DE69627820T2 - Rezeptorspezifischer transepithelialer transport von immunogenen - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Produkte zur Einleitung einer Immunantwort gegen ein Antigen und betrifft insbesondere die transepitheliale Zufuhr von Antigenen, um Toleranz und Immunität hervorzurufen.
  • Das Immunsystem eines Säugetiers entwickelt sich während der Schwangerschaft und wird im späten Säugetierfötus aktiv. Obwohl aktiv, kann es immer noch als "unreif" bezeichnet werden, weil es Antigenen noch in keinem signifikanten Umfang ausgesetzt worden ist; der Fötus wird weitgehend durch Antigene der Mutter geschützt. Dieses "unreife" Immunsystem wird jedoch ergänzt durch den Transfer von mütterlichem Immunglobulin zum Fötus (oder in manchen Fällen zum Neugeborenen), um in den ersten Wochen selbständigen Lebens humorale Immunität zu gewährleisten.
  • Ratten und Mäuse erhalten den Großteil mütterlichen Immunglobulins (IgG) als Säuglinge von Colostrum und Milch, obwohl ein gewisser Teil pränatal erworben wird.
  • Rinder erhalten IgG ebenfalls von Colostrum. Bei Kaninchen wird IgG über den Dottersack zum Fötus transportiert. Über den Transfer von IgG zum Fötus oder Neugeborenen des Menschen ist wenig bekannt. Die meisten Hinweise legen nahe, daß menschliche Mütter humorale Immunität nur vor der Geburt auf die Nachkommen übertragen, obwohl angenommen wird, daß durch Brustmilch an ein Neugeborenes übertragenes IgA eine Rolle für den Schutz des Neugeborenen gegen Darminfektionen spielt.
  • Die Zufuhr von mütterlichem IgG an den Säugetierfötus und/oder das Säugetierneugeborene erfordert Transport über eine epitheliale Barriere, die weitgehend undurchlässig für Makromoleküle ist. Der Transport von Makromolekülen über solch eine epitheliale Barriere kann durch unspezifische und spezifische rezeptorvermittelte Mechanismen auftreten. Rezeptorunspezifische Mechanismen werden durch parazelluläre Siebungsereignisse repräsentiert, deren Effizienz in umgekehrter Beziehung zum Molekulargewicht des transportierten Moleküls steht. Transport von Makromolekülen wie IgG über diesen parazellulären weg ist höchst ineffizient. Beschreibungen von rezeptorvermitteltem Transport von Immunglobulinen durch Darmepithelzellen sind bislang beschränkt auf den polymeren Immunglobulinrezeptor (polymeric immunoglobulin receptor) und den Enterozytenrezeptor für IgG (ein mit dem Haupthistokompatibilitätskomplex(MHC) Klasse-I verwandter Fc-Rezeptor). Diese beiden Rezeptorsysteme unterscheiden sich in ihrer Spezifität für Immunglobulin-Isotypen, in ihrer Richtung des Immunglobulintransports über die Epithelzelle und in ihrer gewebespezifischen Expression. Beide können eine Rolle bei der Formnung des unreifen Immunsystems spielen.
  • Der polymere Immunglobulinrezeptor wird auf der basolateralen Oberfläche von Enterozyten, Hepatozyten und/oder Gallengang-Epithelzellen exprimiert. Er transportiert polymeres IgA und IgM zur apikalen (luminalen) Oberfläche, wobei diese Immunglobuline für die antimikrobielle Abwehr und den Antigenausschluß konzentriert werden.
  • Der Enterozytenrezeptor für IgG, der eine Homologie zur schweren Kette von MHC Klasse I aufweist und mit Beta2-Mikroglobulin (β2M) in Verbindung steht wird auf Neugeborenen-Enterozyten von Ratte und Maus exprimiert. IgG wird transzellulär in luminaler zu serosaler Richtung über das Darmepithel dieser Nagetier-Neugeborenen transportiert. Auf der apikalen Oberfläche der Enterozyte ist der Fc-Teil des IgG bei dem vergleichsweise sauren pH des Lumens (etwa pH 6,0) an den Enterozytenrezeptor gebunden. Nach Transzytose zur basolateralen Plasmamembran erfolgt die Freisetzung des Immunglobulins bei dem vergleichsweise neutralen pH der interstitiellen Flüssigkeiten (etwa pH 7,4). Der Fc-Rezeptor von Nagetier-Neugeborenen (FcRn) kann daher für die Zufuhr von mütterlichem IgG an das Neugeborene verantwortlich sein und in dieser Eigenschaft für den passiven Erwerb von IgG in dieser Periode verantwortlich sein.
  • Beim Menschen wird mütterliches IgG aktiv über die Plazenta transportiert. Der für diesen Transport verantwortliche Rezeptor ist über viele Jahre gesucht worden. verschiedene IgG-bindende Proteine sind aus der Plazenta isoliert worden. FcγRII wurde in Plazentaendothel und FcγRIII in Synzytiotrophoblasten festgestellt. Beide Rezeptoren wiesen eine vergleichsweise geringe Affinität für monomeres IgG auf. Kürzlich wurde über die Isolierung einer cDNA, die für ein humanes Homolog des Ratten- und Maus-Enterozytenrezeptors kodiert, aus Plazenta berichtet (Story, C. M. et al., J. Exp. Med., Vol. 180: 2377–2381, Dezember 1994). Die vollständige Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz wurde veröffentlicht. Dieser Fc-Rezeptor für IgG kann für die Transport von mütterlichem IgG zum menschlichen Fötus (und sogar möglicherweise zum Neugeborenen) verantwortlich sein,. da das Molekül über sein offenes Leseraster hochgradig mit der Ratten-FcRn-Sequenz homolog ist (69 Nukleotid-Identität und 65% voraussichtliche Aminosäurenidentität). Sogenannte passive Immunisierung beim menschlichen Fötus (und möglicherweise beim menschlichen Neugeborenen) könnte nunmehr besser verstanden werden.
  • Im Gegensatz zur passiven Immunisierung, die die Ergänzung des Immunsystems eines Wirtstiers mit von einem anderen erhaltenen Antikörpern, beinhaltet, beinhaltet aktive Immunisierung die Stimulierung des eigenen Immunsystems des Wirtstiers, um in vivo die gewünschte Immunantwort hervorzurufen. Die am häufigsten praktizierten Verfahren zur aktiven Immunisierung von Kindern und Erwachsenen beinhalten Injektionen eines Immunogens, einmal als Initialdosis und dann mindestens einmal als Auffrischungs(Booster)dosis. Diese Verfahren weisen viele schwerwiegende Nachteile auf, einschließlich den Risiken, die mit dem Gebrauch von Nadeln, die Krankheiten wie AIDS und Hepatitis übertragen können, verbunden sind. (Bei der Tolerisierung eines Patienten gegen ein Allergen werden die Probleme dadurch verstärkt, daß häufig wiederholte Injektionen über eine lange Zeitperiode erforderlich sind). Die erste Abwehrlinie gegen Pathogene, d. h. die mukosale Immunität, wird durch diese Verfahren auch nicht notwendigerweise adäquat ausgelöst. Mukosamembranen kleiden die Luftwege, das Reproduktionssystem und den Gastrointestinaltrakt aus, und diese mukosale Oberfläche bildet das erste Eintrittsportal für viele Krankheiten. Ein oraler Impfstoff, der einfach zuzuführen ist und die mukosale Immunität auslöst, wäre sehr wünschenswert.
  • Immunisierung unter verwendung oraler Impfstoffe ist problematisch. Oftmals wird eine geringe oder gar keine Immunantwort erreicht. Um eine Verbesserung der Immunantwort zu erreichen, wurden interessierende Antigene an Träger gekoppelt, von denen bekannt ist, daß sie stark immunogen sind. Beispielsweise haben Forscher Antigene unter Verwendung von Bacille Calmette-Guérin (BCG) als Träger zugeführt; BCG ist ein Bakterium, das ursprünglich als ein orales Vakzin gegen Tuberkulose eingesetzt wurde. Ein Problem mit solchen Trägern besteht darin, daß der Patient Antikörper gegen den Träger selbst entwickelt, was störend sein kann, wenn der Träger erneut für die Zuführung eines anderen Antigens bei demselben Patienten verwendet wird. Derzeit hat sich keine allgemeine Strategie für orale Vakzine als erfolgreich erwiesen.
  • Immunglobulin und Teile davon sind in der Vergangenheit an Arzneimittel und Bildgebungsmittel gebunden worden, um Zellpopulationen anzusteuern und zu zerstören und um die Halbwertszeit von bestimmten Mitteln zu verlängern. Immuntoxine sind ein Beispiel für solche Konjugate. Solche Konjugate sind jedoch niemals als brauchbar für die Auslösung einer Immunantwort vorgeschlagen worden.
  • Ein geringer Anteil von Arbeiten hat sich auf die tolerisierende Eigenschaft von Immunglobulinen, die an für Autoimmunkrankheiten charakteristische Oligonukleotide oder Proteine gekoppelt sind, konzentriert. (Siehe PCT WO 91/08773).
  • Ein neues verfahren zur Kopplung eines Proteins oder Peptids an ein Gammaglobulin unter Verwendung von Disuccinimidylsuberat (DSS), um ein solches Tolerogen zu bilden, wird von Halina Borel und Yves Borel im Journal of Immunological Methods, 126 (1990), 150–168, beschrieben.
