DE69815828T2

DE69815828T2 - Verwendung von mikropartikeln, auf denen ein protein und ein antikörper adsorbiert sind, zur herstellung eines arzneimittels zur intranasalen verabreichung

Info

Publication number: DE69815828T2
Application number: DE69815828T
Authority: DE
Inventors: Dario Cremaschi; Cristina Porta
Original assignee: Aziende Chimiche Riunite Angelini Francesco ACRAF SpA
Current assignee: Angelini Acraf SpA
Priority date: 1997-04-14
Filing date: 1998-04-08
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2018-04-09
Also published as: SK282398B6; US20020058069A1; HU225523B1; BG64269B1; CZ362499A3; EA002324B1; PL189918B1; CN1252712A; UA62961C2; EP0971703B9; EP0971703A1; DK0971703T3; ES2201492T3; ITMI970856A1; EP0971703B1; CA2288970A1; CA2288970C; BG103873A; AU742079B2; AU7526098A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Mikropartikels mit einem Protein und einem Antikörper daran adsorbiert zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die intranasale Verabreichung.
In der vorliegenden Beschreibung und den darauf folgenden Ansprüchen umfaßt die Bezeichnung "Protein" jede Verbindung einer Kondensation von zwei oder mehr Aminosäuren. Die Bezeichnung umfaßt daher biologisch aktive Peptide, Polypeptide und Proteine, ist jedoch nicht darauf begrenzt.
Es ist bekannt, daß bei verschiedenen Tierarten, einschließlich dem Menschen, die Absorption von Proteinen, die über den nasalen Weg verabreicht werden, mehr als 40% für Peptide mit 3 bis 6 Aminosäuren (AA) beträgt, ungefähr 10 bis 15% für Polypeptide mit 9 bis 27 AA und weniger als 1% für Polypeptide mit einem höheren Molekulargewicht (zum Beispiel für Insulin (51 AA) ist die Absorption fast Null), obwohl es deutliche Unterschiede für dasselbe Peptid zwischen Arten gibt oder selbst zwischen verschiedenen Individuen derselben Spezies (Lee W. A., Longenecker J. P., "Biopharm. Manufact." April S. 1–7 (1988)).
Daher wurden Ausgang der 80er Jahre nur 3 Nonapeptide als solche (Desmopressin, Lypressin, Oxytocin) auf dem Nasalweg verabreicht und Proteaseinhibitoren und Verstärker des Transits durch die nasale muköse Membran wurden mit Beginn der 80er studiert. Im allgemeinen sind diese Verstärker Tenside, die die passive Permeabilität der nasalen mukösen Membran erhöhen. Aufgrund dessen war es möglich, Formulierungen für die intranasale Verabreichung von Calcitonin (32 AA), Insulin (51 AA), Wachstumshormon (191 AA) und anderen Proteinen und hochmolekularen Polypeptiden bereitzustellen (Lee W. A., Longenecker J. P., "Biopharm. Manufact." April S. 1–7 (1988); Verhoef J. C. et al., "Eur. J. of Drug Metab. and Pharmacokin.", 15, 83 (1990); Mishima M. et al., "J. Pharmacobio-Dyn." 10, s. 69 (1987); Mishima M. et al. "J. Pharmacobio-Dyn." 12, 32 (1989); Watanabe Y. et al., "Chem. Pharm. Bull." 40, 3100 (1992); Schipper N. G. M. et al., "Pharmaceutical Res. 10, 682 (1993); Shao Z. et al., "Pharmaceutical Res." 11, 1174 (1994)).
Die Verstärker haben jedoch, da sie im wesentlichen Tenside sind, den Nachteil einer Schädigung der mukösen Membran in mehr oder weniger starker Weise und mehr oder weniger reversibel, wodurch sie die passive Permeabilität derselben erhöhen.
In einem Versuch, die Absorption zu begünstigen, sind auch Verzögerungsmittel für den nasalen Transit verwendet worden, wie z. B. viskose Mittel, adhäsive Polymere und ähnliches, und die erhaltenen Resultate sind nur mäßig. Verzögerungsmittel weisen jedoch außerdem toxische Wirkungen auf die muköse Membran und die Zilien auf.
Um diese Nachteile zu überwinden wurde eine Verabreichung von Arzneimitteln vorgeschlagen, inkorporiert in Mikrosphären von Stärke, die nicht absorbiert werden, da sie zu groß sind, die jedoch im nasalen Lumen teilweise hydratisiert werden und die vorher inkorporierten Peptide langsam freisetzen (Illum L. et a., "Int. J. Pharm." 39, 189 (1987); Björk E., Edman P., "Int. J. Pharm." 47, 233 (1988)). Auf diese Weise wurde zusammen mit einer Verbesserung der Absorption von kleinen und mittelgroßen Molekülen eine Verzögerungswirkung erhalten. Die Absorption von großen Molekülen hat sich jedoch nicht verbessert, da die muköse Membran nicht betroffen ist.
EP-A-0 474 453 offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung für die nasale Verabreichung, umfassend i) ein Protein und ii) eine wärmelabile Enterotoxin B Untereinheit (LTB). Der Protein/LTB-Komplex stellt eine Erhöhung der Absorption des Proteins auf dem nasalen Weg im Vergleich mit der Verabreichung des Proteins alleine bereit (siehe Tabelle 1). LTB ist jedoch nicht ein Antikörper und der Protein/LTB-Komplex wird nicht von einem Mikropartikel getragen. Weiterhin berichtet EP-A-0 474 453 nicht über die Absorption des Protein/LTB-Komplexes durch die nasale Mukosa gegenüber der intestinalen Mukosa.
EP-A-0 681 833 offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung für die nasale Verabreichung, umfassend i) ein Protein, adsorbiert auf einen ii) polyvalenten Metallträger. Von dieser Zusammensetzung wird gesagt, daß sie eine gleiche oder höhere Bioverfügbarkeit bereitstellt verglichen mit derjenigen, die durch Injektion oder orale Verabreichung erhalten wird. Tabelle 1 der EP-A-0 681 833 zeigt jedoch, daß der Unterschied in der Bioverfügbarkeit des Insulins über den nasalen Weg nur zweifach höher ist als der über den subkutanen Weg, von dem wiederum bekannt ist, daß er eine höhere Bioverfügbarkeit bereitstellt als der orale Weg.
Schließlich offenbart die PCT-Patentanmeldung WO 94/28879 eine pharmazeutische Zusammensetzung für die orale Verabreichung, umfassend ein biologisch aktives Material, einen Antikörper, der spezifisch an das biologisch aktive Material bindet, und eine Vielzahl von Mikropartikeln aus einem polymeren Material. Insbesondere gehört das biologisch aktive Material zu der Familie der Peptide, Polypeptide und Proteine. Vorzugsweise sind die Mikropartikel Mikrosphären aus Polystyrol.
Das biologisch aktive Material und die Antikörper werden an die Mikropartikel adsorbiert und die letzteren werden durch das Epithelium endozytosiert, das die Follikel der Peyerschen Haufen in der Maus beschichtet. Es ist daher möglich, in einem Labortier sowohl die Quantität der Mikropartikel, die die Trägerzellen betreten (Aufnahme) als auch die Quantität der Mikropartikel, die effektiv transmural passieren und die Lymphe im mesenteralen Gang erreichen, der alles transportierte Material sammelt, zu berechnen.
Bei der oben erwähnten Anmeldung wurde der wirksamste Transport durch Verwendung von bovinem Wachstumshormon als Protein und dem spezifischen Antikörper desselben, bGH-Ab, als Antikörper erhalten.
Aufnahmemessungen wurden durch in vivo Insertion ins Jejunum und Ileum der Ratte von 3,6 × 10¹¹ beschichteten Mikropartikeln, Fixieren des Gewebes nach 90 Minuten und Durchführung der Messung durchgeführt (6 Endozytose-Zyklen in 90 Minuten wurden in der Berechnung in die Betrachtung mit einbezogen).
Die erhaltenen Ergebnisse waren die folgenden:

