CN108587859B - 样本液滴发生系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种样本液滴发生系统及方法，包括针头固定架，与针头固定架连接的气压管道，气压针头，样本液滴发生器和用于容纳样本液滴发生器下部的导热容器；所述导热容器上端和下端分别设有第一密封盖和密封套，第一密封盖上设有排气口，排气口上设有单向阀；气压针头与样本液滴发生器连接，导热容器中设有液滴载体油，样本液滴发生器下部位于导热容器中，液滴载体油的油面的高度高于样本液滴发生器的各个微流道所处的高度，气压管道上设有恒流恒压泵。本发明具有优良稳定性和重现性，超高的灵敏度，极致的精确度，成本低的特点。

Description

样本液滴发生系统及方法

技术领域

本发明涉及基因分子诊断试剂设备技术领域，尤其是涉及一种确保导热容器内的样本与外界隔绝的样本液滴发生系统及方法。

背景技术

目前荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR)已发展成为体外分子诊断领域一项关键的常规技术，极大地推动了生命科学在卫生医疗领域的发展。但是，荧光定量PCR定量只是相对定量，其准确度和重现性依然不能满足目前体外分子诊断系统和生物基因学研究领域的发展需求。但在液态活检，NIPT等众多项目上，面临一些技术瓶颈，比如肿瘤循环DNA在血液中含量极低，传统各项检测手段的灵敏度及精度都无法满足检测要求。

目前常用的二代测序技术虽然可以进行液态活检检测，但是样品制备复杂，测序样品建库繁琐，测序试剂成本高昂，测序时间长，准确率及低，且需要专业人员操作，数据分析十分复杂，非生物信息专业博士无法直接解读数据。这些技术上的瓶颈大大限制了其在医院临床方面的应用和推广。数字PCR多重突变位点液态活检诊断技术检测灵敏度可达到万分之一，准确率是测序仪的1000倍，可为液态活检提供革命性的突破。检测灵敏度可与测序检测相比，检测成本仅为测序技术的30％，操作简单，任何高中以上学历者都可应用操作，直接给出检测结果，一目了然，无需专业数据分析人员。数字PCR检测的位点可囊括液态活检的常用临床诊断需求，所以适合大规模在医院推广。

另外，由于PCR扩增产物对酶催化反应的抑制作用，目前qPCR技术的基因变异检测方法对体细胞中低丰度的肿瘤基因变异常常无能为力。

发明内容

本发明的发明目的是为了克服现有技术中的qPCR技术对体细胞中低丰度的肿瘤基因变异及母体胎儿基因靶标识别无能为力的不足，提供了一种确保导热容器内的样本与外界隔绝的样本液滴发生系统及方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种样本液滴发生系统，包括针头固定架，与针头固定架连接的气压管道，气压针头，样本液滴发生器和用于样本液滴发生器下部的容纳导热容器；所述导热容器上端和下端分别设有第一密封盖和密封套，第一密封盖上设有排气口，排气口上设有单向阀；气压针头与样本液滴发生器连接，导热容器中设有液滴载体油，液滴载体油的油面的高度高于样本液滴发生器的各个微流道所处的高度，气压管道上设有恒流恒压泵。

导热容器采用具有高导热率，分子结构稳定，不与任何油相反应，具有较强的耐腐蚀性材料制成，其表面需做钝化处理，导热容器内部形状呈锥柱状，两端为通孔(至少一端为开口，且另一端为复合材料密封)，大的锥口上设有与密闭盖紧密配合的锁紧结构，确保与密封套紧密配合形成一个完整的密闭容器，且具有很高的导热效果。

再将作为系统一部分的液滴载体油灌入样本杯体内，而此油相内含有1/2矿物油+1/5二甲基硅油+1/8角鲨烯+6％P135+8％EM90和十四烷等化学物质，此液滴载体油流体在流经液滴发生器的流道时，其中的化学物质会在其经过的所有接触面形成一层硅烷化膜，此膜将液滴发生器的内腔表面与样本模板流体进行隔离，确保样本模板在液滴发生器内不会受到任何接触性的污染，此油相的量按设计需求进行控制灌入，待油相灌入后将密封盖上。再将固定在针头固定架的气压针头插入密封盖内，气压针头的材料为表面光洁度高，钢性硬度好的材料，(PC或不锈钢)，通过针头固定架与恒压恒流泵的气压管道连接，组成一套完整的样本液滴发生系统。

