ES2258820T3 - Transporte transepitelial de agentes terapeuticos especifico de receptores. - Google Patents

Transporte transepitelial de agentes terapeuticos especifico de receptores.

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Neil E. Simister
Wayne I. Lencer
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Abstract

La presente invención se refiere en general a procedimientos y productos que permiten cebar una reacción inmunitaria contra un antígeno y se refiere en particular, a la administración de antígenos con el fin de inducir la tolerancia y la inmunidad. La presente invención se refiere también a procedimientos y productos para la administración trans-epitelial de agentes terapéuticos. En particular la invención se refiere a procedimientos y composiciones para administrar agentes terapéuticos conjugados a una pareja de enlaje de FcRn en el epitelio intestinal, el epitelio de las mucosas y el epitelio de los pulmones. La invención se refiere finalmente a la síntesis, la preparación y la utilización de conjugados de parejas de enlace con el FcRn como composiciones farmacéuticas o en composiciones farmacéuticas destinadas a la administración oral sistémica de medicamentos y de vacunas.

Description

Transporte transepitelial de agentes terapéuticos específico de receptores.
La presente invención se refiere a métodos y a productos para la liberación transepitelial de agentes terapéuticos. En particular, la invención se refiere a métodos y a composiciones para la liberación de agentes terapéuticos conjugados con una molécula de unión a FcRn en el epitelio intestinal, en el epitelio de la mucosa y en el epitelio del pulmón. La presente invención además se refiere a la síntesis, preparación y uso de los conjugados de molécula de unión a FcRn como tales o en composiciones farmacéuticas para la liberación sistémica oral de fármacos y vacunas.
El sistema inmune de un mamífero se desarrolla durante la gestación y se vuelve activo en las últimas fases del desarrollo del feto del mamífero. Aunque es activo, podría considerarse "inmaduro" porque no se ha expuesto en una medida significativa a antígenos; el feto está protegido en gran medida de los antígenos por la madre. Este sistema inmune "inmaduro", sin embargo, se suplementa por la transferencia de inmunoglobulina materna al feto (o en algunos casos al recién nacido) para proporcionar inmunidad humoral durante las primeras semanas de vida independiente.
Las ratas y los ratones reciben la mayor parte de la inmunoglobulina G (IgG) materna por succión del calostro y la leche, aunque parte se adquiere antes del nacimiento. Las vacas también reciben IgG del calostro. En el caso de los conejos, la IgG se transporta al feto a través del saco vitelino. Se sabe poco sobre la transferencia de IgG al feto o al recién nacido en los seres humanos. La mayoría de los indicios sugieren que las madres humanas transfieren inmunidad humoral a la descendencia sólo antes del nacimiento, aunque se cree que la IgA transferida a un recién nacido a través de la leche materna interviene en la protección del recién nacido contra infecciones entéricas.
El suministro de IgG materna al feto y/o recién nacido de mamífero requiere el transporte a través de una barrera epitelial que es en gran medida impermeable a macromoléculas. El transporte de macromoléculas a través de dicha barrera epitelial puede producirse por mecanismos mediados por receptores específicos y no específicos. Los mecanismos de receptores no específicos se representan por sucesos de cribado paracelular, cuya eficacia está relacionada inversamente con el peso molecular de la molécula transportada. El transporte de macromoléculas tales como IgG a través de esta ruta paracelular es muy ineficaz. Las descripciones del transporte mediado por receptores de inmunoglobulinas a través de células del epitelio intestinal se han limitado hasta ahora al receptor de inmunoglobulina polimérica y al receptor de IgG de enterocitos (un receptor Fc relacionado con el complejo de histocompatibilidad principal (MHC) de clase I). Estos dos sistemas receptores difieren en su especificidad por el isotipo de inmunoglobulina, en su dirección de transporte de inmunoglobulina a través de la célula epitelial y en su expresión con especificidad de tejido. Los dos pueden participar en el moldeo del sistema inmune inmaduro.
El receptor de inmunoglobulina polimérica se expresa en las superficies basolaterales de los enterocitos, hepatocitos y/o células epiteliales del conducto biliar. Transporta IgA e IgM poliméricas a las superficies apicales (luminales), concentrando estas inmunoglobulinas para la defensa antimicrobiana y la exclusión de antígenos.
El receptor de los enterocitos para IgG, que tiene homología con la cadena pesada del MHC de clase I y está asociado con la beta_{2}-microglobulina (\beta_{2}M), se expresa en enterocitos de rata y ratón recién nacidos. La IgG se transporta por vía transcelular en una dirección luminal a serosa a través del epitelio intestinal de estos roedores recién nacidos. En la superficie apical del enterocito, la porción Fc de la IgG se une al receptor de enterocitos al pH relativamente ácido del lumen (aproximadamente pH 6,0). Después de la transcitosis a la membrana plasmática basolateral, se produce una descarga de la inmunoglobulina al pH relativamente neutro de los fluidos intersticiales (aproximadamente pH 7,4). Por lo tanto, el receptor Fc (FcRn) del roedor recién nacido podría ser responsable del liberación de IgG materna al recién nacido y de esta manera puede ser responsable de la adquisición pasiva de IgG durante este periodo.
En los seres humanos, la IgG materna se transporta activamente a través de la placenta. El receptor responsable de este transporte se ha buscado durante muchos años. Se han aislado varias proteínas de unión a IgG a partir de placenta. En el endotelio placentario se detectó Fc\gammaRII y en sincitiotrofoblastos se detectó Fc\gammaRIII. Estos dos receptores, sin embargo, mostraron una afinidad relativamente baja por la IgG monomérica. Recientemente se ha informado sobre el aislamiento a partir de placenta de un ADNc que codifica un homólogo humano del receptor para IgG de enterocitos de rata y ratón. (Story, C.M. et al., J. Exp. Med., Vol. 180:2377-2381, diciembre de 1994). Se presenta la secuencia completa de nucleótidos y de aminoácidos deducida. Este receptor Fc para IgG puede ser responsable del transporte de la IgG materna al feto humano (e incluso posiblemente al recién nacido), ya que la molécula es muy homóloga en su fase de lectura abierta a la secuencia de FcRn de rata (con una identidad de nucleótidos de 69% y una identidad de aminoácidos previstos de 65%). Ahora puede entenderse mejor la denominada inmunización pasiva en el feto humano (y posiblemente en el recién nacido humano).
A diferencia de la inmunización pasiva que implica el suplemento del sistema inmune del hospedador con anticuerpos procedentes de otro individuo, la inmunización activa implica la estimulación del sistema inmune del propio hospedador para generar in vivo la respuesta inmune deseada. Los métodos puestos en práctica más generalmente de inmunización activa en niños y adultos implican inyecciones de un inmunógeno, una vez como una dosis inicial y después al menos otra vez como una dosis de refuerzo. Estos métodos tienen muchos inconvenientes importantes, incluyendo los riesgos asociados con el uso de agujas que pueden transmitir enfermedades tales como el SIDA y la hepatitis. (Cuando se induce tolerancia en un paciente contra un alergeno, los problemas se deben a que a menudo se requieren inyecciones repetidas durante un largo periodo de tiempo). Además, estos métodos no necesariamente desencadenan de forma adecuada la primera línea de defensa contra muchos patógenos, es decir, inmunidad mucosa. Las membranas mucosas revisten las vías respiratorias, el sistema reproductor y el tracto gastrointestinal, y esta superficie mucosa representa la primera vía de entrada para muchas enfermedades. Sería muy deseable una vacuna oral que fuera fácil de administrar y que indujera inmunidad mucosa.
La inmunización usando vacunas orales es problemática. A menudo se consigue una respuesta inmune pequeña o nula. Para mejorar la respuesta inmune, se han acoplado antígenos de interés a soportes que se sabe que son muy inmunogénicos. Por ejemplo, los investigadores han suministrado antígenos usando el Bacilo Calmette-Guerin (BCG) como soporte; BCG es una bacteria usada originalmente como vacuna oral contra la tuberculosis. Un problema que surge con dichos portadores es que el paciente desarrollará anticuerpos contra el propio portador, lo cual puede ser problemático si el portador se usa de nuevo para suministrar un antígeno diferente al mismo paciente. Hasta la fecha no ha resultado satisfactoria ninguna estrategia general para vacunas orales.
En el pasado se han conjugado inmunoglobulinas y porciones de las mismas con fármacos y agentes de formación de imágenes para fijar como diana y destruir poblaciones celulares y para prolongar las vidas medias de ciertos agentes. Las inmunotoxinas son ejemplos de esos conjugados. Sin embargo, estos conjugados nunca se han propuesto como agentes útiles para iniciar una respuesta inmune.
Una pequeña cantidad de trabajo se ha centrado en la capacidad tolerogénica de inmunoglobulinas acopladas a oligonucleótidos o proteínas características de enfermedades autoinmunes. (Véase el documento PCT WO 91/08773). Este trabajo se basa en la idea de que la inducción de tolerancia puede verse muy influenciada por restos de portadores y que los portadores de inmunoglobulina parecen ser fuertemente tolerogénicos. El soporte preferido es la IgG isóloga, y la administración intravenosa fue el modo usado para suministrar los conjugados de IgG. Aunque este grupo de trabajos se prolonga durante más de una década, la administración oral se menciona sólo una vez y sólo para conjugados en los que el soporte de inmunoglobulina es la IgA. De esta manera, aunque en la técnica se conocen conjugados de inmunoglobulina tolerogénicos, estos conjugados nunca se han sugerido como agentes para inducir una respuesta sólida contra un antígeno característico de un patógeno. (Por el contrario, la técnica sugiere que estos conjugados, si acaso, inducirían tolerancia en un sujeto contra un patógeno, lo cual sería muy indeseable). Además, nunca se ha sugerido que estos conjugados sean tolerógenos eficaces cuando la inmunoglobulina es IgG y el modo de administración es la administración oral.
El documento WO 96/22024 describe métodos y productos para modular una respuesta inmune en mamíferos por medio de la administración de un conjugado de un antígeno y una molécula de unión a FcRn, con lo que la molécula de unión a FcRn se usa para transportar el antígeno a través de una barrera epitelial. El antígeno puede ser característico de un patógeno, de una enfermedad autoinmune, de un alergeno o de un tumor.
El documento WO 93/20834 describe métodos y composiciones para liberar agentes terapéuticos en un sujeto por medio de la administración oral de una molécula quimérica que tiene un agente terapéutico conjugado con el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o el factor de crecimiento de transformación \alpha (TGF-\alpha), que reconoce el receptor de EGP y es capaz de realizar el transporte transepitelial del agente terapéutico por transcitosis.
El documento US 5.534.496 describe métodos y composiciones para mejorar el transporte de fármacos (incluyendo péptidos, oligonucleótidos, proteínas y fármacos convencionales) a través de células epiteliales hasta sitios de la mucosa por medio de la introducción del fármaco en estos sitios en combinación o acoplado con un péptido que comprende al menos dos aminoácidos, tal como Pro-Leu-Gly-Pro-Arg o Pro-Leu, y un grupo protector tal como fenilazobenciloxicarbonilo, N-metilo, t-butiloxicarbonilo, fluorenilmetiloxicarbonilo o carbobenzoxi, en el extremo N.
La invención implica el descubrimiento de que pueden acoplarse compuestos a moléculas que se unen al receptor FcRn, tales como inmunoglobulinas o porciones de las mismas, y suministrarse a través de barreras epiteliales por transporte activo por el enterocito por medio de receptores FcRn. La inmunoglobulina o la porción de la misma se une al receptor FcRn y actúa como soporte para el antígeno, ya que la inmunoglobulina o la porción de la misma se transporta a través de la barrera epitelial por un transporte mediado por FcRn. El receptor FcRn está presente en el tejido epitelial humano de niños y adultos.
Las moléculas de unión a FcRn pueden utilizarse para la liberación de una amplia diversidad de compuestos y agentes terapéuticos y sustancias bioactivas, incluyendo agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de cáncer, citoquinas, incluyendo interferón; y hormonas incluyendo insulina, hormona de crecimiento humana (HGH), fármacos para la fertilidad, calcitonina, calcitriol y otros esteroides bioactivos. Las moléculas de unión a FcRn pueden utilizarse además para la liberación dirigida de un vehículo de liberación, tal como liposomas.
La molécula de unión a FcRn de la presente invención se usa para la liberación dirigida de compuestos hematológicos.
En realizaciones preferidas, la molécula de unión a FcRn es una IgG no específica o un fragmento de unión de IgG a FcRn. Aún más preferiblemente, la molécula de unión a FcRn es un fragmento Fc de IgG. También se prefiere que el antígeno se acople covalentemente a la molécula de unión a FcRn. Preferiblemente, el conjugado se administra por vía oral al epitelio intestinal, en un aerosol a los pulmones o por vía intranasal. Estas preparaciones pueden ser no asépticas. Además, pueden administrarse agentes potenciadores suplementarios, como se describe más adelante.
