DE69728769T2 - Polymerzusammensetzung zur oralen administration von peptiden und proteinen - Google Patents

Polymerzusammensetzung zur oralen administration von peptiden und proteinen Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf eine therapeutikumhaltige Zusammensetzung, die an die orale Verabreichung eines anderen biologisch aktiven Materials als Insulin angepaßt ist, wobei die therapeutischen Proteine und Peptide gewöhnlich nicht leicht oral zugeführt werden. Die Formulierung kann aus einer herkömmlichen chemischen Verbindung, einem Protein, einem Peptid oder einem in ein Hydrogel eingearbeiteten Peptid-Biomimetikum bestehen, dessen Polymerstruktur chemisch modifiziert wurde, um eine Funktionalität, die das Therapeutikum vor dem Abbau schützt und eine Funktionalität einzuschließen, die mit der Magen- oder Darmschleimhaut in Wechselwirkung tritt, um die Wahrscheinlichkeit günstig zu erhöhen, daß das Therapeutikum in das Kreislaufsystem diffundiert. Genauer befaßt sich die Erfindung mit einer ein Therapeutikum enthaltenden Zusammensetzung, die an die orale Verabreichung eines anderen biologischen Materials als Insulin angepaßt ist, wobei diese Zusammensetzung ein wasserquellbares Polymer, das mit einem Enzyminhibitor chemisch modifiziert wurde und sowohl ein Protein, Peptid oder Peptid-Biomimetikum wie etwa Wachstumshormon und Erythropoietin als auch andere Peptide, deren Molekulargewicht im Bereich von 30000 ist oder andere Proteine mit einem Molekulargewicht bis zu einer Million umfaßt, zur oralen Zufuhr beim Behandeln entsprechender verschiedener Formen und Grade verschiedener, mit einem Wachstumshormon zusammenhängender Krankheiten und verschiedener mit dem Blut zusammenhängender Krankheiten. Andere Verwendungen schließen speziell die Behandlung tierischer Krankheiten und andere biologische Anwendungen ein, die Wachstumshormone und verwandte Analoga und Metaboliten zu einer verbesserten Milch- und/oder Fleischproduktion einschließen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Seit der Einführung der Biotechnologie ist von vielen Proteintherapeutika festgestellt worden, daß sie bei vielen möglicherweise ernsten Krankheiten bedeutende therapeutische Vorteile aufweisen. Derartige Krankheiten schließen Krebs, Herzkrankheiten, Krankheiten des Zentralnervensystems, Krankheiten des Immunsystems, Krankheiten des Blut- und Kreislaufsystems und viele Krankheiten auf hormoneller Grundlage ein.
  • Unglücklicherweise sind viele dieser medizinischen Störungen chronisch und erfordern die kontinuierliche Verabreichung des erforderlichen Therapeutikums.
  • Die breite Verwendung von Proteintherapeutika und vieler anderer schwer zuzuführender Therapeutika hängt jedoch von der Fähigkeit ab, sie an Patienten in kontrollierbarer und annehmbarer Weise zu verabreichen. Die orale Verabreichung wäre eindeutig das am meisten erwünschte Verfahren zum Verabreichen derartiger Materialien an Patienten, die diese über einen ausgedehnten Zeitraum einnehmen müssen. Unglücklicherweise ist die Fähigkeit zum Verabreichen von Proteinen auf diese Weise niemals erreicht worden, da Proteine und Peptide typischerweise leicht verstoffwechselt, teilweise abgebaut und/oder im Magen und Darm konformativ modifiziert werden können, wenn sie Patienten oral zugeführt werden. Außer mit einem Abbau verbundenen Problemen ist ihr Molekulargewicht typischerweise zu hoch, um einen bedeutenden Transport durch die Darmwand in das Kreislaufsystem zu erlauben. Dies trifft selbst dann zu, wenn sie vor einem ausgedehnten Abbau im Magen und/oder Darm geschützt werden können und die Darmwand in im wesentlichen biochemisch unveränderter Form erreichen können. Im Ergebnis können Proteintherapeutika nur durch Injektion (typischerweise intravenös (IV) oder subkutan) gegeben werden und selbst Peptide und Peptidmimetika niedrigen Molekulargewichts können praktisch nicht oral verabreicht werden. Dies hat ihre breite Verwendung für viele Krankheiten stark eingeschränkt.
  • Tatsächlich ist viele Jahre nach einem Weg gesucht worden, der die direkte orale Zufuhr von Proteinen und Peptiden gestattet, da allgemein erkannt worden ist, daß ein derartiger Weg, wenn er denn entwickelt wird, wichtige Vorteile besäße und auf diese Weise die möglichen Verwendungen für Protein- und Peptidtherapeutik stark erweitern würde. Nichtsdestotrotz und trotz umfangreicher Anstrengungen, Insulin und andere Proteine und Peptide und gegenüber der Wirkung verschiedener verdauender Proteinase resistente Zubereitungen, die zur Zufuhr in den Blutstrom durch die Darmschleimhaut befähigt sind, zu entwickeln, ist bis jetzt kein derartiger Weg gefunden und zur allgemeinen Verabreichung entweder von Insulin oder anderen Protein- oder Peptidtherapeutika verwendet worden.
  • Tatsächlich sind die Nachteile einer Verabreichung durch Injektion bei den meisten Proteintherapeutika eines der Hauptelemente, die die Verwendung von Proteinen als Therapeutika für chronische Krankheiten einschränken. Dieselben Probleme und Einschränkungen treffen auf die Verwendung von Proteinen bei Tieren, wo mehrfache und oft tägliche Wiederholungsdosen zum Erzielen der notwendigen biologischen Wirkung erforderlich sind, und auf Therapeutika zu, die kein Protein sind und nicht oral bioverfügbar sind.
