CZ362499A3

CZ362499A3 - Použití mikročástic obsahujících na sobě adsorbovaný protein a protilátku pro přípravu farmaceutického prostředku k intranasálnímu podání

Info

Publication number: CZ362499A3
Application number: CZ19993624A
Authority: CZ
Inventors: Dario Cremaschi; Cristina Porta
Original assignee: Aziende Chimiche Riunite Angelini Francesco A. C. R. A. F S. P. A.
Priority date: 1997-04-14
Filing date: 1998-04-08
Publication date: 2000-04-12
Also published as: KR20010006267A; ES2201492T3; SK142299A3; EP0971703A1; IL132114A; SK282398B6; UA62961C2; WO1998046209A1; CA2288970C; US20020058069A1; HUP0001752A2; ATE243502T1; PT971703E; EA199900934A1; PL336207A1; HUP0001752A3; EP0971703B1; HU225523B1; KR100507449B1; IT1291559B1

Description

Použití mikročástic obsahujících na sobě adsorbovaný protein a protilátku pro přípravu farmaceutického prostředku k intranasálnímu podání

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká použití mikročástic obsahujících na sobě adsorbovaný protein a protilátku pro přípravu farmaceutického prostředku k intranasálnímu podání.

Dosavadní stav techniky

V předkládaném vynálezu a následujících patentových nárocích zahrnuje termín protein jakoukoliv sloučeninu tvořenou dvěma nebo více aminokyselinami. Termín proto zahrnuje, ale není omezen na, biologicky aktivní peptidy, polypeptidy a proteiny.

Je známo, že pro různé zvířecí druhy, včetně lidí, je absorpce protienů podaných intranasálně vyšší než 40% pro proteiny tvořené 3 až 6 aminokyselinami (AA), přibližně 10-15% pro proteiny tvořené 9 až 27 aminokyselinami a menší než 1% pro polypeptidy s vyšší molekulovou hmotností (například pro insulin (51 AA) je absorpce prakticky nulová), ačkoliv existují významné rozdíly mezi absorpcí stejného peptidu u různých druhů (Lee W.A.

Longenecker J.P., Biopharm. Manufact., Apríl, str. 1-7 (1988)).

Toto je důvod, proč na konci osmdesátých let byly pouze 3 nonapeptidy (desmopressin, lypressin, oxytocin) podávány intranasálně a proč byly od počátku osmdesátých let studovány inhibitory proteas a zesilovače přenosu přes nasální sliznici. Obecně jsou tyto zesilovače přenosu surfaktanty, které zvyšují pasivní permeabilitu nasální sliznice. Díky jim bylo možné připravit prostředky pro intranasální podání obsahující i · 4i 9

9 ·

9 999

- 2 kalcitonin (32 AA) , insulin (51 AA) , růstový hormon (191 AA) a jiné proteiny a polypeptidy o vysoké molekulové hmotnosti. (Lee W.A. Longenecker J.P., Biopharm. Manufact, April, str. 1-7 (1988); Verhoef J.C. a kol., Eur. J. Drug Metab. and

Pharmacokin., 15: 83 (1990); Mishima M. a kol., J.

Pharmacobio-Dyn. 10: 69 (1987); Mishima M. a kol., J.

Pharmacobio-Dyn. 12: 32 (1989); Watanabe Y., a kol., Chem. Pharm. Bull. 40: 3100 (1992); Schipper N.G.M. a kol., Pharmaceutical Res. 10: 682 (1993); Shao Z. a kol., Pharmaceutical Res. 11: 1174 (1994)).

Zesilovače přenosu mají nicméně tu nevýhodu, že - jelikož se jedná obyčejně o surfaktanty - poškozuji více či méně závažně a reversibilně slizniční membrány, čímž zvyšují pasivní permeabilitu sliznice.

Pro zlepšení absorpce byla také použita činidla zpomalující přenos, jako jsou viskozní činidla, adhesivní polymery a podobně, a bylo dosaženo mírných úspěchů. Činidla zpomalující přenos mají také toxické účinky na sliznici a ciliární oblast.