En una realización preferida, cuando el compuesto a liberar es un péptido o una proteína, el conjugado de molécula de unión a FcRn-proteína puede sintetizarse como una proteína de fusión recombinante.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se refieren a moléculas de unión a FcRn conjugadas con compuestos hematológicos para administración oral, sublingual o intranasal sistémica. La preparación farmacéutica de la presente invención incluye un conjugado de un compuesto hematológico y una molécula de unión a FcRn. Las moléculas de unión a FcRn preferidas son como se han descrito anteriormente. La preparación farmacéutica de la presente invención también incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las preparaciones farmacéuticas de la invención pueden formularse en una forma de dosificación unitaria construida y dispuesta para la liberación en un portador epitelial, tal como para la liberación oral en el epitelio intestinal, la liberación por aerosol en el epitelio pulmonar y la liberación intranasal en el epitelio nasal. De esta manera, la presente invención incluye comprimidos que contienen IgG (o una porción de unión a FcRn de la misma) acoplada a compuestos hemato-
lógicos.
Las preparaciones farmacéuticas anteriores pueden liberarse junto con agentes potenciadores suplementarios. Los agentes potenciadores suplementarios por sí mismos pueden acoplarse a una molécula de unión a FcRn para facilitar la liberación de estos agentes a través de la barrera epitelial. Los modos de administración preferidos en general incluyen dosificaciones orales en el epitelio intestinal, aerosoles para los pulmones y dosificaciones intranasales.
La presente invención además se refiere a la síntesis, preparación y uso de los conjugados de molécula de unión a FcRn de la presente invención tal cual o en composiciones farmacéuticas para la liberación sistémica oral e intranasal de fármacos y vacunas. La síntesis de los conjugados de molécula de unión a FcRn de la presente invención comprende el acoplamiento covalente de una molécula de unión a FcRn a un compuesto hematológico. Además, la síntesis de los conjugados de molécula de unión a FcRn de la presente invención comprende el acoplamiento covalente de una molécula de unión a FcRn a un vehículo de liberación, por ejemplo, liposomas. La molécula de unión a FcRn preferida también es como se ha descrito anteriormente. Los conjugados después pueden usarse para preparar las preparaciones farmacéuticas de la presente invención.
Estos y otros aspectos de la invención se describen con más detalle más adelante.
Figura 1. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos del fragmento Fc de la IgG humana.
La presente invención se refiere a moléculas de unión a FcRn modificadas para la liberación dirigida de agentes terapéuticos y liposomas en barreras epiteliales. La invención implica el descubrimiento de que el receptor FcRn humano es activo en tejido epitelial adulto y el descubrimiento de que pueden usarse moléculas de unión a FcRn tales como IgG o fragmentos Fc para transportar otras moléculas, incluyendo antígenos, a través de barreras epiteliales. De esta manera, pueden usarse "moléculas de unión a FcRn" tales como IgG o una porción de unión a FcRn de la misma, para liberar un antígeno o un agente terapéutico a través de una circulación sistémica epitelial, induciendo de esta manera una respuesta o efecto beneficioso, por ejemplo, una respuesta inmune.
Este sistema es útil siempre que sea deseable mejorar la liberación de un antígeno a través de una barrera epitelial al sistema inmune. De esta manera, el sistema puede usarse para liberar antígenos a través del tejido del epitelio intestinal, el tejido del epitelio pulmonar y otras superficies mucosas incluyendo superficies nasales, superficies vaginales, superficies de colon y superficies del árbol biliar. El sistema puede usarse para modular el sistema inmune de un sujeto, tal como por medio de la estimulación de una respuesta humoral de anticuerpos contra un antígeno, por medio de la estimulación de la actividad de células T, o por medio de la estimulación de tolerancia a un antígeno. Como se usa en este documento, sujeto significa: seres humanos, primates, caballos, vacas, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos, pollos y roedores. Cuando se suministran antígenos tumorales, el sistema puede usarse para tratar sujetos que tienen enfermedades susceptibles de un rechazo mediado por inmunidad, tales como tumores no sólidos o tumores sólidos de pequeño tamaño. También se contempla que la liberación de antígenos tumorales por los métodos descritos en este documento será útil para el tratamiento posterior a la extirpación de tumores sólidos grandes. Los métodos también pueden usarse para tratar sujetos de los que se sospecha que tienen cáncer.
Los métodos son útiles siempre que sea deseable conseguir la liberación sistémica de un agente terapéutico, fármaco, vehículo de liberación, proteína o combinaciones de los mismos, a través de una barrera epitelial hasta la circulación sistémica. De esta manera, los conjugados pueden usarse para liberar agentes terapéuticos a través del tejido del epitelio intestinal, el tejido del epitelio pulmonar y otras superficies epiteliales mucosas incluyendo las superficies nasales, superficies vaginales, superficies del colon y recto y superficies del árbol biliar. Los conjugados pueden usarse para administrar un agente terapéutico para inducir un efecto beneficioso. Los conjugados de molécula de unión a FcRn están diseñados para liberar una amplia diversidad de agentes terapéuticos incluyendo nucleótidos de ARN y ADN como los que se usan, por ejemplo, en terapia génica, péptidos, carbohidratos y pequeñas moléculas. Estos agentes terapéuticos incluyen, pero sin limitación, fármacos anticancerosos y quimioterapéuticos, por ejemplo, doxorubicina; fármacos antiinflamatorios, por ejemplo, esteroides; fármacos para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, por ejemplo, inhibidores de colinesterasa; fármacos para el tratamiento de trastornos relacionados con una infección viral, por ejemplo, cirrosis hepática debida a una infección de hepatitis; fármacos para el tratamiento de trastornos del peso, por ejemplo, anfetaminas; agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, citoquinas, fármacos para la fertilidad, antibióticos, hormonas, esteroides, etc.
La invención implica la formación de un conjugado de una molécula de unión a FcRn y un compuesto hematológico. Por conjugado se entiende dos o más entidades unidas entre sí por cualquier medio fisicoquímico, incluyendo, pero sin limitación, interacción hidrófoba, interacción covalente, interacción de enlaces de hidrógeno o interacción iónica entre una sustancia bioactiva, tal como un antígeno o un agente terapéutico, y las porciones hidrófobas no específicas de una molécula de anticuerpo, unión específica anticuerpo-antígeno y acoplamiento covalente. La naturaleza de la unión preferida dependerá, entre otras cosas, del modo de administración y de los vehículos farmacéuticos usados para liberar el conjugado a la barrera epitelial seleccionada. Por ejemplo, algunos enlaces no son tan adecuados como otros para soportar ciertos medios tales como el estómago, pero pueden protegerse del mismo por sistemas de liberación que evitan el estómago. Por supuesto, es importante que el enlace entre la molécula de unión a FcRn y el compuesto sea de tal naturaleza que no destruya la capacidad de la molécula de unión a FcRn para unirse al receptor FcRn. Estos enlaces son bien conocidos por los especialistas habituales en la técnica y se proporcionan ejemplos con más detalle más adelante. El conjugado además puede formarse como una proteína de fusión, también descrita con más detalle más adelante.
Una molécula de unión a FcRn significa cualquier entidad que puede unirse específicamente al receptor FcRn con el consiguiente transporte activo por el receptor FcRn de la molécula de unión a FcRn. Como se ha mencionado anteriormente, se ha aislado el receptor FcRn para varias especies de mamífero, incluyendo seres humanos. La secuencia del FcRn humano, FcRn de rata y FcRn de ratón puede encontrarse en Story, C.M. et al, J. Exp. Med., vol. 180:2377-2381, diciembre de 1994. La molécula del receptor FcRn actualmente está bien caracterizada. El receptor FcRn se une a IgG (pero no a otras clases de inmunoglobulina tales como IgA, IgD, IgM e IgE) a un pH relativamente inferior, transporta activamente la IgG transcelularmente en una dirección de luminal a serosa, y después libera la IgG a un pH relativamente superior que se encuentra en los fluidos intersticiales. Como reconocerán los especialistas habituales en la técnica, los receptores FcRn pueden aislarse por clonación o por purificación por afinidad usando, por ejemplo, anticuerpos monoclonales. Estos receptores FcRn aislados después pueden usarse para identificar y aislar moléculas de unión a FcRn, como se describe más adelante.
Las moléculas de unión a FcRn de la presente invención incluyen cualquier entidad que pueda unirse específicamente al receptor FcRn, incluyendo la IgG entera, el fragmento Fc de la IgG y otros fragmentos de IgG que incluyan la región de unión completa para el receptor FcRn. La región de la porción Fc de IgG que se une al receptor FcRn se ha descrito basándose en cristalografía de rayos X (Burmeister, W.P. et al., Nature, 1994; 372: 379-378). El área de contacto principal de Fc con el receptor FcRn está cerca de la unión de los dominios C_{H}2 y C_{H}3. Son contactos potenciales los restos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 y 314 en C_{H}2 y 385-381, 428 y 433-436 en C_{H}3. (Estos sitios son distintos de los identificados por comparación de subclases o mutagénesis de localización dirigida como sitios importantes para la unión de Fc a Fc\gammaRI y Fc\gammaRII de leucocitos). Los contactos Fc - FcRn anteriores están dentro de una sola cadena pesada de Ig. Se ha indicado previamente que dos receptores FcRn pueden unirse a una sola molécula de Fc. Los datos cristalográficos sugieren que en este complejo, cada molécula de FcRn se une a un solo polipéptido del homodímero de Fc.
En una realización de la presente invención, pueden usarse moléculas de unión a FcRn distintas de la IgG entera para transportar agentes terapéuticos a través de la barrera epitelial. En dicha realización, se prefiere elegir una molécula de unión a FcRn que se una al FcRn con mayor afinidad que la IgG entera. Esta molécula de unión a FcRn tiene utilidad para utilizar el FcRn para conseguir el transporte activo de un agente terapéutico conjugado a través de la barrera epitelial, y también tiene utilidad para prevenir la unión y el transporte de IgG entera a través de la barrera epitelial por medio del FcRn. La actividad de unión a FcRn de estas moléculas de unión a FcRn de mayor afinidad puede medirse usando ensayos convencionales conocidos por los especialistas en la técnica, incluyendo: (a) ensayos de transporte que usan células polarizadas que expresan naturalmente el FcRn, o se han modificado por ingeniería genética para expresar el FcRn o la cadena alfa del FcRn; (b) ensayos de unión proteína:proteína que usan FcRn soluble o fragmentos del mismo, o FcRn inmovilizado; (c) ensayos de unión que utilizan células polarizadas o no polarizadas que expresan naturalmente el FcRn o se han modificado por ingeniería genética para expresar el FcRn o la cadena alfa del FcRn.
De acuerdo con la presente invención, la molécula de unión a FcRn puede producirse por técnicas de ingeniería genética recombinante. Dentro del alcance de la invención se encuentran secuencias de nucleótidos que codifican moléculas de unión a FcRn humanas. Las moléculas de unión a FcRn incluyen IgG entera, el fragmento Fc de IgG y otros fragmentos de IgG que incluyen la región de unión completa para el FcRn. Los sitios de contacto principales incluyen los aminoácidos 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 y 314 de C_{H}2 y los aminoácidos 385-387, 428 y 433-436 de C_{H}3. Por lo tanto, en una realización preferida de la presente invención se encuentran secuencias de nucleótidos que codifican regiones del Fc de IgG que incluyen estos aminoácidos.
Dada la información anterior, los especialistas habituales en la técnica reconocerán fácilmente que la región Fc de IgG puede modificarse de acuerdo con procedimientos bien reconocidos tales como mutagénesis de localización dirigida y similares, para producir IgG modificada o fragmentos Fc modificados, o porciones de los mismos, que se unirán al receptor FcRn. Estas modificaciones incluyen modificaciones lejanas de los sitios de contacto con FcRn, así como modificaciones dentro de los sitios de contacto que conservan o incluso mejoran la unión. Además, puede identificarse y aislarse otras moléculas de unión. Pueden identificarse y aislarse anticuerpos o porciones de los mismos específicas para el receptor FcRn y que pueden transportarse por FcRn una vez unidos, usando técnicas bien establecidas. De forma similar, pueden seleccionarse diversas bibliotecas moleculares generadas de forma aleatoria y pueden aislarse moléculas que se unen y transportan por receptores FcRn usando técnicas convencionales. No se pretende que la invención se limite por la selección de ninguna molécula de unión a FcRn particular.
Si el péptido está compuesto totalmente de aminoácidos codificados por genes, o una porción está compuesta por estos aminoácidos, el péptido o la porción pertinente también puede sintetizarse usando técnicas de ingeniería genética recombinante convencionales.