  • Die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung beziehen sich sowohl auf jegliche Anzahl möglicherweise wirksamer Proteine und Peptide als auch auf andere Therapeutika. Die orale Zufuhr von Wachstumshormonen wird zum Veranschaulichen der Anwendbarkeit der beschriebenen Verfahrensweise und der Formulierungen verwendet. Wir zeigen Tieruntersuchungen, Formulierungen und eine Verfahrensweise zum Herstellen der Formulierungen, was das Herstellen gegenüber der Wirkung von verdauender Proteinase resistenten Zubereitungen gestattet. Die Verwendung dieser Formulierungen gestattet dem enthaltenen therapeutischen Protein, die Darmschleimhaut zu durchdringen und in das Kreislaufsystem einzudringen, wo es seine therapeutische Wirkung entfalten kann. Wir zeigen weiter, daß eine therapeutische Wirksamkeit mit Insulindosiswerten erzielt werden kann, die mit Dosiswerten vergleichbar ist, die gemeinhin bei herkömmlichen therapeutischen Injektionen verwendet werden.
  • Das US-Patent Nr. 5 049 545 offenbart injizierbare, insulinhaltige Zusammensetzungen, die auf einem Polymer (einschließlich eines Polymerhydrogels) wie etwa Stärke, Dextran, Polyoxyethylen und Polyvinylpyrrolidon immobilisiertes Insulin umfassen und in diesen Formulierungen sind Inhibitoren proteolytischer Enzyme enthalten. Die in dieser Arbeit synthetisierten, insulinhaltigen Polymerzusammensetzungen zeigen jedoch keine bedeutende Stabilität gegenüber dem Angriff verdauender Enzyme und sind daher für die orale Zufuhr nicht brauchbar.
  • Saffran M., Kumar G. S. et al., Biochem. Soc. Trans. 1990, Bd. 18, Nr. 5, S. 752; Damge, C., J. Controlled Release, 1990, Bd. 13, S. 233, und Greenley R. Z., Broun T. M. et al., Polymer Prepr., 1990, Bd. 31, Nr. 2, S. 182, haben verschiedene Formulierungen mitgeteilt, die ein Polymer und Insulin enthalten, aber die sich daraus ergebenden Zusammensetzungen sind zum Zuführen von Insulin in den Blutstrom beim oralen Verabreichen nicht ausreichend wirksam.
  • Die am 28. September 1995 veröffentlichte Offenlegungsschrift der deutschen Patentanmeldung DE 195 10 551 A1 offenbart die orale Zufuhr von Insulin, die ein hydrophiles Polymer, das mit aus Enten- oder Puteneiweiß isoliertem Ovomucoid (das ein Inhibitor proteolytischer Enzyme ist modifiziert ist, Insulin und Wasser umfaßt. Es gibt keinen Vorschlag, daß irgendwelche anderen Proteine in einer solchen Weise zugeführt werden können oder daß irgendein anderer auf einer Gelmatrix immobilisierter Enzyminhibitor eine derartige Zufuhr erleichtern kann oder wird. Tatsächlich konnte nicht vorhergesagt werden, daß andere biologisch aktive Proteine oder Peptide durch Einsetzen einer derartigen Formulierung verabreicht werden können, da Proteine und Peptide komplexe Moleküle sind, die sich in der chemischen Zusammensetzung und in den physikalischen Eigenschaften voneinander unterscheiden.
  • Es versteht sich wohl, daß es viele mit der oralen Zufuhr von Proteinen oder Peptiden verbundene Hindernisse und Schwierigkeiten gibt. Diese schließen den chemischen und enzymatischen Abbau ein, der in verschiedenen Teilen des Verdauungstrakts stattfindet, wobei die Hindernisse gegenüber einem Transport durch die Darmschleimhaut und darin enthaltene spezifische Enzyme und die noch größeren Zellschranken und engen Übergänge dargestellt werden (Wei Wang, J. of Drug Targeting, (1996), Bd. 4, Nr. 4, 5. 195–232). Trotz derartiger Barrieren besteht genügend Beweis, daß einige Nahrungs- und andere Proteine in begrenztem Maß durch diese Schranken hindurchgehen können. Derartige Unterschiede beim Proteinverhalten, Transporthindernisse und verwandte Probleme haben die praktische Zufuhr von Proteinen oder proteinähnlichen, biologisch aktiven Materialien auf oralem Weg bis heute unerreichbar gemacht (Elke Lipka, John Crison, Gordon Amidon, J. Controlled Release (1996) 39, 121–129). Es ist weiterhin bekannt, daß es sowohl spezielle Aminosäure- und di- und -tripeptid-Transportmechanismen als auch Rezeptoren und Transportmechanismen für spezielle Proteine und Peptide in unterschiedlichen Teilen des Darmsystems bestehen (US-Patent 5 438 040 (Ekwuribe) und P. Smith "Exploitation of the Intestinal Oligopeptide Transporter to Enhance Drug Absorption." Bd. 3, Nr. 2, 1966). Dressman und Berardi2 J. Pharm. Sci. 82 (9), 1993, S. 857, führen aus, daß es viele GI-Parameter wie etwa pH, Bürstensaum und Mikrokolonaktivität gibt, die eine Schlüsselrolle bei der Menge und dem Zustand der oral zuzuführenden Therapeutikamoleküle spielen. Sie zeigen, daß obschon viele spezielle Mechanismen und Wege vorgeschlagen worden sind, keiner breit angewendet worden ist und jeder an einen speziellen Weg gebunden ist.
  • Es besteht ein breiter Bereich abbauender Enzyme wie etwa Peptidasen und Proteasen, die in verschiedenen Bereichen des Darmtrakts angesiedelt sind und in größerem oder geringerem Ausmaß unter verschiedenen Bedingungen gegen unterschiedliche Arten Proteine aktiv sind. Es ist zu erwarten, daß alle diese Bedingungen beim Versuch, jeden schwer zuzuführenden und instabilen Proteinwirkstoff erfolgreich zuzuführen, getrennt betrachtet und beeinflußt werden müssen.
