синуса с использованием гепарина лития в качестве антикоагулянта в моменты времени в следующем интервале: от 0,05 до 8 ч (внутривенный способ) и от 0,25 до 6 или 24 ч (пероральный способ). Пробы цельной крови центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин и хранят образцы полученной плазмы при -20°С в ожидании анализа.

4.7.2. Фармакокинетическое исследование на собаках.

Из соединений получают препараты в смесях ПЭГ200/физиологический раствор для внутривенного способа введения и в 0,5% метилцеллюлозе или в смесях ПЭГ400/гидроксипропил-в-циклодекстрин, подкисленных лимонной кислотой до рН 2-3, для перорального способа введения. Тестируемые соединения дозируют перорально через желудочный зонд при 5-30 мг/кг и дозируют внутривенно в виде болюса или 10 мин инфузии через сонную артерию при 1 мг/кг. Каждая группа состоит из 3 самцов или самок собак породы бигль. Пробы крови отбирают либо из яремной вены при использовании гепарина лития в качестве антикоагулянта в моменты времени в интервале от 0,083 до 24 ч после введения дозы. Пробы цельной крови центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин и хранят образцы полученной плазмы при -20°С в ожидании анализа.

4.7.3. Количественная оценка концентрации соединения в плазме.

Концентрацию в плазме каждого соединения определяют методом ЖХ-МС/МС, в котором массспектрометр функционирует в режиме положительного электроспрея.

4.7.4. Определение фармакокинетических параметров.

Фармакокинетические параметры вычисляют с использованием ^ииои^и® (РйагЦдй!®, Иш!еб). Пример 4.8. 7-Дневное исследование токсичности на крысах.

7-Дневное исследование пероральной токсичности тестируемых соединений проводят на самцах крыс 8!гадие-Оа^1еу для оценки потенциала их токсичности и токсинокинетики при суточных дозах, составляющих 100, 300 и 500 мг/кг/день, при помощи желудочного зонда, при постоянном значении доза-объем, составляющем 5 мл/кг/день.

Из тестируемых соединений получают препараты в 30% (об./об.) НРвСИ в очищенной воде. Каждая группа включает в себя 5 доминирующих самцов крыс, а также 3 подчиняющихся животных для фармакокинетики. Четвертая группа получает только 30% (об./об.) НРвСИ в воде с той же частотой, объемом дозы и таким же способом введения и выступает в качестве контрольной группы, получающей разбавитель.

Цель данного исследования заключается в определении минимальной дозы, которая приводит к отсутствию идентифицируемых неблагоприятных подобных эффектов (отсутствует наблюдаемый уровень неблагоприятного воздействия - NОΛЕ^).

Пример 4.9. Гепатоцитарная стабильность.

Модели для оценки метаболического очищения гепатоцитов описаны МсСтпйу е! а1. Игид Ме!аЬо11кт аиб Ищрокйюи 2008, 32, 11, 1247.

Специалистам в данной области будет понятно, что предшествующие описания по своей природе служат в качестве примеров и разъяснений и в указанном виде предназначены для иллюстрации данного изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления. В ходе стандартного проведения экспериментов специалист увидит очевидные модификации и изменения, которые можно сделать, не выходя за рамки данного изобретения. Таким образом, подразумевается, что данное изобретение определено не приведенным выше описанием, а следующей формулой изобретения и ее эквивалентами.

- 32 020111

Ссылки.

АгдИез ЛИ, Ьорег-Зогхапо РЛ. (1998) СаЪаЬоНс р гοίη £ Xаттаϋ огу суЬокхпез. Сигг Ορίη С11П ЫиСг МеЬаЬ Саге. 1:245-51. ВизЬ КА, Рагтег КМ, Иа1кег ЛЗ, КтгкЬат ВИ . (2002) Ведисехоп о£ ίοίηΐ 1п£1аттаЬ1оп апд Ьоле егозхоп ίη гас ад] тгапь агСЬгхСгз Ьу ЪгеаЬтепЪ νίύΐι 1пЬег1еик1п· -17 гесерЬог

1дС1 Рс Сизгоп. ргоРехп. АгЬЬгхЫэ ЕЬеит. 46: 802-5.

СЬоу ЕН, Рапау! 05. (2001). N Епд1 Л Мед. 344; 907-16.

СЬиЬгпзкауа 5 апд Киееьпег КЕ (2003) . Неди1аЫоп о£ озьеодепхс ρτοΐβίηβ Ьу сЬопдгосуЬез. ТЬе 1пСегпаЬ1Опа1 ]оигпа1 о£ ЫосЪетпхзСгу & се11 Ыо1оду 35(9)1323-1340.

С1едд 00 еГ а1. (2006) N Епд1 Л Мед. 2006 354:795-808.

С51исозаш1пе, сЬопдгохЪхп зи1£а£е, апд СЬе £νο ίη сотЬ1па£1оп £ог ра1п£и1 клее озСеоагСЬгхМз.

СопзСапСхпезси еЪ а1., 2007, Тгепдз ίη В1ос11ет1са1

Зсхепсез 33(3): 122-131.

Г1ге2Се1П 03. (2003). ИаС/ИГё. 423:356-61.

Сегоп е£ а1. (2008) δθίβοΐιΐνβ 1пЫЬШоп о£ ЛАК2-дх1Уеп егуЫагохд д1££егепЫа1:1оп о£ роХусуСЬетха уезга ргодепХсогз Сапсег Се11 13 (4), 321-30.

1р е£ аХ. (2006) 1пЪег1еик1п (1Ъ)-4 апд 1Б-ХЗ ир-гедиХасе топосуСе сЬетоаЬЬгасЬапЬ рго£е1п-1 ехргезехоп ίη Питал ЬгопсЫаХ ер1ЪЬеИа1 сеХХз: ίηνοίνβπιβηΐζ о£ р38 тхЪодепасЫуаСед ргоье1п кхпазе, ех£гасе1ХиХаг з1дпаХ-геди1аЬед к1лазе 1/2 апд Лапиз к1пазе-2 ЬиС по£ с-Лип ЫН2-£егт1паХ к1пазе 1/2 81дпа111пд раСЬадауз, С11п. Ехр. 1ттип, 162-172.

Лои ΙΜ, йЫаи АЪ, СЬеп 8Υ, И апд СК, ЗЫеЬ ОБ, Тза! СЗ, Ии

- 33 020111

СЬ. (2005) ТкготЬозропЛп 1 аз ап β££θοΐ:ίνβ депе ЫтегареиСдс зЪгабеду ίη со11адеп-1п<1исес1 ахекгЗХгз. Агбкг1С13 Екеит. 52:339-44.

КасЫд^ап Ьм. (2006) СоИадеп апП1Ьос1у-1пс1исед. агсЬгхЫз, ИаЪиге РгоСосо1з 2512-2516.

КИасЫдгап, Ь. М. СоИадеп апС1Ьо0у-1п0исе<2 аг£Ьг1С1е. (2006) КГа^иге Рхо£осо1е 1, 2512-6.

КисПасг еС а1. (2008) ТЬе σΑΚ-З епЫЫСог СР-690550 хз а роЪепЪ ап^1-1п£1аттаСогу адепб ίη а тиххпе тоде1 о£ ри1топагу еозхп-ОрЬИха, Еиг 3 Ркахтасо 154-161.

Ьее ϋΜ, ИехпЫаЬЪ МЕ (2001). ЬапсеС. 358: 903-11.

Ьедепдге Р, ОисШха <1, Ридо1 θ’-Р, Воддапо^хсг Р. (2003) ЗАК/2ТАТ ЬиЪ ηοΐ: ЕЕК1/ЕЕК2 раЪЬюау тесИакез хп1зег1еик1пд (1Ь)6/зо1иЫе ΙΙι-бЕ 6о^п-геди1аЫоп о£ Суре II соИадеп, аддгесап соге, апд Ипк рхоЪехп £гапзсг1р1:1оп ίη ахС1си1аг скопскгосуЬез. σ ΒίοΙ Скет. 278(5)2903-2912.

Ы КЗ, 0екпа<1е Е, га£аги11ак М. (2001) ОпсозСаЫп М1пЗисес1 таСГ1х те^аНоргоСехпазе ап<5 £1ззие хпЬхЫСог о£ теЪаНоргобехпазе-З депез ехрхезз1оп ίη скопдхосубез гедиххез дапиз к1пазе/8ТАТ вхдпаИпд ра^киау. (2001) 3 1ттипо1 166:34913498 .

Ып Н8, Ни СУ, Скап ΗΥ, Ыем ΥΥ, Ниапд НР, Ьерезскеих Ь, ВазЫапеШ Е, Вагоп В, Εβνβάί С, С1етеп£-Ьасхохх Р. (2007) Апсх-гкеитасхе асб1У1Мез о£ кхзкопе (йеасеСуЗазе (ЮАС) хпЫЫЬогз ίη νίνο ίη со11адеп-1пс1исе0 агЪИгд.Ъх5 ίη годепСз. Вг Л Ркагтасо1. Арг; 150 (7):829-31.

МиШдкап СС, гкапд 3, Нагуеу ЕС, СоШпз-ипЗехадоод ЗЕ, 8ски1тап ВА, ΡΗΐΙΙίρε ЬА, Тазхап 8К, Ьок МЬ, 8и X, Ыи И, Ώβνί<^3 М, АС1аз 8Е, Скеп Ι-М, С1х££огс! КЗ, Сегкахс! 02, СагхоИ КЬ, Ееатап ОН, бтхьк м, Ооупгпд ЗЕ, Нипдег 5Р иЩтапе СЬ; (2009) ЗАК тиЪаМопв ίη И1дк-Г1зк ск11с1Ьоос1 асиЬе 1утркоЫазС1с 1еикет1а, ΡΝΑ8 Мау 22. [Публикация на стадии печати.]

Н1а1з еб а1. (2008) Моизе Мос1е1з о£ АНехдхс Азъкгпа: Аси£е апс! Скгопхс АНегдеп СкаИепде, Охзеазе Μοάβΐβ & Мескапгзтз, 213-220.

Νί31Ίίά3 К, Кот1уатпа Т, Мхуагака 3, 8кеп ΖΝ, РихитаГзи Т,

- 34 020111

Βοΐ Η, ΥοδΠΐάβ А, Уатапа Л, Уататига Μ, Ытпоттуа У, 1поие Η, АзаЬага Η. (2004) Ηίδϋοηβ 0еасеСу1азе хпЫЫСог зирргеззтоп о£ аиСоапЫЬоЗу-тесИаЬей агСЬгтШе ΐη πιΐοβ νΐ3 геди1аСтоп о£ р161МК4а апс1 р21 (КАР1/С1р1) ехргезехоп.

АгСЪг±С1в ВЬешп. 10: 3365-76.

О'ЗЬеа, Л, Л., Рези, М., Вогте, ϋ-С-, СЬапдеИап, Р.5., ИаСиге Ββνΐβνδ, 2004, 555-564.

О*Бе11 ЛК. (2004) ТЬегареиСтс зСгаСедгез £ог гЬеигпаСогд ахСЬг1С13. N Епд1 Л МеЗ. 350(25):2591-602.

Овак1 М, Тап Ь, СЬоу ВК, УозЫйа У, СЬеаН КЗЕ, Аигоп РЕ, СоМгхпд МВ. (2003) ТЪе ТАТА-сопаСхптпд соге рготоСег о£ сНе Суре II соИадеп депе (СОБ2А1) 13 СНе СагдеС о£ 1пСег£егопдатта-тесИаСеб. хпЫЫСтоп ΐη Питан сНопйгосуСев: гедитгетепС £οχ 5ТАТ1 а1рПа, ЛАК1 апд ЛАК2. ВгосЬет Л 369:103-115.

ОзСе Ь еС а1., ЕСТС Моп£геа1 2007: А Ь1дЬ СЬгоидЬриС теСЬой о£ теазигхпд Ьопе агсЬ1СесСига1 сНвСигЬапсе ΐη а тигхпе С1А πϊΦάβΙ Ъу ттсго-СТ тогрЬотеСгу.

ОСего М, Ьадо К, Ьадо Е, Сотег Κθΐηο ЛЛ, биаИИо О. (2005) ЗгдпаШпд расЬиау ΐηνοίνβά ΐη ηΐπτΐο οχΐάβ вупсЬаве Суре II ас£1УаС1оп ΐη. сЬопдгосуСез: зупегдхзСхс е££есС о£ 1ерС1п νίϋΠ тпСег1еик1п-1. АгСЬгхСхв КезеагсЬ & ТНегару 7;В581К591.

Реппа еС а1. (2002) ЛАК-ЗТАТ зтдпаИпд ΐη азСЬта Л. СИп.

ТтгееС. 1279. ВаИ ЬС, ВоиЬепо££ К. (2004) ВЬеитпаСогд сасЬехта: ше£аЬо11с аЬпогта11С1ез, тпесНапхзтз апс1 ΐη£θΓνβη£ΐοηδ. КЬеитаСо1оду; 10:1219-23.

ВосНд 8Л, Мегаг МА, ИЫСе ЛМ, Ьатре РА, В11еу ЛК, АгСЬиг СБ, Ктпд КЬ, ЗЬееЬап КСР, Υΐη Ъ, Реппхса Б, ЛоЬпзоп ЕМ, ЗсЬге1Ьег НБ. (1998) БтегирЫоп о£ СЬе Лак1 депе детопвСгаСез оЬИдаСогу апд попгеЛипйапС. го1ез о£ СНе ^акз ΐη суСокхпетпс5исе0 Ыо1одтс гезропзез Се11 93: 373-383. 8а1уеттп1 ϋ,

Маггоп Е, Бидо Ь, Зеггахпо I, Бе Загго А, СариСх АР, Сиггосгеа 3. (2001) АтеИогаШоп о£ ^οΐηο сНзеазе ΐη а гас тоЛе1 о£ со11адеп-1п0исед агСЬгхСтз Ьу М40403, а еирегоххЛе сНатпиСазе т1теС1с. АгСНгтСтз ВНеит. 44:2909-21.

ЗНе1Соп ВЬ, геПег Л, Но МН, Ропв Л, КозепСЬа! А. (2005)

- 35 020111

Ыехлге дго>гЫ1 £ас£от тесИаРез ЬурегаХдезха апд сасЪехха ϊη аи£о1ттипе агЫигхЫз. Рахп. 116:8-16.

Зхте ΝΑ е£ а1., (2004) ТагдеЪхпд оз£еос1аз££ «г±Ы1 го1едгопхс асхс! ргемепЪз Ьопе сЗез£гис£хоп ίη со11адеп-хпйисе<1 агРИгхМз, АгРИгхРхз КЬеитп. 50 2338-2346.

Зхтз ΝΑ, Сгееп σκ, С1а££ М, ЗсИИсе 3, МагШп и,

СШезрхе МТ, Котае Е. (2004) ТагдеЪхпд озЬеос1аз£з νί£1ι го1е<5гопхс асхд ρΓβνβη£.3 Ьопе ёезСгисРхоп ίη со11адеп-хпс1исед агРЬгхРхз. АгРЬ.г1Ыз КЬеит. , 50: 2338-46.

5то1еп ТЗ, ЗЬехпег С. (2003). Ыа£ Κθν Огид ϋί3θον. 2: 47388.

Тагп, Ь., Мс01упп, Ь.М., Тгаупог, Р., МикЬегэее, К.,

ВагЫеРР, .Ι.Μ.3., Едздагйз, Т. (2007) ВгхЬхзЬ Тоигпа1 о£ Сапсег,

97, 378-383.

ТеРзиз! Ыака, ЫогхЬхго ЫхзЫтоРо апй ТаДапиЛэи КхзЫтого,

АгРЪгхЫз Кез 2002, 4 (зирр1 3):3233-3242. Иа1зт1Ы1 АЬаЗ Ь,

КеЪаухаз Ц, ВоиЬепо££ В. (2004) Титог песгозхз £ас£ог-а1рЬа ргосЗисРхоп 13 аззосхаТед νίϋΗ 1езз Ьоб.у се11 тазз хп «отеп адхСЬ гЬеитаРохЦ агРЬгхРхз. Т ВкеитаЬо1.; 31:23-9. Иегпхд еЬ а1.

(2008) ЕЕГхсасу о£ ΤΟΙ 01348, а 3θ1θο£ίνθ ЛАК2 хпЫЫРог, хп егеаьтепь о£ а тпиг1пе πιοάβΐ о£ ТАК2Уб17Г-1пс1исед ро1усуСЬетп1а νβΓθ, Сапсег Се11 13(4), 311-320.

Нхе1апс1 НА, МхсИаеНз М, КхгзсЬЬаит ВТ, Кис1о1рЫ КА.

(2005). Ыа£ Κ€ν Егид ϋίβοον. 4:331-44. ОзСеоаг£кг1£1з - ап ипРгеаъаЫе Зхзеазе?

Ихгрг ер а1. (2007) Моизе Моде1з о£ 1п£1атта£огу Воие1

Юхзеазе, Аймапсед Бгид ϋβϋνβΓγ Κθνίθν/β, 1073-1083.

МсСхппхРу, Ώ.Ρ. (2004) Ема1иаС1оп о£ £гезЬ апд сгуоргезегуей ЬераЪосуЪез аз хп νϊϋΓΟ дгид теЬаЬоНзт ϋοοίβ £ог Ске ргесИсСхоп о£ теСаЬоНс с!еагапсе. Бгид МеЬаЬоМзт апс! Ώχ3ρο3ίΐ;ίοη, 32, 11, 1247.

Все публикации, включая, но не ограничиваясь, патентами и патентными заявками, цитированные в данном описании, включены в настоящее описание ссылкой, как будто каждую отдельную публикацию конкретно и отдельно указывали как включенную в настоящее описание в виде полностью приведенной ссылки.

Из приведенного выше описания специалистам в данной области придут в голову различные модификации и изменения в композициях и способах данного изобретения. Подразумевается, что все подобные модификации, попадающие в рамки прилагаемой

The present invention relates to a compound that is an inhibitor of 1LK, a family of tyrosine kinases involved in inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplant rejection, diseases including deterioration of cartilage tissue renewal, congenital malformations of cartilage tissue and / or diseases associated with hypersecretion of 1bb. The present invention also provides methods for producing this compound, pharmaceutical compositions containing the compound, and methods for preventing and / or treating inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplant rejection, diseases including deterioration of cartilage tissue renewal, congenital cartilage developmental defects tissues and / or diseases associated with hypertecretion of IB, by administering a compound of this invention.

Janus kinases (TAKs) are cytoplasmic tyrosine kinases that transmit a cytokine signal from membrane receptors to transcription factors 8TAT. Four members of the 1AK family are described: 1АК1, 1АК2, 1АК3 and ΤΥΚ2. When cytokine binds to its receptor, members of the 1AK family auto-and / or trans-phosphorylate each other, followed by 8ATAT phosphorylation, which then migrates into the nucleus to modulate transcription. Intracellular 1AK8TAT signaling is provided by interferons, most interleukins, as well as a variety of cytokines and endocrine factors, such as EPO, TPO, OH, O8M, CUT, 6M-C8E, and PQ (W.C. 151). (2008).

Genetic models in combination with the study of small molecules of 1AK inhibitors revealed the therapeutic potential of several 1AK. Using the genetics of mice and humans, it was confirmed that 1AK3 is an immunosuppressive target (O'811ca 1. с1 а1. (2004)). 1AK3 inhibitors have been successfully accepted into clinical development, initially for cases of organ transplant rejection, but subsequently also for other immuno-inflammatory indications, such as rheumatoid arthritis (CA), psoriasis, and Crohn's disease (Yyr: //c11ssa11pak.dou/).

TUK2 is a possible target in the case of immuno-inflammatory diseases, which is confirmed by the method of human genetics and knockout mice (Leyu Ό. Appb Bössch S. (2007)).

1AK1 is a new target in the field of immunoinflammatory diseases. 1AK1 heterodimerizes with other 1AK for signal transmission from pro-inflammatory cytokines. Therefore, inhibition of 1AK1 and / or other 1AK is expected to have a beneficial therapeutic effect in the case of a number of inflammatory conditions, as well as other diseases transmitted by 1AK-mediated signal transduction.

Background to the invention

Cartilage degeneration is a symptom of various diseases, among which the most famous are rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Rheumatoid arthritis (CA) is a chronic degenerative joint disease characterized by inflammation and destruction of joint structures. If you do not treat the disease, this leads to significant disability and pain due to loss of joint function and even premature death. Thus, the goal of CA therapy is not only to slow the progression of the disease, but to achieve remission in order to stop the destruction of the joint. Due to the severity of the consequences of this disease, widespread spacecraft (approximately 0.8% of adults are afflicted around the world) means a large socioeconomic impact (in relation to reviews on spacecraft, the inventors refer to 8th century apt (2003); lee apth etanet (2001); Syou apb Rapau1 (2001); O'1) e11 (2004) and Ensiet (2003)).

Osteoarthritis (also called OA, or arthritis due to wear) is the most common form of arthritis and is characterized by loss of articular cartilage, often associated with bone hypertrophy and pain. Regarding a comprehensive review of osteoarthritis, the inventors refer to V ^ e1app an e1 a1. (2005).

Osteoarthritis is difficult to treat. Currently, there are no reliable methods of treatment and treatment is aimed at alleviating pain and preventing deformation of the affected joint. Common treatments include the use of nonsteroidal and anti-inflammatory drugs (Ν8ΛΙΩ). Although nutritional supplements such as chondroitin and glucosamine sulfate are recommended for the treatment of osteoarthritis, a recent clinical study has found that both treatments do not reduce the pain associated with osteoarthritis (Cedd et al., 200b). In general, the available drugs that correct osteoarthritis are absent.

Stimulation of anabolic processes, blocking catabolic processes, or a combination of these two processes can lead to joint stabilization and, possibly, even reversal of the lesion and, therefore, prevents further development of the disease. Anabolic stimulation of chondrocytes can be stimulated by various triggers. Insulin-like growth factor-1 (ΙΟΕ-Ι) is the dominant anabolic growth factor in synovial fluid and stimulates the synthesis of both proteoglycans and collagen. In addition, it has been shown that family members

- 1 020111 of bone morphogenetic proteins (BMP), namely BMP2, BMP4, VMRb and BMP7, and members of the family of transforming human growth factors β (TOR-β) are able to induce anabolic stimulation of chondrocytes (SyiIyikukaib aib Kieyieg, 2003). Recently, a compound that causes anabolic stimulation of chondrocytes has been identified (US Patent No. 6,500,854; EP 1391211). However, for most of these compounds, serious side effects occur and, therefore, there is a significant need for compounds that stimulate the differentiation of chondrocytes without these side effects.

