JP4679818B2 - 熱サイクルシステム及びその使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、サンプルの急速で均一の温度サイクルを容易にする熱サイクル装置及び方法に関する。本発明は、例えば、反応容器内でDNA増幅及び増幅した生成物の検出を行うように設計されている。

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によるDNAの増幅は、反応混合物が加熱と冷却を何度も繰り返されることを必要とする。市場で入手可能なPCRのための機器は、すべて、周囲の環境を加熱及び冷却することによって、又は周囲の環境の間を自動的にサンプルを移動するかのどちらかによって反応容器の環境温度を変化させることで稼働する。温度サイクルのための最も一般的な機器は、金属ブロックを使って反応混合物を加熱したり冷却したりする。金属ブロックの熱塊は一般的に大きく、これは、温度遷移が比較的遅く、温度を循環させるために大量のエネルギーを必要とすることを意味している。反応混合物は、普通、硬質の射出成形プラスチック容器から成る微量遠心チューブ又はマイクロタイタープレートに入れられる。効率的な熱伝達が発生するためには、これらの容器が金属ブロックと均一の接触をしている必要がある。大きな熱ブロック全体にわたって温度の均一性を維持することもまた課題である。

新規な技法は、サンプルを加熱及び冷却するために金属ブロック付きの機器を使用するという課題を克服しようと考案された。空気流は、プラスチック反応チューブ（例えば、特許文献１参照）、また毛細反応チューブ（例えば、非特許文献１及び特許文献２参照）でサンプルを熱サイクルするために使用することができる。毛細チューブは、他の容器よりも、容積に対し、より広い表面積を提供する。熱媒体として空気を利用することは、少量のサンプルを用いたときに急速で均一な温度遷移を可能にする。

さらに、毛細チューブ自身は異なる温度区域（例えば、特許文献３及び特許文献４参照）全域にわたって物理的に随所に移動させることができ、またサンプルを、固定された毛細（例えば、特許文献５及び特許文献６参照）内で移動させることもできる。後者の技法で、異なるサンプルが連続的にらせん状の毛細チューブを通過するので、サンプルからサンプルへの混入が潜在的な課題である。そのうえ、サンプルの物理的位置を追跡することは技術的に困難である。

薄いプラスチックシートで作られるサンプル容器の使用もまた記述されている。Schoberたちが、マイクロタイタープレート（例えば、非特許文献２）に類似で配列形式のプラスチックシート上に浅くへこんだウエルを形成するための方法を述べている。サンプルが、予め形成されたウエルに置かれた後、第２のシートがその上にかぶせられ、容器が熱でシールされる。付随している熱サイクル装置は、異なる温度区域（例えば、特許文献７）の間でサンプルのトレイを物理的に移動する。温度区域にて多数の熱ブロックを使用することは、この機械を大きくて扱いにくいものにする。

容器がさまざまな反応試薬（例えば、非特許文献３及び特許文献８参照）を含む多数の個々の分室がある場合、プラスチックの二つの薄いシート間で形成された反応チャンバを用いる他のシステムが記載されている。分室は、処理の始めは封止めされている小さな経路で接続している。ある装置は、容器の一端から他端に移動する間、容器を圧搾する可動ローラを有する。そのローラからの圧力は経路の封止めを破り、サンプルを試薬と接触させる。温度は、ローラ構造（例えば、特許文献９）に取り付けられた加熱器によって制御される。第２の装置は、ピストンを利用して分室に圧力を加えて流動体（例えば、特許文献１０）を移動する。ピストンの一つの温度は、熱サイクルを達成するために容器と接触している間は変えることができる。これらの例の両方とも、単一の加熱要素の温度が循環する。加熱要素の温度を変えることは、比較的時間がかかる処理である。

他のシステムは、平面プラスチック容器（例えば、特許文献１１）を使用する。サンプルは固定されたままで、赤外線源であるガスレーザーによって加熱が行われる。

蛍光をモニタすることができる機器と共同して、生成物が蓄積するにつれ蛍光を生じる反応化学を利用して、PCRのリアルタイムでのモニタが可能になる。リアルタイムシステムは、増幅反応と結果観察の間で必要なサンプル伝達の量を大幅に減らす。そのうえ、いくつかのシステムでは、定量的なデータも収集することができる。

多くの市場で入手可能なリアルタイムPCR機器は、蛍光モニタシステムとともに熱サイクル装置と連結して存在している。これらのリアルタイム機器の中で、パーキンエルマー（Perkin-Elmer）５７００と７７００及びBio-Rad iCyclerの熱サイクルは金属熱ブロックが基盤となっている。Roche LightCycler、Idaho Technology Ruggedized Advanced Pathogen Identification system（アイダホテクノロジー耐先進病原体識別システム又はR.A.P.I.D.)、Corbett RotoGeneは、全て空気を用いて反応を熱サイクルする。Cepheid SmartCyclerは、サンプル容器に直接接触するセラミック加熱器板を使用する。
米国特許第５１８７０８４号明細書 米国特許第５４５５１７５号明細書 米国特許第５２７０１８３号明細書 米国特許第５８２７４８０号明細書 米国特許第５９８５６５１号明細書 米国特許第６０３３８８０号明細書 米国特許第５４３０９５７号明細書 米国特許第５２２９２９７号明細書 米国特許第５０８９２３３号明細書 米国特許第５０９８６６０号明細書 国際公開第９８／０９７２８号パンフレット ウイットワー （Wittwer）、外２名 著、 アナリティカル・バイオケミストリー （Analytical Biochemistry）、 （米国）、１９９０年、１８６巻、ｐ．３２８−３３１ ショーバー （Schober）、外６名 著、 バイオテクニックス （Biotechniques）、（米国）、１９９５年、１８巻、ｐ．６５２−６６１ フィンドレー （Findlay）、外９名 著、 クリニカル・ケミストリー （Clinical Chemistry）、（米国）、１９９３年、３９巻、ｐ．１９２７−１９３３

本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応を含みまたそれに限られないさまざまな温度制御処理に使用されるためのサイクルシステムを提供する。本発明はまた、一以上のサンプルの温度を普通自動的に同時に変動することが可能な新規熱サイクルシステムも提供する。本発明は、各反応容器内の温度区域間をサンプルが移動することによって複数の温度間にて急速でほとんど即時の温度変化を可能にする新規熱サイクルシステムをさらに提供する。そのうえ、本発明は、サイクル依存型及び/又は温度依存型蛍光をモニタすることによって、リアルタイムで反応の検出と分析のための熱サイクルシステムを提供する。

例示した実施形態では、反応混合物は、複数の可動加熱機又は発熱体を備えている複数の温度区域と熱接触がある柔らかい側面を有するフレキシブルな容器に収容される。発熱体の一セット以外全てを閉じることによって容器に圧力をかけるとき、容器内部の反応混合物は開いたままの発熱体に移動する。反応混合物は、容器の異なる部分間に移動することが可能であり、発熱体の選択的な開放及び閉鎖によって異なる温度区域にさらされる。反応混合物の温度変化は急速でほとんど即時に起こる。その物質は、反応混合物を保持することができて温度サイクルに耐えることができれば、容器はどんな形であってもよく、例えば引き延ばされてもよく、薄いプラスチックフィルム、金属の薄片、及び柔らかい複合物質のようなフレキシブルな物質からつくることもできる。例えば、プラスチックフィルムは、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレートを含むが、それらだけに限られない、そして合金についても、共有押出し成形、プラズマ昇華、ラミネーションを含む公知技術のいずれの処理によって製造することも可能である。アルミニウムラミネーションのプラスチック、などもまた使用してもよい。