  • Die Vielzahl der Eigenschaften, individuellen molekularen Parameter und einzigartigen möglichen Transportwege, die das Überleben und die Zufuhr eines Proteins beeinflussen können, haben zu vielen verschiedenen Zufuhrstrategien für derartige Moleküle geführt. Es versteht sich daher, daß die Literatur in diesem Bereich keinen allgemeinen Mechanismus vorschlägt, der die orale Zufuhr eines breiten Spektrums von Proteinen beim weitgehenden Ändern des Molekulargewichts mehr oder minder gleichmäßig beeinflussen kann, ohne das Wirkstoffmolekül chemisch zu verändern. Obschon Wege ausgearbeitet wurden, die vom Modifizieren von Proteinwirkstoffen mit speziellen Gruppen und Funktionalitäten abhängen, die aus solchen speziellen und selektiven Transportmechanismen einen Vorteil ziehen können, weisen diese Bemühungen ernste Probleme auf und haben sich weder als allgemein noch praktisch erfolgreich erwiesen. Eindeutig ist jedoch, daß selbst Proteine, die sich von einander nur durch einige Aminosäuresequenzen von Hunderten oder sogar Tausenden derartiger Sequenzen unterscheiden, in den biologischen und/oder Stabilitätseigenschaften sehr verschieden sein können. Somit muß jedes System, von dem gezeigt werden kann, daß es ähnliche Zufuhrergebnisse über einen Bereich derartiger Wirkstoffe beeinflußt, als einmalig angesehen werden, und die hier mitgeteilten, weitgehend beständigen In-vitro- und In-vivo-Ergebnisse sind kaum zu erwarten.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ein allgemeiner Gegenstand der Erfindung ist das Bereitstellen einer Zusammensetzung zur oralen Verabreichung anderer therapeutischer und bioaktiver Materialien als Insulin, deren orale Verfügbarkeit unter normalen Umständen hinlänglich eingeschränkt ist, so daß sie auf diesem Verabreichungsweg nicht wirksam verwendet werden können. Genauer handelt diese Erfindung von einer Zusammensetzung, die ein hydrophiles Polymer, das mit einem Enzyminhibitor chemisch modifiziert ist und ein anderes therapeutisches Material als Insulin, oft ein Protein oder Peptid umfaßt, wobei die Zusammensetzung zur oralen Verabreichung geeignet ist.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das Bereitstellen einer ein Therapeutikum enthaltenden Zusammensetzung zur oralen Verabreichung, die ein wasserquellbares Polymer enthält, das mit einem Enzyminhibitor modifiziert ist und ein anderes therapeutisches Material als Insulin, ein Protein oder Peptid umfaßt, wobei die Zusammensetzung in Form einer Tablette oder Kapsel typischerweise derart vorliegt, daß sie den Bereich des Magens sicher durchqueren und den therapeutischen Bestandteil im Dünndarm freisetzen kann.
  • Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das Erhöhen der Widerstandsfähigkeit der Protein- oder Peptidtherapeutika gegenüber den Wirkungen verschiedener Verdauungsenzyme, um derartigen Therapeutika zu ermöglichen, wirkungsvoller oral verabreicht zu werden.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das Verstärken der Wechselwirkung des ein Therapeutikum enthaltenden Polymerhydrogels mit ausgewählten Transportschranken und interaktiven Stellen des Darms und/oder Gedärms, um die Wirksamkeit der therapeutischen Substanzen zu erhöhen.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das physikalische Einarbeiten und Einschließen eines Proteins oder eines Peptids oder anderer, schwer zuzuführender Therapeutika in die chemisch modifizierten Hydrogele ohne das Umsetzen, Binden oder wesentliche Modifizieren derartiger Therapeutika, um sie vor vorzeitiger Zersetzung, Abbau, Modifizierung oder Zerstörung vor ihrer Zufuhr an den gewünschten Ort im Körper wie etwa der Darmschranke geeignet zu schützen.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das Bereitstellen einer Zusammensetzung, die zum Zuführen einer therapeutisch brauchbaren Menge eines anderen Proteins oder Peptids als Insulin an den Zielort bei Menschen oder Tieren geeignet ist, um brauchbare therapeutische Wirkungen bei solchen Dosiswerten, die erwünschte Ergebnisse erzeugen können, die den beim Injizieren derartiger therapeutischer Materialien in den Körper ähnlich sind und/oder bei Werten zu erzielen, die bedeutend niedriger als bei der oralen Gabe in Abwesenheit dieser Erfindung erforderlich wären.
  • Diese und andere Gegenstände werden durch die nachstehend genauer beschriebenen Zusammensetzungen erreicht.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine Zeichnung der zum Untersuchen der Protein/Peptid-Diffusion aus den Teilchen der polymeren Hydrogele verwendeten Anordnung;
  • 2, 3 und 4 sind graphische Darstellungen der in den Tabellen 9–15 mitgeteilten Daten.
  • GENAUE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung ist auf
    • (1) eine therapeutikumhaltige Zusammensetzung, die an die orale Verabreichung eines anderen biologisch aktiven Materials als Insulin angepaßt ist, umfassend
    • (a) ein wasserunlösliches, aber wasserquellbares, hydrophiles Polymer, daß chemisch modifiziert ist, um mindestens einen Inhibitor eines proteolytischen Enzyms und eine chemische Funktionalität zu enthalten, die eine interaktive Affinität auf Target-Rezeptoren aufweist, die sich auf den Transportsperrwänden des Verdauungstrakts der bestimmungsgemäßen Tierart befinden, wobei die chemische Funktionalität ein lectinbindendes Mittel oder ein Glykosid ist;
    • (b) ein oder mehr therapeutische Materialien, die aus einem Wachstumshormon, einem Interleukin, einem das Blutzellenwachstum stimulierenden Faktor, Erythropoietin (EPO), parathyroidem Hormon (PTH), Selenoprotein P, Cystatin B, Megakaryozytenstimulierungsfaktor (MGDF), Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor, Tumorinvasionshemmfaktoren, transaktivierenden Regulatorproteinen (TAT) des HIV und anderer Retroviren und dem transaktivierenden Regulatorprotein BPC 157, fettreduzierenden Hormonen, Calcitonin und Glucagon ausgewählt sind, und
    • (c) Wasser
    • und (2) ein Verfahren zum Herstellen einer Zusammensetzung des Anspruchs 1, umfassend die Schritte des
    • (a) Funktionalisierens eines Inhibitors proteolytischer Enzyme durch Umsetzen des Inhibitors mit einer Verbindung, die eine polymerisierbare Vinylgruppe und eine funktionelle Gruppe aufweist, die gegenüber dem Inhibitor reaktionsfähig ist,
    • (b) Polymerisierens eines Gemisches, das 75 bis 99 Gewichtsprozent eines oder mehrerer polymerisierbarer Monomeren, 0,1 bis 20 Gewichtsprozent eines Vernetzungsmittels und 0,01 bis 5 Gewichtsprozent eines in Schritt (a) erhaltenen funktionalisierten Inhibitors eines proteolytischen Enzyms umfaßt, unter Liefern eines hydrophilen Polymers und
    • (c) Tauchens des hydrophilen Polymers in eine wäßrige Lösung eines therapeutischen Materials, das aus einem Wachstumshormon, einem Interleukin, einem das Blutzellenwachstum stimulierenden Faktor, Erythropoietin (EPO), parathyroidem Hormon (PTH), Selenoprotein P, Cystatin B, Megakaryozytenstimulierungsfaktor (MGDF), Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor, Tumorinvasionshemmfaktoren, transaktivierenden Regulatorproteinen (TAT) des HIV und anderer Retroviren und dem transaktivierenden Regulatorprotein BPC 157, fettreduzierenden Hormonen, Calcitonin und Glucagon ausgewählt ist, gerichtet.