VanbedN | N81e e! a1. (^ O 2005/124342) found that 1AK1 is a target, the inhibition of which may have therapeutic significance in the case of several diseases, including OA. 1AK1 belongs to the family of Janus kinases (1AK) of cytoplasmic tyrosine kinases involved in cytokine-mediated intracellular signal transduction. The 1AK family consists of 4 members: 1AK1, 1AK2, 1AK3 and TUK2. 1AK are involved in cytokine receptors when they bind to cytokine, followed by heterodimerization of the cytokine receptor and the shared receptor subunit (common gamma-c chain, dr130). Then 1AK is activated by auto- and / or transphosphorylation of another 1AK, which leads to receptor phosphorylation and recruitment and phosphorylation of the members of the signal transmitters and the transcription activator (8ТТ). Phosphorylated 8TAT dimerizes and moves into the nucleus, where they bind to the enhancer regions of the cytokine-responsive genes. Knockout of the 1AK1 gene in mice showed that 1AK1 plays significant and non-redundant roles in the development process: 1AK1 - / - mice died within 24 hours after birth and the development of lymphocytes was severely impaired. Moreover, 1AK1 - / - cells were not or were less reactive towards cytokines than in the case of using Class II cytokine receptors, cytokine receptors using the gamma-c subunit for signal transmission, and a family of cytokine receptors that use the dr130 subunit for transmission signal (VOFd! a1., 1998.)

Different groups implied 1AK-8TAT signal transmission in chondrocyte biology. B1 e! a1. (2001) showed that oncostatin M induces the expression of the MMP and T1MP3 genes in primary chondrocytes due to the activation of the 1AK / 8TAT and MAPK signal transduction pathways. Okak1e! a1. (2003) showed that interferon-gamma-mediated inhibition of collagen II in chondrocytes involves the transmission of the 1AK-8TAT signal. ΓΕ1-β causes catabolism of cartilage by reducing the expression of matrix components and by expressing collagenases and inducible nitric oxide synthase (N082), which mediates the formation of nitric oxide (N0). Oh! Its f! A1., (2005) showed that leptin and ΓΕ1-β synergistically cause the formation of N0 or the expression of N082 mRNA in chondrocytes and that it is blocked by the 1AK inhibitor. Bedeibge e! a1. (2003) showed that the HBB / HBB receptor causes downregulation of the cartilage-specific matrix genes of collagen II, the nucleus of aggrecan and the binding protein in articular bull chondrocytes, and that this is mediated by 1AK / 8TAT signal transmission. Consequently, these observations suggest the role of 1AK-kinase activity in cartilage homeostasis and therapeutic possibilities for 1AKKinase inhibitors.

Members of the 1AK family participated in additional states, including myeloproliferative disorders (O'8 and Shuai et al., 2007, Mo1. Ittiyo1. 44 (10): 2497-506), for which mutations in 1AK2 were identified. This indicates that inhibitors of 1AK, in particular 1AK2, can also be used in the treatment of myeloproliferative disorders. In addition, the 1AK family, in particular 1AK1, is associated with various types of cancer, in particular, various types of leukemia, for example, acute myeloid leukemia (O'8 and Shui et al., 2007, Mo1. Ittioio1. 44 (10): 2497-506; Chaiid et al., 2008, Iiiiisayoi o кот kotais 1AK1 tiíoik 90 рай рай рай рай κ κ κ Е Е 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 ооб κ κ κ Е Е Е Е Е Е Е Е Е Е ) and acute lymphoblastic leukemia (MiSddyai e1 a1., 2009), or solid tumors, such as leiomyosarcoma of the uterus (SoiCaiyieksi a1., 2007, Tibiectus vyusjet1sa1 8s1isek 33 (3): 122-131), prostate cancer w Helez (Tat e! a1., 2007, Voyky 1igia1 o £ Saiseg, 97, 378-383). These results indicate that inhibitors of 1AK, in particular 1AK1 and / or 1AK2, can also be used in the treatment of various types of cancer (leukemia and solid tumors, for example, uterine leiomyosarcoma, prostate cancer).

In addition, Castlman’s disease, multiple myeloma, mesangial proliferative glomerulonephritis, psoriasis, and Kaposi’s sarcoma appear to be due to hypersecretion of cytokine GE-6, the biological effects of which are mediated by intracellular signal transmission of 1AK-8TAT (Teaccate Np1ypoxp. ! aib Tabatiki KzkNipo. Yu. ΛτίΗτίΙΐδ Century 2002, 4 (kirr1 3): 8233-8242). These results indicate that 1AK inhibitors may also be used in the treatment of these diseases.

For 1AK3 and Tuk2, a link was established with autoimmune diseases. Mutations in 1AK3, as well as in the upper components of the signal transmission of the gamma-c chain from the receptor and GE7, add up to approximately 70% of the cases of severe combined immunodeficiency. It should be noted that 1AK1 cooperates with 1AK3 in transmitting signals from the gamma chain to the receptor. Tuk2 polymorphism is noticeable in systemic lupus erythematosus (8ÜE) (O'8i Shuai et al., 2007, Mo1. Ittiyo1. 44 (10): 2497-506). Therefore, the selection of the target of the 1AK family can provide a therapeutic opportunity in the field of immunoassay.

- 2 020111 palatine diseases.

The current therapeutic methods of treatment are not satisfactory and, therefore, there remains a need to obtain other compounds that may be useful in the treatment of inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplant rejection, diseases, including the deterioration of cartilage tissue renewal, congenital malformations of cartilage tissue and / or diseases associated with hypersecretion of 1bb. Thus, the present invention provides a compound, methods for its preparation, and pharmaceutical compositions comprising a compound of the present invention together with a suitable pharmaceutical carrier. In particular, this compound exhibits high efficiency and selectivity against 1-1 compared to other members of the 1ΛΚ family, in addition to 385 kinases and non-kinase targets. In addition, data indicates that this compound has good safety limits. Therefore, it was concluded that the present invention proposed a new possibility of treating diseases mediated by 1-1, in particular inflammatory diseases such as 8ЕЕ (systemic lupus erythematosus) and CA.

In addition, the present invention provides the use of a compound of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of these diseases and conditions.

A brief description of the invention

The present invention is based on the discovery that inhibitors of 1AK, in particular 1AK1, are applicable to the treatment of inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplant rejections, diseases including deterioration of cartilage tissue development, congenital malformations of cartilage tissue and / or diseases associated with 1b hypersecretion. The present invention also provides methods for preparing these compounds, pharmaceutical compositions containing these compounds, and methods for treating inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplant rejection, diseases including deterioration of cartilage tissue renewal, congenital cartilage tissue and / or diseases associated with the hypersection of 1bb, with the introduction of the compounds of this invention.

Accordingly, the first aspect of the invention describes a compound of this invention having the formula I

about N

The compound of the invention is a new inhibitor of 1AK, exhibiting high efficiency and selectivity against 1AK1 compared to other members of the 1AK family, in addition to 385 kinases and non-kinase targets, and also has good safety limits. The use of a compound with such a profile can lead to advantages in the treatment of inflammatory diseases, in particular 8ЕЕ and KA, due to the low percentage of non-specific effects.

In a further aspect, the present invention provides pharmaceutical compositions comprising a compound of the present invention, and a pharmaceutical carrier, excipient, or diluent. In addition, the compound of this invention, applicable in pharmaceutical compositions and described in this description of the methods of treatment is pharmaceutically acceptable according to the preparation and use. In this aspect of the invention, the pharmaceutical composition may also contain additional active ingredients suitable for use in combination with a compound of this invention.

In a further aspect of the invention, the present invention provides a method for treating a mammal susceptible or affected by the condition listed in the present description and, in particular, such a condition that may be associated with aberrant 1AK activity, for example, inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, rejections graft, diseases including deterioration of cartilage tissue renewal, congenital malformations of cartilage tissue development and / or diseases associated with hypersecretion of IB, this method involves the administration of a therapeutically effective amount of a compound of this invention or one or more pharmaceutical compositions disclosed herein. In a particular aspect, the present invention provides a method for treating a mammal susceptible or affected by a condition that may be associated with aberrant 1AK activity, in particular inflammatory conditions, proliferative diseases, and diseases involving deterioration of cartilage tissue renewal.

The following aspect of the present invention provided the compound of this invention,

- 3 020111 intended for the treatment or prevention of a condition listed in the present description, in particular such conditions that may be associated with aberrant 1LK activity, such as inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplant rejection, diseases that include deterioration cartilage tissue renewal, congenital cartilage tissue malformations and / or diseases associated with hyperincretion of IB. In a particular aspect, the present invention provides a compound of the present invention for treating or preventing a condition associated with aberrant 1LK1 activity, in particular inflammatory conditions, proliferative diseases, and diseases involving deterioration of cartilage tissue renewal.

In another aspect related to the method of treatment, the present invention provides a method of treating a mammal susceptible or afflicted with a condition causally associated with the abnormal 1LC activity described herein, the administration of an effective amount for treating a condition or preventing it. one or more of the pharmaceutical compositions described herein, or a compound of this invention. In a specific embodiment, the anomalous activity of 1LC is the anomalous activity of 1LC1.

In a further aspect, the present invention provides a compound of the present invention for treating or preventing a condition causally associated with abnormal 1LC activity. In a specific embodiment, the anomalous activity of 1LC is the anomalous activity of 1LC1.

In additional aspects, the present invention provides methods for synthesizing a compound of the invention, with representative techniques and synthetic routes being described in this description below.

Accordingly, the main purpose of this invention is to provide a compound capable of modifying the activity of 1LP and, thus, to prevent or cure any condition that may be causally associated with it. In particular, any conditions that may be causally related to 1LK1 activity.

The next objective of the present invention is the provision of compounds capable of treating or relieving conditions or diseases or their symptoms, such as inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplant rejection, diseases, including the deterioration of the renewal of cartilage, congenital malformations of cartilage and / or diseases associated with hypersecretion of IB, which may be causally related to the activity of 1LC. In particular, any disease or condition that may be causally related to 1LK1 activity.

Another objective of the present invention is to provide pharmaceutical compositions that can be used to treat or prevent a variety of disease states, including diseases associated with 1LK activity, such as inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplant rejection, diseases that include worsening cartilage tissue renewal, congenital cartilage tissue malformations and / or diseases associated with hyperincretion of IB. In particular, the conditions associated with the activity of 1LK1.

Other objectives and advantages will be apparent to those skilled in the art from consideration of the subsequent detailed description.

Detailed Description of the Invention

Definitions

It is understood that the following terms have the meanings below and are useful for understanding the description and the provided framework of the present invention.

In describing this invention, which may include compounds, pharmaceutical compositions containing such compounds, and methods of using such compounds and compositions, the following terms, if present, have the following meanings, unless otherwise indicated. It should also be understood that the description in the present description, any of the groups defined below may be substituted by a number of substituents and that it is understood that the corresponding definitions include such substituted groups in their framework set forth below. Unless otherwise indicated, the term substituted should be defined as set forth below. In addition, it should be understood that when used in the present description, the terms group and radicals can be considered interchangeable.

Pharmaceutically acceptable means accepted or may be accepted by the regulatory agency of the federal or state government or by the appropriate agency in countries other than the United States, or one that is listed in the US Pharmacopoeia or other generally accepted pharmacopoeias for use in animals, and more specifically for humans.

A pharmaceutically acceptable salt refers to a salt of a compound of this invention that is pharmaceutically acceptable and that possesses the desired pharmacological activity of the parent compound. In particular, such salts are not toxic; they can be salts of addition of inorganic or organic acids and salts of addition of bases. Specifically, similar salts include (1) acid addition salts derived from inorganically

- 4 020111 mi acids, such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, etc .; or obtained with organic acids such as acetic acid, propionic acid, caproic acid, cyclopentane propionic acid, glycolic acid, pyruvic acid, lactic acid, malonic acid, succinic acid, malic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, 3- (4-hydroxybenzoyl) benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, 1,2-ethanedisulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid Lot, benzenesulfonic acid, 4-chlorobenzenesulfonic acid, 2-naphthalenesulfonic acid, 4toluolsulfonovaya acid, camphorsulfonic acid, 4-methylbicyclo [2.2.2] oct-2-ene-1-carboxylic acid, glucoheptonic acid, 3-phenylpropionic acid, trimethylacetic acid , tert-butyl acetic acid, lauryl sulfuric acid, gluconic acid, glutamic acid, hydroxynaphthoic acid, salicylic acid, stearic acid, muconic acid, and so on; or (2) salts formed when the acidic proton present in the parent compound is either replaced by a metal ion, for example, an alkali metal ion, an alkaline earth metal ion, or an aluminum ion; or coordinated with an organic base such as ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, Ν-methylglucamine, etc. In addition, salts include, by way of example only, salts of sodium, potassium, calcium, magnesium, ammonium, tetraalkylammonium, and so on; and in the case when the compound contains a basic functional group, salts of non-toxic organic or inorganic acids, such as hydrochloride, hydrobromide, tartrate, mesylate, acetate, maleate, oxalate, etc. The term pharmaceutically acceptable cation refers to an acceptable cationic counterion of an acidic functional group. Examples of such cations are cations of sodium, potassium, calcium, magnesium, ammonium, tetraalkylammonium, etc.

A pharmaceutically acceptable diluent refers to a diluent, adjuvant, excipient, or carrier with which the compound of this invention is administered.

Prodrugs refer to compounds, including derivatives of the compounds of this invention, which contain leaving groups and, as a result of solvolysis or under physiological conditions, are converted into compounds of this invention that are pharmaceutically active ίη νίνο. Such examples include, but are not limited to, derivatives of choline ether, etc., alkylmormoline ether, etc.

Solvate refers to forms of the compound that are associated with a solvent, usually by a solvolysis reaction.

This physical association includes hydrogen bonding. Common solvents include water, ethanol, acetic acid, etc. The compounds of this invention can be obtained, for example, in crystalline form and can be solvated or hydrated. Suitable solvates include pharmaceutically acceptable solvates, such as hydrates, and also include stoichiometric solvates as well as non-stoichiometric solvates. In some cases, the solvate can be isolated, for example, when one or more solvent molecules enter the crystal lattice of a crystalline solid. The solvate includes both the phase in solution and the solvates evolved. Representative solvates include hydrates, ethanolates, and methanolates.

The subject includes humans. The terms human, patient and subject are used interchangeably herein.

A therapeutically effective amount means an amount of a compound that, when administered to a subject for treating a disease, is sufficient to effect such treatment for the disease. A therapeutically effective amount may vary depending on the compound, the disease and its severity and the age, weight, etc., of the subject to be treated.

A warning or warning refers to reducing the risk of getting or developing a disease or disorder (that is, causing at least one of the clinical symptoms of a disease not to develop in a subject who may be exposed to the disease-causing agent or predisposed to the disease before the onset of the disease).

The term prevention refers to prevention and refers to a measure or procedure that aims to prevent rather than cure or cure a disease. Non-limiting examples of preventive measures may include the introduction of vaccines, the administration of low-molecular-weight heparin inpatients to patients at risk of receiving thrombosis, for example, due to immobilization, and the introduction of an antimalarial agent, such as chloroquine, before a visit to a geographical region in which malaria is endemic, or where there is a high risk of contact with malaria.

The treatment or treatment of any disease or disorder, in one embodiment, refers to alleviating the disease or disorder (i.e., stopping the disease or manifestation, degree or severity of at least one of its clinical symptoms). In another embodiment, the treating or treatment refers to the alleviation of at least one physical parameter that may not be visible to the subject. In another embodiment, carried out

- Treatment or treatment refers to the modulation of a disease or disorder, either physically (for example, stabilization of a noticeable symptom), physiologically (for example, stabilization of a physical parameter), or both. In the following embodiment, the treating or treatment refers to slowing the progression of the disease.

As used herein, the term inflammatory condition (s) refers to a group of conditions including rheumatoid arthritis, osteoarthritis, juvenile idiopathic arthritis, psoriasis, allergic respiratory disease (for example, asthma, rhinitis), inflammatory bowel disease (for example, Crohn’s disease, colitis), painful conditions caused by endotoxins (for example, complications after coronary artery bypass surgery or chronic endotoxic conditions leading, for example, to chronic heart disease Residual) and related diseases involving cartilage, such as diseases of the joints. In particular, this term refers to rheumatoid arthritis, osteoarthritis, allergic respiratory disease (for example, asthma) and inflammatory bowel disease.

Used in the present description, the term autoimmune disease (s) refers to a group of diseases that include obstructive respiratory disease, including conditions such as SORI, asthma (for example, hereditary bronchial asthma, dust asthma, childhood asthma), especially chronic or old asthma (eg, late asthma, or airway hyperresponsiveness), bronchitis, including bronchial asthma, systemic lupus erythematosus (8ÜE), multiple sclerosis, type I diabetes, and related complications endogenous eczema (atopic dermatitis), contact dermatitis and other eczematous dermatitis, inflammatory bowel disease (for example, Crohn's disease and ulcerative colitis), atherosclerosis and amyotrophic lateral sclerosis. In particular, this term refers to SORI, asthma, systemic lupus erythematosus, type I diabetes and inflammatory bowel disease.

Used in the present description, the term proliferative disease (s) refers to conditions such as cancer (eg, uterine leiomyosarcoma or prostate cancer), myeloproliferative disorders (eg, polycythemia vera, essential thrombocytosis and myelofibrosis), leukemia (eg, acute myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia), multiple myeloma, psoriasis, restenosis, scleroderma or fibrosis. In particular, this term refers to cancer, leukemia, multiple myeloma and psoriasis.

Used in the present description, the term cancer refers to a malignant or benign growth of cells on the skin or organs of the body, for example, but without limitation, the breast, prostate, lung, kidney, pancreas, stomach or intestines. Cancer tends to penetrate adjacent tissue and spread (metastasize) to distant organs, such as bones, liver, lungs, or brain. As used herein, the term cancer includes both metastatic tumor cell types, such as melanoma, lymphoma, leukemia, fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma and mastocytoma, and types of tissue carcinoma, such as, but not limited to, colorectal cancer, prostate cancer, small cell cancer lung and non-small cell lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, kidney cancer, stomach cancer, glioblastoma, primary liver cancer, ovarian cancer, prostate cancer and leiomyos arkomy uterus.

The term leukemia as used herein refers to neoplastic diseases of the blood and blood-forming organs. Such diseases can lead to bone marrow and immune system dysfunction, which will make the recipient extremely susceptible to infection and bleeding. In particular, the term leukemia refers to acute myeloid leukemia (AMB) and acute lymphoblastic leukemia (AB).

As used herein, the term graft rejection refers to acute or chronic rejection of allogenetic or xenografts, or cells, tissue, or solid organs, such as pancreatic islets, stem cells, bone marrow, skin, muscle, corneal tissue, neural tissue, heart, lung, joint heart-lung, kidney, liver, intestine, pancreas, trachea or esophagus, or graft versus host disease.

Used in the present description, the term diseases, including the deterioration of the renewal of cartilage tissue includes conditions such as osteoarthritis, psoriatic arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, gouty arthritis, septic or infectious arthritis, reactive arthritis, reflex sympathetic dystrophy, algohystrophy, Tietze syndrome or costal chondritis, fibromyalgia, osteochondritis, neurogenic or neuropathic arthritis, arthropathy, endemic forms of arthritis such as deforming endemic osteoarthritis, Mseleni's disease and Handygodu's disease; degeneration due to fibromyalgia, systemic lupus erythematosus, scleroderma and ankylosing spondylarthritis.

As used herein, the term congenital cartilage defect (s) includes conditions such as hereditary chondrolysis, chondrodysplasia, and pseudochondrodysplasia, in particular, but without limitation, microtia, anotia, metaphysical chondrodysplasia, and related disorders.

The term disease (s) associated with hypertecretion of 1b used in the present description includes conditions such as Castleman’s disease, multiple myeloma, psoriasis, Kaposi’s sarcoma and / or mesangial proliferative glomerulonephritis.

Used in the present description, the term 1AK refers to the family of Janus kinases (TAK), which are cytoplasmic tyrosine kinases that transmit a cytokine signal from membrane receptors to transcription factors 8TAT. Four members of the 1AK family are described: 1АК1, 1АК2, 1АК3 and ТУК2, and the term 1АК can refer to all members of the 1АК family together or to one or more members of the 1АК family, as indicated in the context.

The compound (s) of the invention and the equivalent expressions are intended to include the compound of the formula described herein, wherein the expression includes pharmaceutically acceptable salts and solvates, for example, hydrates and solvates of pharmaceutically acceptable salts, where the context allows. Similarly, it is understood that reference to intermediates, regardless of whether they themselves are claimed, includes their salts and solvates, where the context allows.

When in the present description refer to the intervals, for example, but without limitation, C 1 -C 8 alkyl, the quoting interval should be considered the representation of each member of the specified interval.

Other derivatives of the compounds of this invention possess activity both in the form of their acids and in the forms of derivatives of acids, but in the form of an acid-sensitive form they often show the advantages of solubility, compatibility with tissues or slow release in the mammalian body (see Wiibdagb, N., Eemdp o £ Pgobgidz , pp. 7-9, 21-24, Euscher, Ash-tsegbash 1985). Prodrugs include acid derivatives that are well known to practitioners in the art, for example, esters obtained by reacting the starting acid with a suitable alcohol, or amides, obtained by reacting the starting acid compound with a substituted or unsubstituted amine, or acid anhydrides, or mixed anhydrides. Especially useful prodrugs are simple aliphatic or aromatic esters, amides, and anhydrides derived from acid groups that are pendant in the compounds of this invention. In some cases, it is desirable to obtain double ester type prodrugs, such as (acyloxy) alkyl esters or ((alkoxycarbonyl) oxy) alkyl esters. In particular, such prodrugs are C 1 -C 8 alkyl, C 2 -C 8 alkenyl, aryl, C 7 -C 12 substituted aryl, and C 7 -C 12 arylalkyl esters of the compounds of this invention.

Used in the present description, the term isotopic variant refers to a compound containing artificial percentage of the isotopes of one or more atoms that make up such a compound. For example, an isotopic variant of a compound may contain one or more non-radioactive isotopes, for example, such as deuterium ( 2 H or I), carbon-13 ( 13 C), nitrogen-15 ( 15 ), or the like. It will be understood that in the compound in which such isotopic substitution is carried out, the following atoms, when they are present, may change so that, for example, any hydrogen atom may be 2 H / I, any carbon atom may be 13 C or any nitrogen atom can be 15 , and that the presence and location of such atoms can be determined within the skill in the art. Similarly, the invention may include the preparation of isotopic variants with radioisotopes, for example, in the case where the compounds obtained can be used to study the distribution of the drug and / or substrate in the tissues. For this purpose, radioactive isotopes of tritium, that is, 3 H, and carbon-14, that is, 14 C, are particularly useful in view of the simplicity of their introduction and simple methods of determination. In addition, compounds that are replaced by positron emitting isotopes, such as P C, 18 E, 15 O, and 13 , can be obtained and are applicable in positron emission tomography (PET) studies to study substrate receptor occupancy.

It is understood that all isotopic variants of the compounds provided herein, regardless of whether they are radioactive or not, are within the scope of this invention.

Stereoisomers that are not mirror images of each other are called diastereomers, and stereoisomers that are mutually unrelated mirror images of each other are called enantiomers. If a compound has an asymmetric center, for example, it is associated with four different groups, a pair of enantiomers may be present. The enantiomer can be characterized by the absolute configuration of its asymmetric center and can be described using the rules of the Kann and Prelog I and / or Sequences or the nature of rotation of this plane of polarized light by this molecule and denoted it as a right or left rotation (i.e., (+) - or (-) - isomers, respectively). A chiral compound can exist either as an individual enantiomer or as a mixture thereof. A mixture containing equal amounts of enantiomers is called a racemic mixture.

