DE60316970T2

DE60316970T2 - Arzneistoffzufuhrverfahren unter verwendung von sulfatierten chitinösen polymeren

Info

Publication number: DE60316970T2
Application number: DE60316970T
Authority: DE
Inventors: Agis Kendell Park KYDONIEUS; Clive Halifax ELSON; Maya Thanou
Original assignee: Chitogenics Inc
Current assignee: Kytogenics Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 2002-08-20
Filing date: 2003-08-07
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2023-08-08
Also published as: US8017595B2; US7265097B2; WO2004018010A2; EP1546216A2; US20080076704A1; CA2496376A1; US20040038870A1; AU2003256882A1; ATE376004T1; CA2496376C; EP1546216A4; AU2003256882A8; DE60316970D1; WO2004018010A3; EP1546216B1

Description

Verweis auf verwandte Anmeldungen
Die vorliegende Anmeldung beansprucht den Nutzen von U.S.-Patentanmeldung Nr. 10/224 173, eingereicht am 20. August 2002, deren Inhalt hierdurch unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
Hintergrund der Erfindung
Chitin (N-Acetylglucosamin) ist ein natürlich vorkommendes Polysaccharid und viele seiner Derivate, einschließlich Chitosan, haben Anwendungen auf dem biomedizinischen Gebiet. Chitosan ist ein deacetyliertes Chitinderivat und schließt eine Vielfalt von Polymeren mit unterschiedlichen Deacetylierungs- und Depolymerisationsgraden ein. Die meisten Chitosane sind bei pH-Werten unterhalb von 7 löslich und viele bilden Hydrogele, wenn sie in wässrigen Lösungen gelöst sind.
Im Laufe der letzten Dekade wurden Chitin und seine Derivate zum Mittelpunkt des Interesses in der biomedizinischen und biopharmazeutischen Forschung. Als ein biokompatibles Polymer wurde Chitosan für eine Vielfalt von Anwendungen als ein Biomaterial für Gewebezüchtung, Wundheilung und als ein Hilfsstoff zur Arzneistoffzufuhr verwendet. Chitosan kann als ein Arzneistoffzufuhrmittel für eine große Vielfalt von Therapeutika verwendet werden. Beispielsweise ergibt die DNA-Komplexierung mit Chitosan geeignete nano- und mikropartikuläre Formulierungen zur Transfektion in vivo und in vitro. Außerdem wurde auch über die Peptid- und Proteinzufuhr unter Verwendung von Chitosan als funktionelle Träger berichtet.
Bei neutralen und basischen pH-Werten aggregiert jedoch nicht derivatisiertes Chitosan und fällt aus der Lösung aus. Dies hat die Anwendungen von nicht derivatisierten Chitosanen bei oraler Arzneistoffzufuhr aufgrund der neutralen bis alkalischen Umgebung des Darmtrakts beschränkt.
Entsprechend ist es ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Zuführung eines Therapeutikums quer durch eine Membran, die für das Therapeutikum eine begrenzte Permeabilität aufweist, bereitzustellen. Das Therapeutikum wird der Membran in einer Zusammensetzung, die ein sulfatiertes chitinöses Polymer einschließt, bereitgestellt.
Es ist auch ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts mit einem Therapeutikum durch Verabreichen des Therapeutikums an das Subjekt in einer Zusammensetzung mit einem sulfatierten chitinösen Polymer als einem Hauptträger bereitzustellen.
Diese und andere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und den folgenden Patentansprüchen offensichtlich werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Zuführung eines Therapeutikums quer durch eine Membran, die für das Therapeutikum eine begrenzte Permeabilität aufweist, bereit. Das Verfahren schließt das Zuführen des Therapeutikums an die Membran in einer Zusammensetzung ein, die ein sulfatiertes chitinöses Polymer als Hauptträger einschließt.
Die vorliegende Erfindung ist besonders gut für Membrane wie solche adaptiert, die aus Epithelzellen oder Endothelzellen bestehen. Die Membran kann an der Nase, am Magen, Mund, Darm, an der Scheide, Haut oder am Auge eines Subjekts lokalisiert sein. Das Verfahren und die Zusammensetzung sind zur Zuführung einer breiten Vielfalt von Therapeutika verwendbar. Die Therapeutika können Proteine, Peptide, Nukleinsäuren oder Fragmente davon einschließen. Bevorzugte Peptide haben ein Molekulargewicht zwischen etwa 700 bis etwa 5000 Dalton, während bevorzugte Proteine ein Molekulargewicht zwischen etwa 5000 und 500 000 Dalton haben. Die Erfindung ist auch mit kleinen Molekülen oder Verbindungen mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 100 bis etwa 700 Dalton verwendbar.
In der Erfindung verwendbare sulfatierte chitinöse Polymere haben bevorzugt einen Sulfatierungsgrad zwischen etwa 0,03 und etwa 1,0. Unter einigen Umständen können Sulfatierungsgrade zwischen etwa 0,1 und etwa 1,0, zwischen etwa 0,1 und etwa 0,6 oder zwischen etwa 0,2 und etwa 0,4 verwendet werden. Derartige Stoffe können durch Sulfatierung von Chitosan oder einem Carboxymethylchitosan hergestellt werden und haben Molekulargewichte, die von 10 000 bis 3 Millionen Dalton reichen. Der Ausgangsstoff Chitosan kann von 30 bis 100% deacetyliert werden und der Carboxymethylierungsgrad kann zwischen 30 und 110% variieren.
Die Zusammensetzung kann einen Permeationsverstärker einschließen, wie zum Beispiel einen oberflächenaktiven Stoff. Beispiele von Permeationsverstärkern schließen Folgende ein, doch sind nicht auf diese beschränkt: Docusat-Natrium, Docusat-Calcium, Docusat-Kalium, Natriumdodecylsulfat, Natriumcaprylat, Natriumcholat, Natriumdeoxycholat, Natriumtaurocholat, Natriumglycocholat und Mischungen davon. Die Zusammensetzung kann auch ein Schutzmittel einschließen, wie zum Beispiel einen Proteaseinhibitor, ein Stabilisierungsmittel oder Mischungen davon.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts mit einem Therapeutikum durch Zuführen des Therapeutikums quer durch eine Membran, die für das Therapeutikum eine begrenzte Permeabilität aufweist, bereit. Das Verfahren schließt das Verabreichen einer Zusammensetzung, die das Therapeutikum und ein sulfatiertes chitinöses Polymer als einen Hauptträger einschließt, an das Subjekt ein. Die Zusammensetzung kann oral an das Subjekt verabreicht werden.
Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein sulfatiertes chitinöses Polymer und ein Therapeutikum umfasst. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch ein Schutzmittel einschließen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Säulendiagramm, das den transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) von Caco-2-Zellen, die mit S-SAN (N-sulfatiertem Chitosan) behandelt wurden, darstellt.
2 ist ein Säulendiagramm, das den TEER von Caco-2-Zellen, die mit S-OCC (N-sulfatiertem O-Carboxymethylchitosan) behandelt wurden, darstellt.