  • Die Zusammensetzungen dieser Erfindung zeigen beim oralen Verabreichen mindestens 25% der biologischen Wirksamkeit des zugeführten Therapeutikums verglichen mit der Wirksamkeit wenn das Therapeutikum entweder durch intravenöse oder subkutane Injektion verabreicht wird.
  • Die bei dieser Erfindung brauchbaren Polymeren sind wünschenswerterweise von einer mit Wasser interaktiven und/oder hydrophilen Natur und weisen ein solches Molekulargewicht oder Strukturen auf oder sind derart modifiziert worden, daß sie bedeutende Mengen Wasser absorbieren und Hydrogele bilden können, wenn sie mit Wasser oder einem wäßrigen Medium über einen Zeitraum in Kontakt gebracht werden, der zum Erreichen eines Gleichgewichts mit Wasser ausreichend ist, die sich aber beim Gleichgewicht mit Wasser nicht vollständig lösen. Aus Genauigkeitsgründen definieren wir ein Hydrogel der Erfindung als eine Polymermatrix, die, wenn sie mit einem Überschuß an Wasser in Kontakt gebracht wird, wenigstens das zweifache ihres Gewichts an Wasser absorbiert, wenn sie Wasser bei Raumtemperatur ausgesetzt wird.
  • Derartige Polymere sollten vorzugsweise selbst stabil sein und in einem von pH 1 bis pH 10 reichenden Bereich der pH-Bedingungen stabile Hydrogele bilden und bevorzugter unter von wenigstens 3 bis 9 reichenden pH-Bedingungen ohne zusätzliche Schutzüberzüge stabil sein. Die besonderen erwünschten Stabilitätseigenschaften müssen jedoch auf den Ort der geforderten Zufuhr zugeschnitten sein und es kann besondere Gelegenheiten geben, bei denen höhere oder niedrigere Stabilitäten gegenüber einem besonderen pH und einer chemischen oder biologischen Umgebung höchst erwünscht sind. Es können so Situationen vorliegen, bei denen die Anfälligkeit für einen Abbau bei einem gewählten pH oder in Gegenwart eines speziellen hydrolytischen Enzyms oder einem anderen Abbaumittel zum Erzielen eines besonderen Zufuhrprofils nützlich sein kann. Daher muß die Formulierung der Erfindung unter Bedingungen, die sich von denen des Magens zu denen des Zufuhrortes ändern, über einen Zeitraum von wenigstens dem Zweifachen der normalen Transportzeit zur Zufuhrstelle in dem Wirtstier, für das das therapeutische oder bioaktive Material vorgesehen ist, stabil sein.
  • Die Polymeren der Erfindung können vorzugsweise Polymere aus der Gruppe der Homo- und Copolymeren auf der Grundlage verschiedener Kombinationen der folgenden Vinylmonomeren sein: Acryl- und Methacrylsäuren, Acrylamid, Methacrylamid, Hydroxyethylacrylat oder -methacrylat, Vinylpyrrolidone als auch Polyvinylalkohol und seine Co- und Terpolymeren, Polyvinylacetat, seine Co- und Terpolymeren mit den vorstehend aufgeführten Monomeren und 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (AMPS®) und sulfonierte Styrole. Sehr brauchbar sind Copolymere der vorstehend aufgeführten Monomeren mit copolymerisierbaren funktionellen Monomeren wie etwa Acryl- oder Methacrylamidacrylat oder Methacrylatester, bei denen die Estergruppen aus geradem oder verzweigtkettigem Alkyl, Aryl mit bis zu vier aromatischen Ringen, die Alkylsubstituenten mit 1 bis 6 Kohlenstoffen enthalten können;
    Steroide, Sulfate, Phosphate oder kationische Monomere wie etwa N,N-Dimethylaminoalkyl(meth)acrylamid, Dimethylaminoalkyl(meth)acrylat, (Meth)acryloxyalkyltrimethylammoniumchlorid, (Meth)acryloxyalkyldimethylbenzylammoniumchlorid. Weitere brauchbare Polymere sind die als Dextrane und Dextrine klassifizierten und aus der Klasse Materialien, die als natürliche Gummis und Harze klassifiziert sind, oder aus der Klasse der natürlichen Polymeren wie etwa verarbeitetes Kollagen, Chitin, Chitosan, Pullulan, Zooglan, Alginate und modifizierte Alginate wie etwa "Kelcoloid" (ein mit Polypropylenglykol modifiziertes Alginat), Gellangummen wie etwa "Kelocogel", Xanthangummi wie etwa "Keltrol", Estastin, alpha-Hydroxybutyrat und seine Copolymeren, Hyaluronsäure und ihre Derivate, Polymilch- und Glykolsäure und ihre Derivate und dergleichen einschließlich chemisch und physikalisch modifizierter Versionen dieser Polymeren, Gummis und Harze und Gemischen dieser Materialien miteinander oder anderen Polymeren, solange die Änderungen, Modifikationen oder das Mischen die endgültigen Eigenschaften nicht unter das für die Wasserabsorption, Hydrogelbildung und zur brauchbaren Anwendung erforderliche chemische Stabilität festgelegte Mindestmaß fallen läßt. Ferner können Polymere wie etwa Nylon, Acrylan oder andere, normalerweise hydrophobe, synthetische Polymere durch eine Reaktion ausreichend modifiziert werden, um wasserquellbar zu werden und/oder in wäßrigem Medium stabile Gele zu bilden. In einer derartigen modifizierten Form können derartige Polymeren auch zur oralen Zufuhr einiger Proteine annehmbar sein, falls die Formulierungen, für die sie die Matrix sind, den anderen Lehren der Erfindung folgen.