Tautomers refer to compounds that are interchangeable forms of the structure of a particular compound and which differ in the arrangement of hydrogen atoms and electrons. Thus, as a result of the movement of electrons and any atom (usually H), two structures can be in equilibrium. For example, enols and ketones are tautomers, since they are quickly

- 7 020111 turn into each other when they are treated with either acid or base. Another example of tautomerism is the acy- and nitro-forms of phenylnitromethane, which are obtained in a similar manner by treatment with an acid or base.

The tautomeric forms may be related to the achievement of optimum chemical reactivity and biological activity of the compound in question.

The compound of this invention may contain one or more asymmetric centers; therefore, such compounds can be obtained as individual (K) - or (8) -stereoisomers or as mixtures thereof.

Unless otherwise indicated, it is understood that the description or name of a particular compound in the description and the claims includes individual enantiomers and mixtures, racemic or others. Methods for determining the stereochemical structure and separation of stereoisomers are well known in the art.

Compound.

The present invention is based on the fact that 1LK inhibitors are applicable to the treatment of inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplant rejection, diseases involving the deterioration of cartilage tissue renewal, congenital cartilage tissue diseases, and diseases associated with 1b hypersecretion. In addition, the present invention provides methods for the preparation of this compound, pharmaceutical compositions containing the compound, and methods for treating diseases, including cartilage destruction, bone and / or joint destruction, and / or inflammation, by administering a compound of this invention. The present compound is an inhibitor of members of the 1LC family, specifically, it inhibits the activity of 1LC1, 1LC2, 1LC3 and ΤΥΚ2. In particular, it inhibits the activity of 1LC1.

Accordingly, in the first aspect of the present invention, a compound of the invention is described having the formula I

I

The compound of this invention is {5- [4- (3,3-dimethylazetidine-1carbonyl) phenyl] - [1,2,4] triazole [1,5-a] pyridin-2-yl} amide cyclopropanecarboxylic acid.

In one embodiment, the compound of the present invention is not an isotopic variant.

In one aspect, the compound of this invention is in the form of a free base.

In one aspect, a compound of this invention is a pharmaceutically acceptable salt.

In one aspect, a compound of this invention is a solvate of the compound.

In one aspect, a compound of this invention is a solvate of a pharmaceutically acceptable salt of this compound.

In some aspects, the present invention provides prodrugs and derivatives of the compounds according to the above formula. Prodrugs are derivatives of the compounds of this invention, which contain metabolically cleavable groups, and as a result of solvolysis or under physiological conditions, are converted into compounds of this invention that are pharmaceutically active ίη νίνο. Examples include but are not limited to choline ester derivatives, n-alkyl morpholine esters, etc.

Other derivatives of the compounds of this invention have activity in both the form of their acids and acid derivatives, but the form of a rapidly reacting acid often exhibits advantages in terms of solubility, compatibility with tissues, or slow release in the mammalian body (see Vipbdagb,., Ωοδίβη oG Progid , pp. 7-9, 21-24, Eksuyug. Ltjgbat 1985). Prodrugs include acid derivatives that are well known to those skilled in the art, for example, esters obtained by reacting a starting acid with a suitable alcohol, or amides obtained by reacting a starting acid compound with a substituted or unsubstituted amine, or acid anhydrides, or mixed anhydrides. Preferred prodrugs are simple aliphatic or aromatic esters, amides, and anhydrides derived from acid groups that are pendant in the compounds of this invention. In some cases, it is desirable to obtain double ester type prodrugs, such as (acyloxy) alkyl esters or ((alkoxycarbonyl) oxy) alkyl esters. Especially

- 8 020111 useful C1 to C 8 alkyl, C 2 -C 8 alkenyl, aryl, C 7 -C 1 2 substituted aryl and C 7 -C 1 2 arylalkyl esters of the compounds of this invention.

Pharmaceutical compositions.

When used as a pharmaceutical agent, a compound of this invention is usually administered in the form of a pharmaceutical composition. Such compositions can be obtained by a method that is well known in the pharmaceutical field and contains at least one active compound. Typically, the compound of this invention is administered in a pharmaceutically effective amount. The actual amount of compound administered will usually be determined by the physician, taking into account the relevant circumstances, including the condition to be treated, the chosen route of administration, the actual compound administered, the age, weight and response of the individual patient, the severity of the patient's symptoms, etc.

The pharmaceutical compositions of this invention can be administered in a number of ways, including oral, rectal, transdermal, subcutaneous, intra-articular, intravenous, intramuscular, and intranasal. Depending on the intended mode of delivery, the compounds of this invention preferably comprise the preparation either as an injection, or as an oral composition, as an ointment, as a lotion, or as a patch, all of which are intended for percutaneous administration.

Compositions for oral administration can take the form of bulk liquid solutions or suspensions, or bulk powders. However, it is more common to provide compositions in the form of single dosage forms to facilitate accurate dosage. The term “single dosage form” refers to physically discrete units that are suitable as unit doses for human and other mammalian subjects, with each unit containing a predetermined amount of active substance calculated to provide the desired therapeutic effect, in combination with a suitable pharmaceutical excipient. , thinner or carrier. Typical unit dosage forms include pre-filled, pre-measured ampoules or syringes with liquid formulations, or pills, tablets, capsules, or the like. in the case of solid compositions. In such compositions, the compound of this invention is typically a minor component (from about 0.1 to about 50 wt.% Or preferably from about 1 to about 40 wt.%), With the remainder being various diluents or carriers or processing aids, useful to obtain the desired dosage form.

Liquid forms suitable for oral administration may include a suitable aqueous or non-aqueous diluent with buffering agents, suspending and dispersing agents, colorants, flavoring agents, etc. Solid forms may include, for example, any of the following ingredients or compounds having a similar nature: a binder such as microcrystalline cellulose, a tragacanth gum or gelatin, an excipient such as starch or lactose, a disrupting agent such as alginic acid, primogel or corn starch, a lubricant, such as magnesium stearate, glidant, such as colloidal silicon dioxide, a sweetener, such as sucrose or saccharin, or a flavoring agent, such as peppermint a, methyl salicylate or orange flavoring.

The basis of the compositions for injection is usually injectable sterile saline, or phosphate-buffered saline, or other injectable carriers known in the art. As before, the active compound in such compositions is usually a minor component, often comprising from about 0.05 to 10 wt.%, With the remainder being an injectable carrier, etc.

Percutaneous compositions are usually formulated as a topical ointment or cream containing the active ingredient (s), usually in an amount varying from about 0.01 to about 20% by weight, preferably from about 0.1 to about 20% by weight, preferably from about 0.1 to about 10 wt.% and more preferably from about 0.5 to about 15 wt.%. When formulating an ointment, the active ingredients will usually be combined with either paraffinic or water-immiscible base ointment. Alternatively, the active ingredients can be formulated as a cream, for example with a cream base oil-in-water. Such percutaneous preparations are well known in the art and, as a rule, contain additional ingredients to increase skin penetration or sustainability of the active ingredients of the preparation. All such known percutaneous preparations and ingredients are included in the scope of this invention.

The compound of the present invention can also be administered by transdermal device. Accordingly, transdermal administration can be carried out using a patch of either a reservoir type, or a porous membrane, or a number of solid matrices.

The components described above for orally administered, by injection or topically administered compositions are only representative. Other substances, as well as processing techniques, etc. set out in 8 parts of Keshshdop'8 Rjattaseiysa1 8aspss5. 17 411 οάίΐίοη. 1985, Mask RiIyid Sotrupa, Eioi, Repinu 1uasha, which is incorporated into this description by reference.

The compound of the present invention may also be administered in the form of sustained release forms.

- 9 020111 or sustained release drug delivery systems. A description of representative substances for sustained release can be found in Kettdyoi'8 Ryagtaseiis1 Baieisek.

The following examples of preparations illustrate representative pharmaceutical compositions that can be obtained according to this invention. However, the present invention is not limited to the following pharmaceutical compositions.

The drug 1. Tablets.

The compound of this invention can be mixed in the form of a dry powder with a dry gelatin binder in a weight ratio of about 1: 2. A minor amount of magnesium stearate can be added as a lubricant. Tablets of 240-270 mg (80-90 mg of active amide compound per tablet) can be molded from this mixture using a tablet press.

The drug 2. Capsules.

The compound of this invention can be mixed in the form of a dry powder with a diluent of starch in a mass ratio of approximately 1: 1. This mixture can be filled into capsules of 250 mg each (125 mg of active amide compound per capsule).

Preparation 3. Liquid.

The compound of this invention (125 mg) can be mixed with sucrose (1.75 g) and xanthan gum (4 mg) and the resulting mixture can be mixed, passed through a No. 10 mesh US sieve, and then mixed with a pre-prepared solution of microcrystalline cellulose and sodium carboxymethylcellulose (11:89, 50 mg) in water. Sodium benzoate (10 mg), the flavor and the dye can be diluted with water and added with stirring. After that, with stirring, you can add a sufficient amount of water. You can then add enough water to make a total volume of 5 ml.

The drug 4. Tablets.

The compound of this invention can be mixed in the form of a dry powder with a dry gelatin binder in a weight ratio of about 1: 2. A minor amount of magnesium stearate can be added as a lubricant. This mixture is formed into tablets of 450900 mg (150-300 mg of active amide compound) using a tablet press.

Preparation 5. Injection.

The compound of the present invention can be dissolved or suspended in a buffered sterile saline aqueous medium for injection at a concentration of approximately 5 mg / ml.

Preparation 6. Local.

Stearyl alcohol (250 g) and white petrolatum (250 g) can be melted at about 75 ° C, and then you can add a mixture of the compound of this invention (50 g), methyl paraben (0.25 g), propyl paraben (0.15 g), sodium lauryl sulfate (10 g) and propylene glycol (120 g), dissolved in water (about 370 g), and the mixture can be stirred until it hardens.

Ways of treatment.

The compound of this invention can be used as a therapeutic agent for treating conditions in mammals that are causally related, or belong to the aberrant activity of 1LK. In particular, the states refer to the aberrant activity of 1AK1. Accordingly, the compound and pharmaceutical compositions of the present invention find use as therapeutic agents for the prevention and / or treatment of inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplant rejection, diseases, including deterioration of cartilage tissue renewal, congenital cartilage defects and diseases associated with hypersecretion of G6 in mammals, including humans.

In additional aspects of the method of treatment, the present invention provides methods for treating a mammal susceptible or affected by an inflammatory condition. This method comprises administering an effective amount for treating a condition or preventing a condition of one or more of the pharmaceutical compositions or compounds of the present invention described herein. In a specific embodiment, the inflammatory condition is selected from rheumatoid arthritis, osteoarthritis, allergic respiratory disease (eg, asthma), and inflammatory bowel disease.

In a further aspect, the present invention provides a compound of the present invention for the treatment, prevention, or prophylaxis of an inflammatory condition. In a specific embodiment, the inflammatory condition is selected from rheumatoid arthritis, osteoarthritis, allergic respiratory disease (eg, asthma), and inflammatory bowel disease.

In additional aspects of the method of treatment, the present invention provides methods for treating a mammal susceptible or affected by an autoimmune disease. These methods include the administration of an amount of one or more of the pharmaceutical compositions or compounds of the present invention described herein that is effective for treating a condition or preventing a condition. In a particular embodiment, the autoimmune disease is selected from SORI, asthma, systemic

- 10 020111 dark lupus erythematosus, type I diabetes and inflammatory bowel disease.

In a further aspect, the present invention provides a compound of the present invention for the treatment, prevention, or prophylaxis of an autoimmune disease. In a particular embodiment, the autoimmune disease is selected from SORE. asthma, systemic lupus erythematosus, type I diabetes and inflammatory bowel disease.

In further aspects of the method of treatment, the present invention provides methods for treating a mammal susceptible or affected by a proliferative disease, in particular cancer (eg, solid tumors such as uterine leiomyosarcoma or prostate cancer), leukemia (eg, LML or LJ), multiple myeloma, and / or psoriasis. These methods include the administration of an amount of one or more of the pharmaceutical compositions or compounds of the present invention described herein that is effective for treating a condition or preventing a condition.

In a further aspect, the present invention provides a compound of the present invention for the treatment, prevention, or prophylaxis of a proliferative disease, in particular cancer (eg, solid tumors, such as uterine leiomyosarcoma or prostate cancer), leukemia (eg, LML or LJ), multiple myeloma and / or psoriasis.

In further aspects of the method of treatment, the present invention provides methods for treating a mammal susceptible or rejected to a transplant. These methods include the administration of an amount of one or more of the pharmaceutical compositions or compounds of the present invention described herein that is effective for treating a condition or preventing a condition. In a specific embodiment, the present invention provides methods for the treatment of organ transplant rejection.

In an aspect of the method of treatment in the present invention, a method is provided for the treatment, prevention, or prophylaxis of a mammal susceptible or diseased, including the deterioration of cartilage tissue renewal. These methods include the administration of an amount of one or more of the pharmaceutical compositions or compounds of the present invention described herein that is effective for treating a condition or preventing a condition.

In another aspect, the invention provides a compound of the invention for the treatment, prevention, or prophylaxis of diseases, including deterioration of cartilage tissue renewal.

In addition, the present invention provides a method for the treatment of congenital malformations of cartilage tissue. These methods include the administration of an amount of one or more of the pharmaceutical compositions or compounds of the present invention described herein that is effective for treating a condition or preventing a condition.

In another aspect, the invention provides a compound of the invention for the treatment, prevention, or prophylaxis of congenital malformations of cartilage tissue.

In a further aspect of the methods of treatment, the present invention provides methods for treating a mammal susceptible or afflicted with diseases associated with 1B hypersecretion, in particular Castleman's disease or mesangial proliferative glomerulonephritis. These methods include the administration of an amount of one or more of the pharmaceutical compositions or compounds of the present invention described herein that is effective for treating a condition or preventing a condition.

In a further aspect, the present invention provides a compound of the present invention for the treatment, prevention, or prophylaxis of diseases associated with 1B hypersecretion, in particular Castleman's disease or mesangial proliferative glomerulonephritis.

As a further aspect of the invention, a compound of the present invention is provided for use as a pharmaceutical agent, in particular in the treatment or prevention of the above-mentioned conditions and diseases. In addition, the present disclosure provides the use of a compound for the manufacture of a medicament for treating or preventing one of the above-mentioned conditions and diseases.

The particular mode of the present method comprises administering to a subject suffering from an inflammatory condition an effective amount of a compound of the present invention for a period of time sufficient to reduce the degree of inflammation in the subject and preferably terminate the processes responsible for said inflammation. A particular embodiment of this method involves administering an effective amount of a compound of the present invention to a patient undergoing or susceptible to developing rheumatoid arthritis, for a period of time that is sufficient to reduce or prevent inflammation in the joints of the patient, respectively, and preferably to stop the processes responsible for the indicated inflammation.

The following specific mode of the present method involves administering to a subject suffering from diseases involving the deterioration of cartilage renewal (eg, osteoarthritis) an effective amount of a compound of this invention for a period of time sufficient to

- 11 020111 reduction, and preferably termination of self-sustaining processes responsible for the specified destruction. A specific embodiment of this method involves administering an effective amount of a compound of the present invention to a patient suffering from or susceptible to developing osteoarthritis, for a period of time sufficient respectively to reduce or prevent the destruction of the joints of said patient, and preferably to stop the self-sustaining processes responsible for specified destruction. In a specific embodiment, said compound may exhibit anabolic and / or anti-anabolic properties with respect to cartilage tissue.

The concentration of the dose for injection varies from about 0.1 to at least 10 mg / kg / h, significantly in favor of the interval from about 1 to about 120 hours and especially from 24 to 96 hours. To achieve the corresponding concentrations of the steady state administer a pre-filled bolus containing from about 0.1 to about 10 mg / kg or more. It is expected that the maximum total dose will not exceed approximately 2 g / day for patients weighing between 40 and 80 kg being human.

For the prevention and / or treatment of prolonged conditions, such as degenerative conditions, the treatment regimen usually lasts for many months or years, so that oral dosage is preferred for patient convenience and tolerance. In the case of oral dosing, representative regimens are from one to five, and in particular from two to four, and usually three oral doses per day. When using these dosing regimens, each dose provides from about 0.01 to about 20 mg / kg of the compound of this invention, with each of the specific doses providing from about 0.1 to about 10 mg / kg, and in particular from about 1 to about 5 mg / kg.

Percutaneous doses are usually chosen to obtain a similar or lower blood concentration than the concentration that is achieved using injectable doses.

When used to prevent the onset of an inflammatory condition, the compound of the present invention will be administered to a patient at risk of developing this condition, usually on the advice and under the supervision of a physician, in the dosage concentrations described above. As a rule, the number of patients who are at risk of developing a particular condition includes patients with a family history of which the condition is present, or patients for whom, according to genetic testing or screening, a particular susceptibility to the development of this condition has been established.

The compound of this invention can be administered as a single active agent, or it can be administered in combination with other therapeutic agents, including other compounds that exhibit similar or similar therapeutic activity and for which safety and efficacy have been established in the case of such combined administration. In a specific embodiment, the co-administration of two (or more) agents allows the use of much smaller doses of each of them, which reduces, thus, the observed similar effects.

In one embodiment, a compound of this invention is co-administered with another therapeutic agent to treat and / or prevent an inflammatory condition; Specific agents include, but are not limited to, immunoregulatory agents, such as azathioprine, corticosteroids (eg, prednisolone, or dexamethasone), cyclophosphamide, cyclosporin A, tacrolimus, mycophenolate mofetil, muromonab-CB3 (OCT3, of course, a group, of course, will not be used). ATS, aspirin, acetaminoprofen, ibuprofen, naproxen and piroxicam.

In one embodiment, a compound of this invention is co-administered with another therapeutic agent for the treatment and / or prevention of arthritis (for example, rheumatoid arthritis); Specific agents include, but are not limited to, analgesics, nonsteroidal anti-inflammatory drugs (Ν8ΑΙΌpee), steroids, synthetic ΌΜΑΚΌ8 (for example, but without limitation, methotrexate, leflunomide, sulphazalazine, auranofine, sodium aurominomatin, penicillamine, sulphazalazine, sodium penicyllamine, ayurodomasome, penicillamino, sulfasalazine, atoranophine, atoranophin, atoranophilic, antihypertensive ) and biological ΌΜΑΚΌ8 (for example, but without limitation, infliximab, etanercept, adalimmab, rituximab and abatacept).

In one of the embodiments of the compound of this invention is administered together with another therapeutic agent for the treatment and / or prevention of proliferative disorders; concrete agents include but not limited to methotrexate; monoclonal antibody (for example, Netseria ™), capecitabine, raboxyfenum hydrochloride, EOE inhibitors (for example, 1Ta88a®, Tatseua ™, Hisyim ™), UEOE inhibitors (for example, Auaish ™), proteasome inhibitors (eg measures Ue1sabe ™), and Syues® 115r90 inhibitors (e.g., 17-AAS). In addition, the compound of this invention is administered in conjunction with other therapeutic agents, including, but not limited to, radiation therapy or surgery. In a specific embodiment, the proliferative disorder is selected from cancer, myeloproliferative disease, or leukemia.

- 12 020111

In one embodiment, a compound of this invention is co-administered with another therapeutic agent for the treatment and / or prevention of autoimmune diseases; Specific agents include, but are not limited to, glucocorticoids, cytotoxic agents (for example, purine analogues), alkylating agents (for example, nitrogen mustards (cyclophosphamide), nitrosureas, platinum compounds and others), antimetabolites (for example, methotrexate, azathioprine and mercaproturite, mercaproturite, azapioprine and mercaproturite, etc.), antimetabolites (for example, methotrexate, azathioprine and mercaproturite, etc.) cytotoxic antibiotics (for example, dactinomycin, anthracyclines, mitomycin C, bleomycin and mitramycin), antibodies (for example, anti-SE20, anti-SE25, or anti-SEZ (OTK3) monoclonal antibodies, A1dat® and Tyutod1oi1te®), cyclosporin, tacrolimus, rapamycin (sirolimus), interferons (e.g., ΙΕΝ-β), ΤΝΒsvyazyvayuschimi proteins (e.g., infliximab (Ketyuabe ™), etanercept (Eige1 ™) or adalimumab (Ngtiga ™)), mycophenolate, fingolimod and myriocin.

In one embodiment, a compound of this invention is co-administered with another therapeutic agent for the treatment and / or prevention of transplant rejection; Specific agents include, but are not limited to, calcineurin inhibitors (eg, cyclosporin or tacrolimus (EK506)), tTOV inhibitors (eg, sirolimus, everolimus), antiproliferative corticosteroids (eg, prednisolone, hydrocortisone), antibodies (eg, monoclonal antibodies -1B-2Ba receptor, basiliximab, daclizumab), polyclonal anti-T-cell antibodies (eg, anti-thymocyte globulin (ATC), anti-lymphocyte globulin (ABC)).

In one embodiment, a compound of this invention is co-administered with another therapeutic agent for the treatment and / or prevention of asthma and / or rhinitis and / or SORE; Specific agents include, but are not limited to: agonists in 2 -adrenoreceptors (for example, salbutamol, levalbuterol, terbutaline, and bitolterol), epinephrine (by inhalation or tablets), anticholinergics (for example, ipratropiumumbromide), gluco-corticoids, and inhalants or antholinergics (for example, ipratropiumumbromide), gluco-corticoids, and inhalants or antholinergics (for example, ipratropiambromide), gluco-corticoids, and anticholinergics (for example, ipratropiamol); by inhalation), in 2 long-acting antagonists (for example, salmeterol, formoterol, bambuterol, and sustained-release oral albuterol), a combination of steroids and bronchodiacs administered by inhalation long-acting patches (for example, fluticasone / salmeterol, butoneside / formoterol), antagonists and inhibitors of leukotriene synthesis (for example, montelukast, zafirlukast and zileton), inhibitors of the release of mediators (for example, kromoglikatom and kontonifenom); , antihistamine drugs (for example, ceterisin, cinnarizine, fexofenadine) and vasoconstrictors (for example, oxymetazoline, xylometazoline, naphazoline and tramazolin).

In addition, the compound of the present invention can be administered in combination with emergency therapeutic agents in the case of asthma and / or SORE, with such therapies including the administration of oxygen or oxygen-helium mixture, sprayed salbutamol or terbutaline (optionally in combination with anticholinergic drugs ( for example, ipratropium)), systemic steroids (oral or intravenous, such as prednisone, prednisone, methylprednisolone, dexamethasone, or hydrocortisone), intravenous salbutamol, non-cipher β-agonists, administered by injection or by inhalation (e.g., epinephrine, isoetharine, isoproterenol, metaproterenol), anticholinergics (intravenously or atomized, e.g. glycopyrrolate, atropine, ipratropium), methylxanthines (theophylline, aminophylline, bamifillin), inhalation anesthetics have bronchodilator effects (eg, isoflurane, halothane, enflurane), ketamine, and intravenous magnesium sulfate.