3 ist ein Liniendiagramm, das die intestinale Absorption von LMWH Reviparin in Ratten bei Verabreichung mit und ohne S-NOCC (N-sulfatiertem N,O-Carboxymethylchitosan) zeigt.
4 ist ein Liniendiagramm, das die Wirkung von S-NOCC60 auf den Transport von FD-4 quer durch Caco-2-Zellmonoschichten zeigt.
5 ist ein Liniendiagramm, das die Wirkung von S-NOCC60 auf die Insulinabsorption nach intraduodenaler Verabreichung in Ratten (n = 3 ± Standardabweichung) zeigt.
6 ist ein Liniendiagramm, das die Wirkung von S-SAN auf die Insulinabsorption nach intraduodenaler Verabreichung in Ratten (n = 3 ± Standardabweichung) zeigt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung richtet sich auf Verfahren und Zusammensetzungen zur Zuführung von Therapeutika und anderen Makromolekülen quer durch Membranen, die für solche Verbindungen eine begrenzte Permeabilität aufweisen, unter Verwendung einer Zusammensetzung, die sulfatierte/s chitinöse/s Polymer(e) als einen Hauptträger einschließt. Die sulfatierten chitinösen Polymere ermöglichen dem Therapeutikum, durch die Membran zu dringen und systemisch durch das Subjekt absorbiert zu werden.
Schleimhäute fallen in die Klasse von Membranen, die eine begrenzte Permeabilität für Therapeutika aufweisen, insbesondere solche mit Molekulargewichten über 500 Dalton, die die meisten Peptide und Proteine einschließen. Diese Membranen sind allgemein durch eine Beschichtung mit Epithel- oder Endothelzellen mit „Tight Junctions" (dichte Verbindungen), die physiologisch die Enterozyten apikal verbinden, gekennzeichnet. Beispiele derartiger Membranen sind in oder an der Haut, dem Ohr, dem Auge, der Nase, dem Magen-Darm-Trakt (z. B. Mund, Rachen, Speiseröhre, Magen, Dickdarm, Dünndarm, usw.), dem Reproduktionstrakt (z. B. Scheide, Gebärmutter, usw.) eines Subjekts lokalisiert.
Beispiele von Subjekten schließen Säugetiere ein, wie zum Beispiel Hunde, Schweine, Schafe, Rinder, Katzen, Pferde, Ziegen, Frettchen, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Bären, Affen, Gorillas, Schimpansen und bevorzugt Menschen.
Der Begriff „Hauptträger" soll die Tatsache beschreiben, dass das sulfatierte chitinöse Polymer der Zusammensetzung ermöglicht, ihre bestimmungsgemäße Funktion auszuführen, z. B. Zuführen des Therapeutikums quer durch eine Membran, die normalerweise dafür nicht durchlässig wäre. Die Zusammensetzung kann zwischen etwa 0,01 Gewichts-% bis etwa 99,9 Gewichts-% des sulfatierten chitinösen Polymers aufweisen und dennoch das sulfatierte chitinöse Polymer als den „Hauptträger" aufweisen. Bevorzugte flüssige Zusammensetzungen weisen den Hauptträger mit zwischen etwa 0,1 Gewichts-% bis etwa 50 Gewichts-%, zwischen etwa 0,1 Gewichts-% bis etwa 25 Gewichts-% oder zwischen etwa 1,0 Gewichts-% und etwa 10 Gewichts-% der gesamten Zusammensetzung auf.
Der Begriff „sulfatierte chitinöse Polymere" schließen sulfatierte Derivate von Chitin und Chitosan ein. Beispiele von chitinösen Polymeren schließen solche ein, die beispielsweise in Folgenden beschrieben sind: Tokura et al. J. M. S.-Pure Appl. Chem. A31(11), S. 1701–1718 (1994); Hirano et al. Carbohydrate Research, 137 (1985), S. 205–215 und Whistler et al. Archives Biochem. Biophys. 142 (1971), S. 106–110, die hierin hierdurch unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen sind. Beispiele von Hauptträgern schließen sulfatierte chitinöse Polymere ein, wie zum Beispiel N-sulfatiertes N,O-Carboxymethylchitosan, N-sulfatiertes O-Carboxymethylchitosan und sulfatiertes Chitosan.
Die sulfatierten chitinösen Polymere können unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren synthetisiert werden. Allgemein liegen beispielsweise bei NOCC etwa 30–70% der gesamten Stickstoffzentren am Polymer in Form von Aminen vor. Die Amine können dann mit einem Schwefeltrioxid-Pyridin-Reagenz bei Raumtemperatur und basischem pH reagieren, um NHSO₃ ^–-Gruppen entlang dem Polymer zu bilden. Die Sauerstoffzentren im Chitosan und seinen Derivaten können auch unter wasserfreien Bedingungen unter Verwendung von Dimethylformamid-Schwefeltrioxid-Reagenzien sulfatiert werden. Es wird erwartet, dass O-sulfatierte oder N,O-sulfatierte chitinöse Stoffe auch gemäß den Ausführungen dieser Erfindung funktionieren werden.
Idealisierte Strukturen von jedem dieser sulfatierten chitinösen Polymere sind nachstehend gezeigt. Diese Strukturen sollen bezüglich der Derivatisierung des chitinösen Polymers nicht einschränkend sein. Ein Fachmann wird einsehen, dass das Derivatisierungsmuster der Polymere und/oder des jeweiligen Salzes, soweit erforderlich, verändert werden kann.
Sulfatiertes Chitosan (S-SAN)
N-Sulfatiertes N,O-Carboxymethylchitosan (S-NOCC)
N-Sulfatiertes O-Carboxymethylchitosan (S-OCC)
Der Begriff „Therapeutikum" schließt niedermolekulare Arzneistoffe, Proteine, Peptide, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Polysaccharide und andere Makromoleküle ein. Er schließt Mittel ein, die quer durch die Membran unter Verwendung der permeationsverstärkenden sulfatierten chitinösen Polymere der Erfindung transportiert werden können.
Der Begriff „Arzneistoffe" schließt kleine Moleküle ein, wie zum Beispiel organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 50 und etwa 1000 Dalton. Bevorzugter haben die Verbindungen ein Molekulargewicht zwischen etwa 100 Dalton und etwa 700 Dalton.
Der Begriff „Peptid" schließt Therapeutika mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 700 bis etwa 5000 Dalton ein. Wie die Proteine können die Peptide natürlich vorkommen, rekombinant oder chemisch synthetisiert sein.
Der Begriff „Proteine" schließt Therapeutika mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 5000 und etwa 500 000 Dalton oder zwischen etwa 5000 und etwa 150 000 Dalton ein. Die Proteine können natürlich vorkommen, rekombinant oder chemisch synthetisiert sein.
Der Begriff „therapeutisches Makromolekül" bedeutet jedwedes Makromolekül, das eine therapeutische Wirkung bereitstellt, er schließt Mucopolysaccharide oder Glycosaminglycane, wie zum Beispiel Heparin, ein.