Pro překonání těchto nevýhod bylo navrženo podání léků vložených do škrobových mikrosfér, které nejsou z důvodů příliš velké velikosti absorbovány, ale které jsou částečně hydratovány v nosní dutině a pomalu uvolňují vložené peptidy (Illum L. a kol. Int. J. Pharm 39: 189 (1987); Bjork E., Edman P., Int. J. Pharm. 47: 233 (1988)) . Při tomto způsobu bylo dosaženo efektu zpomaleného uvolňování a zároveň zlepšení absorpce malých a středních molekul. Nicméně, absorpce velkých molekul nebyla zlepšena, protože slizniční membrána nebyla narušena.

Nakonec, PCT přihláška WO 94/28879 popisuje farmaceutický prostředek pro orální podání obsahující biologicky aktivní • · • · * « · · · · ♦ · • · · 4 * · 999999 materiál, protilátku, která se specificky váže na uvedený biologicky aktivní materiál a mnoho mikročástic polymerního materiálu. Konkrétně, biologicky aktivní materiál patři do rodiny peptidů, polypeptidů a proteinů. Mikročásticemi jsou výhodně polystyrénové mikrosféry.

Biologicky aktivní materiál a protilátky jsou adsorbovány na uvedené mikročástice a mikročástice jsou endocytosou pohlceny epitelem folikulů Peyerových plátů u myší. Proto je možné vypočítat u laboratorního zvířete jak množství mikročástic vstupujících do buněk (vychytávání), tak množství mikročástic, které účine projdou transmurálně a dostanou se do lymfy v ductus mesentericus, ve které se shromažďuje veškerý transportovaný materiál.

Ve výše uvedené přihlášce byl nejúčinejší transport získán za použití hovězího růstového hormonu jako proteinu a specifické protilátky proti uvedenému hormonu, bGH-Ab, jako protilátky.

Měření vychytávání bylo provedeno in vivo podáním 3,6 x 10¹¹potažených mikročástic do jejuna a ilea, fixací tkáně po 90 minutách a provedením měření (ve výpočtu bylo bráno v úvahu 6 cyklů endocytosy v 90 minutách).

Byly získány následující výsledky:

O

a) celkové vychytáváni pres 40 cm v 90 minutách: 8400000 mikročástic (účinnost = 0,023 θ/gg (= 8400000/3,6 x 10¹¹);

b) celkové vychytávání na jednotku plochy přes 40 cm² v 90 minutách: 210000 mikročástic/cm²; (účinnost/cm² = 0,00058 °/qq (= 210000/3,β X 10¹¹);

Potom bylo provedeno měření transmurálního přenosu, při kterém bylo in vivo podáno 3,6 x 10·¹·¹ potažených mikročástic do jejuna a

I · · ·

- 4 ·· * · » · ♦ « » · · ·

119 9 9 1 ilea a každých 5 minut byla odebírána lymfa z kanylovaného ductus mesentericus.

Byly získány následující výsledky:

a) Transmurální transport na 40 cm² v 90 minutách: 65000 mikročástic (účinnost na 40 cm² = 65000/3,6 x 10¹¹ (= 0,00018°/qq)

b) Materiál přenesený transmurálně v 90 minutách/cm : 1625 mikročástic/cm²; (účinnost/cm² = 4,4 x 10^-9 (= 0,0000044 °/qq))·

Tato data ukazují, že účinnost endocytosy ve střevu je 130-krát vyšší (2,3 x 10⁵/l,8 x 10^-7) než účinnost transmurálního transportu. To znamená, že ze 130 endocytosovaných částic zůstávalo 129 zachyceno v uvedeném lymfatické tkáni Peyerových plátů a pouze jedna procházela do lymfy.

Podstata vynálezu

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že účinnost aktivního transportu proteinu a specifické protilátky adsorbované na mikročástice polymerní substance v nasální sliznici je 400000-krát vyšší než ve střevu.

Přesněji, protože byla absorpční data v pokusech na střevu získána in vivo, týkají se tato data vstupního toku (lumen-lymfa), který zahrnuje jak aktivní, tak pasivní paracelulární transport, který zvyšuje účinnost. Na základě tohoto předpokladu je poměr účinnosti nasálního a intestinálního transportu ještě dvakrát vyšší, než dříve uvedený 400000-násobek.

Studovaná nasální sliznice byla izolována in vitro a bylo možno provést měření dvou opačných, jednosměrných toků potažených mikročástic a čistá absorpce byla vypočítána jako rozdíl těchto toků. Čistá absorpce v nasální sliznici proto neobsahuje složku

- 5 4 < 4 4 4 4 « 4 4 © | 4*4· & 4 4 * 4 4 4 * * 4φ 4 4 4 444444 • 4 4 4 4 4 4

4444 44 444 4444 «4 44 pasivního transportu, jako tomu bylo při pokusech na střevu, a je výsledkem pouze aktivní absorpce.