当恒压恒流泵工作时，气体经管道和气压针头进入液滴发生器的样本杯体中，将样本杯体中的样本模板压入到液滴发生器中，再经过液滴发生器产生大量的液滴流入导热容器内的液滴载体油中，而导热容器内同等体积的气体就会通过排气孔经过单向阀排出，实现导热容器内和外界的压力平衡。

本发明始终通过单向阀来调节导热容器内部的压力平衡，确保导热容器内的样本与外界隔绝不被污染。

组装好的样本液滴发生器必须将液滴载体油注入导热容器内，并且确保液滴载体油的油面要高于各个微流道口上至0.1mm处即可。

作为优选，所述样本液滴发生器包括两端开口的样本杯体，设于样本杯体上端的第二密封盖，与样本杯体下端连接的上片和与上片连接的下片；下片上表面上设有若干个围绕样本杯体呈环形分布的键合肋，各个键合肋外侧的下片上表面上设有缓冲池，相邻键合肋之间构成主流道，每个主流道外侧的缓冲池内均设有缓冲肋，下片上表面边缘上设有若干个矩形凸块，所述微流道位于相邻矩形凸块之间，每个微流道上均设有张力形成结构，所述张力形成结构为设于微流道外边缘上的由内向外张开的喇叭口，喇叭口张开的角度为40°至150°；气压针头下部穿过密封盖进入样本杯体中，样本杯体下部、上片和下片均位于导热容器中。

本发明由上下两片(或大于两片)晶圆(或近似晶圆的si，sio2等)基材组合而成或任何两种可键合的基材均可，在其中的任何一片晶圆基材中间设有一个杯体安装口，在杯体安装口上设有样本杯体。

下片上表面刻蚀有样本流体的缓冲池，在杯体安装口周边刻蚀有样本流体导入的主流道若干个(大于2)，而主流道的一端与缓冲池相通，在杯体安装口周边设有若干个(大于2)键合肋，在缓冲池内设有用于减弱流体流向冲力和方向的缓冲肋，迫使流体在缓冲池内所受的压力均衡，分散到所有微流道的压力是均衡的，就避免有的微流道因受到不均的压力，至使产生的液滴大小不均而影响信号的采集，同时，由于压力不均会在内部流道产生死体积，因而导致通畅流道会产生气泡，融入到液滴油载体中，给样本液滴在循环扩增时由于气体和流体的热膨胀系数差异大造成不稳定因素，促使样本液滴破碎，导致结果失败。

在上片与下片之间形成大量的微流道，而微流道的截面形状趋向于正方形或圆形，微流道的截面积大于300平方微米，微流道的一端与缓冲池相通，而闭环流道的另一端则位于基材的外延，并呈现出由内向外的喇叭口，样本流体经流道流出时，在喇叭口和流体表面张力的作用下，样本流体在喇叭口处集结，逐步形成液滴，当液滴的自身重量大于样本流体的黏连力时，液滴并脱离喇叭口跌入油相载体中而成为一个独立的样本液滴。

作为优选，每个键合肋和每个缓冲肋均呈向外拱起的圆弧形，或者每个键合肋和每个缓冲肋均为可促使流体形成涡流效应的形状。

作为优选，所述密封套替换为密封膜。

作为优选，所述第二密封盖上设有十字密闭槽，样本杯体下端设有与上片的样本杯体安装口配合的环形凸台，环形凸台下端与上片下表面平齐，或环形凸台下端的高度高于上片下表面的高度。