Beispiele von Peptiden und Proteinen schließen beispielsweise Folgende ein: Cytokine, Peptidhormone, Wachstumsfaktoren, Faktoren des Herz-Kreislauf-Systems, Zelladhäsionsfaktoren, Faktoren des zentralen und peripheren Nervensystems, humorale Faktoren, Faktoren der Knochen und des Skeletts, Faktoren des Magen-Darm-Systems, Faktoren der Nieren und Harnorgane, Faktoren des Bindegewebes und der Haut, Faktoren der Sinnesorgane, Faktoren des Immunsystems, Faktoren des Atmungssystems, Faktoren der Geschlechtsorgane, Enzyme und Fragmente und Teile davon.
Die Cytokine schließen Folgende ein: Lymphokine (z. B. Interferone (z. B. Interferon-α, -β und -γ), Interleukine (z. B. Interleukin-2 bis -11), Monokine (z. B. Interleukin-1)), Tumornekrosefaktoren (z. B. TNF-α und -β), maligner Leukozyteninhibitionsfaktor (LIF) und hämatopoetische Faktoren (z. B. Erythropoetin), Granulozyten-koloniestimulierender Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-stimulierender Faktor (GM-CSF), Makrophagen-koloniestimulierender Faktor (M-CSF) und Fragmente und Analoga davon.
Beispiele von Faktoren der Knochen und des Skeletts schließen Folgende ein: Bone GLa-Peptide, Nebenschilddrüsenhormon und seine aktiven Fragmente (Osteostatin, Endocrinology 129:324, 1991), Histon H4-abhängiges Knochenbildungs- und Proliferations-Peptid (OGP, EMBO 11:1867, 1992) und Fragmente und Analoga davon.
Beispiele von Wachstumsfaktoren schließen Folgende ein: Nervenwachstumsfaktoren (NGF, NGF-2/NT-3), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), Insulin-like Growth Factor (IGF), Transforming Growth Factor (TGF), Platelet-derived Cell Growth Factor (PDGF, Plättchen-generierter Zellwachstumsfaktor), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) und Fragmente und Analoga davon.
Beispiele von Peptidhormonen schließen Folgende ein: Insulin, Wachstumshormon, luteinisierendes Hormon-Releasing Hormon (LHRH), Adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Amylin, Oxytocin, luteinisierendes Hormon und andere Faktoren, die an den Geschlechtsorganen wirken, und Fragmente und Analoga davon.
Beispiele von Faktoren des Herz-Kreislauf-Systems schließen Faktoren ein, die den Blutdruck, Arteriosklerose, usw. regulieren. Diese Faktoren schließen Folgende ein: Endotheline, Endothelin-Inhibitoren, Endothelin-Antagonisten, Endothelin-produzierende Enzyminhibitoren, Vasopressin, Renin, Angiotensin I, Angiotensin II, Angiotensin III, Angiotensin I-Inhibitor, Angiotensin II-Rezeptorantagonist, atriales natriuretisches Peptid (ANP), antiarrythmisches Peptid und Fragmente und Analoga davon.
Beispiele von Faktoren des zentralen und peripheren Nervensystems schließen Folgende ein: opioide Peptide (z. B. Enkephaline, Endorphine, Kyotorphine), neurotrophen Faktor (NTF), Calcitonin Gene-related Peptide (CGRP), Schilddrüsenhormon-Releasing Hormon (TRH), Neurotensin und Fragmente und Analoga davon.
Beispiele von Faktoren des Magen-Darm-Systems sind Secretin und Gastrin. Beispiele von humoralen Faktoren schließen Folgende ein: Calcitonin, Apoprotein E und Hirudin und andere Faktoren, die die Hämagglutination, den Plasmacholesterinspiegel oder Metallionenkonzentrationen regulieren. Beispiele der Zelladhäsionsfaktoren schließen Laminin und interzelluläres Adhäsionsmolekül 1 (ICAM 1) ein. Beispiele von Faktoren der Nieren und Harnwege schließen natriuretisches Peptid (BNP), Urotensin und Fragmente und Analoga davon ein. Beispiele von Faktoren des Immunsystems schließen chemotaktische Peptide und Bradykinine ein.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können einen sekundären Permeationsverstärker, wie zum Beispiel einen oberflächenaktiven Stoff, einschließen. Diese Permeationsverstärker schließen Folgende ein, doch sind nicht auf diese beschränkt: Docusat-Natrium, Docusat-Calcium, Docusat-Kalium, Natriumdodecylsulfat, Natriumcaprylat, Natriumcholat, Natriumdeoxycholat, Natriumtaurocholat, Natriumglycocholat und Mischungen davon. Ebenso kann die Zusammensetzung auch ein Schutzmittel, wie zum Beispiel einen Proteaseinhibitor wie Tetracyclin, ein Stabilisierungsmittel oder Mischungen davon einschließen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können auch einen zusätzlichen pharmazeutisch verträglichen Träger einschließen. Der zusätzliche pharmazeutische verträgliche Träger wird dem Subjekt allgemein in Kombination mit dem Hauptträger und dem Therapeutikum verabreicht.
Der zusätzliche pharmazeutisch verträgliche Träger kann einen/eine/ein pharmazeutisch verträglichen/verträgliche/verträgliches Stoff, Zusammensetzung oder Vehikel einschließen, wie zum Beispiel ein/en flüssigen/flüssiges oder festen/festes Füllstoff, Verdünnungsmittel, Hilfsstoff, Lösungsmittel oder verkapselnden Stoff, der/die/das am Befördern oder Transport der therapeutischen Zusammensetzung der Erfindung, z. B. eines Therapeutikums und eines sulfatierten chitinösen Polymers, im oder zum Subjekt beteiligt ist, sodass die Zusammensetzung ihre bestimmungsgemäße Funktion ausführen kann, z. B. Zuführen des Therapeutikums quer durch eine Membran. Derartige Zusammensetzungen werden allgemein von einem Organ oder Teil des Körpers zu einem anderen Organ oder Teil des Körpers befördert oder transportiert. Jeder zusätzliche Träger muss „verträglich" im Sinne von kompatibel mit den anderen Bestandteilen der Formulierung und darf nicht schädlich für das Subjekt sein. Einige Beispiele von Stoffen, die als zusätzliche pharmazeutisch verträgliche Träger dienen können, schließen Folgende ein: Wasser; Zucker, wie zum Beispiel Lactose, Glucose und Saccharose; Stärken, wie zum Beispiel Maisstärke und Kartoffelstärke; Cellulose und seine Derivate, wie zum Beispiel Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat; gepulvertes Tragant; Malz; Gelatine; Talkum; Hilfsstoffe, wie zum Beispiel Kakaobutter und Suppositorien-Wachse; Öle, wie zum Beispiel Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Safloröl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Sojaöl; Glycole, wie zum Beispiel Propylenglycol; Polyole, wie zum Beispiel Glycerin, Sorbitol, Mannitol und Polyethylenglycol; Ester, wie zum Beispiel Ethyloleat und Ethyllaurat; Agar; Puffermittel, wie zum Beispiel Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; Alginsäure; pyrogenfreies Wasser; isotonische Kochsalzlösung; Ringer-Lösung; Ethylalkohol; Phosphat-Pufferlösungen und andere nichttoxische kompatible Substanzen, die in pharmazeutischen Formulierungen eingesetzt werden.
