DE69833492T2 - Rezeptorspezifischer transepithelialtransport von therapeutica - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Produkte für die Transepithelabgabe von Therapeutika. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen für die Abgabe von Therapeutika, die mit einem FcRn-Bindungspartner konjugiert sind, an Darmepithel, Schleimepithel und Epithel der Lunge. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter die Synthese, Herstellung und Verwendung von FcRn-Bindungspartnerkonjugaten als pharmazeutische oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen für die orale systemische Abgabe von Wirkstoffen und Vakzinen.
  • Das Immunsystem eines Säugetiers entwickelt sich während der Gestation und wird im späten Säugerfötus aktiv. Obwohl aktiv, kann es noch als „unreif" charakterisiert werden, da es noch nicht in einem erheblichen Umfang durch Antigene gereizt worden ist; der Fötus wird vor Antigenen weitestgehend durch die Mutter geschützt. Dieses „unreife" Immunsystem wird jedoch ergänzt durch den Transfer von mütterlichen Immunglobulinen auf den Fötus (oder in einigen Fällen auf das Neugeborene), um eine humorale Immunität während der ersten Wochen des unabhängigen Lebens bereitzustellen.
  • Ratten und Mäuse erhalten das meiste an mütterlichem Immunglobulin G (IgG) durch Stillen aus dem Kolostrum und der Milch, obwohl etwas parenteral aufgenommen wird. Rinder erhalten IgG ebenfalls aus dem Kolostrum. Bei Kaninchen wird IgG über den Dottersack zum Fötus transportiert. Es ist wenig bekannt über den Transfer von IgG auf den Fötus oder das Neugeborene beim Menschen. Die meisten Belege schlagen vor, dass menschliche Mütter humorale Immunität auf Ihre Nachkommen nur kurz vor der Geburt übertragen, obwohl man glaubt, dass IgA, das auf ein Neugeborenes durch Brustmilch übertragen wird, beim Schutz des Neugeborenen gegen Darminfektionen eine Rolle spielt.
  • Die Abgabe von mütterlichem IgG auf den Säugetierfötus und/oder das Neugeborene macht den Transport über eine Epithelbarriere erforderlich, die für Makromoleküle weitestgehend undurchlässig ist. Der Transport von Makromolekülen über eine derartige Epithelbarriere kann durch unspezifische und spezifische Rezeptor-vermittelte Mechanismen erfolgen.
  • Unspezifische Rezeptormechanismen werden durch parazelluläre Siebeffekte dargestellt, deren Wirksamkeit invers mit dem Molekulargewicht des transportierten Moleküls korreliert ist. Der Transport von Makromolekülen wie beispielsweise IgG über diesen parazellulären Weg ist in höchstem Maße ineffizient. Beschreibungen von Rezeptor-vermitteltem Transport von Immunglobulinen durch intestinale Epithelzellen sind bisher auf den polymeren Immunglobulinrezeptor und den Enterozytenrezeptor für IgG (ein mit dem Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse I-verwandter Fc-Rezeptor) beschränkt. Diese zwei Rezeptorsysteme unterscheiden sich in ihrer Spezifität hinsichtlich des Immunglobulinisotyps, in der Richtung ihres Immunglobulintransportes über die Epithelzelle und in ihrer gewebespezifischen Expression. Beides kann eine Rolle beim Ausbilden des unreifen Immunsystems spielen.
  • Der polymere Immunglobulinrezeptor wird auf den Basolateralen Oberflächen von Enterozyten, Hepatozyten und/oder Zellen des Gallengangepithels exprimiert. Er transportiert polymeres IgA und IgG zu den apikalen (luminalen) Oberflächen, wodurch diese Immunglobuline für die antimikrobielle Verteidigung und Antigenexklusion konzentriert werden.
  • Der Enterozytenrezeptor für IgG, der eine Homologie zu der schweren Kette von MHC Klasse I aufweist und mit β2-Mikroglobulin (β2M) verbunden ist, wird auf neonatalen Enterozyten der Ratte und der Maus exprimiert. IgG wird in einer Richtung von luminal zu serosal über das Darmepithel dieser Nagetierneugeborenen transzellulär transportiert. Auf der apikalen Oberfläche des Enterozyten wird der Fc-Teil des IgG an den Enterozytenrezeptor bei dem vergleichsweise sauren pH des Lumens (pH bei etwa 6,0) gebunden. Nach Transzytose an die basolaterale Plasmamembran wird das Immunglobulin bei einem vergleichsweise neutralen pH der Interstitialflüssigkeiten (pH etwa 7,4) freigegeben. Der Fc-Rezeptor (FcRn) von Nagetierneugeborenen könnte für die Abgabe von mütterlichem IgG an das Neugeborene und als solches für den passiven Erwerb von IgG während dieser Phase verantwortlich sein.
  • Beim Menschen wird mütterliches IgG aktive über die Plazenta transportiert. Der Rezeptor, der für diesen Transport verantwortlich ist, ist seit vielen Jahren gesucht worden. Mehrere IgG-bindende Proteine sind aus der Plazenta isoliert worden. FcγRII wurde in Plazentaendothel und FcγRIII in Synzytiotrophoblasten nachgewiesen. Beide Rezeptoren zeigten jedoch eine vergleichsweise niedrige Affinität für monomeres IgG. Kürzlich wurde die Isolierung einer cDNA aus Plazenta berichtet, die ein menschliches Homolog zu dem Enterozytenrezeptor für IgG der Ratte und der Maus kodiert. (Story, C.M. et al., J. Exp. Med., Vol. 180:2377-2381, Dezember 1994). Die vollständige Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz wird berichtet. Dieser Fc-Rezeptor für IgG kann für den Transport von mütterlichem IgG zu dem menschlichen Fötus (und möglicherweise sogar zu dem Neugeborenen) verantwortlich sein, da das Molekül in hohem Maße über seinen offenen Leserahmen zu der FcRn-Sequenz der Ratte (69 % Nukleotididentität und 65 % Identität betreffend vorhergesagter Aminosäure) homolog ist. Die sogenannte passive Immunisierung beim menschlichen Fötus (und möglicherweise beim Neugeborenen des Menschen) kann nun besser verstanden werden.
  • Im Gegensatz zur passiven Immunisierung, die die Ergänzung des Immunsystems eines Wirtes mit Antikörpern betrifft, die von einem anderen abgeleitet ist, umfasst die aktive Immunisierung die Stimulierung des eigenen Immunsystems des Wirts, um in vivo die erwünschte Immunantwort zu erzeugen. Die am Weitesten verbreiteten durchgeführten Verfahren zur aktiven Immunisierung bei Kindern und Erwachsenen umfassen die Injektion eines Immunogens, einmal als initiale Dosis und dann wenigstens noch einmal als eine Auffrischungsdosis. Diese Verfahren weise viele ernsthafte Nachteile auf, einschließlich des Risikos, das mit der Verwendung von Nadeln verbunden ist, die Erkrankungen wie beispielsweise AIDS und Hepatitis übertragen können. (Wenn ein Patient gegenüber einem Allergen tolerant gemacht wird, verschlimmern sich die Probleme dahingehend, dass oft wiederholte Injektionen über eine lange Zeitspanne erforderlich sind.) Diese Verfahren lösen auch nicht notwendigerweise in adequater Weise die erste Verteidigungslinie gegen fehlende Pathogene aus, d. h. die durch die Schleimhaut vermittelte Immunität. Schleimmembranen kleiden die Luftwege, das reproduktive System und den gastrointestinalen Trakt aus und diese Schleimoberfläche stellt für viele Erkrankungen die erste Eintrittspforte dar. Ein orales Vakzin, das leicht abzugeben ist und das eine durch die Schleimhaut vermittelte Immunität auslöst, wäre im hohen Maße wünschenswert.
  • Die Immunisierung unter Verwendung von oralen Vakzinen ist problematisch. Oftmals wird nur eine geringe oder keine Immunantwort erreicht. Um die Immunantwort zu verstärken, sind interessierende Antigene mit Trägern gekoppelt worden, von denen bekannt ist, dass sie stark immunogen sind. Beispielsweise haben Wissenschaftler und Forscher Antigene unter Verwendung von Bacille Calmotte-Guerin (BCG) als einen Träger abgegeben; BCG ist ein Bakterium, das ursprünglich als ein orales Vakzin gegen Tuberkulose verwendet worden ist. Ein Problem mit derartigen Trägern besteht darin, dass der Patient Antikörper gegen den Träger selbst entwickeln werden wird, was nachteilig sein kann, wenn der Träger erneut für die Abgabe eines anderen Antigens an den gleichen Patienten verwendet wird. Bis zum heutigen Tage hat sich keine allgemeine Strategie für orale Vakzine als erfolgreich erwiesen. Immunglobulin und Teile davon sind in der Vergangenheit mit Wirkstoffen und bildgebenden Agenzien konjugiert worden, um Zellpopulationen anzuvisieren und zu zerstören und die Halbwertszeit bestimmter Agenzien zu verlängern. Immuntoxine sind ein Beispiel für derartige Konjugate. Derartige Konjugate sind jedoch nie als für die Initiierung einer Immunantwort nützlich vorgeschlagen worden.
  • Ein kleiner Teil der Arbeit hat sich auf die tolerogene Kapazität von Immunglobulinen konzentriert, die mit Oligonukleotiden oder Proteinen gekoppelt waren, die für Autoimmunerkrankungen charakteristisch sind (siehe PCT WO 91/08773). Diese Arbeit basiert auf der Vorstellung, dass die Induktion von Toleranz stark durch Trägerbestandteile beeinflusst werden kann, und dass Immunglobulinträger stark tolerogen zu sein scheinen. Isologes IgG ist der bevorzugte Träger und intravenöse Verabreichung war die zur Abgabe der Konjugate von IgG verwendete Art und Weise. Obwohl sich diese Arbeit über mehr als ein Jahrzehnt erstreckte, wird die orale Verabreichung nur einmal und nur für Konjugate erwähnt, wo IgA der Immunglobulinträger ist. Obwohl somit tolerogene Immunglobulinkonjugate in der Technik bekannt sind, sind diese Konjugate nie als Agenzien für das Induzieren einer robusten Antwort gegen ein Antigen vorgeschlagen worden, das für ein Pathogen charakteristisch ist. (Im Gegenteil, die Technik schlägt vor, dass derartige Konjugate, wenn überhaupt, ein Lebewesen gegen ein Pathogen tolerant machen würden, was im hohen Maße unerwünscht wäre.) Darüber hinaus ist nie vorgeschlagen worden, dass derartige Konjugate wirksame Tolerogene sein würden, wenn das Immunglobulin IgG ist und die Art der Abgabe die orale Abgabe ist.
  • WO 96/22024 offenbart Verfahren und Produkte zum Modulieren einer Immunantwort in Säugetieren durch Verabreichung eines Konjugates aus einem Antigen und einem FcRn-Bindungspartner, wobei der FcRn-Bindungspartner verwendet wird, um das Antigen über eine Epithelialbarriere zu transportieren. Das Antigen kann für ein Pathogen, für eine Autoimmunerkrankung oder ein Allergen oder einen Tumor charakteristisch sein.
  • WO 93/20834 offenbart Verfahren und Zusammensetzungen für die Abgabe von therapeutischen Agenzien an ein Lebewesen durch orale Verabreichung eines chimären Moleküls mit einem therapeutischen Agens, das an einen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) oder transformierenden Wachstumsfaktor α (TGF- α) konjugiert ist, das den EGF-Rezeptor erkennt und in der Lage ist, einen transepithelialen Transport des therapeutischen Agens durch Transzytose zu bewirken.
  • US 5,534,496 offenbart Verfahren und Zusammensetzungen zur Verstärkung des Transportes von Wirkstoffen (einschließlich Peptiden, Oligonukleotiden, Proteinen und herkömmlichen Wirkstoffen) über Epithelzellen an Mukosastellen durch Einführen des Wirkstoffes an derartigen Stellen zusammen mit oder gekoppelt an ein Peptid, das wenigstens zwei Aminosäuren, wie beispielsweise Pro-Leu-Gly-Pro-Arg oder Pro-Leu, und eine Schutzgruppe wie beispielsweise Phenylazobenzyloxycarbonyl, N-Methyl, t-Butyloxycaronyl, Fluoroenylmethyloxycarbonyl, oder Carbobenzoxy, am N-Terminus umfasst.
  • Die Erfindung umfasst die Entdeckung, dass Verbindungen an Moleküle gekoppelt werden können, die an den FcRn-Rezeptor binden, wie beispielsweise Immunglobuline, oder Teile davon, und über Epithelialbarrieren durch einen. aktiven Transport durch die Enterozytose vermittels FcRn-Rezeptoren abgegeben werden können. Das Immunglobulin oder ein Teil davon bindet an den FcRn-Rezeptor und wirkt als ein Träger für das Antigen, während das Immunglobulin oder ein Teil davon über die Epithelialbarriere durch FcRn-vermittelten Transport transportiert wird. Der FcRn-Rezeptor ist in dem menschlichen Epithelgewebe von Kindern und Erwachsenen vorhanden.
  • FcRn-Bindungspartner können für die Abgabe einer großen Vielzahl von Verbindungen und Therapeutika und bioaktiven Substanzen verwendet werden, einschließlich chemotherapeutischen Agenzien für die Behandlung von Krebs, Zytogenen, einschließlich Interferon; und Hormonen einschließlich Insulin, menschliches Wachstumshormon (HGH), Fertilitätswirkstoffe, Calcitonin, Calcitriol und andere bioaktive Steroide. FcRn-Bindungspartner können weiter für die gezielte Abgabe eines Abgabevehikels wie beispielsweise eines Liposoms verwendet werden. Die FcRn-Bindungspartner der vorliegenden Verwendung werden für die gezielte Abgabe von hämatologischen Verbindungen verwendet.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist der FcRn-Bindungspartner nicht-spezifisches IgG oder ein FcRn-Bindungsfragment von IgG. Am bevorzugtesten ist der FcRn-Bindungspartner ein Fc-Fragment von IgG. Es ist auch bevorzugt, dass das Antigen kovalent mit dem FcRn-Bindungspartner gekoppelt ist. Bevorzugterweise wird das Konjugat oral an das Darmepithel verabreicht, in einem Aerosol an die Lungen oder intranasal. Derartige Zubereitungen können nicht-aseptisch sein. Ergänzende verstärkende Agenzien, wie unten beschrieben, können zusätzlich verabreicht werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, wenn die abzugebende Verbindung ein Peptid oder Protein ist, kann das FcRn-Bindungspartnerproteinkonjugat als ein rekombinantes Fusionsproteins synthetisiert werden.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung betreffen FcRn-Bindungspartner, die mit hämatologischen Verbindungen konjugiert sind, für die orale, sublinguale oder intranasale systemische Verabreichung. Die pharmazeutische Zubereitung der vorliegenden Erfindung umfasst ein Konjugat aus einer hämatologischen Verbindung und einem FcRn-Bindungspartner. Die bevorzugten FcRn-Bindungspartner sind wie oben beschrieben. Die pharmazeutische Zubereitung der vorliegenden Erfindung umfasst auch einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Die pharmazeutischen Zubereitungen der Erfindung können in Einheitsdosierungsformen, die für die Abgabe an einen Epithelträger konstruiert und angeordnet sind, für die orale Abgabe an das Darmepithel, Aerosolabgabe an das Lungenepithel und intranasale Abgabe an das Nasenepithel formuliert sein. Tabletten, die IgG (oder einen FcRn-Bindungsteil davon) enthalten, das an hämatologische Verbindungen gekoppelt ist, sind von der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • Die vorstehenden pharmazeutischen Zubereitungen können zusammen mit ergänzenden Verstärkungsagenzien abgegeben werden. Die ergänzenden Verstärkungsagenzien können selbst an einen FcRn-Bindungspartner gekoppelt sein, um die Abgabe von derartigen Agenzien über die Epithelbarriere zu erleichtern. Bevorzugte Verabreichungsformen umfassen im Allgemeinen orale Dosierungen an das Darmepithel, Aerosole an die Lungen und intranasale Dosierungen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiter die Synthese, Herstellung und Verwendung von FcRn-Bindungspartnerkonjugaten der vorliegenden Erfindung als oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen für die orale und intranasale systemische Abgabe von Wirkstoffen und Vakzinen. Die Synthese der FcRn-Bindungspartnerkonjugate der vorliegenden Erfindung umfasst das kovalente Koppeln eines FcRn-Bindungspartners an eine hämatologische Verbindung. Weiterhin umfasst die Synthese der FcRn-Bindungspartnerkonjugate der vorliegenden Erfindung das kovalente Koppeln eines FcRn-Bindungspartners an ein Abgabevehikel, z. B. Liposomen. Der bevorzugte FcRn-Bindungspartner ist ebenfalls oben beschrieben. Die Konjugate können dann verwendet werden, um die pharmazeutischen Zubereitungen der vorliegenden Erfindung herzustellen.
  • Diese und andere Aspekte der Erfindung werden detaillierter nun im Folgenden beschrieben.
  • 1 Nukleotid- und Aminosäuresequenz des Fc-Fragmentes von menschlichem IgG.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft FcRn-Bindungspartner, die für die gezielte Abgabe von Therapeutika und Liposomen an Epithelbarrieren modifiziert sind. Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass der menschliche FcRn-Rezeptor bei Epithelgewebe von Erwachsenen aktiv ist und dass FcRn-Bindungspartner wie beispielsweise IgG oder Fc-Fragmente verwendet werden können, um andere Moleküle, einschließlich Antigenen, über Epithelbarrieren hinweg zu transportieren. Auf diese Weise können „FcRn-Bindungspartner" wie beispielsweise IgG oder ein FcRn-Bindungsteil davon verwendet werden, um ein Antigen oder ein Therapeutikum über ein Epithel an den systemischen Blutkreislauf abzugeben, wodurch eine vorteilhafte Reaktion oder eine vorteilhafte Wirkung, z. B. eine Immunantwort, hervorgerufen wird.
  • Ein derartiges System ist immer dann nützlich, wenn es wünschenswert ist, die Abgabe eines Antigens über eine Epithelbarriere an das Immunsystem zu verstärken. Das System kann daher verwendet werden, um Antigene über Darmepithelgewebe, Lungenepithelgewebe und andere Schleimhautoberflächen abzugeben, einschließlich nasaler Oberflächen, vaginaler Oberflächen, Kolonoberflächen und Oberflächen des Gallengangsystems. Das System kann verwendet werden, um das Immunsystem eines Lebewesens zu modulieren, wie beispielsweise durch Stimulieren einer humoralen Antikörperantwort gegen ein Antigen zu stimulieren, durch Stimulieren der Aktivität der T-Zellen, oder durch Stimulieren einer Toleranz gegenüber einem Antigen. Wie hierin verwendet bedeutet Lebewesen: Menschen, Primaten, Pferde, Kühe, Schafe, Schweine, Ziegen, Hunde, Katzen, Hünchen und Nagetiere. Bei der Abgabe von Tumorantigenen kann das System verwendet werden, um Lebewesen zu behandeln, die unter einer Krankheit leiden, die für eine durch Immunität vermittelte Abstoßung zugänglich ist, wie beispielsweise nicht-solide Tumoren oder solide Tumoren mit geringer Größe. Es wird auch ins Auge gefasst, dass die Abgabe von Tumorantigenen durch die hierin beschriebenen Verfahren für die Behandlung, die der Entfernung großer solider Tumoren nachfolgt, nützlich sein wird. Die Verfahren können auch verwendet werden, um Lebewesen zu behandeln, von denen vermutet wird, dass sie an Krebs leiden.