  • Diese Arbeit beruht auf den Ansicht, daß die Induktion von Toleranz stark durch Trägerkomponenten beeinflußt sein kann und das Immunglobulinträger stark tolerogen zu sein scheinen. Isologes IgG ist der bevorzugte Träger und intravenöse Verabreichung war die Art, die für die Zuführung der IgG-Konjugate verwendet wurde. Obwohl diese Arbeiten sich über mehrere Dekaden erstrecken, ist orale Verabreichung nur einmal erwähnt worden und nur für Konjugate, bei denen IgA der Immunglobulinträger ist. Obwohl tolerogene Immunglobulin-Konjugate im Stand der Technik bekannt sind, sind solche Konjugate nie als Mittel zur Induzierung einer robusten Antwort gegen ein für ein Pathogen charakteristisches Antigen vorgeschlagen worden. (Im Gegenteil, der Stand der Technik legt nahe, daß solche Konjugate, wenn überhaupt, ein Subjekt nur gegen ein Pathogen tolerisieren würden, was höchst unerwünscht wäre). Darüber hinaus ist nie vorgeschlagen worden, daß solche Konjugate wirksame Tolerogene sein würden, wenn das Immunglobulin IgG ist und die Art der Verabreichung orale Zufuhr ist.
  • Die Erfindung beinhaltet die Entdeckung, daß Antigene an Moleküle gekoppelt werden können, die an den FcRn-Rezeptor binden, wie beispielsweise Immunglobuline oder Teile davon, und mittels aktiven Transports durch die Enterozyte mittels FcRn-Rezeptor über die Epithelbarriere zugeführt werden können. Das Immunglobulin oder ein Teil davon bindet an den FcRn-Rezeptor und fungiert als Träger für das Antigen, während das Immunglobulin oder ein Teil davon über die Epithelbarriere durch FcRn-vermittelten Transport transportiert wird. Der FcRn-Rezeptor ist im menschlichen Epithelgewebe von Kindern und Erwachsenen anwesend und die Erfindung erlaubt daher wirksame Strategien zur Immunisierung von Menschen.
  • Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Modulation des Immunsystems eines Säugetiers bereit. Eine wirksame Menge eines Konjugats von einem Antigen und einem FcRn-Bindungspartner wird an eine epitheliale Barriere eines Säugetiers, das einer solchen Immunmodulation bedarf, verabreicht. Das Antigen ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem Antigen, das für ein Pathogen charakteristisch ist, einem Antigen, das für eine Autoimmunkrankheit charakteristisch ist, einem Antigen, das für ein Allergen charakteristisch ist und einem Antigen, das für einen Tumor charakteristisch ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist der FcRn-Bindungspartner ein unspezifisches IgG oder ein FcRn-Bindungsfragment von IgG. Am meisten bevorzugt ist der FcRn-Bindungspartner ein Fc-Fragment von IgG. Es ist ebenfalls bevorzugt, daß das Antigen kovalent an den FcRn-Bindungspartner gekoppelt ist. Bevorzugt wird das Konjugat oral an das Darmepithel, in einem Aerosol an die Lungen, oder intranasal verabreicht. Solche Zubereitungen können nicht-aseptisch sein. Ergänzende potenzierende Mittel, wie unten beschrieben, können zusätzlich verabreicht werden.
  • Nach der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Konjugates aus einem Molekül, das an einen an menschlichen FcRn bindenden FcRn-Bindungspartner, gekoppelt ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur transepithelialen Behandlung eines Patienten bereitgestellt, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung an eine epitheliale Barriere eines Patienten zwecks Abgabe des Moleküls über die epitheliale Barriere des Patienten angepaßt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verwendung eines Konjugates aus einem Molekül, das an einen FcRn-Bindungspartner gekoppelt ist, der menschlichen FcRn bindet zur Herstellung eines Arzneimittels zur transepithelialen Modulation des Immunsystems eines Patienten bereitgestellt, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung an eine epitheliale Barriere eines Patienten zwecks Abgabe des Moleküls über die epitheliale Barriere des Patienten angepaßt ist.
  • Die Arzneimittel und pharmazeutischen Zubereitungen gemäß der Erfindung können ein Konjugat aus einem Antigen und einem FcRn-Bindungspartner einschließen, wobei das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Antigen, das für ein Pathogen charakteristisch ist, einem Antigen, das für eine Autoimmunkrankheit charakteristisch ist, einem Antigen, das für ein Allergen charakteristisch ist und einem Antigen, das für einen Tumor charakteristisch ist. Die bevorzugten FcRn-Bindungspartner sind wie oben beschrieben. Das Konjugat liegt in einer Menge vor, die für die Modulierung der Immunantwort eines Säugetiers wirksam ist. Die pharmazeutische Zubereitung enthält auch einen pharmazeutische annehmbaren Träger. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Einheitsdosierform hergestellt sein, die für die Zufuhr an eine epitheliale Barriere gestaltet und angeordnet sind, beispielsweise für orale Zufuhr an das Darmepithel, Aerosolzufuhr an das Lungenepithel und intranasale Zufuhr an das Nasenepithel. Auf diese weise sind Tabletten, die IgG (oder ein FcRn bindendes Teil davon) enthalten, das an irgendeines der oben charakterisierten Antigene gekoppelt ist, von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
  • Die vorgenannten pharmazeutischen Präparate können zusammen mit ergänzenden potenzierenden Mitteln einschließlich Adjuvanzien, Cytokinen, Bio-Haftmitteln und dergleichen zugeführt werden. Die ergänzenden potenzierenden Mittel selbst können an einen FcRn-Bindungspartner gekoppelt sein, um die Zufuhr solcher Mittel über die epitheliale Barriere zu erleichtern. Bevorzugte Arten der Verabreichung beinhalten im allgemeinen orale Dosierungen an das Darmepithel, Aerosole an die Lungen und intranasale Dosierungen an das Nasenepithel.
  • Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden beschrieben oder sind in den Unteransprüchen angegeben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung überschreitet das Konjugat mit dem Antigen die epitheliale Barriere in einer Menge, die mindestens doppelt so groß ist wie der Umfang, in dem das Antigen die epitheliale Barriere in unkonjugierter Form überschreitet. Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, einen Mechanismus zu entwickeln, um die Fähigkeit eines Antigens, die epitheliale Barriere zu überschreiten, zu erhöhen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine neue Klasse von oral aktiven Immunogenen und Tolerogenen zu entwickeln.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Verfahren zur Stimulierung mukosaler Immunität zu entwickeln.
  • Der Erfindung beinhaltet die Entdeckung, daß der menschliche FcRn-Rezeptor in adultem Epithelgewebe aktiv ist und die Entdeckung, daß FcRn-Bindungspartner wie IgG oder Fc-Fragmente verwendet werden können, um andere Moleküle, einschließlich Antigenen, über epitheliale Barrieren zu transportieren. In dieser Weise können FcRn-Bindungspartner wie IgG oder ein an FcRn bindender Teil davon verwendet werden, um ein Antigen über eine epitheliale Barriere an das Immunsystem eines Subjekts zuzuführen, wobei eine Immunantwort ausgelöst wird.
  • Die Erfindung ist vorteilhaft, wann immer es wünschenswert ist, die Zuführung eines Antigens über eine epitheliale Barriere an das Immunsystem zu verbessern. Die Erfindung kann auf diese Weise eingesetzt werden, um Antigene über Darmepithelgewebe, Lungenepithelgewebe und andere mukosale Oberflächen, einschließlich nasalen Oberflächen, vaginalen Oberflächen, Dickdarmoberflächen und Gallenwegsoberflächen zuzuführen. Die Erfindung kann auch zur Modulierung des Immunsystems eines Subjekts, beispielsweise durch Stimulierung einer humoralen Antikörper-Antwort gegen ein Antigen, durch Stimulierung der T-Zell-Aktivität oder durch Stimulierung von Toleranz gegenüber einem Antigen, verwendet werden. So wie er hier verwendet wird, bedeutet der Begriff Subjekt: Menschen, Primaten, Pferde, Kühe, Schafe, Schweine, Ziegen, Hunde, Katzen, Hühner und Nagetiere.
  • Wenn Tumorantigen zugeführt werden, kann die Erfindung dazu verwendet werden, Subjekte zu behandeln, die eine Krankheit aufweisen, die einer immunitätsvermittelten Abwehr zugänglich ist, wie nicht-solide Tumoren oder solide Tumoren kleiner Größe. Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, daß die Zufuhr von Tumorantigenen durch die hier beschriebenen Verfahren vorteilhaft bei der Behandlung im Anschluß an eine Entfernung eines großen soliden Tumors ist. Die Erfindung kann ebenfalls zur Behandlung von Subjekten verwendet werden, die im Verdacht stehen, Krebs zu haben.