a) Gesamtaufnahme nach 90 Minuten durch 40 cm²: 8.400.000 Mikropartikel [Ertrag = 0, 023‰ (= 8.400.000 (3,6 × 10¹¹)].
b) Gesamtaufnahme pro Bereichseinheit in 90 Minuten durch 40 cm²: 210.000 Mikropartikel/cm² [Ertrag/cm² = 0,00058‰ (= 210.000/3,6 × 10¹¹)].

Weiterhin wurden transmurale Flußmessungen durchgeführt, indem in vivo in das Jejunum und das Ileum der Ratte 3,6 × 10¹¹ beschichtete Mikropartikel inseriert wurden und die Lymphe von dem mit einer Kanüle versehenen mesenteralen Gang alle 5 Minuten gesammelt wurde.
Die Ergebnisse waren die folgenden:

a) Transmuraler Transport auf 40 cm² in 90 Minuten: 65.000 Mikropartikel [Ertrag auf 40 cm² = 65.000/3,6 × 10¹¹ (= 0,00018‰)];
b) Transmural in 90 Minuten/cm² transportiertes Material: 1.625 Mikropartiel/cm² [Ertrag/cm² = 4,4 × 10^–9 (= 0,0000044‰)].

Diese Daten zeigen, daß der Endozytose-Ertrag im Intestinaltrakt 130 mal (2,3 × 10^–5/1,8 × 10^–7) höher als der Ertrag des transmuralen Transports ist. Dies bedeutet, daß von 130 endozytosierten Partikeln 129 in dem Lymphgewebe der Peyerschen Haufen gefangen bleiben und nur 1 in die Lymphe passiert.
Es wurde nun überraschend festgestellt, daß der Ertrag des aktiven Transports in der nasalen mukösen Membran eines Proteins und des spezifischen Antikörpers dieser Substanz, adsorbiert auf Mikropartikeln aus einer polymeren Substanz, 400.000-fach höher ist als der im Intestinaltrakt.
Insbesondere, da die Absorptionsdaten in Experimenten im Intestinaltrakt in vivo erhalten wurden, beziehen sich diese Daten auf einen Einfluß (Lumen-Lymphe), umfassend sowohl den aktiven als auch den passiven parazellulären Transport, der den Ertrag erhöht. Basierend auf dieser anfänglichen Annahme ist das Verhältnis des Ertrags von nasalem und intestinalen Transport zweifellos höher als die vorher erwähnten 400.000 Mal.
Tatsächlich wurde die nasale muköse Membran isoliert in vitro untersucht und es war möglich, die beiden gegenübergesetzten, unidirektionalen Flüsse von beschichteten Mikropartikeln zu messen, und die Nettoabsorption wurde als Differenz dieser Flüsse berechnet. Die Nettoabsorption der nasalen mukösen Membran beinhaltet daher nicht die einfließende passive Komponente sondern ist, anders als im Hinblick auf den Bericht für den Intestinaltrakt, nur das Ergebnis einer aktiven Absorption.
Es ist außerdem wichtig festzuhalten, daß zusätzlich zu dem außerordentlich günstigen Ertragsverhältnis, im allgemeinen der nasale Weg ebenfalls vorteilhafter im Vergleich zu dem oralen Weg darin ist, daß die absorbierte Substanz nicht durch das schwierige Verdauungssystem des Gastrointestinaltrakts durchgeführt werden muß, und wenn sie dann in den Kreislauf eingetreten ist, nicht plötzlich durch die Leber geführt werden muß.
Daher ist es eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung eines Polymeren eines Mikropartikels mit einem Protein und einem Antikörper daran adsorbiert zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die intranasale Verabreichung bereitzustellen.
Das Protein wird vorzugsweise aus der Gruppe gewählt, umfassend BSA (bovines Serumalbumin), Insulin, Enzephalin, Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Koagulationsfaktoren, Neuropeptide, antimikrobielle Mittel und Fragmente davon. Der Antikörper ist wiederum ein Immunglobulin, ausgewählt aus der Gruppe umfassend IgM, IgA und IgG. Das Immunglobulin ist vorzugs weise spezifisch für das Protein. Die Mikropartikel sind vorzugsweise Mikrosphären aus nicht-immunogenen polymeren Materialien, wie z. B. Polystyrol, Latex oder anderen Polymeren. Optional ist das polymere Material vom bioabbaubaren Typ.