Je třeba si uvědomit, že kromě mimořádně příznivé účinnosti je intranasální podání výhodnější ve srovnání s orálním podáním v tom, že absorbovaná substance neprochází trávícím traktem a po vstupu do cirkulace nemusí procházet játry.

Proto je prvním předmětem předkládaného vynálezu použití mikročástic obsahujících na sobě adsorbovaný protein a protilátku pro přípravu farmaceutického prostředku k intranasálnímu podání.

Protein je výhodně vybrán ze skupiny zahrnující BSA (hovězí sérový albumin), insulin, enkefalin, hormony, růstové faktory, cytokiny, koagulační faktory, polypeptidy (neuropeptidy), antimikrobiální činidla a jejich fragmenty. Protilátkou je imunoglobulin vybraný ze skupiny skládající se z IgM, IgA a IgG. Imunoglobulin je výhodně specifický pro protein. Mikročástice jsou výhodně mikrosféry tvořené neimunogenními polymerními materiály jako je polystyren, latex nebo jiné polymery. Volitelně je polymerní materiál biologicky degradovatelný.

Výhodně je farmaceutický prostředek podle předkládaného vynálezu připraven ve vhodné dávkové formě obsahující účinnou dávku proteinu a protilátky, které jsou adsorbovány na mikročásticích z polymerního materiálu, a farmaceuticky přijatelné inertní přísady.

Příklady vhodných dávkových forem pro intranasální podání jsou krémy, masti, aerosoly, spreje a kapky.

Dávkové formy mohou také obsahovat jiné běžné přisady, jako jsou konzervační činidla, stabilizační činidla, pufry, soli pro

ΦΦΦ ·Φ Φ

- 6 • 9 9

ΦΦΦ

Φ · « · * * úpravu osmotického tlaku, emulgační činidla, chuťová korigens a podobně.

Množství proteinu a protilátky ve farmaceutické prostředku podle předkládaného vynálezu může být velmi různé, podle různých známých faktorů, jako je například stadium a závažnost onemocnění, tělesná hmotnost pacienta, počet denních dávek a aktivita vybraného proteinu. Optimální množství může být snadno a rutině určeno odborníkem v oboru.

Obecně je poměr protein/imunoglobulin od 1 do 15000 molů proteinu na mol imunoglobulinu. Výhodně je od 1 do 5000, lépe od 1 do 100 molů proteinu na mol imunoglobulinu.

Hmotnost proteinu ve farmaceutickém prostředku podle předkládaného vynálezu může být snadno určena v jednotlivém případu odborníkem v oboru podle aktivity použitého proteinu.

Dávková forma farmaceutického prostředku podle předkládaného vynálezu může být připravena technikami v oboru dobře známými, včetně míšení, granulování, stlačení, rozpouštěni, sterilizace a podobně.

Aktivita proteinů adsorbovaných na mikročástice spolu s protilátkami specifickými pro použitý protein byla hodnocena v následujících pokusech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Přenos mikročástic intranasálním způsobem

Dvě heterolaterální nosní sliznice byly izolovány od samců albínů New Zealand králíků (tělesná hmotnost 3 - 3,5 kg) po

00···· · · · · · 0 0 e· · · · · 0 -· 0 0 ·

0 00000 « · ♦ 0 * 0 000 000

0 0 0 0 0 * 0000 »0 0 0 · 0 »0 0 00 0 0

- 7 usmrcení králíků zlomením vazu a byly použity v pokusu. Oblasti sliznice odpovídající concha nasalis superior byly promyty Krebs-Henseleitovým roztokem (Comp. Biochem. Physiol.,

Cremaschi D a kol., 99A: 361 (1991); Biochem. Biophys. Acta, Cremaschi, D. a kol., 27: 1280 (1996)) a byly umístěny v teflonu v Ussing komůrce (použitá plocha 0,3 cm ) a byly inkubovány s Krebs-Henseleitovým roztokem při 27 ± 1 θθ.