Die sulfatierten chitinösen Polymere enthalten allgemein basische funktionelle Gruppen, wie zum Beispiel Amino, und sind somit fähig, mit pharmazeutisch verträglichen Säuren pharmazeutisch verträgliche Salze zu bilden. Der Begriff „pharmazeutisch verträgliche Salze" bezeichnet in dieser Hinsicht relativ nichttoxische, anorganische und organische Säureadditionssalze von Verbindungen der Erfindung. Diese Salze können in situ während der letzten Isolierung und Reinigung der Verbindungen der Erfindung oder durch gesondertes Reagieren einer gereinigten Verbindung der Erfindung in ihrer freien Basenform mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure und Isolieren des somit gebildeten Salzes hergestellt werden. Repräsentative Salze schließen Folgende ein: Hydrobromid-, Hydrochlorid-, Sulfat-, Bisulfat-, Phosphat-, Nitrat-, Acetat-, Valerat-, Oleat-, Palmitat-, Stearat-, Laurat-, Benzoat-, Lactat-, Phosphat-, Tosylat-, Citrat-, Maleat-, Fumarat-, Succinat-, Tartrat-, Naphthylat-, Mesylat-, Glucoheptonat-, Lactobionat- und Laurylsulfonatsalze und desgleichen. (Siehe z. B. Berge et al. (1977) „Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1–19).
Die sulfatierten chitinösen Polymere können auch eine oder mehrere saure funktionelle Gruppen enthalten und sind somit fähig, mit pharmazeutisch verträglichen Basen pharmazeutisch verträgliche Salze zu bilden. Der Begriff „pharmazeutisch verträgliche Salze" bezeichnet in diesen Fällen die relativ nichttoxischen, anorganischen und organischen Baseadditionssalze von Verbindungen der Erfindung. Diese Salze können gleichfalls in situ während der letzten Isolierung und Reinigung der Verbindungen oder durch gesondertes Reagieren der gereinigten Verbindung in ihrer freien Säureform mit einer geeigneten Base, wie zum Beispiel Hydroxid, Carbonat oder Bicarbonat eines pharmazeutisch verträglichen Metallkations, mit Ammoniak oder mit einem pharmazeutisch verträglichen organischen primären, sekundären oder tertiären Amin hergestellt werden. Repräsentative Alkali- oder Erdalkalisalze schließen die Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium- und Aluminiumsalze und desgleichen ein. Repräsentative organische Amine, die zur Bildung von Baseadditionssalzen verwendbar sind, schließen Ethylamin, Diethylamin, Ethylendiamin, Ethanolamin, Diethanolamin, Piperazin und desgleichen ein.
Netzmittel, Emulgiermittel und Gleitmittel, wie zum Beispiel Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat, sowie Farbstoffe, Trennmittel, Überzugsmittel, Süßungs-, Aroma- und parfümierende Stoffe, Konservierungsmittel und Antioxidanzien können auch in der Zusammensetzung der Erfindung vorliegen.
Formulierungen der Erfindung schließen solche ein, die zur oralen, nasalen, topischen, transdermalen, bukkalen, sublingualen, rektalen, vaginalen und/oder parenteralen Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können praktischerweise in „Unit Dosage Form" (Einheitsdosierungsform des Arzneimittels) angeboten werden und können durch jedwede auf dem Gebiet der Pharmazie gut bekannten Verfahren hergestellt werden. Die Formulierungen können das Therapeutikum, das sulfatierte chitinöse Polymer und einen zusätzlichen pharmazeutisch verträglichen Träger einschließen, doch sind nicht darauf beschränkt.
Formulierungen der Erfindung, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können in Form von Folgenden vorliegen: Kapseln, Cachets, Pillen, magensaftresistenten Tabletten, Lutschpastillen (unter Verwendung einer aromatisierten Grundlage, gewöhnlich Saccharose und Akazie oder Tragant), Pulvern, Granulat oder als eine Lösung oder eine Suspension in einer wässrigen oder nichtwässrigen Flüssigkeit oder als eine Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Flüssigemulsion oder als ein Elixier oder Sirup oder als Pastillen (unter Verwendung einer inerten Grundlage, wie zum Beispiel Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Akazie) und/oder als Mundspülmittel und desgleichen, wobei jedes eine vorbestimmte Menge des Therapeutikums enthält. Die Formulierungen der Erfindung können auch als ein Bolus, eine Latwerge oder Paste verabreicht werden.
In festen Dosierungsformen der Erfindung zur oralen Verabreichung (Kapseln, Tabletten, Pillen, Dragees, Pulver, Granulat und desgleichen) werden das Therapeutikum und das sulfatierte chitinöse Polymer mit einem oder mehreren zusätzlichen pharmazeutisch verträglichen Trägern, wie zum Beispiel Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat, und/oder jedwedem der Folgenden gemischt: Füllstoffen oder Streckmitteln, wie zum Beispiel Stärken, Lactose, Saccharose, Glucose, Mannitol und/oder Kieselsäure; Bindemitteln, wie etwa beispielsweise Carboxymethylcellulose, Alginaten, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und/oder Akazie; Feuchthaltemitteln, wie zum Beispiel Glycerol; Sprengmitteln, wie zum Beispiel Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, bestimmten Silikaten und Natriumcarbonat; Lösungsverzögerern, wie zum Beispiel Paraffin; Absorptionsbeschleunigern, wie zum Beispiel quartären Ammoniumverbindungen; Netzmitteln, wie etwa beispielsweise Cetylalkohol und Glycerolmonostearat; Absorptionsmitteln, wie zum Beispiel Kaolin- und Bentonit-Ton; Gleitmitteln, wie zum Beispiel Talkum, Calciumstearat, Magnesiumstearat, festen Polyethylenglycolen, Natriumlaurylsulfat und Mischungen davon; und Farbstoffen. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen auch Puffermittel umfassen. Feste Zusammensetzungen einer ähnlichen Art können auch als Füllstoffe in weich und hart gefüllten Gelatinekapseln unter Verwendung derartiger Hilfsstoffe wie Lactose oder Milchzucker sowie Polyethylenglycolen mit hohem Molekulargewicht und desgleichen eingesetzt werden.
Eine Tablette kann durch Verpressen oder Formen, optional mit einem oder mehreren Zusatzbestandteilen, hergestellt werden. Komprimierte Tabletten können unter Verwendung von Bindemittel (beispielsweise Gelatine oder Hydroxypropylmethylcellulose), Gleitmittel, inertem Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel, Sprengmittel (beispielsweise Natriumstärkeglycolat oder vernetzte Natriumcarboxymethylcellulose), oberflächenaktives oder Dispergiermittel hergestellt werden. Geformte Tabletten können durch Formen einer Mischung der gepulverten Verbindung, die mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel befeuchtet ist, in einer geeigneten Maschine hergestellt werden.
