DE69835887T2

DE69835887T2 - Thermische Mikroventile

Info

Publication number: DE69835887T2
Application number: DE1998635887
Authority: DE
Inventors: A. Mark Ann Arbor BURNS; N. Brian Ann Arbor JOHNSON; Michael Chen
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 1997-07-03
Filing date: 1998-07-02
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2018-07-03
Also published as: AU8284798A; JP2001509437A; US8617905B2; CA2294819A1; US6949385B1; ES2273424T3; US8071056B2; AU748763B2; ATE339640T1; EP1007873B1; CA2294819C; EP1007873A1; WO1999001688A1; DE69835887D1; IL133838A0; US20120077231A1; US6048734A; EP1007873A4; US20050272079A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Mikrofabrikation von Mikromassstabseinrichtungen und Reaktionen in Mikromassstabseinrichtungen und insbesondere die Bewegung von biologischen Proben in Mikrotröpfchen durch Mikrokanäle zum Initiieren biologischer Reaktionen.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Die Komplexität und Leistungsfähigkeit biologischer Reaktionen hat in den zurückliegenden dreissig Jahren gewaltig zugenommen. Auf die anfänglichen Beobachtungen des "Hybridisierungs"-Prozesses, d. h. die Fähigkeit zweier Nucleinsäurepolymere, die komplementäre Sequenzen enthalten, einander zu finden und sich durch Basenpaarungsinteraktion wieder zu verbinden, durch Marmur und Lane, Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. 46, 453 (1960), und Doty et al., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. 46, 461 (1960), folgte die Verfeinerung dieses Prozesses zu einem wesentlichen Hilfsmittel der modernen Biologie.
Anfängliche Hybridisierungsstudien, wie zum Beispiel jene, die durch Hayashi et al., Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A. 50, 664 (1963), durchgeführt wurden, fanden in Lösung statt. Die Weiterentwicklung führte zur Immobi lisierung der Ziel-DNS oder -RNS auf festen Trägern. Mit der Entdeckung spezifischer Restriktionsendonucleasen durch Smith und Wilcox, J. Mol. Biol. 51, 379 (1970), wurde es möglich, diskrete DNS-Fragmente zu isolieren. Die Verwendung von Immobilisierungstechniken, wie zum Beispiel jenen, die durch Southern, J. Mol. Biol. 98, 503 (1975), beschrieben wurden, in Kombination mit Restriktionsenzymen hat es ermöglicht, Einzelkopiegene unter einer Masse fraktionierter genomischer DNS durch Hybridisierung zu identifizieren.
Im Jahr 1977 wurden zwei Verfahren zur DNS-Sequenzierung berichtet. Dabei handelte es sich um das chemische Abbauverfahren von Maxam und Gilbert (1977 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560) und das enzymatische Verfahren von Sanger et al. (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463). Beide Verfahren erzeugen Populationen von radioaktiv markierten Oligonucleotiden, die an einem festen Punkt beginnen und nach dem Zufallsprinzip in einem festen Rest oder Resttyp terminieren. Diese Populationen werden auf Polyacrylamidgele aufgelöst, die die Unterscheidung zwischen Oligonucleotiden gestatten, die sich in der Länge um gerade einmal ein einziges Nucleotid unterscheiden.
Das Verfahren von Maxam und Gilbert arbeitet mit einem DNS-Fragment, das an einem Ende radioaktiv markiert ist, das in fünf separaten chemischen Reaktionen teilweise gespalten wird, von denen jede für eine bestimmte Base oder einen bestimmten Basentyp spezifisch ist. Die Produkte dieser chemischen Reaktionen sind fünf Populationen markierter Moleküle, die sich von dem markierten Ende bis zu der Stelle der chemischen Spaltung erstrecken. Dieses Verfahren hat sich seit seiner anfänglichen Entwicklung kaum verändert. Dieses Verfahren funk tioniert am besten für DNS-Sequenzen, die weniger als 250 Nucleotide von dem markierten Ende entfernt liegen.
Im Gegensatz dazu ist das Verfahren von Sanger in der Lage, mehr als 500 Nucleotide in einer einzigen Gruppe von Reaktionen zu sequenzieren. Das Verfahren von Sanger ist eine enzymatische Reaktion, die mit kettenterminierenden Didesoxynucleotiden (ddNTPs) arbeitet. ddNTPs sind kettenterminierend, weil ihnen ein 3'-Hydroxyl-Rest fehlt, der die Bildung einer Phosphodiester-Verbindung mit dem nachfolgenden Desoxyribonucleotid (dNTP) verhindert. Eine geringe Menge eines einzelnen ddNTP ist mit den vier herkömmlichen dNTPS in einer Polymerisationsreaktion enthalten. Polymerisation oder DNS-Synthese wird durch eine DNS-Polymerase katalysiert. Es gibt eine Konkurrenz zwischen der Verlängerung der Kette durch Einbindung der herkömmlichen dNTPS und der Terminierung der Kette durch Einbindung eines ddNTP. Man lässt ein kurzes Oligonucleotid oder einen kurzen Primer mit einer Matrize, welche die zu sequenzierende DNS enthält, reassoziieren. Die ursprünglichen Protokolle erforderten einsträngige DNS-Matrizen. Die Verwendung doppelsträngiger Matrizen wurde später berichtet (Chen und Seeburg 1985). Der Primer stellt eine 3'-Hydroxyl-Gruppe bereit, die die Polymerisation einer DNS-Kette gestattet, wenn ein Polymerase-Enzym und dNTPS bereitgestellt werden.
Die ursprüngliche Version des Verfahrens von Sanger verwendet das Klenow-Fragment von E. coli-DNS-Polymerase. Dieses Enzym hat die Polymerisation und 3' bis 5'-Exonuclease-Aktivität der nicht-modifizierten Polymerase, doch ihm fehlt die 5' bis 3'-Exonuclease-Aktivität. Das Klenow-Fragment hat verschiedene Einschränkungen, wenn es für die enzymatische Sequenzie rung verwendet wird. Eine Einschränkung ist die geringe Verarbeitbarkeit des Enzyms, wodurch ein starker Hintergrund an Fragmenten entsteht, die durch die zufällige Dissoziation des Enzyms von der Matrize anstatt durch die gewünschte Terminierung infolge der Einbindung eines ddNTP terminieren. Die geringe Verarbeitbarkeit bedeutet auch, dass das Enzym nicht zum Sequenzieren von Nucleotiden verwendet werden kann, die mehr als 250 Nucleotide von dem 5'-Ende des Primers entfernt erscheinen. Eine zweite Einschränkung ist, dass Klenow nicht effizient Matrizen verwenden kann, die Homopolymerstränge oder Regionen von hoher sekundärer Struktur aufweisen. Die Probleme, die durch sekundäre Strukturen in der Matrize verursacht werden, können minimiert werden, indem man die Polymerisationsreaktion bei 55°C ablaufen lässt (R. Gomer und R. Firtel, "Sequencing homopolymer regions", Bethesda Res. Lab. Focus 7: 6 1985).
Zu Verbesserungen an dem ursprünglichen Verfahren von Sanger gehören die Verwendung anderer Polymerasen als das Klenow-Fragment. Es ist Umkehrtranskriptase zum Sequenzieren von Matrizen verwendet worden, die Homopolymerstränge aufweisen (S. Karanthanasis, "M13 DNA sequencing using reverse transcriptase", Bethesda Res. Lab. Focus 4(3): 6 1982; Graham et al., "Direct DNA sequencing using avian myeloblastosis virus and Moleney murine leukemia virus reverse transcriptase", Bethesda Res. Lab. Focus 8(2): 4 1986). Umkehrtranskriptase ist ein wenig besser als das Klenow-Enzym bei Verwendung von Matrizen, die Homopolymerstränge enthalten.
Die Verwendung einer modifizierten T7-DNS-Polymerase (Sequenase^TM) war die bedeutendste Verbesserung an dem Verfahren von Sanger. Siehe Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 13.7–13.9, und Hunkapiller, M. W. (1991) Curr. Op. Gen. Devl. 1: 88–92. Sequenase^TM ist eine chemisch-modifizierte T7-DNS-Polymerase mit reduzierter 3' bis 5'-Exonuclease-Aktivität (Tabor et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4767). Sequenase^TM Version 2.0 ist eine gentechnische Form der T7-Polymerase, der vollständig die 3' bis 5'-Exonuclease-Aktivität fehlt. Sequenase^TM hat eine sehr hohe Verarbeitbarkeit und eine hohe Polymerisationsrate. Es kann effizient Nucleotidanaloge wie zum Beispiel dITP und 7-deaza-dGTP aufnehmen, die zum Auflösen von Kompressionsregionen in Sequenzierungsgelen verwendet werden. In DNS-Regionen mit hohem G+C-Gehalt kann es zur Entstehung von Hoogsteen-Verbindungen kommen, was zu Komprimierungen in der DNS führt. Diese Komprimierungen führen zu abnormalen Migrationsmustern von Oligonucleotidsträngen in Sequenzierungsgelen. Weil sich diese Basenanaloge nur schwach mit herkömmlichen Nucleotiden paaren, werden sekundäre Intrastrangstrukturen gemindert. Im Gegensatz dazu nimmt Klenow diese Analoge nicht so effizient auf. Die Haupteinschränkung bezüglich der Menge an DNS-Sequenz, die aus einer einzelnen Gruppe von Kettenterminierungsreaktionen unter Verwendung von Sequenase^TM erhalten werden kann, ist die Auflösungskraft von Polyacrylamidgelen, nicht die Eigenschaften des Enzyms.
Die Verwendung von Taq-DNS-Polymerase ist eine Ergänzung jüngeren Datums zu den Verbesserungen des Verfahrens von Sanger (Innis et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9436). Taq-Polymerase ist ein wärmestabiles Enzym, das bei 70–75°C effizient arbeitet. Die Fähigkeit zum Katalysieren der DNS-Synthese bei erhöhter Temperatur macht Taq-Polymerase zur Sequenzierung von Matrizen geeignet, die extensive sekundäre Strukturen bei 37°C aufweisen (die Standardtemperatur, die für Klenow- und Sequenase^TM-Reaktionen verwendet wird). Taq-Polymerase hat, wie Sequenase^TM, einen hohen Verarbeitbarkeitsgrad, und wie bei Sequenase 2.0 fehlt ihr die 3' bis 5'-Nuclease-Aktivität.
Es wurden auch Verfahren zum Untersuchen von Einbasenänderungen ohne direkte Sequenzierung entwickelt. Diese Verfahren gestatten das "Scannen" von DNS-Fragmenten auf das Vorhandensein von Mutationen oder sonstigen Sequenzvariationen. Wenn zum Beispiel eine interessierende Mutation zufällig in eine Restriktionserkennungssequenz fällt, so kann eine Änderung des Aufschliessungsmusters als diagnostisches Hilfsmittel verwendet werden (zum Beispiel Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus [RFLP]-Analyse).
Vor dem Hintergrund der Entwicklung dieser komplexen und leistungsfähigen biologischen Techniken ist ein ehrgeiziges Projekt unternommen worden. Dieses Projekt mit dem Namen "Human Genome Project" (HGP) beinhaltet die vollständige Charakterisierung der archetypischen menschlichen Genomsequenz, die 3 × 10⁹ DNS-Nucleotidbasenpaare aufweist. Ein implizites Ziel des Projekts ist die Erkenntnis, dass alle Menschen auf DNS-Sequenz-Ebene zu über 99 % identisch sind. Die Unterschiede zwischen den Menschen bilden jedoch die Informationen, die für die individuelle Gesundheitsfürsorge die grösste Relevanz besitzen, einschliesslich möglicher Schätzungen des Krankheitsrisikos oder des Ansprechens auf eine bestimmte medizinische Behandlung. Nach der Beendigung des HGP wird sich ein Teil der fortgesetzten Bemühungen der humangenetischen Forschungsgemeinde auf die Untersuchung von Unterschieden innerhalb von Popu lationen und von individuellen Varianten vom definierten Archetyp richten. Obgleich die 15-jährige Arbeit des HGP eine definierte DNS-Datenerfassungsmenge darstellt, steht der künftige Bedarf an DNS-Informationen mit individueller genetischer Variation in Verbindung und ist daher unbegrenzt.