Složení Krebs-Henseleitova roztoku bylo následující (v mM):

Na⁺ 142,9; K⁺ 5,9; Ca^{2 +} 2,5; Mg^{2 +} 1,2; Cl’ 127,7; HCO3 24,9; H2PO4' 1,2; so4²’ 1,2; Glukosa 5,5. pH bylo udržováno na hodnotě 7,4 při probublávání 02 95% + C0₂ 5%. Probublávací plyn byl také použit pro oxygenaci tkáně a míšení roztoku.

Rozdíly v transepiteliálních elektrických potenciálech (V_mg) byly stanoveny na takto připravených heterolaterálních tkáních za použití digitálního měřícího přístroje (Keithley Instr.,

Cleveland, USA, model 136) . Měření byla prováděna každých 10 minut v průběhu prvních 30 minut pokusu (pro hodnocení funkčnosti epitelu po izolaci) a na konci pokusu (150 minut po zahájení; t.j. po 120 minutové inkubační době).

Na konci preinkubačního období byl roztok z podslizniční strany jedné tkáně a ze slizniční strany druhé tkáně nahrazen 250 μΐ suspenze fluorescentních polystyrénových mikrosfér (konjugovaných s fluorescenčním činidlem isothiokyanatanem, FITC, Polyscience lne., Warrington, PA, USA) o průměru přibližně 0,5 gm. Koncentrace mikrosfér byla měřena.ve vzorcích 10 μΐ (odebraných alespoň na začátku a na konci inkubační doby) s kalibračními přímkami absorbance (lambda5 fotometr od Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT, USA) při vlnové délce 600 nm. Refereční koncentrace pro mikrosféry byly předem stanoveny v Burkerově komůrce po vhodném ředění (Ortoplan MPV2

- 8 ··· · •« «« «· • · · · · · · ···« ♦ » · «···· « ♦ · · « <►····♦ • «► 9 · · · 9

9999 99 999 ···· ·* 99 fluorescenční mikroskop od Leitz GMBH, D-6330 Wetzlar, Germany).

V průběhu pokusu nebyly pozorovány významné změny mezi počáteční a konečnou koncentrací mikrosfér. Množství mikročástic transportovaných během 120 minutové inkubace bylo stanoveno v Burkerově komůrce z důvodů jejich nízké koncentrace a toto množství bylo vyjádřeno jako jednosměrný slizniční-podslizniční tok (J_ms) nebo naopak (J_gm) v počtu mikročástic.cm“².h’¹.

Jak donorový roztok, tak roztok obsahující transportované mikročástice, byly na začátku a na konci pokusu zpracovány před provedením měření ultrazvukem, aby se zabránilo agregaci mikročástic v Krebs-Henseleitově roztoku a tendenci k absorpci na tkáň. Donorový roztok byl kompletně obnovován každých 30 minut, což umožnilo zachování konstantní koncentrace volných mikročástic.

Příklad 2: Transport proteinů adsorbovaných na mikročástice intranasálním způsobem

Byl použit stejný postup jako v příkladu 1 s tou výjimkou, že mikročástice byly suspendovány v proteinovém roztoku (6,5 x 10’⁵M) a suspenze byly inkubována po dobu 90 minut při 37 °C. Potom byly provedeny 4 promytí, které se skládaly ze srážení centrifugováním a resuspendování v Krebs-Henseleitově roztoku obsahujícím hovězí sérový albumin, BSA (7,4 x 10“⁴ M, 5% p/v).

Příklad 3: Transport protilátek adsorbovaných na mikročástice intranasálním způsobem

Byl použit stejný postup jako v příkladech 1 a 2 s tou výjimkou, že mikročástice byly suspendovány v proteinovém roztoku obsahujícím protilátku.

······ · ·· «· ·» « · · 9 · * » 9 9 9 9

9 · » · · · · • ·· 9 9 9 999999

9 9 9 9 9 9

9999 99 ··· ···· 99 99

Příklad 4: Transport proteinů navázaných na protilátku adsorbovaných na mikročástice intranasálním způsobem

Byl použit stejný postup jako v příkladech 1 a 2 s tou výjimkou, že byly použity polypeptidy adsorbované na mikročástice a specificky navázané na protilátku. Mikročástice byly nejprve všechny suspendovány ve vhodném proteinovém roztoku (6,5 x 10“⁶M) a celá suspenze byla inkubována po dobu 90 minut při 37 °C. Potom byly provedeny 4 promytí, které se skládaly ze srážení centrifugováním a resuspendování v Krebs-Henseleitově roztoku obsahujícím hovězí sérový albumin, BSA (7,4 x ΙΟ^-4 M, 5% p/v) . Nakonec byla provedena druhá inkubace mikročástic potažených roztokem obsahujícím specifickou protilátku proti polypeptidu (6,5 x 10⁸ M), při 4 °C po dobu 16 hodin.