Vorzugsweise wird die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung in geeigneter Dosierungsform hergestellt, umfassend eine effektive Dosierung eines Proteins und eines Antikörpers, adsorbiert auf Mikropartikeln aus polymerem Material zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen inerten Bestandteil.
Beispiele für geeignete Dosierungsformen für die Verabreichung durch den intranasalen Weg sind Cremes, Salben, Aerosole, Sprays und Tropfen.
Die Dosierungsformen können auch andere konventionelle Bestandteile enthalten, wie z. B. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Puffer, Salze zur Einstellung des osmotischen Drucks, Emulgatoren, Geschmacksstoffe und ähnliches.
Die Menge des Proteins und des Antikörpers in der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann in einem breiten Bereich in Beziehung zu bekannten Faktoren variieren, wie z. B. dem Zustand und der Schwere der Krankheit, dem Körpergewicht des Patienten, der Anzahl der täglichen Dosierungen und der Aktivität des gewählten Proteins. Die optimale Quantität kann nichtsdestotrotz einfach und auf dem Routineweg durch den Fachmann bestimmt werden.
Im allgemeinen liegt das Protein/Immunglobulin-Verhältnis bei 1 zu 15.000 Mol Protein für jedes Mol Immunglobulin. Vorzugsweise bei 1 bis 5.000, noch bevorzugter bei 1 bis 100 Mol Protein für jedes Mol Immunglobulin.
Weiterhin kann die Quantität pro Gewicht des Proteins in der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung einfach im individuellen Fall durch den Fachmann auf der Basis der bekannten Aktivität des verwendeten Proteins bestimmt werden.
Die Dosierungsformen der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung können durch dem pharmazeutischen Chemiker wohlbe kannte Verfahren hergestellt werden, umfassend das Vermischen, Granulieren, Pressen, Auflösen, Sterilisieren und ähnliches.
Die Aktivität der zusammen mit den für die betrachteten Proteine spezifischen Antikörper auf die Mikropartikel adsorbierten Proteine wurde durch die unten beschriebenen Experimente bewertet.
Beispiel 1
Transport von Mikropartikeln auf dem intranasalen Weg
Zwei heterolaterale nasale muköse Membranen, isoliert aus männlichen Neuseeland Albinokaninchen (Körpergewicht 3–3,5 kg) wurden für das Experiment verwendet, nach Opferung durch zervikale Luxation. Die Bereiche der mukösen Membran, korrespondierend zu der Concha nasalis superior wurden mit Krebs-Henseleit-Lösung gewaschen ("Comp. Biochem. Physiol.", Cremaschi D. et al., 99A, 361 (1991); "Biochem. Biophys. Acta", Cremaschi D. et al., 27, 1280 (1996)) und dann in Teflon in einer Ussing-Kammer (exponierter Bereich 0,3 cm²) angeordnet und mit Krebs-Henseleit-Lösung inkubiert und bei 27 ± 1°C gehalten.
Die Zusammensetzung der Krebs-Henseleit-Lösung war die folgende (in mM): Na⁺ 142,9; K⁺ 5,9; Ca²⁺ 2,5; Mg²⁺ 1,2; Cl^– 127,7; HCO₃ ^– 24,9; H₂PO₄-1,2; SO₄ ^2– 1,2; Glucose 5,5. Der pH wurde bei 7,4 gehalten, während mit 02 95% + CO₂ 5% gewaschen wurde. Das Waschgas wurde auch zum Oxigenieren des Gewebes und Mischen der Lösung verwendet.
Unterschiede im transepithelialen elektrischen Potential (V_ms) wurden auf den so angeordneten heterolateralen Geweben bestimmt, und zwar unter Verwendung eines Digitalmultimeters (Keithley Instr., Cleveland, USA, Modell 136). Die Messungen wurden alle 10 Minuten während der ersten 30 Minuten des Experiments durchgeführt (um die Bewertung der Funktionalität des Epithels folgend auf die Isolierung zu ermöglichen) und am Ende des Experiments (150 Minuten nach dem Beginn; d. h. eine 120-minütige Inkubationszeitspanne).