単独の容器は、温度サイクルに使用することができる。別態様として、同時の温度サイクルについては、多数の容器を同時に使用してもよい。多数の容器は、シート形式で並列経路又は円になってお互いに隣接して円盤を形成したりすることで積み重ねていくことができる。発熱体は、例えば、薄膜金属加熱器、セラミック半導体、ペルチェ装置、金属（例えば、銅）線がエッチングされている回路板、均一の加熱分散のための任意の金属板、または上記の組み合わせで製造することができる。厚い金属加熱器は、もし装置が小規模である必要がない場合の選択肢でもある。公知技術の他の加熱器も使用してもよい。

発熱体は、PCRのような特有の化学工程のための特徴的な温度のセットに、又はその近くに、保たれている。化学工程がPCRのとき、少なくとも二つの温度区域が必要である： 一つは核酸サンプルの変性に効果的な温度、もう一つはプライマアニーリング及び伸長を可能にする温度。例えば、両温度区域に関して発熱体が開放位置のとき、反応容器は装置に挿入される。PCRのための温度サイクルは、一温度区域の発熱体が閉鎖位置に至り、容器の反対側の開放温度区域の方に反応混合物を追いやる。開放温度区域では、発熱体は容器壁と熱接触している。適切な定温放置時間の後で、その区域発熱の要素は閉鎖位置におかれ、一方、他の区域の発熱体の要素は開放される。この活動は、反応混合物を他の温度区域に移動させる。こうした温度区域を開放したり閉鎖したりする過程は、核酸増幅のために必要なだけ何度も繰り返される。当然のことながら、追加発熱体要素は、二つより多い温度が必要な処理について用いてもよい。例えば、PCR反応はしばしば、変性温度、アニーリング温度、伸長温度を使う。

本発明の前述及びその他多数の態様は、さまざまな図と併用して好ましい実施態様の以下の詳細な説明を読まれると、より明確になる。

図５及び６に図示されているリアルタイム熱サイクル装置又はシステム１０は、PCR又はサイクルシーケンスによるDNA増幅のような温度制御されている処理に使用するため、例えば、オプションとして蛍光モニタによる反応の検出と分析に使用するために提供される。例えば、システム１０は、独特の遺伝子構造によって生物を特異的に同定するための生物学的因子識別システムとして利用される。システム１０は、熱サイクルサブアセンブリ１２及び蛍光測定器サブアセンブリ３８を含む。通例、熱サイクルサブアセンブリ１２は、核酸サンプルを含む反応混合物即ちサンプル１６（図１A-１Eに図示している）を、温度サイクル、即ち、例えば核酸サンプルの変性のため及びプライマアニーリングと伸長のために加熱と冷却を繰り返すこと、に供する。サンプル１６はフレキシブルなプラスチックフィルム容器１８の内側に密閉され、サブアセンブリ１２のアクチュエータは容器１８を前後に圧搾するので、サンプル１６は二以上の温度区域間を移動する。サブアセンブリ３８は、サイクル依存型及び/又は温度依存型蛍光をモニタすることによってリアルタイムに反応を検出して分析する。システム１０は、機械ブレッドボード３６と、その構造３６を支持するように結合している基盤４６として示されている垂直支持構造をさらに含む。図５に示されているように、各サブアセンブリ１２、３８は、構造３６に据える。各サブアセンブリ１２、３８は以下にてより詳細に議論する。

上記のように、反応混合物１６は核酸サンプルを含み、例えば、図２Aに示されているような、単独で、柔らかい側面の反応容器１８内に収容されている。容器１８はシステム１０で使われて、核酸サンプル１６を受け入れるための反応容器本体１９及び栓受け２４を含む。反応容器本体１９は、プラスチックシートの二平面の面の間を一緒にしてシールされ封止め側２２を形成することで作られる。個々の容器１８は、したがって封止め側２２によって付近の容器１８から切り離されている。液体が栓受け２４に注入されて反応容器本体１９（当初は、容器１８の外壁に重力又は減圧が作用することによって圧搾平面である）に移動することができる。一旦サンプル１６が反応容器本体１９に注入されると、容器１８は、例えばヒートシール、圧締め、接着剤の使用を介して封止２１を作るために封止めすることができる。

他の態様として、栓受け２４は、例えばポリプロピレンから生産されたプラスチック備品（図示されていない）と適合することが可能である。各容器本体１９は、先端で、そこに連結しているプラスチック備品とともに、ある点（図示されていない）まで先細りになることがあるので、ピペット又は注射器のような栓のどちらかの使用を介して、サンプル１６を反応容器本体１９に押し込むことができる。各プラスチック備品は、それぞれの容器本体１９の最上に取り付けて、射出ポートをそれぞれの容器本体に含む。従って、液体試薬が、例えばピペットなどを使用して本体１９に注入されてもよい。過剰空気は、容器１８をヒートシール及び熱サイクルのために熱サイクルサブアセンブリ１２に挿入する以前に本体１９から圧搾されることがあることが、以下により詳細に述べられている。

そのうえ、例えばポリプロピレン取付具又はプラスチックキャップ２３（図２A及び２Bに図示されている）を、容器１８の補助的な閉止を提供するために用いてもよい。プラスチックキャップ２３は、備品にて容器本体１９を封止めするために使われることもあり、それによって、シールエリア２１にて本体１９を封止めする必要を無くしている。プラスチックキャップ２３を入れるように容器本体１９に取り付けること、容器本体１９の上又は中にスナップ嵌めすること、及び/又は本体１９に溶接することなどは、この開示の範囲内である。

またその他の異なる実施態様では、より大きなプラスチック取付具又は備品（図示されていない）もまたサンプル１６を、取付具の複数の空隙、例えば１２個の空隙で凍結乾燥することを可能にするために使ってもよい。単独の注入ポートは、いくつかの反応容器１８につながっており、用意されたDNAサンプルがポートに挿入されたとき、サンプル１６は真空の力によって自動的に各容器１８の本体１９に引き込まれる。このサンプル１６の自動的な配分は、一つの起源に由来する多数の病原体又は多数の遺伝子に関してサンプル１６をテストするために利用してもよい。注射器ピストン棒は、取付具の最上に挿入され、凍結乾燥処理の終わりに自動的に押し下げられ、したがって真空で試薬ペレットを封止めする。本体１９は、それから長期安定のため保護袋で内側を真空封止めする。引用することで本明細書に援用する２００２年４月２３日出願のアメリカ仮出願番号６０/３７４，７３０を参照すること。