Pro studie týkající se kinetiky transportu potažených mikročástic nebyly mikročástice ředěny ani koncentrovány, dokud nebyly potaženy v obvyklé počáteční koncentraci, takže bylo dosaženo homogeního potahu bez ohledu na konečnou koncentraci mikročástic.

Z použitých polypeptidů byly hovězí sérový albumin (BSA), imunoglobulin A (lidský kolostrální IgA), imunoglobulin G (myší protilátka proti lidskému insulinu a proti BSA) dodány Sigma (St. Louis, MO, USA) a hovězí insulin a enkefalin ((Leu5)enkefalin) byly dodány Calbiochem AG (Lucerne, Switzerland).

Výsledky příkladů 1-4 jsou uvedeny v tabulce 1, která ukazuje toky mukosa-submukosa (J_mg) a submukosa-mukosa (J_sm) nativních mikročástic (nepotažených) nebo mikročástic potažených různými proteiny.

Bez ohledu na typ potahu byl pokus považován za platný pouze

- 10 • · · « 0 00 0 000 0 .0 0 0 0 • 0 0 00000 0 0 0 0 0 0 000000 0 0 0 0 0 · · 0000 00 0000000 00 0 0 tehdy, pokud bylo zjištěno, že izolovaná sliznice je vitální na počátku pokusu, během pre-inkubace a na konci pokusu. Parametry pro určení vitality byly rozdíl v transepiteliálním elektrickém potenciálu (V_ms), známky transepiteliálního transportu aktivních elektrogenních iontů a buněčný metabolismus (který umožňuje transport iontů) a integrita epitelu jako bariery.

Počáteční minimální V_ms byl +1 mV (pozitivní v submukose) . V_msse pomalu a progresivně zvyšoval během pokusu, což ukazuje nejen na to, že izolované sliznice nepodléhá degradaci, ale také na to, že se konstantně obnovuje funkce uvedené sliznice in vitro. Zjištěný časový průběh byl podobný průběhu, který popsal Cremaschi, D. a kol., Coomp. Biochem. Physiol 99A: 361 (1991).

Inkubační teplota byla 27 + 1 °C. Ve srovnání s 37 °C tato teplota snižuje metabolismus a transport přibližně dvakrát, ale izolovaná tkáň je při této teplotě stabilnější. V různých typech provedených pokusů byl průměrný V_ms po 30 minutách pre-inkubace při 27 °C (před zavedením donorového roztoku s mikročásticemi a zahájením inkubace s měřením toku) 40 ± 0,1 mV (134 sliznic).

V_mc, na konci 120 minutové inkubace byl 6,6 ± 0,2 (134 sliznic, lilo p < 0,01).

Bez ohledu na typ potahu se koncentrace mikročástic v donorových roztocích s časem během 120 minutové inkubace významně nesnižovala. Tato koncentrace byla na počátku pokusu rovna 3,25 + 0,05 x 10¹¹ mikročástic/ml (134 pokusů) a 3,22 + 0,04 x 10¹¹mikročástic/ml (134 námi provedených pokusů) na konci pokusu.

To znamená, že toky J_ms a J_sm byly v uvažovaném období jednosměrné a nedocházelo ke ztrátám mikročástic způsobeným absorpcí nebo agregací. Dále tato skutečnost poskytuje bezpečnou

- 11 000000 0 00 00 00 «0 0 00·· 0 · 0 0 • · 0 0 0 0 · 0 0 00 0 0 · 000000 referenční hodnotu pro koncentraci roztoku vytvářejícího toky.