Die derzeitigen DNS-Genotypisierungstechnologien sind für die detaillierte Analyse von Proben ausreichend, deren Zahl jährlich von Hunderten bis Tausende reicht. Genotypisierungsprojekte in der Grössenordnung von Millionen Assays übersteigen jedoch die Kapazitäten heutiger Laboratorien. Der Grund dafür sind die derzeitigen Ineffizienzen (i) beim Umgang mit flüssigen Reagens- und DNS-Matrizenlösungen, (ii) bei der Messung von Lösungsvolumina, (iii) beim Vermischen von Reagens und Matrize, (iv) bei der kontrollierten thermischen Reaktion der vermischten Lösungen, (v) beim Beladen eines Elektrophoresegels mit der Probe, und (vi) bei der DNS-Produktdetektion auf grössentrennenden Gelen. Es wird eine Methodologie gebraucht, die ein hohes Volumen an biologischen Reaktionen ohne diese derzeit vorhandenen Ineffizienzen ermöglicht.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert und betrifft die Mikrofabrikation von Mikromassstabseinrichtungen und Reaktionen in Mikromassstabseinrichtungen und insbesondere die Bewegung von biologischen Proben in Mikrotröpfchen durch Mikrokanäle zum Initiieren biologischer Reaktionen. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit Mikromassstabseinrichtungen, die Mikrotröpfchentransportkanäle, Reaktionsregionen (zum Beispiel Kammern), Elektrophoresemodule und Strahlungsdetektoren aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden diese Elemente aus Silicium- und Glassubstraten mikrofabriziert. Die verschiedenen Komponenten sind unter Verwendung eines Oberflächenspannungsgradientenmechanismus verknüpft (d. h. stehen in Flüssigkeitsverbindung), wobei diskrete Tröpfchen unterschiedlich erwärmt und durch geätzte Kanäle vorangetrieben werden. Elektronische Komponenten werden auf dem gleichen Substratmaterial hergestellt, wodurch Sensoren und Steuerschaltungen in dieselbe Einrichtung integriert werden können. Da alle Komponenten unter Verwendung herkömmlicher photolithographischer Techniken hergestellt werden, können Mehrkomponenteneinrichtungen problemlos zu komplexen, integrierten Systemen zusammengesetzt werden. US 4,269,212 offenbart ein Verfahren zum Beschränken des Fluidflusses in einem Kanal, welches das Bereitstellen einer Einrichtung mit einem schmelzbaren Material, das in einem Substrat angeordnet ist, aufweist, wobei das schmelzbare Material mit einem Heizelement assoziiert ist. Bei dem Kanal handelt es sich um einen Seitenkanal, der mit einem Hauptkanal verbunden ist. Nachdem das schmelzbare Material mittels des Heizelements geschmolzen wurde, kommen Bewegungsmittel zum Einsatz, um das schmelzbare Material zu veranlassen, aus dem Seitenkanal zu dem Hauptkanal zu fliessen. Gemäss US 4,269,212 ist der Fluss des schmelzbaren Materials selbst durch den Seitenkanal blockiert.
Es besteht nicht die Absicht, die vorliegende Erfindung durch die Art der in der Mikromassstabseinrichtung ablaufenden Reaktionen einzuschränken. Zu den Reaktionen gehören einschliesslich beispielsweise chemische und biologische Reaktionen. Zu biologischen Reaktionen gehören einschliesslich beispielsweise Sequenzierung, Re striktionsenzymaufschliessungen, RFLP, Nucleinsäureverstärkung und Gelelektrophorese. Es ist ebenfalls nicht beabsichtigt, die Erfindung durch den konkreten Zweck der Ausführung der biologischen Reaktionen einzuschränken. In einer medizinischen Diagnoseanwendung kann es wünschenswert sein, zwischen einem heterozygoten und einem homozygoten Ziel zu unterscheiden und im letzteren Fall anzugeben, welche Homozygote vorliegt. wo eine bestimmte genetische Position für Allel A oder Allel a codieren könnte, gestattet das Assay die Unterscheidung zwischen einem AA-, einem Aa- und einem aa-Allelpaar. In einer weiteren medizinischen Diagnoseanwendung kann es wünschenswert sein, einfach das Vorhandensein oder Fehlen spezifischer alleler Varianten von Pathogenen in einer klinischen Probe zu detektieren. Zum Beispiel können verschiedene Spezies oder Unterspezies von Bakterien unterschiedlich auf Antibiotika ansprechen. Eine rasche Identifizierung der spezifischen Spezies oder Unterspezies dient der Aids-Diagnose und ermöglicht die Einleitung einer entsprechenden Behandlung.
Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit einem Verfahren zum Bewegen von Mikrotröpfchen. Es ist beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung durch die konkrete Art des Mikrotröpfchenströmungslenkungsmittels eingeschränkt wird. In einer Ausführungsform weist sie eine Reihe von Aluminiumheizelementen auf, die entlang des Transportkanals gruppiert sind, und die Mikrotröpfchen werden durch Differenzialerwärmung des Mikrotröpfchens durch die Heizelemente transportiert.
Es ist empirisch festgestellt worden, dass die Verfahren und Einrichtungen der vorliegenden Erfindung mit Erfolg eingesetzt werden können, wenn vor dem oben be schriebenen Transportieren der eine oder die mehreren Transportkanäle mit einer hydrophilieverstärkenden Verbindung behandelt werden. Es ist nicht beabsichtigt, die Erfindung durch den genauen Zeitpunkt zu beschränken, wann die Behandlung stattfindet. Es gibt genau genommen eine gewisse Flexibilität aufgrund der Langlebigkeitscharakteristika einiger Verstärkungsverbindungen.
Es wurde des Weiteren empirisch festgestellt, dass die Notwendigkeit einer Flüssigkeitssperre zwischen der Flüssigkeit in den Kanälen und der Elektronik des Siliciumchips besteht. Eine bevorzugte Sperre weist eine erste Siliciumoxidschicht, eine Siliciumnitridschicht und eine zweite Siliciumoxidschicht auf.
Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit Einrichtungen auf Siliciumbasis, die eine Vielfalt von Mikrotröpfchentransportkanälen enthalten. In einer Ausführungsform weist die Einrichtung Folgendes auf: i) ein Gehäuse aus Silicium, ii) einen in dem Silicium geätzten Mikrotröpfchentransportkanal, iii) ein Mikrotröpfchenempfangsmittel, das über die Transportkanäle mit einer Reaktionsregion in Flüssigkeitsverbindung steht, und iv) eine Flüssigkeitssperre, die zwischen den Transportkanälen und einem Mikrotröpfchenströmungslenkungsmittel angeordnet ist. In einer Ausführungsform ist die Einrichtung aus zwei Teilen zusammengesetzt. Zuerst werden die Kanäle in einer beliebigen Anzahl von Konfigurationen geätzt. Als zweites wird dieses Stück mit einem Chip auf Siliciumbasis verbondet, der die Elektronik enthält. Das ermöglicht sowohl spezifische Anpassung (in dem ersten Stück) als auch Standardisierung (in dem zweiten Stück).
Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich des Weiteren mit Einrichtungen und Verfahren für die Abdichtung von Kanälen mit schmelzbarem Material. In einer Ausführungsform weist die Einrichtung ein schmelzbares Material auf, das innerhalb eines Substrats angeordnet ist und mit einem Heizelement assoziiert ist.
In einer weiteren Ausführungsform beschäftigt sich die vorliegende Erfindung mit einem Verfahren zum Beschränken des Fluidflusses in einem Kanal, wobei das Verfahren Folgendes aufweist: a) Bereitstellen einer Einrichtung, die Folgendes aufweist: i) ein schmelzbares Material, das innerhalb eines Substrats angeordnet ist, wobei das schmelzbare Material mit einem Heizelement assoziiert ist; und ii) eine Membran, die so positioniert ist, dass sie im ausgedehnten Zustand das schmelzbare Material berührt; b) Dehnen der Membran dergestalt, dass sie das schmelzbare Material berührt; und c) Erwärmen des schmelzbaren Materials mit dem Heizelement dergestalt, dass sich das schmelzbare Material wenigstens teilweise verflüssigt, und dergestalt, dass das Substrat nicht beschädigt wird. In einer Ausführungsform weist das Verfahren des Weiteren auf, d) das schmelzbare Material abkühlen zu lassen. Obgleich die vorliegende Erfindung nicht durch die Grösse des Kanals eingeschränkt ist, weist das Substrat in einer Ausführungsform des Weiteren einen Mikrotröpfchenkanal auf, der in dem Substrat angeordnet ist, wobei das schmelzbare Material innerhalb des Mikrotröpfchenkanals angeordnet ist.
Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich des Weiteren mit einem Verfahren zum Einschränken des Fluidflusses in einem Kanal, das Folgendes aufweist: a) das Bereitstellen: i) eines Hauptkanals, der mit einem Seitenka nal verbunden ist und innerhalb eines Substrats angeordnet ist, ii) eines schmelzbaren Materials, das innerhalb des Seitenkanals angeordnet ist und mit einem Heizelement assoziiert ist, und iii) eines Bewegungsmittels, das dergestalt mit dem Seitenkanal verbunden ist, dass das Anwenden des Bewegungsmittels das schmelzbare Material veranlasst, aus dem Seitenkanal in den Hauptkanal zu fliessen; b) Erwärmen des schmelzbaren Materials dergestalt, dass sich das schmelzbare Material wenigstens teilweise verflüssigt; und c) Anwenden des Bewegungsmittels dergestalt, dass das verflüssigte schmelzbare Material aus dem Seitenkanal in den Hauptkanal fliesst. Obgleich die vorliegende Erfindung nicht durch das Bewegungsmittel eingeschränkt ist, ist das Bewegungsmittel in einer Ausführungsform Druckluft. In einer Ausführungsform weist das Verfahren des Weiteren auf, d) das schmelzbare Material abkühlen zu lassen. Obgleich die vorliegende Erfindung nicht durch die Grösse des Kanals beschränkt ist, sind der Hauptkanal und der Seitenkanal in einer Ausführungsform Mikrotröpfchenkanäle.
Obgleich die vorliegende Erfindung nicht durch die Art des Substrats beschränkt ist, weist das Substrat in einer Ausführungsform Silicium oder Glas auf. Gleichermassen ist die vorliegende Erfindung nicht durch die Zusammensetzung des schmelzbaren Materials beschränkt. In einer Ausführungsform umfasst das schmelzbare Material Lot. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Lot Sn:Pb im Verhältnis 40:60. In weiteren Ausführungsformen ist das schmelzbare Material aus einer Gruppe ausgewählt, die aus Kunststoff, Polymer und Wachs besteht. Gleichermassen ist die vorliegende Erfindung nicht durch die Anordnung des schmelzbaren Materials in dem Substrat beschränkt. In einer weiteren Ausführungsform ist das schmelzbare Material neben einem Kanal angeordnet, während es in einer weiteren Ausführungsform in der Nähe der Kreuzung von mehr als einem Kanal angeordnet ist.
Definitionen
Die im vorliegenden Text verwendeten Begriffe sind folgendermassen definiert:
"Biologische Reaktionen" meint Reaktionen, an denen Biomoleküle wie zum Beispiel Enzyme (zum Beispiel Polymerasen, Nucleasen usw.) und Nucleinsäuren (sowohl RNS als auch DNS) beteiligt sind. Biologische Proben sind solche, die Biomoleküle enthalten, wie zum Beispiel Proteine, Lipide und Nucleinsäuren. Die Probe kann von einem Mikroorganismus (zum Beispiel einer Bakterienkultur) oder von einem Tier stammen, einschliesslich vom Menschen (zum Beispiel Blut, Urin usw.). Alternativ kann die Probe einer Reinigung (zum Beispiel einer Extraktion) oder einer sonstigen Behandlung unterzogen worden sein. Biologische Reaktionen erfordern einen gewissen Grad an Bioverträglichkeit mit der Einrichtung. Das heisst, die Reaktionen sollten idealerweise nicht wesentlich durch die Charakteristika oder die Art der Komponenten der Einrichtung gehemmt werden.
"Chemische Reaktionen" meint Reaktionen, an denen chemische Reaktanden, wie zum Beispiel anorganische Verbindungen, beteiligt sind.
"Kanäle" sind Wege durch ein Medium (zum Beispiel Silicium), die die Bewegung von Flüssigkeiten und Gasen ermöglichen. Kanäle können somit andere Komponenten verbinden, d. h. Komponenten "in Flüssigkeitsverbindung" halten. "Mikrotröpfchentransportkanäle" sind Kanäle, die (in Mikrometern) so konfiguriert sind, dass sie "Mikrotröpfchen" aufnehmen können. Obgleich es nicht beabsichtigt ist, die vorliegende Erfindung durch genaue Abmessungen der Kanäle oder genaue Volumina für Mikrotröpfchen einzuschränken, seien zur Veranschaulichung folgende Bereiche für Kanäle und Mikrotröpfchen genannt: Die Kanäle können zwischen 0,35 und 50 μm (bevorzugt 20 μm) tief und zwischen 50 und 1000 μm (bevorzugt 500 μm) breit sein, und das Volumen der Mikrotröpfchen kann (anhand ihrer Längen berechnet) in einem Bereich zwischen ungefähr einem (1) und (100) (in der Regel zwischen zehn und fünfzig) Nanolitern liegen.
"Transportieren" meint "hindurch bewegt zu werden", wie in dem Fall, wo ein Mikrotröpfchen durch einen Transportkanal hindurch zu einem bestimmten Punkt, wie zum Beispiel einer Reaktionsregion, transportiert wird. Das Transportieren kann über ein Strömungslenkungsmittel bewerkstelligt werden.
Ein "Strömungslenkungsmittel" ist ein beliebiges Mittel, mit dem eine Bewegung eines Mikrotröpfchens in einer bestimmten Richtung erreicht wird. Ein bevorzugtes Lenkungsmittel nutzt einen Oberflächenspannungsgradientenmechanismus, bei dem diskrete Tröpfchen differenziell erwärmt und durch geätzte Kanäle hindurch angetrieben werden.
"Hydrophilieverstärkende Verbindungen" sind jene Verbindungen oder Präparate, welche die Hydrophilie einer Komponente verstärken, wie zum Beispiel die Hydrophilie eines Transportkanals. Die Definition ist nicht strukturell, sondern funktional. Zum Beispiel ist Rain-X^TM Anti-Fog ein handelsübliches Reagens, das Glykole und Siloxane in Ethylalkohol enthält. Jedoch ist die Tatsache, dass es eine Glas- oder Siliciumoberfläche hydrophiler macht, wichtiger als die konkrete Formel des Reagens.
