EA018935B1

EA018935B1 - Нуклеозидный ингибитор для вгс (hcv)

Info

Publication number: EA018935B1
Application number: EA200970358A
Authority: EA
Inventors: Нильс-Гуннар Йоханссон; Генадий Калаянов; Джозеф Армстронг Мартин; Дэвид Бернард Смит; Анна Винквист
Original assignee: Медивир Аб; ЯНССЕН ПРОДАКТС, Эл.Пи.
Priority date: 2006-10-10
Filing date: 2007-10-04
Publication date: 2013-11-29
Also published as: CN101979397A; US7825239B2; US8158779B2; CA2665049A1; IL197907A0; ES2392948T3; MY145314A; EP2084175B1; HK1154247A1; US7935681B2; WO2008043704A1; BRPI0719258A2; DK2084175T3; US7666856B2; ZA200902496B; CR10789A; HN2009000614A; CA2665049C; JP2010505902A; CN101573370B

Abstract

4-Амино-1-((2R,3S,4S,5R)-5-азидо-4-гидрокси-5-гидроксиметил-3-метилтетрагидрофуран-2-ил)-1Н-пиримидин-2-он (22) представляет собой ингибитор полимеразы вируса гепатита С (ВГС/HCV). Также раскрыты композиции и способы ингибирования ВГС и лечения заболеваний, опосредованных ВГС, способы изготовления соединений и синтетических промежуточных продуктов, использованных в осуществлении способа.

Description

Данное изобретение относится к нуклеозидным соединениям и некоторым их производным, которые являются ингибиторами РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса. Данные соединения представляют собой ингибиторы РНК-зависимой репликации РНК вируса и применимы для лечения РНК-зависимой РНК вирусной инфекции. Они особенно применимы в качестве ингибиторов Ν85Β полимеразы вируса гепатита С ВГС (НСУ), в качестве ингибиторов репликации ВГС и для лечения инфекции гепатита С.

Соединение относится к нуклеозидным ингибиторам репликации РНК репликона ВГС. В частности, изобретение связано с применением пиримидиновых нуклеозидных соединений в качестве ингибиторов субгеномной репликации РНК ВГС и фармацевтических композиций, содержащих указанные соединения.

Вирус гепатита С является главной причиной хронического заболевания печени во всем мире. (Воуег, Ν. е( а1. 1. Нера1о1. 2000 32:98-112). Пациенты, инфицированные посредством ВГС, представляют собой группу риска по развитию цирроза печени и последующей гепатоцеллюларной карциномы и, следовательно, ВГС является главным указанием для трансплантации печени.

ВГС был классифицирован как представитель семейства вирусов Науцзпбае. которое включает род флавивирусов, пестивирусов и гепацивирусов, из которых последний включает вирусы гепатита С (КГсе С.М., ИауМпбае: ТНе уйикек апб 1Не1г герНсаНоп, ίη: Ие1б8 Уйо1оду, Ебйога: Ие1б8, Β.Ν., Кпре, Ό.Μ., апб Но^1еу, Ρ.Μ., Ырртсои-Рауеп РиЬйкйегк, РЫ1абе1рЫа, Ра., СНар1ег 30, 931-959, 1996). ВГС представляет собой вирус в оболочке, содержащий геном однонитевой РНК положительной полярности из приблизительно 9,4 т.п.н. Вирусный геном состоит из 5'-нетранслируемой области (ИТК.), длинной открытой рамки считывания, кодирующей полипротеиновый предшественник из приблизительно 3011 аминокислот, и короткой 3' ИТК. 5' иТР является самой высокосохраняемой частью генома ВГС и важна для начала и контроля полипротеиновой трансляции.

Генетический анализ НСУ идентифицировал шесть главных генотипов, которые отличаются более чем 30% последовательности ДНК. Было произведено различение более чем 30 подтипов. В США приблизительно 70% инфицированных индивидуумов имеют инфекцию типа 1а и 1Ь. Тип 1Ь является самым преобладающим подтипом в Азии. (X. Еотпк апб 1. ВикН, Сйшск ίη Ьтует О|5еа5е 1999 3:693-716; 1. ВикН е( а1., Бетт Είν. Όίδ. 1995 15:41-63). К сожалению, инфекции типа 1 являются более устойчивыми к терапии, чем типа 2 или генотипов 3 (Ν.Ν. 2ет, С1т М1сгоЬю1. Реу., 2000 13:223-235).

Вирусные структурные белки включают нуклеокапсидный кор-белок (С) и два оболочечных гликопротеида, Е1 и Е2. ВГС также кодирует две протеазы, цинкзависимую металлопротеиназу, кодированную №2-ЫБ3 областью, и серинпротеазу, кодированную в ХБ3 области. Данные протеазы требуются для расщепления определенных областей предшественника-полипротеина в настоящие пептиды. Карбоксильная половина неструктурного белка 5, №5В, содержит РНК-зависимую РНК полимеразу. Функция остальных неструктурных белков, ХБ4А и ХБ4В, и функция ХБ5А (аминоконцевая половина неструктурного белка 5) остаются неизвестными. Предполагают, что большинство неструктурных белков, кодированных посредством РНК генома ВГС, включены в репликацию РНК.

В настоящее время имеется ограниченное число апробированных терапий, доступных для лечения ВГС инфекции. Новые и существующие терапевтические подходы к лечению ВГС и ингибированию Ж5В полимеразы ВГС рассмотрены в публикациях: Р.С. ΟίδΗ, Бет. Ьтует. Όίδ., 1999 19:5; Όί Векседйе, А.М. апб Васоп, В.Р., БаепбПс Атепсап, ОсЮЬег: 1999 80-85; О. Баке-Вякаат, СиггеШ апб ЕиФте ТНегару Гог Сйтошс НераЙ18 С У1Ш8 Ьтует П18еа8е, Сигг. Эгид Тагд. 1пГес( Όίδ. 2003 3(3):247-253; Р. НоГГтапп с! а1., Ресеп1 ра1еп(5 оп ехрептеп1а1 (Негару Гог НераШБ С νίπΐδ тГесйоп (1999-2002), Ехр. Орт ТНег. Ра1еп15 2003 13 (11):1707-1723; М.Р. \Уа1кег е( а1., Ртотшпд Сапб1ба1е8 Гог (Не 1геа1теп1 оГ сктотс йерабШ С, Ехр. Орт. 1пуе5Йпд. Эгидх 2003 12(8):1269-1280; Б.-Ь. Тап е( а1., НераШБ С Тйегареибск: Сиггеп! Б1а1из апб Етегдтд Б1га1ед1е8, №1Шге Вех. Эгид ЭБсом 2002 1:867-881.

НО он

1а: Β. = €<=Ο)ΝΗ, 1Ь: Ρ α ΝΗ-)ΝΗ,

Рибавирин (1а; амид 1-((2К,3К,4Б,5К)-3,4-дигидрокси-5-гидроксиметилтетрагидрофуран-2-ил)-1Н[1,2,4]триазол-3-карбоновой кислоты; виразол) представляет собой неинтерферон-индуцирующий противовирусный нуклеозидный аналог широкого спектра. Рибавирин обладает активностью ш У1(го против некоторых ДНК и РНК вирусов, включающих ИауМпбае (Оату Ь. Όην^, Са51гоеп1его1оду 2000 118:Б104Б114). При монотерапии рибавирин снижает сывороточные уровни аминотрансферазы до нормальных у 40% пациентов, но он не снижает сывороточных уровней ВГС-РНК. Рибавирин также проявляет значительную токсичность и, как известно, снижает анемию. Вирамидин 1Ь является пролекарством, превращаемым в 1а в гепатоцитах.

Интерфероны (ΙΕΝδ) использовались для лечения хронического гепатита в течение почти десяти

- 1 018935 лет. ΙΕ№ представляют собой гликопротеиды, производимые иммунными клетками в ответ на вирусную инфекцию. Рассматривают два разных типа интерферонов: тип 1 включает несколько интерферонов α'δ и один интерферон β, тип 2 включает интерферон γ. Интерфероны типа 1 производятся главным образом инфицированными клетками и защищают соседние клетки от новой (йе ηονο) инфекции. ΙΕΝδ ингибируют вирусную репликацию многих вирусов, включая ВГС, и при применении в качестве единственного лечения против инфекции гепатита С ΙΡΝ подавляет сывороточную ВГС-РНК до неопределяемых уровней. Кроме того, ΙΡΝ нормализует сывороточные уровни аминотрансферазы. К сожалению, эффекты ΙΡΝ являются временными. Прекращение терапии дает 70% показатель рецидивов, и только 10-15% проявляют длительный вирологический ответ с нормальными сывороточными уровнями аланинтрансферазы. (Ь.-В. Όανίδ, см. выше).

Одно ограничение ранней ΙΡΝ терапии состояло в быстром выведении белка из крови. Получение химических производных ΙΡΝ с полиэтиленгликолем (РЕО) привело к белкам с существенно улучшенными фармакокинетическими свойствами. ΡΕΟΆ8Υ8® представляет собой сопряженный интерферон α2а и 40 ΕΏ разветвленный монометокси-РЕО, и РЕО-ΙΝΤΚΟΝ® представляет собой конъюгат интерферона а-2Ь и 12 кЭ монометокси-РЕО. (В.А. Ьихоп е! а1., Ο1ίη. Тйетар. 2002 24 (9):1363-1383; А. Κοζ1ο\ν51<ί апй ЕМ. Наттщ, 1. Οοηίτοί. К.е1еа§е, 2001 72:217-224).

Комбинированная терапия в отношении ВГС с рибавирином и α-интерфероном в настоящее время представляет собой оптимальную терапию. Объединение рибавирина и РЕО-ΙΕΝ (см. ниже) дает пролонгированный ответ на вирус у 54-56% пациентов. 8УК. приближается к 80% для типа 2 и 3 ВГС. (\Ма11<ег, см. выше). К сожалению, комбинация также дает побочные эффекты, которые ставят клинические проблемы. Депрессия, симптомы, подобные симптомам гриппа, и кожные реакции связаны с подкожным ΙΕΝ-α, и гемолитическая анемия связана с продолжительным лечением рибавирином.

В последующем был идентифицирован ряд потенциальных молекулярных мишеней для разработки лекарственных средств в качестве терапии против ВГС, включающих, но без ограничения только ими, Ν82-Ν83 аутопротеазу, Ν3 протеазу, Ν3 хеликазу и Ν85Β полимеразу. РНК-зависимая РНК полимераза является, безусловно, основной для репликации генома однонитевой РНК положительной полярности. Данный фермент вызвал значительный интерес среди химиков, связанных с медициной.

Как нуклеозидные, так и ненуклеозидные ингибиторы Ν85Β известны.

Нуклеозидные ингибиторы могут действовать либо как прерыватель цепи, либо как конкурирующий ингибитор, который препятствует присоединению нуклеотида к полимеразе. Для функционирования в качестве прерывателя цепи нуклеозидный аналог должен поглощаться клеткой и превращаться ίη νίνο в трифосфат, чтобы конкурировать за полимеразный нуклеотидный связывающий сайт. Данная конверсия в трифосфат обычно опосредована клеточными киназами, которая диктует дополнительные структурные требования к потенциальному нуклеозидному ингибитору полимеразы. Кроме того, это ограничивает прямую оценку нуклеозидов как ингибиторов репликации ВГС по анализу на клетках, допускающему фосфорилирование ίη δίΐιτ

В документе \¥О 0190121, опубликованном 29 ноября 2001 г., 1.-Р. %ηηι;ιώ8Μ и Р. КатоНа раскрывают и показывают анти-ВГС полимеразную активность 1'-алкил- и 2'-алкилнуклеозидов формул 2 и 3. В документе \¥О 01/92282, опубликованном 6 декабря 2001 г., 1-Р. 5οηιηι;^ο8Μ и Р. КатоНа раскрывают и показывают лечение против флавивирусов и пестивирусов 1'-алкил- и 2'-алкилнуклеозидами формул 2 и 3. В документах \¥О 03/026675 и \УО 03/026589 - оба опубликованы 3 апреля 2003 г., О. Οο§^1ίη е! а1. раскрывают 4'-алкилнуклеозиды 4 и методы применения 4'-алкилнуклеозидов для лечения против флавивирусов и пестивирусов. В документах \¥О 2004003000 и \УО 2004002999 - оба опубликованы 8 января 2004 г., 1-Р. 5οηιηι;^ο8Μ е! а1. раскрывают пролекарства 1'-, 2'-, 3'- и 4'-замещенных β-Ό и β-Ь нуклеозидов. В документе \¥О 04/002422, опубликованном 8 января 2004 г., 1.-Р. %ηη·Μο$Μ е! а1. раскрывают 3'-О-Ь-валиновый сложный эфир 2'-С-метилрибофуранозил цитидина и его применение в лечении против ВГС.

Фирма Шешх опубликовала клинические опыты по родственному соединению ΝΜ283, которое представляет собой валиновый сложный эфир 5 цитидинового аналога 2 (В=цитозин). Кроме того, Шегах Рйаттасеийсак, ЬШ. также раскрывает в документе \¥О 04/046331 мутации Р1ау1У1Г1Йае. вызванные биологически активными 2'-разветвленными β-Ό или β-Ь нуклеозидами или их фармацевтически приемлемой солью или пролекарством.

но он но он но он

ЕРг

3 4

В=аденин, тимидин, урацил, цитидин, гуанин и гипоксантин.

- 2 018935

В документе \¥О 02/057425, опубликованном 25 июля 2002 г., 8.8. Сагго11 е! а1. раскрывают нуклеозидные ингибиторы РНК-зависимой РНК полимеразы, где карбогидратная субъединица химически модифицирована. В документе \¥О 02/05787, опубликованном 25 июля 2002 г., 8.8. Сагго11 е! а1. раскрывают производные, родственные 2а-метил и 2в-метилрибозе, в которых основа представляет собой необязательно замещенный 7Н-пирроло[2,3-б]пиримидиновый радикал 6. Та же заявка раскрывает один пример 3βметилнуклеозида. 8.8. Сагго11 е! а1. (1. Бю1. Сйет. 2003 278(14):11979-11984) раскрывают ингибирование полимеразы ВГС посредством 2'-О-метилцитидина (6а). В документе и.8. РиЬбсабои № 2004/0259934, опубликованном 23 декабря 2004 г., Э.В. О1кеи е! а1. раскрывают методы ингибирования репликации вируса Сотоиаушбае и лечения инфекции вируса Сотоиаушбае нуклеозидными соединениями.