Výsledky uvedené v tabulce 1 ukazují, že

a) při použití různých potahů odpovídá hodnota J_gm přibližně 3 - 6 milionům mikročástic.cm ,h z 325 bilionů mikročástic/ml v donorovém roztoku;

b) pokud nejsou mikročástice potaženy polypeptidy, tak se hodnota J_ms významně neliší od hodnoty J_sm; proto nedochází k čisté absorpci mikročástic (J_ne^ se významně neliší od nuly);

c) potažení mikročástic polypeptidy, bez ohledu na typ použitého polypeptidu (BSA, insulin, enkefalin, IgA,' anti-insulin IgG, anti-BSA IgG) způsobí, že hodnota J_mg je signifikantně vyšší než hodnota J_arY1; proto dochází k čisté absorpci mikročástic (J_net ^{se v}Ý^znamně liší od nuly);

d) pokud je po potažení mikročástic adsorpci insulinu nebo BSA navázána příslušná protilátka (anti-insulin IgG nebo anti-BSA IgG v koncentraci 1:100 vzhledem ke koncentraci použité pro adsorpci) , kdy vazba je specifická pro tyto dva proteiny, tak je hodnota J_mg silně stimulována jak pro insulin, tak pro BSA, stejně jako pro obě protilátky specificky adsorbované na mikročástice; v důsledku toho se značně zvyšuje čistá absorpce

Protože nejvyšší hodnoty toku byly získány pro insulin navázaný na specifický IgG, byly kinetíky transportu vyšetřovány pro tento typ potahu. V tomto pokusu byly mikročástice potaženy dříve uvedeným způsobem, potom byly ředěny a koncentrovány a potom byly měřeny toky při různých koncentracích mikročástic.

Tabulka 2 ukazuje výsledky získané v 6 pokusech provedených pro každou koncentraci. Tyto výsledky ukazují, že:

a) při koncentraci 2 biliony a 200 milionů mikročástic/ml je J_mgvýznamně neliší od J_gm. J_net ^se P^rot° neliší od nuly;

9 · · • · · ·

- 12 b) při vyšších koncentracích nevykazuje J_sm žádnou statisticky významnou změnu, zatímco J_ms se stává významně vyšší než J_sm·

J_net je proto statisticky odlišný od nuly;

c) při ještě vyšších koncentracích se J_mg progresivně zvyšuje a také se zvyšuje rozdíl od J_sm; v důsledku toho se také zvyšuje J_net· Zvýšení je stále ještě pozorováno při koncentraci 982 bilionů mikročástic/ml, t.j. při koncentraci 500-krát vyšší, než je minimální použitá koncentrace;

d) trend kinetiky je esovitý a maximální účinnost/cm transepitelového přenosu je získána při 3,2 x 10^ mikročástic/ml, což je ekvivalentní 1,7°/_Og. Tato účinnost, získaná pří 27 θ<3, je 400000-krát vyšší než příslušná účinnost získaná ve střevu při 37 °C, která byla stanovena jako celkový aktivní tok a pasivní tok lumen-lymfa, jak již bylo řečeno (1,7 x 10^_3/4,4 x 10~⁹ = 400000).

·· ····

• · · «·*· «· ·· • · · • · · ·»· ♦

íc ÍM ε υ O 0 E-*	£ —1	0.5+0.38	2.60+0.50”	7.10+1.15”	2.60+0.53”	3.06+0.87°	9.81+1.08“	0 0 rr O) 0 44 co 0 cd	·*· 0 0 r-«. co CD 44 CM CO CO co	o 0 CO CM 44 cn co ai	-
S —3	tt o +1 r*- co cd	co CM O 44 co co TT	r* iq o 44 co O) co	O) o o Ή co co '«r	CO o’ 44 CM O) cd	CM CM ?l CO co cd	rr co Q 44 00 0 tŤ	co T 0 44 O) cd	co cd 4*1 r- •m·’
i “3	CO O 44 *r CT> cd	• • XT co O 44 co ΤΓ f<	11.06+1.47··	• • co iq ?! co CM f<	• co co o +1 co cn cd	• • co 0 44 r- rr cd	• • CM 44 cn O	• • co 0 r< 44 co CM -?r Γ-	• • cn ΤΓ 44 co co cd
r—1 β H-l 2 Š 8 i ΐ ί*ι :ι		CM O °^r CM	tO O ¥2 M* — tq cd	S 3 £i r*. co	co o ¥2 co — CM cd	co o . 44 ™ co ZZ· cd	O 0 — oo CM	cn 0 ¥^ ·«—- co cd	co 0 s 4-} CM_ 0 cd	CO 0 á§ CM cd	3.22+0.04 (134)
X	CO O ¥^ CO — to CM	CO o ¥2 co — °rr cd	co o 44 $Mj oo cd	co o § CM cd	co ¥2 co — CM cd	σ 00 *—ί CM	*^r 0 ¥2 co — CM cd	co 0 Ή CM r» *—«- cd	r·'- 0 p cd	to 0 0 Ό· 44 cn CM cd
Γ <AUi)‘A	'1* i	O ΟΊ 44 n CM CO	o cm 4-1 ZZ, co r-í	co _ o ?l Si CM cd	CM 44 ΣΖCM r-í	0_ ,-: cm +1 00 co	to __ 0 44 ΣΖ. r-í	CM ._ ,-I CM i¹“ O)	co 0 <j° ?l Si. ΤΓ cd	co S ⁰⁴ideo	?! 2 co —<d
co ¥2 'T **** xí·	b cd	co 44 CM cd	co -Φ	¥2 CO *— cd	CM ¥ ^wS =. cd	r*. ¥2 r- —« tri	CM 44 cm CO cd	0 +Í2 to ·—* cd	0 M·
Poěet Of pokusu ;	CO	co	co	co	co	co	co	co	co
Q ii I	bez potahu (nativní)	< CO CQ	.£ 5 ω c	•S 1	< σ	IgG anti-insulin	IgG anli-BSA	Insulin + IgG anti-insulin	BSA + IgG anliBSA	i