Die Tabletten und andere feste Dosierungsformen der Zusammensetzungen der Erfindung, wie zum Beispiel Dragees, Kapseln, Pillen und Granulat, können optional eingekerbt oder mit Überzügen und Hüllen, wie zum Beispiel magensaftresistenten Überzügen und anderen in der pharmazeutischen Formulierungstechnik gut bekannten Überzügen hergestellt werden. Sie können auch derart formuliert werden, dass sie eine langsame oder kontrollierte Freisetzung des Therapeutikums und sulfatierten chitinösen Polymers, dabei unter Verwendung von beispielsweise Hydroxypropylmethylcellulose in variierenden Anteilen zur Bereitstellung des gewünschten Freisetzungsprofils, anderer Polymergrundsubstanzen, von Liposomen und/oder Mikrosphären, bereitstellen. Sie können beispielsweise durch Filtration durch einen bakteriendichten Filter oder durch Einbringen von Sterilisationsmitteln in Form von sterilen festen Zusammensetzungen, die in sterilem Wasser oder irgendeinem anderen sterilen injizierbaren Medium gelöst werden, unmittelbar vor der Verwendung sterilisiert werden. Diese Zusammensetzungen können auch optional Opakisierungsmittel enthalten und können von einer Zusammensetzung sein, dass sie den/die Wirkstoff(e) nur, oder bevorzugt, in einem bestimmten Teil des Magen-Darm-Trakts, optional in einer verzögerten Weise, freisetzen. Beispiele von Zusammensetzungen zur Einbettung, die verwendet werden können, schließen polymere Substanzen und Wachse ein.
Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung der Therapeutika und des sulfatierten chitinösen Polymers schließen pharmazeutisch verträgliche Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere ein. Zusätzlich zum sulfatierten chitinösen Polymer und dem Therapeutikum können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel, die gewöhnlich in der Technik verwendet werden, enthalten, wie etwa beispielsweise Wasser oder andere Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgiermittel, wie zum Beispiel Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol, Öle (insbesondere Baumwollsamen-, Erdnuss-, Mais-, Keim-, Oliven-, Kastor- und Sesamöle), Glycerol, Tetrahydrofurylalkohol, Polyethylenglycole und Fettsäureester von Sorbitan und Mischungen davon. Neben inerten Verdünnungsmitteln können die oralen Zusammensetzungen auch Adjuvanzien, wie zum Beispiel Netzmittel, Emulgiermittel und Suspensionsmittel, Süßungs-, Aroma-, Farb-, parfümierende Stoffe und Konservierungsmittel, einschließen.
Suspensionen können zusätzlich zum Therapeutikum und sulfatierten chitinösen Polymer Suspensionsmittel enthalten, wie beispielsweise ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbitol und Sorbitanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant und Mischungen davon.
Formulierungen des Therapeutikums und sulfatierten chitinösen Polymers zur rektalen oder vaginalen Verabreichung können als ein Suppositorium dargeboten werden, das durch Mischen des Therapeutikums und des sulfatierten chitinösen Polymers mit einem oder mehreren geeigneten nicht reizenden Hilfsstoffen oder Trägern, die beispielsweise Kakaobutter, Polyethylenglycol, ein Suppositorien-Wachs oder ein Salicylat umfassen, hergestellt werden kann und das bei Raumtemperatur fest ist, doch bei Körpertemperatur flüssig ist und daher im Rektum oder Scheidenhohlraum schmelzen und das Therapeutikum und sulfatierte chitinöse Polymer freisetzen wird. Formulierungen der Erfindung, die zur vaginalen Verabreichung geeignet sind, schließen auch Pessarien, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprayformulierungen ein, die derartige Träger, die in der Technik als geeignet bekannt sind, enthalten.
Dosierungsformen zur topischen oder transdermalen Verabreichung eines Therapeutikums und sulfatierten chitinösen Polymers dieser Erfindung schließen Puder, Sprays, Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gele, Lösungen und Pflaster ein. Das Therapeutikum und sulfatierte chitinöse Polymer können unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und mit jedweden Konservierungsmitteln, Puffern oder Treibmitteln, die erforderlich sein können, gemischt werden.
Die Salben, Pasten, Cremes und Gele können zusätzlich zum Therapeutikum und sulfatierten chitinösen Polymer Hilfsstoffe enthalten, wie zum Beispiel tierische und pflanzliche Fette, Öle, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglycole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid oder Mischungen davon.
Transdermale Pflaster haben den zusätzlichen Vorteil, dass eine kontrollierte Zufuhr einer Verbindung zum Körper bereitgestellt wird. Derartige Dosierungsformen können durch Lösen oder Dispergieren der Verbindung in dem geeigneten Medium hergestellt werden. Absorptionsverstärker können auch verwendet werden, um den Fluss der Verbindung quer durch die Haut zu erhöhen. Die Rate eines derartigen Flusses kann entweder durch Bereitstellen einer die Rate kontrollierenden Membran oder durch Dispergieren der aktiven Verbindung in einer Polymermatrix oder einem Gel kontrolliert werden.
Ophthalmische Formulierungen, Augensalben, Puder, Lösungen und desgleichen werden auch als im Rahmen dieser Erfindung liegend erwogen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen dieser Erfindung, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, umfassen ein Therapeutikum und sulfatiertes chitinöses Polymer in Kombination mit einer oder mehreren pharmazeutisch verträglichen, sterilen, isotonischen, wässrigen oder nichtwässrigen Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen oder sterilen Pudern, die in sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen genau vor der Verwendung wieder eingesetzt werden können, die Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostatika, gelöste Stoffe, die die Formulierung mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers isotonisch machen, oder Suspensions- oder Verdickungsmittel enthalten können.
Beispiele von geeigneten wässrigen und nichtwässrigen Trägern, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung eingesetzt werden können, schließen Wasser, Ethanol, Polyole (wie zum Beispiel Glycerol, Propylenglycol, Polyethylenglycol und desgleichen) und geeignete Mischungen davon, pflanzliche Öle, wie zum Beispiel Olivenöl, und injizierbare organische Ester, wie zum Beispiel Ethyloleat, ein. Die richtige Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung von Überzugsstoffen, wie zum Beispiel Lecithin, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Fall von Dispersionen und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Stoffen aufrechterhalten werden.
Diese Zusammensetzungen können auch Adjuvanzien enthalten, wie zum Beispiel Konservierungsmittel, Netzmittel, Emulgiermittel und Dispergiermittel. Die Verhinderung der Aktivität von Mikroorganismen kann durch den Einschluss von verschiedenen antibakteriellen und antifungalen Mitteln, beispielsweise Paraben, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure und desgleichen, gewährleistet werden. Es kann auch wünschenswert sein, isotonische Mittel, wie zum Beispiel Zucker, Natriumchlorid und desgleichen, in den Zusammensetzungen einzuschließen. Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein sulfatiertes chitinöses Polymer und ein Therapeutikum umfasst. Das Therapeutikum kann auch ein Schutzmittel oder einen zusätzlichen pharmazeutisch verträglichen Träger einschließen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erklärt.