Nach Abschluß der Präinkubationsperiode wurde die Lösung von der submukosalen Seite von einem der beiden Gewebe und von der mukosalen Seite des anderen Gewebes her durch 250 μl einer Suspension aus fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären substituiert (konjugiert mit Fluoresceinisothiocyanat, FITC: Polyscience Inc., Warrington, PA, USA), mit einem Durchmesser von ungefähr 0,5 μm. Die Konzentration der Mikrosphären wurde an 10 μl Proben gemessen (genommen mindestens zu Beginn und Ende der Inkubationszeitspanne) mit geraden Linien einer Absorbtionskalibrierung (λ5 Fotometer, erhältlich von Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT, USA) bei einer Wellenlänge von 600 nm. Die Referenzkonzentrationen für die Mikrosphären wurden in einer Burker-Kammer nach geeigneter Verdünnung vorbestimmt (Orthoplan MPV2 Fluoreszenzmikroskop von Leitz GmbH, D-6330 Wetzlar, Deutschland). Während des Experiments zeigten die anfänglichen und endgültigen Konzentrationen der Mikropartikel keine signifikanten Veränderungen. Diese Mikropartikel, die während den 120 Minuten Inkubation transportiert wurden, wurden in der Burker-Kammer aufgrund ihrer niedrigen Konzentration gemessen und als unidirektionale Mukosa-Submukosa-Strömungen (J_ms) oder anders herum (J_sm) als Anzahl von Mikropartikeln cm^–2 h^–1 ausgedrückt.
Sowohl die Donorlösung als auch die Lösung, die die transportierten Mikropartikel enthielt, wurden einem Ultraschall zu Beginn und Ende des Experiments unterzogen, und zwar bevor die Messungen durchgeführt wurden, um zu verhindern, daß die in Krebs-Henseleit plazierten Mikropartikel miteinander aggregierten und in dem Gewebe absorbiert wurden. Die Donorlösung wurde alle 30 Minuten vollständig erneuert, wobei sich dieses Verfahren als geeignet zum Erhalt einer konstanten Konzentration freier Mikropartikel erwiesen hatte.
Beispiel 2
Transport auf dem intranasalen Weg von Proteinen, adsorbiert an Mikropartikel
Dasselbe Verfahren wie in dem vorstehenden Beispiel 1 wurde durchgeführt, außer daß die Mikropartikel in einer Proteinlösung (6,5 × 10^–6 M) suspendiert wurden und daß die komplette Suspension 90 Minuten bei 37°C inkubiert wurde. Es wurden dann 4 Waschschritte durchgeführt, jeweils bestehend aus einer Ausfällung durch Zentrifugation und einer Resuspension in Krebs-Henseleit-Lösung, enthaltend bovines Serumalbumin, BSA (7,4 × 10^–6 M, 5% p/v).
Beispiel 3
Transport auf dem intranasalen Weg von Antikörpern, absorbiert an Mikropartikel
Dasselbe Verfahren wie in dem vorstehenden Beispielen 1 und 2 wurde befolgt, außer daß die Mikropartikel in einer Proteinlösung, bestehend aus einem Antikörper, suspendiert waren.
Beispiel 4
Transport auf dem intranasalen Weg von adsorbierten Proteinen, gebunden an Antikörper auf Mikropartikeln
Dasselbe Verfahren wie beschrieben in den vorstehenden Beispielen 1 und 2 wurde durchgeführt, außer daß an Mikropartikel adsorbierte und spezifisch an Antikörper gebundene Polypeptide verwendet wurden. Die Mikropartikel wurden zunächst in einer geeigneten Proteinlösung (6,5 × 10^–6 M) suspendiert, und die gesamte Suspension wurde 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Vier Waschschritte wurden durchgeführt, jeweils bestehend aus einem Ausfällen durch Zentrifugation und einer Resuspension in Krebs-Henseleit-Lösung, enthaltend BSA (7,4 × 10^–4 M, 5% p/v). Schließlich wurde eine zweite Inkubation der Mikropartikel, beschichtet mit einer Lösung enthaltend einen spezifischen Rnti-Polypeptid-Antikörper durchgeführt (6,5 × 10^–8 M) und zwar für 16 Stunden bei 4°C.