容器本体１９は、フレキシブルな物質でできている。そのようなフレキシブルな物質は、薄いプラスチックフィルム、ホイル、軟質の合成物質を含むが、反応混合物１６を入れることができ、変形、細かな亀裂、亀裂、あるいは溶解することなく、反応で使われる温度に繰り返しさらされても耐えることができるのであれば、それらに限らない。ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、そして合金についても、共有押出し成形、プラズマ昇華、ラミネーション等のプラスチックフィルムが好まれる。アルミニウムラミネーションのプラスチックなどもまた好まれる。さらに容器本体１９は、約０．０２-２０W/m*degKの範囲の熱伝達の係数を有している。以下で議論するが、容器本体１９は薄いので、異なる温度で異なる加熱器に接触している容器本体１９の部分間の熱を効果的に伝達することができない。

もし反応の蛍光モニタが要望された場合は、サブアセンブリ３８の使用を通して、例えば、実施されている波長での吸収度及び自己蛍光が十分低いプラスチックフィルムが好まれる。そのような物質は、異なるプラスチック、異なる可塑剤及び合成比、だけでなく、異なるフィルムの厚さを試すことによって発見することが可能である。アルミニウム又は他のホイルラミネーションのプラスチック、蛍光検出装置３８によって読み込まれる容器１８の部分は、ホイルなしのままでもかまわない。PCRの例では、約０．００４８インチ（０．１２１９ミリメートル）の厚さのポリエステル（Mylar, Dupont, Wilmington DE）及び０．００１-０．００３インチ（０．０２５-０．０７６ミリメートル）の厚さのポリプロピレンフィルムからなるフィルム薄片が上手く機能する。例えば、容器本体１９は透明な物質から構成されているので、容器本体１９は、入射光の約８０％-９０％を伝達することが可能である。

多数のサンプルの同時反応を行うため、図２Bに図示されているように、容器１８が、例えば、反応容器１８の配列又は列２０を形成するように配列される。例示されている実施態様では、容器１８は、標準96-ウエル又は384-ウエルマイクロタイタープレートにて既知の間隔を模倣するために９mm又は６mmの間隔で配列されている。しかしながら、他の適した間隔を有している容器１８の列２０を含むことは、この開示の範囲内である。図２Bは、１２個の反応容器１８を含むため容器１８の列又は配列２０を図示している。しかしながら、この開示のシステム１０を使用するために他の数の容器１８を有している他の構成を含むことは、この開示の範囲内である。例えば、リアルタイムモニタのために蛍光を使用するとき、封止め側２２の最下端１４は一つのサンプル容器１８から次への蛍光の垂れ流しを減少させるため、黒くしてもよい。

上記で簡単に述べたように、容器１８（又は容器１８の列２０）は、図３-５に図示されているように熱サイクルサブアセンブリ１２と一緒に使用される。例えば、図３に図示されているように、熱サイクルサブアセンブリ１２は、第１壁４８と、第１壁４８から間隙がありスペーサ３０によって第１壁４８と結合している第２壁５０を有する取り付け台サポート３２を含む。例えば、サポート３２の各第１及び第２壁４８、５０と結合している４つのスペーサ３０がある。取り付け台サポート３２は、第１壁４８と結合している取り付け台５１をさらに含むので、取り付け台サポート３２は、例えば、図６に図示されているように、構造３６をサポートするために結合してもよい。

例えば、熱サイクルサブアセンブリは４つの加熱器をさらに含む：図３に図示されている及び図１A-１Eに図示されている、第１加熱器２５、第２加熱器２６、第３加熱器２７、第４加熱器２８。各加熱器２５、２６、２７、２８は、以下にて議論するように、一個以上の容器１８に面している第１表面５６を有する頭部５４及び反対側表面５８を含む。例えば、図３に図示されているように、各頭部５４は普通長方形の形をしている。しかしながら、容器１８に熱的に接触するためにいずれかの最適な形を有している頭部を含むことは、この開示の範囲内である。

各加熱器２５、２６、２７、２８は、各加熱器２５、２６、２７、２８の接触表面５６と結合している発熱体６０をさらに含む。発熱体６０は、例えば、薄膜金属加熱器又は一つ以上の回路基盤を基にした加熱器、又はその二つの組み合わせであってもよい。金属（例えば銅）線即ち配線は、回路基盤を基にした加熱器にエッチングされるてもよい。各加熱器頭部５６は、例えば金属板で、その結果、発熱体６０によって生成された熱は均一に分散又は分配されてもよい。しかしながら、各頭部又は金属板５６は、オプションとして、加熱器２５、２６、２７、２８の構成要素になる。回路基盤を基にした発熱体は、金属配線の全体にわたって電圧を制御することによって加熱を提供し、金属配線の抵抗を測定することによって温度感知を提供する。しかしながら、他の種類の温度センサを含むことは、この開示の範囲内である。マイクロプロセッサは、回路基盤の標準化した温度を読み込むために使用され、所望の温度に達するために電圧を制御することが可能である。温度の均一性を上げるために各発熱体６０の外側のエッチングされていない銅膜を含むことも、この開示の範囲内である。厚い金属加熱器及びペルチェ装置も、装置が小規模である必要がない場合の選択肢の一つである。オプションとして、アクティブ加熱は、サンプルと接触中又はそれ以前に熱パージなどを適用することによって、より高い温度区域にて行われることができる。オプションとして、アクティブ冷却は、以下に述べられているように、適切な時間、発熱体（図１D及び１E）と接触しているヒートシンク５２などの利用によって、より低い温度区域にて使用することができる。

図３及び図１A-１Eに図示されているように、各第１及び第２加熱器２５、２６は、軸３３によって取り付け台サポート３２の第一壁４８と堅く結合している。以下に述べられるように、各軸３３は第１壁４８と堅く結合しているので、第１及び第２加熱器２５、２６は温度サイクル処理の間ずっと動かないままである。各第２及び第３加熱器２７、２８は、軸又は線形ベアリング３４によって取り付け台サポート３２の第２壁５０と可動できるように結合している。図４A-４Cに示されているように、各軸３４はそれぞれの加熱器２７、２８と堅く結合しているので、加熱器２７、２８は壁５０と関連している各それぞれの軸３４とともに移動するようにされている。

さらに第２及び第３加熱器２６、２７は、第１上部の温度区域６６を作りだし、第１及び第４加熱器２５、２８は第２下部の温度区域６８を作り出す。例えば、下部区域６８がプライマアニーリング及び伸長のために提供される一方で上部区域６６はサンプル１６の変性のために提供されている。各区域６６、６８の加熱器は、各容器１８内の混合物１６の加熱及び冷却のためのある既定温度を保つように設定されている。そういうものとして、区域６６（第２及び第３加熱器２６、２７を含む）は、区域６８（第１及び第４加熱器２５、２８を含む）とは異なる温度に保たれている。加熱器の上部及び下部区域６６、６８は、例えば図１A-１Eに図示されていて、以下においてより詳細に議論される。さらに、ここに述べられている上部及び下部区域６６、６８以外の追加の温度区域（したがって多数の加熱器）を有する熱サイクルサブアセンブリ１２を含むことは、この開示の範囲内である。例えば、第３及び第４温度区域７０、７２は、図１Aに実例として図示されている。