Beispiel 1: Einfluss von S-NOCCs auf den TEER und die Lebensfähigkeit von Caco-2-Zellen.
Dieses Beispiel demonstriert die Fähigkeit von sulfatierten chitinösen Polymeren, die Permeabilität durch intestinale Epithelzellen zu verstärken. Die intestinalen Caco-2-Epithelzellen, die in diesem Beispiel verwendet wurden, bilden apikal Tight Junctions, die die parazellulären Wege verschließen. Eine Unterbrechung der Tight Junction-Barriere führt zu erhöhter parazellulärer Permeabilität von hydrophilen Arzneistoffen, die durch den Darm schlecht absorbiert werden. Die Intaktheit der Tight Junctions kann durch Messen der Abnahmen des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER), wenn die Tight Junctions geöffnet sind, bestimmt werden.
Caco-2-Zellkulturen wurden anfangs aus Kryoröhrchen (in flüssigem Stickstoff aufbewahrt) in Kolben besiedelt und mit Trypsin behandelt. Nach der Behandlung mit Trypsin wurden die Zellen auf Costar Transwell Filtern (24-Well- Platten, Costar Europe, Badhoevedorp, Niederlande) bei einer Besiedlungsdichte von 10⁴ Zellen/cm² besiedelt. Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma, Bornem, Belgien, pH = 7,4), das mit 1% nichtessenziellen Aminosäuren, 10% fötalem Kälberserum (Hyclone, Greiner, Niederlande), Benzylpenicillin G (160 U/ml) und Streptomycinsulfat (100 μg/ml) (Sigma) ergänzt war, wurde als Kulturmedium verwendet und wurde sowohl zur Donor- als auch der Akzeptor-Kammer gegeben. Das Medium wurde jeden zweiten Tag ausgetauscht. Die Zellkulturen wurden bei einer Temperatur von 37°C in einer feuchten Atmosphäre von 5% CO₂ und 95% Luft gehalten. Für die Experimente wurden die Zellen bei 21 oder 25 Tagen nach der Besiedlung verwendet. Die Anfangswerte des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) betrugen 1200 Ω cm². Vier Stunden vor der Applikation der sulfatierten chitinösen Polymere wurde das Medium durch DMEM, das mit 40 mM N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N-(2-ethansulfonsäure) (HEPES, Sigma, Bornem, Belgien) auf pH 7,4 gepuffert war, ersetzt. Die Zellen mit DMEM-HEPES-Medium dienten als Kontrolle.
S-OCC (N-sulfatiertes O-Carboxymethylchitosan), S-NOCC (N-sulfatiertes N,O-Carboxymethylchitosan) und S-SAN (N-sulfatiertes Chitosan) wurden auf die Caco-2-Zellkulturen appliziert und der TEER wurde für 4 Stunden gemessen. Nach vier Stunden wurden die Polymere entfernt. Der TEER wurde auch bei 24 Std. nach der Applikation aufgenommen, um die Lebensfähigkeit der Monoschichten zu untersuchen.
S-SAN wurde in Konzentrationen von sowohl 3% als auch 5% getestet. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 1 dargestellt. Es wurde gefunden, dass bei einer Konzentration von 3% der TEER über die gesamte Dauer von vier Stunden etwa 20% seines Anfangswerts betrug. Bei einer Konzentration von 5% betrug der TEER für die Dauer von vier Stunden etwa 10% seines Anfangswerts. Dies zeigt, dass S-SAN zur Öffnung der Tight Junctions der Epithelzellen wirksam war.
S-OCC wurde auch in Konzentrationen von sowohl 3% als auch 5% getestet. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 2 dargestellt. Es wurde gefunden, dass bei einer Konzentration von 3% der TEER für die Dauer von vier Stunden nach der Applikation zwischen 60% und 80% des Anfangswerts betrug. Bei einer Konzentration von 5% betrug der TEER während des ganzen Experiments etwa 40% der anfänglichen Messung.
S-NOCC wurde in einer Konzentration von 1% getestet. Es wurde gefunden, dass S-NOCC bei dieser Konzentration den TEER für etwa 4 Stunden nach der Applikation auf etwa 80% seines ursprünglichen Werts herabsetzte.
Dieses Beispiel zeigt, dass die sulfatierten chitinösen Polymere, S-SAN, S-OCC und S-NOCC, jeweils fähig waren, die Tight Junctions zwischen den Caco-2-Epithelzellen wirksam zu unterbrechen.
Beispiel 2: Wirkung von S-NOCCs als Hauptträger von LMWH (Low Molecular Weight Heparin – niedermolekulares Heparin) in vivo
Die Wirkung von S-NOCCs (N-sulfatierten N,O-Carboxymethylchitosanen) als Hauptträger in vivo wurde unter Verwendung von Ratten getestet. Männliche Wistar-Ratten (SPF-Status, ungefähr 250 g) wurden von Charles River (NL) erhalten. Die Tiere wurden für 16 Stunden vor der Verabreichung mit freiem Zugang zu Wasser gefastet. Die Tiere wurden mit Hypnorm (Fentanylcitrat) und Dormicum (Midazolam) narkotisiert. Die Körpertemperatur der Ratten wurde bei 36–37°C gehalten und wurde während des gesamten Experiments überwacht.
Die Lösung von Reviparin LMWH (Reviparin, Knoll, 108 Anti-Xa U/mg) wurde in physiologischer Kochsalzlösung zu 625 Anti-Xa U/ml zubereitet.
S-NOCC wurde bei zwei Viskositäten, 40 und 60 cps (S-NOCC40 und S-NOCC60), die ein niedermolekulares bzw. höhermolekulares chitinöses Polymer darstellen, getestet. Die S-NOCCs wurden zu 3% (m/V) in der Lösung von Reviparin gelöst, um ein viskoses Gel zu bilden.
Um die LMWH-Formulierungen zu verabreichen, wurde ein dünner Teflon-Schlauch (~1 mm ID) zur Kontrolle (kein Polymer) verwendet. Um die S-NOCC-Formulierungen zu verabreichen wurde ein Polypropylen-Schlauch mit einem ID von 3 mm verwendet, um die Verabreichung der viskosen Gele zu erleichtern. Beide Schläuche wurden an eine Spritze angeschlossen.
Der Bauch der Tiere wurde durch einen Schnitt geöffnet und der Magen wurde zur Schnittstelle bewegt. Es wurde ein kleiner Schnitt am Magen vorgenommen, um zu ermöglichen, dass jeder Schlauch über den Pylorus zum Beginn des Zwölffingerdarms (ersten 2–3 cm) geführt werden kann. Die Formulierungen wurden langsam über 5 min und bei +/– 2 ml, normalisiert auf das Körpergewicht von jedem Tier, verabreicht, um eine Verabreichung von 5000 Anti-Xa U/kg zu gewährleisten.