In one embodiment, a compound of this invention is co-administered with another therapeutic agent for the treatment and / or prevention of inflammatory bowel disease (ΙΒΌ); Specific agents include, but are not limited to, glucocorticoids (for example, prednisone, budesonide), synthetic disease modifying immunomodulatory agents (for example, methotrexate, leflunomidom, sulfasalazine, mesalazine, azathioprine, 6-capcopurine, cyclosporin, and other physioporinic izectos, izalazine, mesalazine, azathioprine, cyclocorpine, cyclosporin, syphasazin, mesalazine, azathioprine, cyclosporine, cyclocorticoid) , rituximab and abataceptom).

In one embodiment, a compound of this invention is co-administered with another therapeutic agent for treating and / or preventing systemic lupus erythematosus; specific agents include, but are not limited to disease modifying antirheumatic drugs (ΌΜΑΚΌ), such as antimalarial drugs (for example, Plaquenil, hydroxychloroquine), immunosuppressants (for example, methotrexate and azathioprine), cyclophosphamide, and mycophenolic acid; immunosuppressive drugs and analgesics, such as nonsteroidal anti-inflammatory drugs, opiates (for example, dextropropoxyphene and codamol), opioids (for example, hydrocodone, oxycodone, ий8 Soiyi, or methadone) and containing fentanyl and thermomes containing thermophenol containing oxycodone, Μ8 Soiyi, or methadone).

In one embodiment, a compound of this invention is administered together with another.

- 13 020111 therapeutic agent for the treatment and / or prevention of psoriasis; Specific agents include, but are not limited to, topical treatments such as immersion solutions, moisturizers, medicinal creams and ointments containing coal tar, dithranol (anthralin), corticosteroids such as deoxymethasone (Τορίεοή ™), fluocinonide, vitamin аналоги 3 analogues (for example, calcipotriol), retinoids of argan oil (etretinate, acitretin, tazaroten), systemic treatments such as methotrexate, cyclosporine, retinoids, thioguanine, hydroxyurea, sulfalazine, mycophenolate mofetil, azathioprine, tacrolimus, fumaric acid esters or biological products such as Ltsbus ™. Nshshga ™, Vetkabe ™, Karjua ™ and Ustekinumab (blocker 1b-12 and 1b-23). In addition, the compound of this invention can be administered in combination with other therapies, including, but not limited to, phototherapy or photochemotherapy (for example, psoralen and ultraviolet A-phototherapy (RIUL)).

Co-administration includes any means of delivering two or more therapeutic agents to a patient as part of the same treatment regimen, as will be apparent to those skilled in the art. Although two or more agents can be administered simultaneously as a single drug, this is not essential. These agents can be administered in different formulations and at different times.

General Synthesis Techniques

General

The compound of the present invention can be prepared from readily available starting materials using the following general methods and procedures. It is clear that in the case when typical or preferred conditions of the method are given (for example, reaction temperature, duration, molar ratios of reagents, solvents, pressure, etc.), other method conditions can also be used, unless otherwise specified. The optimal reaction conditions may vary depending on the specific reagents or solvent used, but one skilled in the art can determine such conditions by standard optimization methods.

In addition, it will be obvious to those skilled in the art that standard protective groups may be required to prevent undesirable reactions from taking place with some functional groups. The selection of an appropriate protecting group for a particular functional group, as well as suitable conditions for protection and deprotection is well known in the art. For example, numerous protective groups and their introduction and removal are described in Τ. ^. Troy apb R.S.M. \ Uik rgейku Сe Soiirk Огη Ogdache 8yuyek1k, \ upeu, Ute Ugk, 1991 and in references cited therein.

The following methods are presented in detail in relation to obtaining representative bicycloheteroaryl, which were listed in the present description earlier. A person skilled in the art of organic synthesis can obtain the compound of this invention from known or commercially available starting materials and reagents.

All reagents were of technical quality and were used without further purification, unless otherwise specified. In the reactions carried out in an inert gas atmosphere, commercially available anhydrous solvents were used. In all other cases, used solvents, pure for analysis, unless otherwise specified. Column chromatography was performed on silica gel 60 (35-70 μm). Thin layer chromatography was carried out on plates with pre-applied silica gel E-254 (thickness 0.25 mm). The 1 H-NMR spectra were recorded on a Vickake 400 spectrometer (400 MHz). The chemical shifts (δ) in the Я-NMR spectra are given in ppm (ppm) relative to tetramethylsilane (δ 0.00) or the peak of the residual proton of the corresponding solvent, i.e. CHC1 3 (δ 7.27) as an internal standard. The multiplicity is given in the form of a singlet (s), a doublet (d), a triplet (t), a quadruplet (q), a multiplet (m), and a broadened signal (br). Constants of spin-spin interaction (1) are given in Hz. Mass spectra with electrospray ionization were recorded on a Mkgotakk p1a1Gogt HC / M8 spectrometer. Column used for all analyzes by HPLC: Wacter lecium IRS VEN C18 1.7 µm, 2.1 mm W 50 mm b (batch no. 186002350).

Preparative HPLC: HVPbde Rager S18 5 µm ΟΌΒ 19 mm Wx100 mm L (batch No. 186002978). All methods were carried out using gradients MeCY / H 2 O. B H 2 O contained either 0.1% TFA or 0.1% 3 .

- 14 020111

The following is a list of abbreviations used in the experimental section:

BCM Methylene chloride ΠΐΡΕΑ Ν,-diisopropylethylamine Mesa Acetonitrile BOC Tert-butoxycarbonyl DMF N, N-dimethylformamide Cat. Catalytic amount Tfa Trifluoroacetic acid THF Tetrahydrofuran NMR Nuclear magnetic resonance DMSO Dimethyl sulfoxide w-ms Chromatomass spectrometry Md Millionth share Ρά / С Palladium on activated carbon 10% RMB Paramethoxybenzyl Rour Benzotriazole-1yloxytris (pyrrolidine) phosphonium hexafluoroborate EbOAc Ethyl acetate ARS1 Chemical ionization at atmospheric pressure ke Retention time with singlet ravine C Broad Singlet m multiplet min minute Ml milliliter μl microliter g gram mg milligram RyS1 2 drr £ [1,1'-bis (diphenylphosphine) ferrocene] dichloropalladium (II) TEM Triethylamine MMD Matrix Metalloproteinase YNAS Normal chondrocytes of the human articular cartilage zrnk Small RNA forming hairpins RNA Ribonucleic acid Αά-θίΡΗΚ Adenovirus-encoded είΡΗΚ RVZT Phosphate-buffered saline containing Tmeep 3.2 mM Ma 2 HPO 4 , 0.5 mM KH 2 PO 4 , 1.3 mM KC1,135 mM NaC1.0.05% Τν / eel 20, pH 7.4 ARMA 4-aminophenylmercury acetate Umem The minimum nutrient medium Needle, modified Dalbekko EVZ Fetal bull serum ISAE Human Adenovirus Cell Receptor 3-ΜΟΙ The multiplicity of infection, equal to 3 άΝΤΡ Deoxyribonucleoside triphosphate ORSK Quantitative polymerase chain reaction cDNA Complementary deoxyribonucleic acid ΟΑΡϋΗ Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase

- 15 020111

Synthesis of a compound of the invention

The compound according to the invention can be prepared according to the following scheme. General method of synthesis.

Scheme

ΝΗ-, ΟΗ.ΗΟΙ 'Ργ 2 ΝΕΙ EUN / MeOH Δ

-Ι.Κεοα, Ε ^ Ν 2. ΝΙ-C / MeON

ΟΗ 3 ΟΝ, 20 ° С [20 ° С

Ag (5)

HE

Ar – B 7

HE

wherein Ar is phenyl-L-heterocycloalkyl, L1 is —CO—, and the heterocycloalkyl group is optionally substituted.

General

1.1.1. 1- (b-Bromopyridin-2-yl) -3-carbethoxythiourea (2)

(2)

To a solution of 2-amino-b-bromopyridine (1) (253.8 g, 1.4b7 mol) in Ό0 Μ (2.5 l), cooled to 5 ° C, ethoxycarbonyl isothiocyanate (173.0 ml, 1, 4b7 mol) for 15 minutes Then the reaction mixture is allowed to warm to room temperature (20 ° C) and stirred for 1b hours. Evaporation in vacuo gives a solid, which can be isolated by filtration, washed thoroughly with petroleum ether (3 x 100 ml) and dried in air, obtaining (2 ). This thiourea can be used in the next step as such without any purification. 'Η (400 MHz, ΟΌΟ1 3 ) δ 12.03 (1H, br.s, ΝΗ), 8.81 (1H, d, 1 = 7.8 Hz, H-3), 8.15 (1H, br . s, ΝΗ), 7, b0 (1H, t, 1 = 8.0 Hz, H-4), 7.32 (1H, dd, 1 = 7.7 and 0, b Hz, H-5), 4.31 (2H, q, 1 = 7.1 Hz, CH 2 ), 1.35 (3H, t, 1 = 7.1 Hz, CH 3 ).

1.1.2. 5-Bromo- [1,2,4] triazole [1,5-a] pyridin-2-ylamine (3)

To a suspension of hydroxylamine hydrochloride (101.8 g, 1.4b5 mol) in a mixture of EUN / MeOH (1: 1, 900 ml) add Ν,-diisopropylethylamine (145.3 ml, 0.879 mol) and stir the mixture at room temperature ( 20 ° C) for 1 hour. After that, 1- (b-bromopyridin-2-yl) -3 carbethoxythiourea (2) (89.0 g, 0.293 mol) is added and the mixture is slowly heated to reflux (note: for extinguishing of excreted H 2 § an absorption tube with bleach is required). After 3 hours at reflux, the mixture is allowed to cool and is filtered, separating the precipitated precipitate.

Additional product is isolated by evaporation of the filtrate in vacuo, addition of H 2 O (250 ml) and filtration. The combined precipitates are successively washed with H 2 O (250 ml), EUN / MeOH (1: 1, 250 ml) and EO (250 ml), then dried in vacuo to give the triazole pyridine derivative (3) as a solid. This compound can be used in the next step as such without any purification. 'H (400 MHz, DMSO-b b) δ 7,43-7,34 (2H, m, 2haromatichesky H), 7.24 (1H, dd, b = 1, 8 and 1.8 Hz, aromatic H) , b, 30 (2H, br, N ^ 0; t / ζ 213/215 (1: 1, M + H 4 , 100%).

1.1.3. (5-Bromo- [1,2,4] triazole [1,5-a] pyridin-2-yl) amide cyclopropanecarboxylic acid (4)

To a solution of 2-aminotriazolpyridine (3) (7.10 g, 33.3 mmol) in dry ί.Ή 3 ί'Ν (150 ml) at 5 ° C add Εΐ 3 (11, b ml, 83.3 mmol ), then add cyclopropanecarbonyl chloride (83.3 mmol). The reaction mixture is then allowed to warm to ambient temperature and stirred until all the starting material (3) has been consumed. If necessary, to ensure complete reaction, add another добавляют 3 (4, b4 ml, 33.3 mmol) and cyclopropanecarbonyl chloride (33.3 mmol). After evaporation of the solvent in vacuo, the resulting residue is treated with 7N. ammonia solution in methanol (50 ml) and stirred at ambient temperature (for 1-1 h) to hydrolyze any bis-acylation product. Isolation of the product is carried out by removing volatile substances.

- 1b 020111 substances in vacuum, followed by trituration in EO (50 ml). The precipitates were isolated by filtration, washed with H 2 O ( 2 × 50 ml), acetone (50 ml) and E1 2 O (50 ml), then dried in vacuo to obtain the desired bromo intermediate (4).

Synthesis methodology for the preparation of a compound of this invention.

Compound 1.

Stage 1. The combination of Suzuki

To a solution of (5-bromo- [1,2,4] triazole [1,5-a] pyridin-2-yl) amide cyclopropanecarboxylic acid (intermediate compound 4, 5 g, 0.018 mol) in 1,4-dioxane / water (5: 1) was added 4carboxyphenylboronic acid (3.5 g, 0.021 mol). K 2 CO 3 (5.0 g, 0.036 mol) and PbSebrG (5%) were added to the solution. After that, the resulting mixture was heated by traditional heating in an oil bath at 90 ° C for 16 hours. A 1 M HC1 solution was added, and a precipitate formed in the acidic solution. This precipitate was filtered, dried in vacuo to give the title compound, which was used in the next step without further purification.

Step 2. {5- [4- (3,3-Dimethylazetidin-1-carbonyl) phenyl] - [1,2,4] triazole [1,5-a] pyridin-2-yl} amide cyclopropanecarboxylic acid (compound 1 )

To a solution of 4- [2- (cyclopropanecarbonylamino) - [1,2,4] triazole [1,5-a] pyridin-5-yl] benzoic acid (4 g, 0.012 mol) in the OSM (150 ml) was added ΕΌΟ ( 3.59 g, 0.019 mol), NEW! (2.53 g, 0.019 mol) and PEA (4.48 ml) at room temperature. The resulting mixture was stirred for 10 minutes at room temperature. Dimethylazetidine hydrochloride salt (1.64 g, 0.013 mol) was added to the solution and the mixture was stirred for 16 h. Water was added to the reaction mixture. The organic layer was separated and washed with 2n. NaOH solution, 2n. HC1 solution and water. The organic phase was dried over MgO 4 , filtered and evaporated in vacuo. As a result of purification by flash chromatography (eluent: from a 1: 1 mixture of petroleum ether / EUAc to pure E (OAc), {5- [4- (3,3-dimethylazetidine-1carbonyl) phenyl] - [1,2,4 ] triazole [1,5-a] pyridin-2-yl} amide cyclopropanecarboxylic acid.

The compound of this invention, which was obtained or which can be obtained according to the method of synthesis described here, is given below in table. I. The NMR spectral data of the compound of the invention are presented in Table. ΙΙ.

TABLE I Mass spectrometry data of a compound of the invention.

Comm. Number Structure Title M MS Opr. one N ° {5- [4- (3,3 dimethylase etidine-1carbonyl) phenyl] [1,2,4] triazole [1,5a] pyridin-2 -yl} amide cyclopropanecarboxylic acid 389.46 390.0

TABLE II

These NMR compounds of the invention

- 17 020111

Comm. Number NMR data (δ) one PH, DMSO-CZ 11.01 (1H, br, ΝΗ), 8.08 (2H, d, AgN), 7.79 (2H, d, AgN), 7.73 (1H, d, AgN), 7 72 (1H, s, AGN), 7.35 (1H, dd, ArH), 4.04 (2H, br, CH 2), 3.77 (2H, br, CH2), 2.02 (1 H , br, CH), 1.27 (6H, s, 2xCH 3 ), 0.81 (4H, m, 2xCH 2 ).

Biological examples. Example 1. Analysis of ίη νίΐΓΟ. Example 1.1. 1LK1 inhibition assay.

Recombinant human 1LC1 (catalytic domain, amino acids 8bb-1154; catalog number RU4774) was obtained from ΙηνίίΓΟ ^ βη. Were incubated with 1 ng 1LK1 20 nM i11dk1-1LK1 protein (1ug1023) (catalog number Regkt E1teg TKE0121) in kinase reaction buffer (25 mM pH MOR8 b, 8, 0,01b Vgu35%, 8.33 mmol MdS1 2, 3, 33 mM ETT. 7 µM ATP) in the presence or in the absence of 4 µl containing the test compound or diluent (DMSO, 1% final concentration) in a total volume of 20 µl on a 384 littox white plate (Stegeg, catalog number 781075). After b0 min at room temperature, the reaction was stopped by adding 20 μl / well of the detector mixture (1x detector buffer (Regkt E1teg, catalog number CK97-100C), 0.5 nM europium-anti-phosphotyrosine (RTbb) (Regkt E1teg, catalog number LI00b8 ), 10 mM EDTA). The reading was carried out using Εηνίδίοη under excitation at 320 nm and determining the radiation at 1515 nm (Regc1n E1teg). Kinase activity was calculated by subtracting the relative fluorescence units (KEI) obtained in the presence of a positive control inhibitor (10 μM staurosporin) from the KEI obtained in the presence of a diluent. The ability of the test compound to inhibit this activity was defined as the percent inhibition = ((KЕυ determined for the sample in the presence of the test compound — KEI determined for the sample with a positive control inhibitor) divided by (KEI determined in the presence of the diluent KEI determined for sample positive control inhibitor)) -100.

Serial dilutions of the dose were obtained for the compounds, which makes it possible to test the effect of the dose response in the 1LK1 assay and calculate 1C 50 for this compound. Each compound was tested in a standard way at a concentration of 20 μM, followed by a serial dilution of 1/5, 8 points (20 μM-4 μM-800 nM-1b0 nM-32 nM-b, 4 nM-1.28 nM-0.2b nM) at a final concentration of 1% DMSO. With increasing efficiency of the compound, additional dilutions are prepared and / or the upper concentration is reduced (for example, 5, 1 μM). Data are presented as an average of 1C 50 from analyzes ± standard error of the mean value.

Table ΙΙΙ Values of 1C 50 compounds for ίΛΙ <1

In 'Connect. TsAK1 (nm) one 6.6 + 0.7

Example 1.2. Analysis for the determination of K1 1ЛК1.

To determine the K1 with the enzyme, different amounts of inhibitor were mixed and the enzyme reaction was monitored as a function of ATP concentration. K1 was determined using a double reciprocal graphical map of Kt relative to the concentration of the compound (graph Wte \ ueweg-Wigk). DAK1 (Ιηνίίτο ^ η, РУ4774) was used at a final concentration of 500 ng / ml. The substrate was the sodium salt of Polu (61i, Tug) (4: 1), Mm. 20000-50000 (B1dta, Р0275). The reaction was carried out in 25 mm Nerek pH 7.5; 0.01% T / yeene 20, 10 mM MdCl 2 at different concentrations of ATP and compound and stopped by the addition of 150 mM phosphoric acid. The determination of the incorporated phosphate in the substrate Po1u6T was carried out by placing the samples on a filter plate (using a harvester, Regkt E1teg), followed by washing. Included 33 P in PoluT is determined on a Thorson scintillation counter! after adding scintillation fluid to the filter plates (RegC1n E1Tag).

When tested in this assay, Compounds 1 received a K1 value of b, 9 nM.

Alternatively, various amounts of inhibitor were mixed with the enzyme to determine K1 and the enzyme reaction was monitored as a function of ATP concentration. K1 was determined using a double reciprocal graphical map of Kt relative to the concentration of the compound (ETteaueg-Wigk graph). In this analysis, 1 ng of DAK1 (Ιην РУ ^ η, RU4774) was used. The substrate consisted of 50 nM peptide lNDN-.TLK-1 (Tug1023) (Regk1n E1teg, TKE0121). The reaction was carried out in 25 mM MOR8 pH b, 8, 0.01%, 2 mM ITT, 5 mM MdCl 2 Vgu-35 at various concentrations of ATP and compound. Phosphorylated substrate was determined using Eu-labeled anti-phosphotyrosine antibody PTb (Regk1n E1teg, LI00b8). The reading was carried out with the aid of an EPUIOP (Regc1n E1Tag) under excitation at 320 nm and subsequent emission at b15 and bb5 nm.

- 18 020111

When tested in this assay, Compounds 1 received a K1 value of 5.6 nM.

Example 1.3. Analysis of inhibition of 1AK2.

Recombinant human 1AK2 (catalytic domain, amino acids 866-1154; catalog number RU4210) was obtained from 1 year. They were incubated with 0.012 μI 1AK2 with 25 nM peptide and 11 dB (-LAC1 ((ang1010)) (catalog number Regkt E1tag TKP0121) in reaction kinase buffer (41.66 mM HER8 pH 7.0, 0.016% Tyop X-100, 12, 5 mM MdS1 2 , 3.33 mM 7, 7.5 μM ATP) in the presence or in the absence of 4 μl containing the test compound or diluent (DMSO, 1% final concentration) in a total volume of 20 μl on a white plate 384 Fittoas (Stated , catalog number 781075). After 60 min at room temperature, the reaction was stopped by adding 20 μl / well of the detector mixture (1 detector buffer (Regkt E1teg, catalog number CK97-100 C), 0.5 nM europium antiphosphotyrosine (PT66) (Regi1 E1teg, catalog number AE0068) .10 mM EDTA. Readout was performed using Ep18yp under excitation at 320 nm and determining the emission at 615 nm (Regi1E1teg). Kinase activity calculated by subtracting the relative fluorescence units (CREEs) obtained in the presence of a positive control inhibitor (10 μM staurosporin) from the CRE, obtained in the presence of a diluent. The ability of the test compound to inhibit this activity was determined as the percentage of inhibition = ((CRC determined for the sample in the presence of the test compound — CWI defined for the sample with a positive control inhibitor) divided by (CWI determined in the presence of a diluent CWI defined for the sample with positive control inhibitor)) -100.

Received serial dose dilutions for compounds, which allows you to test the effect of dose response in the analysis of 1AK2 and calculate 1C 50 for this compound. Each compound was tested in a standard way at a concentration of 20 μM, followed by a serial dilution of 1/5, 8 points (20 μM-4 μM-800 nM-160 nM-32 nM-6.4 nM-1.28 nM-0.26 nM) at a final concentration of 1% DMSO. With increasing efficiency of the compound, additional dilutions are prepared and / or the upper concentration is reduced (for example, 5, 1 μM). Data are presented as an average of 1C 50 from analyzes ± standard error of the mean value.

Table IV Values 1C 50 compounds for 1AK2

Comm. Number TsAK2 (nm) one 67 ± 5

Example 1.4. Analysis for the determination of K1 1AK2.

To determine the K1 with the enzyme, different amounts of inhibitor were mixed and the enzyme reaction was monitored as a function of ATP concentration. K1 was determined using a double reciprocal graphical map of Kt relative to the concentration of the compound (graph of teteuyeg-Wigk). In this analysis, 0.025 mTi of 1Ac2 (Cipodolip, РV4210) was used. The substrate was sodium salt Po1y (Cl, Tug) (4: 1), M. m. 20000-50000 (81 dta, Р0275). The reaction was carried out in 10 mM MOR8 pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 0.01% Vgu-35, 1 mM, 15 mM MdAc at various concentrations of ATP and the compound and stopped by the addition of 150 mM phosphoric acid. Determination of the incorporated phosphate in the substrate Po1UST was carried out by placing the samples on a filter plate (using a harvester, Regkt E1teg), followed by washing. Included 33 P in PoluT is determined on a Torsoip scintillation counter! after adding scintillation fluid to the filter plates (Regkt E1teg).

When tested in this assay, Compounds 1 received a K1 value of 126 nM.

Alternatively, various amounts of inhibitor were mixed with the enzyme to determine K1 and the enzyme reaction was monitored as a function of ATP concentration. K1 was determined using a double reciprocal graphical map of Kt relative to the concentration of the compound (graph of Hyperf-Vcgc). In this analysis, 0.0125 tI 1AK2 (1puytodep, РV4210) was used. The substrate was 50 nM peptide υ1ίβ1ιΙ-ΙΛΙ <-1 (Tug1023) (Regkt Eteg, TKP0121). The reaction was carried out in 25 mM HEEP8 pH 7.0, 0.01% Tyop X-100, 2 mM OTT, 7.5 mM MdCl 2 at various concentrations of ATP and the compound. Phosphorylated substrate was determined using Eu-labeled anti-phosphotyrosine antibody PT66 (Regkt E1teg, A00068). The reading was carried out using Epizyup (Regkt E1teg) with excitation at 320 nm and subsequent emission at 615 and 665 nm.