"Initiieren einer Reaktion" meint zu bewirken, dass eine Reaktion stattfindet. Reaktionen können durch ein beliebiges Mittel initiiert werden (zum Beispiel Wärme, Wellenlängen von Licht, Beigabe eines Katalysators usw.).
Eine "Flüssigkeitssperre" oder "Feuchtigkeitssperre" ist eine beliebige Struktur oder ein beliebiger Behandlungsprozess an vorhandenen Strukturen, die bzw. der Kurzschlüsse und/oder Schäden an elektronischen Elementen verhindert (zum Beispiel die Zerstörung der Aluminiumheizelemente verhindert). In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Flüssigkeitssperre eine erste Siliciumoxidschicht, eine Siliciumnitridschicht und eine zweite Siliciumoxidschicht auf.
"Vermengen" ist etwas anderes als "Vermischen". Wenn ein erstes und ein zweites Mikrotröpfchen vermengt werden, so dass ein vermengtes Mikrotröpfchen entsteht, so kann die Flüssigkeit vermischt sein, muss aber nicht. Des Weiteren kann der Grad des Vermischens in einem vermengten Mikrotröpfchen durch eine Vielzahl verschiedener Techniken, die durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen werden, verstärkt werden, einschliesslich beispielsweise des Umkehrens der Strömungsrichtung des vermengten Mikrotröpfchens.
"Nucleinsäureverstärkung" beinhaltet das Erhöhen der Konzentration von Nucleinsäure und insbesondere der Konzentration eines bestimmten Stücks von Nucleinsäure.
Eine bevorzugte Technik ist als die "Polymerasekettenreaktion" bekannt. Mullis et al., US-Patente Nr. 4,683,195 und Nr. 4,683,202, beschreiben ein Verfahren zum Erhöhen der Konzentration eines Segments der Zielsequenz in einer Mischung aus genomischer DNS ohne Klonen oder Reinigen. Dieser Prozess zum Verstärken der Zielsequenz besteht aus dem Einbringen eines molaren Überschusses zweier Oligonucleotidprimer in die DNS-Mischung, welche die gewünschte Zielsequenz enthält. Die zwei Primer sind zu ihren jeweiligen Strängen der doppelsträngigen Sequenz komplementär. Die Mischung wird denaturiert, woraufhin man sie hybridisieren lässt. Im Anschluss an die Hybridisierung werden die Primer mit Polymerase erweitert, so dass komplementäre Stränge entstehen. Die Schritte der Denaturierung, Hybridisierung und Polymeraseerweiterung können so oft wie nötig wiederholt werden, um eine relativ hohe Konzentration eines Segments der gewünschten Zielsequenz zu erhalten. Die Länge des Segments der gewünschten Zielsequenz wird durch die relativen Positionen der Primer relativ zueinander bestimmt, weshalb diese Länge ein kontrollierbarer Parameter ist. Aufgrund des wiederholenden Aspekts des Prozesses wird das Verfahren von den Erfindern als die "Polymerasekettenreaktion" (im Weiteren "PKR") bezeichnet. Weil das gewünschte Segment der Zielsequenz zu den dominanten Sequenzen (im Hinblick auf die Konzentration) in der Mischung wird, spricht man davon, dass sie "PKR-verstärkt" sind.
"Substrat" meint im Sinne des vorliegenden Textes ein Material, das in der Lage ist, Kanäle und Mikrotröpfchentransportkanäle zu enthalten. Als nicht-einschränkende Beispiele seien Silicium und Glas genannt.
"Schmelzbares Material" meint im Sinne des vorliegenden Textes ein Material, das sich bei Umgebungstemperatur mindestens in einem halb-festen (und bevorzugt einem vollkommen festen) Zustand befindet, das sich verflüssigt, wenn es auf Temperaturen oberhalb der Umgebungstemperatur erwärmt wird, und das sich beim Abkühlen wenigstens teilweise wieder verfestigt. Bevorzugt verflüssigt sich schmelzbares Material wenigstens teilweise bei einer Temperatur, die das Substrat unbeschädigt lässt. Das heisst, bei der Temperatur, bei der sich das schmelzbare Material verflüssigt, verflüssigen sich das Substrat und andere Metalle in dem Substrat nicht (was sich problemlos testen lässt, wie in Beispiel 6 dargelegt) und ändern nicht ihre Eigenschaften. Mit "Ändern der Eigenschaften" ist gemeint, dass das Substrat oder Metall seine strukturelle Integrität beibehält, nicht seine Leitfähigkeit ändert und sich nicht verflüssigt. Das Charakteristikum der Schmelzfähigkeit ist also nicht an einen bestimmten Schmelzpunkt geknüpft. Als nicht-einschränkende Beispiele seien Lot, Wachs, Polymer und Kunststoff genannt.
"Lot" meint im Sinne des vorliegenden Textes ein Metall oder eine Legierung, das bzw. die ein schmelzbares Material ist. Bevorzugt ist das Lot ein Lot mit niedriger Schmelztemperatur, wie es zum Beispiel in US-Patent Nr. 4,967,950 beschrieben ist. Mit "Lot mit niedriger Schmelztemperatur" ist eine eutektische Legierung gemeint. Obgleich die vorliegende Erfindung nicht auf ein spezifisches Lot beschränkt ist, ist eine bevorzugte Lotzusammensetzung für die Paste eine eutektische Legierung aus Zinn und Blei im Verhältnis 63:37. Ein weiteres kompatibles Lot ist eine 90 %-ige Metallzusammensetzung mit einer eutektischen Legierung aus Zinn, Blei und Silber im Verhältnis 63:35:2. Weitere gewünschte Lotzusammensetzungen wie zum Beispiel eutektisches Pb:Sn, Pb:In, Pb:In:Sn usw.
"Heizelement" meint im Sinne des vorliegenden Textes ein Element, das in der Lage ist, ein schmelzbares Material wenigstens teilweise zu verflüssigen. Ein schmelzbares Material ist mit einem Heizelement "assoziiert", wenn es sich in einer solchen Nähe zu dem Heizelement befindet, dass das Heizelement das schmelzbare Material wenigstens teilweise schmelzen kann. Die erforderliche Nähe hängt von den Schmelzcharakteristika des schmelzbaren Materials sowie von der Heizleistung des Heizelements ab. Das Heizelement kann gegebenenfalls innerhalb desselben Substrats wie das schmelzbare Material angeordnet sein.
"Membran" meint im Sinne des vorliegenden Textes ein Element, das so gehandhabt werden kann, dass es wenigstens teilweise den Durchtritt von Fluid in einem Kanal in einer Position (ausgedehnt) sperren und den Fluidfluss in einem Kanal in einer anderen Position freigeben kann. Eine "Betätigungskraft" ist eine Kraft, die in der Lage ist, eine Membran auszudehnen. Ein "Ventilsitz" ist ein Element, das dafür ausgelegt ist, einen Abschnitt der Membran im ausgedehnten Zustand aufzunehmen. Ein "Bewegungsmittel" ist ein Mittel, das in der Lage ist, verflüssigtes schmelzbares Material zu bewegen (zum Beispiel Druckluft, Magnetfeld usw.).
Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Schaubild eines integrierten Analysesystems der vorliegenden Erfindung.
2 zeigt ein zweiteiliges Konstruktionskonzept für eine Siliciumeinrichtung der vorliegenden Erfindung.
3 ist ein Schaubild des Prinzips der thermisch induzierten Flüssigkeitsmikrotröpfchenbewegung in einem geschlossenen Kanal.
4A zeigt ein ausgewähltes Vollbild eines Videobandes, wobei sich zwei Mikrotröpfchen an ihren Startpositionen in den Zweigen des Y-Kanals befinden.
4B zeigt eine Bewegung durch Erwärmen der linken Grenzfläche beider Mikrotröpfchen.
4C zeigt die Mikrotröpfchen am Schnittpunkt.
4D zeigt das Vermengen der Mikrotröpfchen zu einem kombinierten Mikrotröpfchen. Die hohlen Pfeilspitzen in der Figur weisen auf den hinteren Meniskus, und die ausgefüllten Pfeilspitzen weisen auf den vorderen Meniskus für jedes Mikrotröpfchen.
5A ist eine Mikrofotografie von Einbettungsheizelementen auf der Oberfläche eines Siliciumwafers.
5B ist eine Elektronenraster-Mikrofotografie (ERMF) eines Einbettungsheizdrahtes im Querschnitt (die Pfeile bezeichnen die abgeschiedenen Aluminium-, Siliciumdioxid- und Siliciumnitridschichten).
5C ist eine ERMF eines Kanals, der mittels eines Nassätzprozesses auf Glas ausgebildet ist, in Querschnittsdarstellung, wobei sich die geätzte Fläche des Wafers unmittelbar neben dem Kreuzungspunkt zweier Kanäle befindet.
6A ist eine Mikrofotografie einer Polyacrylamidgelelektrophorese in einem breit geätzten Glaskanal.
6B ist eine Mikrofotografie einer Gruppe von vier diffusionsdotierten Diodenstrahlungsdetektorelementen, die auf einem Siliciumwafer ausgebildet sind.
6C ist eine Oszilloskopspur eines Ausgangs aus dem Strahlungsdetektor, die individuelle Zerfallsereignisse von ³²P-markierter DNS zeigt.
7 ist ein Foto einer Gelelektrophorese von PKR-Reaktionen, wobei der PKR potenziell hemmende Komponenten direkt beigegeben werden.
8 ist eine Ausführungsform einer Testeinrichtung für die vorliegende Erfindung.
9 ist ein Schaubild einer Ausführungsform zum Herstellen eines verschliessbaren Ventils der vorliegenden Erfindung.
10 ist ein Schaubild einer Ausführungsform für das Layout des beweglichen Dichtmittels der vorliegenden Erfindung.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Mikrofabrikation und biologischen Reaktionen in mikrofabrizierten Einrichtungen und insbesondere die Bewegung und das Vermischen von biologischen Proben in Mikrotröpfchen durch Mikrokanäle. Die Beschreibung der Erfindung beinhaltet:

I) die Konstruktion von Mikromassstabseinrichtungen (dazu gehören Mikrotröpfchentransportkanäle, Reaktionskammern, Elektrophoreseöffnungen und Strahlungsdetektoren) unter Verwendung von Silicium- und Glassubstraten,
II) die Bewegung diskreter Mikrotröpfchen unter Verwendung eines Oberflächenspannungsgradientenmechanismus, wobei diskrete Mikrotröpfchen differenziell erwärmt und durch geätzte Kanäle hindurch angetrieben werden, und
III) das Vermischen von biologischen Proben für Reaktionen.

I. Konstruktion von Mikromassstabseinrichtungen
Obgleich es viele Formate, Materialien und Grössenmassstäbe für den Bau integrierter fluidischer Systeme gibt, zieht die vorliegende Erfindung mikrofabrizierte Siliciumeinrichtungen als eine kosteneffektive Lösung in Betracht. Silicium ist das Material, das für die Herstellung von Computer-Mikroprozessoren verwendet wird, und seine Fertigungstechnologien haben sich in den zurückliegenden 30 Jahren in beispiellosem Tempo entwickelt. Obgleich diese Technologie ursprünglich für die Herstellung mikroelektronischer Bausteine angewendet wurde, werden die gleichen Techniken heute auch für mikromechanische Systeme genutzt.
Der Flüssigkeitstransport im Dauerfluss ist unter Verwendung einer mikrofluidischen Einrichtung, die mit Silicium entwickelt wurde, beschrieben worden. Siehe J. Pfahler et al., Sensors and Actuators, A21–A23 (1990), Seiten 431–434. Es sind auch Pumpen beschrieben worden, die mit von aussen einwirkenden Kräften arbeiten, um eine Strömung zu erzeugen, und die auf der mikromaschinellen Bearbeitung von Silicium basieren. Siehe H. T. G. Van Lintel et al., Sensors and Actuators 15: 153–167 (1988). Im Gegensatz dazu arbeitet die vorliegende Erfindung mit dem Transport diskreter Tröpfchen in Silicium (d. h. im Gegensatz zum Dauerfluss) unter Verwendung interner Kräfte (d. h. im Gegensatz zur Verwendung externer Kräfte, die durch Pumpen erzeugt werden).
Als ein mechanisches Baumaterial hat Silicium allgemein bekannte Fertigungseigenschaften. Die wirtschaftliche Attraktivität von Bauelementen aus Silicium ist, dass ihre zugehörigen mikromaschinellen Bearbeitungstechnologien im Wesentlichen fotografische Reproduktionstechniken sind. In diesen Prozessen werden transparente Matrizen oder Masken, die opake Strukturen enthalten, verwendet, um Objekte auf der Oberfläche des Siliciumsubstrats zu fotodefinieren. Die Strukturen auf den Matrizen werden mit Hilfe von Programmen für computerunterstütztes Design erzeugt. Diese können Strukturen mit Linienbreiten von weniger als einem Mikrometer zeichnen. Nachdem eine Matrize erzeugt wurde, kann sie fast unendlich oft verwendet werden, um identische Replikatstrukturen zu erzeugen. Folglich können selbst überaus komplexe Mikromaschinen in Serienfertigungsmengen und zu geringen Grenzstückkosten reproduziert werden, sofern alle Komponenten mit dem mikromaschinellen Siliciumbearbeitungsprozess kompatibel sind. Obgleich auch für andere Substrate, wie zum Beispiel Glas oder Quarz, photolithographische Verfahren eingesetzt werden können, um mikrofabrizierte Analyse-Einrichtungen herzustellen, bietet nur Silicium den zusätzlichen Vorteil, eine grosse Vielzahl verschiedener elektronischer Komponenten innerhalb derselben Struktur herstellen zu können.