Para la producción recombinante, una secuencia polinucleotídica que codifica a la molécula de unión a FcRn se inserta en un vehículo de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada, o en el caso de un vector viral de ARN, los elementos necesarios para la replicación y traducción. El vehículo de expresión después se utiliza para transfectar una célula diana adecuada que expresará el péptido. Dependiendo del sistema de expresión usado, el péptido expresado después se aísla por procedimientos bien establecidos en la técnica. En la técnica son bien conocidos métodos para la producción de proteínas y péptidos recombinantes (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.; y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).
Para aumentar la eficacia de la producción, el polinucleótido puede diseñarse para codificar múltiples unidades de la molécula de unión a FcRn separadas por sitios de escisión enzimática. El polipéptido resultante puede escindirse (por ejemplo, por tratamiento con la enzima apropiada) para recuperar la unidades peptídicas. Esto puede aumentar el rendimiento de péptidos dirigidos por un solo promotor. Cuando se usa en sistemas de expresión viral apropiados, la traducción de cada péptido codificado por el ARNm se dirige internamente en el transcrito; por ejemplo, por un sitio interno de entrada de ribosomas, IRES. De esta manera, la construcción policistrónica dirige la transcripción de un solo ARNm policistrónico grande que, a su vez, dirige la traducción de múltiples péptidos individuales. Esta estrategia elimina la producción y procesamiento enzimático de poliproteínas y puede aumentar significativamente el rendimiento de péptido dirigido por un solo promotor.
Pueden utilizarse diversos sistemas de hospedador-vector de expresión para expresar las moléculas de unión a FcRn descritas en este documento. Éstas incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias transformadas con ADN de bacteriófago recombinante o vectores de expresión de ADN plasmídico que contienen una secuencia codificante apropiada; levaduras u hongos filamentosos transformados con vectores de expresión de levadura u hongo recombinantes que contienen una secuencia codificante apropiada; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contiene una secuencia codificante apropiada; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor o el virus del mosaico del tabaco) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti) que contienen una secuencia codificante apropiada; o sistemas de células animales.
Los elementos de expresión de los sistemas de expresión varían en su intensidad y especificidades. Dependiendo del sistema hospedador/vector utilizado, en el vector de expresión puede usarse cualquiera de varios elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clonan en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como pL del bacteriófago \lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) y similares; cuando se clona en sistemas de células de insecto, pueden usarse promotores tales como el promotor de la polihedrina de baculovirus; cuando se clona en sistemas de células vegetales, pueden usarse promotores derivados del genoma de células vegetales (por ejemplo, promotores de choque térmico; el promotor para la subunidad pequeña de RUBISCO; el promotor para la proteína de unión a la clorofila a/b) o de virus vegetales (por ejemplo, el promotor de ARN 35S de CaMV; el promotor de la proteína de la cubierta de TMV); cuando se clona en sistemas de células de mamífero, pueden usarse promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de la metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de vaccinia virus 7.5 K); cuando se generan líneas celulares que contienen múltiples copias del producto de expresión, pueden usarse vectores basados en SV40, BPV y EBV con un marcador selectivo apropiado.
En los casos en los que se usan vectores de expresión vegetales, la expresión de secuencias que codifican formas lineales o no cíclicas de los péptidos cíclicos de la invención puede dirigirse por cualquiera de varios promotores. Por ejemplo, pueden usarse promotores virales tales como los promotores de ARN 35S y promotores de ARN 19S de CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310: 511-514), o el promotor de la proteína de la cubierta de TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6:307-311); como alternativa, pueden usarse promotores vegetales tales como la subunidad pequeña de RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie et al., 1984, Science 224:838-843) o promotores de choque térmico, por ejemplo, hsp17.5-E o hsp17.3-B de soja (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565). Estas construcciones pueden introducirse en células vegetales usando plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus vegetales, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación, etc. Como revisiones de estas técnicas, véase, por ejemplo, Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, páginas 421-463; y Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, Londres, Capítulo 7-9.
En un sistema de expresión de insecto que puede usarse para producir los péptidos de la invención, se usa el virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar los genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. Puede clonarse una secuencia codificante en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y ponerse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de la polihedrina). La inserción satisfactoria de una secuencia codificante dará como resultado la inactivación del gen de la polihedrina y la producción de virus recombinantes no ocluidos (es decir, virus que carecen de la cubierta proteica codificada por el gen de la polihedrina). Estos virus recombinantes después se usan para infectar células de Spodoptera frugiperda en las que se expresa el gen insertado. (Véase, por ejemplo, Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, Patente de Estados Unidos Nº 4.215.051). Pueden encontrarse otros ejemplos de este sistema de expresión en Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ausubel et al., eds., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.
En células hospedadoras de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus. En los casos en los que se usa un adenovirus como un vector de expresión, puede unirse una secuencia codificante a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico después puede insertarse en el genoma del adenovirus por recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar el péptido en hospedadores infectados. (Por ejemplo, véase Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 3655-3659). Como alternativa, puede usarse el promotor de vaccinia 7.5K; (véase, por ejemplo, Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931).
De acuerdo con realizaciones que no son parte de la presente invención, la molécula de unión a FcRn se conjuga con un antígeno. Un antígeno como se usa en este documento se clasifica en cuatro clases: 1) antígenos que son característicos de un patógeno; 2) antígenos que son característicos de una enfermedad autoinmune; 3) antígenos que son característicos de un alergeno; y 4) antígenos que son característicos de un tumor. Los antígenos en general incluyen polisacáridos, glicolípidos, glicoproteínas, péptidos, proteínas, carbohidratos y lípidos de las superficies celulares, citoplasma, núcleos, mitocondrias y similares.
Los antígenos que son característicos de patógenos incluyen antígenos derivados de virus, bacterias, parásitos u hongos. Los ejemplos de patógenos importantes incluyen vibrio cóleras, Escherichia coli enterotoxigénica, rotavirus, Clostridium difficile, especies de Shigella, Salmonella typhi, virus de la parainfluenza, virus de la influenza, Streptococcus pneumonias, Borrelia burgdorferi, VIH, Streptococcus mutans, Plasmodium falciparum, Staphylococcus aureus, virus de la rabia y virus de Epstein-Barr.
Los virus en general incluyen, pero sin limitación, los de las siguientes familias: picornaviridae; caliciviridae; togaviridae; flaviviridae; coronaviridae; rhabdoviridae; filoviridae; paramyxoviridae; orthomyxoviridae; bunyaviridae; arenaviridae; reoviridae; retroviridae; hapadnaviridae; parvoviridae; papovaviridae; adenoviridae; herpesviridae; y poxyviridae.
Las bacterias en general incluyen, pero sin limitación: P. aeruginosa; E. coli. Klebsiella sp.; Serratia sp.; Pseudomonas sp.; P. cepacia; Acinetobacter sp.; S. epidermis; E. faecalis; S. pneumoniae; S. aureus; Haemophilus sp.; Neisseria Sp.; N. meningitidis; Bacteroides sp.; Citrobacter sp.; Branhamella sp.; Salmonella sp.; Shigella sp.; S. pyogenes; Proteus sp.; Clostridium sp.; Erysipelothrix sp.; Listeria sp.; Pasteurella multocida; Streptobacillus sp.; Spirillum sp.; Fusospirocheta sp.; Treponema pallidum; Borrelia sp.; Actinomycetes; Mycoplasma sp.; Chlamydia sp.; Rickettsia sp.; Spirochaeta; Legionella sp.; Mycobacteria sp.; Ureaplasma sp.; Streptomyces sp.; Trichomonas sp.; y P. mirabilis.
Los parásitos incluyen, pero sin limitación: Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malaria; Toxoplasma gondii; Leishmania mexicana, L. tropica, L. major, L. aethiopica, L. donovani, Trypanosoma cruzi, T. brucei, Schistosoma mansoni, S. haematobium, S. japonium; Trichinella spiralis; Wuchereria bancrofti; Brugia malayi; Entamoeba histolytica; Enterobius vermicularis; Taenia solium, T. saginata, Trichomonas vaginatis, T. hominis, T. tenax; Giardia lamblia; Cryptosporidium parvum; Pneumocystis carinii, Babesia bovis, B. divergens, B. microti, Isospora belli, L hominis; Dientamoeba fragilis; Onchocerca volvulus; Ascaris lumbricoides; Necator americanis; Ancylostoma duodenale; Strongyloides stercoralis; Capillaria philippinensis; Angiostrongylus cantonensis; Hymenolepis nana; Diphyllobothrium latum; Echinococcus granulosus, E. multilocularis; Paragonimus westermani, P. caliensis; Chlonorchis sinensis; Opisthorchis felineas, G. viverini, Fasciola hepatica, Sarcoptes scabiei, Pediculus humanus; Phthirius pubis; y Dermatobia hominis.
Los hongos en general incluyen, pero sin limitación: Cryptococcus neoformans; Blastomyces dermatitidis; Aiellomyces dermatitidis; Histoplasma capsulatum; Coccidioides immitis; especies de Candida, incluyendo C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guilliermondii y C. krusei, especies de Aspergillus, incluyendo A. fumigatus, A. flavus y A. niger, especies de Rhizopus; especies de Rhizomucor; especies de Cunninghammella; especies de Apophysomyces, incluyendo A. saksenaea, A. mucor y A. absidia; Sporothrix schenckii, Paracoccidioides brasiliensis; Pseudallescheria boydii, Torulopsis glabrata; y especies de Dermatophytes.
Los antígenos que son característicos de enfermedades autoinmunes típicamente procederán de la superficie celular, citoplasma, núcleo, mitocondrias y similares de tejidos de mamífero. Los ejemplos incluyen antígenos característicos de uveítis (por ejemplo, antígeno S), diabetes mellitus, esclerosis múltiple, lupus sistémico eritematoso, tiroiditis de Hashimoto, miastenia grave, mixoedema primario, tirotoxicosis, artritis reumatoide, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, esclerodermia, gastritis atrófica autoinmune, menopausia prematura (algunos casos), infertilidad masculina (algunos casos), diabetes juvenil, síndrome de Goodpasture, pénfigo vulgar, penfigoide, oftalmia simpática, uveítis facogénica, anemia hemolítica autoinmune, púrpura trombocitopénica idiopática, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria (algunos casos), colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, granulomatosis de Wegener, poli/dermatomiositis y lupus discoide eritematoso.
Los antígenos que son alergenos generalmente son proteínas o glicoproteínas, aunque los alergenos también pueden ser haptenos alergénicos de bajo peso molecular que inducen alergia después de la combinación covalente con un soporte proteico (Remington's Pharmaceutical Sciences). Los alergenos incluyen antígenos derivados de polen, polvo, mohos, esporas, caspa, insectos y alimentos. Los ejemplos específicos incluyen los urusioles (pentadecilcatecol o heptadecilcatecol) de especies de Toxicodendron tales como hiedra venenosa, roble venenoso y zumaque venenoso, y las lactonas sesquiterpenoides de la ambrosía y plantas relacionadas.
Los antígenos que son característicos de antígenos tumorales típicamente procederán de la superficie celular, citoplasma, núcleo, orgánulos y similares de células de tejido tumoral. Los ejemplos incluyen antígenos característicos de proteína tumorales, incluyendo proteínas codificadas por oncogenes mutados; proteínas virales asociadas con tumores; y mucinas y glicolípidos tumorales. Los tumores incluyen, pero sin limitación, los de los siguientes sitios de cáncer y tipos de cáncer: labios, nasofaringe, faringe y cavidad oral, esófago, estómago, colon, recto, hígado, vesícula biliar, árbol biliar, páncreas, laringe, pulmón y bronquios, melanoma de piel, mama, cuello del útero, útero, ovario, vejiga, riñón, cerebro y otras partes del sistema nervioso, tiroides, próstata, testículos, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple y leucemia. Las proteínas virales asociadas con tumores serían las de las clases de virus indicados anteriormente. Los antígenos característicos de tumores pueden ser proteínas no expresadas habitualmente por una célula precursora tumoral, o pueden ser una proteína que se expresa normalmente en una célula precursora tumoral, pero que tiene una mutación característica de un tumor. Un antígeno característico de un tumor puede ser una variante mutante de la proteína normal que tiene una actividad o distribución subcelular alterada. Las mutaciones de genes que producen antígenos tumorales, además de las especificadas anteriormente, pueden estar en la región codificante, en regiones 5' o 3' no codificantes o en intrones de un gen, y pueden ser el resultado de mutaciones puntuales, cambios de fase, deleciones, adiciones, duplicaciones, transposiciones cromosómicas y similares. Un especialista habitual en la técnica estará familiarizado con la amplia diversidad de alteraciones en la estructura génica normal y en la expresión que producen antígenos tumorales. Los ejemplos específicos de antígenos tumorales incluyen: proteínas tales como el idiotipo Ig del linfoma de células B, la quinasa 4 dependiente de ciclina mutante de melanoma, Pmel-17 (gp 100) de melanoma, MART-1 (Melan-A) de melanoma, la proteína p15 de melanoma, la tirosinasa de melanoma, MAGE 1, 2 y 3 de melanoma, tiroides medular, cáncer microcítico de pulmón, cáncer de colon y/o de células escamosas bronquiales, BAGE de vejiga, melanoma, carcinoma de mama y de células escamosas, gp75 de melanoma, antígeno oncofetal de melanoma; carbohidratos/lípidos tales como mucina de cáncer de mama, páncreas y ovario, gangliósidos GM2 y GD2 de melanoma; oncogenes tales como p53 mutante de carcinoma, ras mutante de cáncer de colon y proto-oncogen HER21neu de carcinoma de mama; productos virales tales como proteína de papilomavirus humano de cánceres de células escamosas de cuello del útero y esófago. También se contempla que los antígenos tumorales proteicos pueden presentarse por moléculas de HLA como péptidos específicos derivados de la proteína entera. El procesamiento metabólico de proteínas para producir péptidos antigénicos es bien conocido en la técnica; por ejemplo, véase la patente de Estados Unidos Nº 5.342.774 (Boon et al.). De esta manera, el presente método incluye la liberación de péptidos antigénicos y estos péptidos en un polipéptido mayor o proteína entera que produce péptidos antigénicos. Las liberación de péptidos o proteínas antigénicas puede dar lugar a una inmunidad humoral o celular.