When tested in this assay, Compounds 1 obtained a K1 value of 35 nM.

Example 1.5. Analysis of inhibition of 1AK3.

The catalytic domain of recombinant human 1AK3 (amino acids 781-1124; catalog number РV3855) was obtained from 1 year. 0.025 MI of 1AK3 was incubated with 2.5 μg of substrate POTT (catalog number 81dt P0275) in a kinase reaction buffer (25 mM Tt pH 7.5, 0.5 mM ESTA, 0.5 mM NazVO 4 , 5 mM L-glycerol phosphate, 0.01% Tyop X-100, 1 μM non-radioactive ATP, 0.25 μCi 33 Rgamma-ATP (CE Nealisate, catalog number AN9968 final concentrations)) in the presence or in the absence of 5 μL containing the test compound or diluent (DMSO , 1% final concentration

- 19 020111 traction) in a total volume of 25 μl in a polypropylene 9-well plate (Chain, Y-shaped bottom). After 105 minutes at 30 ° C., the reactions were stopped by the addition of 25 μl / well of 150 mM phosphoric acid. All stopped kinase reaction mixtures were transferred to pre-washed (75 mM phosphoric acid) 9b-well filter plates (Regix E1te, catalog number 6005177) using a cell harvester (Regix E1teg). The plates were washed once with a solution of 75 mM phosphoric acid in an amount of 300 μl per well and the bottom of the plates was tightly closed. 40 μl / well of М1сго8С1иЗ-20 were added, the top of the plates was tightly closed and the data was read using Torsoi3 (Regix E1Tr). The kinase activity was calculated by subtracting the number of counts per minute (cp), obtained in the presence of a positive control inhibitor (10 μM staurosporin), from cp, obtained in the presence of a diluent. The ability of the test compound to inhibit this activity was defined as the percent inhibition = ((cpt defined for the sample in the presence of the test compound — cpt determined for the sample with a positive control inhibitor) divided by (cpt determined in the presence of a diluent cpt defined for sample c positive control inhibitor)) -100.

Serial dilutions of the dose were obtained for the compound, which makes it possible to test the effect of the dose response in the analysis .ΤΑΚ3 and calculate 1C 50 for this compound. Each compound was tested in a standard manner at a concentration of 20 μM, followed by 1/3 serial dilution, 8 points (20 μM-b, B7 μM-2.22 μM-740 nM-247 nM-82 nM-27 nM-9 nM) at the final concentration of 1% DMSO. With increasing efficiency of the compound, additional dilutions are prepared and / or the upper concentration is reduced (for example, 5, 1 μM). Data are presented as an average of 1C 50 from analyzes ± standard error of the mean value.

Table V Values 1C 50 compounds for ΙΑΚ3

Comm. Number DAKZ (nM) one 408 ± 62

Example 1.b. Analysis on the definition of ΙΑΚι ΙΑΚ3.

To determine, various amounts of inhibitor were mixed with the enzyme and the enzyme reaction was monitored as a function of ATP concentration. Κί was determined using a double reciprocal graphical display relative to the concentration of the compound (graph of teteauegeg – vigk). ίΑΚ3 (Sagpa B1O8C1eisse8, 09CB8-0b25B) was used at a final concentration of 10 mg / ml. The substrate was sodium salt Po1y (Cl, Tug) (4: 1), M. m. 20000-50000 (81dsha, Р0275). The reaction was carried out in 25 mM Tp8 pH 7.5, 0.01% Trgop X-100, 0.5 mM ETA, 2.5 mM 0,5, 0.5 mM Na 3 UO 4 , 5 mM фglycerol phosphate, 10 mM mdCl 2 at various concentrations of ATP and compounds and stopped by the addition of 150 mM phosphoric acid. Determination of the incorporated phosphate in the substrate Po1UST was carried out by placing the samples on a filtering plate (using a harvester, Regksh E1teg), followed by washing. Included 33 P in Po1uST is determined on a TorsoshI scintillation counter after adding a scintillation fluid to the filter plates (Regix E1teg).

When tested in this assay, Compounds 1 received a value of рав equal to 188 nM.

Example 1.7. Analysis of inhibition of TUK.2.

The catalytic domain of recombinant TU1 <2 people (amino acids 871-1187; catalog number 08-147) was obtained from Sagpa Vyuvshepsev. Incubated 5 ng of TUK.2 with 12.5 µg of substrate POTT (catalog number 81dt P0275) in reaction kinase buffer (25 mM HEPE8 pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.2 mM Na 3 PO 4 , 0.1% No-40, 0.1 μM non-radioactive ATP, 0.125 μCi 33 P-gamma-ATP (CE NeaIsage, catalog number AN99b8) final concentrations)) in the presence or in the absence of 5 μL containing the test compound or diluent (DMSO, 1% final concentration) in a total volume of 25 μl in a polypropylene 9b-well plate (Chain, U-shaped bottom). After 90 minutes at 30 ° C., the reactions were stopped by the addition of 25 μl / well of 150 mM phosphoric acid. All stopped kinase reaction mixtures were transferred to pre-washed (75 mM phosphoric acid) 9b-well filter plates (Regix E1 tag, catalog number B005177) using a cell harvester (Regix E1 tag). The plates were washed once with a solution of 75 mM phosphoric acid in an amount of 300 μl per well and the bottom of the plates was tightly closed. 40 μl / well of Mugot8SSh1-20 was added, the top of the plates was tightly closed and the data was read using TorsoshI (RegSch E1Tag). The kinase activity was calculated by subtracting the number of counts per minute (cp), obtained in the presence of a positive control inhibitor (10 μM staurosporin), from cp, obtained in the presence of a diluent. The ability of the test compound to inhibit this activity was defined as the percent inhibition = ((cpt defined for the sample in the presence of the test compound — cpt determined for the sample with a positive control inhibitor) divided by (cpt determined in the presence of a diluent cpt defined for sample c positive control inhibitor)) - 100.

Received serial dilution dose for the connection, which allows you to test the effect of dose

- 20 020111 response in the analysis of ΤΥΚ2 and calculate 1C 50 for this compound. Each compound was tested in a standard manner at a concentration of 20 μM, followed by 1/3 serial dilution, 8 points (20 μM-b, B7 μM-2.22 μM-740 nM-247 nM-82 nM-27 nM-9 nM) at the final concentration of 1% DMSO. With increasing efficiency of the compound, additional dilutions are prepared and / or the upper concentration is reduced (for example, 5, 1 μM). Data are presented as an average of 1C 50 from analyzes ± standard error of the mean value.

Table VI Values ΤΥΚ2 1C 50 for connection

Comm. Number ΤΥΚ2 (nM) one 219 ± 37

Example 2. Cellular assays.

Example 2.1. Analysis of signal transmission 1AK-8TAT.

Heba cells were kept in the Eagle's minimal nutrient medium modified by Dalbecco (ΌΜΕΜ) containing 10% heat-inactivated fetal calf serum, 100 and / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin. Heba cells were used at 70% confluency for transfection. 20,000 cells in 87 μl of cell culture medium were quickly transfected with 40 ng of the p8TAT1 (2) luciferase reporter, 8 ng of the Ba2 reporter as the internal control reporter, and 52 ng of the pB8K using 0.32 μl of 1e1-PE1 (Po1ur1i§) as the transfection reagent for well in the format of 9 bluno tablet. After incubation overnight at 37 ° C in the presence of 10% CO 2, the transfection medium was removed. 75 μl ΌΜΕΜ and 1.5% heat-inactivated fetal calf serum were added. 15 μl of compound at a concentration of 7.0 ml of HB, 7, and then 10 μl of human O8M (Roperolesia) at a final concentration of 33 ng / ml were added over a period of 40 minutes.

All compounds were tested twice, starting at 20 μM followed by 1/3 serial dilution, for a total of 8 doses (20 μM-b, b μM-2.2 μM-740 nM-250 nM-82 nM-27 nM-9 nM) at a final concentration of 0.2% DMSO.

After overnight incubation at 37 ° C in the presence of 10% CO 2, cells were lysed in 100 μl of lysis buffer / well (PB8, 0.9 mM CaCl 2 , 0.5 mM MgCl 2 , 5% trehalose, 0.025% tergitol ΝΓ9. 0.15% B8A).

μl of cell lysate was used to read β-galactosidase activity by adding 180 μl of solution (Ja1 (30 μl O№6 4 mg / ml and 150 μl of β-galactosidase buffer (0.0b M № 2 HPO 4 , 0.04 M NaH 2 PO 4 , 1 mM MdCl 2 )) for 20 minutes, the reaction was stopped by the addition of 50 μl of 1 M No. C.'O 3. The absorption was read at 405 nm.

The luciferase activity was determined using 40 μl of cell lysate and 40 μl of 81e4у1ее®, as described by the manufacturer (Regix E1teg), using ίπνίβίοη (Regkt E1teg).

µM paradise-1AK inhibitor was used as a positive control (100% inhibition). 0.5% DMSO (0% inhibition) was used as a negative control. Positive and negative controls were used to calculate ζ ’and процента percent inhibition values (ΗΝ).

The percentage of inhibition = ((fluorescence determined in the presence of a diluent — fluorescence determined for the sample in the presence of the test compound) divided by (fluorescence determined in the presence of the diluent fluorescence determined for the sample in the absence of a trigger)) - 100.

The ΓΙΝ values were plotted for the tested compounds as dose-response dependencies and EC 50 values were obtained.

Table VII

The values of the EU 50 connection when transmitting a signal 8TAT

Comm. Number Ezzo (nM) one 539 ± 130

Example 2.2. Analysis of the transmission signal O8ML-1V.

It was shown that O8M and HB-1 β exhibit synergistic upregulation of the MMP13 level in the human chondrosarcoma cell line 8A11353. Cells were sown in 9b-well plates in an amount of 15,000 cells / well in a volume of 120 μl of EMEM (ShuIgoda) containing 10% (v / v) BV8 and 1% of a mixture of penicillin / streptomycin (Shugoda) incubated at 37 ° C and 5% CO 2 . Cells were preincubated in the presence of 15 μl of the compound in M199 medium containing 2% DMSO for 1 h before starting using 15 μl of O8M and EB-1b, reaching 25 ng / ml O8M and 1 ng / ml GB-1 β, and determined the concentration of MMP13 in the conditioned medium within 48 h after launch. The activity of MMP13 was determined using analysis of the activity of the capture of antibodies. To this end, 35 μl of 1.5 μg / ml solution of anti-human MMMP13 anti-human antibody (Β & Ό 85551et5, MAB511) was coated on 384-well plates (ΝϋΝ ^ 4b0518 Max18og black) for 24 hours at 4 ° C. After washing the wells 2 times with a mixture of PB8 and 0.05% Tney and the remaining binding sites were blocked with 100 μl of 5% non-fat dry milk

- 21 020111 ka (8aia Sgikh. 50-2325. Βίοΐΐο) in PB8 for 24 hours at 4 ° C. Then the wells were washed 2 times with a mixture of PB8 and 0.05% Tteyeep and 35 μl of culture supernatant was added in a 1/10 dilution containing MMP13 in blocking buffer with 100-fold dilution and incubated for 4 hours at room temperature. The wells were then washed twice with a mixture of PB8 and 0.05% Tteyeep, followed by activation of MMP13 with the addition of 35 μl of 1.5 mM 4-aminophenylmercury acetate (APMA) (81dta, A9563) and incubation at 37 ° C for 1 hour. The wells were washed again with a mixture of PB8 and 0.05% Tteyeep and 35 μl of the substrate MMP13 (B1oto1, P-126, fluorogenic substrate OtshMMP) was added. After incubation for 24 hours at 37 ° C, the fluorescence of the transformed substrate was determined using a RegC1p E1TeGaU11as Εηνίδίοη 2102 Mi1111eBe1 Beabeg instrument (excitation light wavelength: 320 nm, emitted light wavelength: 405 nm).

The percentage of inhibition = ((fluorescence determined in the presence of a diluent — fluorescence determined for the sample in the presence of the test compound) divided by (fluorescence determined in the presence of the diluent fluorescence determined for the sample in the absence of a trigger)) - 100.

Data are expressed as mean EC 50 from analyzes ± standard error of the mean.

Table VIII Values EU 50 MMP13 compounds

Comm. Number ec 50 (nM) one 4196 ± 2370

Example 2.3. Analysis of the proliferation of Pb.

Human peripheral blood lymphocytes (PBB) were stimulated by IL-2 and proliferation was determined using the BGI embedding assay. Initially, PBB was stimulated for 72 hours with PHA to induce the IB-2 receptor, maintained without food for 24 hours to stop cell proliferation, then stimulated with IB for another 72 hours (including 24-hour labeling in HBI). The cells were preincubated with the test compounds for 1 h prior to the addition of IB-2. Cells were grown in PPM1 1640 containing 10% (v / v) EB8.

Example 2.4. Analysis of whole blood (\ vba).

2.4.1. Стимуα stimulation protocol.

In order to predict the selectivity of the tested compounds in relation to inhibition of 1AK1-compared to 1AK2-dependent signal transduction pathways ίη νίνο, a physiologically relevant model ίη νίίτο was created using human whole blood. In the analysis of \ UVA, blood taken from volunteer people who gave informed consent was treated ex νίνο with compound (11), and then stimulated with interferon for 30 min (ΙΕΝα, 1АК1-dependent signal transmission path) or for 2 h with granulocyte-macrophage colony stimulating factor (6M-C8P, 1AK2dependent signal transmission path).

2.4.1.1. Analysis of phospho-8TAT1.

During ΙΕΝα stimulation, an increase in phosphorylation of signal transmitters and transcription activators 1 (p8TAT1) under the action of ΙΕΝα in extracts of white blood cells was determined using the p8TAT1 ЕЫ8А analysis. Phosphorylation of the signal transmitter and transcription activators 1 (8TAT1) after initiation by interferon alpha (ΙΕΝα) is a 1AK1-mediated event. Analysis of phospho-8TAT1, which was used to determine the level of phospho-8TAT1 in cell extracts, was developed in order to assess the ability of a compound to inhibit 1AK1-dependent signal transduction pathways.

Whole human blood taken from human volunteers who gave informed consent was treated ex ν νο with compound (11) and then stimulated for 30 minutes α. The increase in phosphorylation of 8TAT1 under the action of ΙΕΝα in extracts of white blood cells was determined using an analysis of phospho-8TAT1 EX8A.

The ASC-lysis buffer included 0.15 M IN 4 Cl, 10 mM KNSO 3 , 0.1 mM EDTA. The pH of the buffer was 7.3.

A 10-fold concentrate of cell lysis buffer (part of the kit for the ELISA analysis of the E8A sandwich type Pa1118san P1yu5r1yu-8TAT1 (Tug701) from Ce11 δί ^ ηπΕη ^) was diluted 10 times with H 2 O. Proteinase inhibitors were added to the buffer before use.

μg ΙΕΝα was dissolved in 40 μl of N 2 O, receiving 500 μg / ml of the original solution. This stock solution was stored at -20 ° C.

Prepared 3-fold serial dilutions of the compound in DMSO (maximum concentration: 10 mM). Then this compound was further diluted with medium (the dilution factor depends on the desired final concentration of the compound).

2.4.1.1.1. Incubation of blood with compound and ляцияα stimulation.

Human blood was collected in heparinized tubes. This blood was divided into aliquots.

- 22 020111 by 392 μl. Then 4 μl of compound dilution was added to each aliquot, and blood samples were incubated for 1 h at 37 ° C. The original solution ΙΡΝα was diluted 1000 times with medium KRM1, receiving 500 ng / ml of working solution. 4 μl of 500 ng / ml working solution was added to the blood samples (final concentration ΙΡΝη: 5 ng / ml). Samples were incubated at 37 ° C for 30 minutes.

2.4.1.1.2. Obtaining cell extracts.

At the end of the stimulation period, 7.6 ml of ASA buffer was added to the blood samples to lyse the red blood cells. Samples were mixed by inverting the tubes five times and the reaction mixture was incubated on ice for 5 minutes. During this incubation, lysis of the air force should have been obvious. Cells were pelleted by centrifugation at 300 d, 4 ° C for 7 min and the supernatant was removed. 10 ml of 1xPB8 was added to each tube and the pellet was resuspended after centrifugation. Samples were again centrifuged at 300 d, 4 ° C. The supernatant was removed and the pellet was resuspended after centrifugation in 500 μl 1xPB8. The cell suspension was then transferred to a clean 1.5 ml microcentrifuge tube. Cells were precipitated by centrifugation at 700 d for 5 min at 4 ° C. The supernatant was removed and the pellet was dissolved in 150 μl of cell lysis buffer. Samples were incubated on ice for 15 minutes. After that, the samples were stored at -80 ° C until further processing.

2.4.1.1.3. Determination of 8TAT1 phosphorylation by ЕЫ8А.

To determine the level of phospho-8TAT1, an Enzyme Immunoassay kit for the EI8L sandwich type RaI8sai P1u5r1yu-8TLT1 (Tug701) from Ce11 81dia11id (catalog No. 7234) was used.

Cell extracts were thawed on ice. The tubes were centrifuged for 5 min at 16000 d, 4 ° C and lightened lysates were obtained. At the same time, the microwell strips from the kit were equilibrated at room temperature and the wash buffer was prepared by diluting the wash buffer with 20 × H 2 O. Samples were diluted 2-fold with sample diluent and 100 μl were added to the microwell strips. The strips were incubated overnight at 4 ° C.

The next day, the wells were washed 3 times with wash buffer. 100 μl of the detector antibody was added to the wells. The strips were incubated at 37 ° C for 1 hour. Then the wells were again washed 3 times with washing buffer. 100 μl of HBP-bound secondary antibody was added to each well and the samples were incubated at 37 ° C. After 30 min, the wells were washed 3 times again and 100 μl of TMB substrate was added to all wells. When the color of the samples changed to blue, 100 μl of 8TOR solution was added to stop the reaction. Absorbance was measured at 450 nm.

2.4.1.2. SINA 1B-8.

During the stimulation of OM-C8P, the increase in the concentration of interleukin-8 (1b-8) in the blood plasma was determined using the analysis of 1b-8 using the ЕH18A method. The induced expression of 1b-8 granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (OM-C8P) is a 1AK2-mediated event. EB18A 1b-8, which can be used to determine the concentration of 1b-8 in plasma samples, was developed in order to evaluate the ability of a compound to inhibit 1AK2-dependent signal transduction pathways.

Whole human blood taken from human volunteers who gave informed consent was treated ex ν νο with compound (1i), and then stimulated with OM-C8P for 2 hours. An increase in plasma concentration of lb-8 was determined by the method ЕH18А 1b-8.

μg of OM-C8P was dissolved in 100 μl of H 2 O, obtaining 100 μg / ml of the initial solution. This stock solution was stored at -20 ° C.

Prepared 3-fold serial dilutions of the test compound in DMSO (maximum concentration: 10 mM). Then this compound was further diluted with medium (the dilution factor depends on the desired final concentration of the compound).

2.4.1.2.1. Incubation of blood with the compound and stimulation of OM-C8P.

Human blood was collected in heparinized tubes. This blood was divided into aliquots of 245 μl. Then 2.5 μl of the compound dilution was added to each aliquot and the blood samples were incubated for 1 h at 37 ° C. The original solution OM-C8P was diluted 100 times with medium BPM1, receiving 1 μg / ml working solution. 2.5 μl of 1 μg / ml working solution was added to the blood samples (final concentration of OM-C8P: 10 ng / ml). Samples were incubated at 37 ° C for 2 h.

2.4.1.2.2. Obtaining plasma samples.

Samples were centrifuged for 15 min at 1000 d, 4 ° C.

Received 100 μl of plasma and stored at -80 ° C until further use.

2.4.1.2.3. Determination of the concentration of lb-8 by the method Е8a.

To determine the concentration of lb-8, a 1b-8 human immunoenzyme immunoassay kit from Β & Ό 8y51et5 (catalog No. 08000V) was used.

Wash buffer was prepared by diluting the wash buffer with 10xH 2 O. A working O1o reagent was prepared by adding 1 part O1o reagent 1 to 2 parts O1o reagent B for 15 minutes to 4 hours before use.

To each well was added 100 μl of a ΚΟΙ-86 assay diluent. After this was added 50 μl of

- 23 020111 raztsa (plasma). The EB18A plate was incubated for 2 hours at room temperature, 500 rpm. All wells were washed 4 times with wash buffer and 200 μl of IB-8 conjugate was added to each well. After incubation for 3 hours at room temperature, the wells were washed 4 times with wash buffer and 100 μl of working C 1o reagent was added to each well. The EB18A plate was incubated for 5 min at room temperature (protected from light). Measured luminescence (reading time 0.5 s / well).

2.4.1.4. Results.

p1C 50 of compound 1 with inhibition of the ΙΝΡα-induced increase in the concentration of p8TAT1 was 6.32 ± 0.07 (8EM), while p1C 50 with inhibition of the CM-C8G-induced increase in 1b-8 was 4.87 ± 0.13 (8EM) (results obtained using 6 blood donors). This shows that compound 1 is 28 times more selective in relation to the 1AK1 pathway. than with respect to the 1AK2 path. Therefore, in the cellular environment, it is clear that compound 1 shows selectivity in relation to 1AK1 compared to 1AK2. Compound 1 appears to be more selective in relation to 1AK1 than in relation to 1AK2, compared with known structurally related compounds or other known inhibitors of 1AK.

2.4.1.3. Treatment data processing and results.

In order to further refine the results, the data of inhibition of phospho-8TAT1 induction under the action of α in cell extracts or inhibition of 1B-8 induction under the action of CM-C8P in plasma were plotted relative to the concentration of the compound and the values obtained were 1C 50 using CgarNrab software. The data was saved if I 2 exceeded 0.8 and the slope of the hump was less than 3, and retained only those donors for whom reliable data were obtained in both analyzes.

For example, when presenting this additional data analysis protocol, the determined p1C 50 of compound 1 in the case of inhibition of an ΙΝΡα-induced increase in the concentration of p8TAT1 was 6.21 ± 0.09 (8EM), while p1C 50 in the case of inhibition of the 6M-C8P-induced increase in 1b- 8 was 4.97 ± 0.14 (8EM) (results obtained using 6 blood donors). This confirms that compound 1 is 17.6 times more selective with respect to the 1AK1 path than with respect to the 1AK2 path. Therefore, in the cellular environment, it is clear that compound 1 shows selectivity in relation to 1AK1 compared to 1AK2. Compound 1 appears to be more selective in relation to 1AK1 than in relation to 1AK2, compared with known structurally related compounds or other known inhibitors of 1AK.