  • Die Erfindung beinhaltet die Bildung eines Konjugates aus einem FcRn-Bindungspartner und einem Antigen. Mit Konjugat sind zwei Einheiten gemeint, die aneinander durch irgendein physikalisch-chemisches Mittel, einschließlich hydrophober Wechselwirkung zwischen einem Antigen und dem unspezifischen hydrophoben Teil eines Antikörpermoleküls, spezifischer Antikörper-Antigen-Bindung und kovalenter Kopplung, gebunden sind. Die Beschaffenheit der bevorzugten Bindung hängt, unter anderem, von der für die Zufuhr des Konjugats an die vorgesehene epitheliale Barriere verwendeten Art der Verabreichung und dem pharmazeutischen Träger ab. Beispielsweise sind einige Bindungen nicht so gut wie andere geeignet, um bestimmten Umgebungen wie dem Magen zu widerstehen, können davor aber durch Zufuhrsysteme, die den Magen umgehen, geschützt werden. Es ist natürlich wichtig, daß die Bindung zwischen dem FcRn-Bindungspartner und dem Antigen von einer Beschaffenheit ist, daß sie die Fähigkeit des FcRn-Bindungspartners, an den FcRn-Rezeptor zu binden, nicht zerstört. Solche Bindungen sind dem Fachmann gut bekannt. Ausführlichere Beispiele werden unten angegeben. Das Konjugat kann darüber hinaus als ein Fusionsprotein hergestellt werden, wie unten genauer beschrieben.
  • Unter einem FcRn-Bindungspartner ist eine Einheit zu verstehen, die spezifisch durch den FcRn-Rezeptor gebunden werden kann, mit nachfolgendem aktiven Transport des FcRn-Bindungspartners durch den FcRn-Rezeptor. wie oben erwähnt, ist der FcRn-Rezeptor aus verschiedenen Säugetierarten isoliert worden, einschließlich dem Menschen. Die Sequenz des menschlichen FcRn, Ratten-FcRn und Maus-FCRn ist in Story, C. M. et al., J. Exp. Med., 180: 2377–2381, Dezember 1994, zu finden. Das FcRn-Rezeptor-Molekül ist nunmehr gut charakterisiert. Der FcRn-Rezeptor bindet IgG (aber nicht andere Immunglobulinklassen wie IgA, IgD, IgM und IgE) bei einem vergleichsweise niedrigeren pH, transportiert das IgG transzellulär in luminaler zu serosaler Richtung und gibt das IgG dann bei einem vergleichsweise höheren pH, wie er in der interstitiellen Flüssigkeit vorgefunden wird, ab. Wie der Fachmann bemerken wird, kann der FcRn-Rezeptor durch Klonierung oder Affinitäts-Aufreinigung, beispielsweise unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, isoliert werden. Solche isolierten FcRn-Rezeptoren können dann verwendet werden, um FcRn-Bindungspartner zu identifizieren und isolieren, wie unten beschrieben.
  • FcRn-Bindungspartner schließen ganzes IgG, das Fc-Fragment von IgG und andere Fragmente von IgG, die die vollständige Bindungsregion für den FcRn-Rezeptor beinhalten, ein. Die Region des Fc-Teils von IgG, die an den FcRn-Rezeptor bindet ist unter Anwendung von Röntgenstrahlenkristallographie beschrieben worden (Burmeister, W. P. et al., Nature, 1994, 372: 379–378). Die hauptsächliche Kontaktzone von Fc mit dem FcRn-Rezeptor liegt nahe der Verbindungsstelle der CH2- und CH3-Domänen. Mögliche Kontakte sind die Reste 248, 250-257, 272, 285, 288, 290–291, 308–311 und 314 in CH2 und 385–387, 428 und 433–436 in CH3. (Diese Stellen sind von denen verschieden, die durch Unterklassenvergleich oder durch zielgerichtete Mutagenese (site-directed mutagenesis) identifiziert wurden, was wichtig ist für die Fc-Bindung an Leukozyten-FcγRI und -FCγRII). Die vorgenannten Fc-FcRn-Kontakte liegen alle innerhalb einer einzigen schweren Ig-Kette. Es ist vorher bereits festgestellt worden, daß zwei FcRn-Rezeptoren ein einziges Fc-Molekül binden können. Die kristallographischen Daten legen nahe, daß in einem solchen Komplex jedes FcRn-Molekül ein einziges Polypeptid des Fc-Homodimers bindet.
  • Die vorgehenden Informationen vorausgesetzt, wird der Fachmann ohne weiteres erkennen, daß die Fc-Region des IgG nach wohlbekannten Verfahren wie der zielgerichteten Mutagenese und dergleichen modifiziert werden kann, um modifiziertes IgG oder modifizierte Fc-Fragmente oder Teile davon zu erhalten, die von dem FcRn-Rezeptor gebunden werden. Solche Modifikationen schließen Modifikationen ein, die entfernt von den FcRn-Kontaktstellen liegen sowie Modifikationen innerhalb der Kontaktstellen, die die Bindung erhalten oder sogar fördern. Darüber hinaus können andere Bindungspartner identifiziert und isoliert werden. Antikörper oder Teile davon, die spezifisch für den FcRn-Rezeptor und in der Lage sind, durch FcRn nach der Bindung transportiert zu werden, können unter Anwendung gut etablierter Techniken identifiziert und isoliert werden. Genauso können zufallsgenerierte Molekülbibliotheken durchsucht werden und Moleküle, die durch FcRn gebunden und transportiert werden, können durch konventionelle Techniken isoliert werden. Es ist nicht beabsichtigt, die Erfindung durch Auswahl irgendeines bestimmen FcRn-Bindungspartners einzuschränken. In Fällen, in denen der Bindungspartner IgG oder ein FcRn-bindender Teil davon ist, kann das IgG oder der Teil davon nach konventionellen Methoden, wie unten genauer beschrieben, hergestellt werden.
  • Der FcRn-Bindungspartner ist mit einem Antigen konjugiert. Ein Antigen nach dem hier verwendeten Begriff fällt in vier Klassen: 1) Antigene, die für ein Pathogen charakteristisch sind; 2) Antigene, die für eine Autoimmunkrankheit charakteristisch sind; 3) Antigene, die für ein Allergen charakteristisch sind; und 4) Antigene, die für einen Tumor charakteristisch sind. Antigene schließen im allgemeinen Polysaccharide, Glykolipide, Glykoproteine, Peptide, Proteine, Kohlenhydrate und Lipide von Zelloberflächen, aus Cyotoplasma, Zellkernen, Mitochondrien und dergleichen ein.
  • Antigene, die für ein Pathogen charakteristisch sind beinhalten Antigene, die von Viren, Bakterien, Parasiten oder Pilzen abgeleitet sind. Beispiele für wichtige Pathogene sind Vibrio cholerae, enterotoxigenes Escherichia coli, Rotavirus, Clostridium difficile, Shigella-Arten, Salmonella typhi, Parainfluenzavirus, Influenzavirus, Streptococcus pneumoniae, Borellia burgdorferi, HIV, Streptococcus mutans, Plasmodium falciparum, Staphylococcus aureus, Tollwutvirus und Epstein-Barrvirus.
  • Viren beinhalten im allgemeinen, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden Familien: Picornaviridae; Caliciviridae; Togaviridae; Flaviviridae; Coronaviridae; Rhabdoviridae; Filoviridae; Paramyxoviridae; Orthomyxoviridae; Bunyaviridae; Arenaviridae; Reoviridae; Retroviridae; Hepadnaviridae; Parvoviridae; Papovaviridae; Adenoviridae; Herpesviridae und Poxviridae.
  • Bakterien beinhalten im allgemeinen, sind aber nicht beschränkt auf: P. aeruginosa; E. coli; Klebsiella sp.; Serratia sp.; Pseudomonas sp.; P. cepacia; Acinetobacter sp.; S. epidermis; E. faecalis; S. pneumoniae; S. aureus; Haemophilus sp.; Neisseria sp.; N. meningitidis; Bacteroides sp.; Citrobacter sp.; Branhamella sp.; Salmonella sp.; Shigella sp.; S. pyogenes; Proteus sp.; Clostridium sp.; Erysipelothrix sp.; Listeria sp.; Pasteurella multocida; Streptobacillus sp.; Spirillum sp.; Fusospirocheta sp.; Treponema pallidum; Borrelia sp.; Actinomycetes; Mycoplasma sp.; Chlamydia sp.; Rickettsia sp.; Spirochaeta; Legionella sp.; Mycobacterium sp.; Ureaplasma sp.; Streptomyces sp.; Trichomonas sp. und P. mirabilis.
  • Parasiten beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf: Plasmodium falciparum, P. vivar, P. ovale, P. malaria; Toxoplasma gondii; Leishmania mexicana, L. tropica, L. major, L. aethiopica, L. donovani; Trypanosoma cruzi, T brucei; Schistosoma mansoni, S haematobium, S japonium; Trichinella spiralis; Wuchereria bancrofti; Brugia malayi; Entamoeba histolytica; Enterobius vermicularis; Taenia solium, T saginata; Trichomonas vaginalis, T. hominis, T. tenax, Giardia lamblia; Cryptosporidium parvum; Pneumocystis carinii; Babesia bovis, B. divergens, B. microti; Isospora belli, I. hominis; Dientamoeba fragilis; Onchocerca volvulus; Ascaris lumbricoides; Necator americanis; Ancylostoma duodenale; Strongyloides stercoralis; Capillaria philippinensis; Angiostrongylus cantonensis; Hymenolepis nana; Diphyllobothrium latum; Echinococcus granulosus, E. multilocularis; Paragonimus westermani, P. caliensis; Chlonorchis sinensis; Opisthorchis felineus, 0. viverrini; Fasciola hepatica; Sarcoptes scabiei; Pediculus humanus; Phthirius pubis und Dermatobia hominis.