Ιϊΐ

á^- •9 9999

9 9 9 • · 9 ·

999 999

9

9 9 9

.. !4

Tabulka 2: Toky mikročástic potažených insulinem navázaným na IgG proti insulinu. Donorový roztok obsahuje různé koncentrace mikročástic -

Koncentrace mikročástic (1o/ml)	6 21 Toky (10 cm h)
^ms	^sm	^net
0.022±0.002	5.84±0.65	5.14±0.54	0.69±0.44
0.14±0.01	7.62±0.55··	5.17±0.35	2.45+0.36”
0.32±0.01	9.40+0.78··	4.28±0.12	5.12±0.79°°
0.69±0.03	13.16+0.69··	4.20±0.18	8.96+0.67”
1.52±0.06	26.75+1.43··	4.69±0.21	22.06±1.33°°
1.73±0.03	34.27±1.66··	4.36±0.16	29.91±1.53°°
2.79±0.08	61.39±3.87··	4.45±0.34	56.94+3.76”
5.43+0.13	79.85+5.73··	5.54±0.63	• 74.32+5.81”
9.82±0.14	98.84+7.12··	6.31 ±0.90	92.53±6.67”

°° · p < 0,01 vzhledem k nule p <0,01 vzhledem k J_sm

Claims

1. Použití mikročástic obsahujících na sobě adsorbovaný protein a protilátku pro přípravu farmaceutického prostředku k intranasálnímu podání.

2. Použití polymerních mikročástic podle nároku 1, ve kterých je protein vybrán ze skupiny zahrnující BSA, insulin, enkefalin, hormony, růstové faktory, cytokiny, koagulační faktory, polypeptidy, antimikrobiální činidla a jejich fragmenty.

3. Použití polymerních mikročástic podle nároků 1 nebo 2, ve kterých je protilátkou imunoglobulin vybraný ze skupiny skládající se z IgM, IgA a IgG.

4. Použití polymerních mikročástic podle nároku 3, ve kterých je imunoglobulin specifický pro protein.

5. Použití polymerních mikročástic podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4, ve kterých jsou mikročástice mikrosféry tvořené polymerním materiálem.

6. Použití polymerních mikročástic podle nároku 5, ve kterých je polymerní materiál biodegradovatelný.

7. Použití polymerních mikročástic podle nároku 5, ve kterých je polymerních materiálem polystyren.

8. Použití polymerních mikročástic podle jakéhokoliv z nároků 1 až 6, ve kterých je poměr protein/imunoglobulin od 1 do 15000 molů proteinu na mol imunoglobulinu.

9. Použití polymerních mikročástic podle jakéhokoliv z nároků 1 ·♦ ····

- 16 ·· ·· ·· ·· · ···· ··«· • · · · · · · · • · · · ········ • · · · · · · «··· ·· ··· ···· ·· ·· až 6, ve kterých je poměr protein/imunoglobulin od 1 do 5000 molů proteinu na mol imunoglobulinu.

10. Použití polymernich mikročástic podle jakéhokoliv z nároků 1 až 6, ve kterých je poměr protein/imunoglobulin od 1 do 100 molů proteinu na mol imunoglobulinu.