2.4.2. Stimulation protocol 1b-6.

To establish the selectivity of the compound in relation to 1AK1 compared to 1AK2, flow cytometric analysis of ex νίνο was also performed using human whole blood. Thus, blood was taken from volunteer people who gave informed consent. After that, the blood was equilibrated for 30 min at 37 ° C with gentle rocking, then aliquots were taken into Eppendorf tubes. The compound was added in various concentrations and incubated at 37 ° C for 30 min, and then stimulated for 20 min at 37 ° C while gently pumped with interleukin 6 (1H-6) to stimulate the 1AK1-dependent pathway or CM-C8P to stimulate 1AK2-dependent of the way. After that, phospho-8TAT1 and phospho-8TAT5 were evaluated using the RAS8 assay.

2.4.2.1. Phospho-8TAT1 assays.

In the case of a lb-6-stimulated increase in phosphorylation of signal carriers and transcription activators 1 (p8TAT1) in white blood cells, human whole blood obtained from human volunteers who gave informed consent was treated with ex νίνο compound for 30 minutes and then stimulated for 20 min 1b-6. The increase in phosphorylation of 8TAT1 under the action of lb-6 in lymphocytes was determined using anti-phospho-8TAT1 antibody using PAC8.

The 5x Bu8e / G1x buffer (ΒΌ ΡΙιοΜΙολν, catalog No. 558049) was diluted 5 times with distilled water and preheated at 37 ° C. The remaining diluted Luke / Hx buffer was discarded.

µg Gyb-6 (I & E 8y51et5, catalog No. 206-1I) was dissolved in 1 ml of PB8 0.1% B8A, yielding 10 µg / ml of the initial solution. This stock solution was stored as aliquots at -80 ° C.

A 3-fold serial dilution of the compound in DMSO (10 mM stock solution) was prepared. DMSO was added to the samples treated with the control substance instead of the compound. All samples were incubated at 1% final concentration of DMSO.

2.4.2.1.1. Incubation of the blood with the compound and stimulation by the action of IL-6

Human blood was collected in heparinized tubes. This blood was divided into aliquots of 148.5 μl. Then, 1.5 μl of the compound dilution was added to each aliquot and the blood samples were incubated for 30 min at 37 ° C with gentle rocking. An initial solution of 1b-6 (1.5 μl) (final concentration 10 ng / ml) was added to the blood samples and the samples were incubated at 37 ° C for 20 min.

- 24 020111 with a gentle swing.

2.4.2.1.2. The preparation of white blood cells and the introduction of the label SE4.

At the end of the stimulation period, 3 ml of 1-fold preheated Luke-Their buffer was instantly added to blood samples, stirred for a short time by rotation and incubated for 15 minutes at 37 ° C in a water bath to lyse red blood cells and fix white blood cells, then frozen. at -80 ° C until further use.

For the following stages, the tubes were thawed at 37 ° C for about 20 minutes and centrifuged for 5 minutes at 400 ° C at 4 ° C. The pellet was washed with 3 ml of cold 1xBB8 and, after centrifugation, the cell pellet was resuspended in 100 μl of PB8 containing 3% B8A. An NTS-conjugated anti-CO4 antibody or a control NTS-conjugated isotopic antibody was added and incubated for 20 minutes at room temperature, in the dark.

2.4.2.1.3. Permeabilization of cells and labeling with an anti-phospho-8TAT1 antibody.

After washing the 1xPB8 cells, the cell pellet was resuspended in 100 μl of ice-cold 1xPB8 and 900 μl of ice-cold 100% methanol was added. The cells were then incubated at 4 ° C for 30 minutes to permeabilize.

After that, the permeabilized cells were washed with 1xPB8 containing 3% V8A and finally resuspended in 80 μl of 1xPB8 containing 3% B8A.

20 μl of PE mouse anti-8TAT1 (ρΥ701) or PE mouse 1dO2aK isotopic control antibody (HE Vyukshepsek, catalog No. 612564 and 559319, respectively) was added and mixed, then incubated for 30 min at 4 ° C in the dark.

After that, the cells were washed once with 1xPB8 and analyzed on an EAC8C'ap1o II flow cytometer (VO Vyukshepsek).

2.4.2.1.4. Fluorescence analysis for EAC8Cap1O II.

A total of 50,000 events were counted and phospho-8TAT1 positive cells were determined after gating on ΟΩ4 + cells in the lymphocyte gate. The data were analyzed using the EAC8O | ya software, and they corresponded to the percent inhibition of Gb-b stimulation calculated for the percentage of positive cells for phospho-8TAT1 on SE4 + cells.

2.4.2.2. Analysis of phospho-8TAT5.

In the case of 6M-C8E-stimulated increase in phosphorylation of signal carriers and transcription activators 5 (p8TAT5) in white blood cells, human whole blood obtained from human volunteers, who gave informed consent, was treated with ex u1oo for 30 minutes and then stimulated for 20 min CM-C8E. The increase in phosphorylation of 8TAT5 under the action of OM-C8E in monocytes was determined using an anti-phospho-8TAT5 antibody using EAC8.

The 5-fold Buke / Hx buffer (BO RiokNot, catalog No. 558049) was diluted 5 times with distilled water and preheated at 37 ° C. The remaining diluted Luke / Hx buffer was discarded.

µg r11CM-C'8E (ABCook 8 A., catalog No. P300-03) was dissolved in 100 µl of PB8 0.1% B8A, yielding 100 µg / ml of the initial solution. This stock solution was stored as aliquots at -80 ° C.

A 3-fold serial dilution of the compound in DMSO (10 mM stock solution) was prepared. DMSO was added to the samples treated with the control substance instead of any test compound. All samples were incubated at 1% final concentration of DMSO.

2.4.2.2.1. Incubation of blood with the compound and stimulation by the action of CM-C8E.

Human blood was collected in heparinized tubes. This blood was divided into aliquots of 148.5 μl. Then, 1.5 μl of the compound dilution was added to each aliquot and the blood samples were incubated for 30 min at 37 ° C with gentle rocking. A stock solution of CM-C8E (1.5 μl) (final concentration 20 pg / ml) was added to the blood samples and the samples were incubated at 37 ° C for 20 min with gentle rocking.

2.4.2.2.2. The preparation of white blood cells and the introduction of the label SE14.

At the end of the stimulation period, 3 ml of 1-fold preheated Luke-Hx buffer was instantly added to blood samples, stirred for a short time by rotation and incubated for 15 minutes at 37 ° C in a water bath to lyse red blood cells and fix white blood cells, then freeze at -80 ° C until further use.

For the following stages, the tubes were thawed at 37 ° C for approximately 20 minutes and centrifuged for 5 minutes at 400 ° C at 4 ° C. The cell pellet was washed with 3 ml of cold 1xPB8 and, after centrifugation, the cell pellet was resuspended in 100 μl of PB8 containing 3% B8A. A murine anti-CO14 antibody (VO Vukshepsek, catalog No. 345784) or a control NTS mouse was added! Murine <isotopic antibody (Vyukshepsek, catalog No. 555057) and incubated for 20 min at room temperature, in the dark.

2.4.2.2.3. Permeabilization of cells and labeling with an anti-phospho-8TAT5 antibody.

- 25 020111

After washing the 1xPB8 cells, the cell pellet was resuspended in 100 μl of ice-cold 1xPB8 and 900 μl of ice-cold 100% methanol was added. The cells were then incubated at 4 ° C for 30 minutes to permeabilize.

After that, the permeabilized cells were washed with 1xPB8 containing 3% B8A, and finally resuspended in 80 μl of 1 xPB8 containing 3% B8A.

20 μl of PE mouse anti-8TAT5 (ρΥ694) or PE mouse 1dC1K isotopic control antibody (VO VChOxChepsek, catalog No. 612567 and 554680, respectively) were added and mixed, then incubated for 30 min at 4 ° C in the dark.

After that, the cells were washed once with 1xPB8 and analyzed on an EAC8SapCho II flow cytometer (VO VChOXChepssek).

2.4.2.2.4. Fluorescence analysis for EAC8Sap! II.

A total of 50,000 events were counted and phospho-8TAT5 positive cells were determined after gating on SE14 + cells. The data were analyzed using the EAS8O1ua software, and they corresponded to the percent inhibition of CM-C8E stimulation calculated for the percentage of positive cells for phospho-8TAT5 on SE14 + cells.

2.4.2.3. Results.

When presented to this protocol, the percent inhibition (RU) obtained from the average of 3 healthy volunteers was determined for the compound of this invention. For example, compound 1 was tested and returned to ρ ^ 5 ο = 6.61 with inhibition of 8TAT1 phosphorylation and ρ ^ 5 ο = 5.37 with inhibition of 8TAT5 phosphorylation.

When comparing the effects of compound 1 on 8TAT1 (CHAK1-dependent pathway) and 8TAT5 (1AK2-dependent pathway), 17.6-fold selectivity was determined for ChAK1 relative to CHAK2.

Example 3. Models ίη νίνο.

Example 3.1. NAV model.

3.1.1. Materials

Freund's complete adjuvant (CEA) and Freund's incomplete adjuvant (CEA) were purchased from Aiso. Collagen type II cows (SPs), lipopolysaccharide (LR8) and enbrel were purchased from SEigegeh (Cheyay'Eyane, France); 8щщЫша (й й й А е, France), \ W11ue !! (25 mg syringe for injection, France) Asgok OgapChsk (Pa1o A1! O, SA), respectively. All other reagents used were chemically pure, and all solvents were analytically pure.

3.1.2. Animals

Dark-colored agouti rats (males, 7–8 weeks old) were obtained from Nagyla Boge Chopeck (Muscovy, France). Mice EVA / 1H (males, 7 weeks old) were obtained from Sepchetre'eead! Be KergoinsEop CHAKUCHECK (SEU) (Laval, France). Rats and mice were kept in a 12-hour light / dark shift cycle (0700-1900). The temperature was maintained at 22 ° C, food and water were provided freely.

3.1.3. Collagen-induced arthritis (SCHA).

One day before the experiment, a solution of SP (2 mg / ml) with a content of 0.05 M acetic acid was prepared and stored at 4 ° C. Immediately before immunization, equal volumes of the PEA) and SP adjuvant were mixed using a homogenizer in a pre-cooled glass bottle in a water bath with ice. Excess adjuvant and prolonged homogenization may be required if an emulsion does not form.

Mice: injected 0.1 ml of the emulsion percutaneously into the base of the tail of each mouse for 1 day, the second booster dose of percutaneous injection (SP solution at 1 mg / ml in CEA 0.1 ml of saline) was performed on day 21. The method of immunization was modified on the basis of published methods (Οηνίά Ό. Vgapy, Kagu A. LaShat & Efgay E. KoNoshes. Co11adep-tyissei aypPk. No. 1!

Rats: Injection of 0.2 ml of the emulsion percutaneously into the base of the tail of each rat was performed on day 1, the second booster dose of percutaneous injection (SP solution at 2 mg / ml in CEA 0.1 ml of saline) was performed on day 9. The method of immunization was modified on the basis of published methods (8ίηΐ5 NА е! А1, (2004) TAGDePdp o51eos1a515 \ νί! 1ι hоyygosssL rgeuep (5 lоpe ekChgisPop co11depschisyysyyyyyyy AG! 11p chaste, AH 11p chaste, AH 11p! ChastepArnArArAnArAnA, a1, 2004) ., 2005).

3.1.4. Organization of the study.

The therapeutic effects of the test compounds were investigated in rat or mouse NAC models. Animals were randomly divided into equal groups, and each group contained 10 animals. All rats were vaccinated on day 1 and re-vaccinated on day 9. All mice were vaccinated on day 1 and re-vaccinated on day 21. Therapeutic dosing lasted from 16 to 30 days. A negative control group received a diluent (MS 0.5%) and a positive control group enbrel (10 mg / kg, 3 weeks, cs). The considered compound was usually tested in the form of 3 doses, for example 3, 10, 30 mg / kg, p.o.

3.1.5. Clinical evaluation of arthritis.

Evaluation of arthritis was performed according to the KYASYDCHAP 2006, Bp e! a1. 2007 and ΝίκΗίάη e! a1. 2004.

- 26 020111

Arthritic evaluation of swelling of each of the four paws was as follows: 0 - no symptoms, 1 - weak but distinct redness of one type of joints, such as the ankle or wrist, or obvious redness and swelling, limited to individual fingers, regardless of the number affected fingers, 2 - moderate redness and swelling of two or more types of joints, 3 - severe redness and swelling of the whole paw, including the fingers, 4 - the most inflamed limb with the involvement of numerous joints (maximum cumulative Kaya arthritic score 16 per animal) (Νίδΐιίάα f) a1., 2004).

To allow for a meta-analysis of numerous studies, the clinical evaluation values were normalized as follows:

AIS clinical assessment (AIS assessment): the area under the curve (AIS) from 1 to 14 days was calculated for each individual rat. The AIS for each animal was divided by the average AIS obtained for the diluent in the study, from which data were obtained for this animal, and multiplied by 100 (that is, the AIS was expressed as a percentage of the average AIS diluent per study).

The increase in clinical evaluation from day 1 to day 14 (endpoint count): the difference in clinical evaluation for each animal was divided by the average difference in clinical evaluation obtained for the diluent in the study, from which data were obtained for the animal, and multiplied by 100 (i.e. AIS was expressed as a percentage of the average clinical evaluation of the diluent per study).

3.1.6. Change in body weight (%) after the onset of arthritis.

Clinically, the loss of body mass is associated with arthritis (H1c11op e) a1., 2005; AgdIsk e) a1., 1998; Ka11, 2004; \ ν; · ι15ΐηί11ι (e) a1., 2004). Consequently, a change in body weight after the onset of arthritis can be used as a non-specific endpoint for assessing the effect of therapeutic agents on a rat model. The change in body mass (%) after the onset of arthritis can be calculated as follows:

Mice body weight ^ weeks ) - body weight ^ 5 DIED L |.) Body weight (5 weeks )

Rat body weight (4 Ned DI) - the mass of Telara week) x body weight ^ n of the week)

3.1.7. Estimation according to Larsen.

After death, the Larsen score was derived for both hind paws of all rats by at least 2 scientists. Calculate the average value of these estimates, getting one mark for Larsen per rat. In order to compare the Larsen estimates between studies, the Larsen score for each rat was divided by the average Larsen score obtained for the diluent in the study, which the rat belongs to, and multiplied by 100 (i.e. expressing the Larsen mark as a percentage average clinical evaluation of the diluent per study). Calculated and compared the average score for Larsen for different groups treated.

3.1.8. X-ray examination.

X-rays were taken of the hind legs of each individual animal. Each of the photographs was given a random blind identification number, and the severity of bone erosion was ranked using two independent assessments of the Larsen radiological assessment system as follows: 0 — normal with unaffected bone contours and normal articular space; 1 - slight anomaly with one or two external metatarsal bones, in which there is a slight erosion of the bones; 2 a certain early anomaly with the manifestation of bone erosion for three to five external metatarsal bones; 3 - the average destructive anomaly, in which for all external metatarsal bones, as well as for any one or two internal metatarsal bones, a certain erosion of bones is manifested; 4 - severe destructive anomaly, in which for all external metatarsal bones a certain erosion of the bones appears and at least one of the internal metatarsal joints is completely eroded with partially preserved contours of the bones of the joint; 5 - disfiguring anomaly without contours of bones. This rating system is a modification of 5>; · ι1νοιηίπί e) a1., 2001; Wick (e) a1., 2002; §1t8 e) a1., 2004; 1st e1 a1., 2005.

3.1.9. Histological analysis.

After X-ray analysis, the hind paws of the mice were fixed in 10% formalin with phosphate buffer (pH 7.4), decalcified using a fast decalcifier of bones for high-quality histological analysis (Bog) (EEGoYo) and paraffin was poured. In order to guarantee a comprehensive assessment of arthritic joints, at least four serial sections (5 μm thick) were made and 100 μm gaps were made between each series of sections. Sections were stained with hematoxylin and eosin (H & E). Histological studies of synovial inflammation and damage to bones and cartilage tissue were performed in a double-blind fashion. For each foot, four parameters were evaluated using a four-point scale. These parameters were cell infiltration, pannus severity, erosion of cartilage and bone erosion. The assessment was carried out as follows: 1 - normal, 2 - light, 3 - moderate, 4 - severe. Four rating data

- 27 020111 summarized and presented in the form of an additional assessment, namely the overall assessment of the AC. To enable comparison of histological counts for different studies, the total histological score for each rat was divided by the average total histological score obtained for the diluent in the study to which the rat belongs, and multiplied by 100 (i.e., the total histological score was expressed as a percentage of the average total histological evaluation of the diluent for the study). The calculation and comparison of the average total histological evaluation for various groups treated was carried out.

3.1.10. Microcomputer tomographic (CTL) analysis of calcanus (calcaneus).

The destruction of the bone, observed in CA, occurs mainly in the cortical bone and can be detected by the method of TsST analysis (81t§ Ν.Α. е! А1., 2004; OChE L. e! A1., ECTS Moped1 2007 ). After scanning and 3E-volume reconstruction of the calcaneus, bone destruction is defined as the number of discrete objects present on the slide, highlighted ίη chiso perpendicular to the longitudinal axis of the bone. The more destroyed the bone, the more discrete objects allocated. Analyze 1000 sections, evenly distributed along the heel bone (with an interval of about 10.8 microns).

3.1.11. Results.

Compound 1 was tested in a C1A study in mice at 30 mg / kg and in a C1A study in rats at 30, 10, 3, and 1 mg / kg. Compound 1 was effective in all counts performed in the C1A study in rats, with statistical confidence in several counts, in particular, significant improvements were observed for the AIS clinical assessment (from 10 mg / kg), the final clinical assessment (from 1 mg / kg), Larsen estimates (from 30 mg / kg) and paw swelling (1 mg / kg).

Example 3.2. Septic shock model.

Injection of lipopolysaccharide (LP8) causes a rapid release of soluble tumor necrosis factor (T # a) receptors to the periphery. This model is used to analyze putative release blockers T # ίη νί \ Ό.

Six female VAB / c1 mice (20 g) per group are treated with once-specified doses, p.o. After 30 min make ί.ρ. Lp8 injection (15 µg / kg, serotype E. Soi 0111: B4). After 90 min, the mice are euthanized and blood is collected. Concentrations of circulating Т№а are determined using commercially available sets ЕЬ18А. Dexamethasone (5 µg / kg) was used as a control anti-inflammatory compound. Selected compounds are tested at single or multiple doses, for example, 3, and / or 10, and / or 30 mg / kg, p.o.

Compound 1 exhibited a statistically significant decrease in the release of ΤNΕ (> 50%) at 30 mg / kg po.

Example 3.3. Model MAH (model with monoclonal antibody).

The MAB model makes it possible to conduct a rapid assessment of the modulation of a CA-like inflammatory response with therapeutic agents (KAI-1LMM # 11IGe Pgososki (2006) 2512-2516: Conjugate aPcBoyu-Tyissei ar (Ng1115). EVA / ыш mice are injected ί.ν. with a mixture of tAH directed against collagen II. After a day, start treatment with the compound (diluent: 10% v / v βί, Ό). After three days, the mice receive a ί.ρ. injection of LP8 (50 μg / mouse), resulting in a rapid onset of inflammation.Treatment with the compound is continued for 10 days after the injection of ABI. Inflammation is determined by Testing for swelling of the paws and recording the clinical evaluation of each paw. General clinical evaluations of arthritis of the four limbs to demonstrate the severity of inflammation are presented.The evaluation system is applied to each limb using a scale of 0-4, with 4 being the most severe inflammation.

- Symptoms are absent.

- Weak but distinct redness and swelling of one type of joint, such as the ankle or wrist, or obvious redness and swelling, limited to individual fingers, regardless of the number of affected fingers.

- Moderate redness and swelling of two or more types of joints.

- Severe redness and swelling of the whole paw, including the fingers.

- Maximum inflamed limb involving multiple joints.

Example 3.4. Oncology models.

The ίη νί \ Ό models for confirming the effectiveness of small molecules in relation to 1AK2-controlled myeloproliferative diseases are described by EG! a1. Sapseg Ce 11 13, 311, 2008 and Seg e! a1. Sapseg Ce11 13, 321, 2008.

Example 3.5. Model ΙΒΌ in mice.

Models 1п νίΙΐΌ and ш νί \ Ό to confirm the effectiveness of small molecules with respect to ΙΒΌ are described \ νίΠζ е! a1. 2007

Example 3.6. Model of asthma in mice.

Models 1п νίΙΐΌ and ш νί \ Ό to confirm the effectiveness of small molecules in relation to asthma are described as "no f! A1., 2008; Ιρ e! a1. 2006; Registered! A1., 2002; ΙιάΡκζ e! A1., 2008.

Example 4. Models of toxicity, EMRK and safety.

- 28 020111

Example 4.1. Thermodynamic solubility.

A solution of 1 mg / ml of the test compound is prepared in 0.2 M phosphate buffer with a pH of 7.4 or 0.1 M citrate buffer with a pH of 3.0 at room temperature in a glass jar.

The samples are rotated on the rotator disk 8ТК 4 (81иай δοίοηΙίΓίο. В1Ью) with a speed of 3.0 at room temperature for 24 hours.

After 24 hours, 800 μl of the sample is transferred to an Eppendorf tube and centrifuged for 5 minutes at 14,000 rpm. Then, 200 μl of the sample supernatant is transferred to a MyNysgsp 8o1b11yu P1a1c tablet (M1Schore, M88BRS50) and the supernatant (10-12 mmHg) is filtered using a vacuum comb into a clean polypropylene 9b-well plate with a Y-shaped bottom (catalog No. 651201). 5 μl of the filtrate is diluted with 95 μl (G20) of the same buffer that was used for incubation in a plate containing a calibration curve (Ogeteg, catalog No. b51201).

The calibration curve for this compound is made freshly prepared in DMSO, starting from 10 mM stock solution in DMSO diluted with factor 2 in DMSO (5000 μM), and then further diluted with DMSO to 19.5 μM. Then 3 μl of the serial dilution, starting with 5000 μM, are transferred to 97 μl of a mixture of acetonitrile buffer (50/50). The final concentration range is from 2.5 to 150 μM.

The tablet is sealed with sealing films (MA9BKE-048, TET et al. 818.co.iK) and the samples are measured at room temperature using LC-MS (~ 1525 Å \ 5) under optimized conditions using Oiampyxhe to determine the appropriate mass of the molecule.

Samples were analyzed on LC-MS at a flow rate of 1 ml / min. Solvent A is 15 mM ammonia and solvent B is acetonitrile. The sample passes under the conditions of a positive ionic spray on a XVpbde C18 3.5 μM column (2.1x30 mm) from the Sealer 5. The solvent gradient has a total pass time of 2 minutes and varies from 5 to 95% B.

The analysis of the peak areas is carried out using the MacDupx software package and the peak areas of the samples are plotted against the calibration curve, yielding the solubility of the compound.

Solubility values are given in μM or μg / ml.

Example 4.2. Solubility in water.

Starting from 10 mM stock solution in DMSO, serial dilution of the compound in DMSO is prepared. Serial dilutions are transferred to a 9b-well plate with a P-shaped bottom ΝίυΝί Mahyog (catalog No. 442404) and 0.2 M phosphate buffer with a pH of 7.4 or 0.1 M citrate buffer with a pH of 3.0 is added at room temperature.