  • Die Verfahren sind immer dann nützlich, wenn es wünschenswert ist, eine systemische Abgabe eines Therapeutikums oder Wirkstoffes oder Abgabevehikels oder Proteins oder Kombinationen davon über eine Epithelbarriere an den systemischen Blutkreislauf zu erreichen. Die Konjugate können somit verwendet werden, um Therapeutika über Darmepithelgewebe, Lungenepithelgewebe und andere Schleimepitheloberflächen abzugeben, einschließlich nasale Oberflächen, vaginale Oberflächen, Kolon- und Rektaloberflächen und Oberflächen des Gallengangsystems. Die Konjugate können verwendet werden, um ein Therapeutikum zu verabreichen, um eine vorteilhafte Wirkung hervorzurufen. Die FcRn-Bindungspartnerkonjugate sind so konstruiert, dass sie eine große Breite von Therapeutika abgeben, einschließlich RNA- und DNA-Nukleotide, wie, beispielsweise, in der Gentherapie verwendet, Peptide, Kohlenhydrate und kleine Moleküle. Diese Therapeutika umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Krebsmittel und chemotherapeutische Wirkstoffe, z. B. Doxorubicin; anti-entzündliche Wirkstoffe, z. B. Steroide; Wirkstoffe für die Behandlung von kardiovaskulärer Erkrankung, z. B. Cholinesteraseinhibitoren, Wirkstoffe für die Behandlung von Störungen, die mit viralen Infektionen im Zusammenhang stehen, z. B. Leberzhirrose, die aus Hepatitisinfektion hervorgeht; Wirkstoffe für die Behandlung von Gewichtsstörungen, z. B. Amphetamine; antibakterielle Agenzien, anti-Pilzmittel, Zytokine, Fertilitätswirkstoffe, Antibiotika, Hormone, Steroide etc.
  • Die Erfindung umfasst die Ausbildung eines Konjugates aus einem FcRn-Bindungspartner und einer hämatolytischen Verbindung. Unter Konjugat werden zwei oder mehrere Einheiten verstanden, die aneinander durch irgendein physiochemisches Mittel gebunden sind, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, hydrophobe Wechselwirkung, kovalente Wechselwirkung, Wasserstoffbrückenbindung oder ionische Wechselwirkung zwischen einer bioaktiven Verbindung, wie beispielsweise einem Antigen oder einem Therapeutikum, und den nicht-spezifischen hydrophoben Teilen eines Antikörpermoleküls, Antikörper-Antigenspezifisches Binden und kovalentes Koppeln. Die Art der bevorzugten Bindung wird, unter anderen, von der Verabreichungsart und den pharmazeutischen Trägern abhängen, die verwendet werden, um das Konjugat an die ausgewählte Epithelbarriere abzugeben. Beispielsweise sind einige Bindungen nicht so geeignet wie andere, um bestimmten Umgebungen wie beispielsweise dem Magen zu widerstehen, können aber davor durch Abgabesysteme geschützt werden, die den Magen umgehen. Es ist natürlich wichtig, dass die Bindung zwischen dem FcRn-Bindungspartner und der Verbindung von einer solchen Art ist, dass sie nicht die Fähigkeit des FcRn-Bindungspartners zerstört, an den FcRn-Rezeptor zu binden. Derartige Bindungen sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und Beispiele werden detaillierter im Folgenden angegeben. Das Konjugat kann weiter als ein Fusionsprotein ausgebildet sein, wie ebenfalls detaillierter im Folgenden diskutiert.
  • Ein FcRn-Bindungspartner bedeutet irgendeine Einheit, die spezifische durch den FcRn-Rezeptor gebunden werden kann mit nachfolgendem aktiven Transport des FcRn-Bindungspartners durch den FcRn-Rezeptor. Wie oben erwähnt ist der FcRn-Rezeptor für mehrere Säugetierarten isoliert worden, einschließlich dem Menschen. Die Sequenz des menschlichen FcRn, des FcRn der Ratte und des FcRn der Maus kann in Story, C.M. et al, J. Exp. Med., Band 180:2377-2381, Dezember 1994 gefunden werden. Das FcRn-Rezeptormolekül ist nun gut charakterisiert. Der FcRn-Rezeptor bindet IgG (aber nicht andere Imumunoglobulinklassen wie beispielsweise IgA, IgD, IgM und IgE) bei einem vergleichsweise niedrigen pH, transportiert aktiv das IgG transzellulär in einen Hohlraum in serosaler Richtung und setzt dann das IgG bei einem vergleichsweise höheren pH frei, der in den Interstizialflüssigkeiten vorliegt. Wie von den Fachleuten auf dem Gebiet anerkannt werden wird, können FcRn-Rezeptoren durch Klonieren oder durch Affinitätsreinigung isoliert werden unter Verwendung, beispielsweise, von monoklonalen Antikörpern. Derartig isolierte FcRn-Rezeptoren können dann verwendet werden, um FcRn-Bindungspartner zu identifizieren und zu isolieren, wie unten beschrieben.
  • FcRn-Bindungspartner der vorliegenden Erfindung umfassen eine jegliche Einheit, die spezifisch durch den FcRn-Rezeptor gebunden werden kann, einschließlich ganzem IgG, des Fc-Fragments von IgG und andere Fragmente von IgG, die die vollständige Bindungsregion für den FcRn-Rezeptor umfassen. Die Region des FcR-Teils von IgG, die an den FcRn-Rezeptor bindet, ist auf der Grundlage von Röntgenkristallographie beschrieben worden (Burmeister, W.P. et al., Nature, 1994; 372:379-378). Die Hauptkontaktfläche von Fc mit dem FcRn-Rezeptor befindet sich nahe der Verbindung der CH2- und CH3-Domänen. Potentielle Kontakte stellen die Reste 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 und 314 in CH2 und 385-387, 428 und 433-436 in CH3 dar. (Diese Stellen sind verschieden von jenen, die durch Unterklassenvergleich oder durch ortspezifische Mutagenese als für die Fc-Bindung FcγRI und FcγRII von Leukozyten wichtig bestimmt worden sind). Die vorstehenden Fc-FcRn-Kontakte befinden sich alle innerhalb einer einzelnen schweren IgG-Kette. Man hat vor kurzem festgestellt, dass zwei FcRn-Rezeptoren ein einzelnes Fc-Molekül binden können. Die kristallographischen Daten legen nahe, dass in einem derartigen Komplex ein jedes FcRn-Molekül ein einzelnes Polypeptid des Fc-Homodimers bindet.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können FcRn-Bindungspartner verwendet werden, die von ganzem IgG verschieden sind, um Therapeutika über die Epithelbarriere zu transportieren. In einer derartigen Ausführungsform ist bevorzugt, dass ein FcRn-Bindungspartner ausgewählt ist, der FcRn mit einer höheren Affinität als ganzes IgG bindet. Ein derartiger FcRn-Bindungspartner ist nützlich bei der Verwendung von FcRn, um einen aktiven Transport eines konjugierten Therapeutikums über die Epithelialbarriere zu erreichen, und ist auch nützlich, um die Bindung und den Transport von ganzem IgG über die Epithelbarriere vermittels des FcRn zu verhindern. Die FcRn-Bindungsaktivität dieser höher affinen FcRn-Bindungspartner kann gemessen werden unter Verwendung von Standardtests, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, einschließlich: (a) Transporttests unter Verwendung von polarisierten Zellen, die den FcRn natürlicherweise exprimieren, oder genetisch modifiziert worden sind, um den FcRn oder die alpha-Kette des FcRn zu exprimieren; (b) Protein:Protein-Bindungstests unter Verwendung von löslichem FcRn oder Fragmenten davon, oder immobilisierten FcRn; (c) Bindungstests unter Verwendung von polarisierten oder nicht-polarisierten Zellen, die natürlicherweise den FcRn exprimieren oder genetisch modifiziert worden sind, um den FcRn oder die alpha-Kette des FcRn zu exprimieren.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der FcRn-Bindungspartner durch rekombinante gentechnische Methoden hergestellt werden. Im Rahmen der Erfindung enthalten sind Nukleotidsequenzen, die menschliche FcRn-Bindungspartner kodieren. Die FcRn-Bindungspartner umfassen ganzes IgG, das Fc-Fragment von IgG und andere Fragmente von IgG, die die vollständige Bindungsregion für den FcRn umfassen. Die Hauptkontaktstellen umfassen die Aminosäurereste 248, 250-257, 272, 285; 288, 290-291, 308-311 und 314 des CH2 und die Aminosäurereste 385-387, 428 und 433-436 des CH3. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind somit Nukleotidsequenzen umfasst, die Bereich des IgG-Fc kodieren, die diese Aminosäurereste überspannen.
  • Auf der Grundlage der vorstehenden Information werden die Fachleute auf dem Gebiet leicht erkennen, dass die Fc-Region von IgG gemäß gut bekannten Verfahrensweisen modifiziert werden kann, wie beispielsweise ortspezifische Mutagenese oder dergleichen, um modifiziertes IgG oder modifizierte Fc-Fragmente oder Teile davon zu erhalten, die durch den FcRn-Rezeptor gebunden werden. Derartige Modifikationen umfassen Modifikationen, die von den FcRn-Kontaktstellen entfernt sind, ebenso wie Modifikationen innerhalb der Kontaktstellen, die die Bindung beibehalten oder sogar verstärken. Zusätzlich können andere Bindungspartner identifiziert und isoliert werden. Antikörper oder Teile davon, die für den FcRn-Rezeptor spezifisch und in der Lage sind, durch FcRn transportiert zu werden, wenn sie einmal gebunden sind, können identifiziert und isoliert werden unter Verwendung von gut etablierten Techniken. In ähnlicher Weise können zufallsmäßig erzeugte molekular diverse Bibliotheken gescreent und Moleküle, die durch die FcRn-Rezeptor gebunden und transportiert werden, isoliert werden unter Verwendung herkömmlicher Techniken. Die Erfindung soll nicht durch die Auswahl von irgendeinem speziellen FcRn-Bindungspartner beschränkt sein.
  • Wenn das Peptid vollständig aus Gen-codierten Aminosäuren zusammengesetzt ist, oder ein Teil davon so zusammengesetzt ist, kann das Peptid oder der relevante Teil davon auch synthetisiert werden unter Verwendung von herkömmlichen rekombinanten gentechnischen V erfahren.
  • Für die rekombinante Produktion wird eine Polynukleotidsequenz, die den FcRn-Bindungspartner kodiert, in ein geeignetes Expressionsvehikel eingeführt, d. h. einen Vektor, der die erforderlichen Elemente für die Transkription und Translation der eingeführten kodierenden Sequenz enthält, oder im Falle eines viralen RNA-Vektors die erforderlichen Elemente für die Replikation und Translation enthält. Das Expressionsvehikel wird dann in eine geeignete Zielzelle transfiziert, die das Peptid exprimieren wird. Abhängig von dem verwendeten Expressionssystem wird dann das exprimierte Peptid durch Verfahren isoliert, die in der Technik gut etabliert sind. Verfahren für die Produktion von rekombinantem Protein und Peptid sind in der Technik gut bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.; and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).
  • Um die Effizienz der Produktion zu erhöhen, kann das Polynukleotid so konstruiert sein, dass es mehrere Einheiten des FcRn-Bindungspartners kodiert, die durch enzymatische Spaltungsstellen getrennt sind. Das sich ergebende Polypeptid kann gespalten werden (z. B. durch Behandlung mit dem entsprechenden Enzym), um die Peptideinheiten zu gewinnen. Dies kann die Ausbeute an Peptiden erhöhen, die von einem einzelnen Promotor gesteuert wird. Wenn in geeigneten viralen Expressionssystemen verwendet, wird die Translation eines jeden Peptids, das durch die mRNA kodiert wird, intern in dem Transkript gesteuert; z. B. durch eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES). Das polycistronische Konstrukt steuert somit die Transkription einer einzelnen, großen polycistronischen mRNA, die wiederum die Translation von mehreren einzelnen Peptiden steuert. Dieser Ansatz beseitigt die Produktion und enzymatische Bearbeitung von Polyproteinen und kann die Ausbeute am Peptid signifikant erhöhen, die durch einen einzelnen Promotor gesteuert wird.
  • Eine Vielzahl von Wirtsexpressionsvektorsystemen kann verwendet werden, um die FcRn-Bindungspartner zu exprimieren, die hierin beschrieben sind. Diese umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Mikroorganismen wie beispielsweise Bakterien, die mit rekombinanter Bakteriophagen-DNA transformiert sind, oder Plasmid-DNA-Expressionsvektoren, die eine geeignete kodierende Sequenz enthalten; Hefe- oder filamentöse Pilze, die mit rekombinanten Hefe- oder Pilz-Expressionsvektoren transformiert sind, die eine geeignete kodierende Sequenz enthalten; Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z. B. Baculovirus) infiziert sind, die eine geeignete kodierende Sequenz enthalten; Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z. B. Blumenkohlmosaikvirus oder Tabakmosaikvirus) infiziert sind, oder mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren (z. B. Ti-Plasmid) transformiert sind, die eine geeignete kodierende Sequenz enthalten; oder tierische Zellsysteme.
  • Die Expressionselemente der Expressionssysteme variieren hinsichtlich ihrer Stärke und Spezifitäten. Abhängig von dem verwendeten Wirt-Vektor-System kann eine jegliche Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiver und induzierbarere Promotoren, in dem Expressionsvektor verwendet werden. Beispielsweise können beim Klonieren in bakteriellen Systemen induzierbare Promotoren wie beispielsweise pL von Bakteriophagen λ plac, ptrp, ptac (ptrp-lac-Hybridpromotor) und dergleichen verwendet werden; Beim Klonieren in Insektenzellsystemen können Promotoren wie beispielsweise der Baculovirus-Polyeder-Promotor verwendet werden; beim Klonieren in Pflanzsystemen können Promotoren verwendet werden, die von dem Genom von Pflanzenzellen abgeleitet sind (z. B. Hitzeschockpromotoren; der Promotor für die kleine Untereinheit von RUBISCO; der Promotor für das Chlorophyll a/b-Bindungsprotein) oder der von Pflanzenviren (z. B. der 35S-RNA-Promotor von CaMV; der Hüllproteinpromotor von TMV); beim Klonieren in Säugetierzellsystemen können Promotoren verwendet werden, die von dem Genom von Säugetierzellen (z. B. Metallothionein Promotor) oder von Säugetierviren (z. B. der späte adenovirale Promotor; der Promotor des Vacciniavirus 7,5 K) verwendet werden; wenn Zelllinien erzeugt werden, die mehrere Kopien des Expressionsproduktes enthalten, können SV40-, BPV- und EBV-basierte Vektoren mit einem geeigneten selektierbaren Marker verwendet werden.
  • In den Fällen, wo Pflanzenexpressionssysteme verwendet werden, kann die Expression von Sequenzen, die lineare oder nicht-zyklisierte Formen der zyklischen Peptide der Erfindung codieren, durch irgendeine Anzahl von Promotoren gesteuert werden. Beispielsweise können virale Promotoren wie beispielsweise die 35S-RNA- und 19S-RNA-Promotoren von CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310: 511-514) oder der Hüllproteinpromotor von TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6: 307-311) verwendet werden; alternativ können Pflanzenpromotoren wie beispielsweise der Promotor der kleinen Untereinheit von RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224: 838-843) oder Hitzeschockpromotoren, z. B. hsp17.5-E oder hsp17.3-B von der Sojabohne (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 559-565) verwendet werden. Diese Konstrukte können in Pflanzenzellen unter Verwendung von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzenvirusvektoren, direkte DNA-Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation etc. eingeführt werden. Für Übersichten derartiger Techniken siehe z. B. Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Abschnitt VIII, Seiten 421-463; und Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2. Ausgabe, Blackie, London, Kap. 7-9.
  • In einem Insektenexpressionssystem, das verwendet werden kann, um die Peptide der Erfindung herzustellen, wird das nukleäre Polyhidrosevirus von Autographa californica (AcNPV) als ein Vektor verwendet, um die Fremdgene zu exprimieren. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Eine codierende Sequenz kann in nicht-essentielle Regionen (z. B. das Polyedergen) des Virus kloniert werden und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors gestellt werden (z. B. den Polyederpromotor). Das erfolgreiche Einführen einer codierenden Sequenz wird zu einer Inaktivierung des Polyedergens und Produktion von nichtokkludiertem rekombinanten Virus führen (das ist ein Virus, dem die Proteinhülle fehlt, die durch das Polyedergen codiert wird). Diese rekombinanten Viren werden dann verwendet, um Spodoptera frugiperda-Zellen zu infizieren, in denen das eingeführte Gen exprimiert wird (siehe z. B. Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, US-Patent Nr. 4,215,051). Weitere Beispiele dieses Expressionssystems können in Current Protocols in Molecular Biology, Band 2, Ausubel et al., Herausgeber, Greene Publish. Assoc. & Wilqey Interscience gefunden werden.
  • In Säugetierwirtszellen kann eine Anzahl von viral basierten Expressionssystemen verwendet werden. In Fällen, wo ein Adenovirus als ein Expressionsvektor verwendet wird, kann eine codierende Sequenz an einen Transkriptions/Translationskontrollkomplex des Adenovirus ligiert werden, z. B. den späten Promtor und die dreiteilige Leadersequenz. Dieses chimäre Gen kann dann in das adenovirale Genom durch in vitro- oder in vivo-Rekombination eingeführt werden. Die Einführung in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms (z. B. Region E1 oder E3) wird zu einem rekombinanten Virus führen, der lebensfähig und in der Lage ist, Peptid in infizierten Wirten zu exprimieren (z. B. siehe Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 3655-3659). Alternativ kann der 7.5 K-Promotor von Vaccinia verwendet werden (siehe z. B. Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 4927-4931).
  • Gemäß den Ausführungsformen, die nicht Teil der vorliegenden Erfindung sind, ist der FCRn-Bindungspartner mit einem Antigen konjugiert. Ein Antigen, wie hierin verwendet, fällt in vier Klassen: 1) Antigene, die für ein Pathogen charakteristisch sind; 2) Antigene, die für eine Autoimmunerkrankung charakteristisch sind; 3) Antigene, die für ein Allergen charakteristisch sind; und 4) Antigene, die für einen Tumor charakteristisch sind. Antigene umfassen im Allgemeinen Polysaccharide, Glycolipide, Glycoproteine, Peptide, Proteine, Kohlenhydrate und Lipide von Zelloberflächen, Zytoplasma, Kernen, Mitochondrien und dergleichen.
  • Antigene, die für Pathogene charakteristisch sind, umfassen Antigene, die von Viren, Bakterien, Parasiten oder Pilzen abgeleitet sind. Beispiele für wichtige Pathogene umfassen Vibrio cholerae, enterotoxigene Escherichia coli, Roatvirus, Clostridium difficile, Shigella-Arten, Salmonella typhi, Parainfluenzavirus, Influenzavirus, Streptococcus pneumoniae, Borrelia burgdorferi, HIV, Streptococcus mutans, Plasmodium falciparum, Staphylococcus aureus, Tollwutvirus und Epstein-Barr-Virus.
  • Viren im Allgemeinen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf jene der folgenden Familien: Picornaviridae; Caliciviridae; Togaviridae; Flaviviridae; Coronaviridae; Rhabdoviridae; Filoviridae; Paramyxoviridae; Orthomyxoviridae; Bunyaviridae; Arenaviridae; Reoviridae; Retroviridae; Hepadnaviridae; Parvoviridae; Papovaviridae; Adenoviridae; Herpesviridae; und Poxyviridae.
  • Bakterien umfassen im Allgemeinen, sind aber nicht beschränkt auf: P. aeruginosa; E. coli, Klebsiella sp.; Serratia sp.; Pseudomonas sp.; P. cepacia; Acinetobacter sp.; S. epidermis; E. faecalis; S. pneumoniae; S. aureus; Haemophilus sp.; Neisseria Sp.; N. meningitidis; Bacteroides sp.; Citrobacter sp.; Branhamella sp.; Sahmonella sp.; Shigella sp.; S. pyogenes; Proteus sp.; Clostridium sp.; Erysipelothrix sp.; Listeria sp.; Pasteurella multocida; Streptobacillus sp.; Spirillum sp.; Fusospirocheta sp.; Treponema pallidum; Borrelia sp.; Actinomycetes; Mycoplasma sp.; Chlamydia sp.; Rickettsia sp.; Spirochaeta; Legionella sp.; Mycobacteria sp.; Ureaplasma sp.; Streptomyces sp.; Trichomonas sp.; und P. mirabilis.