В документе \¥О 02/100415, опубликованном 19 декабря 2002 г. (И8 2003/0236216 А1), К.К. Эемок е! а1. раскрывают 4'-замещенные нуклеозидные производные, которые проявляют активность против ВГС. Четыре соединения, идентифицированные подробно, включают 4'-азидосоединение 7а, 4'этинилсоединение 7Ь, 4'-этоксисоединение 7с и 4'-ацетилсоединение 7б. Представленные модификации группировки рибозы включают 2'-деоксипроизводное 8а, 3'-деоксипроизводное 8Ь, 3'-метоксипроизводное 8е, 3'-фторпроизводное 8с и 2',2'-дифторпроизводное 8б. В документе \¥О 2004/046159, опубликованном 3 июня 2004 г. (И8 2004121980), 1.А. Матйи е! а1. раскрывают пролекарства 7а, применимые для лечения заболеваний, опосредованных ВГС. Обе заявки США включены в описание ссылкой в полном объеме.

7а:	Κ=Ν₃	8а:	К¹⁼ОН, К²=Й³=К⁴=Н
7Ь:	К=этинил	8Ь:	В.--ОН, К¹=К²=Е⁴=Н
7с:	К=ОЕЬ	8с:	К²=ОН, К²=Г,
7ύ:	В=С(=0)Ме	8ά:	ε^χ=ε²=η, к³=к’=р
		8е:	К¹⁼ОМе, Е³=ОН, Й²=В⁴=Н

Заявка США № 10/167106, зарегистрированная 11 июня 2002 г. под заголовком 4'-8иЬкй!и!еб Νυс1еомбе ЭепуаНуек ак 1пЬ1Ь1!отк о! НСУ ΚΝΑ Кер1юа!юи, и заявка США № 10/717260, зарегистрированная 19 ноября 2003 г., раскрывают соединения, родственные данному изобретению. Обе заявки включены в настоящее описание в полном объеме в качестве ссылки.

Υ.-Н. Уии е! а1. (Атсй. Рйатт. Кек. 1985 18 (5): 364-35) раскрывают синтез и противовирусную активность 4'-азидо-2'-деокси-2'-фторарабинофуранозилнуклеозидов (9: К=Н, Ме и С1).

10 П

Владении, урацил, тимин

6.8. 1еои апб V. №п (Те!гайебтоп 1996 52 (39):12643-50) раскрывают синтез 4'-азидометил-2',3'деоксирибонуклеозидов 10 (В=аденин, тимин и урацил) как ингибиторов обратной транскриптазы ВГС.

Было опубликовано несколько расчетных исследований 4'-азидонуклеозидов: Ό. 6аБк!ео е! а1., 1.

Мо1. 8!гис!. 1996 384 (1):25-33; 1. Рере е! а1., Еиг. 1. Меб. Сйет. 1996 32 (10):775-786: Е. ЕкКаба е! а1., 1и кШсо к!иб1ек 1о\уагб 1Пе бщсоуету о! Νον Аи!1 Н1У МШеомбе. 1. Сйет. 1п&. Сотр. 8а. 2002 42 (5):11941203.

- 3 018935

I. 8идшю1о е! а1. раскрыли синтез и ВГС и Н. 8ипр1ех биоанализ 4'-этинил-2'-деоксицитидина (11) и других заместителей с двумя атомами углерода в 4'-положении (М.1с1ео81бе8 аиб №.1с1еойбе8. 183. 8уп!1е818 о£ 4'-(3-Вгапс11сб Тйут1бше8 аз а Νο\ν Туре о£ Αηΐίνίταί Адеп!, Вюотд. Меб. С1ет. Бей. 1999 9:385-88). Т. Ааба е! а1. (М.1с1ео81бе8 апб №.1с1еоббе8 1996 15 (1-3):287-304) раскрывают синтез и активность против ВГС 4'-С-метилнуклеозидов.

В документе АО 01/32153, опубликованном 10 мая 2001 г., В. 8!огег раскрывают методы лечения или профилактики вирусной инфекции от представителей семейства Р^Мпбае введением диоксолановых аналогов нуклеозидов. В документе АО 02/18404, опубликованном 7 марта 2002 г., В. Эето8 е! а1. раскрывают новые и известные пуриновые и пиримидиновые нуклеозидные производные и их применение в качестве ингибиторов субгеномной репликации ВГС и фармацевтические композиции, содержащие указанные нуклеозидные производные. Раскрытые соединения состоят из нуклеозидов с замещенными пуриновыми и пиримидиновыми основаниями.

ЕРА №. 0352248 раскрывает широкий класс Ь-рибофуранозилпуриновых нуклеозидов для лечения ВГС, герпеса и гепатита. Такое же описание изобретения находится в заявке АО 88/09001, поданной фирмой АВПеЬо 1аде1 А8!га.

К. Кйапо е! а1. (Те!тайебгоп 1997 53 (39):13315-13322) раскрывает синтез 4'-фторметил-2-деокси-Ээритро-, рибо- и арабино-пентофуранозилцитозинов и противоопухолевую активность.

Ненуклеозидные аллостерические ингибиторы обратной транскриптазы ВГС проявили эффективную терапию сами по себе и в комбинации с нуклеозидными ингибиторами и с ингибиторами протеазы. Были описаны некоторые классы ненуклеозидных ингибиторов Ν85Β ВГС и в настоящее время находятся на разных стадиях разработки, причем они включают бензимидазолы, (Н. На81шпо1о е! а1. АО 01/47833, Н. На8Ыто!о е! а1. АО 03/000254, Р.Б. ВеаиИеи е! а1. АО 03/020240 А2; Р.Б. ВеаиИеи е! а1. И8 6448281 В1; Р.Ь. Веаийеи е! а1. АО 03/007945 А1); индолы (Р.Ь. Веаийеи е! а1. АО 03/0010141 А2); бензотиадиазины, например 1 (Ό. Ийапак е! а1. АО 01/85172 А1, зарегистрированная 5/10/2001; Ό. С1ии е! а1., АО 2002098424, зарегистрированная 6/7/2002, Ό. Ийаиак е! а1. АО 03/037262 А2, зарегистрированная 10/28/2002; Кб. ЭиГГу е! а1. АО 03/099801 А1, зарегистрированная 5/23/2003, М.О. Оатсу е! а1. АО 2003059356, зарегистрированная 10/28/2002; Ό. Ски е! а1., АО 2004052312, зарегистрированная 6/24/2004, Ό. Ски е! а1., АО 2004052313, зарегистрированная 12/13/2003; Э.М. Рйсй е! а1., АО 2004058150, зарегистрированная 12/11/2003; И.К. Ни!сЫп8оп е! а1. АО 2005019191, зарегистрированная 8/19/2004; РК. Рга!! е! а1. АО 2004/041818 А1, зарегистрированная 10/31/2003); тиофены, например 2, (С. К. Скап е! а1. АО 02/100851 А2); бензотиофены (Э.С. Уоипд апб Т.В. Вайеу АО 00/18231); βкетопируваты (8. Айатита е! а1. И8 6492423 В1, А. Айатита е! а1. АО 00/06529); пиримидины (С. ОатбеШ е! а1. АО 02/06246 А1); пиримидиндионы (Т.В. Вайеу апб И.С. Уоипд АО 00/13708); триазины (К.-Н. Сйипд е! а1. АО 02/079187 А1); производные роданина (Т.В. Вабеу апб Э.С. Уоипд АО 00/10573, Ю кап е! а1. АО 01/77091 А2); 2,4-диоксопираны (В.А. Боте е! а1. ЕР 256628 А2); фенилаланиновые производные (М. Аапд е! а1. 1. Вю1. С1ет. 2003 278:2489-2495). Тиазины, которые ингибируют №5В ВГС, были раскрыты ЕР. В1аке е! а1. в документе и.8. РиЬ. № 20060040927, зарегистрированном 22 августа 2005 г.

Ингибиторы протеазы ВГС, требуемой для вирусной репликации, также были раскрыты (Р. МсРкее е! а1., Игид8 о£ !1е Ри!иге 2003 28 (5):465-488; Υ.8. Т8ап1пхо8 е! а1., Апде\т. С1ет. 1п!. Еб. Епд. 2003 42 (12): 1356-1360). Нуклеозидное соединение данного изобретения можно применять в комбинации с этими и другими ингибиторами полимеразы и протеазы.

Результаты этих попыток были рассмотрены (ΕΖ. С1еп апб Ζ. Нопд, Татдейпд №5В ^А-Эерепбеп1 ВNΑ Ро1утега8е £от Апй-НСУ СйетоШетару, Сигг. Эгид Тагд. 1пР. И18. 2003 3(3): 207-219). Ненуклеозидные ингибиторы не имеют отношения к данному изобретению.

Цель данного изобретения состоит в том, чтобы предложить новые нуклеозидные соединения, способы и композиции для лечения хозяина, инфицированного вирусом гепатита С.

В настоящее время отсутствует профилактическая обработка вируса гепатита С (ВГС), и принятые в настоящее время терапии, которые существуют только против ВГС, являются ограниченными. Создание и разработка новых фармацевтических соединений является важной.

Неожиданно было установлено, что 2'-деокси-2'-в-метил-4'-азидоцитидин или его сложные эфиры применимы в лечении против ВГС и проявляют меньшую токсичность после введения хозяину. Данное изобретение также относится к фармацевтическим композициям из соединения и по меньшей мере одно

- 4 018935 го фармацевтически приемлемого носителя, эксципиента или разбавителя.

Комбинированная терапия оказалась полезной для лечения вирусного заболевания и новых соединений, синергистических с другой принятой и исследованной терапией против ВГС, и данное изобретение относится к обработке ВГС нуклеозидами общей формулы, раскрытой выше, или фармацевтически приемлемой солью в комбинации или чередованием с одним или несколькими другим(и) эффективным(и) противовирусным(и) средством(ами) или иммуномодуляторами, необязательно включающими по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.

Данное изобретение относится к нуклеозиду формулы I или его фармацевтически приемлемой соли и к применению таких соединений для лечения хозяина, инфицированного посредством ВГС, где В¹ представляет собой водород;

В² и В³ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, СОВ⁴ и С(=О)СНВ⁵ХНВ⁶; или В¹ и

В³ означают Н и В² представляет собой монофосфатный, дифосфатный или трифосфатный сложный эфир;

В⁴ независимо выбран из группы, состоящей из С_1-10 неразветвленного или разветвленного алкила;

В⁵ представляет собой изопропил, изобутил или втор-бутил;

В⁶ представляет собой водород;

или его фармацевтически приемлемые соли.

В предпочтительном варианте изобретение относится к соединению, в котором каждый В¹, В² и В³представляют собой водород.

В более предпочтительном варианте изобретение относится к соединению, в котором В¹ представляет собой водород, В² и В³ представляют собой СОВ⁴ и В⁴ представляет собой неразветвленный или разветвленный С_1-10алкил или его фармацевтически приемлемые соли.

В еще более предпочтительном варианте изобретение относится к соединению, в котором В⁴ выбран из метила, этила, изопропила или трет-бутила или его фармацевтически приемлемые соли.

В наиболее предпочтительном варианте изобретение относится к 3',5'-О-бис(изобутирил)-4'-азидо2'-в-С-метил-2'-деоксицитидину.

В другом варианте изобретение относится к соединению, в котором В³ представляет собой водород или С(=О)СНВ⁵ХНВ⁶В¹, и В² представляет собой С(=О)СНВ⁵1ХНВ⁶

В предпочтительном варианте изобретение относится к соединению, в котором В⁵ представляет собой изопропил, изобутил или вторбутил.

В более предпочтительном варианте изобретение относится к соединению, в котором В⁵ имеет стереохимию Ь-аминокислоты.

В наиболее предпочтительном варианте изобретение относится к соединению, выбранному из группы, состоящей из

3',5'-О-бис(изобутирил)-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидина,

3',5'-О-бис(Ь-валинил)-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидина,

4'-азидо-3'-О-(Ь-валинил)-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидина,

4'-азидо-3'-О-изобутирил-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидина,

5'-О-(Ь-валинил)-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидина,

5'-О-изобутирил-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидина;

или его фармацевтически приемлемая соль.

Данное изобретение также относится к применению соединения формулы I или фармацевтически приемлемой соли, необязательно, в комбинации с другим эффективным противовирусным средством(ами) и необязательно с включением по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого носителя, эксципиента или разбавителя для лечения инфекции ВГС в изготовлении лекарственного средства для лечения и профилактики ВГС у хозяина.

В предпочтительном варианте изобретение относится к применению соединения формулы I для лечения или приготовления лекарственного средства для лечения заболевания, опосредованного вирусом гепатита С (ВГС).

Без привлечения теории предполагают, что соединения по изобретению последовательно фосфорилируются в клетках человека киназами до 5'-О-монофосфата, 5'-О-дифосфата и, в конечном счете, до 5'О-трифосфата, который представляет собой активный против вируса метаболит. Следующий аспект изобретения, следовательно, относится к этим 5'-О-фосфорилированным видам, т.е. к соединениям формулы I, в которой В¹ и В³ означают Н и В² представляет собой монофосфатный, дифосфатный или трифосфат

- 5 018935 ный сложный эфир.

Противовирусная активность нуклеозидного ингибитора обычно представляет собой совместный результат поглощения нуклеозида в клетки хозяина, превращения нуклеозида в активный трифосфат, внутриклеточной устойчивости трифосфата и способности трифосфата влиять на активность синтеза РНК вирусной полимеразы. Как представлено в биологических примерах ниже, соединения изобретения легко фосфорилируются ίη νίνο до активного трифосфата и имеют долгий период полураспада внутриклеточного трифосфата, тем самым допускают пролонгированные и высокие концентрации продуктов, активных против вирусов.