Generalmente, los sujetos pueden recibir una cantidad eficaz del antígeno tumoral y/o péptido derivado del mismo por uno o más de los métodos detallados más adelante. Las dosis iniciales pueden seguirse por dosis de refuerzo, siguiendo protocolos de inmunización convencionales en la técnica. De esta manera, la liberación de antígenos tumorales puede estimular la proliferación de linfocitos T citolíticos.
En los casos de antígenos proteicos y peptídicos, se pretende que la unión covalente a una molécula de unión a FcRn incluya la unión por enlaces peptídicos en una sola cadena polipeptídica. Podrían usarse métodos establecidos (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989) para obtener por ingeniería genética un ADN que codificara una proteína de fusión compuesta de péptido o proteína antigénica y una molécula de unión a FcRn. Este ADN se pondría en un vector de expresión y se introduciría en células bacterianas o eucariotas por métodos establecidos. La proteína de fusión se purificaría a partir de las células o del medio de cultivo por métodos establecidos.
De acuerdo con la presente invención, puede formarse un conjugado como una proteína de fusión. Los conjugados incluyen fusiones de la molécula de unión a FcRn a una proteína, péptido o derivado proteico tal como los indicados en este documento incluyendo, pero sin limitación, antígenos, alergenos o patógenos, o a otras proteínas o derivados proteicos de interés terapéutico potencial tales como factores de crecimiento, factores estimuladores de colonias, factores inhibidores del crecimiento, moléculas de señalización, hormonas, esteroides, neurotransmisores o morfógenos que serían de utilidad cuando se liberan a través de una barrera epitelial.
A modo de ejemplo, pero sin limitación, las proteínas usadas en las proteínas de fusión para sintetizar conjugados pueden incluir el Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF) (Patente de Estados Unidos Nº 4766076), Factor de Crecimiento de Células Endoteliales Derivado de Plaquetas (PD-ECGF) (Patente de Estados Unidos Nº 5227302), Hormona de Crecimiento de Pituitaria Humana (HGH) (Patente de Estados Unidos Nº 3853833), Factor de Crecimiento de Transformación Beta (TGF\beta) (Patente de Estados Unidos Nº 5168051), Factor de Crecimiento de Transformación Alfa (TGF\alpha) (Patente de Estados Unidos Nº 5633147), Factor de Crecimiento de Queratinocitos (KGF) (Patente de Estados Unidos Nº 5731170), Factor de Crecimiento semejante a Insulina-I (IGF-I) (Patente de Estados Unidos Nº 4963665), Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) (Patente de Estados Unidos Nº 5096825), Eritropoyetina (EPO) (Patente de Estados Unidos Nº 4703008), Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos-Macrófagos (GM-CSF) (Patente de Estados Unidos Nº 5200327); M-CSF (Patente de Estados Unidos Nº 5171675), Factor Estimulador de Colonias-1 (CSF-1) (Patente de Estados Unidos Nº 4847201), Factor de Steel, Calcitonina, proteínas AP-1 (Patente de Estados Unidos Nº 5238839), Factor Neurotrófico Derivado de Cerebro (BDNF) (Patente de Estados Unidos Nº 5229500).
En una realización, se construyen proteínas de fusión de la presente invención en las que el conjugado consiste en un fragmento Fc (empezando con los aminoácidos D-K-T-H en el extremo N de la región CH1, incluyendo las regiones de bisagra y CH2, y continuando a través de la secuencia S-P-G-K en la región CH3) fusionado a una de las proteínas indicadas anteriormente. Como ejemplo, las secuencias de nucleótidos que codifican la eritropoyetina (EPO) se fusionan a la molécula de unión a Fc.
Para obtener por ingeniería genética el vector de ADN que codifica el conjugado de proteína de fusión-molécula de unión a FcRn, el vector de expresión de mamíferos scFvE-sec (descrito en Persic, et al. GENE 187:1-8 1997) se linealizó con BssH2 y NotI y el plásmido linealizado se purificó en gel por protocolos convencionales en la técnica.
El ADN que codificaba la proteína a fusionar a Fc se preparó como se indica a continuación. Se retiró la secuencia EPO entera (de ratón) del vector de expresión (descrito en Bill et al., Biochem. Biophy. Acta 1261:35-43, 1995) por las enzimas de restricción BamH1 y Sal1 fuera del inserto de EPO. El fragmento linealizado se purificó en gel y se modificó por protocolos de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) convencionales y se añadió un sitio BssH2 adyacente al ADN que codificaba la primera alanina N-terminal de EPO de ratón (extremo 5'); el ADN que codificaba el extremo C-terminal de EPO de ratón se modificó con una secuencia correspondiente a un enlazador ala-ala-ala seguido de un sitio de restricción Sal1 (extremo 3'). El fragmento EPO después se cortó con BssH1 y Sal1 y se purificó en gel por protocolos convencionales en la técnica. El fragmento Fc se cortó con enzimas de restricción SalI y NotI y se purificó en gel.
Los tres ADN linealizados y purificados en gel descritos anteriormente, incluyendo el vector scfve-sec, el fragmento Fc y los ADN de EPO modificados se unieron en un solo vector circular por una unión triple usando protocolos convencionales en la técnica.
Debe indicarse que el ADN que codifica EPO puede reemplazarse por ADN que codifica cualquiera de las proteínas anteriores u otras proteínas de interés o fragmentos proteicos de las mismas por técnicas convencionales, para crear una proteína de fusión con Fc que conduzca a un conjugado. De manera similar, esta invención permite el reemplazo del ADN que codifica el fragmento Fc en el vector por ADN que codifica una molécula de unión a FcRn como se describe en este documento. Además, esta invención permite el reemplazo tanto del ADN que codifica EPO como del ADN que codifica el fragmento Fc de tal forma que el vector final de cómo resultado un conjugado que se asocia con el FcRn.
Para demostrar que un conjugado obtenido por la fusión de una molécula de unión a FcRn y una proteína de interés es capaz de retener la actividad biológica, se expresó la proteína del ejemplo anterior y se ensayó la actividad biológica de eritropoyetina de la siguiente manera. El vector de expresión de mamífero que contenía la fusión EPO-Fc se utilizó para transfectar células CHO (Células de Ovario de Hámster Chino) y se expresó por protocolos convencionales en la técnica. Se recogieron sobrenadantes de células CHO transfectadas o no transfectadas y se inyectaron por vía subcutánea en ratones BALB/c. Se obtuvieron recuentos de reticulocitos de ratones por análisis FACS de Coulter por técnicas conocidas en este campo de la técnica. Los resultados demostraron que los ratones a los que se les habían inyectado los sobrenadantes de las células transfectadas tenían cantidades de reticulocitos (eritrocitos inmaduros) varias veces mayores que los ratones a los que se les había inyectado el control (sobrenadantes no transfectados). Como se ha documentado que EPO estimula la producción de eritrocitos, los resultados descritos en este documento confirman la capacidad de la invención de sintetizar conjugados de moléculas de unión a FcRn biológicamente activos.
De manera similar, sería de esperar que las proteínas de fusión que sustituyeran el fragmento Fc por un dominio de molécula de unión a FcRn alternativo en el vector descrito anteriormente retuvieran la actividad biológica.
Las moléculas de unión a FcRn pueden conjugarse con una diversidad de agentes terapéuticos o fármacos para conseguir una liberación sistémica dirigida de sustancias biológicas. La presente invención se refiere a la liberación sistémica dirigida de compuestos hematológicos.
Como se usa en este documento, la expresión "sustancia biológicamente activa" se refiere a células eucariotas y procariotas, virus, vectores, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, polisacáridos y carbohidratos, lípidos, glicoproteínas y combinaciones de los mismos, y fármacos orgánicos e inorgánicos sintéticos que ejercen un efecto biológico cuando se administran a un animal. Para facilitar la referencia, la expresión también se usa para incluir compuestos detectables tales como compuestos radiopacos incluyendo aire y bario, y compuestos magnéticos. La sustancia activa puede ser soluble o insoluble en agua. Los ejemplos de sustancias biológicamente activas incluyen factores anti-angiogénesis, anticuerpos, factores de crecimiento, hormonas, enzimas y fármacos tales como esteroides, fármacos anticancerosos o antibióticos.
En realizaciones de diagnóstico, las moléculas de unión a FcRn también pueden conjugarse con un resto emisor de radiación gamma farmacéuticamente aceptable, incluyendo pero sin limitación indio y tecnecio, partículas magnéticas, materiales radiopacos tales como aire o bario y compuestos fluorescentes.
A modo de ejemplo, las siguientes clases de fármacos pueden conjugarse con moléculas de unión a FcRn para la liberación en barreras epiteliales:
Compuestos Antineoplásicos. Nitrosoureas, por ejemplo carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina; Metil-hidrazinas, por ejemplo, procarbazina, dacarbazina; hormonas esteroideas, por ejemplo, glucocorticoides, estrógenos, progestinas, andrógenos, tetrahidrodesoxicorticosterona, citoquinas y factores de crecimiento; Asparaginasa.
Compuestos Inmunoactivos. Inmunosupresores, por ejemplo, pirimetamina, trimetopterina, penicilamina, cicloaporina, azatioprina; inmunoestimuladores, por ejemplo, levamisol, ditiocarbamato de dietilo, encefalinas, endorfinas.
Compuestos Antimicrobianos. Antibióticos, por ejemplo, \beta-lactama, penicilina, cefalosporinas, carbapenems y monobactamas, inhibidores de \beta-lactamasa, aminoglicósidos, macrólidos, tetraciclinas, espectinomicina; Antimaláricos, Amebicidas, Antiprotozoarios, Antifúngicos, por ejemplo, anfotericina B, agentes Antivirales, por ejemplo, aciclovir, idoxuridina, ribavirina, trifluridina, vidarbina y ganciclovir.
Parasiticidas. Antihelmínticos, agentes radiofarmacéuticos y fármacos gastrointestinales.
Compuestos Hematológicos. Inmunoglobulinas; proteínas de la coagulación sanguínea; por ejemplo, factor antihemofílico, complejo de factor IX; anticoagulantes, por ejemplo, dicumarol, heparina Na; inhibidores de fibrolisina, ácido tranexámico.
Fármacos Cardiovasculares. Fármacos antiadrenérgicos periféricos, fármacos antihipertensivos de actuación central, por ejemplo, metildopa, metildopa HCl; vasodilatadores directos antihipertensivos, por ejemplo, diazóxido, hidralazina HCl; fármacos que afectan al sistema renina-angiotensina; vasodilatadores periféricos, fentolamina; fármacos antianginales; glicósidos cardiacos; inodilatadores; por ejemplo, amrinona, milrinona, enoximona, fenoximona, imazodan, sulmazol; antidisrítmicos; bloqueantes de la entrada de calcio; fármacos que afectan a los lípidos sanguíneos; ranitidina, bosentan, rezulín.