熱サイクルサブアセンブリ１２は、図３に示されている第１ステップモータ２９及び第２ステップモータ３１をさらに含む。第１ステップモータ２９は、第１上部区域６６に位置している第３加熱器２７に結合して制御する。第２ステップモータ３１は、第２下部区域６８に位置している第４加熱器２８に結合して制御する。各ステップモータ２９、３１は、軸３４の長軸に沿って直線経路にあるそれぞれの加熱器２７、２８を動かすために提供されている。ステップモータ２９、３１は示されているが、サーボモータ、歯車電動機、ソレノイド、圧電装置などの例のようないずれの最適な種類の電気機械式の駆動体又はアクチュエータを含むことは、この開示の範囲内である。

図１Aは、この開示のシステム１０及び特にサブアセンブリ１２とともに使用するために加熱器２５、２６、２７、２８の間ではさまれている単独で柔らかい側面の容器１８を図示している。上記で述べられているように、加熱器は二以上の温度区域を作る：第１上部区域６６及び第２下部区域６８。各第３及び第４加熱器２７、２８は、それぞれのステップモータ２９、３１のおかげで開放及び閉鎖位置の間を移動できる。図１Aに示されているように、全ての加熱器のセットは、例えば、容器１８のその中への積み込みを容易にするために開放位置にある。図１B-１Eに図示されていて以下に述べられているように、反応容器１８内部の反応混合物１６は、温度区域内にある特有の加熱器が開放位置に維持されているとき、他の区域内の他の加熱器全てが閉鎖位置にある間、その特有の温度区域にて温められている。図１Bは、上部温度区域６６内の第３加熱器２７が閉鎖位置にある典型的な二つの温度サイクルシステムを図示している。図１Bに示されているように、区域６６内の容器１８の部分は、区域６８（そこでは加熱器２８は開放位置にある）内の容器１８の部分に事実上全ての反応混合物１６をしぼり出すために合わせて圧搾されている。したがって反応混合物１６は、第１及び第４加熱器２５、２８が設定されているところの温度に加熱及び/又は冷却されるために区域６８内の第１及び第４加熱器２５、２８と完全な熱接触にある。その反面、反応混合物１６は区域６６から区域６８にしぼり出されているので、区域６６の温度のままである反応混合物１６はほぼない。

適切な時間の後、加熱器２７は開放位置に移動するので区域６６は開放され、加熱器２８は閉鎖位置に移動するので区域６８は閉鎖し、したがって図１Cに示されているように、反応混合物１６を容器１８の上部分に移動して、上部区域６６の第２及び第３加熱器２６、２７と完全な熱接触をする。熱サイクルは、これらのステップを繰り返すことによって達成される。約９０％又はそれ以上の反応混合物１６が上部及び下部温度区域６６、６８間に移送されることは、この開示の範囲内である。しかしながら、サブアセンブリ１２が熱サイクル処理中に混合物１６の物質移動の他の適量に達することも、この開示の範囲内である。二温度サイクルシステムについて図１B-１Eに示されているように、各容器１８内におかれた反応混合物１６の量はいつでも反応容器本体１９の最大量のだいたい半分より少ないので、反応混合物１６の全て又は事実上全ては二温度区域６６、６８の間を移動することができる。

図１D及び１Eは、オプションとして下部温度区域６８の加熱器２５、２８のアクティブ冷却に役立つヒートシンク５２を使用するのを図で示している。例えば、図１Eで示されているように、ヒートシンク５２はPCR処理の変性段階中に加熱器２５、２８のアクティブ冷却のため下部温度区域６８の加熱器２５、２８とともに使用するために提供される。別態様において、ヒートシンク５２は、アニーリング/伸長段階中に加熱器２５、２８のアクティブ冷却のために使用されたり（図示されていない）、又は加熱器２５、２８に直接接触されること（図示されていない）によって間断なく使用される。例えばヒートシンク５２は、アルミニウム又は銅である。しかしながら、他の適当な物質から成る他のヒートシンクを含むことは、この開示の範囲内である。下部温度区域６８は、ヒートシンク５２を加熱器２５、２８の裏側又は表面５８に接触させることによって積極的に冷却される。変性段階の間、下部温度区域６８の加熱器２５、２８の最上部分は、より高い温度区域６６に近いために又は容器物質を通して加熱された流動体サンプル１６の下端に接触しているために、残存部分よりも温度が高いことがある。加熱器２５、２８の長軸に沿った温度の不均等は、サンプル１６がアニーリング/伸長のために下部温度区域６８に移送されたときにサンプル１６の非効率及び不均等な冷却をまねく可能性がある。ヒートシンク５２が変性段階中に使用されると、ヒートシンクは下部温度区域６８の非均一温度の発生を妨げ、この問題を通例回避する。ヒートシンク５２がアニーリング/伸長段階中に使用されると、ヒートシンクは下部温度区域６８の温度均一性の回復を助け、サンプルが下部温度区域６８に移送されると、変性したサンプルのより急速な冷却を可能にする。ヒートシンク５２を加熱器２５、２８に取り付けると、ヒートシンクは加熱器の温度の均一性を保つことを助け、変性したサンプルの急速な冷却を可能にする。取り付けたヒートシンク５２について適切な熱塊を選択することによって、加熱器２５、２８による電力消費量を最小化することもまた可能になる。

例えば、サブアセンブリ１２は、幅１１０mmで高さ５０mmである加熱器の間の作用面積を特徴としている。これは、１００μlで１２本の反応容器１８（配列２０のような）、又は９mmの間隔を収容するために十分な大きさである。しかしながら、容器１８について他の適当な大きさの作用面積を有する装置を含むことは、この開示の範囲内である。

図３は、この開示のシステム１０のサブアセンブリ１２の一例を図示している。反応容器１８の並列配列又は列２０が、第１及び第２加熱器２５、２６と第３及び第４加熱器２７、２８の間に位置していることが示されている。実例的なPCR応用に関して、第２及び第３加熱器２６、２７は、二本鎖DNAを変性するために十分高い第１温度（一般的に摂氏９０から９６度）に保つ。第１及び第４加熱器２５、２８は、プローブのアニーリング、耐熱性のDNAポリメラーゼによる伸長を可能にする第２温度（摂氏５０から７２度の間）に保つ。これら両方の温度が前もって決められるか、又は、蛍光モニタが一本鎖DNAから二本鎖DNAを区別する染色システムを用いてリアルタイムで実施されるとき、蛍光フィードバックを介して動的に決定されることは、この開示の範囲内である。例えば、U.S.特許番号６，１７４，６７０を参照のこと。

図４Aに示されているように、移動式又は可動式の第３及び第４加熱器２７、２８はそれぞれの軸３４に各自取り付けられる。ステップモータ２９は、固定加熱器２６の方向に向かって軸３４とともに可動第３加熱器２７を前進させて、第３加熱器２７及び固定第２加熱器２６の間の距離を調整するために作用する。同じ方法で、下部区域６８（第１固定加熱器２５及び第４で可動加熱器２８によって定義された）の加熱器間の距離も第２ステップモータ３１によって制御される。温度区域６６、６８の開放と閉鎖を制御するための手段は、ステップモータに限られる必要はない。例えば、第３及び第４加熱器２７、２８を移動するために、図９に示されているような空気圧式ブラダの使用もまた実行可能な方法である。したがって、お互いに向かったり離れたりして加熱器２５、２６、２７、２８を移動する他の適切な手段を含むのは、この開示の範囲内である。さらに、特定の区域内で加熱器の両方のセットを移動することは、この開示の範囲内である。さらにまた図３に最もよくみられるように、各加熱器２５、２６、２７、２８は、反応容器１８の全列２０と接触するために伸びて形成される。しかしながら、個々の反応容器１８に独自に接触するために分割された形式で加熱器の各組（又は４つの加熱器全て）の可動加熱器２７、２８を提供することは、この開示の範囲内である。各小部は、別途の移動手段によって制御されてもよい。