II. Фармацевтическая композиция ингибирующая вирус гепатита С, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по п.1, и остаток, содержащий по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.

В другом варианте осуществления данного изобретения предлагается фармацевтическая композиция, ингибирующая вирус гепатита С, содержащая терапевтически эффективное количество соединения формулы I, и остаток, содержащий а) по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и Ь) по меньшей мере один модулятор иммунной системы и/или по меньшей мере одно противовирусное средство, которое ингибирует репликацию ВГС.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения предлагается фармацевтическая композиция, представляющая собой прессованную таблетку массой 500-1500 мг, содержащую 35-75 мас.% соединения формулы I, в которой К¹, В², В³, В⁴, В⁵ и В⁶ принимают значения, определенные в настоящем описании выше; или его фармацевтически приемлемую соль, и остаток, включающий по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.

В другом варианте осуществления данного изобретения предлагается фармацевтическая композиция, представляющая собой прессованную таблетку массой 500-1500 мг, содержащую 40-60 мас.% соединения формулы I, в которой В¹, В², В³, В⁴, В⁵ и В⁶ принимают значения, определенные в настоящем описании выше; или его фармацевтически приемлемую соль, и остаток, включающий по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.

Фраза определенные/как определено в настоящем описании выше относится к первому определению для каждой группы, данной в определении формулы I.

Термины необязательный или необязательно, как используются в настоящем описании, означают, что описанное явление или обстоятельство может происходить или не происходить и что данное описание включает примеры, где указанное явление или обстоятельство имеет место, и примеры, в которых оно отсутствует. Например, необязательно замещенный фенил означает, что фенил может быть или может не быть замещенным и что описание включает как незамещенный фенил, так и фенил, где есть замещение.

Соединения данного изобретения могут иметь асимметрические центры на боковой цепи сложного карбоксильного эфира, амида или карбонатной группировки, которые образуют диастереомеры при присоединении к нуклеозиду. Все стереоизомеры боковой цепи соединений данного рассматриваемого изобретения обсуждены как в смесях, так и в чистом или в основном в чистом виде. Определение соединений согласно изобретению охватывает все как выделенные оптические изомерные энантиомеры, так и их смеси, включающие рацемическую форму. Чистый оптический изомер можно приготовить стереоспецифическим синтезом из α-Ό-рибозы, или рацемическую форму можно разделить физическими методами, такими как, например, фракционированная кристаллизация, отделение или кристаллизация диастереомерных производных или отделение хиральной колоночной хроматографией. Отдельно взятые оптические изомеры можно получить из рацематов обычными методами, такими как, например, образование соли с оптически активной кислотой с последующей кристаллизацией.

Термин алкил, как используется в настоящем описании, означает углеводородный остаток с неразветвленной или разветвленной цепью, содержащий от 1 до 18 атомов углерода. Термин низший алкил означает углеводородный остаток с неразветвленной или разветвленной цепью, содержащий от 1 до 6 атомов углерода. Иллюстративные группы с низшим алкилом включают метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, грет-бутил или пентил.

Когда термин алкил использован как суффикс после другого термина, как в фенилалкиле или гидроксиалкиле, это предназначено для отсылки к алкильной группе, определенной выше, которая замещена одним-двумя заместителями, выбираемыми из другой конкретно названной группы. Таким образом, например, фенилалкил относится к алкильной группе, имеющей один-два фенильных заместителя, и, таким образом, включает бензил, фенилэтил и бифенил. Алкиламиноалкил представляет собой алкильную группу, имеющую один-два алкиламиновых заместителя.

Термин галогеналкил, как используется в настоящем описании, означает алкильную группу с неразветвленной или разветвленной цепью, определенную выше, в которой 1, 2, 3 или более атомов водорода замещены галогеном. Примеры представляют собой 1-фторметил, 1-хлорметил, 1-бромметил, 1иодметил, трифторметил, трихлорметил, трибромметил, трииодметил, 1-фторэтил, 1-хлорэтил, 1бромэтил, 1-иодэтил, 2-фторэтил, 2-хлорэтил, 2-бромэтил, 2-иодэтил, 2,2-дихлорэтил, 3-бромпропил или 2,2,2-трифторэтил.

- 6 018935

Термин циклоалкил, как используется в настоящем описании, означает насыщенное карбоциклическое кольцо, содержащее 3-8 атомов углерода, т.е. циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил или циклооктил.

Термин циклоалкилалкил, как используется в настоящем описании, относится к радикалу В'В''-, в котором В' представляет собой циклоалкильный радикал, определенный в настоящем описании, и В представляет собой алкиленовый радикал, определенный в настоящем описании, с пониманием того, что точка присоединения циклоалкилалкильной группировки будет находиться на алкиленовом радикале. Примеры циклоалкилалкильных радикалов включают, но без ограничения только ими, циклопропилметил, циклогексилметил, циклопентилэтил. С_3-7циклоалкил-С1_-3алкил относится к радикалу В'В'', где В' представляет собой С_3-7циклоалкил и В'' представляет собой алкиленовый радикал, определенный в настоящем описании.

Термин алкилен, как используется в настоящем описании, означает дивалентный насыщенный нормальный углеводородный радикал из 1-8 атомов углерода или разветвленный насыщенный дивалентный углеводородный радикал из 3-8 атомов углерода, если не указано иное. Примеры алкиленовых радикалов включают, но без ограничения только ими, метилен, этилен, пропилен, 2-метилпропилен, бутилен, 2-этилбутилен.

Термин алкенил, как используется в настоящем описании, означает незамещенный [или замещенный] углеводородный цепочечный радикал, имеющий от 2 до 18 атомов углерода, предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода, и имеющий одну или две олефиновые двойные связи, предпочтительно одну олефиновую двойную связь. Примеры представляют собой винил, 1-пропенил, 2-пропенил (аллил) или 2бутенил (кротил).

Термин алкинил, как используется в настоящем описании, означает незамещенный углеводородный цепочечный радикал, имеющий от 2 до 18 атомов углерода [предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода] и имеющий одну или, где возможно, две тройные связи [предпочтительно одну тройную связь]. Примеры представляют собой этинил, 1-пропинил, 2-пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил или 3-бутинил.

Термин алкокси, как используется в настоящем описании, означает алкоксигруппу с ненасыщенной неразветвленной или разветвленной цепью, где алкильная часть принимает значения, как определено выше, а именно метокси, этокси, н-пропилокси, изопропилокси, н-бутилокси, изобутилокси, третбутилокси, пентилокси, гексилокси, гептилокси, включая их изомеры. Низшая алкокси, как используется в настоящем описании, означает алкоксигруппу с низшей алкильной группой, определенной ранее.

Термин алкилтио или тиоалкил, как используется в настоящем описании, означает (алкил)8группу, в которой алкильная часть принимает значения, как определено выше. Примеры представляют собой метилтио, этилтио, н-пропилтио, изопропилтио, н-бутилтио, изобутилтио или трет-бутилтио.

Термины алкилсульфинил или арилсульфинил, как используются в настоящем описании, означают группу формулы -8(=О)В, в которой В представляет собой алкил или арил соответственно, и алкил и арил принимают значения, определенные в настоящем описании.

Термины алкилсульфонил или арилсульфонил, как используются в настоящем описании, означают группу формулы -8(=О)₂В, в которой В представляет собой алкил или арил соответственно, и алкил и арил принимают значения, определенные в настоящем описании.

Термин арил, как используется в настоящем описании, означает необязательно замещенную моноциклическую или полициклическую ароматическую группу, содержащую атомы углерода и водорода. Примеры подходящих арильных групп включают, но без ограничения только ими, фенил и нафтил (например, 1-нафтил или 2-нафтил). Подходящие заместители для арила выбраны из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила, арилокси, циклоалкила, ацила, ациламино, алкокси, амино, алкиламино, диалкиламино, галогена, галогеналкила, гидрокси, нитро и циано.

Термин ацил (алкилкарбонил), как используется в настоящем описании, означает группу формулы -С(=О)В, в которой В представляет собой водород, неразветвленный или разветвленный алкил, содержащий 1-7 атомов водорода, или фенильную группу.

Термины алкоксикарбонил и арилоксикарбонил, как используются в настоящем описании, означают группу формулы -С(=О)В, в которой В представляет собой алкил или арил соответственно, и алкил и арил принимают значения, определенные в настоящем описании.

Термин галоген имеет силу для фтора, хлора, брома или иода, предпочтительно для фтора, хлора, брома.

Термин ацилирующий агент, как используется в настоящем описании, относится либо к ангидриду, ацилгалогениду, либо к другому активированному производному карбоновой кислоты. Термин ангидрид, как используется в настоящем описании, относится к соединениям общей формулы ВС(О)-ОС(О)В, где В принимает значения, определенные в предыдущем разделе. Термин ацилгалогенид, как используется в настоящем описании, относится к группе ВС(О)Х, в которой X представляет собой бром или хлор. Термин активированное производное соединения, как используется в настоящем описании, относится к переходной реакционноспособной форме первоначального соединения, которая предоставляет соединение, активное в требуемой химической реакции, в которой первоначальное соединение яв

- 7 018935 ляется только умеренно реакционноспособным или нереакционноспособным. Активация достигается образованием производного или химической группировки внутри молекулы с более высоким содержанием свободной энергии, чем энергия первоначального соединения, и это помогает активированной форме быть более чувствительной к взаимодействию с другим реагентом. В контексте данного изобретения активация карбоксильной группы является особенно важной. Термин ацилирующий агент, как используется в настоящем описании, дополнительно включает реагенты, которые образуют сложные эфиры карбонатов ОС(=О)ОВ⁴, где В⁴ принимает значения, определенные в настоящем описании выше.

Термин защитная группа, как используется в настоящем описании, обозначает химическую группу, которая (а) предохраняет реакционноспособную группу от участия в нежелательной химической реакции и (Ь) может быть легко удалена после того, как защита реакционной группы больше не требуется. Например, триалкилсилил представляет собой защитную группу для первичной гидроксильной функциональной группы и ацетонид представляет собой защитную группу для вицинального диола.

В графическом представлении соединений, раскрытых в этой заявке, связь в виде утолщенного конусообразного клина указывает заместитель, который находится перед плоскостью кольца, которому принадлежит асимметрический углерод (также обозначенный β), и пунктирная конусообразная, имеющая форму клина связь указывает заместитель, который находится за плоскостью кольца, которому принадлежит асимметрический углерод (также обозначенный α).

Термин комбинация или комбинированная терапия, как используется в настоящем описании, относится к введению многих лекарственных средств в лечебную схему одновременным или последовательным внесением лекарственных средств в одно и то же время или в разные периоды времени.

Термин интерферон, полученный химическим путем, как используется в настоящем описании, относится к молекуле интерферона, ковалентно присоединенной к полимеру, который изменяет физические и/или фармакокинетические свойства интерферона. Неограничивающий перечень таких полимеров включает гомополимеры полиалкиленоксида, такие как полиэтиленгликоль (РЕС) и полипропиленгликоль (РРС), полиоксиэтиленированные полиолы, их сополимеры и их блок-сополимеры, при условии, что поддерживается водная растворимость блок-сополимеров. Специалист в данной области будет осведомлен о разных подходах к связыванию полимера и интерферона (например, см. А. Κοζ1ο\ν51<ί аиб ТМ. Натл8 1. Соп1то1. Рс1са5с 2001 72(1-3): 217-24). Неограничивающий перечень химически полученного ΙΕΝα, рассмотренного в данном патенте, включает пегинтерферон-а-2а (РЕСА8У8®) и пегинтерферона-2Ь (РЕСИХ/ТОО).

Соединения формулы Ι проявляют таутомерию. Таутомерные соединения могут существовать в виде двух или более взаимопревращаемых формах. Прототропные таутомеры получаются от миграции ковалентно связанного водородного атома между двумя атомами. Таутомеры обычно существуют в равновесии и попытки выделить отдельно взятые таутомеры обычно дают смесь, химические и физические свойства которой соответствуют смеси соединений. Положение равновесия зависит от химических образований внутри молекулы. Например, во многих алифатических альдегидах и кетонах, таких как ацетальдегид, кетоформа преобладает, в то время как в фенолах преобладает енольная форма. Обычные прототропные таутомеры включают кето/енольные (-С(=О)-СН- -С(-ОН)=СН-), кислотные амид/имидные (-С(=О)-№Н- -ί’(-ΟΗ)=Ν-) и амидиновые (^(=ΝΚ)-ΝΗ- ^(-ΝΗΚ.)=Ν-) таутомеры. Последние два типа особенно свойственны для гетероарильных и гетероциклических колец, и данное изобретение охватывает все таутомерные формы соединений.