Fármacos Respiratorios. Fármacos simpatomiméticos: albuterol, mesilato de bitolterol, dobutamina HCl, dopamina HCl, efedrina SO, epinefrina, fenfluramina HCl, isoproterenol HCl, metoxamina HCl, bitartrato de norepinefrina, fenilefrina HCl, ritodrina HCl; fármacos colinomiméticos, por ejemplo, acetilcolina CI; anticolinesterasas, por ejemplo, edrofonio Cl; reactivadores de colinesterasa, fármacos bloqueantes adrenérgicos, por ejemplo, acebutolol HCl, atenolol, esmolol HCl, labetalol HCl, metoprolol, nadolol, mesilato de fentolamina, propanolol HCl; fármacos antimuscarínicos, por ejemplo, metilbromuro de anisotropina, atropina SO4, clinidio Br, glicopirrolato, ipratropio Br, escopolamina HBr.
Fármacos Bloqueantes Neuromusculares. Despolarizantes, por ejemplo, besilato de atracurio, hexafluorenio Br, yoduro de metocurina, succinilcolina Cl, tubocurarina Cl, vecuronio Br; relajantes musculares de actuación central, por ejemplo, baclofeno.
Neurotransmisores y Agentes neurotransmisores. Acetilcolina, adenosina, adenosina trifosfato, neurotransmisores de aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos excitadores, GABA, glicina; neurotransmisores de amina biogénicos, por ejemplo, dopamina, epinefrina, histamina, norepinefrina, octopamina, serotonina, tiramina; neuropéptidos, óxido nítrico, toxinas de canales de K+.
Fármacos contra el Parkinson. Amantidina HCl, mesilato de benztropina, por ejemplo, carbidopa.
Fármacos Diuréticos. Diclorfenamida, metazolamida, bendroflumetiazida y politiazida.
Fármacos Uterinos, Antimigraña. Carboprost trometamina, mesilato, y maleato de metilsergida.
Hormonas. Hormonas de la pituitaria, por ejemplo, gonadotropina coriónica, cosintropina, menotropinas, somatotropina, corticotropina, protirelina, tirotropina, vasopresina, lipresina; hormonas adrenales, por ejemplo, dipropionato de beclometasona, betametasona, dexametasona, triamcinolona; hormonas pancreáticas, por ejemplo, glucagón, insulina; hormona paratiroidea, por ejemplo, dihidrocolesterol; hormonas tiroideas, por ejemplo etidronato de calcitonina disódico, levotiroxina Na, liotironina Na, liotrix, tiroglobulina, acetato de teriparatida, fármacos antitiroides; hormonas estrogénicas; progestinas y antagonistas, anticonceptivos hormonales, hormonas testiculares; hormonas gastrointestinales: colecistoquinina, enteroglicano, galanina, polipéptido inhibidor gástrico, factor de crecimiento epidérmico-urogastrona, polipéptido inhibidor gástrico, péptido de liberación de gastrina, gastrinas, pentagastrina, tetragastrina, motilina, péptido YY, secretina, péptido intestinal vasoactivo, sincalida.
Enzimas. Hialuronidasa, estreptoquinasa, activador de plasminógeno tisular, uroquinasa, PGE-adenosina desaminasa.
Anestésicos Intravenosos Droperidol, etomidato, citrato de fetanilo/droperidol, hexobarbital, ketamina HCl, metohexital Na, tiamilal Na, tiopental Na.
Antiepilépticos. Carbamazepina, clonazepam, divalproex Na, etosuximida, mefenitoína, parametadiona, fenitoína, primidona.
Péptidos y proteínas. Las moléculas de unión a FcRn pueden conjugarse con péptidos o polipéptidos, por ejemplo, anquirinas, arrestinas, proteínas de la membrana bacteriana, clatrina, conexinas, distrofina, receptor de endotelina, espectrina, selectina, citoquinas; quimioquinas; factores de crecimiento, insulina, eritropoyetina (EPO), factor de necrosis tumoral (TNF), neuropéptidos, neuropéptido Y, neurotensina, factor de crecimiento de transformación \alpha, factor de crecimiento de transformación \beta, interferón (IFN), y hormonas, inhibidores de crecimiento, por ejemplo, genisteína, esteroides etc.; glicoproteínas, por ejemplo, transportadores de ABC, glicoproteínas plaquetarias, complejo GPIb-IX, complejo GPIIb-IIIa, vitronectina, trombomodulina, CD4, CD55, CD58, CD59, CD44, antígeno asociado a la función de linfocitos, molécula de adhesión intercelular, molécula de adhesión de células vasculares, Thy-1, antiportadores, antígeno CA-15-3, fibronectinas, laminina, glicoproteína asociada a mielina, GAP, GAP-43. En esta realización de la presente invención, los agentes terapéuticos polipeptídicos pueden conjugarse covalentemente con la molécula de unión a FcRn o la molécula de unión a FcRn y el agente terapéutico pueden expresarse como una proteína de fusión usando técnicas de ingeniería genética recombinantes convencionales.
Citoquinas y Receptores de Citoquinas. Los ejemplos de citoquinas y sus receptores que pueden liberarse por medio de una molécula de unión a FcRn o un conjugado con una molécula de unión a FcRn de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin limitación: interleuquina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, receptor de IL-1, receptor de IL-2, receptor de IL-3, receptor de IL-4, receptor de IL-5, receptor de IL-6, receptor de IL-7, receptor de IL-8, receptor de IL-9, receptor de IL-10, receptor de IL-11, receptor de IL-12, receptor de IL-13, receptor de IL-14, receptor de IL-15, receptor de IL-16, receptor de IL-17, receptor de IL-18, factor inhibidor de linfoquinas, factor estimulador de colonias de macrófagos, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de células madre, factor de crecimiento tumoral \beta, factor de necrosis tumoral, linfotoxina, Fas, factor estimulador de colonias de granulocitos, factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos, interferón \alpha, interferón \beta e interferón \gamma.
Factores de Crecimiento y Hormonas Proteicas. Los ejemplos de factores de crecimiento y sus receptores y hormonas proteicas y sus receptores que pueden liberarse por medio de una molécula de unión a FcRn o un conjugado con una molécula de unión a FcRn de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin limitación: eritropoyetina, angiogenina, factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento tumoral \alpha, trombopoyetina, factor estimulador de tiroides, hormona de liberación tiroidea, neurotrofina, factor de crecimiento epidérmico, VEGF, factor neurotrófico ciliar, LDL, somatomedina, factor de crecimiento de insulina, y factor de crecimiento semejante a insulina I y II.
Quimioquinas. Los ejemplos de quimioquinas y sus receptores que pueden liberarse por medio de una molécula de unión a FcRn o un conjugado con una molécula de unión a FcRn de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin limitación: ENA-78, ELC, GRO-\alpha, GRO-\beta, GRO-\gamma, HRG, LIF, IP-10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, MIG, MDC, NT-3, NT-4, SCF, LIF, leptina, RANTES, linfotactina, eotaxina-1, eotaxina-2, TARC, TECK, WAP-1, WAP-2, GCP-1, GCP-2, receptores de quimioquina \alpha: CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7, receptores de quimioquina \beta: CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6 y CCR7.
Agentes Quimioterapéuticos. Las moléculas de unión a FcRn pueden conjugarse con agentes para quimioterapia o agentes antitumorales que son eficaces contra diversos tipos de canceres humanos, incluyendo leucemia, linfomas, carcinomas, sarcomas, mielomas, etc., tales como doxorubicina, mitomicina, cisplatino, daunorubicina, bleomicina, actinomicina D, neocarcinostatina.
Anticuerpos. Las moléculas de unión a FcRn de la presente invención pueden conjugarse con anticuerpos que incluyen, pero sin limitación: (a) anti-grupos de antígenos de diferenciación CD-1 a CD-166 y los ligandos o contra-receptores para estas moléculas; (b) anticuerpos anti-citoquina, por ejemplo, anti-IL1 a anti-IL18 y los receptores para estas moléculas; (c) anticuerpos anti-receptores inmunes, anticuerpos contra receptores de células T, complejos de histocompatibilidad principal I y II, receptores de células B, receptores inhibidores de destructores de selectina, receptores activadores de destructores, OX-40, MadCAM-1, Gly-CAM1, integrinas, cadherinas, sialoadherens, Pas, CTLA-4, receptores Fc\gamma, receptores Fc\alpha, receptores Fc\varepsilon, receptores Fc\mu y sus ligandos; (d) anticuerpos anti-metaloproteinasa, por ejemplo, colagenasa, MMP-1 a MMP-8, TIMP-1, TIMP-2; moléculas contra la lisis celular/proinflamatorias, por ejemplo, perforina, componentes del complemento, prostanoides, óxido nitroso, tromboxanos; y (e) anticuerpos contra moléculas de adhesión, por ejemplo, antígenos carcinoembrionarios, lamininas, fibronectinas.
Agentes Antivirales. Las moléculas de unión a FcRn pueden conjugarse con agentes antivirales tales como inhibidores de la transcriptasa inversa y análogos de nucleósido, por ejemplo, ddl, ddC, 3TC, ddA, AZT; inhibidores de proteasa, por ejemplo, Invirase, ABT-538; inhibidores del procesamiento de ARN, por ejemplo, ribavirina.
Los ejemplos específicos de agentes terapéuticos conocidos que pueden liberarse por medio de una molécula de unión a FcRn incluyen, pero sin limitación:
(a) Capoten, Monopril, Pravachol, Avapro, Plavix, Cefzil, Duricef/Ultracef, Azactam, Videx, Zerit, Maxipime, VePesid, Paraplatin, Platinol, Taxol, UFT, Buspar, Serzone, Stadol NS, Estrace, Glucophage (Bristol-Myers Squibb);
(b) Ceclor, Lorabid, Dynabac, Prozac, Darvon, Permax, Zyprexa, Humalog, Axid, Gemzar, Evista (Eli Lily);
(c) Vasotec/Vaseretic, Mavacor, Zocor, Prinivil/Prinizide, Plendil, Cozaar/Hyzaar, Pepcid, Pcilosec, Primaxin, Noroxin, Recombivax HB, Varivax, Timoptic/XE, Trusopt, Proscars Fosamax, Sinemet, Crixivan, Propecia, Vioxx, Singulair, Maxalt, Ivermectin (Merck & Co.);
(d) Diflucan, Unasyn, Sulperazon, Zithromax, Trovan, Procardia XL, Cardura, Norvasc, Dofetilide, Feldene, Zoloft, Zeldox, Glucotrol XL, Zyrtec, Eletriptan, Viagra, Droloxifene, Aricept, Lipitor (Pfizer);
(e) Vantin, Rescriptor, Vistide, Genotropin, Micronase/Glyn./Glyb., Fragmin, Total Medrol, Xanax/alprazolam, Sermion, Halcion/triazolam, Freedox, Dostinex, Edronax, Mirapex, Pharmorubicin, Adriamycin, Camptosar, Remisar, Depo-Provera, Caverject, Detrusitol, Estring, Healon, Xalatan, Rogaine (Pharmacia & Upjohn);
(f) Lopid, Accrupil, Dilantin, Cognex, Neurontin, Loestrin, Dilzem, Fempatch, Estrostep, Rezulin, Lipitor, Omnicef, FemHRT, Suramin, Clinafloxacin (Warner Lambert).
Otros ejemplos de agentes terapéuticos que pueden liberarse por medio de las moléculas de unión a FcRn de la presente invención pueden encontrarse en: Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. 9ª ed. McGraw-Hill 1996.
Cuando se administran, los conjugados se administran en preparaciones farmacéuticamente aceptables. Estas preparaciones pueden contener rutinariamente concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes tamponantes, conservantes, vehículos compatibles, agentes potenciadores del sistema inmune complementarios tales como adyuvantes y citoquinas, y opcionalmente otros agentes terapéuticos. De esta manera, se contemplan "cócteles" que incluyen los conjugados y los agentes. Los propios agentes pueden conjugarse con moléculas de unión a FcRn para mejorar la liberación de los agentes a través de las barreras epiteliales.
Los conjugados pueden administrarse en una forma purificada o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Cuando se usan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables, pero convenientemente pueden usarse sales que no sean farmacéuticamente aceptables para preparar sales farmacéuticamente aceptables y no se excluyen del alcance de la invención. Estas sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, las preparadas a partir de los siguientes ácidos: ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-tolueno sulfónico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftaleno-2-sulfónico y benceno sulfónico. Además, pueden prepararse sales farmacéuticamente aceptables como sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, tales como sales de sodio, potasio o calcio del grupo de ácido carboxílico.
Los agentes tamponantes adecuados incluyen: ácido acético y una sal (1-2% P/V); ácido cítrico y una sal (1-3% P/V); ácido bórico y una sal (0,5-25,0% P/V); bicarbonato sódico (0,5-1,0% P/V); y ácido fosfórico y una sal (0,8-2% P/V). Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio (0,003-0,03% P/V); clotubutanol (0,3-0,9% P/V); parabenos (0,01-0,25% P/V) y tiomerosal (0,004-0,02% P/V).