Blutproben, ~225 μl, wurden aus den Kapillaren der Schwanzvene (nach Einschnitt) in Eppendorf-Gefäßen, die 25 μl Natriumcitrat 3,8% enthielten, gesammelt. Die Proben wurden bei 13000 rpm for 20 min zentrifugiert.
Die Analyse der Proben wurde unter Verwendung des Chromostrate Heparin Anti-Xa Assays (Organon Teknika, NL) durchgeführt. Dieser Assay misst die potenzierende Wirkung von Heparin auf die Anti-Xa-Aktivität in Plasma- und Mediumproben durch ein amidolytisches Verfahren unter Verwendung eines synthetischen chromogenen Substrats (CH₃OCO-D-Val-Gly-Arg-pNA.AcOH). Die Proben, die Heparin enthielten, wurden in Gegenwart von Antithrombin III (ATIII; Plasma-Cofaktor) mit einem Überschuss von Faktor Xa zur Bildung eines ATIII-Heparin-Xa-Komplexes inkubiert. Der verbleibende Xa katalysierte die Freisetzung von p-Nitroanilin (pNA) aus dem chromogenen Substrat. Die Freisetzung von pNA wurde durch ein Endpunktverfahren bei 405 nm in einem EL808 Ultra Microplate Reader (Biotek Instruments Inc.) gemessen. Die Analyse von LMWH wurde unter Verwendung einer Standardkalibrierungskurve in einem Bereich von 0,0–0,7 Anti-Xa Units/ml durchgeführt.
3 ist ein Diagramm, das die intestinale Absorption von LMWH Reviparin in Ratten bei Verabreichung einer Dosis von 5000 Anti-Xa U/kg mit oder ohne die sulfatierten chitinösen Polymere (für alle Gruppen n = 6 ± Standardfehler des Mittelwerts) zeigt. Ohne die S-NOCC-Polymere war die intestinale Absorption von LMWH begrenzt. Die S-NOCCs erhöhten die Absorption des LMWH zu den und über die antithrombotischen Niveaus (0,2 Anti-Xa U/ml). Die Absorption wurde während des gesamten Experiments for 6 Stunden aufrechterhalten. Es wurden keine größeren Unterschiede zwischen S-NOCC40 und S-NOCC60 beobachtet.
Beispiel 3: Wirkung von S-NOCC auf den Transport von ¹⁴C-Mannitol quer durch Caco-2-Zellmonoschichten
In Gegenwart eines sulfatierten chitinösen Polymers ist der Transport von ¹⁴C-Mannitol quer durch Caco-2-Zellmonoschichten ein quantitatives Maß der parazellulären Erhöhung. ¹⁴C-Mannitol ist ein inertes, radioaktives, ungeladenes Molekül, das als Marker der parazellulären Permeabilität fungiert.
¹⁴C-Mannitol (MW 182,2; spezifische Radioaktivität 57 mCi/mmol) wurde von Amersham-Pharmacia (Niederlande) erhalten. S-NOCC60 wurde zu Konzentrationen von 1%, 3% und 5% (m/V) in DMEM-HEPES, das ¹⁴C-Mannitol enthielt, gelöst. Der pH der Lösungen wurde dann auf 7,40 eingestellt. Proben von 200 μl wurden von der basolateralen Seite für 4 Stunden entnommen und wurden durch ein gleiches Volumen von vorgewärmtem DMEM-HEPES ersetzt. Kontrollexperimente wurden bei jedem Experiment mit Lösungen, die die radioaktiven Marker ohne jedwede gelösten Polymere enthielten, durchgeführt. Die auf die Zellen applizierte Radioaktivität wurde in 200 μl-Proben der getesteten Lösungen bestimmt und die Hintergrund-Radioaktivität wurde in 200 μl-Proben von DMEM-HEPES ohne den radioaktiven Marker bestimmt. Die in den Proben vorliegende Radioaktivität wurde nach Zugabe von 3 ml Szintillationscocktail (Ultima Gold) in einem Flüssigszintillationszähler bestimmt. Die Ergebnisse wurden für die Verdünnung korrigiert und als kumulativer Transport zur Zeit t ausgedrückt.
Der Transport von Mannitol wurde als P_app (apparent permeability coefficient = scheinbarer Permeabilitätskoeffizient) ausgedrückt, der gemäß der folgenden Formel berechnet wird: Papp (dC/dt)·(1/A·60·C0),worin P_app in cm/s gemessen wird, dC/dt die Permeabilitätsrate ist, A die Diffusionsfläche der Monoschicht (cm²) ist und C₀ die Anfangskonzentration des radioaktiven Markers ist.
Die Verhältnisse der Erhöhung (R) wurden gemäß der folgenden Formel berechnet: R = Papp Polymer/Papp Kontrolle
Die Verhältnisse der Erhöhung und die scheinbaren Permeabilitätskoeffizienten sind für jede getestete Konzentration von S-NOCC60 in Tabelle 1 nachstehend gezeigt: Tabelle 1

P_app × 10^–8 R

Kontrolle 4,1 ± 0,8 1

S-NOCC60 1% (m/V) 7,1 ± 8,5 1,7

S-NOCC60 3% (m/V) 61,1 ± 5,8 14,8

S-NOCC60 5% (m/V) 131 ± 15,5 28,5
Bei jeder getesteten Konzentration war S-NOCC60 ein wirksamer Permeationsverstärker, wie in Caco-2-Zellmonoschichten getestet wurde. Die Wirkung auf die parazelluläre Permeation schien konzentrationsabhängig zu sein.
Beispiel 4: Wirkung von S-NOCC60 auf den Transport von FD-4 quer durch Caco-2-Zellmonoschichten
Dieses Beispiel demonstriert die Fähigkeit eines sulfatierten chitinösen Polymers, S-NOCC60, die Permeabilität von FITC-Dextran (FD-4) durch Caco-2-Zellmonoschichten zu erhöhen.
Die Lösung von FD-4 (MW 4000, Sigma) wurde in HBSS-HEPES (Hank's Balanced Salt Solution ohne Phenolrot, Sigma) bei pH 7,4 und zu einer Konzentration von 1 mg/ml hergestellt. Lösungen von S-NOCC60 in Konzentrationen von 3% und 5% (m/V) wurden auf die Caco-2-Zellmonoschichten appliziert. Proben von 200 μl wurden von der basolateralen Seite für 4 Stunden entnommen.
Die Analyse der Proben wurde durch HPLC-Größenausschlusschromatographie (SEC) durchgeführt. Es wurden eine Waters 515 HPLC Pumpe, ein Waters 474 Scanning Fluorescence Detector und ein Gilson 234 Autoinjector verwendet. Die Säule war eine PSS Suprema 30 von Polymer Standard Service. Der Eluent war 15/85 Acetonitril/CH₃COONH₄ 0,05 M pH = 9,0. Die Retentionszeit lag bei 7 Minuten; jedoch wurden die Chromatogramme bis zu 15 Minuten laufen gelassen, um die Elution von möglichen Abbauprodukten (MW niedriger als 4000 Da) zu untersuchen. Die Proben für die Kalibrierungskurven wurden mit ansteigender Konzentration von FD-4 hergestellt.