In einer Ausführungsform erwägt die vorliegende Erfindung mikromaschinell bearbeitete Siliciumkomponenten in einem integrierten Analysesystem, das die in 1 schematisch gezeigten Elemente enthält. In diesem vorgeschlagenen Format werden die Probe und das Reagens über Eingangsöffnungen (A) in die Einrichtung injiziert, und sie werden als diskrete Tröpfchen durch Kanäle (B) zu einer Reaktionskammer transportiert, wie zum Beispiel einem thermisch gesteuerten Reaktor, wo Vermischen und Reaktionen (zum Beispiel Restriktionsenzymaufschliessung oder Nucleinsäureverstärkung) stattfinden (C). Die biochemischen Produkte werden dann mittels des gleichen Verfahrens zu einem Elektrophoresemodul (D) bewegt, wo Migrationsdaten durch einen Detektor (E) erfasst und zu einem (nicht gezeigten) Aufzeichnungsinstrument übermittelt werden. Vor allem sind die fluidischen und elektronischen Komponenten in Funktion und Aufbau auf volle Kompatibilität mit den biologischen Reaktionen und Reagentien ausgelegt.
Bei der mikromaschinellen Siliciumbearbeitung beinhaltet eine einfache Technik zum Ausbilden geschlossener Kanäle das Ätzen einer offenen Mulde auf der Oberfläche eines Substrats und das anschliessende Bonden eines zweiten, ungeätzten Substrat über den offenen Kanal. Es gibt eine breite Vielfalt isotroper und anisotroper Ätzreagentien, entweder als Flüssigkeit oder als Gas, mit denen sich Kanäle mit exakt definierten Seitenwänden und gleichmässigen Ätztiefen erzeugen lassen. Da die Pfade der Kanäle durch die Fotoprozessmaske definiert werden, ist die Komplexität der Kanalstrukturen auf der Einrichtung praktisch unbeschränkt. Ein kontrolliertes Ätzen kann auch Probeneintrittslöcher erzeugen, die vollständig durch das Substrat hindurch verlaufen, was zu Eingangsöffnungen auf der Aussenseite der Einrichtung führt, die mit Kanalstrukturen verbunden sind.
2 zeigt ein Konzept eines zweiteiligen Aufbaus. Mikrokanäle (100) werden in dem Siliciumsubstrat (200) ausgebildet, und die Struktur wird auf ein Glassubstrat (300) gebondet. Die Technik des zweiteiligen Kanalaufbaus erfordert Ausrichtungs- und Bondingprozesse, eignet sich aber für eine Vielzahl verschiedener Substrate und Kanalprofile. Oder anders ausgedrückt: Für Herstellungszwecke gestattet das zweiteilige Konzept die zweckspezifische Anpassung eines Stücks (d. h. des Siliciums mit Kanälen und Reaktionsformaten) und das Verbonden mit einem standardisierten (nicht zweckspezifisch angepassten) zweiten Stück, das zum Beispiel standardmässige elektrische Kontaktstellen (400) enthält.
II. Bewegung von diskreten Mikrotröpfchen
Die vorliegende Erfindung beschreibt die kontrollierte Bewegung flüssiger Proben in diskreten Tröpfchen in Silicium. Der Transport diskreter Tröpfchen beinhaltet ein System, das geschlossene Kanäle oder Röhren verwendet, um die Flüssigkeit zu den gewünschten Stellen zu transportieren (1, B). Innerhalb der Kanäle können diskrete Flüssigreagens-Mikrotröpfchen injiziert, gemessen und zwischen den biochemischen Analysekomponenten bewegt werden. Die Bewegung diskreter Tröpfchen hat drei Vorteile. Zuerst wird jedes Probentröpfchen von allen anderen getrennt, so dass das Risiko einer Kontamination verringert wird. Zweitens kann in einem gleichförmigen Kanal das Volumen jeder Probe durch blosses Messen der Tröpfchenlänge bestimmt werden. Drittens kann die Bewegung dieser Tröpfchen durch einfaches Erwärmen erreicht werden (d. h. unter Ausnutzung interner Kräfte und ohne bewegliche Teile). Die Bewegung erfolgt unter Nutzung von Wärmegradienten, um die Grenzflächenspannung auf der Vorder- oder Rückseite der Tröpfchen zu ändern und somit Druckunterschiede an den Tröpfchen zu erzeugen (3). Zum Beispiel kann ein Tröpfchen in einem hydrophilen Kanal durch Erwärmen der rückseitigen Grenzfläche vorwärts getrieben werden. Die lokale Erhöhung der Temperatur verringert die Oberflächenspannung auf der Rückseite des Tröpfchens und verringert darum den Druckunterschied an der Grenzfläche. Der verringerte Druckunterschied entspricht einer Erhöhung des lokalen Innendrucks auf jenes Ende des Tröpfchens (P₁ nimmt zu). Die zwei Tröpfchengrenzflächen sind nicht mehr im Gleichgewicht, wobei P₁ grösser als P₂ ist, und der Druckunterschied treibt die Tröpfchen voran.
Das heisst, die Vorwärtsbewegung kann dadurch aufrecht erhalten werden, dass man das Tröpfchen fortgesetzt an seiner Rückseite mittels aufeinanderfolgender Heizvorrichtungen entlang des Kanals erwärmt, während das Erwärmen der Vorderseite zum Umkehren der Bewegung des Tröpfchens verwendet werden kann. Das Anlegen einer Spannung an den Draht unter dem Kanal erzeugt Wärme unter dem Rand des Tröpfchens. Das Erwärmen der linken Grenzfläche erhöht den Innendruck auf jenes Ende des Tröpfchens und drängt das gesamte Tröpfchen nach rechts. Der Druck auf das Innere des Tröpfchens kann berechnet werden, wenn man den atmosphärischen Druck P_atm, die Oberflächenspannung σ und die Abmessungen des Kanals kennt. Für einen kreisrunden Querschnitt ist der Innendruck P_i durch P_i = P_atm – (4σ cos θ)/d gegeben, wobei d der Durchmesser des Kanals ist und θ der Kontaktwinkel ist. Da σ eine Funktion der Temperatur ist (σ = σ₀(1 – bT), wobei σ₀ und b positive Konstanten sind und T die Temperatur ist), verringert ein Erhöhen der Temperatur am linken Ende des Tröpfchens die Oberflächenspannung und erhöht darum den Innendruck an jenem Ende. Der Druckunterschied zwischen den zwei Enden drückt dann das Tröpfchen in Richtung des geringeren Drucks (d. h. nach rechts). Das dargestellte wässrige Tröpfchen befindet sich in einem hydrophilen Kanal (0 < θ < 90). Im Fall eines hydrophoben Kanals (90 < θ < 180) würde das Erwärmen des rechten Randes das Tröpfchen nach rechts verschieben.
Die Kontaktwinkelhysterese (der Kontaktwinkel am vorauseilenden Rand des Tröpfchens ist grösser als der Kontaktwinkel am sich zurückeilenden Rand) erfordert einen Mindesttemperaturunterschied, bevor es zu einer Bewegung kommt. Die Geschwindigkeit des Tröpfchens nach Beginn der Bewegung kann mittels der Gleichung v = ÆPd²/32 μL angenähert werden, wobei ÆP der Druckunterschied ist, μ die Viskosität der Lösung ist und L die Länge des Tröpfchens ist. Die vorliegende Erfindung zieht Temperaturunterschiede von mehr als dreissig (30) Grad Celsius zum Erzeugen einer Bewegung in Betracht. Experimente, bei denen Temperatursensoren, die entlang des gesamten Kanals angeordnet waren, verwendet wurden, zeigen, dass ein Unterschied von ungefähr 40°C an den Tröpfchen ausreicht, um eine Bewegung zu erzeugen. In diesen Experimenten betrug der Kanalquerschnitt 20 μm × 500 μm, und das Volumen jedes dieser Tröpfchen kann anhand seiner Länge berechnet werden und beträgt ungefähr 100 Nanoliter für ein 1 cm langes Tröpfchen.
III. Durchflusssteuerung mit abgedichteten Ventilen
Die vorliegende Erfindung zieht die Verwendung abgedichteter Ventile zum Steuern des Fluidflusses in Betracht. Obgleich die vorliegende Erfindung nicht auf ein bestimmtes Abdichtungsverfahren beschränkt ist, drückt in einer Ausführungsform eine Betätigungskraft eine Membran gegen einen Ventilsitz, um den Fluidfluss zu begrenzen, und die Membran wird dann gegen den Ventilsitz abgedichtet. In einer solchen Ausführungsform sind die Lötkontakte mit einem Heizelement assoziiert, welches das Lot schmelzen kann. Dieses verflüssigte Lot fliesst über Bereiche des Ventilsitzes und der Membran, um Kontaminierungen, Risse und Brüche zwischen der Membran und dem Ventilsitz zu überdecken. Während die Betätigungskraft immer noch die Membran und den Ventilsitz zusammenhält, wird das Heizelement abgeschaltet, damit sich das Lot abkühlen und wiederverfestigen kann. Nach dem Verfestigen kann die Betätigungskraft gelöst werden, und das Ventil ist abgedichtet. Um das Ventil wieder zu öffnen, kann das Lot verflüssigt werden, ohne dass eine Betätigungskraft angelegt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ventil so konstruiert, dass Lötkontakte auf der Membran oder dem Ventilsitz angeordnet werden. Obgleich die vorliegende Erfindung nicht auf ein konkretes Verfahren zum Anordnen dieser Lötkontakte beschränkt ist, wird konkret in Betracht gezogen, dass sie aufgalvanisiert werden können.
IV. Vermischen von biologischen Proben in Reaktionen
Die Tröpfchenbewegung (die oben allgemein beschrieben wurde) wird als ein einzelner Schritt in einem Weg betrachtet. Die übrigen Schritte beinhalten in der Regel das Vermischen der Proben und eine kontrollierte Reak tion. Zum Beispiel ermöglichen es die integralen Heizvorrichtungen, die entlang der gesamten Oberfläche des Kanals, der für die Tröpfchenbewegung verwendet wird, angeordnet sind, auch, dass eine Region eines Kanals als eine thermische Reaktionskammer genutzt wird. Für das Vermischen der Proben vor der Reaktion wird eine Y-Kanal-Einrichtung in Betracht gezogen (4A). In einer solchen Einrichtung wird ein erstes Tröpfchen, das eine erste Probe (zum Beispiel Nucleinsäure) enthält, entlang eines Kanals der Y-Kanal-Einrichtung bewegt, und ein zweites Tröpfchen, das eine zweite Probe (zum Beispiel ein Restriktionsaufschliessungsenzym in Aufschliessungsbuffer) enthält, wird entlang des anderen Kanals der Y-Kanal-Einrichtung (4B und 4C) bewegt.
Nach dem Vermengen der Proben (4D) besteht die Befürchtung, dass die kombinierten Proben nicht ordentlich vermischt wurden. Das heisst, wenn zwei ähnliche Mikrotröpfchen in laminarem Fluss mit der gleichen Strömungsrate in den einzelnen Kanal eintreten, so bilden sie ein axial gleichförmiges Tröpfchen, werden aber in der Breite nicht vermischt. Für das Vermischen in der Breite gibt es eine Reihe verschiedener Möglichkeiten.
Zuerst erfolgt ein einfaches Diffundieren, obgleich für grosse DNS-Moleküle die charakteristische Zeit für dieses Vermischen in der Grössenordnung von mehreren Stunden oder länger liegen kann. Zirkulationsmuster, die während der Bewegung und Erwärmung im Inneren der Tröpfchen erzeugt werden, verkürzen diese Zeit deutlich. In dieser Hinsicht sieht die vorliegende Erfindung vor, die Mischung unter Verwendung der integralen Heizvorrichtungen und Temperatursensoren als eine er wärmte Mischung aufrecht zu halten (zum Beispiel die Temperatur 10 Minuten lang bei 65°C zu halten).
Zweitens erwägt die vorliegende Erfindung das Vermischen durch Umkehren der Strömungsrichtung der Mischung über eine relativ kurze Distanz in dem Kanal. Obgleich eine Vielzahl verschiedener Strömungsumkehrungskonzepte möglich sind, haben sich eine oder zwei Richtungsänderungen über eine Distanz von ungefähr zwei Tröpfchenlängen als sinnvoll erwiesen.
Schliesslich gibt es noch das Vermischungskonzept, wobei die Mischung gegen oder über physische Hindernisse bewegt wird. Zum Beispiel kann die Mischung gegen einen Vermengungspunkt des Y-Kanals "zurückgeschleudert" oder einfach über absichtliche Unebenheiten in dem Kanal hinwegbewegt werden (d. h. ein "Achterbahn"-Vermischen).