  • Parasiten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malaria; Toxoplasma gondii; Leishmania mexicana, L. tropica, L. major, L. aethiopica, L. donovani, Trypanosoma cruzi, T. brucei, Schistosoma mansoni, S. haematobium, S. japonium; Trichinella spiralis; Wuchereria bancrofti; Brugia malayi; Entamoeba histolytica; Enterobius vermicularis; Taenia solium, T. saginata, Trichomonas vaginatis, T. hominis, T. tenax; Giardia lamblia; Cryptosporidium parvum; Pneumocystis carinii, Babesia bovis, B. divergens, B. microti, Isospora belli, L hominis; Dientamoeba fragilis; Onchocerca volvulus; Ascaris lumbricoides; Necator americanis; Ancylostoma duodenale; Strongyloides stercoralis; Capillaria philippinensis; Angiostrongylus cantonensis; Hymenolepis nana; Diphyllobothrium latum; Echinococcus granulosus, E. multilocularis; Paragonimus westermani, P. caliensis; Chlonorchis sinensis; Opisthorchis felineas, G. Viverini, Fasciola hepatica, Sarcoptes scabiei, Pediculus humanus; Phthirius pubis; und Dermatobia hominis.
  • Pilze umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Cryptococcus neoformans; Blastomyces dermatitidis; Aiellomyces dermatitidis; Histoplasma capsulatum; Coccidioides immitis; Candida-Art, einschließlich C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guilliermondii und C. krusei, Aspergillus-Art, einschließlich A. fumigatus, A. flavus und A. niger, Rhizopus-Arten; Rhizomucor-Arten; Cunninghammella-Art; Apophysomyces-Arten, einschließlich A. saksenaea, A. mucor und A. absidia; Sporothrix schenckii, Paracoccidioides brasiliensis; Pseudallescheria boydii, Torulopsis glabrata; und Dermatophytes-Art.
  • Antigene, die für eine Autoimmunerkrankung charakteristisch sind, werden typischerweise von der Zelloberfläche, aus dem Zytoplasma, Nukleus, Mitochondrien und dergleichen von Säugetiergeweben abgeleitet. Beispiele umfassen Antigene, die für Uveitis (z. B. S-Antigen), Diabetes mellitus, multiple Sklerose, systemischen Lupus erythematosus, Hashimoto's Schilddrüsenentzündung, Myasthenia gravis, primäres Myxödem, Schilddrüsenüberfunktion, rheumatoide Arthritis, perniziöse Anämie, Addisonkrankheit, Sklerodermie, autoimmune atrophische Gastritis, verfrühte Menopause (in seltenen Fällen), Zeugungsunfähigkeit des Mannes (in seltenen Fällen), Jugenddiabetes, Goodpasturesyndrom, Pemphigus vulgaris, Pemphigoid, sympathische Ophthalmie, phacogene Uveitis, autoimmune hämolytische Anämie, idiopathische thrombozytopenische Purpura, idiopathische Leukozytopenie, primäre biliäre Zirrhose (in seltenen Fällen), ulcerative Colitis Sjogrensyndrom, Wegener-Granulomatose Granulomatose, Poly-/Dermatomyositis, und diskoidaler Lupus erythematosus charakteristisch sind.
  • Antigene, die Allergene sind, sind im Allgemeinen Proteine oder Glycoproteine, obwohl Allergene auch niedermolekulare allergene Haptene sein können, die Allergie induzieren nach kovalentem Kombinieren mit einem Proteinträger (Remington's Pharmaceutical Sciences). Allergene umfassen Antigene, die von Pollen, Staub, Schimmel, Sporen, Tierhautschuppen, Insekten und Lebensmitteln abgeleitet sind. Spezifische Beispiele umfassen die Urushiole (Pentadecylcatechol oder Heptadecylcatechol) von Toxicodendron-Arten wie beispielsweise Giftefeu, Gifteiche und Giftrhus, und die Sesquiterpenoidlactone von Jakobs-Greiskraut und verwandten Pflanzen.
  • Antigene, die für Tumorantigene charakteristisch sind, werden typischerweise von der Zelloberfläche, dem Zytoplasma, dem Nukleus, den Organellen und dergleichen von Zellen von Tumorgeweben abgeleitet sein. Beispiele umfassen Antigene, die für Tumorproteine charakteristisch sind, einschließlich Proteine, die von mutierten Onkogenen codiert sind; virale Proteine, die mit Tumoren assoziiert sind; und Tumormuzine und -glycolipide. Tumoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf jene von den folgenden Stellen von Krebs und Krebsarten: Lippe, Nasenrachenraum, Pharynx und Mundhöhle, Esophagus, Magen, Kolon, Rektum, Leber, Gallenblase, Gallengangsystem, Pankreas, Larynx, Lunge und Bronchus, Melanom der Haut, Brust, Cervix, Uteri, Uterus, Ovarien, Blase, Nieren, Gehirn und anderen Teilen des Nervensystems, Schilddrüse, Prostata, Hoden, Hodgkinserkrankung, Nicht-Hodgkinslymphom, multiples Myelom und Leukämie. Virale Proteine, die mit Tumoren assoziiert sind, würden jene von den oben angegebenen Virusklassen sein. Antigene, die für Tumoren charakteristisch sind, können Proteine sein, die normalerweise nicht durch eine Tumorvorläuferzelle exprimiert werden, oder ein Protein, das normalerweise in einer Tumorvorläuferzelle exprimiert ist, aber eine Mutation trägt, die für einen Tumor charakteristisch ist. Ein für einen Tumor charakteristisches Antigen kann eine mutierte Variante des normalen Proteins mit einer geänderten Aktivität oder subzellulären Verteilung sein. Mutationen von Genen, die Tumorantigene hervorbringen, zusätzlich zu den oben angegebenen, können in der codierenden Region, den 5'- oder 3'-nicht-codierenden Regionen vorhanden oder Introns eines Gens sein und können das Ergebnis von Punktmutationen, Leserahmenverschiebungen, Deletionen, Additionen, Duplikationen, chromosomalen Umordnungen und dergleichen sein. Ein Fachmann auf dem Gebiet ist mit der großen Vielzahl von Änderungen der normalen Genstruktur und -Expression vertraut, die zu Tumorantigenen führt. Spezifische Beispiele für Tumorantigene umfassen: Proteine wie beispielsweise Ig-Idiotyp von B-Zelllymphom, mutierte Zyklin-abhängige Kinase 4 von Melanom, Pmel-17 (gp 100) von Melanom, MART-1 (Melan-A) von Melanom, p15-Protein von Melanom, Tyrosinase von Melanom, MAGE 1, 2 und 3 von Melanom, Schilddrüsenmark, kleinzelliger Lungenkrebs, Kolon- und/oder Bronchialplattenepithelkrebs, BAGE von der Blase, Melanom, Brust und Plattenepithelkarzinom, gp75 von Melanom, oncofetales Antigen von Melanom; Kohlenhydrat/Lipide wie beispielsweise Muci-Mucin von Brust, Pankreas und Ovarialkrebs, GM2 und GD2-Ganglioside von Melanom; Onkogene wie beispielsweise mutiertes p53 von Karzinom, mutiertes ras von Dickdarmkrebs und HER21neu Proto-Onkogen von Brustkrebs; virale Produkte wie beispielsweise Proteine des menschlichen Papillomavirus von Plattenepithelkrebsen des Zervix und Esophagus. Es wird auch ins Auge gefasst, dass Proteintumorantigene durch HLA-Moleküle als spezifische Peptide präsentiert werden, die vom vollständigen Protein abgeleitet sind. Die metabolische Prozessierung von Proteinen, um antigene Peptide zu ergeben, ist in der Technik gut bekannt; siehe beispielsweise US-Patent 5,342,774 (Boon et al.). Das vorliegende Verfahren umfasst somit die Abgabe von antigenen Peptiden und derartigen Peptiden in einem größeren Polypeptid oder von ganzem Protein, die antigene Peptide hervorbringen. Die Abgabe von antigenen Peptiden oder Proteinen kann zu einer humoralen oder zellulären Immunität führen.
  • Im Allgemeinen kann ein Lebewesen eine wirksame Menge des Tumorantigens und/oder Peptids erhalten, das davon abgeleitet ist, durch ein oder mehrere der unten detailliert angegebenen Verfahren. Anfängliche Dosen können von Auffrischungsdosen entsprechend Immunisierungsprotokollen, die in der Technik Standard sind, gefolgt sein. Die Abgabe von Tumorantigenen kann somit die Proliferation von zytolytischen T-Lymphozyten stimulieren.
  • Im Falle von Protein- und Peptidantigenen soll die kovalente Verbindung an einen FcRn-Partner die Bindung durch Peptidbindungen in einer einzigen Polypeptidkette umfassen. Etablierte Verfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989) würden verwendet werden, um DNA herzustellen, die ein Fusionsprotein codiert, das aus dem antigenen Peptid oder Protein und einem FcRn-Partner besteht. Diese DNA würde in einem Expressionsvektor platziert und in eine bakterielle oder eukaryontische Zelle durch etablierte Verfahren eingeführt werden. Das Fusionsprotein würde aus den Zellen oder aus dem Kulturmedium durch etablierte Verfahren isoliert werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Konjugat als ein Fusionsprotein ausgebildet sein. Konjugate umfassen Fusionen des FcRn-Bindungspartners an ein Protein, Peptid oder Proteinderivat, wie jene, die hierin aufgelistet sind, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Antigene; Allergene, Pathogene, oder an andere Proteine oder Proteinderivate mit potentiellem therapeutischen Interesse wie beispielsweise Wachstumsfaktoren, koloniestimulierenden Faktoren, wachstumsinhibitorischen Faktoren, Signalmolekülen, Hormonen, Steroiden, Neurotransmittern oder Morphogenen, die bei der Abgabe über eine Epithelbarriere nützlich wären.
  • Beispielhaft, aber nicht – zu Zwecken der Beschränkung, können Proteine, die bei Fusionsproteinen verwendet werden, um Konjugate zu synthetisieren, von Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) (US-Patent Nr. 4,766,073), von Plättchen abgeleiteter Endothelzellwachstumsfaktor (PD-ECGF) (US-Patent Nr. 5,227,302), menschliches Hypophysenwachstumshormon (HGH) (US-Patent Nr. 3,853,833), transformierender Wachstumsfaktor beta (TGFβ) (US-Patent Nr. 5,168,051), transformierender Wachstumsfaktor alpha (TGFα) (US-Patent Nr. 5,633,147), Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) (US-Patent Nr. 5,731,170), Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor I (IGF-I) (US-Patent Nr. 4,963,665), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) (US-Patent Nr. 5,096,825), Erythropoietin (EPO) (US-Patent Nr. 4,703,008), Granulocyten-Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor (GM-CSF) (US-Patent Nr. 5,200;327); M-CSF (US-Patent Nr: 5,171,675), Kolonie-stimulierender Faktor-1 (CSF-1) (US-Patent Nr. 4,847,201), Steel-Faktor, Calcitonin, AP-1-Proteine (US-Patent Nr. 5,238,839), vom Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor (BDNF) (US-Patent Nr. 5,229,500) sein.
  • In einer Ausführungsform werden Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung konstruiert, bei denen das Konjugat aus einem Fc-Fragment besteht (beginnend mit den Aminosäuren D-K-T-H am N-Terminus der CH1-Region, einschließlich der Gelenks- und den CH2-Regionen, und sich über die S-P-G-K-Sequenz in die CH3-Region fortsetzend), das mit einem der oben aufgelisteten Proteine fusioniert ist. Beispielsweise sind die für Erythropoietin (EPO) codierenden Nukleotidsequenzen mit dem Fc-Bindungspartner fusioniert.
  • Um den DNA-Vektor zu konstruieren, der das Fusionsprotein-FcRn-Bindungspartnerkonjugat codiert, wurde der Säugetierexpressionsvektor scFvE-sec (beschrieben in Persic, et al. GENE 187: 1-8 1997) mit BssH2 und NotI linearisiert und das linearisierte Plasmid gemäß Protokollen, die in der Technik üblich sind, gelgereinigt.
  • Die das Protein codierende DNA, das mit dem Fc fusioniert werden soll, wurde wie folgt hergestellt. Die vollständige (Maus-)EPO-Sequenz wurde aus dem Expressionsvektor (beschrieben in Bill et al., Biochem. Biophy. Acta 1261: 35-43, 1995) durch die Restriktionsenzyme BamH1 und Sal1-Stellen außerhalb des EPO-Inserts entfernt. Das linearisierte Fragment wurde gelgereinigt und durch Standard-PCR (Polymerasekettenreaktion)-Protokolle modifiziert und eine BssH2-Stelle benachbart der DNA eingeführt, die das erste N-terminale Alanin von Maus-EPO (5'-Ende) codiert; die DNA, die das C-terminale Ende des Maus-EPO codierte, wurde mit einer Sequenz modifiziert entsprechend einem Ala-Ala-Ala-Linker gefolgt von einer Sal1-Restriktionsstelle (3'-Ende). Das EPO-Fragment wurde dann mit BssH1 und Sal1 geschnitten und durch in der Technik bekannte Standardprotokolle gelgereinigt. Das Fc-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen Sal1 und NotI geschnitten und gelgereinigt.
  • Die drei linearisierten und gelgereinigten DNAs, die oben beschrieben sind, einschließlich des scfve-sec-Vektors, Fc-Fragmentes und modifizierten EPO-DNAs wurden in einen einzelnen zirkulären Vektor durch eine Dreifachligation unter Verwendung von Standardprotokollen der Technik ligiert.
  • Es wird festgestellt, dass die EPO-codierende DNA durch Standardtechniken durch DNA ersetzt werden kann, die irgendeines der obigen Proteine oder andere interessierende Proteine oder Proteinfragmente davon codiert, um ein Fc-Fusionsprotein zu erzeugen, das zu einem Konjugat führt. In ähnlicher Weise erlaubt diese Erfindung, dass DNA in dem Vektor, die das Fc-Fragment codiert, ersetzt wird durch DNA, die einen FcRn-Bindungspartner wie hierin beschrieben codiert. Zusätzlich erlaubt diese Erfindung, dass sowohl die EPO-codierende DNA als auch die das Fc-Fragment codierende DNA ersetzt wird, so dass der letztendliche Vektor zu einem Konjugat führt, das mit dem FcRn in Verbindung tritt.
  • Um zu zeigen, dass ein Konjugat, das durch die Fusion eines FcRn-Bindungspartners und eines interessierenden Proteins hergestellt ist, in der Lage ist, biologische Aktivität beizubehalten, wurde das obige Beispielsprotein exprimiert und auf biologische Aktivität von Erythroprotein in der folgenden Art und Weise getestet. Der Säugetierexpressionsvektor, der die EPO-Fc-Fusion enthielt, wurde in CHO (chinesische Hamsterovarien)-Zellen transfiziert und durch Standardprotokolle der Technik exprimiert. Überstände von transfizierten oder nicht-transfizierten CHO-Zellen wurden gesammelt und subkutan in BALB/c-Mäuse injiziert. Reticulozytenzahlen von Mäusen wurden durch Coulter-FACS-Analysen durch in der Technik bekannte Verfahren erhalten. Die Ergebnisse zeigten, dass Mäusen, denen man die Überstände der transfizierten Zellen injizierte, Reticulozyten (unreife Erythrozyten)-Zahlen aufwiesen, die um ein Mehrfaches höher waren als bei Mäusen, denen man die Kontrolle (nicht-transfizierte Überstände) injiziert hatte. Da dokumentiert ist, dass EPO die Produktion von Erythrozyten stimuliert, stützen die hierin offenbarten Ergebnisse die Möglichkeit der Erfindung, biologisch aktive FcRn-Bindungspartnerkonjugate zu synthetisieren.
  • In ähnlicher Weise würde man erwarten, dass Fusionsproteine, bei denen das Fc-Fragment durch eine alternative FcRn-Bindungspartnerdomäne in dem oben beschriebenen Vektor ausgetauscht ist, die biologische Aktivität beibehalten würde.
  • Die FcRn-Bindungspartner können mit einer Vielzahl von Therapeutika oder Wirkstoffen für die gerichtete systemische Abgabe von biologisch aktiven Substanzen konjugiert sein. Die vorliegende Erfindung betrifft die gerichtete systemische Abgabe von hämatolytischen Verbindungen.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „biologisch aktive Substanz" eukaryotische und prokaryotische Zellen, Viren, Vektoren, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Polysaccharide und Kohlenhydrate, Lipide, Glykoproteine und Kombinationen davon und synthetische organische und anorganische Wirkstoffe, die eine biologische Wirkung entfalten, wenn sie einem Tier verabreicht werden. Aus Gründen einer einfachen Bezugnahme wird der Begriff auch so verwendet, dass es nachweisbare Verbindungen umfasst wie beispielsweise strahlenundurchlässige Verbindungen einschließlich Luft und Barium, magnetische Verbindungen. Die aktive Substanz kann in Wasser löslich oder unlöslich sein. Beispiele für biologisch aktive Substanzen umfassen Anti-Angiogenesefaktoren, Antikörper, Wachstumsfaktoren, Hormone, Enzyme und Wirkstoffe wie beispielsweise Steroide, Antikrebsmittel oder Antibiotika.
  • In diagnostischen Ausführungsformen können FcRn-Bindungspartner auch mit einer pharmazeutische akzeptablen gamma-emittierenden Komponente konjugiert sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Indium und Technetium, magnetische Partikel, strahlenundurchlässiges Material wie beispielsweise Luft oder Barium und fluoreszierende Verbindungen.
  • Beispielhaft können die folgenden Wirkstoffklassen an FcRn-Bindungspartner zu Zwecken der Abgabe an Epithelgrenzen konjugiert sein:
  • Antineoplastische Verbindungen.
    • Nitrosoharnstoffe, z. B. Carmustin, Lomustin, Semustin, Strepzotocin; Methylhydrazine, z. B. Procarbazin, Dacarbazin; Steroidhormone, z. B. Glucocorticoide, Östrogene, Progestine, Androgene, Tetrahydrodesoxycaricosteron, Cytokine und Wachstumsfaktoren; Asparaginase.
  • Immunaktive Verbindungen.
    • Immunsuppressiva, z. B. Pyrimethamin, Trimethopterin, Penicillamin, Cyclosporin, Azathioprin; Immunstimulanzien, z. B. Levamisol, Diethyldithiocarbamat, Enkephaline, Endorphine.
  • Antimikrobielle Verbindungen.
    • Antibiotika, z. B. β-Lactam, Penicillin, Cephalosporine, Carbapenime und Monobactame, β-Lactamase-Inhibotoren, Aminoglycoside, Macrolide, Tetracycline, Spectinomycin; Antimalariamittel, Amöbizide, antiprotozoische Mittel, Antipilzmittel, z. B. Amphotericin B, antivirale Mittel, z. B. Acyclovir, Idoxuridin, Ribavirin, Trifluridin, Vidarbin, Gancyclovir.
  • Parasitenmittel.
    • Antiwurmmittel, Radiopharmazeutika, Gastrointestinalwirkstoffe.
  • Hematologische Verbindungen.
    • Immunglobuline; Blutgerinnungsproteine; z. B. antihämophiler Faktor, Faktor IX-Komplex; Antikoagulanzien, z. B. Dicumarol, Heparin-Na; Fibrolysin-Inhibitoren, Tranexamsäure.
  • Cardiovaskuläre Wirkstoffe.
  • Periphere antiadrenerge Wirkstoffe, zentral wirkende Bluthochdruckwirkstoffe, z. B. Methyldopa, Methyldopa-HCl; Blutdruck-senkende Vasodilatoren, z. B. Diazoxid, Hydralazin-HCl; Wirkstoffe, die das Renin-Angiotensin-System beeinflussen; periphere Vasodilatoren, Phentolamin; Wirkstoffe gegen Angina; Herzglycoside; Inodilatoren, z. B. Amrinon, Milrinon, Enoximon, Fenoximon, Imazodan, Sulmazol; Mittel gegen Rhythmusstörungen; Kalziumeintrittsblocker; Wirkstoffe mit Einfluss auf die Blutlipide; Ranitidin, Bosentan, Rezulin.