Обычно используемые сокращения включают ацетил (Ас), азо-бис-изобутирилнитрил (ΑΙΒΝ), атмосферы (А1т), трет-бутоксикарбонил (Вос), ди-трет-бутилпирокарбонат или Ьос ангидрид (ВОС₂О), бензил (Вп), бутил (Ви), бензилоксикарбонил (ί’ΒΖ или Ζ), карбонилдиимидазол (СОЦ, 1,4диазабицикло[2.2.2]октан (ЭАВСО). 1,5-диазабицикло[4.3.0]нон-5-ен (ΌΒΝ), 1,8-диазабицикло[5.4.0] ундец-7-ен (ΌΒυ), Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид (ОСС), 1,2-дихлорэтан (ОСЕ), дихлорметан (ЭСМ), диэтилазодикарбоксилат (ΌΕΑΌ), диизопропилазодикарбоксилат (ΌΙΑΌ), диизобутилалюминийгидрид (ΌΙΒΑΕ или ΌΙΒΑΕ-Н), диизопропилэтиламин (О1РЕА), Ν,Ν-диметилацетамид (ОМА), 4-Ν,Νдиметиламинопиридин (ОМАР), Ν,Ν-диметилформамид (ДМФА/ОМЕ), диметилсульфоксид (ДМСО/ОМ8О), 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (ЕОСТ этил (Е1), этилацетат (ЕЮАс), этанол (ЕЮН), этиловый эфир 2-этокси-2Н-хинолин-1-карбоновой кислоты (ЕЕОС), диэтиловый эфир (Е1₂О), О-(7-азабензотриазол-1-ил)-Н,Д№,№-тетраметилуроний гексафторфосфатуксусная кислота (НАТи), (НОАс), 1-Ы-гидроксибензотриазол (НΟΒΐ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ/НРЬС), литийгексаметилдисилазан (ЫНМО8), метанол (МеОН), температура плавления (т.пл./тр), Ме8О₂- (мезил или М§), метил (Ме), ацетонитрил (МеСЦ), м-хлорпербензойная кислота (МСРВА), масс-спектр (т§), метил-трет-бутиловый эфир (МТВЕ), Ν-бромсукцинимид (ΝΒ8), Νкарбоксиангидрид (ЛСА), Ν-хлорсукцинимид (ΝΟδ), Ν-метилморфолин (ЫММ), Ν-метилпирролидон (ЫМР), пиридиния хлорхромат (РСС), пиридиния дихромат (РОС), фенил (Рй), пропил (Рг), изопропил (1Рг), фунты на кв.дюйм (ры), пиридин (руг), комнатная температура (к.т./й или ВТ), третбутилдиметилсилил или ΐ-ΒиΜе₂8^ (ТЕОМ8), триэтиламин (ТЕА или Е1₃№), 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил (ТЕМРО), трифлат или СЕ₃8О₂- (ТГ), трифторуксусная кислота (ТЕА), тонкослойная

- 8 018935 хроматография (ТСХ/ТЬС), тетрагидрофуран (ТГФ/ТНЕ), триметилсилил или Ме₃81 (ТМ8), птолуолсульфоновая кислота моногидрат (ТкОН или рТ_кОН), 4-Ме-СбН₄8О₂- или тозил (Тб), Ν-уретан-Ыкарбоксиангидрид (υNСΑ). Общепринятые названия, включающие префиксы нормальный (п), изо (1-), вторичный (кес-), третичный (1ег1-) и нео/пес, имеют их обычное значение при применении с алкильной группировкой. (1. ГОдаибу апб Ό.Ρ. К1екпеу, №тепс1а!ите ίη Огдатс СНетМгу. ГОРАС 1979 Регдатоп Ргекк, ОхТогб).

Соединения данного изобретения можно делать разными способами, изображенными в иллюстративных схемах реакций синтеза, показанных и описанных ниже. Исходные продукты и реагенты, использованные в приготовлении данных соединений, обычно либо доступны от коммерческих поставщиков, таких как А1бпск Скетка1 Со., либо приготовлены способами, известными специалистам в данной области, по процедурам, представленным в ссылках, таких как Иекет апб Иекет'к Кеадепй Тог Отдашс 8уп(кебк; \УПеу & 8опк: №\ν Уогк, Уо1ите§ 1-21; К.С. ЬаКоск, Сотртекепыуе Огдатс ТгапзТогтакопк, 2^пбебкюп ^беу-УСН, №\ν Уогк 1999; Сотртекепыуе Огдатс 8уп!ке515, В. Тгок! апб I. Е1ет1пд (Ебк.) уо1. 1-9 Регдатоп, ОхТогб, 1991; Сотргекепыуе Не!егосускс Скет18г1у, А.К. КаЦк/ку апб САУ. Кеек (Ебк) Регдатоп, ОхТогб 1984, уо1. 1-9; Сотргекепыуе Не1егосускс СкепщПу II, А.К. 1<а1п1хку апб САУ. Кеек (Ебк) Регдатоп, ОхТогб 1996, уо1. 1-11; и Огдатс Кеасбопк, \УПеу & 8опз: №\ν Уогк, 1991, Уо1. 1-40. Следующие схемы реакций синтеза являются только иллюстративными по некоторым способам, посредством которых можно синтезировать соединения данного изобретения, и разные модификации данных схем реакций синтеза могут быть сделаны и будут предложены специалисту в данной области, имеющей отношение к раскрытию, содержащемуся в данной заявке.

Исходные продукты и промежуточные продукты схем реакций синтеза можно выделять и очищать, если требуется, используя общепринятые процедуры, включающие, но без ограничения только ими, фильтрование, перегонку, кристаллизацию, хроматографию и тому подобное. Такие продукты можно характеризовать, используя обычные средства, включающие физические константы и спектральные данные.

Если не указано иное, реакции, описанные здесь, предпочтительно проводят в инертной атмосфере при атмосферном давлении и в интервале температур реакции от примерно -78 до примерно 150°С, предпочтительнее от примерно 0 до примерно 125°С и наиболее предпочтительно и удобно при примерно комнатной температуре (или окружающей среды), например примерно 20°С.

Хотя химические модификации 2' и 3' положений нуклеозидов были изучены, модификация 4' положения была менее установленной больше всего из-за дополнительных синтетических проблем, связанных с их синтезом. Маад е! а1. (Апб-НГО Асйуйу оТ 4'-А/|бо апб 4'-Ме!кохупис1ео81бе8, 1. Меб. Скет. 1992 35: 1440-1451) раскрывают синтез 4'-азидо-2-деоксирибонуклеозидов и 4-азидонуклеозидов. С.О. Уапд е! а1. (Те!гакебгоп Ье!!. 1992 33(1): 37-40 и 33(1): 41-44) раскрывают синтез 4'-циано, 4'гидроксиметил- и 4'-формилнуклеозидных производных замещенных нуклеозидов. Данные соединения были оценены в качестве соединений против ВГС. Маад е! а1. (см. выше) показали, что 4'азидонуклеозиды 1бс можно приготовить добавлением азида иода к 5-метилентетрагидрофуран-2-ил нуклеозидам 15, где В означает тимин, урацил, аденин или гуанозин.

но ко (15) г— 16а;Х = 1;В“Н

1=5- 16Ь: X - 0С(О)-ш-С1-С_йН₄С1; К = СОРИ к-*· 16с: Х = ОН; Й = Н

В И.8. Ра!еп! РиЬ. № 20050038240, опубликованном 17 февраля 2005 г., Т.1. Соппо11у е! а1. раскрывают улучшенную процедуру для приготовления 4'-азидонуклеозидов. В \УО 02/100415 К. Эеуоз е! а1. раскрывают новые 4'-замещенные нуклеозидные производные, которые ингибируют участок Ν85Β вирусной ДНК полимеразы ВГС. Добавление азида иода наиболее эффективно выполнено на уридинах 15 (В=урацил), которые могут быть превращены в соответствующий цитидин при применении метода, описанного ΛΌ. ВойкГОск е! а1. (1. Меб. Скет. 1990 33(1): 179; см. также К.1. Э|уакаг апб С. В. Кееке 1. Скет. 8ос, Реткш Тгапз. I 1982 1171-1176).

- 9 018935

Схема А

4-Амино-1 -(5 -азидо-4-гидрокси-5-гидроксиметил-3 -метилтетрагидрофуран-2-ил)-1Н-пиримидин-2он (22) готовили из 1-(4-гидрокси-5-гидроксиметил-3-метилтетрагидрофуран-2-ил)-1Н-пиримидин-2,4диона (18а) (статья Ό.Θ. С1сего с! а1. 8!егсоке1ес!1ус купШскщ оГ поус1 апа1одк оГ 2'-бсоху- апб 2',3'б1бсохупис1сок1бск \\Л11 ро1спПа1 апйу1га1 асйуйу, Вюогд, Меб. Сйсш. Ьей. 1994 4(7): 861-6; документ А. ШЬаггсп, ЕР547008 А1, озаглавленный Ргсрагайоп оГ пс\у (2'Я)- апб (2'8)-2'-бсоху-2'-С-йубгохусагЬу1 апйкепке о11допис1со!1бск иксГи1 ш ксюпййс гексагсй, Шегарсийск апб б1адпок!1ск, опубликованный 16 июня 1993 г.), применяя процедуру Маад с! а1. (см. выше) (схема А). 4-Амино-1-(5-азидо-4-гидрокси-5гидроксиметил-3-метилтетрагидрофуран-2-ил)-1Н-пиримидин-2-он (22) проявляет хорошую активность в клетке на основе анализа репликона по активности полимеразы ВГС (табл. I). Кроме того, соединения обладают низкими уровнями цитотоксичности в анализе.

Таблица I

Соединение	Максимум % Ингибирование полимеразы ВГС (100 мкМ)	Максимум % Цитотоксичность (100 мкМ)
22	98, 58	9, 48

Нуклеозидные производные часто являются потенциальными противовирусными (например, Ηΐν, НСУ, простой герпес, СМУ) и противораковыми химиотерапевтическими средствами. К сожалению, их практическое применение часто ограничено двумя факторами. Во-первых, слабые фармакокинетические свойства часто ограничивают абсорбцию нуклеозида из кишки и внутриклеточную концентрацию нуклеозидных производных и, во-вторых, субоптимальные физические свойства ограничивают выборы композиций, которые могли бы использоваться для усиления доставки активного ингредиента.

А1Ьсй ввел термин пролекарство, чтобы описать соединение, которому не хватает внутренней биологической активности, но которое способно к метаболическому превращению в активное лекарственное средство (А. А1Ьсй, 8с1сс!1ус Тохюйу Сйартап апб На11, Ьопбоп, 1951). Пролекарства были рассмотрены в последнее время (Р. Ейтаусг с! а1., 1. Меб. Сйст. 2004 47 (10): 2393-2404; К. Всаитоп! с! а1., Сигг. Эгид. Мс!аЬ. 2003 4: 461-485; Н. Випбдаагб, Осыдп оГ Ргобгидк: ВюгсусгыЫс бепуайуск Гог уапоик Гипс!юпа1 дгоирк апб сйст1са1 спбйск ш Осщдп оГ Ргобгидк, Н. Випбдаагб (еб) Е1ксу1сг 8с1спсс РиЬБкйсгк, Атсгк!сгбат 1985; С.М. Раи1сй1 с! а1. Абу. Эгид Эейу. Ясу. 1997 27:235-256; Я.Т 1опск апб N. ВщсйоГЬсгдсг, Ап!1У1га1 Яск. 1995 27: 1-15 и С.Я. ^адпег с! а1., Меб. Яск. Ясу. 2000 20: 417-45). В то время как метаболическое превращение может катализироваться определенными ферментами, большей частью гидролазами, активное соединение может также регенерироваться неспецифическими химическими процессами.

Фармацевтически приемлемые пролекарства относятся к соединению, которое метаболизируется, например, гидролизуется или окисляется в хозяине с образованием соединения данного изобретения. Биоконверсия должна происходить в обход образования фрагментов с токсикологическими склонностями. Типичные примеры пролекарств включают соединения, которые имеют биологически лабильные защитные группы, присоединенные к функциональной группировке активного соединения. Алкилирование, ацилирование или другие липофильные модификации гидроксигрупп(ы) на группировке сахара были использованы в создании пронуклеотидов. Данные пронуклеотиды могут гидролизоваться или деалкилироваться ш у1уо с получением активного соединения.

Факторы, ограничивающие пероральную биодоступность, часто представляют собой абсорбцию из желудочно-кишечного тракта и рано происходящее выделение кишечной стенкой и печенью. Оптимизация внутриклеточной абсорбции через С1 тракт требует Ό(7,4) больше чем 0. Оптимизация коэффициен

- 10 018935 та распределения, однако, не обеспечивает успех. Пролекарство может избежать активной утечки транспортеров в энтероците. Внутриклеточный метаболизм в энтероците может приводить к пассивному транспорту или активному транспорту метаболита посредством насосов для оттока обратно в кишечную полость. Пролекарство должно также противостоять нежелательной биотрансформации в крови перед тем, как реагировать с целевыми клетками или рецепторами.

Хотя предполагаемые пролекарства иногда можно создать рационально на основе химических функциональных групп, присутствующих в молекуле, химическая модификация активного соединения производит полностью новый молекулярный объект, который может проявлять нежелательные химические и биологические свойства, отсутствующие в исходном соединении. Регулирующие требования для идентификации метаболитов могут создать проблемы, если кратные пути метаболизма ведут ко множеству метаболитов. Таким образом, идентификация пролекарств остается неопределенным и проблемным осуществлением. Кроме того, оценка фармакокинетических свойств потенциальных пролекарств представляет собой проблемную и дорогостоящую попытку. Фармакокинетические результаты от животных моделей могут быть трудными для экстраполяции на людей.

В патенте США № 6846810, выданном 25 января 2005 г., ТА. Матйп с! а1. показали, что ацилированные 4'-азидонуклеозиды, как установлено, были эффективными пролекарствами. Диацильные производные 23 соединения 22 можно приготовить ацилированием исходного нуклеозида 22.

Соединения данного изобретения в подходящем случае готовят в одну стадию ацилированием соединения 22 в водном органическом растворителе. Растворитель может представлять собой либо гомогенный водный раствор, либо двухфазный раствор. рН водного органического растворителя устанавливают выше 7,5 добавлением основания, чтобы нейтрализовать кислоту, образованную ацилированием. Основание может представлять собой либо щелочь или гидроксид щелочного металла, либо третичный амин. Реакцию проводят в присутствии ΌΜΛΡ, который, как известно в данной области, является катализатором ацилирования. Преимущество данного способа состоит в том, что требуемый продукт можно получить без ацилирования гетероциклического основания.

В альтернативном случае ацилирование удобным образом проводят с помощью соответствующего ацилгалогенида или ангидрида в растворителе, таком как Ό0Μ, хлороформ, четыреххлористый углерод, диэтиловый эфир, ТГФ, диоксан, бензол, толуол, МсС№ ДМФА, раствор гидроксида натрия или сульфолан необязательно в присутствии неорганического или органического основания при температуре от -20 до 200°С, но предпочтительно при температуре от -10 до 160°С. Реакцию ацилирования можно также проводить по Шоттен-Бауману в бифазной водно-органической среде в присутствии межфазного катализатора и ΌΜΛΡ.

