DE69324812T2

DE69324812T2 - Zellaktivator des eingeweidetraktes

Info

Publication number: DE69324812T2
Application number: DE69324812T
Authority: DE
Inventors: Yasuo Fukuwatari; Seiichi Shimamura; Kazuzo Shinoda; Mamoru Tomita
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1992-07-29
Filing date: 1993-02-25
Publication date: 1999-11-11
Anticipated expiration: 2013-02-26
Also published as: EP0654272A1; EP0654272B1; JPH0648955A; DE69324812D1; WO1994003203A1; US5543392A; EP0654272A4

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Mittel zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen, das einen epidermalen Wachstumsfaktor, Lactoferrine und/oder ein Lactoferrin- Hydrolysat enthält und eine große medizinische Anwendungsbreite aufweist, einschließlich der Prävention und Therapie von Erkrankungen des Verdauungstrakts, der Anregung der Verdauungstraktfunktionen und deren Aktivierung.

Stand der Technik

Der epidermale Wachstumsfaktor (im Folgenden bisweilen als "EGF" bezeichnet) ist ein Peptid mit einem Molekulargewicht von etwa 6000, das proliferationsstimulierende Funktionen auf eine Vielzahl von Säugerzellen ausübt und im Körperfluid aller Säuger enthalten ist. Da EGF in der Muttermilch in relativ hoher Konzentration enthalten ist, zieht der Zusammenhang zwischen EGF und Wachstum und Entwicklung eines Neugeborenen (im Falle eines Tieres des Neonatus) allgemeine Aufmerksamkeit auf sich und unter anderem ist der Einfluß des EGF auf die Entwicklung des Verdauungstraktes neugeborener Ratten und Mäuse untersucht worden. Zum Beispiel ist geklärt worden, dass das Füttern einer neugeborenen Ratte mit einer künstlichen Milch, die mit EGF versetzt war, die DNA-Synthese im Dünndarm beschleunigt [C. L. Berseth, American Journal of Physiology, Vol. 253, S. G662, 1987], und dass es das Magennaßgewicht vergrößert [J. Falconer, Biology of the Neonate, Vol. 52, S. 347, 1987; und E. V. O'Loughlin et al., American Journal of Physiology, Vol. 249, S. G674, 1985]. Es ist auch gezeigt worden, dass die Verabreichung von EGF an eine neugeborene Ratte die Entwicklung der Funktionen des Dünndarms und seiner Schleimhaut beschleunigt [C. Malo et al., Gastroenterology, Vol. 83, S. 23, 1982; und Y. Oka et al., Endocrinology, Vol. 112, S. 940, 1983].
Es gibt einige bekannte Anwendungsfälle von EGF zur Therapie von Erkrankungen des Verdauungstrakts im Einklang mit den vorstehend beschriebenen Befunden. Es wurde kürzlich ein Fall beschrieben, bei dem die Verabreichung von EGF an ein 8 Monate altes, an nekrotischer Entzündung des Dünndarms (Nekrotisierende Enteritis) leidendes Kleinkind zu einer Heilung der letalen Schäden am Verdauungstrakt führte [P. E. Sullivan et al., Lancet, Vol. 338, S. 53, 1991], was die klinische Wirksamkeit von EGF belegt.
Der Effekt und der Wirkungsmechanismus des EGF auf kultivierte Zellen sind seit der Entdeckung des EGF 1962 bislang weithin untersucht worden. Mit Bezug auf Verdauungstraktzellen ist nun geklärt worden, dass die DNA-Synthese in Epithelzellen des Darms durch den EGF beschleunigt wird, und diese Wirkung wird über einen in der cytoplasmatischen Membran vorliegenden EGF-Rezeptor verursacht [M. E. Forgue-Lafitte et al., FEBS Letter, Vol. 114, S. 243, 1980; und N. Gallo-Payet et al., Endocrinology, Vol. 116, S. 194, 1985].