  • Pilze beinhalten im allgemeinen, sind aber nicht beschränkt auf: Cryptococcus neoformans; Blastomyces dermatitidis; Ajellomyces dermatitidis; Histoplasma capsulatum; Coccidioides immitis; Candida-Arten, einschließlich C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. guilliermondii und C. krusei; Aspergillus-Arten, einschließlich A. fumigatus, A. flavus und A. niger; Rhizopus-Arten, Rhizomucor-Arten; Cunninghammella-Arten; Apophysomyces-Arten, einschließlich A. saksenaea, A. mucor and A. absidia; Sporothrix schenckii; Paracoccidioides brasiliensis; Pseudallescheria boydii; Torulopsis glabrata und Dermatophytes-Arten.
  • Antigene, die charakteristisch für Autoimmunkrankheiten sind, werden typischerweise aus der Zelloberfläche, dem Cytoplasma, Zellkern, Mitochondrien und dergleichen von Säugetiergewebe erhalten. Beispiele beinhalten Antigene, die charakteristisch sind für Uveitis (z. B. S-Antigen), Diabetes mellitus, multiple Sklerose, systemischer Lupus erythematosus, Hashimoto-Thyreoiditis, Myasthenia gravis, primäres Myxödem, Thyreotoxikose, rheumatische Arthritis, perniziöse Anämie, Addisons Krankheit, Skleroderma, autoimmune atrophische Gastritis, vorzeitige Menopause (wenige Fälle), männliche Unfruchtbarkeit (wenige Fälle), juveniler Diabetes, Goodpasture-Syndrom, Pemphigus vulgaris, Pemphigoid, Sympathische Ophthalmie, phakogene Uveitis, autoimmune hämolytische Anämie, idiopathische thrombozytische Purpura, idiopathische Leukopenie, primäre Gallenzirrhose (wenige Fälle), ulzerative Colitis, Sjögren-Syndrom, Wegener-Granulomatose, Poly-/Dermatomyositis und diskoider Lupus erythematosus.
  • Antigene, die Allergene sind, sind im allgemeinen Proteine oder Glykoproteine, obwohl Allergene auch allergene Haptene mit niedrigem Molekulargewicht sein können, die nach kovalenter Verbindung mit einem Proteinträger (Remington's Pharmaceutical Sciences) eine Allergie auslösen. Allergene beinhalten Antigene aus Pollen, Staub, Schleimpilzen, Sporen, Schuppen, Insekten und Nahrungsmitteln. Spezifische Beispiele beinhalten die Urushiole (Pentadecylcatechol oder Heptadecylcatechol) von Toxicodendron-Arten wie Gift-Efeu, Gifteiche und Giftsumach, und die Sesquiterpen-Lactone von Ambrosien und verwandten Pflanzen.
  • Antigene, die charakteristisch für Tumorantigene sind, werden typischerweise aus der Zelloberfläche, dem Cytoplasma, Zellkern, Organellen und dergleichen von Tumorgewebezellen erhalten. Beispiele schließen Antigene ein, die charakteristisch für Tumorproteine sind, einschließlich Proteinen, die von mutierten Onkogenen codiert werden, viralen Proteinen, die mit Tumoren assoziiert sind und Tumormucinen und – Glykolipiden. Tumore beinhalten solche von den folgenden Krebsorten und Krebstypen, sind aber nicht auf diese beschränkt: Lippe, Nasopharynx, Pharynx und Mundhöhle, Ösophagus, Dickdarm, Rektum, Leber, Gallenblase, Gallenwege, Pankreas, Kehlkopf, Lunge und Bronchus, Melanome von Haut, Brust, Cervix uteri, Uterus, Eierstöcken, Blase, Niere, Gehirn und andere Teile des Nervensystems, Schilddrüse, Prostata, Hoden, Hodgkin-Krankheit, Nicht-Hodgkin-Lymphom, multiples Myelom und Leukämie. Virale Proteine, die mit Tumoren assoziiert sind, wären solche von den oben aufgeführten Virengruppen. Antigene, die charakteristisch für Tumoren sind, können Proteine sein, die nicht üblicherweise von einer Tumor-Vorläuferzelle exprimiert werden, oder können ein Protein sein, daß normalerweise in einer Tumor-Vorläuferzelle exprimiert wird, aber eine Mutation aufweist, die für einen Tumor charakteristisch ist. Ein Antigen, daß für einen Tumor charakteristisch ist, kann eine mutierte Variante eines normalen Proteins mit einer veränderten Aktivität oder subzellulären Verteilung sein. Mutationen von Genen, die zu Tumorantigenen führen, können, zusätzlich zu den oben erwähnten, in der codierenden Region, 5'- oder 3'-nichtcodierenden Regionen oder in Introns von Genen liegen und können das Ergebnis von Punktmutationen, Leserasterverschiebungen, Deletionen, Additionen, Duplikationen, chromosomalen Rearrangements und dergleichen sein. Der Fachmann ist vertraut mit der großen Zahl von Veränderungen der normalen Genstruktur und -expression, die zu einem Tumorantigen führen. Spezifische Beispiele von Tumorantigenen beinhalten: Proteine wie Ig-Idiotypen von B-Zell-Lymphom, mutierte cyclinabhängige Kinase 4 beim Melanom, Pmel-17 (gp100) beim Melanom, MART-1 (Melan-A) beim Melanom, p15-Protein beim Melanom, Tyrosinase beim Melanom, MAGE 1, 2 und 3 beim Melanom, medullären Schilddrüsenkarzinom, kleinzelligem Bronchialkarzinom (small cell lung cancer), Dickdarm und/oder Plattenepithelkrebs (squamous cell cancer), BAGE bei Blasen-, Melanom-, Brust- und Plattenepithelkrebs, gp75 beim Melanom, onkofötales Antigen beim Melanom; Kohlenhydrate/Lipide wie Mucl-Mucin bei Brust-, Pankreas- und Eierstockkrebs, GM2- und GD2-Ganglioside beim Melanom; Onkogene wie p53-Mutante beim Karzinom, ras-Mutante beim Dickdarmkrebs und HER-2/neu-Protoonkogen beim Brustkarzinom; virale Produkte wie Proteine des menschlichen Papillomavirus bei Plattenepithelkrebs des Halses und Ösophagus. Es wird ebenfalls erwogen, daß proteinöse Tumorantigene durch HLA-Moleküle als spezifische Peptide, abgeleitet aus dem Gesamtprotein, präsentiert werden können. Prozessierung von Proteinen durch den Stoffwechsel, um antigene Peptide zu erhalten, ist im Stand der Technik wohlbekannt, siehe z. B. U.S-Patent Nr. 5,342,774 (Boon et al.). Die vorliegende Methode umfaßt daher die Zuführung eines antigenen Peptids und solcher Peptide in einem größeren Polypeptid oder einem ganzen Protein, die zu einem antigenischen Peptid führen. Die Zufuhr antigener Peptide oder Proteine kann zu humoraler oder zellulärer Immunität führen.
  • Im allgemeinen können Subjekte eine wirksame Menge des Tumorantigens und/oder davon abgeleiteten Peptids durch eine oder mehrere der detailliert beschriebenen Verfahren erhalten. Initialdosen können von Booster-Dosen gefolgt werden, gemäß Standard-Immunisierungsprotokollen des Standes der Technik. Die Zufuhr von Tumorantigenen kann daher die Proliferation von zytolytischen T-Lymphozyten anregen.
  • Im Fall von Protein- und Peptidantigenen soll die kovalente Bindung an einen FcRn-Partner die Verknüpfung durch Peptidbindungen in einer einzigen Polypeptidkette einschließen. Etablierte Verfahren würden angewendet, um DNA herzustellen, die ein Fusionsprotein umfassend das Antigenpeptid oder -Protein und einen FcRn-Partner codiert. Diese DNA würde in einen Expressionsvektor plaziert und mit Hilfe etablierter Verfahren in eine Bakterien- oder eukaryontische Zelle eingeführt werden. Das Fusionsprotein würde aus den Zellen oder dem Kulturmedium durch etablierte verfahren aufgereinigt werden.
  • Bei der Verabreichung werden die Konjugate der vorliegenden Erfindung in pharmazeutisch akzeptablen Zubereitungen verabreicht. Solche Zubereitungen können routinemäßig pharmazeutisch annehmbare Konzentrationen von Salz, Puffermitteln, Konservierungsstoffen, kompatiblen Trägern, ergänzende immunpotenzierende Mittel wie Adjuvanzien und Cytokine, und optional andere therapeutische Mittel enthalten. Es werden daher "Cocktails", die die Konjugate und die Mittel enthalten, vorgeschlagen. Die Mittel selbst können an FcRn-Bindungspartner konjugiert werden, um die Zuführung der Mittel über die epitheliale Barriere zu fördern.
  • Die erfindungsgemäßen Konjugate können als solches (unvermischt) oder in der Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes verabreicht werden. Bei Verwendung in der Medizin sollten die Salze pharmazeutisch annehmbar sein, aber nicht pharmazeutisch annehmbare Salze können gewöhnlich zur Herstellung von pharmazeutisch annehmbaren Salzen daraus verwendet werden und werden nicht aus dem Erfindungsbereich ausgenommen. Solche pharmazeutisch annehmbaren Salze beinhalten solche, die aus folgenden Säuren hergestellt werden, sind aber nicht auf diese beschränkt: Salzsäure, Hydrobromsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Maleinsäure, Essigsäure, Salicylsäure, p-Toluolsulfonsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Methansulfonsäure, Ameisensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Naphtalin-2-sulfonsäure und Benzolsulfonsäure. Pharmazeutisch annehmbare Salze können auch als Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze wie Natrium-, Kalium oder Kalziumsalze der Carbonsäuregruppe hergestellt werden.