  • Respiratorische Wirkstoffe.
    • Sympathomimetika: Albuterol, Bitolterol-Mesylat, Dobutamin-HCl, Dopamin-HCl, Ephedrin-SO, Epinephrin, Fenfluramin-HCl, Isoproterenol-HCl, Methoxamin-HCl, Norepinephrin-Bitartrat, Phenylephrin-HCl, Ritodrin-HCl; cholinomimetische Wirkstoffe, z. B. Acetylcholin-Cl; Anticholinesterasen, z. B. Edrophonium-Cl; Cholinesterase-Reaktivatoren; adrenerge Blockierungswirkstoffe, z. B. Acebutolol-HCl, Atenolol, Esmolol-HCl, Labetalol-HCl, Metoprolol, Nadolol, Phentolamin- Mesylat, Propanolol-HCl; antimuscarine Wirkstoffe, z. B. Anisotropin-Methylbroutid, Atropin-SO4, Clinidium-Br, Glycopyrrolat, Ipratropium-Br, Scopolamin-HBr.
  • Neuromuskuläre blockierende Wirkstoffe.
    • depolarisierend, z. B. Atracurium-Besylat, Hexafluorenium-Br, Metocurin-Iodid, Succinylcholin-Cl, Tubocurarin-Cl, Vecuronium-Br; zentralwirkende Muskelrelaxantien, z. B. Baclofen.
  • Neurotranmitter und Neurotransmitteragenzien
    • Acetylcholin, Adenosin, Adenosintriphosphate, Aminosäuren-Neurotransmitter, z. B. exzitatorische Aminosäuren, GABA, Glycin; biogene Amin-Neurotransmitter, z. B. Dopamin, Epinephrin, Histamin, Norepinephrin, Octopamin; Serotonin, Tyramin; Neuropeptide, Stickoxid, K+-Kanaltoxine.
  • Wirkstoffe gegen Parkinson.
    • Amantidin-HCl, Benztropin-Mesylat, z. B. Carbidopa.
  • Diuretische Wirkstoffe.
    • Dichlorphenamid, Methazolamid, Bendroflumethiazid, Polythiazid.
  • Uterine, Antimigräne-Wirkstoffe.
    • Carboprost-Tromethamin, Mesylat, Methysergid-Maleat.
  • Hormones.
    • Epiphysenhormone, z. B. Choriongonadotropin, Cosyntropin, Menotropine, Somatotropin, Corticotropin, Protirelin, Thyrotropin, Vasopressin, Lypressin; Nebennierenhormone, z. B. Beclomethason-Dipropionat, Betamethason, Dexamethason, Triamcinolon; Pankreashormone, z. B. Glucagon, Insulin; Nebenschilddrüsenhormon, z. B. Dihydrochysterol; Schilddrüsenhormone, z. B. Calcitonin-Etidronat-Dinatrium, Levothyroxin-Na, Liothyronin-Na, Liotrix, Thyroglobulin, Teriparatid-Acetate; gegen die Schilddrüse gerichtete Wirkstoffe; Östrogenhormone; Progestine und Antagonisten, hormonelle Kontrazeptiva, Hodenhormone; gastrointestinale Hormone: Cholecystokinin, Enteroglycan, Galanin, mageninhibitorisches Polypeptid, epidermales Wachstumsfaktor-Urogastron, gastrisches inhibitorisches Polypeptid, Gastrin-freisetzendes Peptid, Gastrine, Pentagastrin, Tetragastrin, Motilin, Peptid YY, Secretin, vasoaktives Intestinalpeptid, Sincalid.
  • Enzyme.
    • Hyaluronidase, Streptokinase, gewebeplasminogener Aktivator, Urokinase, PGE-Adenosindeaminase.
  • Intravenöse Anesthetika.
    • Droperidol, Etomidat, Tetanyl-citrate/droperidol, Hexobarbital, Ketamin-HCl, Methohexital-Na, Thiamylal-Na, Thiopental-Na.
  • Antiepileptika.
    • Carbamazepin, Clonazepam, Divalproex-Na, Ethosuximid, Mephenytoin, Paramethadion, Phenytoin, Primidon.
  • Peutide und Proteine.
  • Die FcRn-Bindungspartner können mit Peptiden oder Polypeptiden konjugiert sein, z. B. Ankyrine, Arrestine, bakterielle Membranproteine, Clathrin, Connexine, Dystrophin, Endothelin-Rezeptor, Spectrin, Selectin, Cytokine; Chemokine; Wachstumsfaktoren, Insulin, Erythropoietin (EPO), Tumornekrosefaktor (TNF), Neuropeptide, Neuropeptid Y, Neurotensin, transformierender Wachstumsfaktor α, transformierender Wachstumsfaktor β, Interferon (IFN), und Hormone, Wachstumsinhibitoren, z. B. Genistein, Steroide etc; Glycoproteine, z. B. ABC-Transporter, Plättchen-Glycoprotein, GPIb-IX-Komplex, GPIIb-IIIa-Komplex, Vitronectin, Thrombomodulin, CD4, CD55, CD58, CD59, CD44, Lymphozytenfunktion-assoziiertes Antigen, intrazelluläres Adhäsionsmolekül, vaskuläres Zelladhäsionsmolekül, Thy-1, Antiporter, CA-15-3-Antigen, Fibronectine, Laminin, Myelin-assoziiertes Glycoprotein, GAP, GAP-43. In dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Polypeptidtherapeutika kovalent mit dem FcRn-Bindungspartner oder der FcRn-Bindungspartner und das Therapeutikum als ein Fusionsprotein unter Verwendung von genetischen rekombinanten Standardtechniken exprimiert werden.
  • Cytokine und Cytokinerezeptoren.
  • Beispiele für Cytokine und Rezeptoren dafür, die vermittels eines FcRn-Bindungspartners abgegeben werden oder mit einem FcRn-Bindungspartner gemäß der vorliegenden Erfindung konjugiert sein können, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt: Interleukin-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-1-Rezeptor, IL-2-Rezeptor, IL-3-Rezeptor, IL-4-Rezeptor, IL-5-Rezeptor, IL-6-Rezeptor, IL-7-Rezeptor, IL-8-Rezeptor, IL-9-Rezeptor, IL-10-Rezeptor, IL-11-Rezeptor, IL-12-Rezeptor, IL-13-Rezeptor, IL-14-Rezeptor, IL-15-Rezeptor, IL-16-Rezeptor, IL-17-Rezeptor, IL-18-Rezeptor, Lymphokin-inhibitorischer Faktor, Macrophagenkolonie-stimulierender Faktor, von Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor, Stammzellfaktor, Tumorwachstumsfaktor β, Tumornekrosefaktor, Lymphotoxin, Fas, Granulocytenkolonie-stimmulierender Faktor, Granulocyten-Macrophagenkolonie-stimulierender Faktor; Interferon α, Interferon β, Interferon γ.
  • Wachstumsfaktoren und Proteinhormone.
  • Beispiele für Wachstumsfaktoren und Rezeptoren dafür und Proteinhormone und Rezeptoren dafür, die vermittels eines FcRn-Bindungspartners abgegeben werden können, oder die mit einem FcRn-Bindungspartner gemäß der vorliegenden Erfindung konjugiert sein können, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt: Erythropoietin, Angiogenin, Hepatocytenwachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor, Keratinocytenwachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor, Tumorwachstumsfaktor α, Thrombopoietin, Schilddrüsen-stimulierender Faktor, Schildrüsenfreisetzungshormon, Neurotrophin, epidermaler Wachstumsfaktor, VEGF, ziliärer neurotropher Faktor, LDL, Somatomedin, Insulinwachstumsfaktor, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor I und II.
  • Chemokine.
  • Beispiele für Chemokine und Rezeptoren dafür, die vermittels eines FcRn-Bindungspartners abgegeben werden können, oder an einen FcRn-Bindungspartner gemäß der vorliegenden Erfindung konjugiert sein können, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt: ENA-78, ELC, GRO-α, GRO-β, GRO-γ, HRG, LIF, IP-10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIP-1α, MIP-1β, MIG, MDC, NT-3, NT-4, SCF, LIF, Leptin, RANTES, Lymphotactin, Eotaxin-1, Eotaxin-2, TARC, TECK, WAP-1, WAP-2, GCP-1, GCP-2, α-Chemokinrezeptoren: CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 β-Chemokinrezeptoren: CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7.
  • Chemotherapeutika.
  • Die FcRn-Bindungspartner können an Agenzien für die Chemotherapie oder Tumorbehandlung konjugiert sein, die gegen verschiedene Arten von Krebs beim Menschen wirksam sind, einschließlich Leukämie, Lymphome, Karzinome, Sarcome, Myelome etc., wie beispielsweise, Doxorubicin, Mitomycin, Cisplatin, Daunorubicin, Bleomycin, Actinomycin D, Neocarzinostatin.
  • Antikörper.
  • Die FcRn-Bindungspartner der vorliegenden Erfindung können mit Antikörpern konjugiert sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf (a) anti-Differenzierungsclusterantigen CD-1 bis CD-166 und den Liganden oder Gegenrezeptoren für diese Moleküle; (b) anti-Cytokin-Antikörper, z. B. anti-IL-1 bis anti-IL-18 und die Rezeptoren für diese Moleküle; (c) anti-Immunrezeptorantikörper, Antikörper gegen T- Zellrezeptoren, Haupthistokompatibilitätskomplexe I und II, B-Zellrezeptoren, Selectin-Killer-inhibitorische Rezeptoren, Killer-aktivierende Rezeptoren, OX-40, MadCAM-1, Gly-CAM1, Integrine, Cadherene, Sialoadherene, Fas, CTLA-4, Fcγ-Rezeptoren, Fcα-Rezeptoren, Fcε-Rezeptoren, Fcμ-Rezeptoren, und ihre Liganden; (d) anti-Metallproteinase-Antikörper, z. B. Kollagenase, MMP-1 bis MMP-8, TIMP-1, TIMP-2; anti-Zelllyse/proinflammatorische Moleküle, z. B. Perforin, Komplementkomponenten, Prostanoide, Nitronoxid, Thromboxane; und (e) anti-Adhäsionsmoleküle, z. B. karzioembryonisches Antigen, Lamine, Fibronectine.
  • Antivirale Agenzien.
  • Die FcRn-Bindungspartner können an antivirale Agenzien konjugiert sein, wie beispielsweise reverse Transkriptase-Inhibitoren und Nucleosidanaloga, z. B. ddI, ddC, 3TC, ddA, AZT; Proteaseinhibitoren, z. B: Invirase, ABT-538; Inhibitoren der RNA-Prozessierung, z. B. Ribavirin.
  • Spezifische Beispiele von bekannten Therapeutika, die vermittels FcRn-Bindungspartner abgegeben werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf:
    • (a) Capoten, Monopril, Pravachol, Avapro, Plavix, Cefzil, Duricef/Ultracef, Azactam, Videx, Zerit, Maxipim, VePesid, Paraplatin, Platinol, Taxol, UFT, Buspar, Serzon, Stadol NS, Estrace, Glucophage (Bristol-Myers Squibb);
    • (b) Ceclor, Lorabid, Dynabac, Prozac, Darvon, Permax, Zyprexa, Humalog, Axid, Gemzar, Evista (Eli Lily);
    • (c) Vasotec/Vaseretic, Mavacor, Zocor, Prinivil/Prinizid, Plendil, Cozaar/Hyzaar, Pepcid, Pcilosec, Primaxin, Noroxin, Recombivax-HB, Varivax, Timoptic/XE, Trusopt, Proscar Fosamax, Sinemet, Crixivan, Propecia, Vioxx, Singulair, Maxalt, Ivermectin (Merck & Co.);
    • (d) Diflucan, Unasyn, Sulperazon, Zithromax, Trovan, Procardia XL, Cardura, Norvasc, Dofetilid, Felden, Zoloft, Zeldox, Glucotrol XL, Zyrtec, Eletriptan, Viagra, Droloxifen, Aricept, Lipitor (Pfizer);
    • (e) Vantin, Rescriptor, Vistid, Genotropin, Micronase/Glyn./Glyb., Fragmin, Total Medrol, Xanax/Alprazolam, Sermion, Halcion/Triazolam, Freedox, Dostinex, Edronax, Mirapex, Pharmorubicin, Adriamycin, Camptosar, Remisar, Depo-Provera, Caverject, Detrusitol, Estring, Healon, Xalatan, Rogaine (Pharmacia & Upjohn);
    • (f) Lopid, Accrupil, Dilantin, Cognex, Neurontin, Loestrin, Dilzem, Fempatch, Estrostep, Rezulin, Lipitor, Omnicef, FemHRT, Suramin, Clinafloxacin (Warner Lambert).
  • Weitere Beispiele für therapeutische Agenzien, die durch die FcRn-Bindungspartner der vorliegenden Erfindung abgegeben werden, können gefunden werden in: Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. 9. Ausgabe McGraw-Hill 1996.
  • Wenn sie verabreicht werden, werden die Konjugate in pharmazeutisch akzeptablen Zubereitungen verabreicht. Derartige Zubereitungen können routinemäßig pharmazeutisch akzeptable Konzentrationen an Salz, Puffermitteln, Konservierungsmitteln, verträglichen Träger, ergänzenden immunpotenzierenden Agenzien wie beispielsweise Adjuvanzien und Cytokine und optional andere therapeutische Agenzien enthalten. Somit werden „Cocktails", die die Konjugate und die Agenzien enthalten, ins Auge gefasst. Die Agenzien selbst können mit FcRn-Bindungspartnern konjugiert sein, um die Abgabe der Agenzien über die Epithelbarriere zu verstärken.
  • Die Konjugate können in einer gereinigten Form oder in der Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes verabreicht werden. Wenn sie in der Medizin verwendet werden, sollten die Salze pharmazeutisch akzeptabel sein, es können aber auch nicht-pharmazeutisch akzeptable Salze passend verwendet werden, um pharmazeutisch akzeptable Salze daraus herzustellen, und sie sind nicht vom Umfang der Erfindung ausgeschlossen. Derartige pharmazeutisch akzeptablen Salze umfassen, sind aber nicht beschränkt auf jene, die von den folgenden Säuren hergestellt werden: Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Maleinsäure, Essigsäure, Salicylsäure, p-Toluolsulfonsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Methansulfonsäure, Ameisensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Naphthalen-2-sulfonsäure und Benzensulfonsäure. Pharmazeutisch akzeptable Salze können auch als Alkalimetall- oder Erdalkalisalze wie beispielsweise Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze der Carboxylsäuregruppe hergestellt sein.
  • Geeignete Pufferagenzien umfassen: Essigsäure und Salz (1-2 % Gew/Vol); Zitronensäure und ein Salz (1-3 % Gew/Vol); Borsäure und ein Salz (0,5-2,5 % Gew/Vol); Natriumbicarbonat (0,5-1,0 % Gew/Vol); und Phosphorsäure und ein Salz (0,2-2 % Gew/Vol). Geeignete Konservierungsstoffe umfassen Benzalkoniumchlorid (0,003-0,03 % Gew/Vol); Chlotubutanol (0,3-0,9 % Gew/Vol); Parabene (0,01-0,25 % Gew/Vol) und Thimerosal (0,004-0,02 % Gew/Vol).
  • Der Begriff „Träger", wie er hierin verwendet wird und vollständiger im Folgenden beschrieben ist, bedeutet einen oder mehrere feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünnungsmittel oder Verkapselungsmittel, die geeignet sind für die Verabreichung an einen Menschen oder ein anderes Säugetier. Der „Träger" kann ein organischer oder anorganischer, natürlicher oder synthetischer Bestandteil sein, mit dem der aktive Bestandteil kombiniert ist, um die Verabreichung zu erleichtern.
  • Die Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzungen sind in der Lage, mit den Konjugaten der vorliegenden Erfindung und miteinander vermischt zu werden, in einer Art und Weise, so dass es keine Wechselwirkung gibt, die die erwünschte pharmazeutische Wirksamkeit wesentlich stören würde. Die Bestandteile von oralen Wirkstoffformulierungen umfassen Verdünnungsmittel, Binder, Schmiermittel, Gleitmittel, Sprengmittel, Färbemittel und Geschmacksstoffe. Verkapselungssubstanzen für die Herstellung von enterisch beschichteten oralen Formulierungen umfassen Zelluloseacetatphthalat, Polyvinylacetatphthalat, Hydroxypropylmethylzellulosephthalat und Methacrylsäureestercopolymere. Feste orale Formulierungen wie beispielsweise Kapseln oder Tabletten sind bevorzugt. Elixiere und Sirupe sind ebenfalls gut bekannte orale Formulierungen. Die Bestandteile von Aerosolformulierungen umfassen solubilisierte aktive Bestandteile, Antioxidantien, Lösungsmittelmischungen und Treibmittel für Lösungsformulierungen und mikronisierte und suspendierte aktive Bestandteile, Dispersionsmittel und Treibmittel für Suspensionsformulierungen. Die oralen, Aerosol- und nasalen Formulierungen der Erfindung können unterschieden werden von injizierbaren Präparaten des Standes der Technik insoweit, als dass derartige Formulierungen nicht keimfrei sein können, wohingegen injizierbare Präparate keimfrei sein müssen.
  • Der Begriff „Adjuvans" soll eine jegliche Substanz umfassen, die in die Konjugate eingebaut ist oder gleichzeitig mit diesen verabreicht wird und die nicht spezifisch die Immunantwort in dem Lebewesen potenziert. Adjuvanzien umfassen Aluminiumverbindungen, z. B. Gele, Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat, und Freundsches vollständiges oder unvollständiges Adjuvans (bei dem das Konjugat in die wässrige Phase einer stabilisierten Wasser-in-Paraffinöl-Emulsion eingebaut ist). Das Paraffinöl kann ersetzt sein durch unterschiedliche Arten von Ölen, z. B. Squalen- oder Erdnussöl. Andere Materialien mit Adjuvanseigenschaften umfassen BCG (attenuiertes Mycobakterium tuberculosis), Calciumphosphat, Levamisol, Isoprinosin, Polyanion (z. B. poly A:U), Leutinan, Pertussis-Toxin, Cholera-Toxin, Lipid A, Saponine und Peptide, z. B. Muramyldipeptid. Seltene Erdensalze, z. B. Lanthan und Cer, können auch als Adjuvanzien verwendet werden. Die Menge an Adjuvanzien hängt von dem Lebewesen und dem speziell verwendeten Konjugat ab und kann leicht durch die Fachleute ohne ungebührliches Experimentieren bestimmt werden.
  • Andere ergänzende immunpotenzierende Agenzien wie beispielsweise Zytokine können zusammen mit den Konjugaten verabreicht werden. Die betrachteten Konjugate sind jene, die die vorteilhaften Wirkungen verstärken werden, die sich aus der Verabreichung der Immunmodulatoren gemäß der Erfindung ergeben. Zytokine sind Faktoren, die das Wachstum und die Reifung von Zellen, einschließlich Lymphozyten, unterstützen. Man glaubt, dass das Hinzugeben von Zytokinen die Zytokinaktivität erhöhen wird, die in vivo stimuliert wird, indem die hierin beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Die bevorzugten Zytokine sind Interleukin (IL)-1, IL-2, Gamma-Interferon und Tumornecrosfaktor α. Man glaubt, dass andere nützliche Zytokine IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, Erythropoietin, Leukämie-inhibitorischer Faktor, Oncostatin-M, ciliärer neurotropher Faktor, Wachstumshormon, Prolactin, CD40-Ligand, CD27-Ligand, CD30-Ligand, α-Interferon, β-Interferon und Tumornekrosefaktor-β sind. Andere Zytokine, von denen bekannt ist, dass sie die Aktivität von T-Zellen in einer Art und Weise modulieren ähnlich der, die gemäß der Erfindung nützlich ist, sind Kolonie-stimulierende Faktoren und Wachstumsfaktoren umfassend Granulocyten- und/oder Makrophagen-stimulierende Faktoren (GM-CSF, G-CSF und CSF-1) und von Plättchen abgeleitete, epidermale, Insulin-ähnliche, transformierende und Fibroblastenwachstumsfaktoren. Die Auswahl der speziellen Zytokine wird abhängig sein von der speziellen Modulierung des Immunsystems, die erwünscht ist. Die Aktivität von Zytokinen auf spezielle Zelltypen ist den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
  • Die genauen Mengen der vorstehenden, verwendeten Zytokine wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich des ausgewählten Konjugates, der Dosis und des ausgewählten Dosis-Timings, der Verabreichungsart und den Eigenschaften des Lebewesens.