  • Eine sehr nützliche Klasse bei dieser Erfindung anwendbarer Polymere sind die Carbonsäuremonomeren, olefinisch ungesättigte Carbonsäuren, die wenigstens eine aktivierte olefinische Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung und wenigstens eine Carboxygruppe enthalten; das heißt eine Säure oder Funktion, die leicht in eine Säure umgewandelt werden kann, die eine olefinische Doppelbindung enthält, die bei einer Polymerisation wegen ihres Vorliegens in dem Monomermolekül entweder in der Alpha-beta-Stellung bezüglich einer Carboxygruppe, C=C-COOH, oder als Teil einer endständigen Methylengruppe CH2=C< leicht wirksam ist. Olefinisch ungesättigte Säuren dieser Klasse schließen solche Materialien wie die durch die Acrylsäure selbst verkörperten Acrylsäuren, alpha-Cyanacrylsäure, beta-Methylacrylsäure (Crotonsäure), alpha-Phenylacrylsäure, beta-Acryloxypropionsäure, Zimtsäure, p-Chlorzimtsäure, 1-Carboxy-4-phenylbutadien-1,3, Itaconsäure, Citraconsäure, Mesaconsäure, Glutaconsäure, Aconitsäure, Maleinsäure, Fumarsäure und Tricarboxyethylen ein. Hierin verwendet schließt der Ausdruck "Carbonsäure" Polycarbonsäuren und deren Säureanhydride wie etwa Maleinanhydrid ein, wobei die Anhydridgruppe durch die Eliminierung eines Moleküls Wasser aus zwei am selben Carbonsäuremolekül befindlichen Carboxygruppen gebildet wird. Maleinanhydrid und andere hierin brauchbare Säureanhydride weisen die allgemeine Struktur
    Figure 00110001
    auf, worin R und R' aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasserstoff, Halogen und Cyanidgruppen (-C≡N) und Alkyl-, Aryl-, Alkaryl-, Aralkyl- und Cycloalkylgruppen wie etwa Methyl, Ethyl, Propyl, Octyl, Decyl, Phenyl, Tolyl, Xylyl, Benzyl und Cyclohexyl besteht.
  • Die bevorzugten Carbonsäuremonomeren sind die monoolefinischen Acrylsäuren mit der allgemeinen Struktur:
    Figure 00110002
    worin R2 ein Substituent ist, der aus Wasserstoff, Halogen und Cyanidgruppen (-C≡N), einwertigen Alkylresten, einwertigen Arylresten, einwertigen Aralkylresten, einwertigen Alkarylresten und einwertigen cycloaliphatischen Resten ausgewählt ist. Von dieser Klasse sind Acryl- und Methacrylsäure am bevorzugtesten. Andere brauchbare Carbonsäuremonomeren sind Maleinsäure und ihr Anhydrid.
  • Die Polymeren schließen sowohl Homopolymere von Carbonsäuren oder Anhydriden davon als auch die definierten Carbonsäuren ein, die mit einem oder mehr Vinylidenmonomeren copolymerisiert sind, die wenigstens eine endständige >CH2-Gruppe enthalten. Die anderen Vinylidenmonomeren liegen in einer Menge von weniger als 30 Gewichtsprozent bezogen auf das Gewicht der Carbonsäure oder des Anhydrids zuzüglich des (der) Vinylidenmonomers (Vinylidenmonomeren) vor. Derartige Monomeren schließen zum Beispiel Acrylatestermonomere einschließlich der Acrylsäureestermonomeren wie etwa Derivate einer durch die Formel
    Figure 00110003
    dargestellten Acrylsäure, worin R3 eine Alkylgruppe mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 20 Kohlenstoffatomen ist und R2 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist, ein und liegen in dem Copolymer in einer Menge von zum Beispiel etwa 1 bis 40 Gewichtsprozent oder mehr vor. Repräsentative Acrylate schließen Methylacrylat, Ethylacrylat, Propylacrylat, Isopropylacrylat, Butylacrylat, Isobutylacrylat, Methylmethacrylat, Methylethacrylat, Ethylmethacrylat, Octylacrylat, Heptylacrylat, Octylmethacrylat, Isopropylmethacrylat, 2-Ethylhexylmethacrylat, Nonylacrylat, Hexylacrylat, n-Hexylmethacrylat und dergleichen ein. Höhere Alkylacrylester sind Decylacrylat, Isodecylmethacrylat, Laurylacrylat, Stearylacrylat, Behenylacrylat und Melissylacrylat und deren Methacrylatversionen. Gemische aus zwei oder mehr langkettigen Acrylestern können mit einem der Carbonsäuremonomeren erfolgreich polymerisiert werden. Andere Comonomere schließen Olefine einschließlich alpha-Olefine, Vinylether, Vinylester und Gemische davon ein.