  • Geeignete Puffermittel beinhalten: Essigsäure und ein Salz (1–2% Gew./Vol.); Zitronensäure und ein Salz (1–3% Gew./Vol.); Borsäure und ein Salz (0,5–2,5% Gew./Vol.); Natriumbicarbonat (0,5–1,0% Gew./vol.); und Phosphorsäure und ein Salz (0,8–2% Gew./vol.). Geeignete Konservierungsmittel beinhalten. Benzalkoniumchlorid (0,003–0,03% Gew./Vol.); Chlorbutanol (0,3–0,9% Gew./Vol.); Paraben (0,01–0,25% Gew./Vol.) und Thimerosal (0,004–0,02% Gew./vol.).
  • Der hier verwendete Begriff "Träger", der unten näher beschrieben wird, bedeutet einen oder mehrere feste oder flüssige Füllmittel, Verdünnungsmittel oder einschließende Substanzen, die für die Verabreichung an einen Menschen oder ein anderes Säugetier geeignet sind. Der "Träger" kann ein organischer oder anorganische Inhaltsstoff sein, natürlich oder synthetisch, mit dem der wirksame Inhaltsstoff kombiniert wird, um die Verabreichung zu erleichtern.
  • Die Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzungen können mit den Konjugaten der vorliegenden Erfindung und miteinander in einer Weise vermischt werden, daß keine Wechselwirkung stattfindet, die die gewünschte pharmazeutische Wirksamkeit wesentlich beeinträchtigen würde. Die Bestandteile von oralen Arzneimittelformulierungen beinhalten Verdünnungsmittel, Bindemittel, Schmiermittel, Gleitmittel, Sprengmittel, Färbemittel und Geschmacksstoffe. Einschließende Substanzen für die Herstellung von magensaftresistenten ("enteric-coated") oralen Formulierungen beinhalten Zelluloseacetat-Phthalat, Polyvinylacetat, Phtalat, Hydroxypropyl-Methylzellulose-Phtalat und Methacrylsäureester-Copolymere. Feste orale Formulierungen wie Kapseln oder Tabletten sind bevorzugt. Elixiere und Sirups sind ebenfalls wohlbekannte orale Formulierungen. Die Bestandteile von Aerosol-Formulierungen beinhalten gelöste wirksame Mittel, Antioxidantien, Lösungsmittelmischungen ("solvent blends") und Treibmittel für Lösungsformulierungen, und "micronized" und suspendierte wirksame Mittel, Dispergiermittel und Treibmittel für Suspensionsformulierungen. Die erfindungsgemäßen oralen, Aerosol- und nasalen Formulierungen können dadurch von injizierbaren Zubereitungen des Standes der Technik unterschieden werden, daß solche Formulierungen nicht-aseptisch sein können, während injizierbare Zubereitungen aseptisch sein müssen.
  • Der Begriff "Adjuvans" soll jede Substanz umfassen, die in das erfindungsgemäße Konjugat aufgenommen ist oder gleichzeitig mit diesem verabreicht wird und die die Immunantwort in dem Subjekt unspezifisch potenziert. Adjuvanzien beinhalten Aluminium-Verbindungen, z. B. Gele, Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat, und Freunds vollständiges oder unvollständiges Adjuvans (bei dem das Konjugat in der wäßrigen Phase einer stabilisierten Wasser-in-Paraffinöl-Emulsion enthalten ist). Das Paraffinöl kann ersetzt werden durch verschiedene Arten von Ölen, z. B. Squalen- oder Erdnußöl. Andere Materialien mit Adjuvans-Eigenschaften schließen BCG (attenuiertes Mycobacterium tuberculosis), Kalziumphosphat, Levamisol, Isoprinosin, Polyanionen (z. B. Poly-A:U), Leutinan, Pertussis-Toxin, Choleratoxin, Lipid A, Saponine und Peptide, z. B. Muramyldipeptid. Seltene-Erden-Salze, z. B. Lanthan und Cerium können ebenfalls als Adjuvanzien verwendet werden. Die Menge von Adjuvans hängt von dem Subjekt und dem verwendeten Konjugat ab und kann vom Fachmann rasch ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand ermittelt werden.
  • Andere ergänzende immunpotenzierende Mittel wie. Cytokine können in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Konjugaten zugeführt werden. Die umfaßten Cytokine sind solche, die die vorteilhafte Wirkung, die aus der Verabreichung der erfindungsgemäßen Immunmodulatoren resultiert, verstärken. Cytokine sind Faktoren, die Wachstum und Reifung von Zellen, einschließlich Lymphozyten, fördern. Es wird angenommen, daß der Zusatz von Cytokinen die Cytokinaktivität in vivo erhöht, die durch Ausführung der erfindungsgemäßen verfahren stimuliert wurde. Die bevorzugten Cytokine sind Interleukin(IL)-1, IL-2, Gamma-Interferon und Tumornekrosefaktor α. Andere vorteilhafte Cytokine können sein IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, Erythropoietin, Leukämieinhibierender Faktor, Oncostatin-M, ziliärer neurotropher Faktor (ciliary neurotophic factor), Wachstumshormon, Prolaktin, CD40-Ligand, CD27-Ligand, CD30-Ligand, Alpha-Interferon, Beta-Interferon und Tumornekrosefaktor β. Andere Cytokine, von denen bekannt ist, daß sie die T-Zell-Aktivität in einer Weise modulieren, die es wahrscheinlich macht, daß sie gemäß der Erfindung vorteilhaft eingesetzt werden können sind Kolonie-stimulierender Faktor und Wachstumsfaktoren einschließlich Granulozyten- und/oder Makrophagen-stimulierende Faktoren (GM-CSF, G-CSF und CSF-1) und Blutplättchen-, Epidermis-, insulinartiger, transformierender und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren. Die Auswahl des jeweiligen Cytokins hängt von der jeweils gewünschten Modulation des Immunsystems ab. Die Wirksamkeit von Cytokinen auf bestimmte Zelltypen ist dem Fachmann bekannt.
  • Die genauen Mengen der vorgenannten Cytokine, die im Rahmen der Erfindung Verwendung finden, hängt von einer. Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich dem gewählten Konjugat, der gewählten Dosis und dem gewählten Dosierplan, der Art der Verabreichung und den Eigenschaften des Subjekts. Die genaue Menge kann ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand ermittelt werden, insbesondere da die Schwellenwertmenge jede Menge sein wird, die die Immunantwort fördert. Es wird daher angenommen, daß Nanogramm- bis Mikrogramm-Mengen wahrscheinlich am geeignetsten sein werden, da physiologische Niveaus von Cytokinen entsprechend niedrig sind.
  • Die erfindungsgemäßen Zubereitungen werden in wirksamen Mengen verabreicht. Eine wirksame Menge ist die Menge von Konjugat, die allein oder zusammen mit weiteren Dosen, eine gewünschte Immunantwort hervorruft. Dies kann die Stimulierung einer humoralen Antikörper-Antwort, resultierend in einem Anstieg des Antikörper-Titers im Serum, verbesserte mukosale Immunität, eine klonale Expansion von zytotoxischen T-Lymphozyten oder Toleranz gegenüber einem Antigen, einschließlich einem Selbst-Antigen, beinhalten. Es wird angenommen, daß Dosen im Bereich von 1 Nanogramm/Kilogramm bis 100 Nanogramm/Kilogramm, abhängig von der Art der Verabreichung, wirksam sein werden. Es wird angenommen, daß der bevorzugte Bereich zwischen etwa 500 Nanogramm und 500 Mikrogramm/Kilogramm liegt, und am meisten bevorzugt zwischen 1 Mikrogramm und 100 Mikrogramm/Kilogramm. Die absolute Menge hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich dem gewählten Konjugat, der gewünschten Immunmodulation, ob die Verabreichung in einer einzigen oder mehreren Dosen erfolgt und individuellen Patientenparametern einschließlich Alter, physischem Zustand, Größe und Gewicht. Zur Behandlung eines Subjekts mit einem Tumor kann die Größe, der Typ, der Ort und Metastasen des Tumors bei der Bestimmung der Menge Konjugat, die zu verabreichen ist, berücksichtigt werden. Diese Faktoren sind dem Fachmann wohlbekannt und können mit Hilfe von Routineuntersuchungen berücksichtigt werden.
  • Eine Vielfalt von Verabreichungswegen ist verfügbar. Die jeweils gewählte Art hängt, natürlich, vom jeweils gewählten Konjugat, dem jeweiligen zu behandelnden Zustand und der erforderlichen Dosierung für eine therapeutische Wirksamkeit ab. Die erfindungsgemäßen Verfahren beinhalten, allgemein gesprochen, die Zuführung des erfindungsgemäßen Konjugates an eine epitheliale Oberfläche. Bevorzugte Verabreichungsarten sind oral, intrapulmonal, intrabiliär und intranasal.
  • Zusammensetzungen können in geeigneter weise in Einheitsdosierformen bereitgestellt werden und können mit Hilfe jeder der auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Alle Verfahren schließen den Schritt ein, das Konjugat in Verbindung mit einem Träger zu bringen, der eine oder mehrere Nebeninhaltsstoffe beinhaltet. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen gefertigt durch gleichmäßiges und enges Zusammenbringen des Konjugats mit einem flüssigen Träger, einem schließlich geteilten Träger, oder beidem, und, wenn nötig, Formen des Produkts.