Nachdem die Brauchbarkeit des EGF zur Aktivierung des Verdauungstrakts aufgezeigt worden ist, ist das Zumischen von EGF in Pulvermilch für Kleinkinder vorgeschlagen worden (vorläufige japanische Patentveröffentlichung Nr. 62-228,225; und vorläufige japanische Patentveröffentlichung Nr. 1-148,146). Da die Verdauungstraktzellen nicht ausgereift sind, ist ein Neugeborenes insbesondere anfällig für das ungehinderte Eindringen verschiedener Bakterien und Antigene durch den Verdauungstrakt und aufgrund einer unvollständigen immunologischen Funktion ist ein Neugeborenes darüber hinaus anfällig für infektiöse Erkrankungen. Daher wurde im Hinblick auf eine Wachstums- oder Proliferationsbeschleunigung der Verdauungstraktzellen, eine Beschleunigung der Entwicklung der Verdauungstraktfunktionen und eine Verhütung des Eindringens von Bakterien vorgeschlagen, EGF in Pulvermilch für Kleinkinder einzumischen.
Muttermilch enthält neben dem EGF weitere Substanzen mit proliferationsstimulierender Funktion. Lactoferrin (im Folgenden bisweilen als "Lf" bezeichnet) ist ein eisenbindendes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 80 000, das in der Muttermilch in sehr großer Menge enthalten ist und bekanntermaßen eine antimikrobielle Aktivität gegen schädliche Mikroorganismen wie Escherichia coli, candida, clostridium und Staphylococcus zeigt [Journal of Pediatrics, Vol. 94, S. 1, 1979; und Journal od Dairy Science, Vol. 67, S. 60, 1984]. Die bekannten Funktionen von Lf und seinem Hydrolysat umfassen eine antimikrobielle Aktivität und die Inhibierung der Tyrosinaseaktivität (vorläufige Europäische Patentveröffentlichung Nr. 438 750); die Verhinderung der Pathogenanhaftung (vorläufige japanische Patentveröffentlichung Nr. 3- 220,130); und eine antivirale Aktivität (vorläufige japanische Patentveröffentlichung Nr. 1-233,226). Kürzlich ist geklärt worden, dass die DNA-Synthese in Epithelzellen der Dünndarmkrypta von Ratten durch Lf beschleunigt wird [B. L. Nichols et al., Pediatric Research, Vol. 21, S. 563, 1987]. Die allgemeine Aufmerksamkeit richtet sich auf Lf als neuen proliferationsstimulierenden Faktor in der Muttermilch. Unter dem gleichen Gesichtspunkt wie für EGF wird auch ein Einmischen von Lf in Kleinkindnährmittel vorgeschlagen (vorläufige japanische Patentveröffentlichung Nr. 1-93,534).
Wie vorstehend beschrieben, sind EGF und Lf bislang isoliert in pulverförmiger Milch für Kleinkinder und Kleinkindnährmitteln verwendet worden. Andererseits steigt die Zahl von Personen, die unter Erkrankungen des Verdauungstraktes, wie Darmkrebs, leiden, unter dem Einfluß von psychischem Stress; und selbstverständlich haben ältere Personen fortgeschrittenen Alters häufiger verminderte Funktionen des Verdauungstraktes. Unter solchen Umständen wird es als bedeutsam erachtet, die Forschungsergebnisse bezüglich der vorstehend angesprochenen Pulvermilch für Kleinkinder und dergleichen zur Prävention und Therapie von Erkrankungen des Verdauungstraktes bei Erwachsenen und zur Aktivierung der Verdauungstraktzellen, deren Funktionalität mit dem Alter zunehmend nachlässt, nutzbar zu machen.
Im Unterschied zu Verdauungstraktzellen eines Neugeborenen oder eines im Wachstum befindlichen Kleinkinds kann die isolierte Verabreichung von EGF oder Lf keinen nennenswerten Effekt auf Verdauungstraktzellen eines Erwachsenen ausüben, weil die Zellen eines Erwachsenen die rasche Proliferation oder das rasche Wachstum, das im Falle des Neugeborenen oder eines Kleinkindes beobachtet wird, bereits eingestellt haben. Um EGF oder Lf für den vorstehend angesprochenen Zweck zu verwenden, ist es notwendig, deren Aktivität durch bestimmte Maßnahmen zu intensivieren. Eine derartige Maßnahme ist jedoch im Stand der Technik nicht bekannt und es ist bislang nicht versucht worden, EGF und Lf gleichzeitig zu verwenden. Die gleichzeitige Verwendung von EGF und Lf ist nicht versucht worden, weil von der gleichzeitigen Verwendung aufgrund der unterschiedlichen Wirkungsweise als zellproliferationsstimulierender Faktor kein synergistischer Effekt erwartet werden konnte (z. B. vorläufige japanische Patentveröffentlichung Nr. 1-93,534).