Für die Untersuchung der Kinetik des Transports der beschichteten Mikropartikel wurden die letzteren nicht verdünnt oder konzentriert, bis sie in der gewöhnlichen anfänglichen Konzentration beschichtet worden waren, so daß homogene Beschichtungen unabhängig von der endgültigen Konzentration der Mikropartikel vorlagen.
Unter den verwendeten Polypeptiden wurde bovines Serumalbumin (BSA), Immunglobulin A (menschliches Colostrum IgA), Immunglobulin G (murines Anti-Human Insulin und Anti-BSA) von Sigma (St. Louis, MO, USA) bereitgestellt, während bovines Insulin und das Enzephalin ([Leu5]Enzephalin) von Calbiochem AG (Luzern, Schweiz) bereitgestellt wurden.
Die Ergebnisse der Beispiele 1 bis 4 sind in Tabelle 1 dargestellt und zeigen eine Mukosa-Submukosa-Strömung (J_ms) und umgekehrt (J_sm) von nativen Mikropartikeln (nicht beschichtet) oder beschichtet mit verschiedenen Proteinen.
Unabhängig von der Art der Beschichtung wurde das Experiment nur dann als gültig angesehen, wenn festgestellt wurde, daß die isolierte muköse Membran vital war, und zwar sowohl zu Beginn des Experiments als auch während der Präinkubation wie auch am Ende der Inkubation. Die für diesen Zweck in die Betrachtung einbezogenen Parameter waren der Unterschied im transepithelialen elektrischen Potenzial (V_ms), die Indizes von sowohl transepithelialem Transport von aktiven elektrogenen Ionen als auch dem Zellmetabolismus (was den letzteren unterstützt) und der Integrität des Epithels als Barriere.
Das anfängliche Minimum V_ms betrug +1 mV (positive Submukosa). V_ms erhöhte sich langsam und progressiv während des Experiments und zeigte so nicht nur an, daß die isolierte muköse Membran keinem Zerfall unterlag, sondern zeigte sogar eine konstante Erholung der Funktionalität der mukösen Membran in vitro an. Der Trend mit Zeitverlauf erwies sich als ähnlich zu demjenigen, über den von Cremaschi D. et al. in "Comp. Biochem. Physiol." 99A, 361 (1991) berichtet wurde.
Die Inkubationstemperatur betrug 27 ± 1°C. Im Vergleich mit 37°C erniedrigte diese Temperatur den Stoffwechsel und den Transport ungefähr um das zweifache, macht das isolierte Gewebe jedoch stabiler. Bei verschiedenen Experimentarten, die durchgeführt wurden, betrug das mittlere V_ms nach 30 Minuten der Präinkubation bei 27°C (vor Insertion der Donorlösung mit den Mikropartikeln und Beginn der Inkubation mit den Strömungsmessungen) 4,0 ± 0,1 mV (134 Mukosae).
V_ms zum Abschluß der 120 Minuten Inkubation betrug 6,6 ± 0,2 mV (134 Mukosae, p < 0,01).
Unabhängig von der Art der Beschichtung zeigte die Konzentration der Mikropartikel in den Donorlösungen keine signifikante Reduktion mit dem Zeitablauf während der 120-minütigen Inkubation. Diese Konzentration war tatsächlich gleich mit 3,25 ± 0,05 × 10¹¹ Mikropartikeln/ml (134 Experimente) zu Beginn der Inkubation und 3,22 ± 0,04 × 10¹¹ Mikropartikeln/ml (von uns durchgeführte 134 Experimente) zum Abschluß der Inkubation.
Dies bedeutet, daß die Strömungen J_ms und J_sm in der betrachteten Zeitspanne unidirektional waren und daß kein Verlust von Mikropartikeln aufgrund einer Absorption oder Aggregation auftrat. Dies gab uns weiterhin eine sichere Referenz für die Konzentration der Lösung, die die Strömungen erzeugt.
Die in Tabelle 1 berichteten Ergebnisse zeigen daß:

a) unter den unterschiedlichen Bedingungen der Beschichtung die J_sm Werte zu ungefähr 3 bis 6 Millionen Mikropartikeln cm^–2 h^–1 von 325 Milliarden Mikropartikeln/ml der Donorlösung korrespondieren;
b) wenn die Mikropartikel nicht mit Polypeptiden beschichtet sind, unterscheidet sich der Jms Wert nicht signifikant von dem J_sm Wert; daher tritt keine Nettoabsorption von Mikrosphären auf (J_net ist nicht signifikant unterschiedlich von Null);
c) die Beschichtung mit Polypeptiden, unabhängig von dem verwendeten Polypeptid (BSA, Insulin, Enzephalin, IgA, Anti-Insulin IgG, Anti-BSA IgG), erzeugt einen Jms Wert, der immer deutlich höher ist als der J_sm wert; daher tritt eine Nettoabsorption auf (J_net unterscheidet sich deutlich von Null);
d) wenn nach einer Beschichtung der Mikropartikel über Adsorption von Insulin oder BSA der jeweilige Antikörper (Anti-Insulin IgG oder Anti-BSA IgG in einer Konzentration von 1 : 100 im Hinblick auf die für die Adsorption verwendete Konzentration) daran mit einer Bindung gebunden ist, die für diese beiden Proteine spezifisch ist, wird J_ms sowohl im Hinblick auf Insulin als auch auf BSA als auch im Hinblick auf die beiden Antikörper, die unspezifisch an die Mikropartikel adsorbiert sind, deutlich stimuliert; dementsprechend zeigt die Nettoabsorption (J_net) einen deutlichen Anstieg.