  • Andere Zuführsysteme können Systeme mit zeitabhängiger, verzögerter oder anhaltender Abgabe beinhalten. Solche Systeme können wiederholte Verabreichungen der erfindungsgemäßen Konjugate vermeiden, wodurch sich die. Annehmlichkeit für das Subjekt und den Arzt erhöhen. viele Typen von Abgabe-/Zuführsystemen sind verfügbar und dem Fachmann bekannt. Sie beinhalten polymerbasierte Systeme wie Polymilchsäure und Polyglykolsäure, Polyanhydride und Polycaprolactone; Wachsüberzüge, komprimierte Tabletten unter Verwendung konventioneller Bindemittel und Arzneiträger und dergleichen. Bio-Haftmittel-Polymersysteme zur Verbesserung der Zufuhr eines Materials an das Darmepithel sind bekannt und in der PCT-Anmeldung WO 93/21906 veröffentlicht. Kapseln zur Zuführung von Mittel an das Darmepithel werden ebenfalls in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 93/19660 beschrieben.
  • BEISPIELE
  • Materialien
  • Abkürzungen
  • BSA, Rinderserumalbumin; cDNA, komplementäre Desoxyribonukleinsäure; CT-B, Choleratoxin B-Untereinheit; DMEM, Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (Dulbecco's modified Eagle's medium); DMSO, Dimethylsulfoxid; DOC, Desoxycholat; ZCL, erhöhte Chemilumineszenz; ELISA, enzymgekoppelter Immunassay (ELISA); HBSS, physiologische Salzlösung nach Hank (Hanks' balanced salt solution) ohne Kalzium oder Magnesium; HEPES, N-[2-hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]; hGH, menschliches Wachstumshormon (human growth hormone); IEC, Darmepithelzellen; KI, Kaliumiodid; MHC, Haupt-Histokompatibilitätskomplex; NaOH, Natriumhydroxid; NH4Cl, Ammoniumchlorid; NHS-Rhodamin, N-Hydroxysuccinimidylrhodamin; RNA, Ribonukleinsäure; RT-PCR, Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (reverse transcriptasepolymerase chain reaction); SATA, N-Succinimdyl-S-acetylthioacetat; SDS-PAGE, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis); Sulfo-LC-SPDP, Sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionamid]-hexanoat; Sulfo-NHS-Biotin, Sulfosuccinimidobiotin; Sulfo-SMCC, Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclo-hexan-1-carboxylat.
  • Chemikalien
  • cDNA-Zyklus-Kits wurden von Invitrogen (San Diego, CA) beschafft. Taq-Polymerase wurde von Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT) beschafft. CircumVentTM-Kits wurden von New England Biolabs (Beverly, MA) beschafft. Radionukleotide und radioaktive Chemikalien wurden von DuPont/NEN (Boston, MA) erhalten. HBSS und DMEM wurden von GIBCO/Life Technologies (Gaithersburg, MD) beschafft. RPMI 1640 wurde von Cellgro (Herndon, Va.) beschafft. L-Glutamin wurde von Cellgro beschafft. Protein-A-Sepharose wurde erhalten von Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Streptavidin-Meerettich-Peroxidase, Sulfo-LC-SPDP, Sulfo-NHS-Biotin, Sulfo-SMCC, SATA und immobilisiertes Ficin wurden erhalten von Pierce (Rockford, IL). Balb/c-Mäuse wurden erhalten von Charles River Laboratories (Wilmington, MA). ECL-Kits wurden beschafft von Amersham (Arlington Heights, IL). Plasmin, AvidChrom-Protein A, Protein-G-Sepharose, BSA, Choleratoxin-B-Untereinheit, Anti-hGH-Antikörper und alle anderen Chemikalien wurden von Sigma (St. Louis, MO) erhalten.
  • Beispiel 1: Expression von FcRn-mRNA in menschlichen Primärzellen und Zellinien des Darmepithels.
  • Die gesamte RNA wurde aus erwachsenen menschlichen Enterozyten mit Hilfe von Standardmethoden, die im Stand der Technik (Sambrook et al., ebd.) wohlbekannt sind, extrahiert. Ein Mikrogramm RNA von jedem Zelltyp wurde als Matrize zur Herstellung des cDNA-Substrates für die Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) unter Verwendung eines cDNA-Zyklus-Kits (Invitrogen, San Diego, CA) eingesetzt. Unter Einsatz der Taq-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) wurden nach Herstellerangaben dreißig PCR-Zyklen mit der cDNA unter Verwendung der Primer TGCTGGGCTGTGAACTG und CGCTTTTAGCAGTCGGAA durchgeführt. Die PCR-Zyklusbedingungen waren: Denaturierung bei 94°C für eine Minute, Anlagerung ("annealing") bei 55°C für zwei Minuten und Extension bei 72°C für drei Minuten. Die Amplifikationsprodukte wurden durch Elektrophorese auf einem 1.5% Agarosegel aufgetrennt und durch Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht, die die Gegenwart des erwarteten ungefähr 800 Basenpaare umfassenden Amplifikationsprodukts in allen Proben mit Ausnahme der adulten Dickdarmepithelzellen zeigte. Um die Identität des RT-PCR-Amplifikationsprodukts zu bestätigen, wurde die DNA-Bande aus dem Agarosegel herausgeschnitten, in pCR II (Invitrogen, San Diego, CA) subkloniert und unter Verwendung eines Prism "Dye-deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit" (Applied Biosystems, Foster City, CA) unter Verwendung von Primern von der Sequenz sowohl des Vektors als auch des menschlichen FcRn sequenziert. Reaktionsprodukte wurden auf einem Applied-Biosystems-Sequenzer analysiert. Die Sequenz des Amplifikationsprodukts stimmte exakt mit. der FcRn-Gensequenz überein und bestätigte die Identität des exprimierten Gens.
  • Beispiel 2: Nachweis von FcRn-mRNA durch Northern-Blot
  • Um die Expression von FcRn in menschlichen Darmepithelzellen und -zellinien zu bestätigen wurde ein Northern-Blot unter Verwendung der RNA-Proben, die wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurden, von adulten menschlichen Enterozyten, und von zwei menschlichen Adenokarzinom-Zellinien vom Dickdarm, Caco-2 und HT-29 hergestellt. Die RNA-Proben wurden durch Formaldehyd/Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Standardverfahren auf eine Nylonmembran übertragen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989). Die Membran wurde mittels Standardmethoden unter Verwendung einer 32Pradiomarkierten 120-Basenpaar-Sonde vom 3'-untranslatierten Bereich von FcRn untersucht.
  • Autoradiogramme des Northern-Blots zeigten die Gegenwart des 1,5-Kilobasen-hFcRn-Transkripts in den Enterozyten und beiden Zellinien. Die Expression von FcRn in adulten menschlichen Darmepithelzellen und – zellinien wurde daher mit Hilfe von zwei verschiedenen RNA-Nachweisverfahren nachgewiesen.
  • Beispiel 3: Markierung und Immunpräzipitation des MHC-Klasse-I-verwandten Fc-Rezeptors (FcRn) aus Darmepithelzellen
  • Die Expression von FcRn in menschlichen Darmepithelzellen wurde bestätigt durch Immunpräzipitation des Proteins. Caco-2-Zellen wurden metabolisch unter Verwendung von 35S-Methionin (DuPont/NEN, Boston, Mass.) markiert und Proteine wurden mittels im Stand der Technik (Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual) wohlbekannter verfahren extrahiert. Ein für die schwere Kette von MHC-Klasse-I-verwandtem FcR spezifisches polyklonales Kaninchen-Anti-Ratte-Antiserum, gebunden an Protein-A-Sepharose, wurde verwendet, um FcRn aus Zellextrakten unter Anwendung von Standardmethoden zu immunpräzipitieren (FcRn kann durch bewährte Verfahren gereinigt werden, Simister und Rees 1985, European J. Immunology, 15: 733–8, und zur Immunisierung von Ratten verwendet werden, mit anschließendem Entnehmen von Serum, Harlow und Lane, s. oben). Immunpräzipitate wurden mit Hilfe von SDS-PAGE getrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Ein 48-Kilodalton FcRn-Protein wurde festgestellt, die Expression, die auf RNA-Ebene beobachtet wurde, bestätigend.
  • Beispiel 4: Expression von FcRn-Protein auf der Zelloberfläche von menschlichen Darmepithelzellen
  • Etwa 3 × 107 HT-29-Darmepithelzellen wurden durch nicht-enzymatische Verfahren von Gewebekulturplatten abgelöst und wurden viermal mit eiskalter physiologischer Salzlösung nach Hank ohne Kalzium und Magnesium (HBSS, GIBCO/Life Technologies, Gaithersburg, MD) gewaschen. Zur Markierung von Zelloberflächenproteinen wurden die gewaschenen Zellen zweimal für 20 Minuten mit 1,5 ml von 0,5 mg/ml Sulfo-NHS-Biotin (Pierce, Rockford, IL) in DMSO inkubiert. Markierte Zellen wurden fünfmal mit 50 mM NH4Cl gewaschen, 20 Minuten mit 10 ml RPMI 1640 (Cellgro, Herndon, VA), enthaltend 1 mM L-Glutamine (Mediatech, Washington, DC), inkubiert und viermal mit HBSS gewaschen. Die Zellen wurden lysiert, dann über Nacht mit Protein-A-Sepharose-Perlen (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) unter Anwendung von im Stand der Technik wohlbekannter Standardtechniken vorgereinigt. SDS und Desoxycholsäure (DOC) wurden zum Überstand zu einer Endkonzentration von 0.1% bzw. 0.5% hinzugefügt. Die Lysate wurden mit normalem Kaninchenserum vorgereinigt und mit polyklonalem Kaninchen-Anti-Ratte-MHC-Klasse-I-verwandtem FcR-Antikörper durch im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren immunpräzipitiert. Immunpräzipitate wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembranen transferiert. Die Nitrozellulosemembran wurde für die Inkubation mit 1 : 10000 verdünnter Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (Pierce, Rockford IL) nach Anweisung des Herstellers behandelt. Die Membran wurde dann für die Detektion von gebundener Meerrettich-Peroxidase unter Anwendung eines ECL-Kits (Amersham, Arlington Heights, IL) behandelt.