El término "soporte", como se usa en este documento y como se describe con más detalle más adelante, significa una o más cargas sólidas o líquidas, diluyentes o sustancias de encapsulación que son adecuados para la administración a un ser humano o a otro mamífero. El "soporte" puede ser un ingrediente órgano o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el ingrediente activo para facilitar la administración.
Los componentes de las composiciones farmacéuticas pueden mezclarse con los conjugados de la presente invención, y entre sí, de tal manera que no haya ninguna interacción que perjudique sustancialmente a la eficacia farmacéutica deseada. Los componentes de las formulaciones de fármacos orales incluyen diluyentes, aglutinantes, lubricantes, deslizantes, disgregantes, agentes colorantes y agentes aromatizantes. Las sustancias de encapsulación para la preparación de formulaciones orales con recubrimiento entérico incluyen acetato ftalato de celulosa, acetato ftalato de polivinilo, ftalato de hidroxipropil metilcelulosa y copolímeros de éster de ácido metacrílico. Se prefieren formulaciones sólidas orales tales como cápsulas o comprimidos. Los elixires y jarabes también son formulaciones orales bien conocidas. Los componentes de las formulaciones de aerosol incluyen ingredientes activos solubilizados, antioxidantes, mezclas de disolventes y propulsores para las formulaciones en solución, e ingredientes activos micronizados y suspendidos, agentes de dispersión y propulsores para formulaciones de suspensión. Las formulaciones orales, de aerosol y nasales de la invención pueden distinguirse de las preparaciones inyectables de la técnica anterior porque estas formulaciones pueden ser no asépticas, mientras que las preparaciones inyectables deben ser asépticas.
El término "adyuvante" pretende incluir cualquier sustancia que se incorpora o se administra simultáneamente con los conjugados y que potencia de forma no específica la respuesta inmune en el sujeto. Los adyuvantes incluyen compuestos de aluminio, por ejemplo, geles, hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, y adyuvante completo o incompleto de Freund (en el que el conjugado se incorpora en la fase acuosa de agua estabilizada en una emulsión de aceite de parafina). El aceite de parafina puede reemplazarse por diferentes tipos de aceites, por ejemplo, escualeno o aceite de cacahuete. Otros materiales con propiedades adyuvantes incluyen BCG (Mycobacterium tuberculosis atenuado), fosfato cálcico, levamisol, isoprinosina, polianiones (por ejemplo, poli A:U) leutinan, toxinan pertussis, toxina colérica, lípido A, saponinas y péptidos, por ejemplo, muramil dipéptido. También pueden usarse como adyuvantes sales de tierras raras, por ejemplo, lantano y cerio. La cantidad de adyuvante depende del sujeto y del conjugado particular usado y puede determinarse fácilmente por un especialista en la técnica sin experimentación
indebida.
Junto con los conjugados pueden liberarse otros agentes potenciadores del sistema inmune complementarios, tales como citoquinas. Las citoquinas contempladas son las que mejoran los efectos beneficiosos que resultan de la administración de los inmunomoduladores de acuerdo con la invención. Las citoquinas son factores que ayudan al crecimiento y maduración de las células, incluyendo los linfocitos. Se cree que la adición de citoquinas aumentará la actividad de las citoquinas estimulada in vivo realizando los métodos descritos en este documento. Las citoquinas preferidas son interleuquina (IL)-1, IL-2, interferón gamma y factor de necrosis tumoral \alpha. Se cree que otras citoquinas útiles son IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, eritropoyetina, factor inhibidor de leucemia, oncostatina-M, factor neurotrófico ciliar, hormona de crecimiento, prolactina, CD40-ligando, CD27-ligando, CD30-ligando, interferón alfa, interferón beta y factor de necrosis tumoral \beta. Otras citoquinas que se sabe que modulan la actividad de las células T de una manera que probablemente sea útil de acuerdo con la invención son factores estimuladores de colonias y factores de crecimiento, incluyendo factores estimuladores de granulocitos y/o macrófagos (GM-CSF, G-CSF y CSF-1) y factor de crecimiento derivado de plaquetas, epidérmico, semejante a insulina, de transformación y de fibroblastos. La selección de las citoquinas particulares dependerá de la modulación particular del sistema inmune que se desee. La actividad de las citoquinas sobre tipos celulares particulares es conocida por los especialistas habituales en la técnica.
Las cantidades precisas de las citoquinas anteriores usadas dependerán de una diversidad de factores, incluyendo el conjugado seleccionado, la dosis y la programación de dosificación seleccionada, el modo de administración y las características del sujeto. Las cantidades precisas seleccionadas pueden determinarse sin experimentación indebida, particularmente ya que una cantidad umbral será cualquier cantidad que mejore la respuesta inmune deseada. De esta manera, se cree que son útiles cantidades de nanogramos a miligramos, dependiendo del modo de liberación, pero que es probable que las cantidades de nanogramo a microgramo sean las más útiles debido a que los niveles fisiológicos de las citoquinas son correspondientemente bajos.
Las preparaciones se administran en cantidades eficaces. Una cantidad eficaz es la cantidad de un conjugado que solo, o junto con dosis adicionales, estimula una respuesta inmune deseada. Esto puede implicar la estimulación de una respuesta humoral de anticuerpos que ocasiona un aumento en la titulación de anticuerpos en suero, una inmunidad mucosa mejorada, una expansión clonal de linfocitos T citotóxicos o tolerancia a un antígeno, incluyendo un autoantígeno. Se cree que serán eficaces dosis que varían de un nanogramo/kilogramo a 100 miligramos/kilogramo, dependiendo del modo de administración. Se considera que el intervalo preferido está comprendido entre aproximadamente 500 nanogramos y 500 microgramos/kilogramo, y más preferiblemente entre 1 microgramo y 100 microgramos/kilogramo. La cantidad absoluta dependerá de una diversidad de factores, incluyendo el conjugado seleccionado, la modulación inmune deseada, si la administración está en una sola dosis o en múltiples dosis y parámetros individuales del paciente que incluyen la edad, el estado físico, las dimensiones y el peso. Para el tratamiento de un sujeto con un tumor, deben tenerse en cuenta el tamaño, tipo, localización y metástasis del tumor cuando se determina la cantidad de conjugado a administrar. Estos factores son bien conocidos por los especialistas habituales en la técnica y pueden conseguirse sin más que una experimentación rutinaria.
Se dispone de una diversidad de vías de administración. El modo particular seleccionado dependerá, por supuesto, del conjugado particular seleccionado, la afección particular que se vaya a tratar y la dosificación requerida para la eficacia terapéutica. Los métodos implican suministrar los conjugados de la invención a una superficie epitelial. Los modos de administración preferidos son oral, intrapulmonar, intrabiliar e intranasal.
Las composiciones pueden presentarse convenientemente en una forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar el conjugado con un vehículo que constituye uno o más ingredientes auxiliares. En general, las composiciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el conjugado con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido o ambos, y después si es necesario dando forma al producto.
Otros sistemas de liberación pueden incluir la liberación a lo largo del tiempo, la liberación retardada o los sistemas de liberación sostenida. Estos sistemas pueden evitar administraciones repetidas de los conjugados de la invención, aumentando la conveniencia para el sujeto y el médico. Se dispone de muchos tipos de sistemas de liberación y son conocidos por los especialistas habituales en la técnica. Incluyen sistemas basados en polímeros tales como ácido poliláctico y poliglicólico, polianhídridos y policaprolactona; recubrimientos de cera, comprimidos obtenidos por compresión usando aglutinantes y excipientes convencionales y similares. Se conocen sistemas poliméricos bioadhesivos para mejorar la liberación de un material en el epitelio intestinal y se describen en la publicación de la solicitud PCT WO 93/21906. También se describen cápsulas para liberar agentes en el epitelio intestinal en la publicación de la solicitud PCT WO 93/19660.
La formulación farmacéutica de la invención contiene el conjugado de molécula de unión a FcRn como ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado para la administración y liberación in vivo. En realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se formulan para administración oral, sublingual, bucal, intranasal y por inhalación.
Cuando se administran, los conjugados de la presente invención se administran en preparaciones farmacéuticamente aceptables. Estas preparaciones pueden contener rutinariamente concentraciones farmacéuticamente aceptables de sales, agentes tamponantes, conservantes, vehículos compatibles, agentes potenciadores del sistema inmune complementarios tales como adyuvantes y citoquinas, y opcionalmente otros agentes terapéuticos. De esta manera, se contemplan los "cócteles", incluyendo los conjugados y los agentes. Los propios agentes pueden conjugarse con moléculas de unión a FcRn para mejorar la liberación de los agentes a través de las barreras epiteliales.
La cantidad preferida de conjugados de molécula de unión a FcRn en todas las preparaciones farmacéuticas obtenidas de acuerdo con la presente invención debe ser una cantidad terapéuticamente eficaz que también sea una cantidad médicamente aceptable. Los niveles de dosificación reales de los conjugados de molécula de unión a FcRn en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad de conjugados de molécula de unión a FcRn que sea eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, para la composición farmacéutica de conjugados de molécula de unión a FcRn particular y para el modo de administración particular, sin que sea tóxico para el paciente.
El nivel de dosificación seleccionado y la frecuencia de administración dependerán de una diversidad de factores que incluyen la vía de administración, el momento de administración, la velocidad de excreción del agente o agentes terapéuticos incluyendo los conjugados de molécula de unión a FcRn, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con los conjugados de molécula de unión a FcRn, la edad, sexo, peso, estado, salud general e historia médica previa del paciente a tratar y factores similares bien conocidos en la técnica médica. Por ejemplo, es probable que el régimen de dosificación varíe en caso de mujeres embarazadas, madres en periodo de lactancia y niños, con respecto a adultos sanos.
Un médico con experiencia habitual en la técnica puede determinar fácilmente y recetar la cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico puede empezar con dosis de conjugados de molécula de unión a FcRn empleados en la composición farmacéutica de la presente invención a niveles menores que el necesario para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se consiga el efecto deseado.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención, particularmente las moléculas de unión a FcRn conjugadas con un compuesto hematológico como agente activo, son adecuadas preferiblemente para administración oral, sublingual e intranasal. Las composiciones farmacéuticas son adecuadas para la liberación de los conjugados de molécula de unión a FcRn en barreras epiteliales. Las composiciones farmacéuticas también pueden formularse para ser adecuadas para la liberación parenteral, transdérmica, intradérmica e intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas que contienen conjugados de molécula de unión a FcRn biológicamente activos como agente activo, que son adecuadas para la liberación transmucosa a través de la cavidad oral están en forma de un sólido como comprimidos linguales, bucales o sublinguales, pudiendo usarse también trociscos (grageas), polvos, gránulos de liberación a lo largo del tiempo, píldoras o similares, o en forma de un líquido como una gota o gotas líquidas, pulverización de aerosol o niebla, aplicadas por vía sublingual (debajo de la lengua) o encima de la lengua, o por vía bucal (entre el carrillo y la encía). La velocidad de absorción de la membrana mucosa oral de los conjugados de molécula de unión a FcRn se controla por la formulación de dosificación líquida o sólida específica seleccionada. Las formulaciones específicas permiten que tenga lugar el proceso de absorción durante un periodo de tiempo sostenido pero relativamente corto, permitiendo una acumulación gradual y un nivel sanguíneo constante de los conjugados de molécula de unión a FcRn.
Para la liberación prolongada, el ingrediente activo puede formularse como una preparación de depósito, para administración por implantación; por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica o intramuscular. De esta manera, por ejemplo, el ingrediente activo puede formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles; por ejemplo, como una sal poco soluble del conjugado de molécula de unión a FcRn.
Para administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o cápsulas preparados por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrógeno fosfato cálcico); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o almidón glicolato sódico); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato sódico). Los comprimidos pueden recubrirse por métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para reconstituirse con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Estas preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tamponantes, agentes aromatizantes, colorantes y edulcorantes cuando sea apropiado. Las preparaciones para administración oral pueden formularse convenientemente para proporcionar la liberación controlada del compuesto activo. A modo de ejemplo, pero no de limitación, las moléculas de unión a FcRn pueden conjugarse con los siguientes agentes terapéuticos para la liberación dirigida a la barrera epitelial:
Para administración bucal o sublingual, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o grageas formuladas de una manera convencional. Para las vías de administración rectal y vaginal, el ingrediente activo puede formularse como soluciones (para enemas de retención), supositorios o pomadas.
Para la administración por inhalación, el ingrediente activo puede suministrarse convenientemente en forma de una presentación de pulverización de aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para liberar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para uso en un inhalado o insuflador, que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Si se desea, las composiciones pueden presentarse en un envase o dispositivo distribuidor que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El envase puede comprender, por ejemplo, una lámina metálica o de plástico, tal como un blister. El envase o dispositivo distribuidor puede ir acompañado de instrucciones para la administración.