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegenden Erfinder führten Untersuchungen über die biologische Aktivität von Lactoferrin, Apolactoferrin, metallgesättigtem oder teilweise metallgesättigtem Lactoferrin und Gemischen davon (im Folgenden werden diese kollektiv als "Lactoferrine" bezeichnet) und Hydrolysaten der Lactoferrine durch und gelangten im Ergebnis zu den folgenden neuen Tatsachen, die bislang unbekannt waren:
(1) Obgleich ein Lactoferrine enthaltendes Protein üblicherweise bei der Hydrolyse seine biologische Aktivität verliert, bewahrt ein Hydrolysat der Lactoferringruppe die Zellproliferationsfunktion des Lactoferrins, übt eine synergistische Wirkung mit dem EGF aus und weist somit eine starke wachstums- oder proliferationsbeschleunigende Funktion auf Verdauungstraktzellen auf.
(2) Lactoferrine üben einen synergistischen Effekt mit dem EGF aus und führen zu stärkeren wachstums- oder proliferationsbeschleunigenden Funktionen der Verdauungstraktzellen als bei isolierter Verwendung von Lactoferrinen oder EGF.
Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage der vorstehend angesprochenen Befunde entwickelt und hat die Bereitstellung eines Mittels zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen zum Gegenstand, das die Genesung des Verdauungstrakts einer Person beschleunigt, deren Verdauungstrakt beeinträchtigt ist oder die sich infolge von Krebs einer Operation des Verdauungstrakts unterzogen hat, Verdauungstraktzellen einer älteren Person aktiviert, deren Funktion mit zunehmendem Alter nachgelassen hat, und das Wachstum oder die Proliferation von Verdauungstraktzellen eines Neugeborenen beschleunigt, um die Entwicklung des Verdauungstrakts als solchen zu fördern.
Zur Lösung der vorstehend angesprochenen Aufgabe stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen bereit, das einen epidermalen Wachstumsfaktor, Lactoferrine, ein Hydrolysat der Lactoferrine oder ein Gemisch davon enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mittels zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen sollte die effektive Verabreichungsdosis der vorstehend angesprochenen Lactoferrine, eines Hydrolysats von Lactoferrinen oder eines Gemisches davon vorzugsweise in einem Bereich von 1 bis 500 mg/kg Körpergewicht pro Tag für einen Erwachsenen liegen, und die effektive Verabreichungsdosis des epidermalen Wachstumsfaktors sollte vorzugsweise in einem Bereich von 0,01 bis 50 ug/kg Körpergewicht pro Tag für einen Erwachsenen (Menschen) liegen.
Das erfindungsgemäße Mittel zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen weist Effekte, wie die Vorbeugung gegen und die Linderung einer Beeinträchtigung des Verdauungstrakts, Verbesserung der mit zunehmendem Alter verschlechterten Verdauungstraktfunktionen und Beschleunigung des Wachstums und der Proliferation von Verdauungstraktzellen eines Neugeborenen, auf. Es ist darüber hinaus möglich, es verschiedenen Nahrungsmittelerzeugnissen zuzufügen oder damit zu vermischen, um verdaungstraktzellenaktivierende Nahrungsmittel zu erhalten.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Die Fig. 1 bis 4 veranschaulichen die Ergebnisse von Tests, die zur Untersuchung der Effekte des erfindungsgemäßen Mittels zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen durchgeführt wurden.
Fig. 1 zeigt das Verhältnis zwischen der Konzentration an zugesetztem Rinderlactoferrin (bLf) und der Menge an eingebautem ³H-Thymidin, wobei die Ordinate für die Menge an eingebautem ³H-Thymidin und die Abszisse für die Konzentration an zugesetztem bLf steht. In Fig. 1 bedeuten die Symbole o bzw. isoliertes bLf (n = 4) und in Koexistenz mit EGF (n = 4). Fig. 2 veranschaulicht das Verhältnis zwischen der Konzentration an zugesetztem Pepsinhydrolysat von Rinderlactoferrin (bLf-Hy) und der Menge an eingebautem ³H-Thymidin: die Ordinate steht für die Menge an eingebautem ³H-Thymidin und die Abszisse für die Konzentration an zugesetztem bLf-Hy. In Fig. 2 bedeuten die Symbole o bzw. isoliertes bLf-Hy (n = 4) und in Koexistenz mit EGF (n = 4).
Fig. 3 veranschaulicht den Effekt von Rinderlactoferrin (bLf) auf die Proliferation von Dünndarmepithelzellen von Ratten in Gegenwart von Maus-EGF, und Fig. 4 veranschaulicht den Multiplikationseffekt des Pepsinhydrolysats von Rinderlactoferrin (bLf-Hy) auf Dünndarmepidermalzellen von Ratten in Gegenwart von Maus-EGF. In Fig. 3 bedeuten die Symbole , , o bzw. die Kontrollgruppe (Gruppe ohne Zugabe; n = 6), die Gruppe mit EGF-Zugabe (n = 6), die Gruppe mit bLf-Zugabe (n = 6) und die Gruppe mit EGF/bLf-Zugabe (n = 6). In Fig. 4 bedeuten die Symbole , , o bzw. die Kontrollgruppe (Gruppe ohne Zugabe; n = 6), die Gruppe mit EGF-Zugabe (n = 6), die Gruppe mit bLF-Hy-Zugabe (n = 6) und die Gruppe mit EGF/bLf-Hy-Zugabe (n = 6).