図示されている二温度熱サイクルシステム１０の稼働において、図４Aに示されているように、列２０は加熱器２９の上部及び下部の組の間にのびるように、反応容器１８の細片又は列２０はサブアセンブリ１２の作用領域に挿入される。反応混合物１６を熱サイクルするために、第４加熱器２８は、図４Bに図示されているように、第１固定加熱器２５に向かって閉鎖位置に移動する。加熱器２８を閉鎖位置に移動することは、加熱器２８と加熱器２５がその間に位置している反応容器１８の外壁上に当たることになり、したがってそれぞれの反応容器１８の上部分に実質上全ての反応混合物１６をしぼり出すことになる。反応容器１８の外壁との直接接触を引き続き保ちながら、第２加熱器２６と第３加熱器２７の間の容器栓受けギャップ３５の幅は、開放位置にて、反応容器本体１９の上半分に混合物１６が流入することを可能にするのに十分な広さである。図４Cに図示されているように、加熱器２６と２７の間の栓受けギャップ３５は、第３加熱器２７を第２加熱器２５に向かって閉鎖位置へと通例同時に移動することによって閉じる一方で、加熱器２５と２８の間の容器栓受けギャップ３７の幅は、（図４Bに図示されている）閉鎖位置にて、第４加熱器２８を第１加熱器２５から離れる方向の開放位置に移動することによって開かれる。

図３及び４A-４Cに示されている熱サイクルサブアセンブリ１２の実例的な実施態様は、アニーリング場所として下部区域内に位置している第１及び第４加熱器２５、２８を使用するが、当業者は他の仕組みを思いつくことが可能である。例えば、上部加熱器２６、２７はアニールするために使用されることがあったり、下部加熱器２５、２８は反応混合物１６内のDNAを変性するために使用されたりしてもよい。さらに上記で簡単に述べたように、二つ以上の温度間のサイクルのために二つ以上の加熱器のセット又は区域を有するサブアセンブリ１２を含むことは、この開示の範囲内である。例えば加熱器の三セットは、変性、アニーリング、伸長のために使われる異なる温度の一般的な三温度PCR設定を作りだす。温度区域が縦に並ぶのではなく横に配列される仕組みもまた考えられる。

反応混合物１６の急速で均一な加熱と冷却を達成するための一つの方法は、作用温度区域で加熱器２５及び加熱器２８の間及び加熱器２６及び加熱器２７の間（又は、容器栓受けギャップ３５）で短い距離を保つことである。しかしながら、反応混合物１６の急速な温度均一性はシステム１０の攪拌によって達成することが可能であることもまた予想できる。例えば、二温度PCRシステムで実施される温度遷移のために、それぞれの加熱器が反応混合物の効果的な加熱又は冷却のために開放位置にあるときの作用温度区域に関して、およそ０．１mmからおよそ２mmの容器栓受けギャップ３５が好ましく、０．２５から１mmが最も好ましい。それぞれの加熱器が閉鎖位置のとき、例えば容器栓受けギャップ３７は完全につぶれたサンプル容器の厚さに限りなく近くなり、例えば約０．１から０．１５mmである。さらに、例えば、各それぞれの区域内の加熱器２９の閉鎖と開放の速さは、比較的速い。重ねて、二温度PCRシステムの場合、５mm/sから０．０１mm/sの閉鎖及び開放速度が好ましく、およそ１mm/sが最も好ましい。しかしながら、加熱器２７、２８が他の適当な速さにて開放及び閉鎖することは、この開示の範囲内である。さらに、いくつかの応用ではより遅い閉鎖及び開放の速さが付随して、より遅い温度遷移が好ましいことがあることが分かっている。

図５及び６は、リアルタイムPCR検出システム１０への熱サイクルサブアセンブリ１２の組み込みを示している。上述したように、熱サイクルサブアセンブリ１２は基盤４６と結合しているサポート３６上に取り付けられる。蛍光測定器サブアセンブリ３８は、熱サイクルサブアセンブリ１２下に取り付けられる。蛍光測定器サブアセンブリ３８は、蛍光測定器駆動軸４２によって蛍光測定器線形ベアリング４０に沿って移動することができる。さらにステップモータ４４が提供され、蛍光測定器サブアセンブリ３８を移動するために蛍光測定器駆動軸４２を回転させるためのコンピューター制御がなされている。図６は、複合装置の断面図を示している。下部容器栓受けギャップ３５が開放しているとき、蛍光測定器サブアセンブリ３８は反応容器１８の一つの中から反応混合物１６の蛍光を測定することができる。上に述べたように、蛍光測定器サブアセンブリ３８を移動することは、列又は細片２０内の個々の反応混合物１８のモニタを可能にする。

図７は、図５及び６で述べているリアルタイムシステムを使用して増幅されたDNA断片であるPCRの例を図示している。ヒトベータグロビン遺伝子の１１０塩基の断片は、DNAプライマ5'ACACAACTGTGTTCACTAGC (SEQ ID NO. 1)及び5'CAACTTCATCCACGTTCACC (SEQ ID NO. 2)に各０．５μM、lX SYBR Green I dye（分子プローブ、Eugene OR、１：３０，０００希釈）、２００μMdNTPs、０．０４U/μl Taq ポリメラーゼとTaqStart抗体（Roche Molecular Biochemicals, IN）、PCRバッファ（Idaho Technology, UT）を使用して増幅された。ヒトゲノムDNAの約１５，０００コピーが、１００マイクロリットルの反応混合物に含まれていた。反応混合物１６は反応容器１８に置かれて、以下の温度概要とともに５０サイクルについて温度サイクルされた：９５℃、４秒、６０℃、２秒。図７で、物質の増幅が３７サイクル後に蛍光の増加によって示された八つの反応混合物で確認された。増幅した物質の識別は、LightCyclerシステム（Roche Molecular Biochemicals）を用いて、その融解温度を標準物質の融解温度とを比較したことによって、ベータグロビン断片であることが確認された。一つの実例的な実施態様として、PCR試薬は反応容器にて凍結乾燥されていて、水に溶けているサンプルを加えることによって再構成される。

図８及び９を見ると、代替のPCR装置１１０が提供されている。装置１１０は装置１０と類似しており、したがって、類似参照番号は類似構成部分を識別するために使われている。装置１１０もまた、装置１０と同様に、温度サイクル及び反応混合物の検出及び分析のような機能を果たす。装置１１０は、熱サイクルサブアセンブリ１１２及び蛍光測定器サブアセンブリ１１４の使用を介してこれらの機能を実施する。装置１０と装置１１０間の一つの違いは、装置１１０の可動加熱器２７、２８は空気圧式ブラダ１２９、１３１の二セットで運転している。実例となる空気圧式ブラダが開示されているが、油圧式、ばね配列の例のような適した圧力式アクチュエータならどんなものでも、その使用を介して加熱器２７、２８を移動することは、この開示の範囲内である。