Ein erfolgreiches Vermischen kann natürlich durch Charakterisieren des einen oder der mehreren Reaktionsprodukte bestätigt werden. Wo ein Produkt detektiert wird, so war das Vermischen wenigstens teilweise erfolgreich. Die vorliegende Erfindung erwägt in einer Ausführungsform den Einsatz von Elektrophorese zur Bestätigung der Produktbildung.
BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet: I) Mikrofabrikationstechniken zur Herstellung von Einrichtungen auf Siliciumbasis; II) Kanalbehandlung für optimalen Fluss und optimale Reproduzierbarkeit; und III) Konstruktion von Komponente (insbesonde re des Elektrophoresemoduls und der Strahlungsdetektoren).
I. Mikrofabrikation von Einrichtungen auf Siliciumbasis
Wie zuvor angemerkt, hat Silicium allgemein bekannte Fertigungseigenschaften und zugehörige fotografische Reproduktionstechniken. Das hauptsächliche moderne Verfahren zur Herstellung von integrierten Halbleiterschaltkreisen ist der sogenannte planare Prozess. Der planare Prozess beruht auf den einzigartigen Charakteristika von Silicium und beinhaltet eine komplexe Sequenz von Fertigungsschritten, und zwar Abscheiden, Oxidieren, Fotolithografie, Diffusion und/oder Ionenimplantation und Metallisation, um einen aus Schichten aufgebauten integrierten Schaltungsbaustein in einem Siliciumsubstrat herzustellen. Siehe zum Beispiel W. Miller, US-Patent Nr. 5091328.
Zum Beispiel führt die Oxidation eines kristallinen Siliciumsubstrats zur Bildung einer Schicht aus Siliciumdioxid auf der Substratoberfläche. Mittels Fotolithografie kann dann die Siliciumdioxidschicht selektiv strukturiert und geätzt werden, um einen Abschnitt des darunter liegenden Substrats freizulegen. Diese Öffnungen in der Siliciumdioxidschicht gestatten das Einbringen ("Dotieren") von Ionen ("Dotanden") in definierte Bereiche des darunter liegenden Siliciums. Das Siliciumdioxid fungiert als eine Maske. Das heisst, zum Dotieren kommt es nur dort, wo Öffnungen sind. Eine sorgfältige Steuerung des Dotierungsprozesses und der Art des Dotanden ermöglicht die Bildung begrenzter Bereiche mit unterschiedlichen spezifischen elektrischen Widerstandswerten in dem Silicium. Die konkrete Anordnung von ionendotierten Akzeptorregionen (Regionen mit posi tiven freien Löchern, "p"-Regionen) und ionendotierten Donorregionen (Regionen mit negativen freien Löchern, "n"-Regionen) in grosser Zahl definiert das in Wechselbeziehung stehende Design der Transistoren, Widerstände, Kondensatoren und sonstigen Schaltkreiselemente auf dem Siliciumwafer. Die elektrische Verbindung und der elektrische Kontakt zu den verschiedenen p- oder n-Regionen, aus denen der integrierte Schaltkreis besteht, wird durch Abscheiden eines dünnen Films eines leitfähigen Materials, in der Regel Aluminium oder PolySilicium, hergestellt, wodurch das Design des integrierten Schaltkreises abgeschlossen wird.
Natürlich richten sich der konkrete Fertigungsprozess und der konkrete Fertigungsablauf, die zum Einsatz kommen, nach den gewünschten Charakteristika des Bauelements. Heute kann man unter einer breiten Vielzahl verschiedener Bauelemente und Schaltkreise wählen, um eine gewünschte digitale oder analoge Logikfunktion zu implementieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurden Kanäle auf 500 μm dicken Glaswafern (Dow Corning 7740) unter Verwendung standardmässiger Ätzverfahren auf Wasserbasis hergestellt. Die anfängliche Glasoberfläche wurde gereinigt und bekam mittels Elektronenstrahl zwei Schichten Metall (20 nm Chrom, gefolgt von 50 nm Gold) aufgedampft. Photoresist Mikroposit 1813 (Shipley Co.) wurde mit 4000 U/min 30 Sekunden lang aufgebracht, unter Verwendung von Glasmaske 1 strukturiert und entwickelt. Die Metallschichten wurden in Chrom-Ätzmittel (Cr-14, Cyantek Inc.) und Gold-Ätzmittel (Gold Etchant TFA, Transene Co.) geätzte, bis die Struktur deutlich auf der Glasoberfläche zu sehen war. Das zugängliche Glas wurde dann in einer Lösung aus Fluorwasserstoffsäure und Wasser (1:1 Volumen in Volumen) geätzt. Die Ätzraten wurden anhand von Testwafern geschätzt, wobei der letzte Ätzgang in der Regel Kanaltiefen von 20 bis 30 μm erbrachte. Für jeden Wafer wurde die Tiefe des fertigen Kanals unter Verwendung eines Oberflächenprofilometers bestimmt. Der letzte Abziehvorgang (PRS-2000, J. T. Baker) entfernte sowohl das übrige Photoresistmaterial als auch das darüber liegende Metall.
In einer Ausführungsform wurden Kanäle, die in der oben beschriebenen Weise auf Glas geätzt wurden, in einer zweiteiligen Bauweise unter Verwendung von optischem Klebstoff (SK-9 Lens Bond, Sumers Laboratories, Fort Washington, Pennsylvania) an den Heizelementwafer gebondet. Die Verbindung wurde 12 bis 24 Stunden lang unter einer UV-Lichtquelle (365 nm) gehärtet.
Ursprünglich bauten die Autoren der vorliegenden Erfindung die Einrichtung aus einzelnen Siliciumschichten. Die Erfahrungen haben jedoch gezeigt, dass diese unzureichend waren, um Kurzschlüsse infolge der (notwendigen) Flüssigkeitsmikrotröpfchen innerhalb der Kanäle zu verhindern (siehe die unten beschriebenen Experimente). Das bevorzugte Design enthält einen dreifachen Oxidschichtaufbau. Eine solche bevorzugte Einrichtung, die in der Lage ist, Nanoliter-Tröpfchen zu bewegen und zu vermischen, wurde in der Weise hergestellt, dass man ein planares Siliciumsubstrat an Kanäle bondete, die in einer Glasabdeckung geätzt waren. Eine Reihe metallischer Heizvorrichtungen wurde in das Siliciumsubstrat als zwei parallele Bahnen, die zu einer einzigen Bahn (einer "Y"-Form) zusammenliefen (5A), eingebettet. Die Heizelemente wurden ausgebildet, indem zuerst der Wafer mit einer 1,0 μm dicken Schicht aus thermischem Siliciumdioxid beschichtet wurde. Als nächstes wurden 0,35 μm tiefe, 5 μm breite Rinnen mittels Reaktionsionenätzung (RIE) in das Siliciumdioxid anhand des Struktursatzes in einem darüber liegenden Photoresist eingearbeitet. Aluminium wurde in einer Dicke von 0,35 μm über den gesamten Wafer mittels Elektronenstrahlaufdampfung abgeschieden, und die Metallschicht wurde von allen Oberflächen, die einen intakten Photoresist aufwiesen, mit Hilfe einer Abziehlösung abgehoben. Der Metalleinbettungsprozess erbringt eine relativ planare Oberfläche und bildet eine gleichmässige Basis für die Abscheidung einer für die Lösung undurchdringlichen Sperrschicht. Die Sperrschicht wird mittels einer Abfolge von drei plasmaverstärkten chemischen Dampfabscheidungen (PECVD) hergestellt: 1,0 μm Siliciumoxid (SiO_x), 0,25 μm Siliciumnitrid (Si_xN_y) und 1,0 μm Siliciumoxid (SiO_x) (5B). Einige Heizelemente wurden auch als Widerstandstemperatursensoren benutzt.
Die Heizelemente wurden folgendermassen hergestellt. Ein Siliciumwafer (p-Typ, 18–22½ cm (100), Borkonzentration Å 10¹⁵ cm^–3) wurde als ein Substrat für das Aufwachsen von thermischem Oxid SiO₂ (1 μm) verwendet; Photoresist (AZ-5214-E, Hoechst-Celanese) wurde aufgebracht und bei 3000 U/min 30 Sekunden lang aufgeschleudert. Der Resist wurde strukturiert (Metall 1) und entwickelt. Es wurde eine reaktive Ionenätzung (RIE, PlasmaTherm, Inc.) in die SiO₂-Schicht hinein auf eine Tiefe von 0,35 μm unter folgenden Bedingungen ausgeführt: CHF₃, 15 scm³m (Standardkubikzentimeter pro Minute); CF₄, 15 scm³m; 4 mTorr; Vorspannungs-Gleichspannung 200 V, 100 W, 20 Minuten. Die Ätztiefe wurde mittels eines Profilometers bestimmt, und es wurden 0,35 μm metallisches Aluminium mittels Elektronenstrahl abgeschieden. Der Resist und das darüber liegende Metall wurden durch Entwickeln unter Verwendung des Entferners Microposit 1112A in Lösung (Shipley Co.) abgehoben. Die Sperrschichten bestehen aus 1 μm dickem SiO_x, 0,25 μm dickem Si_xN_y und 1 μm dickem SiO_x, die nacheinander unter Verwendung von plasmaverstärkter chemischer Dampfabscheidung (PECVD) abgeschieden wurden. Mittels RIE wurden unter Verwendung einer zweiten Maske Kontaktlöcher in die Metallschicht geätzt (CHF₃, 15 scm³m; CF₄, 15 scm³m; 4 mTorr; und Vorspannungs-Gleichspannung 200 V, 100 W, 120 Minuten).
Wie in 5 gezeigt, sind die Elemente als zwei parallele Bahnen angeordnet, die jeweils eine Breite von 500 μm aufweisen und zu einer einzigen Bahn zusammenlaufen. Die einzelnen Heizvorrichtungen bestehen aus paarweisen Aluminiumdrähten (5 μm), die sich über die 500 μm breite Region winden. Die breiten Metallbereiche auf beiden Seiten der Elemente sind Bondstellen zur Verbindung mit externen Schaltkreisen. Die Breite des Aluminiumelements beträgt 5 μm. Der Kanal in 5C hat identische Breiten- und Designkonfigurationen wie die Heizelementbahnen in 5A und ist gleichmässig 500 μm breit und ungefähr 20 μm tief geätzt.
Der Heizelementwafer wurde an einen Glaswafer gebondet, der geätzte Kanäle mit dem gleichen "Y"-Format enthielt. Ein wässriges chemisches Ätzmittel aus konzentrierter Fluorwasserstoffsäure wurde verwendet, um Kanäle mit definierten Seitenwänden und gleichmässiger Tiefe zu erzeugen. Die geätzten Kanäle sind durch eine Chrom-Gold-Maske definiert und sind 500 μm breit und ungefähr 20 μm tief (3C). Die komplementären Siliciumheiz- und Glaskanalwafer wurden aufeinander ausgerichtet und dann mit Klebstoff verbondet, so dass die fertige Einrichtung entstand.
Jedes Heizelement, das als ein Temperatursensor benutzt wird, wird vorzugsweise zuerst durch Messen des elektrischen Widerstandes bei 22°C und 65°C unter konstanter Spannung kalibriert. Zwischentemperaturen werden durch lineare Interpolation geschätzt.
II. Kanalbehandlung
Vor der Durchführung einer Mikrotröpfchenbewegung und biologischer Reaktionen werden die Kanäle vorzugsweise durch Auswaschen mit Base, Säure, Puffer, Wasser und einer hydrophilieverstärkenden Verbindung, gefolgt von einer relativ hochkonzentrierten Lösung aus nicht-spezifischem Protein, behandelt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Kanäle jeweils mit ungefähr 100 μl der folgenden Lösungen der Reihe nach ausgewaschen: 0,1 N NaOH; 0,1 N HCl; 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), entionisiertes H₂O, Rain-X Anti-Fog (eine hydrophilieverstärkende Verbindung, die auf dem freien Markt bei der Unelko Corp., Scottsdale, Arizona, bezogen werden kann), und 500 μg/μl Rinderserumalbumin (nicht-spezifisches Protein, das auf dem freien Markt in Restriktionsenzymgüte bei GIBCO-BRL bezogen werden kann). Der Wafer wurde auf einen Stereoskop-Objektträger (Olympus SZ1145) gelegt, und die Kontaktstellen für die Heizelemente wurden an eine benötigte Stromversorgung angeschlossen. Das Erwärmen erfolgte in der Weise, dass man ungefähr 30 Volt in kurzen Impulsen durch das Element leitete und die Bewegungsrate der Tröpfchen beobachtete. In jedem Experiment war eine erkennbare Verringerung des Tröpfchenvolumens durch Verdampfung – in der Regel von weniger als 30 % – zu verzeichnen. Die Tröpfchenbewegung wurde mit einer Hamamatsu-Videokamera auf Videoband aufgezeichnet.