  • Die genauen, ausgewählten Mengen können bestimmt werden ohne ungebührliches Experimentieren, insbesondere da eine Schwellenmenge irgendeine Menge sein wird, die die erwünschte Immunantwort verstärken wird. Man glaubt somit, dass Nanogramm- bis Milligrammmengen nützlich sind, abhängig von der Art der Abgabe, dass aber Nanogramm- bis Mikrogrammmengen wahrscheinlich am nützlichsten sind, da physiologische Titer von Zytokinen entsprechend niedrig sind.
  • Die Präparate werden in wirksamen Mengen verabreicht. Eine wirksame Menge ist jene Menge eines Konjugats, die alleine oder zusammen mit anderen Dosen eine Immunantwort, wie sie erwünscht ist, stimuliert. Dies kann die Stimulierung einer humoralen Antikörper-Antwort sein, die. zu einer Erhöhung des Antikörpertiters im Serum, verbesserte Schleimhautimmunität, einer klonalen Expansion von cytotoxischen T-Lymphozyten oder Toleranz gegenüber einem Antigen, einschließlich einem Selbstantigen, führt. Man glaubt, dass diese Dosen, die von 1 ng/kg bis 100 mg/kg reichen, abhängig von der Art der Verabreichung wirksame sein werden. Man glaubt, dass der bevorzugte Bereich zwischen etwa 500 ng und 500 μg/kg und am bevorzugtesten zwischen 1 μg und 100 μg/kg ist. Die absolute Menge wird abhängen von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich dem ausgewählten Konjugat, der erwünschten Immunmodulation, ob die Verabreichung in Einzel- oder Mehrfachdosen erfolgt und individuellen Patientenparametern, einschließlich Alter, physischem Zustand, Größe und Gewicht. Für die Behandlung eines Lebewesens mit einem Tumor kann die Größe, der Typ, der Ort und Metastasierung des Tumors als Faktoren bei der Bestimmung der Menge des zu verabreichenden Konjugates berücksichtigt werden. Diese Faktoren sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und können mit nicht mehr als Routineversuchen angegangen werden.
  • Eine Vielzahl von Verabreichungsrouten sind verfügbar. Die spezielle, ausgewählte Art wird, natürlich, von dem ausgewählten speziellen Konjugat abhängen, dem speziellen zu behandelnden Zustand und der für therapeutische Wirksamkeit erforderlichen Dosierung. Die Verfahren umfassen die Abgabe der Konjugate der Erfindung an eine epitheliale Oberfläche. Bevorzugte Abgabearten sind oral, intrapulmonal, intrabiliär und intranasal.
  • Zusammensetzungen können bequem in Einheitsdosierungsform präsentiert und können vermittels irgendeinem der auf dem Gebiet der Pharmazie bekannten Verfahren hergestellt werden. Alle Verfahren umfassen den Schritt, das Konjugat mit einem Träger in Verbindung zu bringen, der ein oder mehrere akzessorische Bestandteile darstellt. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen hergestellt durch gleichförmiges und enges in Kontakt bringen des Konjugates mit einem flüssigen Träger, einem fein verteilten festen Träger oder beidem und dann, sofern erforderlich, Formgebung des Produktes.
  • Andere Abgabesysteme können Zeitfreisetzungs-, verzögerte Freisetzungs- oder Depotabgabesysteme umfassen. Derartige Systeme können eine wiederholte Verabreichungen der Konjugate der Erfindung vermeiden, was die Bequemlichkeit für den Patienten und den Arzt erhöht. Viele Arten von Abgabesystemen sind verfügbar und den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Sie umfassen Polymer-basierte Systeme wie beispielsweise Polymilchsäure und Polyglycolsäure, Polyanhydride und Polycaprolactone; Wachsbeschichtungen; unter Verwendung herkömmlicher Binder und Bestandteile komprimierte Tabletten, und dergleichen. Bioadhäsive Polymersysteme, um die Abgabe eines Materials an das Darmepithel zu erhöhen, sind bekannt und in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 93/21906 beschrieben. Kapseln als Abgabeagenzien an das Darmepithel sind ebenfalls in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 93/19660 beschrieben.
  • Die pharmazeutische Formulierung der Erfindung enthält das FcRn-Bindungspartnerkonjugat als den aktiven Bestandteil in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, der für die Verabreichung und Abgabe in vivo geeignet ist. In bevorzugten Ausführungsformen sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung für die orale, sublinguale, bukkale, intranasale und Verabreichung durch Inhalation formuliert.
  • Wenn sie verabreicht werden, werden die Konjugate der vorliegenden Erfindung in pharmazeutisch akzeptablen Zubereitungen verabreicht. Derartige Zubereitungen können routinemäßig pharmazeutisch akzeptable Konzentrationen an Salz, Pufferagenzien, Konservierungsstoffen, kompatiblen Trägern, ergänzenden immunpotenzierenden Agenzien wie beispielsweise Adjuvanzien und Zytokine, und optional andere therapeutische Agenzien enthalten. Derartige „Cocktails" umfassend die Konjugate und die Agenzien werden ins Auge gefasst. Die Agenzien selbst können mit FcRn-Bindungspartnern konjugiert sein, um die Abgabe der Agenzien über die Epithelbarriere zu erhöhen.
  • Die bevorzugte Menge an FcRn -Bindungspartnerkonjugaten in allen pharmazeutischen Zubereitungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt sind, sollte eine therapeutisch wirksame Menge davon sein, die auch eine medizinisch akzeptable Menge davon ist. Tatsächliche Dosierungstiter von FcRn-Bindungspartnerkonjugaten in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können variiert werden, um eine Menge an FcRn-Bindungspartnerkonjugaten zu erhalten, die wirksam ist, um die erwünschte therapeutische Antwort für einen speziellen Patienten, pharmazeutische Zusammensetzung von FcRn-Bindungspartnerkonjugaten und Verabreichungsweg zu erhalten, ohne für den Patienten toxisch zu sein.
  • Der ausgewählte Dosistiter und die Häufigkeit der Verabreichung wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, einschließlich des Verabreichungsweges, der Zeit der Verabreichung, der Exkretionsgeschwindigkeit, des/der therapeutischen Agens/Agenzien, die die FcRn-Bindungspartnerkonjugate enthalten, der Dauer der Behandlung, anderer Wirkstoffe, Verbindungen und/oder Materialien, die zusammen mit den FcRn-Bindungspartnerkonjugaten verwendet werden, dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht, dem Zustand, dem Allgemeinen Gesundheitszustand und der medizinischen Vorgeschichte des zu behandelnden Patienten und ähnlichen Faktoren, die auf dem Gebiet der Medizin gut bekannt sind. Beispielsweise wird das Dosierungsregime wahrscheinlich bei schwangeren Frauen, stillenden Müttern und Kindern verglichen mit gesunden Erwachsenen variieren.
  • Ein Arzt mit üblicher Fachkenntnis auf dem Gebiet kann leicht die therapeutisch wirksame Menge der erforderlichen pharmazeutischen Zusammensetzung bestimmen und verschreiben. Beispielsweise könnte der Arzt mit Dosen an FcRn-Bindungspartnerkonjugaten, die in der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung verwendet werden, bei Titern beginnen, die geringer sind als erforderlich, um die erwünschte therapeutische Wirkung zu erzielen und graduell die Dosierung erhöhen, bis die erwünschte Wirkung erreicht wird.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung, nämlich die an eine hämatologische Verbindung konjugierten FcRn-Bindungspartner als das aktive Agens, sind bevorzugterweise geeignet für die orale, sublinguale und intranasale Abgabe. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind für die Abgabe der FcRn-Bindungspartnerkonjugate an Epithelbarrieren geeignet. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch so formuliert sein, dass sie für die parenterale, transdermale, intradermale und intravenöse Abgabe geeignet sind.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die biologisch aktive FcRn-Bindungspartnerkonjugate als das aktive Agens enthalten, die für die transmukosale Abgabe durch Mundhöhlenabgabe geeignet sind, liegen in der Form eines Feststoffes als linguale, bukkale oder sublinguale Tabletten, Trochiscus (Pastillen), Pulver, Zeitfreisetzungsgranula, wobei Kügelchen oder dergleichen auch verwendet werden können, oder in der Form einer Flüssigkeit oder als Flüssigkeitstropf oder -tropfen, Aerosolspray oder -nebel vor, die sublingual (unter der Zunge), auf der Zunge oder bukkal (zwischen der Wange und dem Zahnfleisch) angewandt werden. Die Geschwindigkeit der oralen mukosalen Schleimhautmembranabsorption von FcRn-Bindungspartnerkonjugaten wird durch die ausgewählte spezifische Flüssig- oder Festdosierungsformulierung gesteuert. Spezifische Formulierungen erlauben, dass der Prozess der Absorption über eine anhaltende, aber vergleichsweise kurze Zeitspanne erfolgt, was einen graduellen Aufbau und konstanten Bluttiter der FcRn-Bindungspartnerkonjugate zur Folge hat.
  • Für eine verlängerte Abgabe kann der aktive Bestandteil als eine Depotzubereitung für die Verabreichung durch Implantation; z. B. subkutane, intradermale oder intramuskuläre Injektion formuliert sein. Somit kann beispielsweise der aktive Bestandteil mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (z.B. als eine Emulsion in einem akzeptablen Öl) oder einem Ionenaustauschharz, oder als schäumend lösliche Derivate (z.B. als eine schäumend lösliche Salzform des FcRn-Bindungspartnerkonjugates) formuliert sein.
  • Für die orale Verabreichung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Form, beispielsweise, von Tabletten oder Kapseln einnehmen, die durch herkömmliche Mittel mit pharmazeutisch akzeptablen Bestandteilen wie beispielsweise Bindemitteln, prägelatinisierter Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylzellulose; Füllmitteln (z.B. Laktose, mikrokristalline Zellulose oder Kalziumhydrogenphosphat); Schmiermitteln (z.B. Magnesiumstearat, Talk oder Silika); Sprengmitteln (Kartoffelstärke oder Natriumstärkeglykolat); oder Befeuchtungsmitteln (z.B. Natriumlaurylsulphat) hergestellt sind. Die Tabletten können durch in der Technik gut bekannte Verfahren beschichtet sein. Flüssigzubereitungen für die orale Verabreichung können die Form von, beispielsweise, Lösungen, Sirupen oder Suspensionen einnehmen oder sie können als ein Trockenprodukt für die Konstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor der Verwendung vorgelegt werden. Derartige flüssige Präparate können durch herkömmliche Mittel mit pharmazeutisch akzeptablen Zusätzen wie beispielsweise Suspensionsagenzien (z.B. Sorbitolsirup, Zellulosederivate oder hydrierte essbare Fette); emulgierenden Agenzien (z.B. Lecithin oder Akazia); nicht-wässrigen Vehikeln (z.B. Mandelöl, ölartige Ester, Ethylalkohol oder fraktionierte Pflanzenöle); und Konservierungsstoffen (z.B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure) hergestellt werden. Die Zubereitungen können auch Puffersalze, Geschmacks-, Farb- und Süßmittel enthalten, wie angemessen. Zubereitungen für die orale Verabreichung können in geeigneter Weise formuliert sein, um eine gesteuerte Freisetzung der aktiven Verbindung zu ergeben. Beispielhaft, aber nicht zu Zwecken der Beschränkung, können die FcRn-Bindungspartner mit den folgenden Therapeutika für die gezielte Abgabe an Epithelbarrieren konjugiert sein:
    Für bukkale oder sublinguale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen einnehmen, die in herkömmlicher Weise formuliert sind. Für die rektale und vaginale Verabreichungswege kann der aktive Bestandteil als Lösungen (für Retentionsklistiere), Suppositorien oder Salben formuliert sein.
    Für die Verabreichung durch Inhalation kann der aktive Bestandteil bequem in der Form einer Aerosolsprayform aus unter Druck stehenden Packungen oder einem Vernebler unter der Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z.B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluormethan, Kohlendioxid oder anderem geeignetem Gas abgegeben werden. Im Falle eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosierungseinheit bestimmt werden, indem ein Ventil vorgesehen ist, um eine abgemessene Menge abzugeben. Kapseln und Kartuschen von, beispielsweise, Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können so formuliert sein, dass sie einen Pulvermix der Verbindung und einer geeigneten Pulverbasis wie bespielsweise Laktose oder Stärke enthalten.
  • Die Zusammensetzungen können, sofern erwünscht, in einer Packung oder einer Spendervorrichtung vorliegen, die eine oder mehrere Einheitsdosisformen enthält, die den aktiven Bestandteil enthält/enthalten. Die Packung kann beispielsweise eine Metall- oder eine Kunststofffolie umfassen, wie beispielsweise eine Blisterpackung. Die Packung oder Abgabevorrichtung kann begleitet sein von Anweisungen für die Verabreichung.
  • BEISPIELE
  • Materialien
  • Abkürzungen
  • BSA, Rinderserumalbumin; cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure; CD-B, Choleratoxin B-Untereinheit; DMEM, Dulbecco's modified Eagle's-Medium; DMSO, Dimethylsulfoxid; DOC, Desoxycholat; ECL, erhöhte Chemilumineszenz, ELISA, Enzymgekoppelter Immunsorbanztest; HBSS, Hanks' balanced salt solution ohne Kalzium oder Magnesium; HEPES, N-[2-Hydroxyethyl] piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]; hGH, menschliches Wachstumshormon; IEC, Darmepithelzellen; KI, Kaliumiodid; MHC, Haupthistokompatibilitätskomplex; NaOH, Natriumhydroxid; NH4Cl, Ammoniumchlorid; NHS-Rhodamin, N-Hydroxysuccinimidyl-Rhodamin; RNA, Ribonukleinsäure; RT-PCR, reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion; SATA, N-Succinimdyl-S-acetylthioacetat; SDS-PAGE, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese; Sulfo-LC-SPDP, Sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionamid] hexanoat; Sulfo-NHS-Biotin, Sulfosuccinimidobiotin; Sulfo-SMCC, Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidoriethyl)cyclohexan-1-Carboxylat.
  • Chemikalien
  • cDNA Cycle Kits wurden gekauft von Invitrogen (San Diego, CA). Die Polymerase wurde gekauft von Perkin-Elmer-Cetus (Norwalk, CT). CircumVentTM-Kits wurden gekauft von New England Biolabs (Beverly, MA). Radionukleotide und radioaktive Chemikalien wurden gekauft von DuPont/NEN (Boston, MA). HBSS und DMEM wurden gekauft von GIBCO/Life Technologies (Gaithersburg, MD). RPMI 1640 wurde gekauft von Cellgro (Herndon, VA). L-Glutamin wurde gekauft von Cellgro. Protein A-Sepharose wurde gekauft von Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Streptavidin-Meerrettichperoxidase, Sulfo-LC-SPDP, Sulfo-NHS-Biotin, Sulfo- SMCC, SATA und immobilisiertes Ficin wurden von Pierce (Rockford, IL) gekauft. BALB/c Mäuse wurden gekauft von Charles River Laboratories (Wilmington, MA). ECL-Kits wurden gekauft Amersham (Arlington Heights, IL). Plasmin, AvidChrom-protein A, Protein G-Sepharose, BSA, Choleratoxin B-Untereinheit, anti-hGH-Antikörper und alle anderen Chemikalien wurden von Sigma, (St. Louis, MO) gekauft.
  • Beispiel 1: Expression von FcRn-mRNA in primären menschlichen Darmepithelzellen und Zelllinien
  • Gesamt-RNA wurde aus Enterozyten von erwachsenen Menschen durch Standardverfahren, wie sie in der Technik gut bekannt sind, extrahiert (Sambrook et al., aa0). Ein Mikrogramm RNA von einem jeden Zellty wurde als eine Matrize verwendet, um das cDNA-Substrat für die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) herzustellen unter Verwendung eines cDNA Cycle Kit (Invitrogen, San Diego, CA). Dreißig Zyklen der PCR wurden an der DNA unter Verwendung von Taq-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) durchgeführt gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung der Primer TGCTGGGCTGTGAACTG und CGCTTTTAGCAGTCGGAA. Die PCR-Zyklusbedingungen waren: Denaturierung bei 94°C für eine Minute, Annelieren bei 55°C für zwei Minuten und Verlängerung bei 72°C für drei Minuten. Die Amplifikationsprodukte wurden durch Elektrophorese auf einem 1,5 % Agarosegel aufgelöst und durch Ethidiumbromidfärbung visualisiert, was die Anwesenheit des erwarteten etwa achthundert Basenpaare großen Amplifikationsproduktes in allen Proben mit Ausnahme der adulten Kolonepithelzellen zeigte. Um die Identität des RT-PCR-Amplifikationsproduktes zu bestätigen, wurde die DNA-Bande aus dem Agarosegel ausgeschnitten, in pCR11 (Invitrogen, Carlsbad, CA) subkloniert und sequenziert unter Verwendung eines Prismdye-Deoxy-Terminator cycle sequencing Kits (Applied Biosystems, Foster City, CA) unter Verwendung von Primern von sowohl Vektor- als auch menschlicher FcRn-Sequenz. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem Sequenziergerät von Applied Biosystems analysiert. Die Sequenz der Amplifikationsprodukte passte genau zu der FcRn-Gensequenz, was die Identität des exprimierten Gens bestätigte.
  • Beispiel 2: Nachweis von FcRn-mRNA durch Northern Blot
  • Um die Expression von FcRn in menschlichen Darmepithelzellen und Zelllinien zu bestätigen, wurde ein Northern Blot hergestellt unter Verwendung der RNA-Proben, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt waren aus adulten menschlichen Enterozyten und aus zwei menschlichen Adenokarzinomazelllinien hergestellt waren, die von Kolon stammen, nämlich Caco-2 und HAT-29. Die RNA-Proben wurden durch Formaldehyd/Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und durch Standardverfahren auf eine Nylonmembran überführt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989). Die Membran wurde mit einer Sonde untersucht unter Verwendung einer 32P-radiomarkierten 120 Basenpaare großen Sonde von dem 3'nicht-translatierten Bereich von FcRn durch Standardverfahren. Autoradiogramme des Northern Blots zeigten die Anwesenheit des 1,5 Kilobasen-hFcRn-Transkriptes in den Enterozyten und beiden Zelllinien. Deshalb wurde die Expression von FcRn in menschlichen adulten Darmepithelzellen und Zelllinien durch zwei unterschiedliche Verfahren des RNA-Nachweises gezeigt.
  • Beispiel 3: Markierung und Immunpräzipitation des MHC-Klasse I-verwandten Fc-Rezeptors (FcRn) aus Darmepithelzellen
  • Die Expression von FcRn in menschlichem Darmepithelzellen wurde bestätigt durch Immunpräzipitation des Proteins. Caco-2-Zellen wurden metabolisch markiert unter Verwendung von IIS-Methionin (DuPont/NEN, Boston, MA) und Proteine wurden durch Verfahren extrahiert, die in der Technik gut bekannt sind (Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual). Ein polyklonales Kaninchen-Antiserum gegen die mit MHC Klasse I verwandte schwere Kette von FcR der Ratte, das an Protein-A-Sepharose gebunden war, wurden verwendet, um FcRn aus den Zellextrakten unter Verwendung von Standardverfahren zu immunpräzipitieren (FcRn kann durch gut etablierte Techniken gereinigt werden, Simister und Rees 1985, European J. Immunology, 15:733-8, und verwendet werden, um Ratten zu immunisieren, gefolgt vom Sammeln von Blut, Harlow und Lane, aaO.). Immunpräzipitate wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und durch Autoradiographie visualisiert. Ein 48 Kilodalton-FcRn-Protein wurde beobachtet, was die auf dem Niveau der RNA beobachtete Expression bestätigte.