Ejemplos Materiales Abreviaturas
BSA, albúmina de suero bovino; ADNc ácido desoxirribonucleico complementario; CT-B, subunidad B de la toxina colérica; DMEM, medio de Eagle modificado por Dulbecco; DMSO, dimetilsulfóxido; DOC, desoxicolato; ECL, quimioluminiscencia potenciada; ELISA, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima; HBSS, solución salina equilibrada de Hank sin calcio o magnesio; HEPES, N-[2-hidroxietil]piperazina-N'-[2-ácido etanosulfónico]; hGH, hormona de crecimiento humana; IEC, células del epitelio intestinal; KI, yoduro potásico; MHC complejo de histocompatibilidad principal; NaOH, hidróxido sódico; NH_{4}Cl, cloruro amónico; NHS-rodamina, N-hidroxisuccinimidil-rodamina; ARN, ácido ribonucleico; RT-PCR transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa; SATA, S-acetiltioacetato de N-succinimidilo; SDS-PAGE, electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida; sulfo-LC-SPDP, 6-[3-(2-piridilditio)propionamida] hexanoato de sulfosuccinidimilo; sulfo-NHS-biotina, sulfosuccinimidobiotina; sulfo-SMCC, 4-(N-maleimidometil) ciclo-hexano-1-carboxilato de sulfosuccinidimilo.
Agentes Químicos
Los Kits cDNA Cycle se adquirieron en Invitrogen (San Diego, CA). La Taq polimerasa se adquirió en Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT). Los Kits CircumVent^{TM} se adquirieron en New England Biolabs (Beverly, MA). Los radionucleótidos y los agentes químicos radiactivos se adquirieron en DuPont/NEN (Boston, MA). El HBSS y DMEM se adquirieron en GIBCO/Life Technologies (Gaithersburg, MD). El RPMI 1640 se adquirió en Cellgro (Herndon, VA). La L-glutamina se adquirió en Cellgro. La proteína A-Sepharose se adquirió en Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). La Estreptavidina-peroxidasa de rábano picante, sulfo-LC-SPDP, sulfo-NHS-biotina, sulfo-SMGC, SATA y ficina inmovilizada se adquirieron en Pierce (Rockford, IL). Los ratones BALB/c se adquirieron en Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Los kits ECL se adquirieron en Amersham (Arlington Heights, IL). La plasmina, AvidChrom-proteína A, proteína G-Sepharose, BSA, subunidad B de la toxina colérica, anticuerpos anti-hGH y todos los demás agentes químicos se adquirieron en Sigma (St. Louis, MO).
Ejemplo 1 Expresión de ARNm de FcRn en Células Primarias y Líneas Celulares de Epitelio Intestinal Humano
Se extrajo ARN total a partir de enterocitos de ser humano adulto por una metodología convencional bien conocida en la técnica (Sambrook et al., ibid.). Se usó un microgramo de ARN de cada tipo celular como plantilla para preparar el sustrato de ADNc para la transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) usando un Kit cDNA Cycle (invitrogen, San Diego, CA). Se realizaron treinta ciclos de PCR sobre el ADNc usando Taq polimerasa (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando los cebadores TGCTGGGCTGT
GAACTG y CGCTTTTAGCAGTCGGAA. Las condiciones de los ciclos de PCR fueron: desnaturalización a 94ºC durante un minuto, templado a 55ºC durante dos minutos y extensión a 72ºC durante tres minutos. Los productos de amplificación se resolvieron por electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio, que mostró la presencia del producto de amplificación esperado de aproximadamente 800 pares de bases en todas las muestras excepto en las células epiteliales colónicas adultas. Para confirmar la identidad del producto de amplificación de RT-PCR, la banda de ADN se escindió del gel de agarosa, se subclonó en pCR 11 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se secuenció usando un kit de secuenciación de ciclos con terminador Prismdye-desoxi (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando cebadores tanto del vector como de la secuencia de FcRn humana. Los productos de reacción se analizaron en un secuenciador Applied Biosystems. La secuencia de los productos de amplificación correspondía exactamente con la secuencia del gen de FcRn, confirmando la identidad del gen expresado.
Ejemplo 2 Detección del ARNm de FcRn por Transferencia de Northern
Para confirmar la expresión de FcRn en células y líneas celulares de epitelio intestinal humano, se preparó una transferencia de Northern usando las muestras de ARN preparadas como se describe en el Ejemplo 1 a partir de enterocitos de humano adulto, y a partir de dos líneas celulares de adenocarcinoma humano de origen colónico, Caco-2 y HT-29. Las muestras de ARN se resolvieron por electroforesis en gel de agarosa/formaldehído y se transfirieron a una membrana de nylon por procedimientos convencionales (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989). La membrana se sondeó usando una sonda de 120 pares de bases radiomarcada con ^{32}P procedente de la región 3' no traducida de FcRn por métodos convencionales. Los autorradiogramas de la transferencia de Northern demostraron la presencia del transcrito de hFcRn de 1,5 kilobases en los enterocitos y en las dos líneas celulares. Por lo tanto, la expresión de FcRn en células y líneas celulares de epitelio intestinal de humano adulto se demostró por dos métodos diferentes de detección de ARN.
Ejemplo 3 Marcaje e Inmunoprecipitación del Receptor Fc Relacionado con el MHC de Clase I (FcRn) en Células de Epitelio Intestinal
La expresión de FcRn en células de epitelio intestinal humano se confirmó por inmunoprecipitación de la proteína. Se marcaron células Caco-2 metabólicamente usando IIS-metionina (DuPont/NEN, Boston, MA) y se extrajeron las proteínas por métodos bien conocidos en la técnica (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual). Se usó un antisuero policlonal de conejo específico anti-cadena pesada de FcR relacionado con el MHC de clase I de rata unido a proteína A-Sepharose para inmunoprecipitar FcRn de los extractos celulares usando métodos convencionales (FcRn puede purificarse por métodos bien establecidos, Simister y Rees 1985, European J. Immunology, 15:733-8, y usarse para inmunizar ratas, seguido de la extracción de suero, Harlow y Lane, supra.). Los inmunoprecipitados se resolvieron por SDS-PAGE y se visualizaron por autorradiografía. Se observó una proteína FcRn de 48 kilodalton, confirmando la expresión observada a nivel del ARN.
Ejemplo 4 Expresión de la Proteína FcRn sobre la Superficie Celular de Células de Epitelio Intestinal Humano
Se separaron aproximadamente 3 x 10^{7} células de epitelio intestinal HT-29 de placas de cultivo de tejidos por métodos no enzimáticos y se lavaron cuatro veces con solución salina equilibrada de Hank enfriada con hielo que no contenía calcio ni magnesio (HBSS-, GIBCO/Life Technologies, Gaithersburg, MD). Para marcar las proteínas de la superficie celular, las células lavadas se incubaron dos veces durante 20 minutos con 1,5 ml de sulfo-NHS-biotina a una concentración de 0,5 mg/ml (Pierce, Rockford, IL) en DMSO. Las células marcadas se lavaron cinco veces con NH_{4}Cl 50 mM, se incubaron 20 minutos con 10 ml de RPMI 1640 (Cellgro, City, State) que contenía L-glutamina 1 mM (Mediatech, Washington, DC) y se lavaron cuatro veces con HBSS.
Las células se lisaron, después se preaclararon durante una noche con perlas de proteína A-Sepharose (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) usando técnicas convencionales bien conocidas en la técnica. Se añadieron SDS y ácido desoxicólico (DOC) a los sobrenadantes a concentraciones finales de 0,1% y 0,5% respectivamente. Los lisados se preaclararon con suero de conejo normal y se inmunoprecipitaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-FcR relacionado con el MHC de clase I de rata por métodos bien conocidos en la técnica. Los inmunoprecipitados se resolvieron por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa se procesó para incubación con estreptavidina-peroxidasa de rábano picante diluida 1:10.000 (Pierce, Rockford IL) como recomienda el fabricante. La membrana después se procesó para la detección de la peroxidasa de rábano picante unida usando un kit ECL (Amersham, Arlington Heights, IL). La luz emitida por la escisión del sustrato quimioluminiscente se detectó por exposición de la membrana a una película sensible a la luz. Las exposiciones de la película demostraron que FcRn se expresaba en la superficie de células de epitelio intestinal HT-29.
Ejemplo 5 Actividad Funcional de FcRn Humano sobre la Superficie Celular de Células de Epitelio Intestinal
Para demostrar que el FcRn expresado en la superficie celular de células de epitelio intestinal era funcional, se ensayaron células Caco-2 y células de epitelio intestinal de yeyuno de adulto humano (IEC) con respecto a la capacidad de unirse al fragmento Fc de anticuerpo. Se distribuyeron células Caco-2 e IEC de yeyuno en tubos de microcentrífuga (2 x 10^{6} células por tubo) y se centrifugaron a 2000 rpm durante 2-3 minutos a 4ºC. Los sedimentos celulares se lavaron una vez en DMBM que contenía HEPES 20 mM, pH 6,0 o pH 8,0 a 4ºC y se resuspendieron en 0,2 ml del mismo medio. Las suspensiones celulares se transfirieron a placas de 12 pocillos para el ensayo. A cada pocillo se le añadió ^{125}I-fragmento Fc (200 ng/ml, 4 x 10^{-9} M) en DMEM que contenía HEPES 20 mM, KI 1,0 mM y gelatina de pescado al 0,1%, pH 6,0 o pH 8,0 con o sin IgG humana no marcada a 0,5 mg/ml (3,3 x 10^{-6}). Se dejó que las células se unieran a IgG o Fc a 37ºC durante dos horas en una atmósfera humidificada con 5% de CO_{2}. Las células se transfirieron a tubos de microcentrífuga y se sedimentaron a 2000 rpm durante 2-3 minutos a 4ºC. Se retiró el ^{125}I-Fc no unido lavando los sedimentos celulares una vez con DMEM frío que contenía HEPES 20 mM, pH 6,0 o pH 8,0 a 4ºC. Las células se rompieron en 0,5 ml de NaOH 0,1 M y la solución resultante se transfirió a viales de centelleo. Se cuantificó el ^{125}I usando un contador gamma CliniGamma 1272 (LKB Wallac, Piscataway, NJ). Tanto las células Caco-2 como las IEC de yeyuno de adulto humano de unían específicamente a ^{125}I-Fc a pH 6,0 pero no a pH 8,0, lo que demuestra una unión funcional dependiente del pH como se observa en el caso de FcRn de ratas recién nacidas y FcRn humano clonado (Story et al., J. Exp. Med. 180:2377-2381; diciembre de 1994).
Ejemplo 6 Preparación de Inmunoglobulina G Humana
Puede adquirirse inmunoglobulina G purificada no específica procedente de ser humano, ratón, rata, cabra, cerdo, vaca y otras especies en vendedores comerciales tales como Sigma Chemical Co., Pierce Chemical, HyClone Laboratories, ICNI Biomedicals y Organon Teknika-Cappel.
La inmunoglobulina G también puede aislarse por precipitación con sulfato amónico de suero sanguíneo. El precipitado proteico se fracciona adicionalmente por cromatografía de intercambio iónico o exclusión molecular, para aislar la IgG no específica sustancialmente purificada. Por IgG no específica se entiende que no es dominante ninguna especificidad individual dentro de la población o grupo de anticuerpos.
La inmunoglobulina G también puede purificarse a partir de suero sanguíneo por adsorción en proteína A unida a un soporte sólido tal como proteína A-Sepharose (Pharmacia), AvidChrom-Proteína A (Sigma) o proteína G-Sepharose (Sigma). Otros métodos de purificación de IgG son bien conocidos para las personas especialistas en la técnica y pueden usarse para aislar la IgG no específica.
Ejemplo 7 Preparación de Inmunoglobulina G Humana
Para preparar los fragmentos Fc de IgG humana, se somete IgG aislada como en el Ejemplo 6 a digestión con papaína inmovilizada (Pierce) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Los especialistas en la técnica conocen otras proteasas que digieren IgG para producir fragmentos Fc intactos que pueden unirse a receptores Fc, por ejemplo, plasmina (Sigma) o ficina inmovilizada (Pierce) y pueden usarlas para preparar fragmentos Fc. La inmunoglobulina digerida después se incuba con una matriz de afinidad tal como proteína A-Sepharose o proteína G-Sepharose. Las porciones que no se unen de IgG se eluyen de la matriz de afinidad por un lavado abundante en formato de lotes o de columna. Los fragmentos Fc de IgG después de eluyen por medio de la adición de un tampón que es incompatible con la unión al adsorbente de Fc. También pueden emplearse otras metodologías eficaces en la purificación de fragmentos Fc.