ブラダの第１上部セット１２９は可動加熱器２７と結合している上部ブラダ１４４、１４６を含み、ブラダの第２下部セット１３１は可動加熱器２８と結合している下部ブラダ１４８、１５０を含む。ブラダ１４４、１４６、１４８、１５０は、例えば、空気圧式取付具１２８の上にヒートシールポリエチレン/ポリプロピレンラミネートフィルムによって各自製造される。このシールは、円形で長方形の場所が加熱器の近くに位置するように、配置される。例えば、各ブラダ１４４、１４６、１４８、１５０は容器１８の列２０内のすべての容器１８に影響するように、各ブラダ１４４、１４６、１４８、１５０（それに結合している各加熱器２５、２６、２７、２８）は装置１１０の長さ分を通常伸びる。さらに各ブラダ１４４、１４６、１４８、１５０は、図９の断面図に一取付具しか図示していないが、例えば二つの空気圧式取付具１２８と結合している。

運用では、空気は各プラスチックフィルムブラダ１４４、１４６、１４８、１５０を膨らませるために取付具１２８に押し込まれ、その結果、各可動加熱器２７、２８と結合している発熱体６０を容器１８と接触させ、固定加熱器２５、２６のそれぞれの発熱体６０に各容器１８中の液体サンプル１６を他の加熱区域に押し込める。装置１１０は、ブラダの各セット１２９、１３１と結合している堅い機械的サポート１２６及び各サポート１２６と結合している断熱材１３３を含む。例えば、機械的サポート１２６は金属又は炭素繊維複合断片でできているが、いずれの適切な物質からサポート１２６ができても、この開示の範囲内である。示されているように、一断熱材１３３が加熱器２７と結合していて他の断熱材１３３は加熱器２８と結合している。各断熱材１３３は断熱物質でできているので、各それぞれの加熱器２７、２８の温度はより一定して保たれていることがある。

図９に図示されているように、各可動加熱器２７、２８は二つのブラダと結合している。例えば、加熱器２７はブラダ１４４、１４６の第１上部セット１２９と結合していて、加熱器２８はブラダ１４８、１５０の第２下部セット１３１と結合している。各可動加熱器２７、２８のための二つのブラダの使用は、各上部及び下部加熱区域６６、６８内のサンプル１６における能動的混合を可能にする。サンプル１６の攪拌は、例えば上部区域６６内の（上部セット１２９の）ブラダ１４４及び１４６を循環的に加圧することによって、又は下部区域６８内の（下部セット１３１の）ブラダ１４８及び１５０を循環的に加圧することによって成し遂げる。マイクロプロセッサ１６２（図９に図示されているように）の制御下にある超小型化バルブ（図示されていない）は、二つの加熱区域６６、６８間の高圧力の切換に利用されてもよく、その場合、上部及び下部温度区域６６、６８間でサンプルが往復させられる。例えば、全ての空気圧式ブラダ１４４、１４６、１４８、１５０は、マイクロプロセッサ１６０によって制御されている。さらに、例えば、別々のマイクロプロセッサが、温度感知、発熱体６０の加熱などを制御するために使用される。

図９に示されているように、装置１１０は他のブラダ１５２によって駆動される密封機構１４２をさらに含む。密封機構１４２は、ブラダ１５２と結合しているばね収縮シールバー１５６を含む。容器１８にサンプル１６を密閉するには、ブラダ１５２を膨張させてばね収縮シールバー１５６を作動させ、シールバー１５６の合わせ面１５８と装置１１０の反対側表面１６０の間を、容器１８の列２０と接触させて、シールバー１５６を押す。シールバー１５６における合わせ面１５８は、例えばニクロム線（図示されていない）と適合するので、それ故に通過電流によって加熱されることが可能である。その線は反応容器本体１９の内膜を溶解するために十分な時間加熱して、それを融合して栓受けの中にサンプル１６をロックする。装置１１０に密封機構１４２が一体化して提供されてはいるが、密封機構１４２が必須でなく、容器１８は公知技術のいずれの方法で密閉されてもよいことは理解されている。

制御機構（図示されていない）もまた提供されており、加熱器板収縮ばね、MACバルブ、取付具１２８のための栓受けを含む。装置１１０は例えば電池で稼働しており内部空気圧式システムを含み、上で述べたように、第１及び第２セット１２９、１３１ブラダ１４４、１４６及び１４８、１５０を含んでいる。例えば、ブラダ１４４、１４６の第１セット１２９はシステムの第１駆動体又はアクチュエータとして作用し、ブラダ１４４、１４６の第２セット１３１はシステムの第２駆動体又はアクチュエータとして作用する。使い捨て２５グラム二酸化炭素シリンダー１３２は、例えば空気圧式システムを駆動するため使用される。図８及び９は携帯型で、電池稼働ユニットを図示しているが、装置１１０は標準の電気源から流入する構成でも構わないことが理解される。さらにまた、二酸化炭素シリンダー１３２が図示してあるが、この開示の範囲内で他の圧搾流体源が使用されてもよいことも、理解される。

図８に図示されているように、装置１１０は、本体１１６及び例えば蝶番（図示されていない）によって本体１１６に結合している蓋１１８を有しており、蓋１１８は開放位置（図示されている）と閉鎖位置間を旋回する輸送ボックス１１１を含む。例えば、ボックス１１１は頑丈な陽極処理アルミニウムでできているが、他の適当な物質でできた輸送ボックスを含むことも、この開示の範囲内である。掛け金１２０は本体１１６の前面部１２２と結合していて、蓋１１８は閉鎖位置にて施錠してもよく、輸送ボックスは容易に運ばれてもよい。蓋１１８は、例えば、３８６DOSコンピューター１２４を含むが、いずれの適当なコンピューター又はマイクロプロセッサが使用されてもよい。PCインターフェイス１３０が提供されているので、コンピューター１２４は、装置１１０からPCに集積された情報をダウンロードするためにユーザPCと接続してもよい。温度、サイクル数などの入力する情報及び変数のためのキーを含んでいるインターフェイス１３４（例えばソフトキーインターフェイス）が、提供される。例えば、２×２０mmの文字表示もまた設けている。表示１３６は、例えばLED、LCD、又は他のそのような表示でもよい。図８にさらに示されているように、ボックス１１１の本体１１６は最上面１３８を含み、容器１８の列２０を収容するためにスロット１４０をそこに形成させる。他のマイクロプロセッサが使用されることがあっても、この開示の範囲内であることが理解される。マイクロプロセッサは、装置１１０の構成部分として提供される必要がなく、用途によっては、マイクロプロセッサが全く必要ないこともあることも理解される。