  • Andere Vinylidenmonomere einschließlich der Acrylnitrile können ebenfalls verwendet werden. Die brauchbaren α,β-olefinisch ungesättigten Nitrile sind vorzugsweise die monoolefinisch ungesättigten Nitrile mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen wie etwa Acrylnitril und Methacrylnitril. Am bevorzugtesten sind Acrylnitril und Methacrylnitril. Die verwendeten Mengen können schwanken, aber für einige Polymere werden zum Beispiel etwa 1 bis 30 Gewichtsprozent der gesamten Monomeren copolymerisiert. 3 bis 35 Kohlenstoffatome enthaltende Acrylamide einschließlich monoolefinisch ungesättigter Amide können ebenfalls verwendet werden. Repräsentative Amide schließen Acrylamid, Methacrylamid, N-t-Butylacrylamid, N-Cyclohexylacrylamid, höhere Alkylamide, bei denen die Alkylgruppe am Stickstoff 8 bis 32 Kohlenstoffatome enthält, Acrylamide einschließlich N-Alkylolamiden alpha,beta-ungesättigter Carbonsäuren einschließlich der mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen wie etwa N-Methylolacrylamid, N-Propanolacrylamid, N-Methylolmethacrylamid, N-Methylolmaleimid, N-Methylolmaleamidsäureester, N-Methylol-p-vinylbenzamid und dergleichen ein. Noch weitere brauchbare Materialien sind dem Fachmann bekannte 2 bis 18 Kohlenstoffatome, bevorzugter 2 bis 8 Kohlenstoffatome enthaltende alpha-Olefine; 4 bis 10 Kohlenstoffatome enthaltende Diene; Vinylester und Allylester wie etwa Vinylacetat; Vinylaromaten wie etwa Styrol, Methylstyrol und Chlorstyrol; Vinyl- und Allylether und -ketone wie etwa Vinylmethylether und Methylvinylketon; Chloracrylate; Cyanalkylacrylate wie etwa α-Cyanmethylacrylat und die α-, β- und γ-Cyanpropylacrylate; Alkoxyacrylate wie etwa Methoxyethylacrylat; Halogenacrylate wie Chlorethylacrylat; Vinylhalogenide und Vinylchlorid und Vinylidenchlorid; Divinyle, Diacrylate und andere polyfunktionelle Monomeren wie etwa Divinylether; Diethylenglykoldiacrylat, Ethylenglykoldimethacrylat, Methylenbisacrylamid und Allylpentaerythrit und Bis(β-halogenalkyl)alkenylphosphonate wie etwa Bis(β-chlorethyl)vinylphosphonat. Copolymere, bei denen das carboxyhaltige Monomer ein untergeordneter Bestandteil ist und die anderen als Hauptbestandteil vorliegenden Vinylidenmonomeren werden leicht gemäß dem Verfahren dieser Erfindung hergestellt.
  • Am bevorzugtesten setzen sich die Hydrogele der Erfindung aus synthetischen Copolymeren aus der Gruppe der Acryl- und Methacrylsäuren, Acrylamid, Methacrylamid, Hydroxyethylacrylat (HEA) oder -methacrylat (HEMA) und Vinylpyrrolidone zusammen, die mit Wasser in Wechselwirkung treten und quellbar sind. Spezielle Anschauungsbeispiele insbesondere zur Zufuhr von Insulin oder Wachstumshormonen brauchbarer Polymere sind die folgenden Polymertypen:
    (Meth)Acrylamid und 0,1 bis 99 Gew.-% (Meth)Acrylsäure;
    (Meth)Acrylamide und 0,1–75 Gew.-% (Meth)acryloxyethyltrimethylammoniumchlorid;
    (Meth)Acrylamid und 0,1–75 Gew.-% (Meth)Acrylamid;
    Acrylsäure und 0,1–75 Gew.-% Alkyl(meth)acrylate;
    (Meth)Acrylamid und 0,1–75 Gew.-% AMPS® (Warenzeichen der Lubrizol Corp.);
    (Meth)Acrylamid und 0 bis 30 Gew.-% Alkyl(meth)acrylamide und 0,1–75 Gew.-% AMPS®;
    (Meth)Acrylamid und 0,1–99 Gew.-% HEMA;
    (Meth)Acrylamid und 0,1–75 Gew.-% HEMA und 0,1 bis 99% (Meth)Acrylsäure;
    (Meth)Acrylsäure und 0,1–99 Gew.-% HEMA;
    50 Mol% Vinylether und 50 Mol% Maleinanhydrid;
    (Meth)Acrylamid und 0,1 bis 75 Gew.-% (Meth)Acryloxyalkyldimethylbenzylammoniumchlorid;
    (Meth)Acrylamid und 0,1 bis 99 Gew.-% Vinylpyrrolidon;
    (Meth)Acrylamid und 50 Gew.-% Vinylpyrrolidon und 0,1–99,9 Gew.-% (Meth)Acrylsäure;
    (Meth)Acrylsäure und 0,1 bis 75 Gew.-% AMPS® und 0,1–75 Gew.-% Alkyl(meth)acrylamid.
  • Bei den vorstehenden Beispielen bedeutet Alkyl gerades und verzweigtes C1 bis C30, vorzugsweise C1 bis C22, und cyclisches C4 bis C16; wenn (Meth) verwendet wird, bedeutet es, daß die Monomeren mit und ohne die Methylgruppe eingeschlossen sind.
  • Andere sehr brauchbare Polymere sind quellbare, aber unlösliche Arten Poly(vinylpyrrolidon), Stärke, Carboxymethylcellulose und Polyvinylalkohol.
  • Für den vorliegenden Zweck nützliche Polymermaterialien schließen Komplexe aus (Poly)Hydroxyalkyl(meth)acrylat : anionischen und kationischen Hydrogelen : Poly(elektrolyt); Poly(vinylalkohol) mit geringem Restacetat : ein quellbares Gemisch aus vernetztem Agar und vernetzter Carboxymethylcellulose : eine quellbare Zusammensetzung, die mit wenig vernetztem Agar vermischte Methylcellulose umfaßt; ein wasserquellbares Copolymer, das durch eine Dispersion von feinverteiltem Copolymer aus Maleinanhydrid mit Styrol, Ethylen, Propylen oder Isobutylen hergestellt wurde; ein wasserquellbares Polymer aus N-Vinyllactamen und quellbare Natriumsalze von Carboxymethylcellulose ein.
  • Andere gelierbare, Flüssigkeit aufnehmende und zurückhaltende Polymere, die zum Bilden des hydrophilen Hydrogels brauchbar sind, schließen Pektin; Polysaccharide wie etwa Agar, Acacia, Karaya, Tragacanth, Algine und Guar und ihre vernetzten Abarten; Acrylsäurepolymere, -copolymere und ihre Salzderivate, Polyacrylamide; Polymercopolymere und ihre Salzderivate, wasserquellbare Indenmaleinanhydridpolymere; Stärkepfropfcopolymere; Polymere und Copolymere des Acrylattyps mit einem Wasserabsorptionsvermögen von etwa dem 2- bis 400fachen ihres ursprünglichen Gewichts; Polyglucandiester und ein Gemisch aus vernetztem Poly(vinylalkohol) und Poly(N-vinyl-2-pyrrolidon) ein.