III. Komponentendesign
Die vorliegende Erfindung erwägt ein oder mehrere Gelelektrophoresemodule als eine Komponente der Mikromassstabseinrichtung. Theoretische und empirische Forschungen haben gezeigt, dass das Verringern der Dicke des Elektrophoresekanals zu einer verbesserten Auflösung führt. Dünnere Gele leiten Wärme zügiger ab und gestatten das Verwenden höherer Spannungen bei gleichzeitigen Verbesserungen bei der Trennung. Die Position und die Breite des Elektrophoresedetektors sind für die letztendliche Auflösung des Elektrophoresesystems ebenfalls entscheidend. Ein mikromaschinell bearbeiteter elektronischer Detektor, wie zum Beispiel eine Fotodiode, die in dem darunter liegenden Siliciumsubstrat angeordnet ist, kann weniger als einen Mikrometer von der Gelmatrix entfernt sein und kann eine Breite von 5 Mikrometern oder weniger haben. Da die Gellänge, die für die Auflösung zweier migrierender Bänder erforderlich ist, proportional zur Auflösung des Detektors ist, kann die Einarbeitung von mikrometerbreiten elektronischen Detektoren die Gesamtgellänge, die für standardmässige Genotypisierung erforderlich ist, um wenigstens eine Grössenordnung verringern.
Um zu demonstrieren, dass die standardmässige Gelelektrophorese in Kanälen mit Mikrometer-Durchmesser funktioniert, wurden Module unter Verwendung geätzter Glaskanäle, die mit 4B identisch waren, und fluoreszenzmarkierter DNS (interkalierender Farbstoff YOYO) hergestellt. Die Polyacrylamidgelelektrophorese einer komplexen DNS-Mischung ist in 6A in einem 500 μm breiten und 20 μm tiefen Kanal gezeigt. Die Elektrophorese wurde mit der positiven Elektrode auf der rechten Seite und der DNS-Probe auf der linken Seite ausge führt. Die weisse vertikale Linie ist die Gel-Puffer-Grenzfläche. Die DNS-Probe (BluescriptKS, mit MspI aufgeschlossen) wird mit interkalierendem UV-Fluoreszenzfarbstoff (YOYO-1) markiert und wird unter Glühlicht sichtbar gemacht. Die Trennung der Komponentenbänder ist weniger als 300 μm von der Pufferreservoir-Gel-Grenzfläche entfernt deutlich sichtbar. Die hohe Auflösung des Detektors (in diesem Fall eines Mikroskops) gestattete die Verwendung eines ungewöhnlich kurzen Gels, das mehrere dicht eluierende Bänder auflöst.
Die vorliegende Erfindung zieht eine Elektrophorese-Einheit in Betracht, die einen mikromaschinell bearbeiteten Kanal und einen elektronischen DNS-Detektor integriert. Der Kanal wird nicht mit dem zuvor beschriebenen Oberflächenätzverfahren, sondern mit Hilfe eines Opferätzprozesses auf einem einzelnen Siliciumwafer hergestellt. Bei der Opferätztechnik wird die Kanalkonfiguration durch Abscheiden eines ätzsensitiven Materials (Phosphorsilikatglas SiO₂·P_x) auf der Waferoberfläche mit einem Dickenäquivalent zu der gewünschten Kanalhöhe strukturiert. Ein Dreifachschichtüberzug aus mittels plasmaverstärkter chemischer Dampfabscheidung abgeschiedenem Siliciumnitrid, undotiertem polykristallinen Silicium und Siliciumnitrid (Si_xN_y/polySi/Si_xN_y) bedeckt vollständig das Opfermaterial, mit Ausnahme kleiner Zugangslöcher oben oder auf den Seiten. Eine selektive Flüssigkeitsätzung entfernt das Opferschichtmaterial, aber nicht den Überzug oder das darunter liegende Substrat. Die Opferätztechnik hat zum Ergebnis, dass ein kompletter Kanal direkt auf dem Substrat, das die elektronischen Komponenten enthält, ausgebildet wird (4C und 4D). Der 3 μm tiefe Kanal hat zwei Pufferreservoirs an jedem Ende mit integralen phosphor dotierten polykristallinen Siliciumelektroden. Die Kanalhöhe, die mit dieser Technik entsteht (~3 μm), ist infolge der Beschränkungen der Opferschichtabscheidung und der Festigkeit der darüber liegenden Schicht deutlich geringer als die Höhe der gebondeten Strukturen. Es ist zu beachten, dass Flüssigkeitstropfen bei diesen Kanalabmessungen Volumen in der Grössenordnung von Pikolitern haben würden.
6B ist eine Mikrofotografie einer Gruppe von vier diffusionsdotierten Diodenstrahlungsdetektorelementen, die auf einem Siliciumwafer hergestellt sind. Für jedes Element definieren die drei parallelen dunklen Linien die Diffusionsregionen der Mitte des Detektors, flankiert durch die Schutzringabschirmelektroden. Die Diffusionsregionen sind ungefähr 300 μm lang und 4 μm breit.
Ein Strahlungsdetektor, der aus einer 10 μm breiten "p-n"-Typ-Diode mit einem 5 μm breiten Schutzring um den äusseren Rand herum besteht, ist direkt in das Siliciumsubstrat unter dem Kanal eingearbeitet. In dieser Implementierung wurde ein integraler Strahlungsdetektor gewählt wegen (i) der hohen Empfindlichkeit (ein einzelnes Zerfallsereignis), (ii) geringen Aperturabmessungen und (iii) bestens bekannten Herstellungs- und Verhaltenscharakteristika. Auf diesem Elektrophoresesystem kann ein 1 cm langes, 3 μm dickes Gel eine Trennung an einem DNS-Fragment mit 80 und mit 300 Basenpaaren ausführen. Es ist anzumerken, dass diese Diode derzeit zwar für die Detektion energiereicher Betateilchen konfiguriert ist, aber ebenso als ein Photonendetektor arbeiten kann. Mit den richtigen Wellenlängenfiltern und Lichtquellen kann die Fluoreszenzemission mit Hilfe einer ähnlichen Einrichtung detektiert werden.
Strahlungsdetektoren wurden folgendermassen hergestellt. Ein Siliciumwafer, 200 ½ cm, (100), mit Schmelzzone, bordotiert und vom p-Typ, wurde als Substrat verwendet. Es wurden diffundierte Schichten aus Phosphor (5 × 10¹⁴ cm^–2) und Bor (1 × 10¹⁵ cm^–2) in lithographisch definierten Regionen auf die Probe ionenimplantiert; über den Wafer wurde thermisches Siliciumoxid aufgewachsen (0,2 μm bei 900°C); und es wurden unter Verwendung von gepufferter Fluorwasserstoffsäurelösung (5:1) Kontaktlöcher in die Diffusionsschicht geätzt. Eine 3,3 μm dicke Schicht aus Photoresist Microposit 1400-37 wurde so strukturiert, dass die Metallkontaktstellen definiert wurden; dann wurden 50 nm Chrom und anschliessend 400 nm Gold über den Resist gedampft; und die Metallisation hob die Regionen ab, die den Resist hielten. Eine Schicht aus Photoresist Microposit 1813 wurde auf den Wafer aufgetragen und 30 Minuten lang bei 110°C gebrannt, so dass eine Sperre für wässrige Lösung entstand. Ereignisse des Zerfalls von radioaktivem Phosphor (³²P) konnten unter Verwendung einer Probe markierter DNS in PKR-Reaktionspuffer auf der Photoresistschicht detektiert werden. Der Detektor war an einen ladungsempfindlichen Vorverstärker (EV-Products 550A) angeschlossen, gefolgt von einem Linearformungsverstärker und einem Standardoszilloskop.
6C zeigt eine Oszilloskopspur eines Ausgangs aus dem Strahlungsdetektor, die einzelne Zerfallsereignisse von ³²P-markierter DNS zeigt. Die wässrige DNS-Probe wurde direkt auf dem Detektor angeordnet und 30 Sekunden lang abgetastet. Der Schirm zeigt einen vertikalen Massstab von 0,5 V/Teilung und einen horizontalen Massstab von 20 μs/Teilung.
Experimente
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung und sind nicht so zu verstehen, als würden sie deren Geltungsbereich einschränken.
In der folgenden experimentellen Offenbarung gelten die folgenden Abkürzungen: eq (Äquivalente); M (Molar); μM (Mikromolar); N (Normal); mol (Mol); mmol (Millimol); μmol (Mikromol); nmol (Nanomol); g (Gramm); mg (Milligramm); μg (Mikrogramm); l (Liter); ml (Milliliter); μl (Mikroliter); cm (Zentimeter); mm (Millimeter); μm (Mikrometer); nm (Nanometer); °C (Grad Celsius); Ci (Curies); MW (Molekülgewicht); OD (optische Dichte); EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure); PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese); UV (ultraviolett); V (Volt); W (Watt); mA (Milliampere); bp (Basenpaar); CPM (Zählungen je Minute).
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel beschreibt Herangehensweisen an das Problem des Ausbildens einer Feuchtigkeitssperre über elektrischen Elementen der Mikromassstabseinrichtung. Bei ersten Prototypen wurde mit 5000 Ångström Aluminium gearbeitet, das mittels PECVD mit SiO_x bedeckt wurde. Bei Tests wurde festgestellt, dass die Flüssigkeiten es später durchdrangen und die Aluminiumheizelemente zerstörten.
Ohne klaren Beleg für die Ursache dieses Problems wurde gemutmasst, dass die Stufenhöhe des Aluminiums Risse in der Passivierungsschicht (dem Oxid) hervorrief. Um dem Problem der Rissbildung entgegenzuwirken, wurde eine Schicht Si_xN_y zwischen zwei Schichten SiO_x ausprobiert, in der Hoffnung, dass die zusätzliche Dicke die Rissbildung infolge der Stufenhöhe unterbinden würde. Die Hoffnung erfüllte sich nicht.
Als nächster Lösungsversuch wurde eine dünnere Schicht (500 Ångström) Aluminium ausprobiert. Dies ergab ein Zehntel der Stufenhöhe der ursprünglichen Prototyp-Einrichtungen. Auf dieses Aluminium wurde eine Dreifachschicht aus SiO_x, Si_xN_x und SiO_x aufgebracht. Des Weiteren wurde der Prozess zur Herstellung der Si_xN_y-Schicht zu einem Prozess geändert, der eine dichtere Schicht entstehen lassen würde. Damit schien das Problem gelöst. Allerdings erzeugte die dünnere Aluminiumschicht einen höheren Widerstand, der nicht akzeptabel war. Wir gelangten zu dem Schluss, dass ein Weg nötig wäre, um dickere Aluminiumschichten für einen geringeren Widerstand zu erzeugen, aber die Oberfläche relativ glatt (planar) zu halten. Diese Aufgabe wurde mittels eines Rückätzungsprozesses (nun als der "Einbettungsprozess" bezeichnet) bewältigt. Durch Rückätzen in eine Schicht aus SiO_x, Abscheiden von Aluminium in den entstandenen Hohlraum und anschliessendes Abziehen der Resistmaske entstand eine Oberfläche mit einer Stufenhöhe, die gering genug war, um eine Rissbildung in den Passivierungsschichten zu verhindern.
Es wurde ausserdem entdeckt, dass die Metallkontaktstellen nicht gut an der anfänglichen, mittels PECVD aufgebrachten SiO_x-Schicht hafteten. Um dem Problem abzuhelfen, wurde der Prozess durch Verwenden einer nassen thermischen SiO₂-Schicht modifiziert.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel beschreibt Herangehensweisen an die Verbesserung der Tröpfchenbewegung durch Oberflächenbehandlung. Diesbezüglich kann das Prinzip der Verwendung von Oberflächenspannung zum Bewirken der Tröpfchenbewegung entweder auf hydrophile oder hydrophobe Oberflächen angewendet werden. Glas zum Beispiel ist von Natur aus hydrophil mit einem Kontaktwinkel mit Wasser von nahe null. Weil die Oxidbeschichtung der vorliegenden Erfindung grundsätzlich aus dem gleichen Material besteht wie Glas, wurde erwartet, dass die Einrichtungen ebenfalls Winkel nahe null aufweisen würden. Es wurde jedoch entdeckt, dass die tatsächlich verwendeten Baumaterialien Kontaktwinkel aufwiesen, die weit von null entfernt waren, wodurch die Effekte der Kontaktwinkelhysterese verstärkt wurden (in Beispiel 3 näher besprochen). Zum Beispiel hatte Wasser einen Kontaktwinkel (statisch) von ~42° auf Polyamid, ~41° auf SiO₂ (Hauptbestandteil der meisten Glasarten) und ~62° auf Silikonspray. Zum Verbessern der Oberflächeneffektivität wurden verschiedene Behandlungsprozesse für sowohl hydrophile als auch hydrophobe Oberflächen ausprobiert, wie weiter unten beschrieben.
Um die Hydrophilie einer Oberfläche zu verbessern, wurden verschiedene Reinigungsverfahren ausprobiert. Es ist berichtet worden, dass Oberflächenkontaminierung und/oder -rauigkeit die Hydrophilie von Oberflächen verringern kann. Darum wurden eine Reinigung mit hochkonzentrierter Chromsäure, eine Reinigung mit hochkonzentrierter Schwefelsäure, ein Brennverfahren (8 Stunden bei 600°C zum Abbrennen von Verunreinigungen) und Oberflächenbeschichtungen ausprobiert. Die Säurereinigungsverfahren waren nicht so wirksam wie das Brennverfahren; allerdings erwies sich keines als mit den Ein richtungen kompatibel, weil die konzentrierten Säuren die Aluminiumkontaktstellen angriffen und die hohe Temperatur das Aluminium ablösen (Schmelzpunkt 660°C) oder die Klebeverbindung zwischen dem Heizungschip und dem Kanal aufbrechen konnte.