自動呼び出しソフトウェアの例は、U.S.特許出願番号第１０/０７４，１７８及び１０/１１７，９４８で述べられているマルチテスト分析方法によって、サンプルを分析するために提供されることがあり、ここに次の改良及び追加を参考にすることによって実現する。複数の箇所（例えば、１０、２０、３０、５０箇所）は、いくつかの蛍光値を獲得するため、各時点に対するそれら蛍光値の中央値をアルゴリズムへの入力として使用するため、各個々のサンプル容器１８の底面１５全体にわたってに応答指令信号が送られる。封止め２２に近いサンプル容器１８の部分からのデータ箇所は、好ましくは、蛍光のエッジ効果のために使用しない。中央値を取る前に、ソフトウェアは個々の蛍光値を目下の獲得値以前のサイクルから獲得したデータともまた比較して、値が極端に異なるそれらの値を無視する。これはソフトウェアが、反応中の気泡、その他の干渉粒子の外見、即ちゆらぎ、のためにさらに誤った蛍光シグナルを生成するサンプル容器１８の部分を無視することを可能にする。中央値を取得する以外の他の数値手段が、各サンプルについて底面全体にわたって取得した多数の測定値を、単一の蛍光値にまとめるために求められることがあることは理解されている。これらは、フーリエ変換、平均化、公知関数への適合、保存基準を含む。最後に、図示された実施態様で、サンプルの区分（すなわち、検体の存在について“ポジティブ”又は“ネガティブ”）は、自動呼び出しがポジティブ及びネガティブコントロールに期待される結果を登録している場合にのみ、又はオプションとして、多重反応又は代替遺伝子座がサンプルと一致した結果を提供するときのみ、ユーザに報告される。例えば、自動呼び出しが、ポジティブ及び/又はネガティブコントロールで期待された呼び出しと矛盾している場合は、そのあとにソフトウェアが反応を繰り返す必要があるとユーザに報告する。もし多重反応又は代替遺伝子座の結果がサンプルと矛盾している場合、ソフトウェアは矛盾を報告し、サンプルを“ポジティブ”又は“ネガティブ”とみなさない。装置１１０は表示画面１３６に結果を表示して、選択すると、特定の反応についてユーザがより深く調べることを可能にする。

上で述べたように、装置１１０は、空気圧式ブラダ１４４、１４６、１４８、１５０の第１及び第２セット１２９、１３１に圧縮ガスを供給するためのガスチャンバ１３２をさらに含む。図８に図示されているように、シリンダー１３２はスロット１４０の近くに位置しているので、チャンバ１３２の一部は本体１１６の最上面１３８の上に突出している。チャンバ１３２は、ユーザが必要に応じてチャンバ１３２を補充してもいいように、輸送ボックス１１１の本体１１６から着脱できる。チャンバ１３２は実例的に円筒形の形だが、ブラダ１２９、１３１に圧縮空気を送り込むためにいずれの適当な形を有しているガスチャンバを含むことは、この開示の範囲内である。装置１０と同様に、装置１１０は輸送ボックス１１１の本体１１６内に各自位置している熱サイクルサブアセンブリ１１２及び蛍光測定器サブアセンブリ１１４を含む。装置１１０のコンピューター１２４は両サブアセンブリ１１２、１１４のある一定の機能を制御することがある。しかしながら、サブアセンブリ１１２、１１４を別々に制御するために他のコンピューター又はマイクロプロセッサを含むことも、この開示の範囲内である。

図９を見ると、熱サイクルサブアセンブリ１１２は、上部及び下部温度区域６６、６８を作り出すために加熱器２５、２６、２７、２８を含む。さらに、加熱器２５及び２６は固定加熱器で、加熱器２７、２８は可動加熱器である。前に簡単に述べたように、空気圧式ブラダ１４４、１４６の第１上部セット１２９は加熱器２７と結合しており、空気圧式ブラダ１４８、１５０の第２下部セット１３１は加熱器２８と結合している。二つのブラダはお互いに結合していることが図示されているが、任意の適当な数の空気圧式ブラダと加熱器が結合することは、この開示の範囲内である。各ブラダ１４４、１４６、１４８、１５０は、二酸化炭素チャンバ１３２に結合している。装置１０に関して上で述べられた温度サイクル処理のために要求されるように、マイクロプロセッサ１６０は、ブラダ１４４、１４６、１４８、１５０の各セット１２９、１３１の膨張及び収縮を制御する。空気圧式ブラダ１４４、１４６、１４８、１５０は、それぞれの加熱器２７、２８において高くて均一の駆動力を提供する。さらに例えば、ブラダ１４４、１４６、１４８、１５０は比較的軽くほとんど場所をとらないので、装置１１０が小さく、コンパクトで、携帯型であることを可能にしている。

サブアセンブリ１１２はまた、各ブラダ１４４、１４６、１４８、１５０に二酸化炭素ガスの出し入れを調整するためにブラダ１４４、１４６、１４８、１５０と結合している１１のバルブ多岐管もまた含む。ここに１１のバルブ多岐管が開示されているが、ブラダ１４４、１４６、１４８、１５０を操作するために他の適当なな数のバルブを有している多岐管を含むことは、この開示の範囲内である。ガスチャンバ１３２内の二酸化炭素ガスは、３０psiに調整され、バルブからの電気損失を最小化するために多岐管を経て切り換えられる。空気圧式ブラダ１４８、１５０の第２セット１３１は、上部及び下部温度区域６６、６８間の各容器１８内のサンプル１６を押し出すために固定加熱器２６に向かって可動加熱器２８を押しやる一方で、空気圧式ブラダ１４４、１４６の第１セット１２９は、固定加熱器２５に向かって可動加熱器２７を押しやる。

稼働中は、ブラダ１４４、１４６及び１４８、１５０の実例的なセット１２９、１３０は、各温度区域６６、６８内のサンプル１６における機械的混合を可能にするためにそれぞれの可動加熱器２７及び２８で揺動運動を発生させることができる。加熱器２７、２８の揺動運動によってサンプル１６を混合することは、各サンプル１６内の温度均一性を増加させ、各自それぞれの容器本体１９の底面にて最高の蛍光測定のための各サンプル１６の位置づけに役立つ。

サブアセンブリ１１２は、図９に図示されて上に述べられているように、加熱器２６、２７の上に位置している密封機構１４２をさらに含む。容器１８の列２０は、シールバー１５６の合わせ面１５８及び表面１６０の間で、本体１１６のスロット１４０に挿入される。シールバー１５６は、上で述べられたように、容器１８で成す列２０をロックして封止めするために空気圧式ブラダ１５２によって表面１６０に向かって移動することを求められている。例えば、シールバー１５６は、封止めを一緒に形成するように各容器１８の容器本体１９の上部分をヒートシールする。しかしながら、固定加熱器２５、２６及び可動加熱器２７、２８間における容器１８の列２０を単に締める又は安全にするシールバー１５６についても、この開示の範囲内である。

本発明の前述説明は、実例及び説明の目的のために提示されている。これは、本発明を記述された精密な形態に網羅的又は制限する意図はなく、明白に多数の他の修正が上記教示に照らして可能である。実施態様は、本発明及びその実用的な応用の原理を最も明らかに説明するために選択されたので、それによって、他の当業者が、さまざまな他の実施態様で本発明を最も効果的に利用すること及び検討された特有な使用に適合することがあるさまざまな他の修正を可能にする。