  • Beispiel 4: Expression von FcRn-Protein auf der Zelloberfläche von menschlichen Darmepithelzellen
  • Etwa 3 × 107 HT-29 Darmepithelzellen wurden von Gewebekulturplatten durch nichtenzymatische Verfahren abgelöst und viermal mit eiskaltem Hanks' ausgeglichener Salzlösung gewaschen, die kein Kalzium oder Magnesium enthielt (HBSS-, GIBCO/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Um Zelloberflächenproteine zu markieren, wurden die gewaschenen Zellen zweifach für 20 Minuten mit 1,5 ml 0,5 mg/ml Sulfo-NHS-Biotin (Pierce, Rockford, IL) in DMSO inkubiert. Markierte Zellen wurden fünfmal mit 50 mM NH4Cl gewaschen, für 20 Minuten mit 10 ml RPMI 1640 (Cellgro, City, State) inkubiert, das 1 mM L-Glutamin (Mediatech, Washington, DC) enthielt, und viermal mit HBSS-gewaschen.
  • Die Zellen wurden lysiert, dann über Nacht mit Protein A-Sepharosekügelchen vorgereinigt (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) unter Verwendung von Standardtechniken, die in der Technik gut bekannt sind. SDS und Desoxycholsäure (DOC) wurden zu den Überständen auf Endkonzentrationen von 0,1% bzw. 0,5% hinzugegeben. Die Lysate wurden vorgeklärt mit normalem Kaninchenserum und immunpräzipitiert mit polyklonalen Kaninchen-anti-Ratten-MHC Klasse I-verwandten FcR-Antikörper durch Verfahren, die in der Technik gut bekannt sind. Die Immunpräzipitate wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembranen überführt. Die Nitrozellulosemembran wurde für die Inkubation mit 1:10.000 verdünnter Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (Pierce, Rockford IL) verarbeitet, wie vom Hersteller empfohlen. Die Membran wurde dann zum Nachweis von gebundener Meerrettich-Peroxidase unter Verwendung eines ECL-Kits (Amersham, Arlington Heights, IL) verarbeitet. Licht, das durch Spaltung des chemilumineszierenden Substrates emittiert wurde, wurde durch Exposition der Membran gegenüber lichtempfindlichem Film nachgewiesen. Die Filmexpositionen zeigten, dass FcRn auf der Oberfläche von HT-29 Darmepithelzellen exprimiert wurde.
  • Beispiel 5: Funktionale Aktivität von menschlichem FcRn auf der Zelloberfläche von Darmepithelzellen
  • Um zu zeigen, dass der auf der Zelloberfläche von Darmepithelzellen exprimierte FcRn funktional war, wurden Caco-2-Zellen und menschliche adulte Jejunumepithelzellen (IECs) auf ihre Fähigkeit hin getestet, Fc-Antikörperfragment zu binden. Caco-2 und Jejunum IECs wurden auf Mikrozentrifugenröhrchen verteilt (2 × 106 Zellen pro Röhrchen) und bei 2000 rpm für 2 bis 3 Minuten bei 4°C pelletiert. Zellpellets wurden einmal in DMEM bei 4°C gewaschen, das 20 mM HEPES, pH 6,0 oder pH 8,0 enthielt, und in 0,2 ml des gleichen Mediums erneut suspendiert. Die Zellsuspension wurde auf Platten mit 12 Näpfen für den Test verteilt. 125I-Fc-Fragment (200 ng/ml, 4 × 10-9 M) in DMEM, das 20 mM HEPES, 1,0 mM KI, und 0,1 % Fischgelatine, pH 6,0 oder pH 8,0 mit oder ohne 0,5 mg/ml unmarkiertes menschliches IgG (3,3 × 10-6 M) enthielt, wurde zu einem jeden Napf hinzugegeben. Man erlaubte, dass die Zellen an IgG oder Fc bei 37°C für 2 Stunden in einer 5% CO2 befeuchteten Atmosphäre banden. Die Zellen wurden in Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei 2000 rpm für 2 bis 3 Minuten bei 4°C pelletiert. Nichtgebundenes 125I-Fc wurde entfernt durch einmaliges Waschen der Zellpellets mit kaltem DMEM bei 4°C, das 20 mM HEPES, pH 6,0 oder pH 8,0 enthielt. Die Zellen wurden zerstört in 0,5 ml 0,1 M NaOH und die sich ergebende Lösung in Szintillationsgläschen überführt. 125I wurde quantifiziert unter Verwendung eines CliniGamma 1272-Gammazählers (LKB Wallac, Piscataway, NJ). Sowohl Caco-2-Zellen als auch menschliche adulte Jejunum-IECs banden spezifisch 125I-Fc bei pH 6,0, aber nicht bei pH 8,0, was die funktionale pH-abhängige Bindung zeigt, wie sie für neonatalen FcRn der Ratte und kloniertem menschlichen FcRn beobachtet wurde (Story et al., J. Exn. Med. 180: 2377-2381; December 1994).
  • Beispiel 6: Herstellung von menschlichem Immunglobulin G
  • Nicht-spezifisches gereinigtes Immunglobulin G von Mensch, Maus, Ratte, Ziege, Schwein, Kuh und anderen Arten kann von kommerziellen Anbietern wie beispielsweise Sigma Chemical Co., Pierce Chemical, HyClone Laboratories, ICN Biomedicals und Organon Teknika-CappaI angeboten werden.
  • Immunglobulin G kann auch durch Ammoniumsulfatpräzipitation von Blutserumpräzipitat isoliert werden. Das Proteinpräzipitat wird weiter fraktioniert durch Ionenaustauschchromatographie oder Gelfiltrationschromatographie, um im wesentlichen gereinigtes nicht-spezifisches IgG zu isolieren. Unter nicht-spezifischem IgG wird verstanden, dass keine einzelne Spezifität innerhalb der Antikörperpopulation oder des Pools dominant ist.
  • Immunglobulin G kann auch aus Blutserum durch Adsorption an Protein A gereinigt werden, das an einen festen Träger wie beispielsweise Protein A-Sepharose (Pharmacia), AvidChrom-Protein A (Sigma), oder Protein G-Sepharose (Sigma) gebunden ist. Andere Verfahren zur Reinigung von IgG sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohl bekannt und können für die Zwecke der Isolierung von nicht-spezifischem IgG verwendet werden.
  • Beispiel 7: Herstellung von menschlichem Immunglobulin G
  • Um die Fc-Fragmente von menschlichem IgG herzustellen, wird IgG, das wie in Beispiel 6 isoliert wurde, einem Verdau mit immobilisiertem Papain (Pierce) gemäß dem empfohlenen Protokoll des Herstellers unterzogen. Andere Proteasen, die IgG verdauen, um intakte Fc-Fragmente herzustellen, die an Fc-Rezeptoren binden können, beispielsweise Plasmin (Sigma) oder immobilisiertes Ficin (Pierce), sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und können verwendet werden, um Fc-Fragmente herzustellen. Das verdaute Immunglobulin wird dann mit einer Affinitätsmatrix wie beispielsweise Protein A-Sepharose oder Protein G-Sepharose inkubiert. Nicht-bindende Teile von IgG werden von der Affinitätsmatrix durch extensives Waschen im Batch- oder Säulenformat eluiert. Fc-Fragmente von IgG werden dann durch Hinzugeben eines Puffers eluiert, der mit Fc-Adsorbenzbindung nicht kompatibel ist. Andere Verfahren, die bei der Reinigung von Fc-Fragmenten wirksam sind, können ebenfalls verwendet werden.
  • Beispiel 8: Konjugation von Verbindungen an menschliche Immunglobulin-Fc-Fragmente
  • Um Verbindungen vermittels des FcRn-Transportmechanismuses abzugeben, können derartige Verbindungen an ganzes IgG oder Fc-Fragmente gekoppelt werden. Die Chemie des Quervernetzens und wirksame Reagenzien für derartige Zwecke sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Die Art des Quervernetzungsreagens, das verwendet wird, um ganzes IgG oder Fc-Fragmente zu konjugieren, und die Verbindung, die abgegeben werden soll, sind durch die Erfindung nicht beschränkt. Ein jegliches quervernetzendes Agens kann verwendet werden unter der Vorraussetzung, dass a) die Aktivität der Verbindung beibehalten wird und b) das Binden des Fc-Teils des Konjugates durch den FcRn nicht nachteilig beeinflusst wird.
  • Ein Beispiel für eine wirksame Einschrittquervernetzung von Fc und einer Verbindung ist die Oxidation von Fc mit Natriumperiodat in Natriumphosphatpuffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von Inkubation über Nacht bei 4°C mit der zu konjugierenden Verbindung. Die Konjugation kann auch erfolgen durch Derivatisierung von sowohl der Verbindung als auch den Fc-Fragmenten mit Sulfosuccinimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)propionamid]-hexonat (Sulfo-LC-SPDP,Pierce) für 18 Stunden bei Raumtemperatur.
  • Konjugate können auch hergestellt werden durch Derivatisieren von Fc-Fragmenten und der abzugeben erwünschten Verbindung mit unterschiedlichen Quervernetzungsreagenzien, die nachfolgend eine kovalente Verbindung ausbilden werden. Ein Beispiel für diese Reaktion ist die Derivatisierung von Fc-Fragmenten mit Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC, Pierce) und die an Fc zu konjugierende Verbindung wird thioliert mit N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA). Die derivatisierten Verbindungen werden so gereinigt, dass sie frei sind von Quervernetzer und bei Raumtemperatur für eine Stunde kombiniert, um ein Quervernetzen zu erlauben. Andere Quervernetzungsreagenzien umfassend funktionale Aldehyd-, Imid-, Cyano-, Halogen-, Carboxyl-, aktivierte Carboxyl-, Anhydrid- und Maleiimid-Gruppen sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und können auch für die Konjugation von Verbindungen an Fc-Fragmente verwendet werden. Die Auswahl des Quervernetzungsreagens wird, natürlich, von der Art der Verbindung abhängen, die an das Fc konjugiert werden soll. Die Quervernetzungsreagenzien, die oben beschrieben sind, sind wirksam für Protein-Protein-Konjugate. Wenn die zu konjugierende Verbindung ein Kohlenhydrat ist oder einen Kohlenhydratbestandteil aufweist, dann sind heterobifunktionale Quervernetzungsreagenzien wie beispielsweise ABH, M2C2H, MPBH und PDPH für die Konjugation mit einem Protein-FcRn-bindenden Molekül nützlich (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Ein weiteres Verfahren zum Konjugieren von Proteinen und Kohlenhydraten wird von Brumeanu et al. offenbart (Genetic Engineering News, 1. Oktober 1995, Seite 16). Wenn die zu konjugierende Verbindung ein Lipid ist oder einen Lipidbestandteil aufweist, der als eine Stelle für die Konjugation für das FcRn-bindende Molekül zusagt, dann können Quervernetzer wie SPDP, SMPB und Derivate davon verwendet werden (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Es ist auch möglich, irgendein Molekül, das abgegeben werden soll, durch nicht-kovalente Mittel zu konjugieren. Ein bequemer Weg zum Erreichen von nicht-kovalenter Konjugation besteht darin, Antikörper gegen die abzugebende Verbindung zu erzeugen, wie beispielsweise monoklonale Antikörper, durch Verfahren, die in der Technik gut bekannt sind, und einen monoklonalen Antikörper auszuwählen, der die richtige Fc-Region und die erwünschten Antigenbindungseigenschaften aufweist. Das abzugebende Antigen wird dann an den monoklonalen Antiköperträger vorgebunden. Bei all den vorherigen Quervernetzungsreaktionen ist es wichtig, dass die derivatisierten Verbindungen so gereinigt sind, dass sie frei von Quervernetzungsagens sind. Es ist wichtig, auch das letztendliche Konjugat so zu reinigen, dass es im Wesentlichen frei von nicht-konjugierten Reaktanten ist. Die Reinigung kann durch Affinitäts-, Gelfiltrations- oder Ionenaustauschchromatographie auf der Grundlage der Eigenschaften einer jeden Komponente des Konjugates erreicht werden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist ein anfänglicher Affinitätsreinigungsschritt unter Verwendung von Protein A-Sepharose, um Fc- und Fc-Verbindungs-Konjugate zurückerhalten, gefolgt von Gelfiltration oder Ionenaustauschchromatographie auf der Grundlage der Masse, Größe oder Ladung des Fc-Konjugates. Der anfängliche Schritt dieses Reinigungsschemas stellt sicher, dass das Konjugat an FcRn binden wird, was ein essentielles Erfordernis der Erfindung ist.
  • Beispiel 9: IgG-erleichterte Abgabe von Fremdantigen über die Darmepithelbarriere
  • Um die Fähigkeit von Fc-Bindungspartnern-Antigen-Konjugaten zu testen, über Epithelbarrieren transportiert zu werden, werden Fremdantigene mit IgG-Molekülen für die Verabreichung an Mäuse konjugiert. Ein geeignetes Fremdantigen ist der Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin, da er in gefrorenen semidünnen Schnitten von Darmepithel visualisiert werden kann. Rhodamin wird kovalent an nicht-spezifisches Maus-IgG, das wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt ist, Choleratoxin B-Untereinheit (Sigma) und Ovalbumin (Sigman) durch Inkubation mit Succinyl-Rhodamin (Molecular Probes, Eugene, OR), wie vom Hersteller empfohlen, gebunden. Das IgG-Rhodamin-Konjugat wird durch Protein-G-Sepharoseaffinitätschromatographie gereingt. Nach Dialyse, um nicht-konjugiertes Succinyl-Rhodamin zu entfernen, werden Choleratoxin B (CT-B)-Rhodamin und Ovalbumin-Rhodamin-Konjugate durch Gelfiltrationen oder Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Fraktionen des Eluats werden auf die Anwesenheit von Konjugaten hin getestet durch Bestimmen der Fluoreszenz. Funktionales Binden der IgG- und CT-B-Untereinheit-Konjugate können durch Binden an FcRn bzw. Gangliosid GM1 getestet werden. Choleratoxin B-Rhodamin und Ovalbumin-Rhodamin dienen als Positiv- bzw. Negativkontrolle.
  • BALB/c-Mäusen werden 0,2 Nanomol der drei Rhodamin-Konjugate, wie sie oben beschrieben sind, mit oder ohne 0,2 Nanomol unmarkiertem Choleratoxin als ein nichtspezifisches Adjuvans durch intragastrische Verabreichung in Gegenwart von 75 Micromol NaHCO3 und 20 mg/ml Sojabohnen-Trypsininhibitor verabreicht, um Magenabbau zu inhibieren. Nach sechs Stunden werden die Mäuse getötet und der Darm entfernt, gefroren und für halbdünnes Schneiden verarbeitet. Schnitte des Darmepithels werden auf einem Fluoreszenzmikroskop beleuchtet und auf intrazelluläre Fluoreszenz hin untersucht. Die Anwesenheit von Fluoreszenz in Darmepithelzellen von Mäusen, denen man IgG-Rhodamin gefüttert hatte, zeigt an, dass die IgG-Konjugate wirksam in apical-basolateral-Richtung über die Darmepithelbarriere transportiert worden sind. FcRn ist in der Lage, Immunogene als Konjugate mit FcRn-Bindungspartnern zu transportieren.
  • Beispiel 10: Schleimhautimmunantwort bei der Maus auf oral verabreichtes Antigen-IgG-Konjugat durch FcRn-vermittelte Transzytose
  • Transgene Mäuse, die für die Deletion von β2-Microglobulin (ein kritischer Bestandteil der Fc-Rezeptorfunktion) homozygot sind, und ihre normalen Wildtypwurfgeschwister werden für Studien zur Erzeugung einer Schleimhautimmunantwort verwendet. Wenn Rhodamin-IgG eine Schleimhautimmunreaktion hervorruft durch Binden an Fc-Rezeptoren an der Apicalmembran, dann sollte eine positive Immunantwort beim Wildtyp, nicht aber bei β2-Microglobulin-„knock out"-Mäusen gefunden werden. Im Gegensatz dazu sollte die Rhodamin-Choleratoxin B-Untereinheit (CT-B) eine positive Immunantwort in sowohl Wildtyp- als auch -„knock out"-Mäusen hervorrufen, da die Transzytose von CT-B über die Epithelbarriere nicht vom Binden an Fc-Rezeptoren an der Apicalmembran abhängt. Rhodamin-Ovalbumin tritt nicht in Transzytosevesikel ein (kann aber in Darmepithel durch Fluidphasenendozytose eintreten) und sollte keine Immunantwort in irgendwelchen Mäusen hervorrufen.
  • Drei Gruppen von Wildtyp- und β2-Microglobulin-knock out-Mäusen wurden oral mit den drei Rhodamin-Konjugaten, wie sie in Beispiel 9 beschrieben sind, immunisiert. Parallelexperimente werden durchgeführt mit der Zugabe von 0,2 Nanomol Choleratoxin als unspezifischem Adjuvans. Äquimolare Mengen der Rhodaminkonjugate werden intragastrisch verabreicht. Die Mäuse werden durch dieses Verfahren alle 10 Tage, insgesamt dreimal „immunisiert". Zwei Wochen nach der dritten oralen Immunisierung werden die Mäuse getötet und die Rhodamin-spezifische Immunantwort wird durch ELISA auf Darmsekretionen und Serum durch Standardverfahren bestimmt. Anti-Rhodamin-Serumimmunglobuline sind am sichtbarsten in den Mäusen vom Wildtyp, die mit Rhodamin-Konjugaten aus CT-B und IgG gefüttert waren. Knock out-Mäuse, denen β2-Microglobulin fehlte, erzeugten eine Schleimhautimmunantwort auf Rhodamin-CT-B, nicht aber auf Rhodamin-IgG, was anzeigt, dass Rezeptor-vermittelte Transzytose eine wichtige Rolle bei der Schleimhautimmunantwort spielt. Die Kontrolle Rhodamin-Ovalbumin-Konjugat ruft eine geringe oder keine Immunantwort in den Wildtyp- und den β2-Microglobulin-knock out-Mäusen hervor.
  • Beispiel 11: IgG-erleichterte Abgabe der bioaktiven Substanz Insulin über die Darmepithelbarriere
  • Um die Fähigkeit von Konjugaten aus Fc-bindenden Partner und bioaktiver Substanz zu testen, über Epithelbarrieren transportiert zu werden, wird die bioaktive Substanz Insulin an IgG-Moleküle für die Verabreichung an Mäuse konjugiert. Ein geeignetes therapeutisches Agens, das abgegeben werden soll, ist Insulin, da seine Anwesenheit in dem systemischen Blutkreislauf bestimmt werden kann durch Messen eines Absinkens des Blutglukosetiters. Die Ergebnisse eines derartigen Tests zeigen die Wirksamkeit des FcRn-Bindungspartnerabgabesystems. Insulin wird kovalent an nicht-spezifisches Maus-IgG, das wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt ist, Choleratoxin B-Untereinheit (Sigma) und Ovalbumin (Sigma) durch Inkubation mit Succinylinsulin (Molecular Probes, Eugene, OR), wie vom Hersteller empfohlen, gebunden. Das IgG-Insulin-Konjugat wird durch Protein G-Sepharose-Affinitätschromatographie gereinigt. Nach Dialyse, um unkonjugiertes Succinyl-Insulin zu entfernen, werden Choleratoxin B (CT-B)-Insulin und Ovalbulmin-Insulin-Konjugate durch Gelfiltrationen oder Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Fraktionen des Eluats werden auf die Anwesenheit von Konjugaten hin untersucht durch Bestimmen der Fluoreszenz. Funktionales Binden der IgG- und CT-B-Untereinheiten-Konjugate kann getestet werden durch Binden an FcRn bzw. Gangliosid GM1. Choleratoxin B-Insulin und Ovalbumin-Insulin dienen als Positiv- bzw. Negativkontrolle.