Beste Ausführungsform der Erfindung

Bei den erfindungsgemäß verwendeten Lactoferrinen kann es sich um ein beliebiges handelsübliches Lf, aus tierischer Milch oder Humanmilch nach einem beliebigen Verfahren isoliertes Lf, durch Enteisenung von Lactoferrin nach einem beliebigen Verfahren erhältliches Apolactoferrin, durch Chelatisierung von Apolactoferrin mit Metallionen, wie Eisen, Kupfer, Zink und Mangan erhältliches metallgesättigtes oder teilweise metallgesättigtes Lactoferrin oder ein Gemisch davon handeln.
Bei dem erfindungsgemäß verwendeten Lactoferrin-Hydrolysat kann es sich um ein durch Hydrolyse der vorstehend angesprochenen Lactoferrine mit Hilfe einer Säure oder eines Enzyms nach einem beliebigen herkömmlichen Verfahren erhältliches Produkt, ein durch Raffination eines derartigen Hydrolysats nach einem beliebigen Verfahren erhältliches Produkt, oder ein Gemisch davon handeln. Die vorstehend angesprochenen Lactoferrine und das Lactoferrin-Hydrolysat können im Gemisch verwendet werden, und man fand - wie aus den nachstehend beschriebenen Tests deutlich wird - dass ein Lactoferrin-Hydrolysat einen synergistischen Effekt mit EGF aufweist.
Bei dem erfindungsgemäß verwendeten EGF kann es sich um einen beliebigen aus Humanharn, tierischer Milch oder Humanmilch nach einem beliebigen Verfahren isolierten EGF, durch DNA-Rekombinationstechnik hergestellten EGF, chemisch synthetisierten EGF, handelsüblichen EGF und ein Gemisch davon handeln.
Das erfindungsgemäße Mittel zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen ist als medizinischer Wirkstoff anwendbar oder kann durch Zugabe zu oder Vermischen mit Nahrungsmitteln oder dergleichen verwendet werden. Bei Verwendung als medizinischer Wirkstoff kann die Anwendung in einer beliebigen Form, wie Tabletten, Pillen, Pulver, Kapseln und Suppositorien, erfolgen, indem es geeigneterweise mit einem Exzipienten, einem Streckmittel oder einem Verdünnungsmittel vermischt wird.
Die Verabreichungsdosis von EGF, einem Wirkbestandteil des erfindungsgemäßen Mittels zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen, der Lac toferrine und/oder des Lactoferrin-Hydrolysats variiert mit dem Alter, Körpergewicht und der Kondition des Patienten (Mensch) und sollte vorzugsweise in einem Bereich von 1 bis 500 mg/kg pro Tag für die Lactoferrine und/oder das Lactoferrin-Hydrolysat und in einem Bereich von 0,01 bis 50 ug/kg für den EGF liegen.
Beim Einsatz des erfindungsgemäßen Mittels zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen für Nahrungsmittel kann dieses geeigneterweise in einer erforderlichen Menge zu einem flüssigen diätetischen Erzeugniss, einer enteralen Ernährung, einem modifizierten Milchpulver usw. gegeben werden. Es ist natürlich sehr wirksam, Lactoferrine, ein Lactoferrin-Hydrolysat und EGF einem Nahrungsmittel zuzusetzen, das diese Bestandteile ursprünglich nicht enthält.
Da Lactoferrine, ein Lactoferrin-Hydrolysat und EGF in Milch vorliegende natürliche Erzeugnisse sind, versteht es sich von selbst, dass diese Bestandteile kein Sicherheitsproblem darstellen.
Die Funktionen und die Effekte der vorliegenden Erfindung werden nun nachstehend anhand von Testbeispielen näher beschrieben.

Test 1

Dieser Test erfolgte zur Bestimmung einer optimalen Konzentration für die beschleunigende Aktivität des EGF auf die DNA-Synthese bezüglich Dünndarmepithelzellen.

(1) Herstellung der Probe:

Es wurde handelsüblicher EGF mit Ursprung aus der Mäuseunterkieferdrüse (hergestellt von der Takara Shuzo Company) verwendet.

(2) Vorgehensweise:

IEC18-Zellen (erworben von der American Type Culture Collection), bei denen es sich um Epithelkryptazellen des Dünndarms von Ratten handelt, wurden auf einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen zu 10 000 Zellen pro Loch ausgesät und mit Dulbecco-modifizierten Eagle-Medium kultiviert, welches 10% fötales Rinderserum (im Folgenden abgekürzt als "10% FBS- DMEM") enthielt, bis die Zellen zusammenfließend wurden (es wurde 1 ml Medium pro Vertiefung verwendet). Dann ersetzte man das Medium durch 1% FBS-DMEM und kultivierte weitere 3 Tage, damit der Zellzyklus in die Ruhephase übergeht. Das Medium wurde durch 1% FBS-DMEM (0,5 ml) ersetzt, das EGF in verschiedenen Konzentrationen enthielt, und die Kultur wurde 18 Stunden durchgeführt. Dann ersetzte man das Medium durch DMEM (0,35 ml), das ³H-Thymidin (Tritium-markiertes Thymidin: 1 Microcurie/ml) enthielt, und kultivierte weitere 2 Stunden.
Die erhaltenen Zellen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS (-), 2 ml] gespült, dann wurde eisgekühlte 5%ige Trifluoressigsäure (5% TFA, 2 ml) dazugegeben. Der Ansatz wurde 1 Stunde lang im Kühlschrank aufbewahrt. Die Zellen wurden zweimal mit 5% TFA (2 ml) gewaschen, und man gab 1 N NaOH (0,4 ml) dazu. Indem der Ansatz 1 Stunde lang bei 37ºC gehalten wurde, wurden die Zellen aufgelöst. Dann wurde die Lösung durch Zugabe von 6 N HCl (0,08 ml) neutralisiert und folglich wurde die Menge an in die DNA eingebautem ³H-Thymidin mittels eines Flüssigkeitsscintillationszählers gemessen.

(3) Ergebnisse:

Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 1 gezeigt. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, erwies sich die optimale EGF-Wirkkonzentration für die DNA-Synthese dieser Zellen als 10 ng/ml. Daher wurde im Folgenden EGF in einer Konzentration von 10 ng/ml verwendet. Tabelle 1

Test 2

Dieser Test wurde durchgeführt, um die Effekte der gleichzeitigen Verwendung eines Lf-Hydrolysats (Lf-Hy) und EGF auf die DNA-Synthese von IEC18-Zellen zu untersuchen.