Может быть достигнуто селективное ацилирование гидроксигрупп. В альтернативном случае Νацильную группу Ν,Ο,Ο-триацилнуклеозида можно селективно разложить с помощью бромида цинка с получением защищенного диацильного соединения (В. Ктсгхск е! а1. Те!гайебгоп Ьей. 1981 22(38): 376264).

Селективное ацилирование определенных гидроксильных групп на карбогидратном радикале может быть выполнено в удобном случае с помощью фермента, катализирующего ацилирование или деацилирование. Ферментативный катализ обеспечивает мягкие селективные условия для органических преобразований. 8.М. ВоЬейк рассмотрел препаративные биологические преобразования (1. Сйет. 8ос. Реткш 1, 2001, 1475; 2000, 611; 1999, 1 и 1998, 157). М. Майтоиб1ап е! а1. (Вюксйпок Арр1. Вюсйет. 1999 29: 229-233) сообщил о селективном ацилировании 5'-положения 2-амино-9-3-Э-арабинфуранозил-6метокси-9Н-пурина с помощью новоцима 435, иммобилизированного препарата из липазы Сапб1ба ап!атсйса. Другие опубликованные ферменты со способностью селективно ацилировать 5'-гидроксил включают протеазу из ВасШик НсйешГогтщ, липоцим ΙΜ (липазу из Мисог 1ше11е! СЬЕС-ВЬ (протеазу из В. НсйешГоттк), савиназу (протеазу из ВасШик кр.), новоцим-243 (протеазу из ВасШик йсйешГоттк), липазу из Л1са1щепек кр. и липолазу (ново).

Ферментный препарат липолаза® (липаза из Тйегтотусек 1апидтокик, 81§та каталог # Ь 0777) была выявлена для того, чтобы селективно гидролизовать 5'-ацильную группу триацилпроизводных для предоставления 2',3'-диацильных соединений. В \УО 2004043894, О.О. Нега1бккоп е! а1. раскрывают применение липазы из Т. 1апидтокик для эстерификации жиров из морских организмов. Ν. ХУеЬег е! а1. (Еиг. 1. оГ Ыр1б 8ск апб Тесйпо1. 2003 105 (10): 624-626) раскрывают трансэстерификацию метилолеата, катализируемую с помощью Т. 1апидшокик. V. Воба1 е! а1. (Α6ν. 8уп!й. Са!. 2003 345(6 и 7): 811-818) описывают новые гидролазы из термофильных нитевидных грибов, которые можно использовать для селективных биологических преобразований.

Другие сообщения о региоселективном ферментативном гидролизе сложного эфира включают следующие публикации: В. Напкоп е! а1., Вюотд. апб Меб. Сйет. 2000, 2681-2687 (8уп!йек1к оГ а 1оЬисатй ргобгид νίη гедюке1ес!ше асу1а!юп апб йубго1ук1к); В.РГаи е! а1., 8уп. Ье!!. 1999, 1817-1819 (8е1ес!Ве йубго1ук1к оГ сатЬойубта!е ек!ег); А. В1апсо е! а1., 1. оГ Мо1. Са!. В.: Еп/утабс 1997 209-212 (Ведюке1ес!ше асу1а!юп апб йубго1ук1к Гог куп!йек1к оГ ча1ю ас1б бетВаЮек); Υ. О!а е! а1., Вюкаепсе, Вю!есйпо1оду, Вюсйет1к!гу (1997), 166-167 (Ведюке1ес!ше ек!ег йубго1ук1к оГ 1,2,3-йШехапо1у1д1усего1); и.Т. Вогпксйеиег е!

- 11 018935 а1., Епхутс МюгоЫа1 Тсс1то1. 1995, 578-86 (Праке са1а1ухск куп!кскск оГ топоасу1д1уссго1; гсуЮу); С.Т. Сооккис с! а1. ДО 9403625 (Всд1окс1сскус ргосскк Гог гско1икоп оГ сагЬокукга!с топоск1сгк); Ν.ν. Воах. ДО 9115470 (8срагакоп оГ а1соко1-ск1сг т1х1игс Ьу кс1сскус спхутакс кукго1ук1к); У.8. 8апдку1 с! а1. И8 2002142307 (Всд1окс1сскус кукго1ук1к оГ 3',5'-к1-О-1суи1ту1пис1сок1кск); 1. Сагаа с! а1. 1. Огд. Скст. 2002, 4513-4519 (Всд1окс1сскус кукго1ук1к 3',5'-к1-О-1суи1ту1пис1сок1кск); О. Кйк с! а1. Вюса! апк ВюкапкГогтакоп (1995) 91-7 (Ыракс са1а1ухск гсд1окс1сскус асу1акоп апк ксасу1акоп оГ д1исокс кспуакуск).

Специалист в данной области будет осознавать, что селективную эстерификацию можно выполнить с помощью стандартной химической методологии. Была описана селективная защита 5'-гидроксильной группы, которая создаст возможность для прямой эстерификации 2'-гидроксила или, в альтернативном случае, включения второй защитной группы, которая позволит удаление защиты и селективное ацилирование первичного спирта.

Соединения данного изобретения могут быть приготовлены в широком разнообразии лекарственных форм для перорального введения и носителей. Пероральное введение может быть в форме таблеток, таблеток в оболочке, твердых и мягких желатиновых капсул, растворов, эмульсий, сиропов или суспензий. Соединения данного изобретения являются эффективными при введении посредством внесения суппозиториев, наряду с другими путями введения. Самый удобный способ введения обычно является пероральным, при этом используется удобная суточная схема приема лекарственного средства, которую можно корректировать согласно тяжести заболевания и реакции пациента на противовирусное медикаментозное лечение.

Соединение или соединения данного изобретения, а также их фармацевтически применимые соли вместе с одним или несколькими общепринятыми эксципиентами, носителями или разбавителями могут быть помещены в форму фармацевтических композиций и стандартных дозировок. Фармацевтические композиции и стандартные лекарственные формы могут быть составлены из традиционных ингредиентов в общепринятых пропорциях, с или без дополнительных активных соединений, и стандартные лекарственные формы могут содержать любое подходящее эффективное количество активного ингредиента, соразмерное с предполагаемым интервалом суточной дозы, предназначенным для использования. Фармацевтические композиции можно применять в виде твердых частиц, таких как таблетки или наполненные капсулы, полутвердые частицы, порошки, композиции с пролонгированным высвобождением действующего вещества, или в виде жидкостей, таких как суспензии, эмульсии, или наполненные капсулы для перорального применения; или в форме суппозиториев для ректального или вагинального введения. Типичный препарат будет содержать от примерно 5 до примерно 95% активного соединения или соединений (мас./мас.). Термин препарат или лекарственная форма предназначен для включения как твердых, так и жидких композиций активного соединения, и специалист в данной области оценит, что активный ингредиент может существовать в разных препаратах в зависимости от требуемой дозы и фармакокинетических параметров.

Термин эксципиент, как используется в настоящем описании, относится к соединению, которое применяется для приготовления фармацевтической композиции и вообще безопасно, нетоксично и ни биологически, ни иным образом не востребовано, и включает эксципиенты, приемлемые для использования в ветеринарии, а также для фармацевтического использования человеком. Соединения данного изобретения можно вводить сами по себе, но большей частью будут вводиться в смеси с одним или несколькими подходящими фармацевтическими эксципиентами, разбавителями или носителями, выбираемыми относительно пути введения и стандартной фармацевтической практики.

Фармацевтически приемлемая солевая форма активного ингредиента вначале может также предоставлять активному ингредиенту требуемые фармакокинетические свойства, которые отсутствуют в несолевой форме, и могут даже положительно влиять на фармакодинамику активного ингредиента, что касается его терапевтической активности в организме. Фраза фармацевтически приемлемая соль соединения, как используется в настоящем описании, означает соль, которая является фармацевтически приемлемой и которая обладает требуемой фармакологической активностью исходного соединения. Такие соли включают: (1) кислотно-аддитивные соли, образованные с неорганическими кислотами, такими как хлористо-водородная кислота, бромисто-водородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и тому подобное; или образованные с органическими кислотами, такими как гликолевая кислота, пировиноградная кислота, молочная кислота, малоновая кислота, яблочная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, 3-(4-гидроксибензоил)бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, 1,2этандисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 4хлорбензолсульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 4-толуолсульфоновая кислота, камфорсульфоновая кислота, лаурилсерная кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, салициловая кислота, муконовая кислота и тому подобное. Следует понимать, что все ссылки на фармацевтически приемлемые соли включают формы присоединения растворителя (сольваты) или кристаллические формы (полиморфы), определенные в настоящем описании, той же самой кислотно-аддитивной соли.

Препараты в твердой форме включают порошки, таблетки, пилюли, капсулы, суппозитории и диспергируемые гранулы. Твердый носитель может представлять собой одно или несколько веществ, кото

- 12 018935 рые могут также действовать в качестве разбавителей, ароматизаторов, веществ, придающих растворимость, замасливателей, суспендирующих средств, связывающих средств, консервантов, таблеточных диспергаторов или инкапсулирующего материала. В порошках носитель обычно представляет собой тонкоизмельченное твердое вещество, которое находится в смеси с тонкоизмельченным активным компонентом. В таблетках активный компонент обычно смешан с носителем, обладающим необходимой связывающей способностью в подходящих пропорциях, и уплотнен в требуемой форме и размере. Подходящие носители включают, но без ограничения только ими, карбонат магния, стеарат магния, тальк, сахар, лактозу, пектин, декстрин, крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлозу, натрия карбоксиметилцеллюлозу, низкоплавкий воск, масло какао и тому подобное. Препараты в твердой форме могут содержать кроме активного компонента окрашивающие вещества, вкусовые добавки, стабилизаторы, буферные средства, искусственные и природные подсластители, диспергаторы, загустители, средства, способствующие растворению и тому подобное.

Жидкие композиции также подходят для перорального введения и включают жидкую композицию, включающую эмульсии, сиропы, эликсиры и водные суспензии. Они включают препараты в твердой форме, которые предназначены для того, чтобы превращаться в препараты в жидкой форме незадолго перед применением. Эмульсии могут быть приготовлены в растворах, например в водных растворах пропиленгликоля, или могут содержать эмульгаторы, такие как лецитин, сорбитанмоноолеат или аравийская камедь. Водные суспензии можно приготовить диспергированием тонкоизмельченного активного компонента в воде с вязким продуктом, таким как природные или синтетические камеди, смолы, метилцеллюлоза, натрия карбоксиметилцеллюлоза и другие хорошо известные суспендирующие средства.

Соединения данного изобретения могут быть приготовлены для введения в виде суппозиториев. Низкоплавкий воск, такой как смесь глицеридов жирных кислот, или масло какао сначала расплавляют и активный компонент гомогенно диспергируют, например, перемешиванием. Расплавленную гомогенную массу затем выливают в формы по размеру, дают возможность охлаждаться и затвердевать.

Соединения данного изобретения могут быть приготовлены для вагинального введения. Пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пены или спреи, содержащие кроме активного ингредиента такие носители, как известные в данной области, являются уместными.

Подходящие композиции наряду с фармацевтическими носителями, разбавителями и эксципиентами описаны в издании Веш1пд!оп: ТЬе 8с1епсе апб Ргасйсе οί РЬагтасу 1995, еббеб Ьу Е.^. Майш, Маск РиЫкЫпд Сотрапу, 19(Н ебйюп, Еакоп, Реппкуката. Специалист по технологии приготовления лекарственных средств может модифицировать композиции в пределах рекомендаций описания, чтобы иметь разные композиции для конкретного способа введения.

Модификации данных соединений для представления их более растворимыми в воде или другом наполнителе, например, можно легко осуществить посредством незначительных изменений (например, солевая композиция), которые по силам обычному специалисту в данной области. Обычному специалисту в данной области также по силам модифицировать путь введения и схему приема лекарственного средства из определенного соединения, чтобы управлять фармакокинетикой данных соединений для максимального полезного эффекта в пациентах.

Термин терапевтически эффективное количество, как используется в настоящем описании, означает количество, требуемое для уменьшения симптомов заболевания в индивидууме. Доза будет устанавливаться по индивидуальным потребностям в каждом конкретном случае. Данная дозировка может меняться в широких пределах, причем зависит от многих факторов, таких как тяжесть заболевания, предназначенного для лечения, возраста и общего состояния здоровья пациента, других лекарственных средств, которыми лечат пациента, пути и формы введения и предпочтений и опыта привлеченного практикующего врача. Для перорального введения суточная дозировка от примерно 0,1 до примерно 10 г в сутки будет целесообразной в монотерапии и/или в комбинированной терапии. Предпочтительная суточная дозировка равна от примерно 0,5 до примерно 7,5 г в сутки, более предпочтительная от 1,5 до примерно 6,0 г в сутки. Обычно лечение начинается с большой исходной нагрузочной дозы, чтобы быстро снизить или устранить вирус, с последующим снижением дозы до уровня, достаточного для предотвращения возврата инфекции. Обычный специалист в лечении заболеваний, представленных в настоящем описании, будет способен, без чрезмерного экспериментирования и основываясь на личных знаниях, опыте и раскрытиях данной заявки, определить терапевтически эффективное количество соединений данного изобретения для данного заболевания и пациента.

Терапевтическая эффективность может быть установлена из оценок функционирования печени, включающих, но без ограничения только ими, уровни белков, а именно, сывороточных белков (например, альбумина, факторов свертывающей системы крови, щелочной фосфатазы, аминотрансферазы (например, аланинтрансаминазы, аспартаттрансаминазы), 5'-нуклеозидазы, глутаминилтранспептидазы и т.д.), синтез билирубина, синтез холестерина и синтез желчных кислот; метаболическую функцию печени, включающую, но без ограничения только этим, карбогидратный метаболизм, метаболизм аминокислот и аммиака. В альтернативном случае терапевтическую эффективность можно контролировать измерением ВГС-РНК. Результаты данных тестов позволят оптимизировать дозу.