The final concentration varies from 200 to 2.5 μM in 5 identical dilution steps. The final concentration of DMSO did not exceed 2%. 200 μM pyrene is added to the corner points of each 9B-well plate, and it serves as a reference point for calibrating the оси-axis in the microscope.

The assay plates are sealed and incubated for 1 hour at 37 ° C with shaking at 230 rpm. After this, the plates are scanned under a microscope with white light illumination, obtaining individual pictures of the precipitate by concentration. The precipitate is analyzed and transferred to the number that is put on the chart. The first concentration, at which the compound is completely dissolved, is the reported concentration, but the true concentration is somewhere between this concentration and the concentration of one dilution step upwards.

Solubility values are given in μg / ml.

Example 4.3. Plasma protein binding (equilibrium dialysis).

mM stock solution of the compound in DMSO is diluted by a factor of 5 in DMSO. This solution is further diluted in freshly thawed human, rat, mouse, or dog plasma (Vyuklesaytop ай) at a final concentration of 10 μM and a final DMSO concentration of 0.5% (5.5 μl in 1094.5 μl of plasma in a 9b-well plate). Mayegyosk (Ogeteg, catalog No. 780285)).

Prepare a plate with Priegs Keb Eu1se inserts (NegtoSaepOps, catalog No. 89809) and fill 750 µl of PB8 buffer tank and 500 µl of spike plasma into the plasma tank. The plate is incubated for 4 hours at 37 ° C. with shaking at 230 rpm. After incubation, 120 μl of the contents of both tanks are transferred to 3b0 μl of acetonitrile in 9b-well round-bottom, PP plates with deep wells (Ships, catalog No. 278743) and sealed with an aluminum foil cover. Samples are mixed and placed on ice for 30 minutes. After that, this plate is centrifuged for 30 min at 1200 gsG at 4 ° C and the supernatant is transferred to a 9b-well PP plate with a U-shaped bottom (Ogeteg, b51201) for analysis by LC-MS.

This plate is sealed with a sealing film (MA9bKE-048) from \\ l \ l \\ cte515.sol.1k and samples are measured at room temperature using LC-MS (ΖΟ 1525 from \ U1e5) under optimized conditions using OiporOiche to determine the appropriate mass molecules.

Samples are analyzed by LC-MS at a flow rate of 1 ml / min. Solvent A is 15 mM ammonia and solvent B is acetonitrile. The sample passes under the conditions of a positive ionic spray on a XVpbde C18 3.5 μM column (2.1x30 mm) from the Sealer 5. The solvent gradient has a total pass time of 2 minutes and varies from 5 to 95% B.

- 29 020111

It is believed that the peak area of the compound in the buffer tank and the plasma tank is 100% of the compound. The percentage of plasma binding is obtained from these results and is represented by L1M8 as a percentage of plasma binding.

The solubility of the compound at the final test concentration in PB8 is examined with a microscope to show whether a precipitate is observed or not.

Example 4.4. Tendency to prolong OT.

The possibility of prolongation of OT is evaluated by the method of local fixation of the potential of NEX.

4.4.1. Local fixation of the potential in the whole cell.

The local fixation of the potential in the whole cell is recorded using an EPC10 amplifier controlled by the software Pu1ke ν8.77 (HEKA). The resistance of the series is usually less than 10 MO and is compensated by more than 60%, the scattering is not subtracted from the readings. Electrodes are made of glass for pipettes (Nagageb).

External immersion solution contains 135 mM №С1, 5 mM КС1, 1.8 mM СаС1 2 , 5 mM glucose, 10 mM HER8, pH 7.4.

The internal solution of a para-pipette contains 100 mM gluconate K, 20 mM KC1, 1 mM CaCl 2 , 1 mM MdCl 2 , 5 mM MMAT, 2 mM glutathione, 1 mM ESTA, 10 mM HEP8, pH 7.2.

Medicinal preparations are perfused with the aid of the biological system of fast perfusion MEU-9 / EUN-9.

All readings are performed on HEK293 cells stably expressing HEX channels. Cells are grown in 12-mm round cover glasses (Septar d1acc, Be11ero), fixed in the recording chamber with the help of two platinum rods (Soo6Gs11o \ y). HEXS currents are induced with an activation pulse of up to +40 mV for 1000 ms, followed by a tail current pulse of up to -50 mV for 2000 ms, while the holding voltage is -80 mV. Pulses were applied every 20 s and all experiments were performed at room temperature.

4.4.2. Data analysis.

For each test compound, the values of 1C 50 and 1C 20 were calculated. The multiple difference between 1C 20 and unbound sms concentrations of the test compound obtained at the relevant therapeutic doses determined from the results obtained from the C1A model in rats was calculated.

As for the curves of concentration versus response, the maximum amplitude of the tail current is measured with a voltage jump of up to -50 mV. Drawing the empirical curve according to the dependence of concentration on response is carried out according to the equation y = a + [(b-a) / 1 + 10a ((1odc-x))] where a is the minimum response, b is the maximum response and b is slope of the curve, and this equation can be used to calculate both 1C 50 (where y = 50 and c is the value of 1C 50 ) and 1C 20 (where y = 20 and c is the value of 1C 20 ). To construct all the curves, the software SgarNRab® Rpkt® (SgarNRab® 8op \\ arge1pe.) Was used. A difference of 100 times or more indicates a low potential for RT prolongation.

Example 4.5. Microsomal stability.

The mM stock solution of the compound in DMSO was diluted 1000 times with 182 mM phosphate buffer pH 7.4 in a 96-well deep-well plate (Steshet, catalog No. 780285) and preincubated at 37 ° C.

μl of deionized water was added to the well of a bar-labeled polypropylene tube for storing Maya 2Ό (Negto Zepayye) and preincubated at 37 ° C.

A working stock solution of glucose-6-phosphate dehydrogenase (C6REN) was prepared in 182 mM phosphate buffer at pH 7.4 and placed on ice until use. A cofactor containing a solution of MdCl 2 , glucose-6-phosphate and NA ^ Ρ + was prepared in deionized water and placed on ice until use.

A final working solution was obtained containing microsomes of the liver (Hepolei) of the species under consideration (human, mouse, rat, dog), previously described C6REN, and cofactors, and the mixture was incubated for no more than 20 minutes at room temperature.

30 μl of the pre-heated dilution of the compound was added to 40 μl of preheated water and 30 μl of microsomal mixture was added. The final reaction concentrations were 3 μM of the compound, 1 mg of microsomes, 0.4 and / ml of SORH, 3.3 mM of MdCl 2 , 3.3 mM of glucose-6-phosphate and 1.3 mM of Na ^ + .

To determine the percentage of the remainder of the compound in a zero period of time, MeOH or ACN (1: 1) was added to the well before adding the microsomal mixture. The plates were sealed with Miai-erg kea1kTM (Maiah, catalog No. 4464) and shaken for a few seconds to ensure complete mixing of all the components.

Samples in which the reaction was not stopped, incubated at 37 ° C, 300 rpm and after 1 h of incubation, the reaction is stopped by adding MeOH or ACN (1: 1).

After stopping the reaction, the samples were mixed and placed on ice for 30 minutes to precipitate proteins. Then the plates were centrifuged for 30 min at 1200 geG at 4 ° C and the supernatant was transferred to a 96-well PP plate with a Υ-shaped bottom (Chainer, 651201) on an LC-MS analysis.

- 30 020111

These plates were sealed using sealing films (MA96KI-048) \\ l \ l \\ cte515.co.ik and samples were measured at room temperature using LC-MS (ΖΟ 1525 from \ Celete5) under optimized conditions using OaporNp ^ e for determine the appropriate mass of the original molecule.

Samples were analyzed by LC-MS at a flow rate of 1 ml / min. Solvent A was 15 mM ammonia and solvent B was acetonitrile, depending on the stop solution used. Samples were passed under positive ion spray conditions on a XVpbde C18 3.5 μM column (2.1 mm × 30 mm) from Vaterp5. The solvent gradient had a total run time of 2 minutes and varied from 5 to 95% B.

The peak area from the starting compound at time 0 was considered as 100% residue. The percentage remaining after 1 h of incubation was calculated from time 0 and was calculated as the remaining percentage. The solubility of the compound at the final test concentration in the buffer solution was examined under a microscope and the results were reported.

Data on microsomal stability are expressed as a percentage of the total amount of the compound remaining after b0 min.

Table IX

Microsomal stability

Compound No. Person Rat one 76-100% 76-100%

Example 4.b. Permeability of Caco2.

Bidirectional Caco-2 assays were performed as described below. The Caco-2 cells were obtained in the European Association of Cell Cultures (ECACC, catalog No. 8b010202) and used after 21 days of cell growth in 24-well plates of Tgap5 \ te11 (Ikyet TKT-545-020B).

Sowed 2x10 5 cells / well in a tablet medium consisting of OMEM + Cl1MAX1 + 1% ΝΕΑΑ + 10% EB8 (Her! A1Clip 11) + 1% Rep / 8! Ter. The medium was changed every 2-3 days.

The test and reference compounds (propranolol and rhodamine 123 or vinblastine, all of which were derived from 81 mg) were prepared in Hanks salt solution containing 25 mM HEPE8 (pH 7.4) and added either to the apical (125 μl) or in the basolateral (B00 μl) compartments of the block of plates of Tgap5 \\ 'e11 at a concentration of 10 μM with a final concentration of DMSO of 0.25%.

50 μM luciferous yellow (81 dta) was added to the donor buffer in all wells to assess the integrity of the cell layers by monitoring the penetration of luciferous yellow. Lucifer yellow (ΕΥ) cannot freely penetrate lipophilic barriers, and the high transfer rate ΕΥ indicates a weak integrity of the cell layer.

After 1 hour of incubation at 37 ° C with shaking on an orbital shaker at 150 rpm, 70 μl aliquots were taken from both the apical (A) and basal (B) compartments and 100 μl of acetonitrile were added to the solution: water 50:50 containing the analytical internal standard (0.5 μM carbamazepine) in a 9b-well plate.

Lucifer yellow was determined using 8 reps of Seti X8 (Ex 42b nm and Et 538 nm) in a clean 9b-well plate containing 150 μl of liquid from the basolateral and apical sides.

The concentration of the compound in the samples was determined by high performance liquid chromatography / mass spectrometry (LC-MS / MS).

The values of apparent permeability (P arr ) was calculated by the equation

Rarr [O θ CI Η Θ NO]] final acceptor hTG ac cpto p ([CONNECTION] initial lonORCHONOR) / TnKHUdonor / surface area xWOD 6 cm / s where T Inc. is the duration of incubation;

surface area - 0.33 cm 2 .

Ratio of efflux as a sign of active outflow from the apical surface of the cell was calculated using the ratio P arr B> A / P arr A> B.

The following acceptance criteria were used.

Propanolol: the value of P arr (A>B)> 20 (x 10 -6 cm / s).

Rhodamine 123 or vinblastine: P app value (A> B) <5 (x10 -6 cm / s) at a ratio of bleedout> 5. Lucifer yellow permeability <100 nm / s.

Table x

Flow rate Saso-2

Connection Ν ' Rarr A> B (X1O ' 6 cm / s) Flow ratio one 7.8 ± 0.8 6.1 ± 0.6

Example 4.7. Pharmacokinetic study.

4.7.1. Pharmacokinetic study in rodents.

The compounds are prepared in mixtures of PEG200 / saline or

- 31 020111

PEG400 / DMSO / saline for intravenous administration and in 0.5% methylcellulose or 10-30% hydroxypropyl-β-cyclodextrin with a pH of 3 or 7.4 for oral administration. Test compounds are dosed orally as a single intraesophageal probe at 5-10 mg / kg and dosed intravenously as a bolus through the tail vein at 1 mg / kg. Each group consists of 3 rats. Blood samples are taken either from the jugular vein using cannulated rats, or from retro-orbital sinus using lithium heparin as an anticoagulant at time points in the following interval: from 0.05 to 8 hours (intravenous method) and from 0.25 to 6 or 24 hours (oral route). Whole blood samples are centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes and stored plasma samples are stored at -20 ° C while waiting for analysis.

4.7.2. Pharmacokinetic study on dogs.

The compounds are prepared in PEG200 / saline mixtures for intravenous administration and in 0.5% methylcellulose or in PEG400 / hydroxypropyl-in-cyclodextrin mixtures acidified with citric acid to pH 2-3 for oral administration. Test compounds are dosed orally via a stomach tube at 5–30 mg / kg and dosed intravenously as a bolus or 10 min infusion through the carotid artery at 1 mg / kg. Each group consists of 3 male or female beagle dogs. Blood samples are taken either from the jugular vein using lithium heparin as an anticoagulant at time points in the range from 0.083 to 24 hours after dosing. Whole blood samples are centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes and stored plasma samples are stored at -20 ° C while waiting for analysis.

4.7.3. Quantitative assessment of the concentration of the compound in the plasma.

The plasma concentration of each compound is determined by LC-MS / MS, in which the mass spectrometer operates in the positive electrospray mode.

4.7.4. Determination of pharmacokinetic parameters.

The pharmacokinetic parameters are calculated using ^ uioi ^ and® (RyagTsd! ®, Ish! Eb). Example 4.8. A 7-day rat toxicity study.

A 7-day study of the oral toxicity of the test compounds was performed on male rats 8 gadi-Oa ^ 1yu to assess the potential of their toxicity and toxin kinetics at daily doses of 100, 300 and 500 mg / kg / day, using a gastric probe, at a constant value Dose-volume of 5 ml / kg / day.

From the tested compounds, preparations are obtained in 30% (v / v) NRVSI in purified water. Each group includes 5 dominant male rats, as well as 3 obeying animals for pharmacokinetics. The fourth group receives only 30% (v / v) NRVSI in water with the same frequency, dose volume and the same route of administration and acts as a control group receiving the diluent.

The purpose of this study is to determine the minimum dose, which leads to the absence of identifiable adverse effects of this kind (there is no observed level of adverse effects - NO ^ E ^).

Example 4.9. Hepatocyte stability.

Models for assessing the metabolic clearance of hepatocytes are described by McStuy e! a1. Igid Me! Alo11kt aib Ischrokyui 2008, 32, 11, 1247.

It will be understood by those skilled in the art that the foregoing descriptions, by their nature, serve as examples and clarifications and are intended to illustrate this invention and its preferred embodiments in this form. During standard experimentation, the technician will see obvious modifications and changes that can be made without departing from the scope of the present invention. Thus, it is understood that this invention is not defined by the above description, but by the following claims and its equivalents.

- 32 020111

References

AgdeIz LI, Loreg-Zoghapo RL. (1998) Saboons p hίί £ Hattaϋ ogu suhohpez. Sigg Ορίη S11P YiSg ME saga. 1: 245-51. Vis KA, Ragteg KM, Ia1keg LZ, Ktgkbat IN AND . (2002) Vedisehop about £ οίηΐ 1p £ 1ttapt1 apd Hole his boom гη gus hell] tgap agSbhSgz lu bgaetep νίύΐι 1nbc · -17 hesebog

1dS1 RS Sizgop. rgoRehp AUGHHYe Ye'eit. 46: 802-5.

Shou EN, Rapau! 05. (2001). N Epd1 L Med. 344; 907-16.

CHEUNG 5 APD KIEENPEG KE (2003). Nediatai o £ ozeodephs ρτοΐβίηβ Üt sopdgosues. THe 1nSeppa1Opa1] oigpa1o £ £ осетЪетппххгу се се се се 35 35 35 35 (9) 1323-1340.

Sedd 00 eG a1. (2006) N Epd1 L Med. 2006 354: 795-808.

С51созашаш1пі, сёопдгхххпи1 £ a £ e, аff СЬё £ νο ίη can make up £ 1 £ £ ogra1п £ и1 glue ozSeoagSgkhMz.

SopzSapShpezsi, a1., 2007, Tgepdz ίη В1ос11ет1са1

Spicerp 33 (3): 122-131.

G1ge2Se1P 03. (2003). IAS / Igyo. 423: 356-61.

Now e £ a1. (2008) δθίβοΐιΐνβ 1pYShop about £ LAK2-dh1Uep eguYagohd D1 ££ egepYa1: 1op about £ roHusuSetha uezga rgodepHsogz Sapseg Se11 13 (4), 321-30.

1p e £ aX. (2006) 1peg1eik1p (1) -4 ADF 1B-HZ-ir gediHase toposuSe setoagasap pro £ e1p 1 ehrgezehop ίη Pital gopsYaH er1eIa1 seHHz: ίηνοίνβπιβηΐζ about £ p38 thodepasYuaSed rgoe1p khpaze, ex-£ gase1HiHag z1dpaH gedi1aed k1laze 1/2 ang Lapiz k1paze-2 Lik on £ c-Lip LNH2- £ erg1nh k1paze 1/2 81dpa111pd raSadauz, S11p. Exp. 1, 162-172.

Loi ΙΜ, YYai A'b, Cepe 8Υ, And Andex CK, ZYe OB, Tza! NW, AI

- 33 020111

Mb (2005) Tkgotyzoplp 1 az an β β ≤ ο οο: ίνβ depe тег tegareiSds to бgadudu η so11adep-1p <1sec1 ahekGZHhz. Agbkg1S13 Ekeit. 52: 339-44.

CASYD ^ an LM. (2006) SoIdep appl1os1u-1ps1sedk. AgsbhYz, Ja'bige Progress 2512-2516.

KYASYDGAP, b. M. CoIdep aS1Boo0y-1n0isse <2 ar £ £ L1c1e. (2006) KGa ^ ige Rho £ especially 1, 2512-6.

Kispasg uS a1. (2008) Thée ΑΚΑΚ-З ЫЫЫССС СР-690550 хз а рёЬпъ an ^ 1-1п £ 1 attaSogu епη бη а іххпдо1о о рри1тагу ёхх-ЬИИХа, Eig 3 Rkahtaso 154-161.

Leer, Impep I (2001). Bluff 358: 903-11.

Depegde R, OisSchha <1, Rideau1 θ'-P, Vodapod ^ xsg R. (2003) II conglomerate, add-ons-coge, apf Ipk rojohp £ gapzsg1p1: 1op ίη ahC1ci1ag scopesus. σ ΒίοΙ Sket. 278 (5) 2903-2912.

We are a place to look at the world of artwork. (2001) 3 ttypo1 166: 34913498.

CP H8, NE SU, Scap ΗΥ, ΥΥem ΥΥ, Nyapd NR, Berezskih V, VaziPeShE, Vagop V, ΕβνβάίС, S1etep £ lashokhkh R. (2007) Apsh-gkeitashe asb1u1emaste, imex, imex, imex, imex, ih, ih, ih, yo, yo, y, y, y, y, y, y, y, y, y, y, y, y, y, y, y, y, y, y, y, y, y shall see νίνο ίη so11adep-1ps1isse0 aggId.dx5 ίη godepSz.Vg L Rkagtaso1. Arg; 150 (7): 829-31.

MiChdkap CC, gkapd 3, Nagueu EC, Sospz-iZehadoood ZE, Skienta BA, ΡΗΐΙΙίρε BA, Tazkhap 8K, Lok Mb, 8i X, LY And, Ώβνί <^ 3 M, AS1az 8E, Skep V-M, S1xV, <3 M, AS1az 8E, Skep YS, S1x, S3, M & S, AS1AZ 8E, Skep S, M & S, XiVi <3M, AS1az 8E, Skep YS, S1x, S, Xi, S1x, S1xM ! KZ, Segkakhs! 02, SaghoI KJ, Eatap OH, btkhk m, Oougpd ZE, Nipdeg 5R and Cstuble Cb; (2009) CLIENT OF TEMPION OF Иη I1DK-G1zk sc11c1Looos1 sbIe 1trkoOzS1s 1iiket1a, ΡΝΑ8 Mow 22. [Publication at the stage of printing.]

H1a1z eb a1. (2008) Moise Mosteers on Anahdhs Azkgpa: Asi £ e aps! Skgopkhs Annegdep SkaIepde, Ohzeaze Μοάβΐβ & Meskapgtsz, 213-220.

Νί31Ίίά3 K, Kot1uatpa T, Mkhuagaka 3, 8kep ΖΝ, RichitaGzi T,

- 34 020111

Οΐ Η, ΥοδΠΐάβ A, Uatapa L, Uatatiga, Ytpottua U, 1 bye Η, Azaaga. (2004) Ηίδϋοηβ 0еaseСу1азе хпЫЫСог зирргззтоп о рги С и и о о тес тес тес аг аг аг г г г г г 3 ΐ 1 С ΐ 16.. Г г 3 еди еди. С С т 21 К.. .1 К 11 ез г ез1 г 1 ез1 1 К1 К 11 11 ез 11 К еди ΐ г1

AgSgr ± S1V Ver. 10: 3365-76.

O'Zea, L, L., Rezi, M., Vogte,-C-, CапpdeIap, R.5., Iasige Ββνΐβνδ, 2004, 555-564.

O * Be11 LC. (2004) TigareiSts zSgaSedgez £ og geyigpaSogd ahSchGr1S13. N Epd1 L MeZ. 350 (25): 2591-602.

Ovak1 M, Tup L, Chou VK, UozYyu U, Ceana KZ, Aigop RE, CoMgpd MV. (2003) TЪe TATA-SopaShhptpd soge rgottoSg about £ sNe Sura II SoIoDepe Depe (SOB2A1) 13 CHE SagdeS about £ 1sSeg £ hispdatta tesI-Seb. hpYyStop Питη Pit snopygosuSev: gedittetepS £ οχ 5TAT1 a1rPa, LAK1 upd LAK2. Will be 369: 103-115.

EXCESS A1., ECTS MOSPEGA 2007: A BURNER OF THE THESE ABOUT THEURESTERS OF THE BELTESEARCH

Asego M, Ádo K, Ádo E, Soteg Κθΐηο LL, biAIIo O. (2005) ZgdpaSpd rasiau ΐηνοίνβά η ηΐπτΐο οχΐάβ vupsvave Sure II price £ 1VaS1op ΐη. sopdgosuSez: zupegdhzSkhs e £ eerS about £ 1erC1n νίϋΠ tnSegteik1n-1. AgSbhShv Kezeag & Thugaru 7; B581K591.

Reppa a1. (2002) LAK-ZTAT zddpaIpd ΐη azSbta L. Sip.

TtgeeS. 1279. YOU bc, voieblo £ p K. (2004) Weightag Soghöht: hе £ аbо11с абпогта11С1ез, тпесНапхзтз aps1 ΐη £ θΓνβ £ ΐοηδ. KjeitSoD; 10: 1219-23.