  • Licht, daß bei der Spaltung des chemilumineszierenden Substrates ausgesendet wurde, wurde detektiert, indem die Membran einem lichtempfindlichen Film ausgesetzt wurde. Die Filmbelichtung zeigte, daß FcRn an der Oberfläche von HT-29-Darmepithelzellen exprimiert wurde.
  • Beispiel 5: Funktionale Aktivität von menschlichem FcRn an der Zelloberfläche von Darmepithelzellen
  • Um zu zeigen, daß der an der Oberfläche von Darmepithelzellen exprimierte FcRn funktionstüchtig war, wurden Caco-2-Zellen und menschliche adulte jejunale Darmepithelzellen (IECs) auf die Fähigkeit getestet, das Fc-Fragment von Antikörpern zu binden. Caco-2 und jejunale IECs wurden auf Mikrozentrifugengefäße verteilt (2 × 106 Zellen pro Gefäß) und bei 2000 UPM für 2–3 Minuten bei 4°C niedergeschlagen. Zellniederschläge wurden einmal in DMEM mit 20 mM HEPES, pH 6,0 oder pH 8,0, bei 4°C gewaschen und in 0,2 ml desselben Mediums resuspendiert. Für den Nachweis wurden die Zellsuspensionen in 12-Loch-Platten transferiert. 125I-Fc-Fragment (200 ng/ml, 4 × 10–9 M) in DMEM mit 20 mM HEPES, 1,0 mM KI und 0,1% Fischgelatine, pH 6,0 oder pH 8,0, mit oder ohne 0,5 mg/ml unmarkiertem menschlichen IgG (3,3 × 106 M) wurden zu jedem Loch zugefügt. Die Zellen wurden bei 37°C für zwei Stunden in einer befeuchteten 5% CO2-Atmosphäre an IgG oder Fc gebunden. Die Zellen wurden zu Mikrozentrifugengefäßen transferiert und bei 2000 UPM für 2–3 Minuten bei 4°C niedergeschlagen. Ungebundenes 125I-Fc wurde durch einmaliges Waschen des Niederschläge mit kaltem DMEM, enthaltend 20 mM HEPES, pH 6,0 oder pH 8,0, bei 4°C entfernt. Die Zellen wurden in 0,5 ml 0,1 M NaOH lysiert und die resultierende Lösung zu Szintillationsgefäßen transferiert . 125I wurde unter Verwendung eines CliniGamma-1272-Gammazählers (LKB Wallac, Piscataway, NJ) quantifiziert. Sowohl Caco-2-Zellen als auch menschliche adulte Jejunum-IECs banden spezifisch 125I-Fc bei pH 6,0, aber nicht bei pH 8,0, wodurch eine funktionierende pH-abhängige Bindung gezeigt wurde, wie sie bei Rattenneugeborenen-FcRn und kloniertes menschliches FcRn beobachtet wurde (Story et al., J. Exp. Med. 180: 2377–2381; Dezember 1994).
  • Beispiel 6: Herstellung von menschlichem Immunglobulin G
  • Nicht-spezifisches gereinigtes Immunglobulin G von Mensch, Maus, Ratte, Ziege, Schwein, Kuh und anderen Arten kann von kommerziellen Lieferanten wie Sigma Chemical Co., Pierce Chemical, HyClone Laboratories, ICN Biomedicals und Organon Teknika-Cappei erhalten werden.
  • Immunglobulin G kann auch durch Ammoniumsulfatpräzipitation von Blutserum isoliert werden. Das Proteinpräzipitat wird durch Ionenaustausch-Chromatographie oder Gelfiltrations-Chromatographie weiter fraktioniert, um im wesentlichen gereinigtes nicht-spezifisches IgG zu isolieren. Unter nicht-spezifischem IgG wird verstanden, daß keine einzelne Spezifität innerhalb der Antikörper-Population oder dem Antikörper-Pool dominiert.
  • Immunglobulin G kann aus Blutserum auch durch Adsorption an Protein A, das an einen festen Träger wie Protein-A-Sepharose (Pharmacia), AvidChrom-Protein A (Sigma), oder Protein-G-Sepharose (Sigma) gebunden ist, auf gereinigt werden. Andere Verfahren zur Reinigung von IgG sind dem Fachmann wohlbekannt und können zum Zweck der Isolierung von nicht-spezifischem IgG verwendet werden.
  • Beispiel 7: Herstellung von menschlichem Immunglobulin-G-Fc-Fragment
  • Zur Herstellung des Fc-Fragments von menschlichem IgG wurde IgG wie in Beispiel 6 isoliert und der Verdauung durch immobilisiertes Papain (Pierce) nach dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll ausgesetzt Andere Proteasen, die IgG verdauen und dabei intaktes Fc-Fragment bilden, das an Fc-Rezeptoren bindet, z. B. Plasmin (Sigma) oder immobilisiertes Ficin (Pierce), sind den Fachleuten bekannt und können zur Herstellung von Fc-Fragmenten verwendet werden. Das verdaute Immunglobulin wird dann mit einer Affinitätsmatrix wie Protein-A-Sepharose oder Protein-G-Sepharose inkubiert. Nicht-bindende Teile von IgG werden von der Affinitätsmatrix durch ausgiebiges Waschen im Batch- oder Säulenverfahren eluiert. Fc-Fragment von IgG werden dann durch Zugabe von einem Puffer, der inkompatibel mit der Fc-Adsorbensbindung ist, eluiert. Andere Verfahren, die für die Aufreinigung von Fc-Fragmenten wirksam sind, können ebenfalls eingesetzt werden.
  • Beispiel 8: Konjugation von Verbindungen an menschliche Immunglobulin-Fc-Fragmente
  • Um Verbindungen über den FcRn-Transportmechanismus zuzuführen, können solche Verbindungen an ganzes IgG oder an Fc-Fragmente gekoppelt werden. Die Chemie des Quervernetzens und wirksame Reagenzien für diese Zwecke sind in der Fachwelt wohlbekannt. Im Rahmen der Erfindung sind die Beschaffenheit des quervernetzenden Reagenz, das für die Konjugation von ganzem IgG oder Fc-Fragmenten verwendet wird, und die zuzuführende Verbindung nicht beschränkt. Jedes quervernetzende Mittel kann verwendet werden, vorausgesetzt a) die Wirksamkeit der Verbindung bleibt erhalten und b) die. Bindung des Fc-Teils des Konjugates durch FcRn wird nicht nachteilig beeinflußt.
  • Ein Beispiel einer wirksamen Ein-Schritt-Quervernetzung von Fc und einer Verbindung ist die Oxidation von Fc mit Natriumperiodat in Natriumphosphatpuffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von Übernacht-Inkubation bei 4°C mit der zu konjugierenden Verbindung. Die Konjugation kann auch mittels Derivatisierung sowohl der Verbindung als auch des Fc-Fragments mit Sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionamid]-hexanoat (Sulfo-LC-SPDP, Pierce) für 18 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Die Konjugation kann auch mittels Derivatisierung von Fc-Fragmenten und der gewünschten zuzuführenden Verbindung mit verschiedenen quervernetzenden Reagenzien, die anschließend eine kovalente Bindung ausbilden, hergestellt werden. Ein Beispiel einer solchen Reaktion ist die Derivatisierung von Fc-Fragmenten mit Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclo-hexan-1- carboxylat (Sulfo-SMCC, Pierce), und die an Fc zu konjugierende Verbindung wird mit N-succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA) thioliert. Die derivatisierten Verbindungen werden vom Quervernetzer gereinigt und bei Raumtemperatur für eine Stunde zusammengeführt, um die Quervernetzung herbaizuführen. Andere quervernetzende Reagenzien, umfassend Aldehyd-, Imid-, Cyano-, Halogen, Carboxyl-, aktivierte Carboxyl-, Anhydrid- und Maleimid-Gruppen, sind dem Fachmann bekannt und können ebenfalls zur Konjugierung von Verbindungen an Fc-Fragment verwendet werden. Die Wahl des quervernetzenden Reaktionsmittels hängt natürlich von der Beschaffenheit der Verbindung ab, die an Fc konjugiert werden soll. Die oben beschriebenen quervernetzenden Reaktionsmittel sind bei Potein-Protein-Konjugationen wirksam. Wenn die zu konjugierende Verbindung ein Kohlenhydrat ist oder eine Kohlenhydratkomponente aufweist, sind heterobifunktionale quervernetzende Reaktionsmittel wie ABH, M2C2H, MPBH und PDPH vorteilhaft für die Konjugation mit einem proteinösen FcRn-Bindungsmolekül (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Ein anderes Verfahren zur Konjugierung von Proteinen und Kohlenhydraten ist von Brumeanu et al. (Genetic Engineering News, Okt. 1, 1995, S. 16) offenbart worden. Wenn die zu konjugierende Verbindung ein Lipid ist oder eine Lipidkomponente aufweist, die für das FcRn-Bindungsmolekül als Ort für die Konjugation geeignet ist, können Quervernetzer wie SPDP, SMPB und Derivate davon verwendet werden (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Es ist auch möglich, jedes Molekül, das durch nicht-kovalente Mittel zugeführt werden soll, zu konjugieren. Ein geeigneter weg zur Erreichung nichtkovalenter Konjugation ist es, durch in der Fachwelt wohlbekannte Verfahren Antikörper, wie beispielsweise monoklonale Antikörper, gegen die zuzuführende Verbindung zu erzeugen, und einen monoklonalen Antikörper mit der korrekten Fc-Region und gewünschten antigenbindenden Eigenschaften zu selektieren. Das zuzuführende Antigen wird dann vorweg an den monoklonalen Antikörperträger gebunden. Bei allen obigen quervernetzenden Reaktionen ist es wichtig, die derivatisierte Verbindung von quervernetzendem Reaktionsmittel zu reinigen. Es ist ebenfalls wichtig, das endgültige Konjugat im wesentlichen frei von unkonjugierten Reaktanden zu reinigen. Die Aufreinigung kann durch Affinitäts-, Gelfiltration oder Ionenaustausch-Chromatographie, basierend auf den Eigenschaften der jeweiligen Komponente des Konjugats, erreicht werden. Eine besonders bevorzugte Methode besteht in einem ersten Affinitäts-Reinigungsschritt unter verwendung von Protein-A-Sepharose, um Fc und Fc-Verbindungs-Konjugate zu erhalten, gefolgt von Gelfiltration oder Ionenaustausch-Chromatographie basierend auf der Masse, Größe oder Ladung des Fc-Konjugates. Der erste Schritt dieser Reinigungsprozedur stellt sicher, daß das Konjugat an FcRn bindet, was eine wesentliche Voraussetzung der Erfindung ist.