В вариантах осуществления изобретения активное соединение или соль можно вводить в комбина

- 13 018935 ции с другим противовирусным средством, таким как рибавирин, другим нуклеозидным ингибитором полимеразы ВГС, ненуклеозидным ингибитором полимеразы ВГС, ингибитором протеазы ВГС, ингибитором хеликазы ВГС или ингибитором фузии ВГС. Когда активное соединение или его производное или соль вводят в комбинации с другим противовирусным средством, активность может повышаться при сравнении с активностью исходного соединения. Когда лечение представляет собой комбинированную терапию, такое введение может быть одновременным или последовательным в отношении введения нуклеозидных производных. Одновременное введение, как используется в настоящем описании, таким образом, включает введение средств в одно и то же время или в разные времена. Введение двух или более средств в одно и то же время может быть достигнуто посредством отдельной композиции, содержащей два или более активных ингредиентов, или, в основном, совместным введением двух или более лекарственных форм с одним активным средством.

Будет подразумеваться, что отсылки данного описания к лечению простираются к профилактике, а также к лечению существующих состояний. Кроме того, термин лечение инфекции ВГС, как используется в настоящем описании, также включает лечение или профилактику, связанную с или опосредованную инфекцией ВГС, или ее клинических симптомов.

Пример 1.

Стадия 1. Раствор 18а (2,17 г, 8,96 ммоль, 1 экв.), имидазола (732 мг, 10,7 ммоль, 1,2 экв.) и Р11₃Р (2,82 г, 10,7 ммоль, 1,2 экв.) в сухом ТГФ (30 мл) охлаждали на водяной бане со льдом и к данному раствору добавляли по каплям в течение 10 мин раствор иода (2,50 г, 9,85 ммоль, 1,1 экв.) в сухом ТГФ (10 мл). Реакционную смесь перемешивали при 0-5°С в течение следующих 10 мин. Водяную баню со льдом удаляли и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 70 ч. Реакционную смесь разбавляли с помощью ЭСМ (200 мл) и промывали с помощью 0,5М Ыа₂8₂О₃ в насыщенном водном №1НСО₃ (150 мл). Водный слой промывали ОСМ (4x50 мл). Объединенные органические экстракты сушили (Ыа₂8О₄), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали δίθ₂ хроматографией, применяя ступенчатое градиентное элюирование с помощью МеОН/ОСМ (1-5% об./об. МеОН) с получением 1,75 г (55%) соединения 18Ь: ^!Н-ЯМР данные (СОС1₃, 25°С): δ 8,22 (ушир.с, 1Н), 7,59 (д, 1Н), 6,19 (д, 1Н), 5,75 (дд, 1Н), 3,79 (м, 1Н), 3,65 (м, 1Н), 3,57 (дд, 1Н), 3,47 (дд, 1Н), 2,69 (м, 1Н), 2,13 (д, 1Н), 1,00 (д, 3Н).

Стадия 2. Раствор 18Ь (1,84 г, 5,22 ммоль) и 0,4М метоксида натрия в МеОН (81 мл) перемешивали при 60°С в течение 5 ч и затем охлаждали на водяной бане со льдом. Пиридиниевую форму ΌΟ\νΕΧ Н (приготовлена обработкой ΌΟνΕΧ Н⁺ пиридином (10 мл/г полимера), фильтрованием и промыванием с помощью МеОН перед применением) добавляли порциями, пока рН раствора не стала нейтральной (всего 5-6 г). Водяную баню со льдом удаляли и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 мин. Полимер удаляли фильтрованием и промывали с помощью МеОН (100 мл). Остаток суспендировали в 6% ЕЮН/ОСМ и вносили в колонку с 8ίΟ₂ и элюировали ЕЮН/ОСМ градиентом (6-7% об./об. Е1ОН) с получением 0,942 г (80%) соединения 19, достаточно чистого для использования на следующей стадии.

Стадия 3. Хлорид бензилтриэтиламмония (1,91 г, 8,4 ммоль, 2 экв.) и азид натрия (546 мг, 8,4 ммоль, 2 экв.) суспендировали в сухом МеСЫ (32 мл) и обрабатывали ультразвуком в течение нескольких минут. Полученную тонкую суспензию перемешивали при к.т. в течение 3 ч и затем фильтровали в атмосфере Ν₂ в сухой ТГФ раствор (30 мл) соединения 19 (942 мг, 4,2 ммоль, 1 экв.). К данной смеси добавляли ЫММ (140 мкл, 0,106 ммоль, 0,3 экв.) и полученный раствор охлаждали на водяной бане со льдом и к нему добавляли по каплям в течение 1 ч раствор иода (1,81 г, 7,14 ммоль, 1,7 экв.) в сухом ТГФ (39 мл). Полученную реакционную смесь перемешивали при 0-5°С в течение дополнительных 2 ч. Добавляли Ν-ацетил-Ь-цистеин (69 мг, 0,035 ммоль, 0,1 экв.) и раствор перемешивали до тех пор, пока не исчезало выделение пузырьков. Добавляли ЫММ (2,31 мл, 21,0 ммоль, 5 экв.) и ОМАР (513 мг, 4,2 ммоль, 1 экв.) с последующим капельным добавлением бензоилхлорида (1,1 мл, 9,24 ммоль, 2,2 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 0-5°С в течение 30 мин, затем хранили в холодильнике в продолжение ночи. Как ТСХ, так и ЖХ-МС анализ показали завершение реакции. Добавляли МеОН (5 мл) и через несколько минут растворитель концентрировали на роторном испарителе до половины объема и затем при перемешивании добавляли раствор 0,1М Ыа₂8₂О₃ в насыщенном водном ЫаСО₃ (300 мл) и смесь нагревали до комнатной температуры. Смесь экстрагировали с помощью ЭСМ (150 мл) и водный слой дважды экстрагировали с помощью ЭСМ (50 мл). Объединенные органические экстракты сушили (Ыа₂8О₄), фильтровали и концентрировали. Органическую фазу затем экстрагировали 5% лимонной кислотой и водную фазу промывали дважды с помощью ЭСМ (2x50 мл). ЭСМ экстракты сушили (Ыа₂8О₄), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали 81О₂ хроматографией, применяя ступенчатое градиентное элюирование с помощью ЕЮН/ОСМ (0, 0,5, 0,75, 1,0, 1,5 и 2% Е1ОН) с получением 1,72 г (83%) соединения 20а: ^!Н-ЯМР данные (СОС1₃, 25°С): δ 8,22-7,46 (7Н), 6,49-6,39 (1Н), 5,84 (дд, 1Н), 5,55-5,47 (1Н), 3,85 (д, 1Н), 3,74 (д, 1Н), 3,18 (м, 1Н), 1,09 (д, 3Н).

Стадия 4. Раствор соединения 20а (1,72 г, 3,47 ммоль, 1 экв.) в ОСМ (155 мл) объединяли со смесью Ви₄ЫН8О₄ (825 мг, 2,43 ммоль, 0,7 экв.) и м-бензойной кислоты (359 мг, 2,29 ммоль, 0,66 экв.) в 1,75М водном К₂НРО₄ (55 мл). Двухфазную систему интенсивно перемешивали при комнатной температуре и к

- 14 018935 ней добавляли в продолжение интервала в 1,5 ч две порции коммерчески доступной смеси реагентов, содержащей 55% МСРВА, 10% м-хлорбензойной кислоты и 35% Н₂О (2x3,57 г, соответствующие 2x16,5 ммоль или 2x3,28 экв. МСРВА и 2x3,3 ммоль или 2x0,66 экв. м-хлорбензойной кислоты). Смесь интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение дополнительных 18 ч. ЖХ-МС анализ показал >96% протекание реакции. Добавляли раствор Ыа₂8₂О₃-5Н₂О (35 г) в насыщенном водном ЫаНСО₃(500 мл) и смесь интенсивно перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Органический слой отделяли и водный слой промывали с помощью ЭСМ (2x10 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным водным ЫаНСО₃ (40 мл). Водный ЫаНСО₃ слой промывали с помощью ЭСМ (2x10 мл). Объединенные органические слои сушили (Иа₂8О₄), фильтровали и концентрировали. Остаток очищали 81О₂ хроматографией, применяя градиентное элюирование с помощью ЕЮН/ЭСМ (1-2% об./об. Е1ОН) с получением 1 г (56%) соединения 20Ь: 'Н-ЯМР данные (СЭС1₃. 25°С): δ 8,19 (ушир.с, 1Н), 8,077,88 (4Н), 7,65-7,36 (6Н), 6,57-6,45 (1Н), 5,64 (дд, 1Н), 5,51-5,42 (1Н), 4,80 (м, 2Н), 3,24 (м, 1Н), 1,09 (д, 3Н).

Стадия 5. Сложный диэфир 20Ь (100 мг, 0,19 ммоль, 1 экв.) и 1,2,4-триазол (131 мг, 1,9 ммоль, 10 экв.) упаривали совместно из сухого пиридина и перерастворяли в сухом пиридине (1 мл). Раствор охлаждали на водяной бане со льдом и к нему добавляли по каплям в течение нескольких мин раствор РОС1₃(44 мкл, 0,475 ммоль, 2,5 экв.) в МеСЫ (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивали при 0-5°С в течение следующих 5 мин и затем перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Реакционную смесь концентрировали до половины объема на роторном испарителе и затем обрабатывали насыщенным ЫН₃в этаноле (20 мл) и полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в продолжение ночи. Остаток после упаривания очищали 81О₂ хроматографией, применяя ступенчатое градиентное элюирование с помощью ЕЮН/ЭСМ (6, 10, 15 и 20% об./об. Е1ОН) с получением 0,036 г (66%) соединения 22, которое было 98% чистоты по данным ЖХМС (~2,0% контаминанта 2'-изомера). Данную реакцию повторяли с 900 мг соединения 20Ь с получением 270 мг (54%, 97% чистота) соединения 22 после хроматографии: ^!Н-ЯМР данные (ДМСО-б₆, 25°С): δ 7,69 (д, 1Н), 7,14 (д, 2Н), 6,32 (ушир.с, 1Н), 5,72 (д, 1Н), 5,78 (ушир.с, 2Н), 3,89 (ушир.с, 1Н), 3,74 (ддд, 2Н), 2,54 (м, 1Н), 0,77 (д, 3Н).

Пример 2. (2В,38,48,5В)-5-(4-Амино-2-оксо-2Н-пиримидин-1-ил)-2-изобутирилоксиметил-4метилтетрагидрофуран-3-иловый эфир изомасляной кислоты (25)

Ме_гСН рН Раствора соединения 22 (0,700 г, 2,48 ммоль) в ТГФ (7 мл) и разбавленного солевого раствора (7 мл) устанавливают до приблизительно 11 с помощью разбавленного водного КОН. В охлаждаемую льдом перемешиваемую бифазную реакционную смесь медленно (по каплям) добавляют изобутирилхлорид (1,0 г), в то время как рН устанавливают равным примерно 11 добавлением разбавленного водного КОН, как требуется. Степень протекания реакции контролируют с помощью ВЭЖХ. Добавленный дополнительный 1 экв. изобутирилхлорида по данным ВЭЖХ указывает на почти полную конверсию. Реакционной смеси позволяют выдерживаться в течение ночи при комнатной температуре. Раствор разбавляют с помощью ЕЮАс (50 мл) и рН водной фазы устанавливают до значения приблизительно 7,5 с помощью конц. НС1. Фазы отделяют и органическую фазу промывают три раза водой и упаривают досуха с получением соединения 25.

Пример 3. (2В,38,48,5В)-5-(4-Амино-2-оксо-2Н-пиримидин-1-ил)-2-азидо-4-гидрокси-2-гидроксиметилтетрагидрофуран-3-иловый эфир пентановой кислоты (27)

К суспензии дипентаноатного сложного эфира 26 (В''=Н-С₄Н₉, 1,9 г, 3,46 ммоль) в МТВЕ (13 мл) и фосфатного буфера (15 мл, 5 мМ фосфата натрия и 0,1М ЫаС1, установленный до рН примерно 6,5) до- 15 018935 бавляют (примерно 2 мл) липолазы® (липазы из Тйеттотусек 1апидто8И8, номер 81§та каталога Ь 0777). Реакционную смесь нагревают до 35°С и перемешивают в течение 2 ч. рН Реакционной смеси устанавливают при 6,5 добавлением ЫаНСО₃. После 2 ч реакция доходит до 8% завершения. Добавляют дополнительные 2 мл липолазы® и перемешивание продолжают в течение 6 ч, после чего добавляют дополнительную 2 мл аликвоту фермента и реакционную смесь перемешивают в течение еще 24 ч. К раствору добавляют ацетон (10 мл), МТВЕ (20 мл) и насыщенный солевой раствор (10 мл) и реакционную смесь нагревают до 50°С. Фазы отделяют и органическую фазу дважды экстрагируют теплым МТВЕ. Объединенные органические фазы дважды промывают горячим насыщенным солевым раствором, сушат (Ыа₂8О₄), фильтруют и концентрируют в вакууме.

Пример 4. (2Я,38,48,5Я)-5-(4-Амино-2-оксо-2Н-пиримидин-1-ил)-2-азидо-3-бутирилокси-4-метилтетрагидрофуран-2-илметиловый эфир тетрадекановой кислоты (28)

Суспензию соединения 29 (1,0 г, 3,52 ммоль), винилмиристата (1,2 г, 4,57 ммоль), липазы из Сапй1йа агИагЦеа. иммобилизированной на поликрилатном полимере (0,30 г; 81дта каталог № Ь4 777 от Νοуокоте) и ТГФ (20 мл) нагревают при 60°С в продолжение ночи. ВЭЖХ показывает, что реакция является завершенной на 33%, и к смеси добавляют еще 2,4 мл винилмиристата и 0,3 г липазы. Через дополнительные 48 ч реакция является завершенной на 50%, и к смеси добавляют еще 0,3 г фермента и 3 мл винилмиристата. После приблизительно 80 ч (общее время реакции) превращение в моноэфир завершено. Сырую реакционную смесь фильтруют через целит® и слой на фильтре промывают ТГФ. Объединенную органическую фазу упаривают. Остаток растворяют в МеОН (50 мл) и экстрагируют гексаном (2x20 мл). Метанольный раствор упаривают и остаток растворяют в ЕЮАс и промывают с помощью NаНСОз и ЕЮАс, фазу сушат (№₂8О₄), фильтруют и упаривают с получением 0,930 г соединения 28 (Κ=0₃Η₂₇), которое очищают хроматографией на 8Ю₂ с градиентным элюированием с помощью МеОН/ОСМ (0-10% МеОН).