4 ist ein Liniendiagramm, das die Wirkung von S-NOCC60 bei 3 und 5% (m/V) auf den Transport von FD-4 quer durch die Caco-2- Zellmonoschichten zeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass S-NOCC60 die Permeabilität von Caco-2-Zellmonoschichten für FD-4 wesentlich erhöhte.
Beispiel 5: Wirkungen von S-NOOC60, S-SAN und Natriumdocusat auf die Absorption von Insulin in vivo
In diesem Beispiel wurde die Wirkung von S-NOCC und SSAN1B mit und ohne Natriumdocusat unter Verwendung von Ratten untersucht. Männliche Wistar-Ratten (SPF-Status, ungefähr 250 g) wurden von Charles River (NL) erhalten. Die Tiere wurden für 16 Stunden mit freiem Zugang zu Wasser gefastet. Die Tiere wurden mit Hypnorm (Fentanylcitrat) und Dormicum (Midazolam) narkotisiert. Ihre Körpertemperaturen wurden während der Operation und während des gesamten Experiments überwacht und wurden bei 36–37°C gehalten.
Eine Lösung von menschlichem Insulin (Aventis, 25 IU/mg) wurde in physiologischer Kochsalzlösung zu 12,5 IU/ml hergestellt. Eine zweite Insulinlösung wurde hergestellt, die Docusat zu 0,5 mg/ml (~1 mg/Ratte oder 4 mg/kg) enthielt.
S-NOCC60 und S-SAN wurden zu 3% (m/V) in der Insulinlösung und in der Docusat-Insulinlösung gelöst. Niedermolekulares N-substituiertes Carboxymethylchitosan 3% diente als Kontrolle und wurde nur mit Insulin und nicht in Kombination mit Docusat getestet. Das Insulin wurde jedem Versuchstier in einer Dosis von 25 IU/2 ml/Ratte verabreicht.
Blutproben (~250 μl) wurden aus den Kapillaren der Schwanzvene in Eppendorf-Gefäßen, die Heparin enthielten, gesammelt. Die Proben wurden dann bei 13000 rpm for 20 min zentrifugiert und das Plasma wurde in sauberen Eppendorf-Gefäßen gesammelt. Die Analyse der Plasmaproben wurde unter Verwendung von Pharmacia Insulin RIA 100 (Pharmacia & Upjohn) durchgeführt.
Die Absorption von menschlichem Insulin in Ratten ist in den 5 und 6 bei Verabreichung mit S-NOCC60 bzw. S-SAN mit und ohne Natriumdocusat (0,5 mg/ml) dargestellt. Die 5 und 6 zeigen, dass sowohl S-NOCC60 als auch S-SAN die Absorption von Insulin bedeutend erhöhen. Die 5 zeigt auch die synergistische Wirkung von Natriumdocusat auf die Absorption bei Verabreichung in Kombination mit S-NOCC60.
Dieses Beispiel zeigt, dass S-NOCC60 und SSAN1B die Absorption von Insulin aus dem Dünndarm erhöhen und dass Docusat eine synergistische Rolle spielen könnte.
Somit ist es offensichtlich, dass die Zusammensetzungen der Erfindung die Permeabilität der Zellen modifizieren kann, um die Penetration von Therapeutika zu ermöglichen. Diese Zusammensetzungen können zur Zufuhr von einer großen Vielfalt von Therapeutika verwendet werden.
Die vorangehenden Beispiele sind lediglich exemplarisch und der Fachmann wird in der Lage sein, andere Abwandlungen der beschriebenen Methoden zu bestimmen, die in den Rahmen der Erfindung fallen. Entsprechend ist die Erfindung durch die folgenden Patentansprüche und Entsprechungen davon definiert.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein sulfatiertes chitinöses Polymer als einen Hauptträger und ein Therapeutikum umfasst, worin genanntes sulfatiertes chitinöses Polymer aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus N-sulfatiertem N,O-Carboxymethylchitosan, N-sulfatiertem O-Carboxymethylchitosan und Mischungen davon besteht.
Pharmazeutische Zusammensetzung von Anspruch 1, worin genanntes Therapeutikum aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren und Fragmenten davon besteht.
Pharmazeutische Zusammensetzung von einem vorstehenden Anspruch, worin genanntes Therapeutikum ein Peptid mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 700 und etwa 5000 Dalton ist; oder genanntes Therapeutikum ein Protein mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 5000 und etwa 500 000 Dalton ist; oder genanntes Therapeutikum ein Molekulargewicht zwischen etwa 100 und etwa 700 Dalton aufweist; oder genanntes Therapeutikum ein therapeutisches Makromolekül, bevorzugt Heparin, ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung von einem vorstehenden Anspruch, worin genanntes sulfatiertes chitinöses Polymer einen Sulfatierungsgrad von zwischen etwa 0,03 und 1,0, bevorzugt zwischen etwa 0,1 und etwa 1,0, bevorzugter zwischen etwa 0,1 und etwa 0,6 und am bevorzugtesten zwischen etwa 0,2 und etwa 0,4, aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung von einem vorstehenden Anspruch, worin genannte Zusammensetzung weiter einen Permeationsverstärker umfasst, worin genannter Permeationsverstärker bevorzugt einen oberflächenaktiven Stoff umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung von Anspruch 5, worin genannter Permeationsverstärker aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgenden besteht: Docusat-Natrium, Docusat-Calcium, Docusat-Kalium, Natriumdodecylsulfat, Natriumcaprylat, Natriumcholat, Natriumdeoxycholat, Natriumtaurocholat, Natriumglycocholat und Mischungen davon, bevorzugt Docusatnatrium.
Pharmazeutische Zusammensetzung von einem vorstehenden Anspruch, worin genannte Zusammensetzung weiter ein Schutzmittel umfasst, worin genanntes Schutzmittel bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Proteaseinhibitor, einem Stabilisierungsmittel und Mischungen davon besteht.
Verwendung eines sulfatierten chitinösen Polymers, wie in Anspruch 1 definiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Zuführung eines Therapeutikums quer durch eine Membran, die für genanntes Therapeutikum eine begrenzte Permeabilität aufweist.
Verwendung nach Anspruch 8, worin das sulfatierte chitinöse Polymer wie in Anspruch 4 definiert ist und/oder das Therapeutikum wie in Anspruch 2 oder 3 definiert ist.
Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, worin genannte Membran Zellen umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Epithelzellen und Endothelzellen besteht, worin genannte Membran bevorzugt an einem Körperteil lokalisiert ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgenden besteht: Nase, Mundhöhle, Magen, Darm, Scheide, Haut und Auge eines Subjekts, worin genanntes Subjekt bevorzugt ein Mensch ist.