  • Polyoxybutylen-Polyethylen-Blockcopolymergele, Carobgummi, Polyestergele, Polyharnstoffgele, Polyethergele, Polyamidgele, Polyimidgele, Polypeptidgele, Polyaminosäuregele, Polycellulosegele, Cyanamer®, vernetztes Inden-Maleinanhydrid-Acrylat-Polymer, Polysaccharide.
  • Repräsentative Polymeren und die Kombinationen von Monomeren, die zum Herstellen synthetischer Hydrogelpolymeren notwendige hydrophile Eigenschaften besitzen, sind dem Fachmann bekannt. Einige repräsentative Beispiele werden bei Scott et al., Handbook of Common Polymers, CRC Press, Cleveland, Ohio (1971), offenbart.
  • Synthetische Hydrogelpolymere können durch eine unbegrenzte Kombination mehrerer Monomeren in mehreren Verhältnissen hergestellt werden. In diesem Fall sind die Eigenschaften der fertigen Hydrogelzusammensetzung dieser Erfindung der Schlüsselparameter. Das Hydrogel kann vernetzt sein und es besitzt die Fähigkeit, Flüssigkeit aufzunehmen und zu absorbieren und es quillt oder expandiert zu einem vergrößerten Gleichgewichtszustand. Das Hydrogel ist eine polymere Zusammensetzung und quillt oder expandiert unter Absorbieren wenigstens des 2- bis 1000fachen seines Gewichts an Wasser. Der bevorzugte Wert der Wasserabsorption für derartige Hydrogele ist das 2- bis 500fache seines Gewichts an Wasser, wogegen der bevorzugteste Bereich der Wasserabsorption das 3- bis 100fache des Gewichts des trockenen Polymers ist. Im allgemeinen muß der optimale Quellbarkeitsgrad für ein gegebenes Hydrogel für verschiedene Therapeutika in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht, Größe, Löslichkeit und der Diffundierbarkeit jedes eingeschlossenen Therapeutikums und dem mit jedem einzelnen Polymer verbundenen spezifischen Abstand und der gegenseitigen Kettenbewegung getrennt bestimmt werden. Bei Insulin, das in dem Acrylamid/Acrylsäure-Copolymer der Erfindung, das wie in Beispiel 2 dargestellt mit Ethylen-N,N'-bis(acrylamid) vernetzt ist, immobilisiert ist, hat das gequollene Polymer das 10-–20fache seines Gewichts an Wasser absorbiert. Das Polymer zeigt die Fähigkeit zum Zurückhalten eines bedeutenden Teils der aufgenommenen Flüssigkeit in der Molekularstruktur des Polymers. Die quellbaren hydrophilen Polymeren sind auch als Osmopolymere bekannt. Das Polymer kann pflanzlichen, tierischen oder synthetischen Ursprungs sein, vorausgesetzt, daß es vernetzt werden kann und der Proteaseinhibitor in einer Weise funktionalisiert werden kann, wo er an das Polymerhydrogel gebunden ist und von dem polymeren Hydrogel durch Waschen nicht abgetrennt werden kann.
  • Die bei dieser Erfindung nützlichen hydrophilen Polymeren sind wasserunlöslich, aber wasserquellbar. Es ist zweckmäßig, derartige wassergequollene Polymeren als Hydrogele oder Gele zu bezeichnen. Derartige Gele können bequem aus wasserlöslichen Polymeren durch ein Verfahren der Vernetzung der Polymeren durch einen geeigneten Vernetzer hergestellt werden. Stabile Hydrogele können jedoch auch aus speziellen Polymeren unter definierten pH-, Temperatur- und/oder Ionenkonzentrationsbedingungen gebildet werden. Bei dieser Erfindung ist es erforderlich, daß ein unter physiologisch brauchbaren Bedingungen stabiles Hydrogel ungeachtet der Mittel, wodurch seine Stabilität erreicht wird, gebildet wird. Vorzugsweise sind die Polymeren vernetzt, das heißt in dem Maß vernetzt, daß die Polymeren gute hydrophile Eigenschaften besitzen, einen (verglichen mit den nicht vernetzten Polymeren desselben oder ähnlichen Typs) guten physikalischen Zusammenhalt aufweisen und eine verbesserte Fähigkeit besitzen, innerhalb des Gelnetzwerks sowohl den Enzyminhibitor als auch das therapeutische Material oder Materialien zurückzuhalten, während die Fähigkeit zum Freisetzen des therapeutischen Materials an einem geeigneten Ort und Zeitpunkt erhalten bleibt.
  • Im allgemeinen sollten die Hydrogelpolymeren mit einem difunktionellen Vernetzer in einer Menge von 0,01 bis 25 Gewichtsprozent bezogen auf das Gewicht der das Copolymer bildenden Monomeren und bevorzugter von 0,1 bis 20 Gewichtsprozent und öfter von 0,1 bis 15 Gewichtsprozent des Vernetzers vernetzt werden. Eine weitere brauchbare Menge eines Vernetzers sind 0,1 bis 10 Gewichtsprozent. Tri-, tetra- oder höher multifunktionelle Vernetzer können ebenfalls eingesetzt werden. Wenn derartige Reagenzien verwendet werden, können niedrigere Mengen zum Erzielen einer entsprechenden Vernetzungsdichte, d. h. des Vernetzungsgrades oder Netzwerkeigenschaften, die zum wirksamen Enthalten des Proteonaseinhibitors ausreichend sind, erforderlich sein.
  • Die Vernetzungen können kovalent, ionisch oder Wasserstoffbindungen sein, wobei das Polymer die Fähigkeit besitzt, in Gegenwart wasserhaltiger Flüssigkeiten zu quellen. Derartige Vernetzer und Vernetzungsreaktionen sind dem Fachmann bekannt und hängen in vielen Fällen vom Polymersystem ab. So kann ein vernetztes Netzwerk durch Freiradikalcopolymerisation ungesättigter Monomeren gebildet werden. Polymere Hydrogele können auch durch Vernetzen vorgebildeter Polymeren durch Umsetzen an den Polymeren angetroffener funktioneller Gruppen wie etwa Alkohole, Säuren, Amine mit solchen Gruppen wie etwa Glyoxal, Formaldehyd oder Glutaraldehyd und Bisanhydride gebildet werden.