Пример 5. 3',5'-О-бис (Ь-валинил)-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидин (34)

Ме_?МСН(ОМеуДМФА

_г*НС1

Ν⁴- [(Диметиламино)метилен] -4 '-азидо-2'-в -С-метил-2 '-деоксицитидин (32).

Раствор соединения 22 (1,81 г, 6,42 ммоль) в ДМФА (30 мл) обрабатывают диметилацеталем диметилформамида (8,2 мл, 61,73 ммоль) и перемешивают в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Раствор упаривают при пониженном давлении и совместно упаривают с этанолом. Кристаллизация из смеси этанол/простой эфир дает указанное в заголовке соединение 32.

3',5'-О-бис[№(трет-Бутоксикарбонил)-Ь-валинил]-^-[(диметиламино)метилен]-4'-азидо-2'-в-Сметил-2'-деоксицитидин (33).

К раствору соединения 32 (1,26 г, 3,74 ммоль) в смеси сухого ацетонитрила (30 мл) и ДМФА (15 мл) последовательно добавляют Вос-Уа1-ОН (1,62 г, 7,48 ммоль), ЕЭС (1,43 г, 7,48 ммоль), ТЕА (1,04 мл, 7,48 ммоль) и ΌΜΛΡ (0,1 г). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре. Протекание реакции контролируют с помощью ВЭЖХ и в реакционную смесь повторно загружают Вос-Уа1-ОН (0,63 г), ЕЭС (0,72 г), ТЕА (0,52 мл) и ΌΜΛΡ (0,05 г). После того как исходный продукт полностью израсходован, растворитель удаляют при пониженном давлении. Остаток поглощают этилацетатом и промывают

- 16 018935 водой и насыщенным солевым раствором. Очистка колоночной хроматографией на силикагеле (градиент 5-40% Е!ОАс в гексане) дает указанное в заголовке соединение 33.

3',5'-О-бис(Ь-валинил)-4'-азидо-2'-3-С-метил-2'-деоксицитидин (тригидрохлоридная соль, 34).

К концентрированному раствору соединения 33 (1,6 г, 2,17 ммоль) в Е!ОАс медленно добавляют 13 мл 1М НС1 в Е!ОН. Реакционную смесь перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре и разбавляют эфиром. Осадок фильтруют и промывают эфиром с получением указанного в заголовке соединения 34 в виде тригидрохлоридной соли.

Пример 6. Альтернативное получение 3',5'-О-бис(изобутирил)-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидина. ((2К,38,48,5К)-2-(4-Амино-2-оксо-2Н-пиримидин-1-ил)-2-изобутирилоксиметил-4-метилтетрагидрофуран-3-иловый эфир изомасляной кислоты) (25)

3',5'-О-бис(изобутирил)-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидин (25).

К раствору соединения 22 (1,26 г, 3,74 ммоль) в сухом пиридине (25 мл) добавляют ангидрид изомасляной кислоты (1,77 г, 11,2 ммоль) при 0°С. Реакционную смесь контролируют с помощью ВЭЖХ и при окончании гасят водой для разложения избытка ангидрида изомасляной кислоты и удаления Ν⁴защиты. Растворители выпаривают при пониженном давлении и совместно выпаривают с этанолом. Остаток растворяют в этилацетате и промывают №1НСОз,. насыщенным солевым раствором. Очистка колоночной хроматографией на силикагеле (градиент 10-40% Е!ОАс в гексане) дает указанное в заголовке соединение 25.

Пример 7. 4'-Азидо-3'-О-(Ь-валинил)-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидин (37)

А,5'-О-бис(монометокситритил)-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидин (35).

Смесь соединения 22 (2,82 г, 10 ммоль) и ММТгС1 (9,15 г, 30 ммоль) в пиридине (50 мл) перемешивают в продолжение ночи при 80°С. После добавления МеОН (5 мл) и перемешивания в течение еще 2 ч растворитель выпаривают и остаток распределяют между этилацетатом и водой. Органическую фазу промывают водой, насыщенным солевым раствором и упаривают. Очистка колоночной хроматографией на силикагеле (0-5% МеОН в ЭСМ) дает указанное в заголовке соединение 35.

А,5'-О-бис(монометокситритил)-4'-азидо-3'-Щ-(трет-бутоксикарбонил)-Ь-валинил]-2'-в-С-метил-2'деоксицитидин (36).

К раствору соединения 35 (3,09 г, 3,74 ммоль) в смеси сухого ацетонитрила (30 мл) и ДМФА (15 мл) последовательно добавляют Вос-Уа1-ОН (0,81 г, 3,74 ммоль), ЕЭС (0,72 г, 3,74 ммоль), ТЕА (0,52 мл, 3,74 ммоль) и ЭМАР (0,07 г). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре. Протекание реакции контролируют с помощью ВЭЖХ и в реакционную смесь повторно загружают Вос-Уа1-ОН (0,4 г), ЕЭС (0,36 г), ТЕА (0,26 мл) и ЭМАР (0,04 г). После того как исходный продукт полностью израсходован, растворитель удаляют при пониженном давлении. Остаток поглощают этилацетатом и промывают водой и насыщенным солевым раствором. Очистка колоночной хроматографией на силикагеле (градиент 5-40% Е!ОАс в гексане) дает указанное в заголовке соединение 36.

- 17 018935

4'-Азидо-3'-О-(Ь-валинил)-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидин (дигидрохлоридная соль, 37).

К концентрированному раствору соединения 36 (2,4 г, 2,34 ммоль) в Ε1ΘΗ медленно добавляют 13 мл 1М НС1 в Ε1ΘΗ. Реакционную смесь перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре и разбавляют эфиром. Осадок фильтруют и промывают эфиром с получением указанного в заголовке соединения (37) в виде дигидрохлоридной соли.

Пример 8. 4'-Азидо-3'-О-изобутирил-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидин (38)

4'-Азидо-3'-О-изобутирил-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидин (38).

К раствору соединения 35 (3,09 г, 3,74 ммоль) в сухом пиридине (25 мл) добавляют ангидрид изомасляной кислоты (0,89 г, 5,61 ммоль) при 0°С. Реакционную смесь контролируют с помощью ВЭЖХ и при окончании гасят водой для разложения избытка ангидрида изомасляной кислоты. Растворители выпаривают при пониженном давлении и совместно выпаривают с этанолом. Остаток растворяют в этилацетате, промывают ЫаНСОз, насыщенным солевым раствором и упаривают. Сырое, защищенное ММТг-группами 3'-изобутирильное производное растворяют в 80% АсОН и перемешивают при 50°С до полного удаления ММТг-групп. Растворитель выпаривают и остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (0-20% МеОН в ЭСМ) с получением указанного в заголовке соединения 38.

Пример 9. 5'-О-(Ь-валинил)-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидин (43)

5'-О-трет-Бутилдиметилсилил-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидин (39).

К раствору соединения 22 (2,82 г, 10 ммоль) в ДМФА (5 мл) добавляют имидазол (1,02 г, 15 ммоль) и ТВБС1 (1,95 г, 13 ммоль). После того как исходный продукт израсходован, реакционную смесь гасят с помощью МеОН (1 мл) и распределяют между этилацетатом и водой. Органическую фазу промывают водой, насыщенным солевым раствором и упаривают. Остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (0-20% МеОН в ЭСМ) с получением указанного в заголовке соединения 39.

5'-О-трет-Бутилдиметилсилил-4'-азидо-М⁴,3'-О-бис(монометокситритил)-2'-в-С-метил-2'деоксицитидин (40).

Смесь соединения 39 (3,7 г, 9,34 ммоль) и ММТгС1 (8,63 г, 28 ммоль) в сухом пиридине (50 мл) пе

- 18 018935 ремешивают в течение ночи при 80°С. После добавления МеОН (5 мл) и перемешивания в течение еще 2 ч растворитель выпаривают и остаток распределяют между этилацетатом и водой. Органическую фазу промывают водой, насыщенным солевым раствором и упаривают. Очистка колоночной хроматографией на силикагеле (0-5% МеОН в ЭСМ) дает указанное в заголовке соединение 40.

4'-Азидо-Н⁴,3 '-О-бис(монометокситритил)-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидин (41).

Раствор соединения 40 (5,3 г, 5,64 ммоль) в ТГФ (20 мл) обрабатывают 1М ТВЛТ в ТГФ (5,7 мл, 5,7 ммоль) и перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляют этилацетатом, промывают водой, насыщенным солевым раствором и упаривают. Хроматография на силикагеле (0-5% этилацетат в СНС1₃) дает указанное в заголовке соединение 41.

5'-[Х-(трет-Бутоксикарбонил)-Т-валинил]-Х⁴,3'-О-бис(монометокситритил)-4'-азидо-2'-в-С-метил2'-деоксицитидин (42).

К раствору соединения 41 (3,09 г, 3,74 ммоль) в смеси сухого ацетонитрила (30 мл) и ДМФА (15 мл) последовательно добавляют Вос-Уа1-ОН (0,81 г, 3,74 ммоль), БОС (0,72 г, 3,74 ммоль), ТЕА (0,52 мл, 3,74 ммоль) и ΌΜΑΡ (0,07 г). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре. Протекание реакции контролируют с помощью ВЭЖХ и в реакционную смесь повторно загружают Вое-УаГОН (0,4 г), ЕЭС (0,36 г), ТЕА (0,26 мл) и ΌΜΑΡ (0,04 г). После того как исходный продукт полностью израсходован, растворитель удаляют при пониженном давлении. Остаток поглощают этилацетатом и промывают водой и насыщенным солевым раствором. Очистка колоночной хроматографией на силикагеле (градиент 5-40% ЕЮАс в гексане) дает указанное в заголовке соединение 42.

5'-О-(Б-валинил)-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидин (дигидрохлоридная соль 43).

К концентрированному раствору соединения 42 (2,4 г, 2,34 ммоль) в ЕЮН медленно добавляют 13 мл 1М НС1 в ЕЮН. Реакционную смесь перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре и разбавляют эфиром. Осадок фильтруют и промывают эфиром с получением указанного в заголовке соединения 43 в виде дигидрохлоридной соли.

Пример 10. 5'-О-изобутирил-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидин (44)

5'-О-изобутирил-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидин (44).

К раствору соединения 41 (3,09 г, 3,74 ммоль) в сухом пиридине (25 мл) добавляют ангидрид изомасляной кислоты (0,89 г, 5,61 ммоль) при 0°С. Реакционную смесь контролируют с помощью ВЭЖХ и при окончании гасят водой для разложения избытка ангидрида изомасляной кислоты. Растворители выпаривают при пониженном давлении и совместно выпаривают с этанолом. Остаток растворяют в этилацетате, промывают ЫаНСО₃, насыщенным солевым раствором и упаривают. Сырое, защищенное ММТг-группами 3'-изобутирильное производное растворяют в 80% АсОН и перемешивают при 50°С до полного удаления ММТг-групп. Растворитель выпаривают и остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (0-20% МеОН в ЭС.'М) с получением указанного в заголовке соединения 44.

Пример 11. Анализ с люциферазой ВепШа.

Данный анализ измеряет способность соединений формулы I ингибировать репликацию РНК ВГС и, следовательно, их потенциальную применимость для лечения инфекций ВГС. Анализ использует репортер для простого считывания внутримолекулярного уровня репликона РНК ВГС. Ген люциферазы ВепШа вводили в первую открытую рамку считывания репликоновой конструкции ΝΚ5.1 (Кпедег е1 а1.,

1. У1го1. 75:4614), непосредственно после внутренней последовательности рибосомного сайта вхождения (1ВЕ8), и сливали с геном неомицин фосфотрансферазы (ΝΡΓΙΙ) через самоотщепляющийся пептид 2А вируса ящура (Вуап & Эге\\·. ЕМВО Уо1.13:928-933). После ίη νίΐτο транскрипции РНК электропорировали в Ний7 клетки гепатомы человека, 0418-резистентные колонии выделяли и увеличивали в объеме. Отобранные стабильные клеточные линии 2209-23 содержат репликативную субгеномную РНК ВГС, и активность люциферазы Веш11а, экспрессируемая репликоном, отражает уровень его РНК в клетках. Анализ выполняли на двух экземплярах планшетов, один в непрозрачном белом и один в прозрачном, чтобы измерять противовирусную активность и цитотоксичность химического соединения в параллели, гарантирующей, что наблюдаемая активность не является результатом уменьшенной клеточной пролиферации.