Vosd 8L, Megag MA, IYSe LM, LATRE RA, Vladeu LC, Agsieg SB, KTPD KL, ZnieBap KSR, Υΐη Ъ, Repphsa B, Lobzop EM, Zstegner NB. (1998) Beginning About £ Ce Lac Dept. Dept. of the World hoca o £ CHe ^ ack ΐη suSokhpetps5is0 Nyo1odts gezropze Ce11 93: 373-383. 8a1tp1 1,

Maggop E, Bido B, Zeggahpo I, Be Zaggo A, SariSh AR, Siggosgea 3. (2001) AteIogaShop about £ ^ ΐοΐηο Nsiaze η and gus toLe1o £ so11adep-1n0cased aSgrHyTsHyi M40403pc hrs4e4404a4403403403 AgsNgtStz Vnet. 44: 2909-21.

SNe1Sop Vb, Hepgeg L, But MN, Ropv L, Kozepsya! A. (2005)

- 35 020111

Lehlg dgr> rhl1lhlhl from the disIaRezh LuregaHdezha apd sas'ehkha ϊη ai £ o1ttype agYigkhYz. Rahp 116: 8-16.

Sxte £ e £ a1., (2004) Tagdehpd oz £ eos1az ££ «г ± Ы1 гёедедгпхс asxs! phemebrus bope sZez £ gis £ hop ίη so11adep-hryise <1 agRIhMz, AgRIhRhz Keithp. 50 2338-2346.

Зхтз ΝΑ, Сеэп σκ, С1а ££ М, ЗСИИсе 3, MagShp и,

Szezrhe MT, Kotae E. (2004) Tagdexezososlaz £ s ν1 £ 1ι GO1e <5gopxs askhd ρΓβνβη £ .3 LopezézSgisHopίίη so11adep-hps1ied agRgkhRhz. AGRI.G1YZ K'EIT. , 50: 2338-46.

5To1ep TZ, S. Zhehpeg (2003). Naa £ Κθν Ogid ϋί3θον. 2: 47388.

Tagp, L., Mc01upp, L.M., Tgaupog, R., Mikgegeei, K.,

BaGeRR, .Ι.Μ.3., Edzdggyz, T. (2007) Bghxhz Toigpa1 o £ Sapseg,

97, 378-383.

Terziz! Yak, Yoghkhgo YkhzYtoRo apy TaDapiLei Kkhzytogo,

Agrggyz Kez 2002, 4 (zirr1 3): 3233-3242. Ia3zt1Y1 ABAZ b,

Keauhaz Ts, Voyepo £ £ B. V. (2004) Titog pesgohz £ as £ oa-a1rba rgoszisrhop 13 azzoshaThed νίϋΗ 1zzz oobu ce11 thaz xn “ote adhСЬ gyеitRohz agRhhRhz. T VkeiBo1 .; 31: 23-9. Yehhhhh eb a1.

(2008) EEHGSASU about £ ΤΟΙ 01348, and 3θ1θο £ ίνθ LAK2 KeyNoChKeTyKyr, hp eGayeatnie about £ and tigigpe πιοάβΐ about £ TAK2Ub17G-1Ps1eUnuscentor1Step1a ντΓ2TKTs2U17G-1Ps1y

NH1An1 ON, MhsIaEnz M, Khgtsbyait VT, Kistoroyi KA.

(2005). Go to £ Κ € ν Egid ϋίβοον. 4: 331-44. OzSeoag £ kg1 £ 1z - an ipRgeaaa Zhzeaze?

Ihgrg er a1. (2007) Moise Models about £ 1 £ £ 1 ata £ agy of War 1

Yukhzeaze, Aymapssed Bgid ϋβϋνβΓγ Κθνίθν / β, 1073-1083.

MsShpphRu, Ώ.Ρ. (2004) Ema1aS1Op about £ £ gezb apd siguorgegeguyuy Bezdruzin aze xp νϊϋΓΟ dyd tebáboNzt ϋοοίβ £ og skke rhesiSkhop o £ teSaoNs! Bgid MeBoMzt aps! Ώχ3ρο3ίΐ; ίοη, 32, 11, 1247.

All publications, including, but not limited to, patents and patent applications cited in this description, are included in the present description by reference, as if each individual publication specifically and individually indicated as included in the present description in the form of a fully cited reference.

From the above description, various modifications and changes in the compositions and methods of this invention will occur to those skilled in the art. It is implied that all such modifications that fall within the scope of the attached

Claims (11)

формулы изобретения, включены в нее.claims included in it. Следует понять, что такие факторы, как способность различных соединений к дифференциальной клеточной проницаемости, могут способствовать расхождению между активностью соединений в биохимических т у1уо и клеточных анализах.It should be understood that factors such as the ability of various compounds to differentiate cellular permeability may contribute to the discrepancy between the activity of compounds in biochemical tests and cell assays. По меньшей мере, некоторые из химических названий соединений изобретения, приведенных и представленных в данном изобретении, могли быть получены в автоматическом базисе при помощи коммерчески доступной компьютерной программы названий химических соединений и не были независимо проверены. Репрезентативные программы, осуществляющие данную функцию, включают в себя компьютерную программу по присваиванию названий Ьехюйет, поставляемую Ореп Еуе 8ойуаге, 1пс., и компьютерную программу Аи1опот 8оП\уаге, поставляемую МОЙ, 1пс. В том случае, когда указанное химическое название и изображенная химическая структура различаются, контроль будет осуществляться по изображенной структуре.At least some of the chemical names of the compounds of the invention, presented and presented in this invention, could be obtained in an automatic basis using a commercially available computer program of the names of chemical compounds and were not independently verified. Representative programs that perform this function include the name-calling computer program supplied by Orep Eue 8th Warranty, 1ps., And the computer program Aiopot 8op / Varue, supplied by MY, 1ps. In the event that the chemical name indicated and the chemical structure shown are different, control will be carried out according to the structure shown. Приведенные в настоящем описании химические структуры были получены либо при помощи СйетЭгау®, либо ^^©/□КАХУ. Любая свободная валентность, возникающая у атома углерода, кислорода или азота в приведенных здесь структурах, указывает на наличие атома водорода. В случае, когда в структуре имеется хиральный центр, но для данного хирального центра не приведено конкретное стереохимическое описание, в структуру входят оба энантиомера, связанные с данной хиральной структурой.The chemical structures given in the present description were obtained either using CeetEgau® or ^^^ / □ KAHU. Any free valence that occurs at a carbon, oxygen or nitrogen atom in the structures listed here indicates the presence of a hydrogen atom. In the case when there is a chiral center in the structure, but no specific stereochemical description is given for this chiral center, the structure includes both enantiomers associated with this chiral structure. - 36 020111- 36 020111 1. Соединение формулы I или его фармацевтически приемлемая соль.1. The compound of formula I or its pharmaceutically acceptable salt. 2. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и фармацевтически эффективное количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1.2. A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and a pharmaceutically effective amount of the compound or its pharmaceutically acceptable salt according to claim 1. 3. Фармацевтическая композиция по п.2, содержащая дополнительный терапевтический агент, где дополнительный терапевтический агент представляет собой агент для лечения, предупреждения или профилактики воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани, и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией Ш6.3. The pharmaceutical composition according to claim 2, containing an additional therapeutic agent, where the additional therapeutic agent is an agent for treating, preventing or preventing inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplant rejection, diseases, including deterioration of cartilage tissue renewal, congenital malformations of cartilage tissue, and / or diseases associated with hypersecretion Ш6. 4. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1 для получения лекарственного средства.4. The use of the compound or its pharmaceutically acceptable salt according to claim 1 for the manufacture of a medicament. 5. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1 в качестве лекарст венного средства.5. The use of the compound or its pharmaceutically acceptable salt according to claim 1 as a medicament. 6. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1 для лечения, предупреждения и/или профилактики воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани, и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией Ш6.6. The use of the compound or its pharmaceutically acceptable salt according to claim 1 for the treatment, prevention and / or prevention of inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplant rejection, diseases, including deterioration of cartilage tissue renewal, congenital malformations of cartilage tissue, and / or diseases associated with hypersecretion Ш6. 7. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по п.1 для получения лекарственного средства для лечения, предупреждения и/или профилактики воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани, и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией Ш6.7. The use of the compound or its pharmaceutically acceptable salt according to claim 1 for the manufacture of a medicament for the treatment, prevention and / or prevention of inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplant rejection, diseases including deterioration of cartilage tissue renewal, congenital malformations cartilage tissue, and / or diseases associated with hypersecretion Ш6. 8. Способ лечения или профилактики воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани, и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией Ш6. при этом указанный способ включает в себя введение эффективного количества соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1, 4 или 5 или фармацевтической композиции по п.2.8. A method of treating or preventing inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplant rejection, diseases, including deterioration of cartilage tissue renewal, congenital malformations of cartilage tissue, and / or diseases associated with hypersecretion Ш6. however, this method includes the introduction of an effective amount of the compound or its pharmaceutically acceptable salt according to any one of claims 1, 4 or 5 or pharmaceutical composition according to claim 2. 9. Способ по п.8, в котором воспалительное состояние представляет собой ревматоидный артрит.9. The method of claim 8, wherein the inflammatory condition is rheumatoid arthritis. 10. Способ по п.8, в котором состояние или заболевание включает в себя воспаление.10. The method according to claim 8, in which the condition or disease includes inflammation. 11. Способ по п.8, где соединение по п.1 вводят в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом, где дополнительный терапевтический агент представляет собой агент для лечения, предупреждения или профилактики воспалительных состояний, аутоиммунных заболеваний, пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантата, заболеваний, включающих в себя ухудшение обновления хрящевой ткани, врожденных пороков развития хрящевой ткани, и/или заболеваний, связанных с гиперсекрецией Ш6.11. The method of claim 8, wherein the compound of claim 1 is administered in combination with an additional therapeutic agent, wherein the additional therapeutic agent is an agent for treating, preventing or preventing inflammatory conditions, autoimmune diseases, proliferative diseases, transplant rejection, diseases including in itself deterioration of cartilage tissue renewal, congenital malformations of cartilage tissue, and / or diseases associated with hypersecretion of Ш6. 4^)4 ^)
EA201270076A 2009-06-26 2010-06-25 CYCLOPROPANECARBOXYLIC ACID {5-[4-(3,3-DIMETYL-AZETIDINE-l-CARBONYL)PHENYL]-[l,2,4]TRIAZOLO[l,5-a]PYRIDIN-2-YL}AMIDE EA020111B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22068509P 2009-06-26 2009-06-26
US29818810P 2010-01-25 2010-01-25
PCT/EP2010/059067 WO2010149771A1 (en) 2009-06-26 2010-06-25 Novel compound useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201270076A1 EA201270076A1 (en) 2012-08-30
EA020111B1 true EA020111B1 (en) 2014-08-29

Family

ID=42340530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201270076A EA020111B1 (en) 2009-06-26 2010-06-25 CYCLOPROPANECARBOXYLIC ACID {5-[4-(3,3-DIMETYL-AZETIDINE-l-CARBONYL)PHENYL]-[l,2,4]TRIAZOLO[l,5-a]PYRIDIN-2-YL}AMIDE

Country Status (38)

Country Link
US (2) US8796457B2 (en)
EP (2) EP2792677B1 (en)
JP (1) JP5486084B2 (en)
KR (1) KR101712561B1 (en)
CN (1) CN102459261B (en)
AR (1) AR077221A1 (en)
AU (1) AU2010264635B2 (en)
BR (1) BRPI1014759A2 (en)
CA (1) CA2765988C (en)
CL (1) CL2011003276A1 (en)
CO (1) CO6491039A2 (en)
CR (1) CR20110673A (en)
CY (1) CY1119711T1 (en)
DK (2) DK2445912T3 (en)
DO (1) DOP2011000378A (en)
EA (1) EA020111B1 (en)
ES (2) ES2519170T3 (en)
HK (2) HK1168098A1 (en)
HR (2) HRP20141057T1 (en)
HU (1) HUE034205T2 (en)
IL (1) IL216618A (en)
JO (1) JO3030B1 (en)
LT (1) LT2792677T (en)
MA (1) MA33447B1 (en)
ME (1) ME01916B (en)
MX (1) MX2011013451A (en)
NZ (1) NZ596836A (en)
PE (1) PE20120494A1 (en)
PL (2) PL2792677T3 (en)
PT (2) PT2445912E (en)
RS (1) RS53617B1 (en)
SG (1) SG177359A1 (en)
SI (2) SI2445912T1 (en)
SM (1) SMT201400169B (en)
TW (1) TWI469981B (en)
UY (1) UY32741A (en)
WO (1) WO2010149771A1 (en)
ZA (1) ZA201109502B (en)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JO3041B1 (en) 2008-07-25 2016-09-05 Galapagos Nv Novel compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
TWI462920B (en) 2009-06-26 2014-12-01 葛萊伯格有限公司 Novel compound useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
JO3030B1 (en) 2009-06-26 2016-09-05 Galapagos Nv Novel Compound Useful for the Treatment of Degenerative and Inflammatory Diseases
JO3417B1 (en) 2010-01-08 2019-10-20 Regeneron Pharma Stabilized formulations containing anti-interleukin-6 receptor (il-6r) antibodies
WO2012142160A1 (en) * 2011-04-12 2012-10-18 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods for inhibiting allograft rejection
TWI589299B (en) * 2011-10-11 2017-07-01 再生元醫藥公司 Compositions for the treatment of rheumatoid arthritis and methods of using same
KR20200039028A (en) * 2011-10-11 2020-04-14 사노피 바이오테크놀로지, 소시에떼 빠르 악씨옹 셍쁠리피에 Compositions for the treatment of rheumatoid arthritis and methods of using same
MX368511B (en) * 2012-06-22 2019-10-07 Galapagos Nv Aminotriazolopyridine for use in the treatment of inflammation, and pharmaceutical compositions thereof.
JP6472803B2 (en) 2013-09-05 2019-02-20 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Triazolopyridine compounds, compositions thereof and methods of use
KR101930603B1 (en) 2013-12-05 2018-12-18 화이자 인코포레이티드 Pyrrolo[2,3-d]pyrimidinyl, pyrrolo[2,3-b]pyrazinyl and pyrrolo[2,3-d]pyridinyl acrylamides
GB201402070D0 (en) 2014-02-07 2014-03-26 Galapagos Nv Pharmaceutical compositions for the treatment of inflammatory disorders
GB201402071D0 (en) 2014-02-07 2014-03-26 Galapagos Nv Novel salts and pharmaceutical compositions thereof for the treatment of inflammatory disorders
PL3283114T3 (en) * 2015-04-13 2024-01-03 Galapagos Nv Methods for the treatment of cardiovascular disorders
US11414413B2 (en) 2016-07-26 2022-08-16 Suzhou Longbiotech Pharmaceuticals Co., Ltd. Heterocyclic compound as JAK inhibitor, and salts and therapeutic use thereof
WO2019149244A1 (en) * 2018-01-31 2019-08-08 南京明德新药研发股份有限公司 Jak inhibitor and use thereof
KR20210049871A (en) 2018-08-29 2021-05-06 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Methods and compositions for treating subjects with rheumatoid arthritis
CN114206442A (en) 2019-01-31 2022-03-18 赛诺菲生物技术公司 anti-IL-6 receptor antibodies for the treatment of juvenile idiopathic arthritis
CN111072655B (en) * 2019-12-30 2021-12-10 深圳市坤健创新药物研究院 Triazole pyridine compound, preparation method thereof, medicinal composition and application
US20230219889A1 (en) 2020-05-19 2023-07-13 Cybin Irl Limited Deuterated tryptamine derivatives and methods of use
US11596612B1 (en) 2022-03-08 2023-03-07 PTC Innovations, LLC Topical anesthetics

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008025821A1 (en) * 2006-08-30 2008-03-06 Cellzome Limited Triazole derivatives as kinase inhibitors
WO2009017954A1 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 Phenomix Corporation Inhibitors of jak2 kinase

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2228451T3 (en) 1999-01-29 2005-04-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROMOTERS OF CONDROGENESIS AND DERIVATIVES OF INDOLIN-2-ONA.
EP1391211A1 (en) 2001-04-27 2004-02-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Chondrogenesis promoters
US6514989B1 (en) * 2001-07-20 2003-02-04 Hoffmann-La Roche Inc. Aromatic and heteroaromatic substituted 1,2,4-triazolo pyridine derivatives
CA2487679A1 (en) * 2002-05-30 2003-12-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of jak and cdk2 protein kinases
WO2004072072A1 (en) 2003-02-14 2004-08-26 Pfizer Products Inc. Triazolo-pyridines as anti-inflammatory compounds
US20050222171A1 (en) * 2004-01-22 2005-10-06 Guido Bold Organic compounds
EP2386856B1 (en) 2004-06-21 2013-07-24 Galapagos N.V. Methods and means for treatment of osteoarthritis
MX2007002050A (en) 2004-08-18 2007-03-29 Pharmacia & Upjohn Co Llc Triazolopyridine compounds.
WO2006038116A2 (en) 2004-10-07 2006-04-13 Warner-Lambert Company Llc Triazolopyridine derivatives as antibacterial agents
GB0515026D0 (en) 2005-07-21 2005-08-31 Novartis Ag Organic compounds
WO2008150015A1 (en) 2007-06-05 2008-12-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterobicyclic compounds as kinase inhibitors
CN101801966A (en) 2007-07-18 2010-08-11 诺瓦提斯公司 Bicyclic heteroaryl compounds and their use as kinase inhibitors
EP2181112A1 (en) 2007-08-31 2010-05-05 Merck Serono S.A. Triazolopyridine compounds and their use as ask inhibitors
GB0719803D0 (en) * 2007-10-10 2007-11-21 Cancer Rec Tech Ltd Therapeutic compounds and their use
US20090217316A1 (en) * 2008-02-22 2009-08-27 Binita Gupta Systems and Methods for Advertising Insertion Notification in a Real-Time Streaming Media Service
PE20110063A1 (en) 2008-06-20 2011-02-16 Genentech Inc DERIVATIVES OF [1, 2, 4] TRIAZOLO [1, 5-a] PYRIDINE AS JAK INHIBITORS
WO2010010187A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Galapagos Nv Novel compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
WO2010010184A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Galapagos Nv [1, 2, 4] triazolo [1, 5-a] pyridines as jak inhibitors
WO2010010189A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Galapagos Nv Novel compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
WO2010010188A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Galapagos Nv Novel compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases.
JO3041B1 (en) * 2008-07-25 2016-09-05 Galapagos Nv Novel compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
WO2010010186A1 (en) * 2008-07-25 2010-01-28 Galapagos Nv Novel compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
CN102459258B (en) 2009-06-05 2015-11-25 赛福伦公司 The preparation of 1,2,4-triazolo [1,5a] pyridine derivate and purposes
JO3030B1 (en) 2009-06-26 2016-09-05 Galapagos Nv Novel Compound Useful for the Treatment of Degenerative and Inflammatory Diseases
TWI462920B (en) * 2009-06-26 2014-12-01 葛萊伯格有限公司 Novel compound useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008025821A1 (en) * 2006-08-30 2008-03-06 Cellzome Limited Triazole derivatives as kinase inhibitors
WO2009017954A1 (en) * 2007-08-01 2009-02-05 Phenomix Corporation Inhibitors of jak2 kinase

Also Published As

Publication number Publication date
US20150031671A1 (en) 2015-01-29
SI2445912T1 (en) 2014-12-31
ES2634325T3 (en) 2017-09-27
JP2012530767A (en) 2012-12-06
HK1202537A1 (en) 2015-10-02
IL216618A0 (en) 2012-02-29
RS53617B1 (en) 2015-04-30
SG177359A1 (en) 2012-02-28
SMT201400169B (en) 2015-01-15
UY32741A (en) 2011-01-31
EA201270076A1 (en) 2012-08-30
EP2445912B1 (en) 2014-08-13
CA2765988C (en) 2017-08-29
BRPI1014759A2 (en) 2016-04-19
AR077221A1 (en) 2011-08-10
LT2792677T (en) 2017-07-25
US8796457B2 (en) 2014-08-05
HRP20141057T1 (en) 2015-03-13
US9505754B2 (en) 2016-11-29
PL2792677T3 (en) 2017-09-29
EP2792677B1 (en) 2017-04-26
SI2792677T1 (en) 2017-08-31
CA2765988A1 (en) 2010-12-29
DK2445912T3 (en) 2014-11-10
WO2010149771A1 (en) 2010-12-29
HUE034205T2 (en) 2018-01-29
DK2792677T3 (en) 2017-07-10
HRP20171024T1 (en) 2017-10-06
EP2445912A1 (en) 2012-05-02
PT2445912E (en) 2014-11-07
PT2792677T (en) 2017-07-06
ZA201109502B (en) 2012-09-26
DOP2011000378A (en) 2012-02-15
KR20120059487A (en) 2012-06-08
AU2010264635B2 (en) 2015-05-07
MA33447B1 (en) 2012-07-03
TW201103937A (en) 2011-02-01
CN102459261A (en) 2012-05-16
ME01916B (en) 2015-05-20
JP5486084B2 (en) 2014-05-07
CO6491039A2 (en) 2012-07-31
US20100331359A1 (en) 2010-12-30
TWI469981B (en) 2015-01-21
PE20120494A1 (en) 2012-05-17
AU2010264635A1 (en) 2011-12-22
PL2445912T3 (en) 2015-02-27
CL2011003276A1 (en) 2012-08-31
HK1168098A1 (en) 2012-12-21
CY1119711T1 (en) 2018-06-27
IL216618A (en) 2014-09-30
NZ596836A (en) 2013-02-22
CN102459261B (en) 2014-11-05
CR20110673A (en) 2012-02-09
JO3030B1 (en) 2016-09-05
KR101712561B1 (en) 2017-03-06
EP2792677A1 (en) 2014-10-22
ES2519170T3 (en) 2014-11-06
MX2011013451A (en) 2012-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020111B1 (en) CYCLOPROPANECARBOXYLIC ACID {5-[4-(3,3-DIMETYL-AZETIDINE-l-CARBONYL)PHENYL]-[l,2,4]TRIAZOLO[l,5-a]PYRIDIN-2-YL}AMIDE
US12042498B2 (en) Compound useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
ES2899581T3 (en) Compounds and methods for the modulation of kinases and indications for these
EA024743B1 (en) Compound useful for the treatment of degenerative and inflammatory conditions
US10519148B2 (en) Acrylic acid derivative, preparation method and use in medicine thereof
EA018080B1 (en) Compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
KR102078069B1 (en) Aminotriazolopyridine for use in the treatment of inflammation, and pharmaceutical compositions thereof
EA032596B1 (en) Salts, method for preparing same and use thereof for the treatment of inflammatory disorders
PT2663564E (en) Imidazo[4,5-c]quinolin-2-one compound and its use as pi3 kinase / mtor dual inhibitor
US20130217722A1 (en) Novel compound useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
EA029827B1 (en) Benzimidazole derivatives and pharmaceutical compositions thereof for the treatment of inflammatory disorders
US20140213576A1 (en) Novel compound useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases
CN112789281A (en) Tert-butyl (S) -2- (4- (phenyl) -6H-thieno [3,2-f ] [1,2,4] triazolo [4,3-a ] [1, 4] diazepin-6-yl) acetate derivatives and related compounds as bromodomain BRD4 inhibitors for the treatment of cancer
EA041895B1 (en) NEW SALTS AND THEIR PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASES

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ MD RU

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY KG TJ TM