Es wurde festgestellt, dass eine Behandlung mit Rain-X Antifog (auf dem freien Markt erhältlich) den gewünschten Erfolg brachte. Es handelt sich dabei um eine Oberflächenbehandlung, die Oberflächen hydrophil macht. Obgleich die entstandenen Oberflächen möglicherweise nicht 0° sind, wird unter Verwendung dieser Beschichtung die gesamte Oberfläche behandelt, wodurch eine gleichförmige Oberfläche für das Tröpfchen entsteht. Durch Experimentieren wurde herausgefunden, dass Behandlungen mit Rain-X Antifog die Tröpfchenbewegungsexperimente, bei denen Wärme zum Einsatz kam, deutlich verbesserten. Eine weitere derartige Behandlung, die getestet wurde, die aber nicht funktionierte, war ein Material mit der Bezeichnung SilWet. Dieses Material wird in der Landwirtschaft zum Verbessern der Benetzbarkeit von Pflanzen mit landwirtschaftlichen Sprühmitteln eingesetzt.
Um hydrophobe Oberflächen zu erhalten, probierten die Autoren der vorliegenden Erfindung das Beschichten von Kapillaren mit Rain-X- und Silanbehandlungen. Keines davon führte zu Winkeln, die viel grösser waren als 90°, weshalb sie mit diesem Mechanismus nicht funktionieren würden. Diese Behandlungen hätten Winkel von 180° erbringen müssen, um für hydrophobe Bewegungsstudien nützlich zu sein. Schliesslich wurde entdeckt, dass man eine Teflon-Beschichtung aufbringen könnte, die ausreichend hydrophob ist, um möglicherweise spätere Tests zu rechtfertigen.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel beschreibt Herangehensweisen an die Tröpfchenbewegung durch Wärmebehandlung. Wie zuvor (oben) angemerkt, ist der Kontaktwinkel am vorauseilenden Ende eines sich bewegenden Flüssigkeitströpfchen (als der vorauseilende Kontaktwinkel bekannt) grösser als der am zurückeilenden Ende (der zurückeilende Kontaktwinkel). Im Fall einer hydrophilen Oberfläche – wie zum Beispiel Wasser auf Glas – führt das allgemein zur Erzeugung eines Staudrucks, der dem versuch entgegenwirkt, eine Vorwärtsbewegung durch Erwärmen der Rückseite eines Tröpfchen zu bewirken. Dies lässt sich am besten durch ein einfaches Modell erklären, das einen laminaren Fluss durch einen Kanal beschreibt.
Durchschnittlicher Fluss durch einen kreisrunden Kanal: <v> = –ΔP·[R2/(8 μL]wobei:

Δ: = Wert am Hinterende – Wert am Vorderende des Tröpfchens
ΔP: = (1/R)·(ΔG) = Druckunterschied zwischen Tröpfchenenden
ΔG: = Änderung der Oberflächenspannung zwischen den Enden des Tröpfchens
R: = Kanalradius
L: = Tröpfchenlänge
μ: = Viskosität

Ebenso gilt für Wasser: ΔG = -Konstante·ΔT, wo Temperaturerhöhungen die Oberflächenspannung der meisten Flüssigkeiten verringern (Konstante = 0,16 dyn/cm für Was ser).
Darum: <v> = –(ΔG)·(1/R)·[R2/(8 μL)] = [–0,16·ΔT·R/(8μL)]wobei: ΔT = Thinten – Tvorn was zu folgender Gleichung führt: <v> = [0,16·R/(8 μL)]·(Thinten – Tvorn)
Dieser Ausdruck gibt an, dass jegliches Erwärmen am hinteren Ende des Tröpfchens (wenn das vordere Ende auf einer niedrigeren Temperatur bleibt) zu einer Bewegung des Flüssigkeitströpfchens führt. Im Experiment wurde das jedoch nicht bestätigt. Anhand von Untersuchungen unter Verwendung von Glaskapillaren wurde herausgefunden, dass ein Mindesttemperaturunterschied erforderlich ist, um das Tröpfchen zu bewegen. Es wird angenommen, dass dieser Effekt das Ergebnis der Kontaktwinkelhysterese (CAH) ist. Bei der CAH ist der vorauseilende Kontaktwinkel grösser als der zurückeilende Kontaktwinkel, was eine Art Rückstau zur Folge hat, der überwunden werden muss, um eine Tröpfchenbewegung zu erreichen. Zur CAH kommt es, wenn die Grenzfläche in Bewegung gesetzt wird (dynamische Winkel). Um diesen Effekt zu berücksichtigen, wurde er in ein Stabilzustands (1D)-Strömungsmodell aufgenommen. Wenn zum Beispiel der vorauseilende Winkel 36° beträgt und der zurückeilende Winkel 29° beträgt (wobei das vordere Ende des Tröpfchens 25°C misst), so müsste das hintere Ende des Tröpfchens im Fall eines 1 mm langen Tröpfchens in ei nem 20 μm hohen Kanal auf ~60°C erwärmt werden. Dies ist nur eine Beispielsituation.
Es wurde jedoch experimentell herausgefunden, dass die Kanalabmessungs- und die Fluidparameter (ausser der Oberflächenspannung) nicht beeinflussen, ob sich das Tröpfchen bewegt oder nicht. Sie bestimmen die Grössenordnung der Bewegung (falls es eine gibt). Was aber bestimmt, ob es zu einer Bewegung kommt oder nicht, ist die folgende Ungleichheit: Gvorn/Ghinten > (Rvorn/Rhinten)·(cos βhinten/cos βvorn)wobei:

β: = der Kontaktwinkel.

Die vorliegenden Berechnungen legen nahe, dass eine Differenz von ~35°C zwischen dem vorderen und dem hinteren Ende eines Tröpfchens ausreichen sollte, um eine Tröpfchenbewegung in einem System mit vorauseilenden Winkeln von 36° und zurückeilenden Winkeln von 29° in einem 20 μm hohen Kanal zu initiieren. Experimentelle Tests an echten Einrichtungen zeigten jedoch, dass das vordere Ende des Tröpfchens sich relativ schnell erwärmt, wodurch die für die Bewegung benötigte Temperaturdifferenz zwischen dem vorderen und dem hinteren Ende des Tröpfchens verringert wird. Dieser Effekt macht es für uns erforderlich, dass wir höhere Spannungen verwenden, um eine Tröpfchenbewegung zu bewirken. Es wurde festgestellt, dass Spannungen, die in der Regel im Bereich von ~30° Volt liegen, erforderlich sind, um eine Bewegung zu bewirken. Weitere Experimente zeigten, dass die entstandene Temperaturdifferenz ~40°C zwischen dem vorderen und dem hinteren Ende des Tröpfchens be trug, was die anfängliche Aussage hinsichtlich der Anforderungen bekräftigte.
Die Bewegung diskreter Tröpfchen in einer mikromaschinell herausgearbeiteten Kanalstruktur unter Verwendung von Wärmegradienten ist in den Videoaufzeichnungsbildern von 4 aufgezeigt. Die Einrichtung besteht aus einer Reihe von Aluminiumheizvorrichtungen, die in ein planares Siliciumdioxidsubstrat (ähnlich der in 2 gezeigten Struktur) eingebettet und mittels Klebstoff an einen nassgeätzten Glaskanal (20 μm tief, 500 μm breit) angebondet sind. Unter Verwendung einer Mikropipette wurden Flüssigkeitsproben von Hand in die zwei Kanäle auf der linken Seite geladen. Das Erwärmen der linken Grenzfläche jedes Tröpfchens treibt das Tröpfchen in Richtung des Schnittpunktes der Kanäle. Am Schnittpunkt treffen die Tröpfchen aufeinander und vereinen sich zu einem einzelnen grösseren Tröpfchen. Es ist zu beachten, dass – weil der Kanalquerschnitt 20 μm × 500 μm beträgt – das Volumen jedes dieser Tröpfchen anhand seiner Länge errechnet werden kann und ungefähr 50 Nanoliter beträgt.
Die Heizvorrichtungen entlang der gesamten Oberfläche des in 4 gezeigten Kanals ermöglichen es, dass er ausser als Tröpfchenbewegungseinrichtung auch als thermische Reaktionskammer genutzt werden kann. Das obere Tröpfchen in der Figur enthält eine DNS-Probe, während das untere ein Restriktionsaufschliessungsenzym (TaqI) und Aufschliessungspuffer enthält. Nach dem Vermengen der Proben wurde das kombinierte Tröpfchen unter Verwendung der integralen Heizvorrichtungen und Temperatursensoren 30 Minuten lang bei 65°C gehalten. Die vollständige enzymatische Reaktion wurde bestätigt, in dem das Tröpfchen vom rechten Ende des Kanals exprimiert und auf ein kapillarisches Gelelektrophoresesystem mit einem laserinduzierten Fluoreszenzdetektor geladen wurde. Das Chromatogramm, das durch die Siliciumeinrichtungsprobe erzeugt wurde, ähnelte Chromatogrammen, die von DNS-Aufschliessungsabläufen in einem (nicht gezeigten) standardmässigen Polypropylenmikroreaktionsgefäss erzeugt wurden.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel beschreibt verschiedene Herangehensweisen an das Bonden von Kanälen an das Substrat, das Schaltkreise zum Erwärmen und zur Temperaturerfassung der Einrichtung der vorliegenden Erfindung enthält (siehe die obige Besprechung des zweiteiligen Aufbaus). Bei den ersten Versuchen wurde Polyamid verwendet. Normales Polyamid war insofern unbefriedigend, als festgestellt wurde, dass die zwei Stücke nicht zusammenkleben bleiben wollten.
Bei anschliessenden Versuchen wurde ein fotodefinierbares Polyamid verwendet. Dies ergab eine klebrige Oberfläche, bildete aber keine perfekte Abdichtung entlang des Kanals. Es wurde entdeckt, dass die Lösemittel, die während des letzten Brennprozesses freigesetzt wurden, Blasen in der Polyamidschicht hervorriefen. Es war eine Klebeschicht erforderlich, die durch Aushärten abdichtete und keine Lösemittel freisetzte.
Es wurden verschiedene unterschiedliche Epoxidharze und Klebstoffe untersucht, wie in der folgenden Tabelle wiedergegeben.
Ein bevorzugter Klebstoff war ein UV-gehärteter Klebstoff, obgleich der Prozess des Auftragens des UV-Klebstoffs umständlich ist und einige Übung erfordert, damit der Klebstoff nicht an Stellen kommt, wo er nicht hingehört, zum Beispiel in die Kanäle.
Hydroxidbonding und Siebdruck von Bondingssubstanzen wurden ebenfalls ausprobiert. Eine weitere Option war Glasband, aber die hohen Temperaturen die erforderlich waren, um das Band zu schmelzen, erwiesen sich für die Einrichtungen der vorliegenden Erfindung als zu hoch.
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel beschreibt eine Nucleinsäureverstärkungsreaktion auf einem Substrat auf Siliciumbasis. Die erwiesenen DNS-biochemischen Schritte für PKR vollziehen sich unter physiologischen Bedingungen ionischer Stärke, Temperatur und pH. Somit unterliegen die Reaktionskammerkomponenten insofern Konstruktionseinschränkungen, als eine Verträglichkeit mit der DNS, Enzymen und weiteren Reagentien in Lösung gegebenen sein muss.
Um die Bioverträglichkeit zu beurteilen, wurden die Komponenten einer standardmässigen PKR-Reaktion hinzugegeben. Die Ergebnisse (siehe 7) zeigten an, dass kristallines Silicium möglicherweise nicht das ideale Material für biologische Verträglichkeit ist. Angesichts dieser Ergebnisse kann es wünschenswert sein, die Oberfläche des mikromaschinell bearbeiteten Siliciumsubstrats mit adsorbierten Oberflächenmitteln, kovalent gebondeten Polymeren oder einer abgeschiedenen Siliciumoxidschicht zu modifizieren.
Um ein biologisch verträgliches Heizelement auszubilden, begannen die Autoren der vorliegenden Erfindung damit, einen standardmässigen Siliciumwafer mit einer 0,5 μm dicken Schicht aus Siliciumdioxid zu beschich ten. Als nächstes wurde ein 0,3 μm tiefer und 500 μm breiter Kanal in das Siliciumoxid geätzt, und Gold oder Aluminium wurden abgeschieden (0,3 μm dick). Dieser Einbettungsprozess führt zu einer relativ planaren Oberfläche (2A) und schafft eine Basis für die Abscheidung einer wasserundurchdringlichen Schicht. Die undurchdringliche Schicht wird durch eine Abfolge dreier plasmaverstärkter Dampfabscheidungen hergestellt: Siliciumoxid (SiO_x), Siliciumnitrid (Si_xN_y) und Siliciumoxid (SiO_x). Da die Materialien aus der Dampfphase abgeschieden werden, sind die genauen Stoichiometrien nicht bekannt. Anstelle der Siliciumdotierten Widerstandsheizvorrichtungen, die zuvor für mikromaschinell bearbeitete PKR-Reaktionskammern aufgezeigt wurden, wurde für diese Einrichtung eine dünne Metallheizungskonstruktion verwendet, da die schmale Metalleinlage ein Beobachten der Flüssigkeitsprobe durch ein transparentes darunter liegendes Substrat, wie zum Beispiel Glas oder Quarz, gestattet. Des Weiteren gestattet die Verwendung mehrerer unabhängiger Heizelemente, dass eine geringe Anzahl von ihnen als hoch-präzise Widerstandstemperatursensoren arbeiten, während die Mehrzahl der Elemente als Heizvorrichtungen fungieren.