Клетки с содержанием репликона ВГС и люциферазы из Веш11а (2209-23), культивированные в ЭЫЬессоА МЕМ (61ЬсоВВБ са1 № 31966-021) с 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (БС8,

- 19 018935

Οί^οΒΚΕ са!. № 10106-169), помещали в 96-луночный планшет в количестве 5000 клеток на лунку и инкубировали в продолжение ночи. Спустя 24 ч различные разбавления химических соединений в среде для роста добавляли к клеткам, которые затем дополнительно инкубировали при 37°С в течение трех дней. В конце инкубационного периода клетки в белых планшетах собирали и активность люциферазы измеряли применением набора для проведения люциферазной реакции (ПиаГЬисйегаке κροτίοτ аккау кук!ет, Рготеда са! № Е1960). Все реагенты, описанные в следующем разделе, были включены в комплект изготовителя, и инструкции изготовителя были применены для приготовления реагентов. Клетки промывали дважды с помощью 200 мкл фосфатно-солевого буферного раствора (рН 7,0) (РВ8) на лунку и подвергали лизированию с помощью 25 мкл 1х пассивного лизисного буфера перед инкубацией при комнатной температуре в течение 20 мин. В каждую лунку добавляли одну сотню микролитров Ьаг ΙΙ реагента. Затем планшет вставляли в ЬВ 96У микропланшетный люминометр (МкгоЬитаЩШк, Вег11то1й), и 100 мкл δ!ορ & Ο1ο® реагента вводили инъекцией в каждую лунку и измеряли сигнал, применяя 10секундную программу измерения с 2-секундной задержкой. ΙΟ₅₀, концентрация лекарственного средства, требуемая для снижения репликонового уровня на 50% по отношению к величине контроля из необработанных клеток, может быть вычислена из графика зависимости процентного снижения активности люциферазы от концентрации лекарственного средства.

Для анализа цитотоксичности применяли ^8Т-1 реагент от фирмы Кцсйе Оха^ю^с (са! № 1644807). Десять микролитров ^8Т-1 реагента добавляли в каждую лунку, включая лунки, которые содержат только среду, в качестве пустых опытов. Затем клетки инкубировали в течение 1-1,5 ч при 37°С и измеряли ΟΌ величину посредством считывающего устройства для 96-луночного планшета при 450 нм (эталонный фильтр при 650 нм). И в этом случае СС₅₀, концентрация лекарственного средства, требуемая для снижения пролиферации клеток на 50% по отношению к величине контроля из необработанных клеток, может быть вычислена из графика зависимости процентного снижения ^8Т-1 величины от концентрации лекарственного средства.

Пример 12. МТ4/ХТТ анализ.

Соединения данного изобретения могут быть также тестированы по активности против сопутствующих инфекций. Например, индивидуумы с риском инфекций, передаваемых с кровью, таких как ВГС, иногда совместно инфицированы посредством ВИЧ/ΗΙν.

Соединения могут быть тестированы по активности против ВИЧ, например, применением кратных определений с ХТТ в МТ-4 клетках (^ίκ1ον е! а1., 1. №11. Сансег Ιηκ!. 1989, νο1. 81 ηο 8, 577 е! кед), предпочтительно включающих определения в присутствии 40-50% сыворотки человека, чтобы показать вклад белкового связывания. Вкратце обычный ХТТ анализ использует МТ4 клетки Т клеточной линии человека, выращенные в ΚΓΜΙ 1640 среде, дополненной 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота (или 40-50% сывороткой человека, как целесообразно), пенициллином и стрептомицином, посеянные в 96-луночные микропланшеты (2х10⁴ клетки/лунка), инфицированные посредством 10-20 ТСГО₅₀ на лунку с ΗΙν-1ΙΙΙΒ (дикий тип) или мутантным вирусом, таким как вирусы, несущие КТ Не 100, Сук 181 или Ακη 103 мутации. Серийно разбавленные тестируемые соединения добавляли в соответствующие лунки и культуру инкубировали при 37°С в атмосфере, обогащенной СО₂, и определяли жизнеспособность клеток на пятые или десятые сутки с помощью жизненно важного ХТТ красителя. Результаты обычно представляют в виде ЕО₅₀ мкМ. Соединение примера 1 показывает ЕО₅₀ около 0,6 мкМ в ХТТ анализе.

Пример 13. Внутримолекулярная концентрация трифосфата и период полураспада.

Предполагаемая активная разновидность соединений изобретения представляет собой β-Ό-2'деокси-2'-β-С-метил-4'-азидоцитидинтрифосфат. Устойчивость трифосфата определяют в свежих человеческих первичных гепатоцитах (методики прямо на клетках (Се1кПпес!) или ίη νίΐτο), предварительно инкубированных с исходным соединением, меченным тритием. Гепатоциты культивируют на 6луночных покрытых коллагеном планшетах (ΒΌ ВО^енсек), обычно при 1,5 миллиона клеток на лунку, используя полную среду, содержащую сыворотку (методики прямо на клетках (Се1кПпес!) или ίη νί!го)/37°С/5%СО₂. Различные штаммы гепатоцитов являются доступными, такие как Ни497, МНЬ-091806 и Ни504, и поэтому полезно тестировать такие штаммы параллельно и вычислять средние величины от ряда штаммов.

Предварительная инкубация имеет место обычно в течение 24 ч с 2 мкМ меченного тритием образца при 10 мкКи/мл. При !0 монослой клеток промывали клеточной культуральной средой, чтобы удалить внеклеточное исходное соединение, и культуры клеток повторно инкубировали со свежей клеточной культуральной средой. Концентрацию внутримолекулярного трифосфата количественно определяли в разных временных точках вплоть до 72 ч. Подходящие временные точки представляли собой 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 и 72 ч со вторым экземпляром клеточных культур для каждой временной точки.

В соответствующий момент времени клетки собирали посредством аспирации клеточной культуральной среды и промывания клеток холодным РВ8. Клетки счищали в среду для экстракции, а именно, в 1 мл предварительно охлажденного 60% (об./об.) метанола, экстрагировали в метанол в течение 24 ч при -20°С. Экстрагированные образцы центрифугировали, чтобы удалить отходы. Супернатант удаляли в свежие пробирки, упаривали и хранили в жидком азоте для анализа. Высушенные пеллеты клеточного

- 20 018935 экстракта растворяли в воде и подвергали нанофильтрованию (например, наноразделительное центрифужное устройство, Ра11 Ь1£е 8с1епсе8). Перед ВЭЖХ анализом образцы снабжали немеченными эталонными стандартами для исходной формы, ее монофосфатной, дифосфатной и трифосфатной форм. Типичная ВЭЖХ система использует ионообменную ВЭЖХ с А1а!тап РагЙ811 108АХ (4,6x250 мм) колонкой в сочетании с радиометрическим детектором (таким как β-ВАМ, ΙΝ/ϋ8 8у8!ет8 1пс.) и обычным линейным градиентом мобильной фазы от 0% водного буфера до 100% фосфатного буфера (например, 0,5М КН₂РО₄/0,8М КС1) при скоростях потока, таких как 1 мл/мин. Для обнаружения радиомеченных видов в (3-ВАМ, можно использовать 5:1 отношение Р1о8ст! IV или ИШтаИоАР (Регкт Е1тег) к элюенту колонки. Исходные и внутриклеточные метаболиты идентифицируют сравнением времен удержи вания внутриклеточных видов на радиохроматограмме с удерживанием нерадиоактивных эталонных стандартов, добавленных в образцы клеточных экстрактов и обнаруженных путем УФ-абсорбции, обычно при 270 нм.

Временной курс поглощения и фосфорилирования измеряют аналогичным образом, при помощи которого первичные гепатоциты человека инкубируют с соединением изобретения, меченным тритием, например, 2 мкМ или 10 мкКи/мл. Подходящий временной курс представляет собой добавление к дублированным культурам соединения за 72, 48, 24, 16, 6 и 1 ч до сбора клеток. Для определения зависимости доза-эффект фосфорилирования соединений изобретения первичные гепатоциты человека инкубировали с тест-соединением, меченным тритием, например, при 0,2, 10, 25, 50, 100 и 250 мкМ в течение 24 ч. Конечную концентрацию достигали дополнением нерадиомеченным тест-соединением. Дублированные клеточные культуры собирали обычно после 24 ч инкубации.

В таких анализах средний период полураспада соединений изобретения составлял 21,4 ч (стандартное отклонение 4,22 ч). Уровень трифосфата в устойчивом состоянии за 24 ч при 2 мкМ составляет около 15 пМ/миллион клеток. При использовании 3 мкл в качестве среднего объема печеночных паренхиматозных клеток человека данная концентрация трифосфата соответствует величине, по существу, превышающую К1 исходного соединения.

Долгий период полураспада трифосфата и высокая концентрация означает, что активные против вирусов концентрации активных представителей будут присутствовать в клетках, зараженных ВГС, в течение продолжительных периодов времени после ведения дозы. Это, в свою очередь, означает, что минимальные суточные глубинные уровни будут оставаться высокими даже при ОЭ дозировании, тем самым минимизируются возможности для субоптимальной экспозиции лекарственным средством, приводящие к разработке лекарственного средства для устранения мутантов.

В противоположность длинному периоду полураспада трифосфата данного изобретения трифосфатный период полураспада аналогичного 2'-β-0 метилпроизводного Р81-6130 (в-Э-2'-деокси-2'-фтор2'в-С-метилцитидина (представленного ниже)) составлял только 4,7 ч с концентрацией трифосфата в устойчивом состоянии в течение 24 ч, равной только 1,3 пМ/миллион клеток.

Пример 14.

Фармацевтические композиции рассматриваемых соединений для введения несколькими путями готовили, как описано в данном примере.

Композиция для перорального введения (А).

Ингредиент	% масс./масс.
Активный ингредиент	20,0%
Лактоза	79,5%
Стеарат магния	0, 5%

Ингредиенты смешивают и распределяют в капсулы, причем каждая содержит примерно от 500 до 1000 мг.

- 21 018935

Композиция для перорального введения (В).

Ингредиент	% масс./масс.
Активный ингредиент	20,0%
Стеарат магния	0,5%
Натрия кросскармелоза	2,0%
Лактоза	76,5%
ΡνΡ (поливинилпирролидон)	1,0%

Ингредиенты объединяют и гранулируют, используя растворитель, такой как метанол. Композицию затем сушат и формуют в таблетки (содержащие примерно 20 мг активного соединения) соответствующей машиной для изготовления таблеток.

Композиция для перорального введения (С).

Ингредиент	% масс./масс.
Активный ингредиент	1,0 г
Фумаровая кислота	0,5 г
Натрия хлорид	2,0 г
Метилпарабен	0,15 г

Пропилпарабен	0,05 г
Гранулированный сахар	25,5 г
Сорбит ¢70% раствор)	12,85 г
Вигум К (УапбегЬИй Со.)	1,0 г
Вкусовая добавка	0,035 мл
Красящие вещества	0,5 мг
Дистиллированная вода	ск. нужно до 100 мл

Ингредиенты смешивают для образования суспензии для перорального введения. Парентеральная композиция (Ό).

Активный ингредиент растворяют в порции воды для инъекции. Затем добавляют с перемешиванием достаточное количество хлорида натрия, чтобы изготовить изотонический раствор. Раствор доводят до массы остатком воды для инъекции, фильтруют через 0,2 микронный мембранный фильтр и упаковы вают в стерильных условиях.

Композиция для суппозитория (Е).

Ингредиент	% масс./масс.
Активный ингредиент	1,0%
Полиэтиленгликоль 1000	74,5%
Полиэтиленгликоль 4000	24,5%

Ингредиенты расплавляют вместе и перемешивают на паровой бане и выливают в формы, содержащие 2,5 г общей массы.

Вышепредставленное изобретение было описано довольно подробно посредством иллюстрации и примера для ясности и понимания. Специалисту в данной области будет ясно, что изменения и модификации можно практиковать в рамках охвата прилагаемой формулы изобретения. Следовательно, следует понимать, что вышеприведенное описание предназначено для того, чтобы быть иллюстративным и неограничительным. Охват изобретения поэтому должен определяться не ссылкой на вышеприведенное описание, но вместо этого должен определяться ссылкой на пункты формулы изобретения вместе с полным охватом эквивалентов, на которые такие пункты правомочны.

Все патенты, патентные заявки и публикации, цитируемые в данной заявке, таким образом, включены ссылкой в полном объеме.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы I в которой

В¹ представляет собой водород;

В² и В³ независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, СОВ⁴ и С(=О)СНВ⁵ИНВ⁶; или В¹ и

В³ означают Н и В² представляет собой монофосфатный, дифосфатный или трифосфатный сложный эфир;

В⁴ независимо выбран из группы, состоящей из С_1-1о неразветвленного или разветвленного алкила;

В⁵ представляет собой изопропил, изобутил или втор-бутил;

В⁶ представляет собой водород;

или его фармацевтически приемлемые соли.
2. Соединение по п.1, в котором каждый В¹, В² и В³ представляет собой водород.
3. Соединение по п.1, в котором В¹ представляет собой водород, В² и В³ представляют собой СОВ⁴и В⁴ представляет собой неразветвленный или разветвленный С^^алкил, или его фармацевтически приемлемые соли.
4. Соединение по п.3, в котором В⁴ выбран из метила, этила, изопропила или трет-бутила, или его фармацевтически приемлемые соли.
5. Соединение по п.4, представляющее собой 3',5'-О-бис(изобутирил)-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'деоксицитидин.
6. Соединение по п.1, в котором В³ представляет собой водород или С(=О)СНВ⁵ИНВ⁶В¹ и В² представляет собой С(=О)СНВ⁵ИНВ⁶.
7. Соединение по п.1, в котором В⁵ представляет собой изопропил, изобутил или втор-бутил.
8. Соединение по п.1, в котором В⁵ имеет стереохимию Ь-аминокислоты.
9. Соединение по п.1, выбираемое из группы, состоящей из 3',5'-О-бис(изобутирил)-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидина, 3',5'-О-бис(Ь-валинил)-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидина, 4'-азидо-3'-О-(Ь-валинил)-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидина, 4'-азидо-3'-О-изобутирил-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидина, 5'-О-(Ь-валинил)-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидина, 5'-О-изобутирил-4'-азидо-2'-в-С-метил-2'-деоксицитидина;

или его фармацевтически приемлемая соль.
10. Применение соединения по п.1 для лечения или приготовления лекарственного средства для лечения заболевания, опосредованного вирусом гепатита С (ВГС).
11. Фармацевтическая композиция, ингибирующая вирус гепатита С, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по п.1 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
12. Фармацевтическая композиция, ингибирующая вирус гепатита С, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по п.1 и а) по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент и Ь) по меньшей мере один модулятор иммунной системы и/или по меньшей мере одно противовирусное средство, которое ингибирует репликацию ВГС.