(1) Herstellung der Probe:

Es wurden handelsüblicher EGF mit Ursprung aus der Mäuseunterkieferdrüse (hergestellt von der Takara Shuzo Company) und Rinderlactoferrin (bLf) (hergestellt von der Yukijirushi Nyugyo Company) verwendet.
Das bLf-Hy wurde aus bLf wie folgt hergestellt. Handelübliches bLf (hergestellt von der Olefina Company) wurde in einem Verhältnis von 500 g/9,5 l in gereinigtem Wasser aufgelöst; der pH der erhaltenen Lösung wurde durch Zugabe von 1 M (mol/l) Salzsäure auf 3,0 eingestellt; dann gab man handelsübliches Schweinepepsin (hergestellt von der Sigma Company) in einer Menge von 10 g pro 500 g bLf zu; die Hydrolyse erfolgte 6 Stunden lang bei 37ºC. Dann wurde der pH mit 6 M Natriumhydroxid eingestellt; das Enzym wurde durch 10-minütiges Erwärmen auf 80ºC inaktiviert; die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und einer Celite-Filtration unterzogen; das Filtrat wurde gefroren und getrocknet, wobei bLf-Hy erhalten wurde.

(2) Vorgehensweise:

Es wurde auf gleiche Weise wie in Test 1 ein Test durchgeführt. Die Testproben schlossen Proben mit bLf- oder bLf-Hy-Zusatz in verschiedenen Konzentrationen und solche mit EGF-Zusatz in einer Menge von 10 ng/ml und bLf- oder bLf-Hy-Zusatz in verschiedenen Konzentrationen ein.

(3) Ergebnisse:

Die Ergebnisse dieses Tests sind in den Fig. 1 und 2 gezeigt.
Wie aus Fig. 1 ersichtlich ist, wurde bei der isolierten Verwendung von bLf kein Effekt beobachtet, während bei gleichzeitigem Vorliegen von EGF ein erheblicher Anstieg der Menge an eingebautem ³H-Thymidin in die DNA von IEC18-Zellen bei einer bLf-Konzentration von 17 bis 150 ug/ml beobachtet und ein synergistischer Effekt von EGF und bLf auf die DNA-Synthese gezeigt wurde.
Wie aus Fig. 2 weiterhin ersichtlich ist, wurde ein Effekt der isolierten Verwendung von bLf-Hy bei bLf-Hy-Konzentrationen von 50 und 150 ug/ml beobachtet. In Gegenwart von EGF stieg die Menge an eingebautem ³H-Thymidin stärker als bei der isolierten Verwendung von bLf- Hy bei bLf-Hy-Konzentrationen von 50 und 150 ug/ml, womit ein synergistischer Effekt von bLf-Hy und EGF auf die DNA-Synthese gezeigt wurde. Tests, die durch Austausch der Art von bLf und bLf-Hy erfolgten, lieferten fast die gleichen Ergebnisse.

Test 3

Da der Test 2 eine besonders signifikante Beschleunigung der Menge an eingebautem ³H-Thymidin in die DNA von IEC18-Zellen durch die gleichzeitige Verwendung von EGF und bLf oder EGF und bLf-Hy offenbarte, wurde dieser Test zur Untersuchung dessen durchgeführt, ob sich dieser Umstand tatsächlich letztlich in der Zellaktivierung wiederspiegelt, d. h. ob er einen Effekt auf die Zellproliferation hat.

(1) Herstellung der Probe:

Es wurden der gleiche EGF, das gleiche bLf und Lf-Hy wie im Testbeispiel 2 eingesetzt.

(2) Vorgehensweise:

ICE18-Zellen (die gleichen wie im Test 1) wurden auf einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen zu 5000 Zellen pro Vertiefung ausgesät und 10 Tage lang mit 1% FBS-DMEM (0,5 ml), das die folgenden Testgegenstände enthielt, kultiviert. Während dieser Testdauer wurde das Medium am 3. und 6. Tag ersetzt und die Zellzahl wurde am 3., 6. und 10. Tag gemessen. Die Zellzahl wurde mit einem Hämozytometer gezählt, nachdem die Zellen mit 0,25%iger Trypsin-Lösung behandelt und in der Lösung suspendiert wurden.
Die Testgegenstände umfaßten eine Probe ohne jeglichen Zusatz, eine Probe mit Zusatz von 10 ng/ml EGF, eine Probe mit Zusatz von 50 ug/ml bLf oder bLf-Hy und eine Probe mit Zusatz von 10 ng/ml EGF und 50 ug/ml bLf oder bLf-Hy.

(3) Ergebnisse:

Die Ergebnisse dieses Tests sind in den Fig. 3 und 4 gezeigt.
Wie aus den Fig. 3 und 4 ersichtlich ist, stiegen die Zellzahlen der Gruppe mit isolierter Zugabe von EGF ( ) fast mit der gleichen Geschwindigkeit wie in der Kontrollgruppe (Δ) ohne jegliche Zugabe, was deutlich zeigt, dass die isolierte Zugabe von EGF keinen Effekt hat. Bei der in Fig. 3 gezeigten ( ) Gruppe mit Zugabe von EGF und bLf wurde am 6. und 10. Tag der Kultur eine erhebliche Zunahme der Zellzahlen beobachtet. Gleichfalls stiegen die Zellzahlen für die Gruppe mit Zugabe von EGF und bLf-Hy, die in Fig. 4 ( ) gezeigt ist, am 6. und 10. Tag der Kultur an. Die Ergebnisse für die Gruppe mit isolierter Zugabe von bf, die in Fig. 3 (o) gezeigt ist, und die Gruppe mit isolierter Zugabe von bLf-Hy, die in Fig. 4 (o) gezeigt ist, zeigen einen Effekt, der schwächer ausgeprägt als derjenige der Gruppe mit gleichzeitiger Zugabe von EGF ist, aber die Zellzahl stieg am 6. und 10. Tag der Kultur im Vergleich zur Kontrollgruppe ( ) und der Gruppe mit isolierter Zugabe von EGF ( ) signifikant an. Ein Test, der mit verschiedenen Arten Lf und Lf-Hy durchgeführt wurde, lieferte fast die gleichen Ergebnisse.
Die vorliegende Erfindung wird nun im Folgenden anhand von Beispielen genauer beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele begrenzt.
Es wurden verschiedene in den einzelnen Beispielen verwendete Arten von Lactoferrinen und EGF hergestellt, wie in den nachstehend beschriebenen Referenzen gezeigt.

Vergleichsbeispiel 1 (Herstellung von Apolactoferrin)

Apolactoferrin wurde wie folgt aus handelsüblichem Rinderlactoferrin (hergestellt von der Oleofina Company) nach der von Suzuki et al. (Eiyo to Shokuryo, Vol. 13, (1978) S. 395) vorgeschlagenen Methode hergestellt.
Zuerst wurde eine 1%ige wässrige Lactoferrinlösung in einer Menge von 1 l bei unterhalb 4ºC 30 Stunden lang mit 0,1-molarer Zitronensäurelösung, die 0,05% EDTA (pH 2,2) enthielt, in einer 20-fachen Menge dialysiert. Das erhaltene Produkt wurde ferner 24 Stunden lang mit entionisiertem Wasser dialysiert und gefroren und getrocknet, wobei etwa 10 g Apolactoferrin erhalten wurden.

Vergleichsbeispiel 2 (Herstellung von EGF)

EGF wurde wie folgt aus menschlichem Harn nach dem Verfahren von Cohen und Carpenter [S. Cohen und G. Carpenter, Proceedings of the National Academy of Science U. S. A., Vol. 72, (1975) 5.1317], dem Verfahren von Savage und Happer [C. R. Jr. Savage und R. Happer, Analytical Biochemistry, Vol. 111, (1981) S. 195] und dem Verfahren von Nishimuro et al. [S. Nishimuro et al. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Vol. 33 (1985) S. 4037] hergestellt.
Essigsäure wurde in einer Menge von 1 l zum Ansäuern zu etwa 20 l menschlichem Harn gegeben, und man gab konzentrierte Salzsäure zu, um den pH auf 3,0 bis 3, 3 einzustellen. Ein Ionenaustauscherharz Bio- Rex70 (hergestellt von der Biorad Company) wurde mit Hydroessigsäure auf einen pH von 3,1 eingestellt, mit 5%iger Essigsäure gewaschen, zu dem vorstehend erwähnten Harn gegeben und 18 Stunden lang bei 4ºC gerührt. Nach 2- bis 4-stündigem Stehenlassen wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt, das Harz wurde mit 0,01 N Salzsäure gewaschen, und der EGF wurde mit 1 N Ammoniumacetat (pH 8,0) eluiert. Die ablaufende Flüssigkeit wurde gefroren und getrocknet, und das erhaltene getrocknete Produkt wurde in 50 ml destilliertem Wasser gelöst. Dann gab man 0,5 mg Pepstein, 2 mmol Arginin und 200 mg Rinderserumalbumin (BSA) dazu.
Man gab Ethanol in einer Menge von 1500 ml zu dieser Lösung, die man anschließend rührte, 30 min stehen ließ, bei 1000 g 20 min lang zentrifugierte und mit 15 ml 2 mM (milli-mol/l) Arginin zur Sedimentation versetzte. Dann stellte man den pH mit Salzsäure auf 3,0 ein und zentrifugierte 20 min lang bei 30 000 g unter Erhalt überstehender Flüssigkeit.
Die vorstehend erwähnte überstehende Flüssigkeit wurde über eine mit DEAE-Zellulose gefüllte Säule (4 · 14 cm) geleitet, die mit 0,05% Ameisensäure (hergestellt von der Wattmann Company) äquilibriert worden war, und der nicht an der Säule haftende EGF im Auslauf wurde gesammelt. Der Auslauf wurde gefroren und getrocknet, und das getrocknete Produkt wurde mit 20 ml 0,05 N Salzsäure gelöst, wobei der pH auf 1,5 eingestellt wurde, und das erhaltene Produkt wurde 30 min lang bei 3000 g unter Erhalt überstehender Flüssigkeit zentrifugiert.
Eine mit Bio-GelP-10 (hergestellt von der Biorad Company) gefüllte Säule (4 · 90 cm) wurde mit 0,05 N Salzsäure äquilibriert. Das Eluieren erfolgte mit einer Fließgeschwindigkeit von 42 ml/h. Während die Hauptmenge der durch UV-Absorption nachgewiesenen Substanzen in 1,5 Säulenvolumina eluiert wurden, wurde der EGF nach 1,7 Säulenvolumina eluiert. Aktivität enthaltende Fraktionen wurden gesammelt, wobei der pH mit Ammoniakwasser auf 6,0 eingestellt wurde, gefroren und getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in 50 ml 0,04 M Ammoniumacetat (pH 3,9) aufgelöst und durch Ultrafiltration auf 5 ml konzentriert.
Eine mit CM-Zellulose (hergestellt von der Wattman Company) gefüllte Säule (0,9 · 10 cm) wurde mit 0,04 M Ammoniumacetat äquilibriert, und die vorstehend erwähnte konzentrierte Flüssigkeit wurde auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde dann mit 0,04 M Ammoniumacetat gewaschen und dann mit 14 ml 1 M Ammoniumacetat eluiert. Der Ausfluß wurde gefroren und getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde dann in 0,02 M Ammoniumacetat (pH 5,3) gelöst.
Eine mit DE-52-Zellulose (hergestellt von der Wattman Company) gefüllte Säule (0,9 · 10 cm) wurde mit 0,02 mol Ammoniumacetat (pH 5,3) äquilibriert. Das Eluieren erfolgte mit einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/h. Nach dem Auftragen der vorstehend erwähnten Lösung wurde die Säule mit 0,02 M Ammoniumacetat gewaschen. Das Eluieren mit einem Konzentrationsgradienten von 0,02 auf 0,03 mol Ammoniumacetat ergab drei Maxima (1 bis 3). Die Hauptmaxima der EGF-Aktivität sind 1 und 3. Es wurde EGF von etwa 150 bis 250 ug erhalten.