  • BALB/c-Mäusen werden 0,2 Nanomol der drei Insulinkonjugate, wie sie oben beschrieben sind, mit oder ohne 0,2 Nanomol unmarkiertem Cholera-Toxin als eine nicht-spezifische Kontrolle durch orale Verabreichung in Gegenwart von 75 Micromol NaHCO3 und 20 mg/ml Sojabohnentrypsin-Inhibitor, um gastrischen Abbau zu vermeiden, verabreicht.
  • In vivo Insulinabgabe
  • Man lies weibliche BALB/c-Mäuse für 12 Stunden vor dem Experiment fasten. Einer jeden Maus wurden 200 μl einer jeden Zubereitung über eine Magensonde zugeführt. Futter wurde sofort nach Verabreichung wieder gegeben. Blutproben für Glucosebestimmung wurden aus der Mausschwanzvene unter Methoxyfluoranbetäubung gezogen. Proben wurden gezogen unmittelbar vor der Verabreichung (0 Stunden), ebenso wie nach 1, 2, 3 und 3,5 Stunden nach Verabreichung einer jeden Zubereitung. Blutglukosetiter wurden gemessen unter Verwendung eines One Touch® Profile Diabetes Tracking Systems (Lifescan, Milpitas, CA) mit One Touch®-Teststreifen, indem Blut aufgetragen wurde, um einen runden Tropfen auszubilden, der den Testpunkt auf dem Teststreifen vollständig abdeckte. Ablesungen (in mg/dl) wurden von dem Messgerät erhalten, das den nachgewiesenen Blutglukosetiter angab.

Claims (8)

  1. Konjugat einer hämatologischen Verbindung und eines FcRn-Bindungspartners, das auf Epithelzellen, die ein FcRn exprimieren, gezielt ist, zur Verwendung bei einer therapeutischen Methode der Transepithelabgabe der hämatologischen Verbindung an einen Säuger.
  2. Konjugat nach Anspruch 1, wobei die hämatologische Verbindung ein Blutgerinnungsprotein ist.
  3. Konjugat nach Anspruch 2, wobei das Blutgerinnungsprotein ein antihämophilischer Faktor ist.
  4. Konjugat nach Anspruch 2, wobei das Blutgerinnungsprotein ein Faktor IX-Komplex ist.
  5. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für die orale, sublinguale, intranasale oder Aerosolverabreichung.
  6. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der FcRn-Bindungspartner nichtspezifisches IgG oder ein FcRn-Bindungsfragment von IgG ist.
  7. Konjugat nach Anspruch 6, wobei der FcRn-Bindungspartner ein Fc-Fragment von IgG ist.
  8. Konjugat nach Anspruch 6, wobei der FcRn-Bindungspartner ein Fragment von IgG ist, das die vollständige Bindungsregion für das FcRn einschließt.
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Families Citing this family (260)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6660842B1 (en) * 1994-04-28 2003-12-09 Tripep Ab Ligand/receptor specificity exchangers that redirect antibodies to receptors on a pathogen
US6040137A (en) * 1995-04-27 2000-03-21 Tripep Ab Antigen/antibody specification exchanger
US6933366B2 (en) * 1996-12-27 2005-08-23 Tripep Ab Specificity exchangers that redirect antibodies to bacterial adhesion receptors
US6030613A (en) * 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) * 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US7888466B2 (en) 1996-01-11 2011-02-15 Human Genome Sciences, Inc. Human G-protein chemokine receptor HSATU68
US6737056B1 (en) * 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7183387B1 (en) * 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
JP4944324B2 (ja) * 1999-07-13 2012-05-30 ボルダー バイオテクノロジー， インコーポレイテッド 免疫グロブリン融合タンパク質
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
GB9922554D0 (en) * 1999-09-23 1999-11-24 Microbiological Res Authority Inhibition of secretion from non-neuronal cells
US9522217B2 (en) * 2000-03-15 2016-12-20 Orbusneich Medical, Inc. Medical device with coating for capturing genetically-altered cells and methods for using same
US8088060B2 (en) * 2000-03-15 2012-01-03 Orbusneich Medical, Inc. Progenitor endothelial cell capturing with a drug eluting implantable medical device
US20070141107A1 (en) * 2000-03-15 2007-06-21 Orbusneich Medical, Inc. Progenitor Endothelial Cell Capturing with a Drug Eluting Implantable Medical Device
US20020136732A1 (en) * 2000-04-23 2002-09-26 Houston L. L. Compositions comprising carriers and transportable complexes
US20020090646A1 (en) * 2000-05-03 2002-07-11 Amgen Inc. Calcitonin-related molecules
US20030031675A1 (en) 2000-06-06 2003-02-13 Mikesell Glen E. B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation
AU6842701A (en) 2000-06-16 2002-01-14 Human Genome Sciences Inc Antibodies that immunospecifically bind to blys
US7420030B2 (en) 2000-09-08 2008-09-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Aminopeptidase A (APA) targeting peptides for the treatment of cancer
US20040170955A1 (en) 2000-09-08 2004-09-02 Wadih Arap Human and mouse targeting peptides identified by phage display
US7452964B2 (en) 2001-09-07 2008-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods of use of targeting peptides against placenta and adipose tissues
MXPA03002918A (es) * 2000-10-02 2004-04-20 Arizeke Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para el transporte de agentes biologicamente activos a traves de barreras celulares.
US20030166160A1 (en) * 2001-09-06 2003-09-04 Hawley Stephen B. Compounds and molecular complexes comprising multiple binding regions directed to transcytotic ligands
US6673574B2 (en) * 2000-11-30 2004-01-06 Unigene Laboratories Inc. Oral delivery of peptides using enzyme-cleavable membrane translocators
ATE489395T1 (de) 2000-12-12 2010-12-15 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
EP1683865A3 (de) 2001-02-02 2006-10-25 Eli Lilly & Company Säugerproteine und insbesondere CD200
JP2005503116A (ja) 2001-02-09 2005-02-03 ヒューマン　ジノーム　サイエンシーズ，　インコーポレイテッド ヒトｇタンパク質ケモカインレセプター（ｃｃｒ５）ｈｄｇｎｒ１０
US6555581B1 (en) 2001-02-15 2003-04-29 Jones Pharma, Inc. Levothyroxine compositions and methods
US20030032675A1 (en) * 2001-02-15 2003-02-13 Franz G. Andrew Manufacture of thyroid hormone tablets having consistent active moiety amounts
KR20040100835A (ko) * 2001-02-15 2004-12-02 킹 파머슈티칼스 리서치 앤드 디벨로프먼트 아이엔씨 안정된 제약및 갑상선 내분비 호르몬 구성물 및 그제조방법
US20030224047A1 (en) * 2001-02-15 2003-12-04 Franz G. Andrew Levothyroxine compositions and methods
US20030211476A1 (en) * 2001-04-04 2003-11-13 O'mahony Daniel Genetic analysis of peyer's patches and M cells and methods and compositions targeting peyer's patches and M cell receptors
EP1385864B1 (de) 2001-04-13 2010-06-09 Human Genome Sciences, Inc. Anti-VEGF-2 Antikörper
CA2451741C (en) 2001-07-02 2014-02-18 Elan Corporation, Plc Peyers's patch and/or m-celle targeting ligands
US20030180353A1 (en) * 2001-08-10 2003-09-25 Franz G. Andrew Stabilized pharmaceutical compositions
US20030190349A1 (en) * 2001-08-10 2003-10-09 Franz G. Andrew Methods of stabilizing pharmaceutical compositions
US20030198667A1 (en) * 2001-08-10 2003-10-23 Franz Andrew G. Methods of producing dispersible pharmaceutical compositions
US20030198671A1 (en) * 2001-08-10 2003-10-23 Franz G. Andrew Levothyroxine compositions having unique plasma AUC properties
US7101569B2 (en) * 2001-08-14 2006-09-05 Franz G Andrew Methods of administering levothyroxine pharmaceutical compositions
US20030203967A1 (en) * 2001-08-14 2003-10-30 Franz G. Andrew Levothyroxine compositions having unique Tmax properties
US20030199586A1 (en) * 2001-08-14 2003-10-23 Franz G. Andrew Unique levothyroxine aqueous materials
US20030199587A1 (en) * 2001-08-14 2003-10-23 Franz G. Andrew Levothyroxine compositions having unique Cmax properties
US20030198672A1 (en) * 2001-08-14 2003-10-23 Franz G. Andrew Levothyroxine compositions having unique triidothyronine plasma AUC properties
US20030195253A1 (en) * 2001-08-14 2003-10-16 Franz G. Andrew Unadsorbed levothyroxine pharmaceutical compositions, methods of making and methods of administration
EP1497314A4 (de) * 2001-09-07 2007-10-10 Univ Texas Auf peptide gegen plazenta- und fettgewebe abzielende zusammensetzungen und verwendungsverfahren
EP1443961B1 (de) * 2001-10-25 2009-05-06 Genentech, Inc. Glycoprotein-zusammensetzungen
US20030191185A1 (en) * 2001-10-29 2003-10-09 Franz G. Andrew Levothyroxine compositions having unique triiodothyronine Tmax properties
US20080254027A1 (en) * 2002-03-01 2008-10-16 Bernett Matthew J Optimized CD5 antibodies and methods of using the same
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20070148171A1 (en) * 2002-09-27 2007-06-28 Xencor, Inc. Optimized anti-CD30 antibodies
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US7662925B2 (en) * 2002-03-01 2010-02-16 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US20080260731A1 (en) * 2002-03-01 2008-10-23 Bernett Matthew J Optimized antibodies that target cd19
US20040063912A1 (en) * 2002-03-15 2004-04-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
AU2002316574B2 (en) * 2002-03-15 2008-05-01 Brandeis University Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
CA2481747A1 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Medimmune, Inc. Recombinant anti-interleukin-9 antibodies
NZ537726A (en) 2002-06-14 2008-06-30 Brigham & Womens Hospital Methods of treating and preventing colitis involving IL-13 and NK-T cells
JP2006513139A (ja) * 2002-07-03 2006-04-20 ザ・ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド 治療薬の全身性送達のための中央部気道投与
US20060235208A1 (en) * 2002-09-27 2006-10-19 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
CA2502367C (en) 2002-10-16 2013-12-10 Euro-Celtique S.A. Antibodies that bind cell-associated ca 125/o772p and methods of use thereof
EP2230249A3 (de) 2003-02-06 2010-12-22 ChronTech Pharma AB Antigen/Antikörper oder Ligand/Rezeptor glycosylierter Spezifität Austauscher
US7335359B2 (en) * 2003-02-06 2008-02-26 Tripep Ab Glycosylated specificity exchangers
EP1594439A2 (de) * 2003-02-13 2005-11-16 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Regulierung der nahrungsaufnahme und glukoseproduktion durch modulation der spiegel von langkettigem fettsäureacyl-coa im hypothalamus
US8388955B2 (en) * 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20070275460A1 (en) * 2003-03-03 2007-11-29 Xencor.Inc. Fc Variants With Optimized Fc Receptor Binding Properties
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
EP2316487B1 (de) 2003-04-11 2014-06-11 MedImmune, LLC Rekombinante IL-9 Antikörper und ihre Verwendung
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AU2016244273B2 (en) * 2003-05-06 2018-10-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Immunoglobulin Chimeric Monomer-Dimer Hybrids
US20050281829A1 (en) * 2003-05-06 2005-12-22 Hehir Cristina A T Fc chimeric proteins with anti-HIV drugs
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
ES2333598T5 (es) 2003-05-06 2013-09-04 Biogen Idec Hemophilia Inc Proteinas quimericas del factor de coagulacion fc para tratar la hemofilia.
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8101720B2 (en) * 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
ES2438098T3 (es) * 2003-11-13 2014-01-15 Hanmi Science Co., Ltd. Composición farmacéutica que comprende un Fc de inmunoglobulina como vehículo
PL1687066T3 (pl) 2003-11-14 2013-01-31 Brigham & Womens Hospital Inc Sposoby modulowania odporności
WO2005077981A2 (en) * 2003-12-22 2005-08-25 Xencor, Inc. Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES
AU2005207960A1 (en) * 2004-01-28 2005-08-11 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Heterodimeric follicle stimulating hormone-Fc (FSH-Fc) fusion proteins for the treatment of infertility
US7276585B2 (en) * 2004-03-24 2007-10-02 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the Fc region
US20060073528A1 (en) * 2004-05-14 2006-04-06 Jean-Michel Lecerf Measurement methods
US20150010550A1 (en) 2004-07-15 2015-01-08 Xencor, Inc. OPTIMIZED Fc VARIANTS
WO2006031994A2 (en) * 2004-09-14 2006-03-23 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin fc domains
WO2006041922A2 (en) * 2004-10-08 2006-04-20 Dara Biosciences, Inc. Agents and methods for administration to the central nervous system
WO2007001448A2 (en) * 2004-11-04 2007-01-04 Massachusetts Institute Of Technology Coated controlled release polymer particles as efficient oral delivery vehicles for biopharmaceuticals
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US20070135620A1 (en) * 2004-11-12 2007-06-14 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) * 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
KR101019525B1 (ko) * 2004-11-12 2011-03-07 젠코어 인코포레이티드 ＦcRn에 대한 변경된 결합성을 갖는 Ｆc 변이체
JP2008521411A (ja) 2004-11-30 2008-06-26 キュラジェン コーポレイション Ｇｐｎｍｂに対する抗体およびその使用
US20090249503A1 (en) * 2004-12-06 2009-10-01 Bolder Biotechnology, Inc. Enzyme conjugates for use as detoxifying agents
AU2006204791A1 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Xencor, Inc Antibodies and Fc fusion proteins with altered immunogenicity
US20090012067A1 (en) * 2005-02-14 2009-01-08 Luciano Rossetti Modulation of Hypothalamic Atp-Sensitive Potassium Channels
JP2008538919A (ja) * 2005-04-29 2008-11-13 ザ ジャクソン ラボラトリー ＦｃＲｎ抗体およびその使用
JP5065253B2 (ja) 2005-05-06 2012-10-31 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド Ｉｌ−３１モノクローナル抗体とその使用法
US20070014776A1 (en) * 2005-06-09 2007-01-18 Gimeno Ruth E Identification of adiponutrin-related proteins as esterases and methods of use for the same
CN101258164B (zh) 2005-08-16 2013-05-01 韩美科学株式会社 用于大量生产缺失起始甲硫氨酸残基的免疫球蛋白Fc区的方法
US7888486B2 (en) 2005-08-19 2011-02-15 Wyeth Llc Antagonist antibodies against GDF-8
WO2007041635A2 (en) * 2005-10-03 2007-04-12 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
AU2006302254B2 (en) * 2005-10-06 2011-05-26 Xencor, Inc. Optimized anti-CD30 antibodies
WO2007142667A2 (en) 2005-10-13 2007-12-13 Human Genome Sciences, Inc. Treatment of patients with autoantibody positive disease
WO2007070682A2 (en) * 2005-12-15 2007-06-21 Massachusetts Institute Of Technology System for screening particles
TW200745163A (en) 2006-02-17 2007-12-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Peptides that block the binding of IgG to FcRn
TWI428448B (zh) * 2006-03-24 2014-03-01 Syntonix Pharmaceuticals Inc 作為第九因子（ｆａｃｔｏｒ ｉｘ）原肽處理酶之ｐｃ５
EP2007435B1 (de) * 2006-03-31 2019-12-18 Massachusetts Institute Of Technology System zur gezielten verabreichung von heilmitteln
EP2027291A2 (de) 2006-04-27 2009-02-25 Pikamab, Inc. Verfahren und zusammensetzungen für antikörpertherapie
WO2007133807A2 (en) 2006-05-15 2007-11-22 Massachusetts Institute Of Technology Polymers for functional particles
WO2007137117A2 (en) * 2006-05-17 2007-11-29 Massachusetts Institute Of Technology Aptamer-directed drug delivery
US9381477B2 (en) * 2006-06-23 2016-07-05 Massachusetts Institute Of Technology Microfluidic synthesis of organic nanoparticles
US7572618B2 (en) 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
GB0614780D0 (en) * 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
US20100144845A1 (en) * 2006-08-04 2010-06-10 Massachusetts Institute Of Technology Oligonucleotide systems for targeted intracellular delivery
EP2383297B8 (de) * 2006-08-14 2023-03-22 Xencor, Inc. Auf CD19 gerichtete optimierte Antikörper
EP2484696B1 (de) 2006-08-28 2017-08-16 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antagonistische hLIGHT-spezifische menschliche monoklonale Antikörper
EP2594586B1 (de) 2006-09-01 2014-08-27 ZymoGenetics, Inc. Monoklonale IL-31-Antikörper und Verfahren zur Verwendung
EP2061904A2 (de) 2006-09-06 2009-05-27 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Biomarker zur überprüfung der reaktion auf eine c-met-behandlung
WO2008036688A2 (en) 2006-09-18 2008-03-27 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target hm1.24
JP2010506842A (ja) 2006-10-16 2010-03-04 メディミューン，エルエルシー 半減期が短縮された分子、その組成物および使用
US20100303723A1 (en) * 2006-11-20 2010-12-02 Massachusetts Institute Of Technology Drug delivery systems using fc fragments
EP2134830A2 (de) * 2007-02-09 2009-12-23 Massachusetts Institute of Technology Oszillations-zellkultur-bioreaktor
US20090092631A1 (en) * 2007-03-26 2009-04-09 Tripep Ab Glycosylated specificity exchangers that induce an antibody dependent cellular cytotoxicity (adcc) response
EP2077859A4 (de) 2007-03-30 2010-11-24 Medimmune Llc Antikörper-formulierung
JP2010523595A (ja) * 2007-04-04 2010-07-15 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー ポリ（アミノ酸）ターゲッティング部分
US7580304B2 (en) * 2007-06-15 2009-08-25 United Memories, Inc. Multiple bus charge sharing
AU2008284047A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
CA2702083C (en) 2007-10-12 2021-11-30 Massachusetts Institute Of Technology Vaccine nanotechnology
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
ME03057B (de) 2007-12-07 2019-01-20 Zymogenetics Inc Für IL-31 spezifische humanisierte Antikörpermoleküle
EP4269443A3 (de) 2007-12-26 2023-12-27 Xencor, Inc. Fc-varianten mit veränderter bindung zu fcrn
WO2009118300A1 (en) 2008-03-25 2009-10-01 Novartis Forschungsstiftung Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Treating cancer by down-regulating frizzled-4 and/or frizzled-1
TWI453031B (zh) 2008-04-25 2014-09-21 Dyax Corp Ｆｃ受體結合蛋白
WO2010014909A1 (en) * 2008-08-01 2010-02-04 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunomodulatory peptides
US8343498B2 (en) 2008-10-12 2013-01-01 Massachusetts Institute Of Technology Adjuvant incorporation in immunonanotherapeutics
US8591905B2 (en) 2008-10-12 2013-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nicotine immunonanotherapeutics
US8277812B2 (en) 2008-10-12 2012-10-02 Massachusetts Institute Of Technology Immunonanotherapeutics that provide IgG humoral response without T-cell antigen
US8343497B2 (en) 2008-10-12 2013-01-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Targeting of antigen presenting cells with immunonanotherapeutics
EP2405920A1 (de) 2009-03-06 2012-01-18 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Neue therapie gegen angstzustände
EP2241323A1 (de) 2009-04-14 2010-10-20 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Tenascin-W und Hirnkrebs
ES2548030T3 (es) 2009-06-01 2015-10-13 Medimmune, Llc Moléculas con semividas prolongadas y usos de las mismas
EA023179B1 (ru) 2009-08-13 2016-05-31 Круселл Холланд Б.В. Антитела против респираторного синцитиального вируса (pcb) и способы их применения
ES2666152T3 (es) 2009-08-13 2018-05-03 The Johns Hopkins University Métodos de modulación de la función inmunitaria con anticuerpos anti-B7-H7CR
EP3222287A1 (de) 2009-08-24 2017-09-27 Amunix Operating Inc. Blutgerinnungsfaktor-ix-zusammensetzungen und verfahren zur herstellung und verwendung davon
EP2292266A1 (de) 2009-08-27 2011-03-09 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Behandlung von Krebs durch Modulation von Copine III