十字密闭槽在无外力的作用下处于密闭状态，确保样本杯体中的样本不会受到外界污染。

作为优选，所述第二密封盖采用具有弹性且分子结构稳定的硅胶和橡胶材料制成，所述密封膜采用塑纸复合材料制成。

作为优选，所述第二密封盖的边缘上设有先向下延伸然后向内弯折的弯折边，样本杯上端设有向外延伸的环形密封凸台。

作为优选，上片及下片均呈矩形，或者上片及下片均呈圆形；上片和下片采用具有稳定分子结构的材料制成，具有稳定分子结构的材料包括金属、硅材料和硬质塑料。

一种样本液滴发生方法，包括如下步骤：

(9-1)使用移液枪头将样本模板送入样本杯体中，拔出移液枪头，将气压针头插入样本杯体；

(9-2)控制恒压恒流泵工作，气体经管道和气压针头进入样本杯体中，将样本杯体中的样本模板压入到各个主流道和各个微流道上；

(9-3)各个主流道和各个微流道产生液滴并流入导热容器内的液滴载体油中，导热容器内同等体积的气体通过排气孔并经过单向阀排出，实现导热容器内部和外界的压力平衡。

因此，本发明具有如下有益效果：具备形成大小均匀的液滴，对样本的收集量没有刻意限制，所有采集提取后的样本模板都可生产液滴，液滴的大小也随实际验证需求定制，实现可随意调节液滴直径大小，所以，对样本液滴的数量不会因样本采集量的多少而受到限制，样本液滴数量的多少是由总体积和单各液滴直径大小而定，所以，采集提取的样本利用率极高，没有死体积；具有自动排气泡功能，由于系统是采用顶部封闭式敞开装置，而溶于油相载体内的气泡比重永远小于油相载体的比重，会自动浮于油相载体表面而排出，这样就确保样本液滴在循环扩增时，不会因油相载体内存在气泡而因膨胀系数不样使体积产生较大的波动，导致样本液滴相互挤压而融合；因此，这就保证样本液滴在经过检测器时的有效液滴数量大大提高，对数据的真实性提供有力保障；系统始终采用封闭式的自动调节机构，通过单向阀来调节导热容器内部的压力平衡，确保导热容器内的样本在整个扩增的过程中与外界气体不发生任何对流和接触，杜绝被污染的可能性，所以也杜绝了样本因被污染而产生的假阳性和假阴性的可能，确保数据更接近真实值。整个系统结构简便，便于快速组装和集成，可实现高通量运用及自动化的实施。

因此，此样本液滴发生系统具有优良稳定性和重现性，超高的灵敏度，极致的精确度，成本低、便于产业化和自动化集成。

附图说明

图1是本发明的一种结构示意图；

图2是本发明的样本杯体的一种结构示意图；

图3是本发明的下片上表面的一种结构示意图；

图4是本发明的下片下表面的园形结构示意图；

图5是本发明的样本液滴发生器和导热容器组装好后的一种示意图；

图6是本发明的样本液滴发生器和导热容器组装好后的底部为覆膜状态示意图；

图7是本发明的一种成品示意图；

图8是本发明的移液枪头将样本模板送入样本杯体的一种示意图；

图9是本发明的将样本模板压入液滴发生器的一种压力示意图；

图10是本发明的样本模板被全部压入发生器后生成液滴流入导热容器内的液滴载体油相中的一种示意图。

图中：样本杯体1、第二密封盖2、上片3、下片4、键合肋5、缓冲池6、主流道8、缓冲肋9、矩形凸块10、微流道11、张力形成结构111、十字密闭槽21、样本杯体安装口7、环形凸台1001、弯折边22、环形密封凸台1002、样本液滴发生器101、针头固定架102、气压管道103、气压针头104、导热容器105、恒流恒压泵106、第一密封盖151、密封套152、排气口153、单向阀154、密封膜155、样本模板1101、液滴载体油1102、移液枪头1103、液滴1104。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的描述。

实施例1

如图7、图8、图9、图10所示的实施例是一种样本液滴发生系统，包括针头固定架102，与针头固定架连接的气压管道103，气压针头104，样本液滴发生器101和用于容纳样本液滴发生器下部的导热容器105；导热容器上端和下端分别设有第一密封盖151和密封套152，第一密封盖上设有排气口153，排气口上设有单向阀154；气压针头与样本液滴发生器连接，导热容器中设有液滴载体油，如图7所示，液滴载体油的油面的高度高于样本液滴发生器的各个微流道所处的高度，气压管道上设有恒流恒压泵106。

如图1、图2、图3、图4所示，样本液滴发生器包括两端开口的样本杯体1，设于样本杯体上端的第二密封盖2，与样本杯体下端连接的上片3和与上片连接的下片4；下片上表面上设有4个围绕样本杯体呈环形分布的键合肋5，各个键合肋外侧的下片上表面上设有缓冲池6，相邻键合肋之间构成主流道8，每个主流道外侧的缓冲池内均设有缓冲肋9，下片上表面边缘上设有40个矩形凸块10，微流道11位于相邻矩形凸块之间，每个微流道上均设有张力形成结构111；气压针头下部穿过密封盖进入样本杯体中，样本杯体下部、上片和下片均位于导热容器中。