Vergleichsbeispiel 3 (Herstellung von eisengesättigtem Lactoferrin)

Eisengesättigtes Lactoferrin wurde wie folgt nach dem Verfahren von Suzuki et al. [Eiyo to Shokuryo, Vol. 31 (1978) S. 395] aus handelsüblichem Rinderlactoferrin (Oleofina Company) hergestellt.
Dann gab man 0,2 l einer 0,1 M Natriumacetatlösung, die 3 mmol Eisen(III)chlorid enthielt, zu 1 l einer 1%igen wässrigen Lactoferrinlösung. Die erhaltene Lösung wurde eine Stunde lang langsam gerührt, mit entionisiertem Wasser 24 Stunden lang dialysiert, gefroren und getrocknet, wobei etwa 10 g eisengesättigtes Lactoferrin erhalten wurden.

Beispiele

Beispiel 1 (Herstellung von Tabletten)

Lactoferrin (Oleofina Company) 50,0 (mg)
EGF nach dem gleichen Verfahren wie in Vergleichsbeispiel 2 0,01
kristalline Zellulose 170,0
Maisstärke 66,0
Talk 11,0
Magnesiumstearat 3,0
Diese Rohmaterialien wurden nach einem herkömmlichen Verfahren in den oben angegebenen Verhältnissen pro Tablette gemischt, granuliert, zu Tabletten geformt und es wurden Tabletten erhalten. Alle Rohmaterialien mit Ausnahme von EGF waren handelsüblich.

Beispiel 2 (Herstellung eines pulverförmigen Arzneimittels)

Apolactoferrin auf der Basis des gleichen Verfahrens wie im Vergleichsbeispiel 1 50,0 (g)
EGF auf der Basis des gleichen Verfahrens wie in Vergleichsbeispiel 2 0,1
kristalline Zellulose 375,0
Maisstärke 575,0
Diese Rohmaterialien wurden gleichmäßig gemischt und es wurden nach einem herkömmlichen Verfahren 1000 Beutel mit pulverförmigem Arzneimittel hergestellt. Alle Rohmaterialien mit Ausnahme des Apolactoferrins und EGF waren handelsüblich.

Beispiel 3 (Herstellung von Kapseln)

Eisengesättigtes Lactoferrin auf der Basis des gleichen Verfahrens wie in Vergleichsbeispiel 3 10,0 (mg)
EGF auf der Basis des gleichen Verfahrens wie in Vergleichsbeispiel 2 0,01
Lactose 120,0
kristalline Zellulose 42,5
Carboxymethylzellulose 10,0
Talk 15,0
Magnesiumstearat 2,5
Diese Rohmaterialien wurden nach einem herkömmlichen Verfahren in den oben angegebenen Verhältnissen gleichmäßig gemischt und mittels einer Kapselfüllvorrichtung als Arzneimittel in Kapselform zubereitet. Alle Rohmaterialien mit Ausnahme des eisengesättigten Lactoferrins und EGF waren handelsüblich.

Beispiel 4 (Herstellung von Kapseln)

EGF auf der Basis des gleichen Verfahrens wie in Vergleichsbeispiel 2 2,0 (mg)
Lactoferrin-Hydrolyseprodukt auf der Basis des gleichen Verfahrens wie in Test 2 20,0 (g)
kristalline Zellulose 78,0
Maisstärke 20,0
Lactose 17,0
Polyvinylpyrrolidon 3,0
Diese Rohmaterialien wurden gleichmäßig gemischt, nach einem herkömmlichen Verfahren granuliert und in 1000 Hartgelatinekapseln eingefüllt, um ein Arzneimittel in Kapselform herzustellen. Alle Rohmaterialien mit Ausnahme des Lactoferrin-Hydrolyseprodukts und EGF waren handelsüblich.