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
US20110189183A1 (en) 2009-09-18 2011-08-04 Robert Anthony Williamson Antibodies against candida, collections thereof and methods of use
US20120244170A1 (en) 2009-09-22 2012-09-27 Rafal Ciosk Treating cancer by modulating mex-3
WO2011045352A2 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Novartis Forschungsstiftung Spleen tyrosine kinase and brain cancers
US20120213801A1 (en) 2009-10-30 2012-08-23 Ekaterina Gresko Phosphorylated Twist1 and cancer
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
US20130004519A1 (en) 2010-03-05 2013-01-03 Ruth Chiquet-Ehrismann Smoci, tenascin-c and brain cancers
US20130034543A1 (en) 2010-04-19 2013-02-07 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Resear Modulating xrn1
US20130089538A1 (en) 2010-06-10 2013-04-11 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute forBiomedical Researh Treating cancer by modulating mammalian sterile 20-like kinase 3
US9611310B2 (en) 2010-07-09 2017-04-04 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor VIII processing and methods thereof
SG186985A1 (en) 2010-07-09 2013-02-28 Crucell Holland Bv Anti-human respiratory syncytial virus (rsv) antibodies and methods of use
DK2591006T3 (da) 2010-07-09 2019-07-29 Bioverativ Therapeutics Inc Processerbare enkeltkædede molekyler og polypeptider fremstillet ved anvendelse deraf
KR20180118808A (ko) 2010-07-09 2018-10-31 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 인자 iｘ 폴리펩티드 및 이들의 사용 방법
EP2614080A1 (de) 2010-09-10 2013-07-17 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Phosphoryliertes twist1 und metastasen
WO2012038744A2 (en) 2010-09-22 2012-03-29 Genome Research Limited Detecting mutations
WO2012065937A1 (en) 2010-11-15 2012-05-24 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Anti-fungal agents
AR085091A1 (es) 2011-01-26 2013-09-11 Kolltan Pharmaceuticals Inc Anticuerpos anti-kit y sus usos
RU2013150331A (ru) 2011-04-20 2015-05-27 Рош Гликарт Аг СПОСОБ И УСТРОЙСТВА ДЛЯ рН-ЗАВИСИМОГО ПРОХОЖДЕНИЯ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА
AU2012262007B2 (en) 2011-06-02 2017-06-22 Takeda Pharmaceutical Company Limited Fc receptor binding proteins
US9181553B2 (en) 2011-06-06 2015-11-10 Novartis Forschungsstiftung Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Method of treatment of breast cancers over-expressing the SHP2 signature genes
EP3527218A1 (de) 2011-06-10 2019-08-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Gerinnungsfördernde verbindungen und verfahren zur verwendung davon
JP2014520869A (ja) 2011-07-18 2014-08-25 アルツ バイオロジクス アクティーゼルスカブ 長期作用性で生物学的活性が有る黄体形成ホルモン（ｌｈ）化合物
AU2012332263A1 (en) 2011-11-04 2014-05-22 Novartis Ag Low density lipoprotein-related protein 6 (LRP6) - half life extender constructs
WO2013068431A1 (en) 2011-11-08 2013-05-16 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research New treatment for neurodegenerative diseases
WO2013068432A1 (en) 2011-11-08 2013-05-16 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Early diagnostic of neurodegenerative diseases
WO2013102825A1 (en) 2012-01-02 2013-07-11 Novartis Ag Cdcp1 and breast cancer
BR112014017165B1 (pt) 2012-01-12 2023-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc Proteína quimérica compreendendo uma proteína de fator viii, composição farmacêutica, e seus usos
SI2814840T1 (sl) 2012-02-15 2020-06-30 Bioverativ Therapeutics Inc. Sestavki faktorja VIII in postopki njihove izdelave in uporabe
EA201491388A1 (ru) 2012-02-15 2015-01-30 Байоджен Айдек Ма Инк. Рекомбинантные белки фактора viii
EP2831112A1 (de) 2012-03-29 2015-02-04 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Hemmung von interleukin 8 und/oder dessen rezeptor cxcrl bei der behandlung von brustkrebs mit her2/her3-überexpression
US20150133383A1 (en) 2012-05-11 2015-05-14 Prorec Bio Ab Method for diagnosis and treatment of prolactin associated disorders
US10202595B2 (en) 2012-06-08 2019-02-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
CA2875246A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Biogen Idec Ma Inc. Procoagulant compounds
MY177331A (en) 2012-06-15 2020-09-12 Pfizer Improved antagonist antibodies against gdf-8 and uses therefor
US20150218238A1 (en) 2012-06-29 2015-08-06 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Resear Treating diseases by modulating a specific isoform of mkl1
WO2014006114A1 (en) 2012-07-05 2014-01-09 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research New treatment for neurodegenerative diseases
WO2014008480A2 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Biogen Idec Ma Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
DK2882450T3 (da) 2012-07-11 2020-02-24 Bioverativ Therapeutics Inc Faktor viii-kompleks med xten og von willebrand-faktorprotein samt anvendelser deraf
EP2872534B1 (de) 2012-07-13 2018-08-08 Roche Glycart AG Bispezifische anti-vegf-/anti-ang-2-antikörper und ihre verwendung bei der behandlung von vaskulären augenerkrankungen
AU2013295848B2 (en) 2012-07-25 2018-05-24 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-KIT antibodies and uses thereof
SG11201502757QA (en) 2012-10-09 2015-05-28 Igenica Biotherapeutics Inc Anti-c16orf54 antibodies and methods of use thereof
PT2956477T (pt) 2013-02-15 2021-02-05 Bioverativ Therapeutics Inc Gene do fator viii otimizado
EP3431592A1 (de) 2013-03-14 2019-01-23 Translate Bio, Inc. Therapeutische mrna-zusammensetzungen und verwendung zur behandlung von krankheiten und störungen
AR095527A1 (es) 2013-03-15 2015-10-21 Biogen Idec Inc Formulaciones de polipéptido fc-factor ix
CA2914369C (en) 2013-06-06 2023-02-14 Igenica Biotherapeutics, Inc. Anti-c10orf54 antibodies and uses thereof
SG10201913738YA (en) 2013-06-28 2020-03-30 Bioverativ Therapeutics Inc Thrombin cleavable linker with xten and its uses thereof
AR096890A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugando fc de inmunoglobulina, que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de la inmunoglobulina a fcrn
ES2761587T3 (es) 2013-08-07 2020-05-20 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Res Nuevo método de cribado para el tratamiento de la ataxia de Friedreich
US10947269B2 (en) 2013-08-08 2021-03-16 Bioverativ Therapeutics Inc. Purification of chimeric FVIII molecules
EP3033097B1 (de) 2013-08-14 2021-03-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Faktor viii-xten fusionen sowie ihre verwendungen.
EP3906945A3 (de) 2013-08-26 2022-03-16 BioNTech Research and Development, Inc. Nukleinsäuren, die menschliche antikörper gegen sialyl-lewis a codieren
US10611794B2 (en) 2013-09-25 2020-04-07 Bioverativ Therapeutics Inc. On-column viral inactivation methods
WO2015070014A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Biogen Idec Ma Inc. Procoagulant fusion compound
WO2015100299A1 (en) 2013-12-24 2015-07-02 Argen-X N.V. Fcrn antagonists and methods of use
PT4176894T (pt) 2014-01-10 2024-05-21 Bioverativ Therapeutics Inc Proteínas quiméricas de fator viii e utilizações destas
MX2016009555A (es) 2014-01-24 2016-12-08 Ngm Biopharmaceuticals Inc Proteinas de union y metodos para utilizarlas.
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
WO2015166105A2 (en) 2014-05-02 2015-11-05 Medimmune Limited Ion channel modulators and uses thereof
US10329556B2 (en) 2014-05-13 2019-06-25 Bioatla, Llc Conditionally active biological proteins
ES2869459T3 (es) 2014-05-16 2021-10-25 Medimmune Llc Moléculas con unión a receptor de fc de neonato alterada que tiene propiedades terapéuticas y de diagnóstico potenciadas
WO2015187811A2 (en) 2014-06-04 2015-12-10 MabVax Therapeutics, Inc. Human monoclonal antibodies to ganglioside gd2
EP3154579A1 (de) 2014-06-13 2017-04-19 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Neue behandlung gegen das influenzavirus
WO2016004113A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Biogen Ma Inc. Optimized factor ix gene
EP3189152A4 (de) 2014-09-03 2018-04-04 BioAtla LLC Entdeckung und herstellung von bedingt aktiven biologischen proteinen in denselben wirten zur herstellung eukaryontischer zellen
WO2016046768A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Lats and breast cancer
CN108064282A (zh) 2014-10-14 2018-05-22 哈洛齐梅公司 腺苷脱氨酶-2(ada2)、其变体的组合物及使用其的方法
ES2834739T3 (es) 2014-12-11 2021-06-18 Pf Medicament Anticuerpos anti-C10orf54 y utilizaciones de los mismos
US10239942B2 (en) 2014-12-22 2019-03-26 Pd-1 Acquisition Group, Llc Anti-PD-1 antibodies
MX2017011194A (es) 2015-03-03 2018-04-10 Kymab Ltd Anticuerpos, usos y métodos.
US11820807B2 (en) 2015-06-12 2023-11-21 Ubi Pharma Inc Immunoglobulin fusion proteins and uses thereof
EA201890423A1 (ru) 2015-08-03 2018-07-31 Биовератив Терапьютикс Инк. Слитые белки фактора ix, способы их получения и применения
EP3337822A1 (de) 2015-08-19 2018-06-27 Rutgers, The State University of New Jersey Neuartige verfahren zur erzeugung von antikörpern
EA201890790A1 (ru) 2015-09-29 2018-10-31 Селджин Корпорейшн Связывающие pd-1 белки и способы их применения
WO2017072669A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Tenascin-w and biliary tract cancers
US11472876B2 (en) 2015-11-02 2022-10-18 Bioatla, Inc. Conditionally active polypeptides
US11753461B2 (en) 2016-02-01 2023-09-12 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor VIII genes
US10766958B2 (en) 2016-09-19 2020-09-08 Celgene Corporation Methods of treating vitiligo using PD-1 binding antibodies
CN109952317A (zh) 2016-09-19 2019-06-28 细胞基因公司 使用pd-1结合蛋白治疗免疫病症的方法
EP3523330A1 (de) 2016-10-04 2019-08-14 Fairbanks Pharmaceuticals, Inc. Anti-fstl3-antikörper und verwendungen davon
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
MX2019006444A (es) 2016-12-02 2019-10-30 Bioverativ Therapeutics Inc Métodos de tratamiento de artropatía hemofílica utilizando factores de coagulación quiméricos.
CN110520149A (zh) 2016-12-02 2019-11-29 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 诱导对凝血因子的免疫耐受性的方法
CA3061206A1 (en) 2017-04-22 2018-10-25 Immunomic Therapeutics, Inc. Improved lamp constructs
JP7222915B2 (ja) 2017-05-02 2023-02-15 イミュノミック セラピューティックス， インコーポレイテッド 癌抗原を含む改善されたｌａｍｐ構築物
MX2020001593A (es) 2017-08-09 2020-07-13 Bioverativ Therapeutics Inc Moleculas de acido nucleico y usos de las mismas.
CN111630069B (zh) 2017-10-13 2024-05-31 勃林格殷格翰国际有限公司 针对Thomsen-nouvelle(Tn)抗原的人抗体
CA3090136A1 (en) 2018-02-01 2019-08-08 Bioverativ Therapeutics, Inc. Use of lentiviral vectors expressing factor viii
TW202003551A (zh) 2018-03-28 2020-01-16 美商必治妥美雅史谷比公司 介白素-2/介白素-2受體阿法融合蛋白及其使用方法
MX2020012397A (es) 2018-05-18 2021-04-12 Bioverativ Therapeutics Inc Metodos de tratamiento de la hemofilia a.
MX2021000016A (es) 2018-07-03 2021-03-09 Bristol Myers Squibb Co Formulaciones de factor de crecimiento de fibroblastos (fgf-21).
CA3106418A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Pierre Fabre Medicament Receptor for vista
WO2020021061A1 (en) 2018-07-26 2020-01-30 Pieris Pharmaceuticals Gmbh Humanized anti-pd-1 antibodies and uses thereof
US20200069817A1 (en) 2018-08-09 2020-03-05 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
WO2020118069A2 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Bioverativ Therapeutics Inc. Use of lentiviral vectors expressing factor ix
WO2020210512A1 (en) 2019-04-09 2020-10-15 Abcuro, Inc. Killer cell lectin-like receptor subfamily g member 1 (klrg1) depleting antibodies
US20220323519A1 (en) 2019-04-17 2022-10-13 Codiak Biosciences, Inc. Compositions of exosomes and aav
CN114126647A (zh) 2019-06-07 2022-03-01 阿尔金克斯有限公司 适用于皮下施用的FcRn抑制剂的药物制剂
WO2021067389A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 Bioverativ Therapeutics Inc. Lentiviral vector formulations
CN114641306A (zh) 2019-10-18 2022-06-17 免疫治疗有限公司 包含癌抗原的改良lamp构建物
JP2023514152A (ja) 2020-02-06 2023-04-05 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｉｌ－１０およびその使用
EP4208197A1 (de) 2020-09-04 2023-07-12 Rutgers, The State University of New Jersey Sars-cov-2-impfstoffe und -antikörper
WO2022081436A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibody specific for sars-cov-2 receptor binding domain and therapeutic methods
WO2022087274A1 (en) 2020-10-21 2022-04-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibodies that neutralize type-i interferon (ifn) activity
JP2024502832A (ja) 2020-12-31 2024-01-23 アラマー バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 高親和性及び／または特異性を有する結合剤分子ならびにその製造及び使用方法
US20240132577A1 (en) 2021-02-19 2024-04-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services SINGLE DOMAIN ANTIBODIES THAT NEUTRALIZE SARS-CoV-2
WO2022204529A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Abcuro, Inc. Anti-klrg1 antibodies
IL307241A (en) 2021-03-26 2023-11-01 Abcuro Inc Antibodies against KLRG1
WO2022212836A1 (en) 2021-04-01 2022-10-06 Pyxis Oncology, Inc. Gpnmb antibodies and methods of use
AU2022320627A1 (en) 2021-07-26 2024-02-08 Abcuro, Inc. Killer cell lectin-like receptor subfamily g member 1 (klrg1) depleting antibodies
US20230227545A1 (en) 2022-01-07 2023-07-20 Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc. Materials and methods of il-1beta binding proteins
WO2024013727A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Janssen Biotech, Inc. Material and methods for improved bioengineered pairing of antigen-binding variable regions
WO2024130158A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding extended serum half-life interleukin-22 for the treatment of metabolic disease

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3853833A (en) 1971-04-27 1974-12-10 Hormone Res Foundation Synthetic human growth-promoting and lactogenic hormones and method of producing same
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
US5096825A (en) 1983-01-12 1992-03-17 Chiron Corporation Gene for human epidermal growth factor and synthesis and expression thereof
US4650675A (en) * 1983-08-18 1987-03-17 The Children's Medical Center Corporation Oligonucleotide conjugates
US4703008A (en) 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
US4847201A (en) 1985-02-05 1989-07-11 Cetus Corporation DNA encoding for CSF-1 and accompanying recombinant systems
US5168051A (en) 1985-03-22 1992-12-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding TGF-β its uses
IL78775A (en) * 1985-05-15 1992-06-21 Biotech Australia Pty Ltd Oral vaccines
US5200327A (en) 1985-11-06 1993-04-06 Cangene Corporation Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from streptomyces
US4963665A (en) 1986-01-07 1990-10-16 Washington University Human preproinsulin-like growth factor I
US4902495A (en) * 1986-07-22 1990-02-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services IgE Fc directed delivery system
ES2054753T3 (es) * 1987-09-02 1994-08-16 Ciba Geigy Ag Conjugados de citoquinas con inmunoglobulinas.
US5336603A (en) * 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
US5238839A (en) 1988-02-09 1993-08-24 Dana Farber Cancer Institute Nucleic Acids Encoding proteins which induce immunological effector cell activation and chemattraction, vectors, and recombinant cells
US5277894A (en) * 1988-02-26 1994-01-11 The General Hospital Corporation Method for tumor detection and treatment
US5171675A (en) 1988-07-28 1992-12-15 Cerretti Douglas P Macrophage colony stimulating factor-γ
US5227302A (en) 1988-12-20 1993-07-13 Ludwig Institute For Cancer Research DNA encoding platelet derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF)
DE69033668T2 (de) 1989-01-31 2001-04-12 Jeffrey S Rubin Dns kodierend für einen für epithelzellen spezifischen wachstumsfaktor
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
ATE130765T1 (de) * 1989-02-24 1995-12-15 Univ California Gentechnologisch veränderte immunglobuline.
US5229500A (en) 1989-08-30 1993-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Brain derived neurotrophic factor
KR0162259B1 (ko) * 1989-12-05 1998-12-01 아미 펙터 감염성 병변 및 염증성 병변을 검출 및 치료하기 위한 키메라 항체
EP0504136A4 (en) * 1989-12-07 1994-06-29 Blood Res Center Tolerogenic immunoglobulin-protein conjugates
US5349053A (en) * 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US5169627A (en) * 1991-10-28 1992-12-08 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Oral pharmaceutical composition containing a polyethylene glycol-immunoglobulin G conjugate for reconstitution of secretory immunity and method of reconstituting secretory immunity
PT627940E (pt) * 1992-03-05 2003-07-31 Univ Texas Utilizacao de imunoconjugados para o diagnostico e/ou terapia de tumores vascularizados
AU3972893A (en) * 1992-04-03 1993-11-08 Baylor College Of Medicine Gene therapy using the intestine
WO1993020834A1 (en) * 1992-04-10 1993-10-28 Brigham And Women's Hospital Methods and compositions for oral delivery of therapeutic agents
US6197346B1 (en) * 1992-04-24 2001-03-06 Brown Universtiy Research Foundation Bioadhesive microspheres and their use as drug delivery and imaging systems
US5534496A (en) * 1992-07-07 1996-07-09 University Of Southern California Methods and compositions to enhance epithelial drug transport
JPH0640945A (ja) * 1992-07-23 1994-02-15 Kureha Chem Ind Co Ltd Ｆｃフラグメント結合抗腫瘍剤
AU693433B2 (en) * 1992-12-21 1998-07-02 Promega Corporation Prevention and treatment of sepsis
US5928647A (en) * 1993-01-11 1999-07-27 Dana-Farber Cancer Institute Inducing cytotoxic T lymphocyte responses
US5633147A (en) 1994-03-08 1997-05-27 Human Genome Sciences, Inc. Transforming growth factor αH1
US5541087A (en) * 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US5698679A (en) * 1994-09-19 1997-12-16 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Product and process for targeting an immune response
PT1323346E (pt) * 1995-01-17 2006-10-31 Brigham & Womens Hospital Administracao transepitelial de antigenicos com a finalidade de provocar tolerancia e imunidade
US6030613A (en) * 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
IT1289608B1 (it) * 1997-02-05 1998-10-15 Angelini Ricerche Spa Composizione per uso terapeutico o diagnostico somministrabile per via intranasale,sublinguale o vaginale

Also Published As

Publication number Publication date
US6030613A (en) 2000-02-29
EP1616574A1 (de) 2006-01-18
EP1003550B1 (de) 2006-02-15
CA2297101A1 (en) 1999-02-04
DE69833492D1 (en) 2006-04-20
ATE317702T1 (de) 2006-03-15
WO1999004813A1 (en) 1999-02-04
ES2258820T3 (es) 2006-09-01
JP2001510807A (ja) 2001-08-07
CA2297101C (en) 2011-09-13
EP1003550A1 (de) 2000-05-31

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