  • Beispiel 9: IgG-erleichterte Zufuhr von Fremdantigen über die Darmepithelbarriere
  • Um die Fähigkeit von Fc-Bindungspartner-Antigen-Konjugaten, über die Epithelbarriere transportiert zu werden, zu überprüfen, werden Fremdantigene zur Verabreichung an Mäuse an IgG-Moleküle konjugiert. Ein geeignetes Fremdantigen ist der fluoreszierende Farbstoff Rhodamin, da er in gefrorenen Semi- Dünnschnitten von Darmepithel sichtbar gemacht werden kann. Rhodamin wird durch Inkubation mit Succinylrhodamin (Molecular Probes, Eugene, Oreg.) nach Herstellerangaben kovalent an nicht-spezifisches Maus-IgG, hergestellt wie in Beispiel 6 beschrieben, Choleratoxin-B-Untereinheit (Sigma) und Ovalbumin (Sigma) gebunden. Das IgG-Rhodamin-Konjugat wird durch Protein-G-Sepharose-Affinitäts-Chromatographie gereinigt. Nach Dialyse zur Entfernung von unkonjugiertem Succinylrhodamin werden Choleratoxin-B(CT-B)-Rhodamin und Ovalbumin-Rhodamin-Konjugate durch Gelfiltration oder Ionenaustausch-Chromatographie aufgereinigt. Fraktionen des Eluats werden auf die Anwesenheit von Konjugaten durch Bestimmung der, Fluoreszenz untersucht. Funktionale Bindung von den IgG- und CT-B-Untereinheit-Konjugaten kann durch Bindung an FcRn bzw. Gangliosid GM1 untersucht werden. Choleratoxin-B-Rhodamin und Ovalbumin-Rhodamin dienen als positive bzw. negative Kontrollen.
  • Balb/c-Mäusen werden 0,2 Nanomol der drei oben beschriebenen Rhodamin-Konjugate mit oder ohne 0,2 Nanomol unmarkiertem Choleratoxin als nicht-spezifischem Adjuvans durch intragastrische Verabreichung in Gegenwart von 75 Mikromol NaHCO3 und 20 mg/ml Sojabohnen-Trypsininhibitor zur Hemmung des Abbaus im Magen verabreicht. Nach 6 Stunden wurden die Mäuse getötet und der Darm wurde entfernt, gefroren und für die Semi-Dünnschnitte vorbereitet. Abschnitte des Darmepithels werden auf einem Fluoreszenzmikroskop beleuchtet und auf intrazelluläre Fluoreszenz untersucht. Die Anwesenheit von Fluoreszenz in Darmepithelzellen von Mäusen, die mit IgG-Rhodamin gefüttert wurden, zeigt, daß die IgG-Konjugate wirksam in apikal zu basolateraler Richtung über die Darmepithelbarriere transportiert werden. FcRn ist in der Lage, Immunogene als Konjugate mit FcRn-Bindungspartnern zu transportieren.
  • Beispiel 10: Mukosale Immunantwort der Maus bei oral zugeführtem Antigen-IgG-Konjugat über FcRn-vermittelte Transzytose
  • Transgene Mäuse, die homozygot sind für Deletionen von β2-Mikroglobulin (eine kritische Komponente der Fc-Rezeptorfunktion), und ihre normalen Wildtyp-Wurfgefährten werden für Untersuchungen zur Erzeugung einer mukosalen Immunantwort verwendet. wenn Rhodamin-IgG eine mukosale Immunantwort durch Bindung an Fc-Rezeptoren der apikalen Membran auslöst, sollte eine positive Immunantwort im Wildtyp, nicht aber in β2-Mikroglobulin-"Knockout"-Mäusen, gefunden werden. Im Gegensatz dazu sollte die Rhodamin-Choleratoxin-B-Untereinheit (CT-6) eine positive Immunantwort sowohl im Wildtyp als auch den "Knockout"-Mäusen auslösen, da die Transzytose von CT-6 über die epitheliale Barriere nicht von der Bindung an Fc-Rezeptoren der apikalen Membran abhängt. Rhodamin-Ovalbumin dringt nicht in Transzytose-Vesikel ein (kann aber durch Flüssigphasen-Endozytose in Darmepithelien eindringen) und sollte in keiner der Mäuse eine Immunantwort auslösen.
  • Drei Gruppen von Wildtyp- und β2-Mikroglobulin-"Knockout"-Mäusen werden oral mit den drei in Beispiel 9 beschriebenen Konjugaten immunisiert. Parallel werden Experimente mit der Zugabe von 0,2 Nanomol Choleratoxin als nicht-spezifischem Rdjuvans durchgeführt. Equimolare Mengen der Rhodamin-Konjugate werden intragastrisch verabreicht. Die Mäuse werden durch diese Methode alle zehn Tage insgesamt drei Mal "immunisiert". Zwei Wochen nach der dritten oralen Immunisierung werden die Mäuse getötet und die Rhodamin-spezifische Immunantwort durch ELISA an Darmsekreten und Serum mit Hilfe von Standardtechniken bestimmt Anti-Rhodamin-Serum-Immunglobuline sind am deutlichsten in den Wildtypmäusen, die mit Rhodamin-Konjugaten von CT-B und IgG gefüttert wurden, nachzuweisen. Knockout-Mäuse, die kein β2-Mikroglobulin aufwiesen, erzeugen eine mukosale Immunantwort auf Rhodamine-CT-B, aber nicht auf Rhodamin-IgG, was darauf hindeutet, daß rezeptorvermittelte Transzytose eine wichtige Rolle bei der mukosalen Immunantwort spielt. Die Kontroll-Rhodamin-Ovalbumin-Konjugate erzeugten geringe oder keine Immunantworten in den Wildtyp oder β2-Mikroglobulin-Knockout-Mäusen.

Claims (9)

  1. Verwendung eines Konjugats von einem Molekül, gekoppelt an einen FcRn-Bindungspartner, der humanen FcRn bindet, für die Herstellung eines Medikamentes zur transepithelialen Behandlung eines Patienten, wobei genanntes Medikament zur Verabreichung an eine epitheliale Barriere eines Patienten zwecks Abgabe des Moleküls über die epitheliale Barriere des Patienten angepasst ist.
  2. Verwendung eines Konjugats von einem Molekül, gekoppelt an einen FcRn-Bindungspartner, der humanen FcRn nach Anspruch 1 bindet, für die Herstellung eines Medikamentes für die transepitheliale Modulation des Immunsystems eines Patienten, wobei genanntes Medikament zur Verabreichung an eine epitheliale Barriere eines Patienten zwecks Abgabe des Moleküls über die epitheliale Barriere des Patienten angepasst ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Molekül ein Antigen oder ein Therapeutikum ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Molekül ein Cytokin ist.
  5. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Molekül ein Antigen, charakteristisch für einen Tumor, charakteristisch für einen Erreger, charakteristisch für ein Allergen oder charakteristisch für eine Autoimmunkrankheit ist.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, worin der FcRn-Bindungspartner nicht spezifisches IgG oder ein FcRn-Bindungsfragment von IgG ist.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, worin der FcRn-Bindungspartner ein Fc-Fragment von IgG ist.
  8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, worin der FcRn-Bindungspartner kovalent an das Molekül gekoppelt ist.
  9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–8, worin das Präparat zwecks Abgabe an eine epitheliale Barriere als eine orale Dosierung, eine Aerosol-Dosierung oder eine intranasale Dosierung gestaltet und angeordnet ist.
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