Beispiel 5 (Herstellung eines pulverförmigen Arzneimittels)

Lactoferrin (hergestellt von der Olefina Co.) 25,0 (g)
Lactoferrin-Hydrolyseprodukt auf der Basis des gleichen Verfahrens wie in Test 2 25,0
EGF auf der Basis des gleichen Verfahrens wie in Vergleichsbeispiel 2 0,1
kristalline Zellulose 375, 0
Maisstärke 575,0
Diese Rohmaterialien wurden gleichmäßig gemischt und es wurden nach einem herkömmlichen Verfahren 1000 Beutel eines pulverförmigen Arzneimittels hergestellt. Alle Rohmaterialien mit Ausnahme des Lactoferrin- Hydrolyseproduktes und EGF waren handelsüblich.

Beispiel 6 (Herstellung von modifiziertem Milchpulver)

Kasein (hergestellt von der New Zealand Dairy Board) wurde in einer Menge von 1,3 kg in 15 l heißem Wasser aufgelöst, mit 5,6 kg Lactose, 2,8 kg Pflanzenöl (hergestellt von Nihon Yushi Company), Vitaminen und Mineralien versetzt, gemischt, homogenisiert und 3 s lang bei 120ºC sterilisiert. Zu dieser Lösung gab man eine Lösung, die 50 g handelsübliches Lactoferrin (hergestellt von der Olefina Company) und 50 mg nach dem gleichen Verfahren wie in Vergleichsbeispiel 2 hergestellten EGF aufgelöst in 500 ml sterilisiertem Wasser enthielt. Das Gemisch wurde gleichmäßig gemischt und nach einem üblichen Verfahren sprühgetrocknet, wobei 10 kg modifiziertes Milchpulver erhalten wurden.

Beispiel 7 (Herstellung einer enteralen Nahrung)

Kaseinpulver (hergestellt von der New Zealand Dairy Board) in einer Menge von 2 kg, 1,5 kg Sojaprotein, und 1 kg Lactoferrin-Hydrolysat, das nach dem gleichen Verfahren wie in Vergleichsbeispiel 2 hergestellt worden war, wurden in 60 l heißem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung gab man 12,5 kg schwerverdauliches Dextrin (hergestellt von der Matsutani Kagaku Kogyo Company), 3 kg Pflanzenöl (hergestellt von Nihon Yushi Company), Vitamine und Mineralien, homogenisierte und ergänzte auf ein Gesamtvolumen von 100 l und sterilisierte das Gemisch 2 s lang bei 150ºC. Eine wässrige EGF-Lösung, die durch Auflösen von 500 mg einesnach dem gleichen Verfahren wie in Vergleichsbeispiel 2 hergestellten EGF und Passieren durch einen sterilisierten Filter hergestellt worden war, wurde steril zu dieser Lösung gegeben, gemischt und homogenisiert, wobei 100 kg flüssige enterale Nahrung erhalten wurden.

Industrielle Anwendbarkeit

Das erfindungsgemäße Mittel zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen ist als Arzneimittelbestandteil zur Herstellung medizinischer Arzneimittel und außerdem zur Herstellung verschiedener Nahrungsmittelerzeugnisse als Nahrungszusatz anwendbar.

Claims

1. Mittel zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen, umfassend einen epidermalen Wachstumsfaktor und Lactoferrin und/oder ein Lactoferrinhydrolysat.

2. Mittel zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen nach Anspruch 1, das epidermalen Wachstumsfaktor und ein Lactoferrinhydrolysat enthält.

3. Mittel zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen nach Anspruch 1, das einen epidermalen Wachstumsfaktor und Lactoferrin enthält.

4. Mittel zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen nach Anspruch 1, das einen epidermalen Wachstumsfaktor und ein Gemisch eines Lactoferrins und eines Lactoferrinhydrolysats enthält.

5. Mittel zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die in einer zur Verabreichung geeigneten Form vorliegende wirksame Dosis des epidermalen Wachstumsfaktor in einem Bereich von 0,01 bis 50 ug/kg Körpergewicht pro Tag für einen Erwachsenen liegt.

6. Mittel zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen nach einem der Ansprüche 1, 2 und 4, wobei die in einer zur Verabreichung geeigneten Form vorliegende wirksame Dosis des Lactoferrinhydrolysats in einem Bereich von 1 bis 500 mg/kg Körpergewicht pro Tag für einen Erwachsenen liegt.

7. Mittel zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen nach Anspruch 1 oder 3, wobei die in einer zur Verabreichung geeigneten Form vorliegende wirksame Dosis des Lactoferrins in einem Bereich von 1 bis 500 mg/kg Körpergewicht pro Tag für einen Erwachsenen liegt.

8. Mittel zur Aktivierung von Verdauungstraktzellen nach Anspruch 1 oder 4, wobei die in einer zur Verabreichung geeigneten Form vorliegende wirksame Dosis des Gemisches des Lactoferrins und des Lactoferrinhydrolysats in einem Bereich von 1 bis 500 mg/kg Körpergewicht pro Tag für einen Erwachsenen liegt.