Ejemplo 8 Conjugación de Compuestos a Fragmentos Fc de Inmunoglobulina Humana
Para liberar compuestos a través del mecanismo de transporte de FcRn, estos compuestos pueden acoplarse a IgG entera o a fragmentos Fc. La química de entrecruzamiento y los reactivos eficaces para estos fines son bien conocidos en la técnica. La naturaleza del reactivo de entrecruzamiento usado para conjugar la IgG entera o fragmentos Fc y el compuesto a liberar no se restringe por la invención. Puede usarse cualquier agente de entrecruzamiento siempre que a) se retenga la actividad del compuesto y b) no se vea afectada de forma adversa la unión por el FcRn de la porción Fc del conjugado.
Un ejemplo de un entrecruzamiento eficaz de una etapa de Fc y un compuesto es la oxidación de Fc con peryodato sódico en tampón fosfato sódico durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de la incubación durante una noche a 4ºC con el compuesto a conjugar. La conjugación también puede realizarse modificando tanto el compuesto como los fragmentos Fc con 6-[3-(2-piridilditio)propionamida)hexanoato de sulfosuccinimidilo (sulfo-LC-SPDP, Pierce) durante 18 horas a temperatura ambiente. También pueden prepararse conjugados modificando fragmentos Fc y el compuesto deseado a liberar con diferentes reactivos de entrecruzamiento que posteriormente formen un enlace covalente. Un ejemplo de esta reacción es la modificación de fragmentos Fc con 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (Sulfo-SMCC, Pierce) y el compuesto a conjugar con Fc se tiola con S-acetiltioacetato de N-succinimidilo (SATA). Los componentes derivatizados se purifican y se liberan del agente de entrecruzamiento y se combinan a temperatura ambiente durante una hora para permitir el entrecruzamiento. Las personas de experiencia habitual en la técnica conocen otros reactivos de entrecruzamiento que comprenden aldehído, imida, ciano, halógeno, carboxilo, carboxilo activado, anhídrido y grupos funcionales de maleimida y también pueden usarse para la conjugación de compuestos con fragmentos Fc. Por supuesto, la elección del agente de entrecruzamiento dependerá de la naturaleza del compuesto que se desea conjugar con Fc. Los reactivos de entrecruzamiento descritos anteriormente son eficaces para conjugaciones proteína-proteína. Si el compuesto a conjugar es un carbohidrato o tiene un resto carbohidrato, entonces son útiles reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales tales como ABH, M2C2H, MPBH y PDPH para la conjugación con una molécula de unión a FcRn proteica (Pierce Chemical Co. Rockford, IL). Otro método de conjugación de proteínas y carbohidratos se describe por Brumeanu et al. (Genetic Engineering News, 1 de octubre de 1995, p. 16). Si el compuesto a conjugar es un lípido o tiene un resto lipídico que es conveniente como sitio de conjugación para la molécula de unión a FcRn, entonces pueden usarse agentes de entrecruzamiento tales como SPDP, SMPB y derivados de los mismos (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). También es posible conjugar cualquier molécula que se vaya a liberar por medios no covalentes. Una forma conveniente para conseguir una conjugación no covalente es inducir anticuerpos contra el compuesto a liberar, tales como anticuerpos monoclonales, por métodos bien conocidos en la técnica, y seleccionar un anticuerpo monoclonal que tenga la región Fc correcta y las propiedades de unión a antígenos deseadas. El antígeno a liberar después se pre-une al soporte de anticuerpo monoclonal. En todas las reacciones de entrecruzamiento anteriores, es importante purificar los compuestos modificados liberándolos del reactivo de entrecruzamiento. También es importante purificar el conjugado final para liberarlo sustancialmente de reactivos no conjugados. La purificación puede conseguirse por cromatografía de afinidad, exclusión molecular o intercambio iónico basándose en las propiedades de cualquier componente del conjugado. Un método particularmente preferido es una etapa de purificación por afinidad inicial usando proteína A-Sepharose para retener Fc y conjugados de Fc-compuesto, seguido de cromatografía de exclusión molecular o de intercambio iónico basándose en la masa, tamaño o carga del conjugado de Fc. La etapa inicial de este esquema de purificación asegura que el conjugado se unirá a FcRn, lo cual es un requisito esencial de la invención.
Ejemplo 9 Liberación Facilitada por IgG de Agentes Extraños a través de la Barrera del Epitelio Intestinal
Para ensayar la capacidad de que conjugados de molécula de unión a Fc-antígeno se transporten a través de barreras epiteliales, se conjugan antígenos extraños con moléculas de IgG para su administración a ratones. Un antígeno extraño conveniente es el colorante fluorescente rodamina, ya que puede visualizarse en secciones semifinas congeladas de epitelio intestinal. Se une covalentemente rodamina a IgG de ratón no específica, preparada como se describe en el Ejemplo 6, subunidad B de toxina colérica (Sigma) y ovalbúmina (Sigma) por incubación con succinil-rodamina (Molecular Probes, Eugene, OR) como recomienda el fabricante. El conjugado de IgG-rodamina se purifica por cromatografía de afinidad en proteína G-Sepharose. Después de la diálisis para retirar la succinil-rodamina no conjugada, los conjugados de toxina B colérica (CT-B)-rodamina y ovalbúmina-rodamina se purifican por cromatografía de exclusión molecular o intercambio iónico. Las fracciones del eluato se ensayan con respecto a la presencia de conjugados determinando la fluorescencia. La unión funcional de los conjugados de IgG y subunidad B de CT pueden ensayarse por unión a FcRn y al gangliósido GM1, respectivamente. Como controles positivo y negativo se usaron, respectivamente, toxina colérica B-rodamina y ovalbúmina-rodamina.
A ratones BALB/c se les administran 0,2 nanomoles de los tres conjugados de rodamina descritos anteriormente, con o sin 0,2 nanomoles de toxina colérica no marcada como adyuvante no específico, por administración intragástrica en presencia de 75 micromoles de NaHCO_{2} y 20 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja para inhibir la degradación gástrica. Después de 6 horas, los ratones se sacrifican y se extrae el intestino, se congela y se procesa para obtener secciones semifinas. Las secciones del epitelio intestinal se iluminan en un microscopio de fluorescencia y se examina la fluorescencia intracelular. La presencia de fluorescencia en las células del epitelio intestinal de ratones a los que se les ha administrado IgG-rodamina indica que los conjugados de IgG se transportan eficazmente en una dirección apical a basolateral a través de la barrera del epitelio intestinal. FcRn puede transportar inmunógenos como conjugados con moléculas de unión a FcRn.
Ejemplo 10 Respuesta Inmune en la Mucosa de Ratón a Conjugado de Antígeno-IgG Liberado por Vía Oral a través de Transcitosis Mediada por FcRn
Se usan ratones transgénicos homocigotos para la deleción de \beta2-microglobulina (un componente crítico de la función del receptor Fc) y sus compañeros de camada de tipo silvestre normal para estudios de generación de una respuesta inmune mucosa. Si la rodamina-IgG induce una respuesta inmune mucosa por unión al receptor de Fc de la membrana apical, se encontraría una respuesta inmune positiva en los ratones de tipo silvestre, pero no en los ratones "knockout" con respecto a la \beta2-microglobulina. Por el contrario, la subunidad B de la toxina colérica (CT-B)-rodamina induciría una respuesta inmune positiva tanto en los ratones de tipo silvestre como en los ratones "knockout", ya que la transcitosis de CT-B a través de la barrera epitelial no depende de la unión a los receptores de Fc de la membrana apical. La rodamina-ovalbúmina no entra en las vesículas transcitóticas (pero puede entrar en el epitelio intestinal por endocitosis en fase líquida) y no induciría una respuesta inmune en ninguno de los ratones.
Tres grupos de ratones de tipo silvestre y knockout con respecto a la \beta2-microglobulina se inmunizan por vía oral con los tres conjugados de rodamina descritos en el Ejemplo 9. Se realizan experimentos paralelos con la adición de 0,2 nanomoles de toxina colérica como adyuvante no específico. Se administran por vía intragástrica cantidades equimolares de los conjugados de rodamina. Los ratones se "inmunizan" por este método cada 10 días hasta un total de tres veces. Dos semanas después de la tercera inmunización oral, los ratones se sacrifican y se determina la respuesta inmune específica de rodamina por ELISA en las secreciones intestinales y en suero por una metodología convencional. Las inmunoglobulinas séricas anti-rodamina son las más evidentes en los ratones de tipo silvestre a los que se les administraron conjugados de rodamina de CT-B e IgG. Los ratones knockout que carecen de microglobulina \beta2 generan una respuesta inmune mucosa a rodamina-CT-B pero no a rodamina-IgG, lo que indica que la transcitosis mediada por los receptores juega un papel esencial en la respuesta inmune mucosa. El conjugado de control de rodamina-ovalbúmina induce una repuesta inmune pequeña o nula en los ratones knockout con respecto a \beta2-microglobulina y en los ratones de tipo silvestre.
Ejemplo 11 Liberación Facilitada por IgG de la Sustancia Bioactiva Insulina a través de la Barrera del Epitelio Intestinal
Para ensayar la capacidad de conjugados de molécula de unión a Fc-sustancia bioactiva para transportarse a través de barreras epiteliales, se conjuga la sustancia bioactiva insulina con moléculas de IgG para administrarse a ratones. Un agente terapéutico conveniente a liberar es la insulina, ya que su presencia en la circulación sistémica puede determinarse midiendo una reducción de los niveles de glucosa en sangre. Los resultados de este ensayo demuestran la eficacia del sistema de liberación de molécula de unión a FcRn. Se une insulina covalentemente a IgG de ratón no específica, preparada como se describe en el Ejemplo 6, subunidad B de toxina colérica (Sigma) y ovalbúmina (Sigma) por incubación con succinil-insulina (Molecular Probes, Eugene, OR) como recomienda el fabricante. El conjugado de IgG-insulina se purifica por cromatografía de afinidad en proteína G-Sepharose. Después de la diálisis para retirar la succinil-insulina no conjugada, se purifican conjugados de toxina colérica B (CT-B)-insulina y ovalbúmina-insulina por cromatografía de exclusión molecular o intercambio iónico. Se ensayan las fracciones del eluato con respecto a la presencia de conjugados determinando la fluorescencia. La unión funcional de los conjugados de IgG y subunidad B de CT puede ensayarse por unión a FcRn y al gangliósido GM1, respectivamente. Como controles positivo y negativo se utilizan, respectivamente, toxina colérica B-insulina y ovalbúmina-insulina.
A ratones BALB/c se les administran 0,2 nanomoles de los tres conjugados de insulina descritos anteriormente, con o sin 0,2 nanomoles de toxina colérica no marcada como control no específico, por administración oral en presencia de 75 micromoles de NaHCO_{3} y 20 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja para inhibir la degradación gástrica.
Liberación de Insulina In Vivo
Se dejaron en ayunas ratones BALB/c de sexo femenino durante 12 horas antes del experimento. A cada ratón se le administraron 200 \mul de cada preparación por medio de una sonda. Se restauró la alimentación inmediatamente después de la administración. Se extrajeron muestras de sangre para determinar la glucosa a partir de la vena de la cola del ratón con anestesia con metoxiflurano. Se extrajeron muestras inmediatamente antes de la administración (0 horas), así como 1, 2, 3 y 3,5 horas después de la administración de cada preparación. El nivel de glucosa en sangre se midió usando un Sistema de Seguimiento de Perfil de Diabetes One Touch® (Lifescan, Milpitas, CA) con una tira de ensayo Touch®, aplicando sangre para formar una gota redonda que cubriera completamente la mancha de ensayo en la tira de ensayo. Se obtuvieron lecturas (en mg/dl) a partir del medidor que indicaban el nivel de glucosa sanguínea detectado.

Claims (8)

1. Un conjugado de un compuesto hematológico y una molécula de unión a FcRn dirigida a células epiteliales que expresan un FcRn, para uso en un método terapéutico de liberación transepitelial de dicho compuesto hematológico a un mamífero.
2. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho compuesto hematológico es una proteína de la coagulación sanguínea.
3. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicha proteína de la coagulación sanguínea es un factor antihemofílico.
4. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicha proteína de la coagulación sanguínea es un complejo de factor IX.
5. Un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para administración oral, sublingual, intranasal o de aerosol.
6. Un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la molécula de unión a FcRn es una IgG no específica o un fragmento de unión a FcRn de IgG.
7. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 6, donde la molécula de unión a FcRn es un fragmento Fc de IgG.
8. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 6, donde la molécula de unión a FcRn es un fragmento de IgG que incluye la región de unión completa para el FcRn.
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