図１Aから１Eは、現在開示の発熱体間に位置する反応混合物を収容している反応容器の断面線図である。
図１Aは、容器から間隙がある各発熱体を示している少なくとも三組の発熱体間に位置している容器の線図である。 図１Bは、二組の発熱体間に位置する容器の図１Aと類似の線図で、最上組の発熱体は閉鎖位置に、最下組の発熱体は開放位置にあるので、通例全ての反応混合物は最下組の発熱体によって加熱される及びその間に位置していることを示している。 図１Cは、図１A及びBと類似の線図で、最下組の発熱体は閉鎖位置に、最上組の発熱体は開放位置にあるので、通例全ての反応混合物は最上組の発熱体によって最下組の発熱体とは異なる温度にて加熱される及びその間に位置していることを示している。 図１Dは、図１Bと類似の線図で、最下組の発熱体は開放位置に、最上組の発熱体は閉鎖位置にあることを示しており、ヒートシンクが近くだが各最下組の発熱体からは間隙があることをさらに示している。 図１Eは、図１Dと類似の線図で、最下組の発熱体は閉鎖位置に、最上組の発熱体は開放位置にあることを示しており、さらに各ヒートシンクはそれぞれの発熱体と連結して最下組の発熱体を冷却することを示している。 図２Aは、容器のフレキシブルな本体と栓受けがつながっている反応容器の斜視図である。 図２Bは、一列を形成するためにお互いに連結している反応容器の配列の斜視図である。 図３は、現在開示（図５及び６にて図示されている）のリアルタイムPCR装置とともに使用される熱サイクルサブアセンブリの実例の斜視図で、サブアセンブリの第１及び第２のステップモータ、最上及び最下の発熱体の組、発熱体の組間に位置づけられた反応容器の列が示されている。

図４Aから４Cは、図３で示されている熱サイクルサブアセンブリの側面図で、容器内に収容されている反応混合物の熱サイクルを示している。
図４Aは、熱サイクルサブアセンブリの側面図で、容器内の反応混合物を加熱する以前の開放位置の最上及び最下の発熱体の組を示している。 図４Bは、熱サイクルサブアセンブリの側面図で、最下組の発熱体が閉鎖位置なので反応混合物は最上組の発熱体と熱接触にあることを示している。 図４Cは、熱サイクルサブアセンブリの側面図で、最上組の発熱体が閉鎖位置で最下組の発熱体は開放位置なので反応混合物は最下組の発熱体と熱接触にあることを示している。 図５は、熱サイクルサブアセンブリ及び蛍光測定器サブアセンブリを含むリアルタイムPCR装置に統合された熱サイクルサブアセンブリの斜視図である。 図６は、図５に示されているリアルタイムPCR装置の側面図である。 図７は、アニーリング温度区域で関連のある蛍光の増幅によってDNA増幅が検出されるPCRのリアルタイムモニタの結果を示しているグラフである。 図８は、代替のリアルタイムPCR装置の斜視図で、その中にサンプル容器を置くためのスロット及びスロット近くの加圧ガスチャンバを含む装置の本体を示していて、その装置は本体にかかっている蓋をさらに含み、PCインターフェイス及び表示モニタを有しているコンピューターを含むことを図示している。 図９は、図８に示されているPCR装置の本体内に位置している構成部分の部分略、部分線断面図であり、熱サイクルサブアセンブリの下に位置する空気圧式ブラダ及び蛍光測定器サブアセンブリを有している代替熱サイクルサブアセンブリを示している。

Claims (8)

1. 反応混合物を繰り返し加熱及び冷却するための温度サイクル装置で、
   第１加熱器が反応混合物の温度に影響を及ぼす第１定位と第１加熱器が反応混合物の温度に影響を及ぼさない第２定位の間を移動できる前記第１温度区域と、
   前記第１温度区域の第１及び第２定位の間を移動する前記第１温度区域のための第１主要駆動体と、
   前記第１加熱器に隣接の第２温度区域で、前記第２加熱器が反応混合物の温度に影響を及ぼす第１定位と前記第２加熱器が反応混合物の温度に影響を及ぼさない第２定位の間を移動できる前記第２温度区域と、
   前記第２温度区域の第１及び第２定位の間を移動する前記第２温度区域のための第２主要駆動体と、
   を備え、
   温度サイクルの最中に、第１の加熱器が第１の定位にある時に第２の加熱器が第２定位にあり、第１の加熱器が第２の定位にある時に第２の加熱器が第１の定位にあり、
   前記反応混合物を収容するためのフレキシブルな反応容器をさらに備え、
   前記第１の温度区域が前記フレキシブルな反応容器の第１部分を受け入れるための第１ギャップを形成し、
   前記第２の温度区域が第１ギャップと隣接する第２ギャップを形成し、
   前記第２ギャップが前記フレキシブルな反応容器の第２部分を受け入れ、
   前記第１の温度区域が閉鎖位置にある時に前記サンプルが前記フレキシブルな反応容器の前記第１部分から押し出され、
   前記第２の温度区域が閉鎖位置にある時に前記サンプルが前記フレキシブルな反応容器の前記第２部分から押し出されることを特徴とするシステム。
2. 請求項１に記載の装置であって、
   前記第１温度区域は、第１発熱体および前記第１発熱体から間隙があり前記第１主要駆動体と結合している第２発熱体を含み、
   前記第２温度区域は、第１発熱体および前記第１発熱体から間隙があり前記第２主要駆動体と結合している第２発熱体を含むことを特徴とする装置。
3. 第１区域と、前記第１区域に隣接しかつ第１区域と連通する第２区域と、を有するフレキシブルな反応容器内に流体サンプルが提供される、前記流体サンプルを熱サイクルするための方法であって、
   a. 前記第１区域に前記サンプルを押し込むため及び第１温度にて第１組の加熱器と接触するため前記第２区域を圧搾すること、
   b.その次に前記第２区域に前記サンプルを押し込むため及び第２温度にて第２
   組の加熱器と接触するため前記第１区域を圧搾すること、
   前記第２温度は前記第１温度とは異なっていること、
   を備えることを特徴とする方法。
4. 請求項３に記載の方法であって、
   多数の温度サイクルの間中、ステップa及びbを繰り返すことをさらに備えることを特徴とする方法。
5. 請求項４に記載の方法であって、
   前記サンプルは核酸を含み、反応容器はＰＣＲを実施するための試薬をその中にさらに含んでいることを特徴とする方法。
6. 請求項５に記載の方法であって、
   前記反応容器は、蛍光要素をその中にさらに含み、
   前記蛍光要素は、核酸の量に関係して蛍光シグナルを提供することを可能にすることを特徴とする方法。
7. 請求項３に記載の方法であって、
   前記フレキシブルな反応容器が、反応容器の列を形成するために複数の独立した反応容器を連ねて形成したものであり、
   前記方法がさらに、
   複数の追加の生物学的サンプルの中で複数の追加核酸を増幅し、
   前記工程aが各反応容器に追加の生物学的サンプルを入れることを含むことを特徴とする方法。
8. 請求項１に記載の装置であって、前記第１と第２のギャップが複数のフレキシブルな反応容器を受け入れるように設計され、
   前記複数のフレキシブルな反応容器の各々が第１部分と第２部分を備え、
   前記フレキシブルな反応容器が、列になった反応容器を形成するために複数の独立した反応容器を連ねたものであることを特徴とする装置。

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