Da die höchsten Nettoströmungen mit Insulin, gebunden an das spezifische IgG, erhalten wurden, wurde die Kinetik des Transports für diese Art der Beschichtung überprüft. Für diesen Zweck wurden die Mikropartikel wie vorher offenbart beschichtet, dann verdünnt oder konzentriert, und die Strömungen für unterschiedliche Konzentrationen von Mikropartikeln gemessen.
Tabelle 2 zeigt die erhaltenen Ergebnisse für die Durchführung von 6 Experimenten für jede Konzentration. Diese Ergebnisse zeigen, daß:

a) mit einer Konzentration von 2 Milliarden und 200 Millionen Mikropartikeln/ml sich J_ms nicht deutlich von J_sm unterscheidet. J_net ist daher nicht unterschiedlich von Null;
b) bei höheren Konzentrationen J_ms, während J_sm keine statistisch signifikante Veränderung aufweist, signifikant höher wird als J_sm J_net ist daher statistisch deutlich unterschiedlich von Null;
c) mit erhöhter Konzentration J_ms progressiv ansteigt und der Unterschied zu J_sm ebenfalls ansteigt; J_net steigt daher ebenfalls an. Ein Anstieg wird immer noch bei einer Konzentration von 982 Milliarden Mikropartikeln/ml beobachtet, d. h. 500 Mal mehr als der minimalen verwendeten Konzentration;
d) der Trend der Kinetik ist sigmoid und der maximale Ertrag/cm2 des transepithelialen Transports wird mit 3,2 × 10¹¹ Mikropartikeln/ml erhalten, das ist äquivalent zu 1,7%. Dieser Ertrag, erhalten bei 27°C, ist 400.000-fach höher als der korrespondierende Ertrag, der im Intestinaltrakt erhalten wird, gemessen bei 37°C und unter Einbeziehung als Strömung der Gesamtheit des aktiven Nettoflusses und des passiven Lumen-Lymph-Flusses, wie bereits festgestellt (1,7 × 10^–3/4,4 × 10^–9 = 400.000).

Tabelle 2

Claims

Verwendung eines Mikropartikels mit einem Protein und einem Antikörper daran adsorbiert für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die intranasale Verabreichung.
Verwendung eines polymeren Mikropartikels gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein gewählt ist aus der Gruppe, umfassend BSA, Insulin, Enzephalin, Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Koagulationsfaktoren, Polypeptide, antimikrobielle Mittel und Fragmente davon.
Verwendung eines polymeren Mikropartikels gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein Immunglobulin ist, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend IgM, IgA und IgG.
Verwendung eines polymeren Mikropartikels gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunglobulin für das Protein spezifisch ist.
Verwendung eines polymeren Mikropartikels gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikropartikel Mikrosphären aus polymerem Material sind.
Verwendung eines polymeren Mikropartikels gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Material bioabbaubar ist.
Verwendung eines polymeren Mikropartikels gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere Material Polystyrol ist.
Verwendung eines polymeren Mikropartikels gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein/Immunglobulin-Verhältnis 1 bis 15.000 Mol Protein pro Mol Immunglobulin beträgt.
Verwendung eines polymeren Mikropartikels gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein/Immunglobulin-Verhältnis 1 bis 5.000 Mol Protein pro Mol Immunglobulin beträgt.
Verwendung eines polymeren Mikropartikels gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein/Immunglobulin-Verhältnis 1 bis 100 Mol Protein pro Mol Immunglobulin beträgt.