如图3所示，每个键合肋和每个缓冲肋均呈向外拱起的圆弧形。

如图6所示，可以将密封套替换为密封膜155。

如图2所示，第二密封盖上设有十字密闭槽21，样本杯体下端设有与上片的样本杯体安装口7配合的环形凸台1001，环形凸台下端与上片下表面平齐。

第二密封盖采用具有弹性且分子结构稳定的硅胶和橡胶材料制成。

第二密封盖的边缘上设有先向下延伸然后向内弯折的弯折边22，样本杯上端设有向外延伸的环形密封凸台1002。

如图3所示，张力形成结构为设于微流道外边缘上的由内向外张开的喇叭口，喇叭口张开的最佳角度为68°。

上片及下片均呈矩形，或者如图4所示，上片及下片均呈圆形。

一种样本液滴发生方法，包括如下步骤：

(9-1)如图8所示，使用移液枪头将样本模板送入样本杯体中，拔出移液枪头，将气压针头插入样本杯体；

(9-2)如图9所示，控制恒压恒流泵工作，气体经管道和气压针头进入样本杯体中，将样本杯体中的样本模板压入到各个主流道和各个微流道上；

(9-3)如图10所示，各个主流道和各个微流道产生液滴1104并流入导热容器内的液滴载体油中，导热容器内同等体积的气体通过排气孔并经过单向阀排出，实现导热容器内部和外界的压力平衡。

应理解，本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种样本液滴发生系统，其特征是，包括针头固定架(102)，与针头固定架连接的气压管道(103)，气压针头(104)，样本液滴发生器(101)和用于容纳样本液滴发生器下部的导热容器(105)；所述导热容器上端和下端分别设有第一密封盖(151)和密封套(152)，第一密封盖上设有排气口(153)，排气口上设有单向阀(154)；气压针头与样本液滴发生器连接，导热容器中设有液滴载体油，液滴载体油的油面的高度高于样本液滴发生器的各个微流道所处的高度，气压管道上设有恒流恒压泵(106)；

所述样本液滴发生器包括两端开口的样本杯体(1)，设于样本杯体上端的第二密封盖(2)，与样本杯体下端连接的上片(3)和与上片连接的下片(4)；下片上表面上设有若干个围绕样本杯体呈环形分布的键合肋(5)，各个键合肋外侧的下片上表面上设有缓冲池(6)，相邻键合肋之间构成主流道(8)，每个主流道外侧的缓冲池内均设有缓冲肋(9)，下片上表面边缘上设有若干个矩形凸块(10)，所述微流道(11)位于相邻矩形凸块之间，每个微流道上均设有张力形成结构(111)，所述张力形成结构为设于微流道外边缘上的由内向外张开的喇叭口，喇叭口张开的角度为40°至150°；气压针头下部穿过密封盖进入样本杯体中，样本杯体下部、上片和下片均位于导热容器中。

2.根据权利要求1所述的样本液滴发生系统，其特征是，每个键合肋和每个缓冲肋均呈向外拱起的圆弧形，或者每个键合肋和每个缓冲肋均为可促使流体形成涡流效应的形状。

3.根据权利要求2所述的样本液滴发生系统，其特征是，所述密封套替换为密封膜(155)。

4.根据权利要求1所述的样本液滴发生系统，其特征是，所述第二密封盖上设有十字密闭槽(21)，样本杯体下端设有与上片的样本杯体安装口(7)配合的环形凸台(1001)，环形凸台下端与上片下表面平齐，或环形凸台下端的高度高于上片下表面的高度。

5.根据权利要求3所述的样本液滴发生系统，其特征是，所述第二密封盖采用具有弹性且分子结构稳定的硅胶和橡胶材料制成，所述密封膜采用塑纸复合材料制成。

6.根据权利要求1所述的样本液滴发生系统，其特征是，所述第二密封盖的边缘上设有先向下延伸然后向内弯折的弯折边(22)，样本杯上端设有向外延伸的环形密封凸台(1002)。

7.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的样本液滴发生系统，其特征是，上片及下片均呈矩形，或者上片及下片均呈圆形；上片和下片采用具有稳定分子结构的材料制成，具有稳定分子结构的材料包括金属、硅材料和硬质塑料。

8.一种基于权利要求1的样本液滴发生系统的样本液滴发生方法，其特征是，包括如下步骤：

(8-1)使用移液枪头将样本模板送入样本杯体中，拔出移液枪头，将气压针头插入样本杯体；

(8-2)控制恒压恒流泵工作，气体经管道和气压针头进入样本杯体中，将样本杯体中的样本模板压入到各个主流道和各个微流道上；

(8-3)各个主流道和各个微流道产生液滴并流入导热容器内的液滴载体油中，导热容器内同等体积的气体通过排气孔并经过单向阀排出，实现导热容器内部和外界的压力平衡。

Images