Eine Einrichtung, die mit metallischen Widerstandsheizvorrichtungen und einer Oxid/Nitride/Oxid-Beschichtung hergestellt wurde, wurde auf biologische Verträglichkeit und Temperatursteuerung unter Verwendung von PKR-Verstärkung einer bekannten DNS-Matrizenprobe getestet. Die Reaktion wurde auf der planaren Einrichtung unter Verwendung von zwanzig Mikrolitern PKR-Reaktionsgemisch ausgeführt, bedeckt mit Mineralöl, um ein Verdunsten zu verhindern. Die Reaktion durchlief ein standardmässiges 35-Zyklen-PKR-Temperaturzyklusregime unter Verwendung der integralen Temperatursensoren, die mit einer pro grammierbaren Steuerung verbunden waren. Da das Reaktionsvolumen deutlich grösser war, als es für das ursprüngliche Heizungsdesign beabsichtigt war, wurde ein Polypropylenring an die Heizungsoberfläche zementiert, um als Probeneinschlusskammer zu dienen. In allen Testfällen zeigte das Vorhandensein von verstärkten Reaktionsprodukten an, dass die Siliciumdioxidoberfläche und die Heizungskonstruktion nicht die Reaktion hemmten. Parallele Verstärkungsexperimente, die in einem handelsüblichen Thermocycler ausgeführt wurden, erbrachten ähnliche Ergebnisse. Eine Reihe von PKR-Verträglichkeitstests zeigte an, dass die Reaktion in der Einrichtung sehr empfindlich auf die Einstellungen der Steuerung und auf das letztendliche Oberflächenmaterial, das mit der (nicht gezeigten) Probe in Kontakt steht, reagiert.
Aus dem oben Dargelegten sollte klar sein, dass die vorliegende Erfindung an volumenstarke Projekte, wie zum Beispiel Genotypisierung, angepasst werden kann. Der Mikrotröpfchentransport vermeidet die derzeitigen Effizienzmängel bei der Flüssighandhabung und dem Vermischen von Reagentien. Des Weiteren sind die Einrichtungen nicht durch die Art der Reaktionen, einschliesslich biologischer Reaktionen, beschränkt.
BEISPIEL 6
In diesem Beispiel wird eine Teststruktur hergestellt (8). Die Teststruktur ist sehr einfach (8). Der Hauptteil besteht aus einem Zweimaskenprozess mit fünf Schichten aus Materialien auf dem Si-Substrat. Ausgehend von der untersten zur obersten Schicht, dient das SiO als ein Isolator zwischen dem Si-Substrat und den anderen Metallschichten, die als Lötkontakte und Heizelemente dienen. Die Ti-Schicht (250 A) dient der Adhäsion von Ni. Die Schichten aus Ni (1000 A) und Au (1000 A) dienen als eine Diffusionssperre für das Lot. Die Au-Schicht dient auch als eine netzbare Kontaktstelle. Schliesslich dient die Schicht aus Lot dem Verbonden zweier Substrate. Das Lot schmilzt durch Erwärmen der Metallschichten. Ein weiteres Substrat, das gebondet wird, hat mit Ausnahme des Lots den gleichen Aufbau.
In der Teststruktur wird ein thermopneumatisches Mikroventil verwendet. Das Schaubild und der Prozessfluss des Mikroventils sind in 9 gezeigt. Es ist eine gewellte Membran gewählt, weil sie weiter auslenkt und empfindlicher ist. Die Membran (Seitenlänge = 1000 μm, Dicke = 3 μm, Anlötsockellänge = 500 μm, Anlötsockeldicke = 10 μm) hat eine Auslenkung von 27 μm bei einem angelegten Druck von 1 atm. Dieser angelegte Druck wird durch einen thermopneumatischen Mechanismus erzeugt, der eine grössere Betätigungskraft erzeugt. Ein Druck von 1 atm wird in dem Hohlraum zwischen der Membran und dem Glas durch Freon-11 erzeugt, wenn es 11°C über Raumtemperatur erwärmt wird. Wie in 9 dargelegt, werden zehn Masken zur Herstellung des Mikroventils angenommen.
9a zeigt einen Abschnitt eines Siliciumsubstrats 10, bei dem es sich um einem (100)-orientierten Si-Wafer vom p-Typ mit normaler Dicke und moderater Dotierung (> 1 cm) handelt. Die bevorzugte Waferdicke ist jedoch gewöhnlich eine Funktion des Waferdurchmessers. Die Oberseite 12 des Siliciumwafers, die das Substrat 10 enthält, wird in der normalen und akzeptierten Weise geläppt, poliert und gereinigt. Isotropes Ätzen mittels reaktiver Ionenätzung (RIE) bildet die Membranwellungen 14 mit Photoresist als Maskierungsmaterial.
9b zeigt die Definition von tiefen Bordiffusionsbereichen 16 zum Ausbilden der Ränder, der mittleren Anlötsockel und der Einlass- und Auslasslöcher der fertigen Einrichtung. 9c zeigt die Abscheidung flacher Bordiffusionsbereiche 18 zum Ausbilden einer Membran. Die verschiedenen Metallschichten, einschliesslich des Lots 20, werden dann abgeschieden. Die Prozesse der tiefen und flachen Bordiffusion definieren die Form der Membran und des Ätzstopps für den Prozess der Waferauflösung.
Anschliessend zeigt 9d die Definition der Oxidschicht 22, um als Isolator des Lots der fertigen Einrichtung zu dienen. Eine Ti-Adhäsion/Ni/Au-Sperre und netzbare Kontaktstellen 24 werden dann abgeschieden, wie in 9e gezeigt. Die Lotform 26 aus Ni und Photoresist wird dann definiert, wie in 9f gezeigt, und der erste Ni-Kanal 28 wird durch mikromaschinelle Oberflächenbearbeitung erzeugt, wobei Photoresist als Opferschichten verwendet wird. Das Ni-Kanalloch wird mittels EDP definiert, um die Opferschichten zu entfernen und ein Kanalloch 30 zu definieren (9g).
Ein zweiter Ni-Kanal 32 wird durch Ni und Photoresist definiert, wie in 9h dargelegt, und Einlasslöcher 34 und Auslasslöcher 36 werden mittels EDP definiert, um die Opferschichten zu entfernen (9i).
Zum Schluss wird eine Ti/Pt-Heizvorrichtung in Glas 38 anodisch an das Siliciumsubstrat gebondet (9j). Freon-11 füllt den Hohlraum durch ein (nicht gezeigtes) Loch in dem Glassubstrat aus. Dieses Loch wird mit ei ner Diamantbohrkrone hergestellt und mit Epoxidharz abgedichtet.
BEISPIEL 7
In diesem Beispiel war vorgesehen, ein Lot mit niedrigem Schmelzpunkt in der Teststruktur zu verwenden. Weil ein universell einsetzbares lotversiegeltes Mikroventil in einem Gasphasenmikroanalysesystem verwendet wird, es ist nicht wünschenswert, ein Lot mit hohem Schmelzpunkt (SP) (> 200°C) zu verwenden, das die Gaseigenschaften beeinträchtigen könnte. Ausserdem kann sich ein Lot mit hohem SP auf andere Komponenten auf der Einrichtung, wie zum Beispiel integrierte Schaltkreise, auswirken und den Stromverbrauch erhöhen. Infolge dessen wird ein Lot mit niedrigem Schmelzpunkt benötigt. Bismuthaltige Lote haben die niedrigsten SPs von 47–138°C. Wenn jedoch eine Teststruktur in ein Becken mit Lot, das zu dieser Gruppe gehört, getaucht wurde, so lösten sich alle Metallschichten in die Lotlösung hinein auf. Ausserdem benetzte dieses Lot nicht selektiv die Oberfläche der Teststruktur.
BEISPIEL 8
Angesichts der Ergebnisse des in Beispiel 7 gezeigten Experiments wurde ein Versuch mit überall erhältlichem Sn:Pb/60:40-Lot (SP 183°C) unternommen. Wenn die Teststruktur in eine Lösung dieses Lots getaucht wurde, so blieben die Metallschichten intakt. Des Weiteren wiesen diese Schichten eine ausgezeichnete Netzbarkeit für das Lot auf, d. h. das Lot blieb nur auf die metallischen Bereiche beschränkt.
BEISPIEL 9
In diesem Beispiel werden eine Einrichtung und ein Verfahren zum Sperren des Fluidflusses in einem Kanal beschrieben. 10 zeigt ein Testschaubild für diese Ausführungsformen. Sn:Pb/60:40-Lot 40, das mit einem Heizelement 42 assoziiert ist, wird in einem Seitenkanal 44 angeordnet. Das Heizelement 42 verflüssigt das Lot 40 wenigstens teilweise, und ein Luftstrom 46 bewegt das verflüssigte Lot aus dem Seitenkanal in einen Hauptkanal 48, wo es sich abkühlt und den Hauptkanal versperrt.

Claims

Einrichtung, die ein Substrat (10), ein in dem Substrat (10) angeordnetes und mit einem Heizelement (38) assoziiertes schmelzbares Material (20) umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass sie weiterhin eine Membran (18) umfasst, die derart positioniert ist, dass sie, wenn ausgedehnt, das schmelzbare Material (20) berühren kann.
Einrichtung nach Anspruch 1, wobei das Substrat (10) weiterhin einen in dem Substrat (10) angeordneten Mikrotröpfchenkanal (34, 36) umfasst, wobei das schmelzbare Material (20) in dem Mikrotröpfchenkanal (34, 36) angeordnet ist.
Einrichtung nach Anspruch 1, wobei das Substrat (10) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glas und Silicium.
Einrichtung nach Anspruch 1, wobei das schmelzbare Material (20) Lot umfasst.
Einrichtung nach Anspruch 1, wobei das Lot eine eutektische Legierung aus Zinn und Blei umfasst.
Einrichtung nach Anspruch 5, wobei die Legierung 60:40 Sn:Pb umfasst.
Einrichtung nach Anspruch 4, wobei das Lot 40:60 Sn:Pb umfasst.
Einrichtung nach Anspruch 1, wobei das schmelzbare Material (20) ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Kunststoff, Polymer und Wachs.
Verfahren zum Einschränken eines Fluidflusses in einem Kanal (34, 36), umfassend: a) Bereitstellen einer Einrichtung, die folgendes umfasst: i) ein in einem Substrat (10) angeordnetes schmelzbares Material (20), wobei das schmelzbare Material (20) mit einem Heizelement (38) assoziiert ist; und ii) eine Membran (18), die derart positioniert ist, dass sie, wenn sie ausgedehnt ist, das schmelzbare Material (20) berührt; b) Ausdehnen der Membran (18) derart, dass sie das schmelzbare Material (20) berührt; und c) Erhitzen des schmelzbaren Materials (20) mit dem Heizelement (38) derart, dass das schmelzbare Material (20) zumindest teilweise verflüssigt, und derart, dass das Substrat (10) nicht beschädigt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, weiterhin mit dem letzten Schritt d) der gestattet, dass das schmelzbare Material (20) abkühlt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Substrat (10) weiterhin einen in dem Substrat (10) angeordneten Mikrotröpfchenkanal (34, 36) umfasst, wobei das schmelzbare Material (20) in dem Mikrotröpfchenkanal (34, 36) angeordnet ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Substrat (10) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glas und Silicium.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das schmelzbare Material (20) Lot umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Lot eine eutektische Legierung aus Zinn und Blei umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Legierung 40:60 Sn:Pb umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das schmelzbare Material (20) ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Kunststoff, Polymer und Wachs.
Verfahren zum Einschränken eines Fluidflusses in einem Hauptkanal (48), umfassend: a) Bereitstellen des folgenden: i) einen Hauptkanal (48), der an einen Seitenkanal (44) angeschlossen ist, wobei beide innerhalb eines Substrats angeordnet sind; ii) in dem Seitenkanal (44) angeordnetes und mit einem Heizelement (42) assoziiertes schmelzbares Material (40) und iii) ein Bewegungsmittel (46), das mit dem Seitenkanal (44) derart verbunden werden kann, dass die Anwendung des Bewegungsmittels (46) das schmelzbare Material (40) induziert, von dem Seitenka nal (44) in den Hauptkanal (48) zu fließen; b) Erhitzen des schmelzbaren Materials (40) derart, dass das schmelzbare Material (40) zumindest teilweise verflüssigt; c) Anwenden des Bewegungsmittels (46) derart, dass das verflüssigte schmelzbare Material (40) von dem Seitenkanal (44) in den Hauptkanal (48) fließt; und d) Gestatten, dass das schmelzbare Material (40) in dem Hauptkanal abkühlt.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Bewegungsmittel (46) Druckluft ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Hauptkanal (48) und der Seitenkanal (44) Mikrotröpfchenkanäle sind.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glas und Silicium.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das schmelzbare Material (40) Lot umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Lot eine eutektische Legierung aus Zinn und Blei umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Legierung 40:60 Sn:Pb umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das schmelzbare Material (40) ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Kunststoff, Polymer und Wachs.