  • Die Polymeren können auch mit irgendeinem Polyen, z. B. Decadien oder Trivinylcyclohexan; Acrylamiden wie etwa N,N-Methylen-bis(acrylamid); polyfunktionellen Acrylaten wie etwa Trimethylolpropantriacrylat oder einem polyfunktionellen Vinylidenmonomer, das wenigstens 2 endständige CH2<-Gruppen enthält, einschließlich zum Beispiel Divinylbenzol, Divinylnaphthalin und Allylacrylate, vernetzt werden. Besonders nützliche Vernetzungsmonomere zur Verwendung beim Herstellen der Copolymeren sind Polyalkenylpolyether mit mehr als einer Alkenylethergruppe je Molekül. Die nützlichsten besitzen Alkenylgruppen, bei denen eine olefinische Doppelbindung vorhanden ist, die an eine endständige Methylengruppe CH2=C< gebunden ist. Sie werden durch die Veretherung eines mehrwertigen Alkohols hergestellt, der wenigstens 2 Kohlenstoffatome und wenigstens 2 Hydroxygruppen enthält. Verbindungen dieser Klasse können durch Umsetzen eines Alkenylhalogenids wie etwa Allylchlorid oder Allylbromid mit einer stark alkalischen, wäßrigen Lösung eines oder mehrerer mehrwertiger Alkohole hergestellt werden. Das Produkt kann ein komplexes Gemisch von Polyethern mit einer wechselnden Anzahl Ethergruppen sein. Die Analyse zeigt die durchschnittliche Anzahl Ethergruppen in jedem Molekül. Die Wirksamkeit des Polyethervernetzers erhöht sich mit der Anzahl potentiell polymerisierbarer Gruppen in dem Molekül. Es ist bevorzugt, Polyether zu benützen, die im Durchschnitt zwei oder mehr Alkenylethergruppen je Molekül enthalten. Andere Vernetzungsmonomere schließen zum Beispiel Diallylester, Dimethallylether, Allyl- oder Methallylacrylate und Acrylamide, Tetravinylsilan, Polyalkenylmethane, Diacrylate und Dimethacrylate, Divinylverbindungen wie etwa Divinylbenzol, Polyallylphosphat, Diallyloxyverbindungen und Phosphitester und dergleichen ein. Typische Mittel sind Allylpentaerythrit, Allylsucrose, Trimethylolpropantriacrylat, 1,6-Hexandioldiacrylat, Trimethylolpropandiallylether, Pentaerythrittriacrylat, Tetramethylendimethacrylat, Ethylendiacrylat, Ethylendimethacrylat und Triethylenglykoldimethacrylat ein. Allylpentaerythrit, Trimethylolpropandiallylether und Allylsucrose liefern ausgezeichnete Polymere. Wenn der Vernetzer vorhanden ist, enthalten die polymeren Gemische üblicherweise bis zu etwa 5 Gew.-% Vernetzungsmonomer bezogen auf die Summe des Carbonsäuremonomers zuzüglich anderer Monomeren, falls vorhanden, und bevorzugter etwa 0,01 bis 20 Gewichtsprozent. Ein bevorzugter Vernetzer ist Alkylen-N,N-bis(acrylamid), insbesondere wenn die Alkylengruppe Methylen oder Ethylen ist.
  • Ein kritischer, wichtiger Bestandteil in der Zusammensetzung dieser Erfindung ist ein Enzyminhibitor. Es ist allgemein bekannt, daß Verdauungsenzyme, die sich im Verdauungstrakt, insbesondere im Dünndarm finden, Proteine und Peptide ziemlich schnell zersetzen. Selbst wenn so ein therapeutisch aktives Protein oder Peptid in einer Schutzkapsel oder Tablette eingeschlossen ist, die unbeeinflußt durch den Magen geht und im Darm unter Freisetzen des therapeutisch aktiven Bestandteils zerfällt, unterliegt das Therapeutikum, sobald es freigesetzt ist, sofort einer zersetzenden Wirkung von (typischerweise proteolytischen) Verdauungsenzymen. Das Ergebnis ist, daß nach einem verhältnismäßig kurzen Zeitraum, wie etwa nur 30 Minuten, von dem therapeutischen Bestandteil wenig im Darm übrig bleibt. Es ist genau dieser Vorgang, durch den ein Protein zu Bestandteilen niedrigeren Molekulargewichts verdaut und zersetzt wird, die die Nahrung liefern. Der in die Zusammensetzung dieser Erfindung aufgenommene, gebundene Inhibitor proteolytischer Enzyme hilft das therapeutisch aktive Protein oder Peptid vor der Wirkung des proteolytischen Enzyms zu schützen und erhöht die Wahrscheinlichkeit, daß ein Therapeutikum durch die Darmschleimhaut absorbiert wird. Es ist zumindest teilweise auf die Wirkung proteolytischer Enzyme zurückzuführen, daß wenn ein Protein oder Peptid durch den Magen dem Darm zugeführt wird, es verhältnismäßig schnell verdaut wird und daher nicht wirkungsvoll in den Blutstrom absorbiert werden kann.
  • Jeder Inhibitor, der die Aktivität proteolytischer Enzyme hemmt, kann in der Zusammensetzung und dem Zufuhrsystem für Proteine und Peptide brauchbar eingesetzt werden. Nützliche Inhibitoren schließen Sojabohnen-Trypsininhibitor, Pankreas-Trypsininhibitor, Chymotrypsininhibitor und aus Kartoffelknollen (Solanum tuberosum L.) isolierten Trypsin- und Chymotrypsininhibitor ein (siehe "Isolation and characterization of a novel trypsin and chymotrypsin inhibitor from potato tubers", Revina, T. A., Valueva, T. A., Ermolova, N. V., Kladnitskaya, G. V., Mosolov, V. V., A. N. Bakh Inst. Biochem., Russian Academy Sci., Moskau, 117071, Russland. Biokhimiya (Moskau) (1995), 60 (11), 1844–52. CODEN: BIOHAO; ISSN: 0320-9725. Die Zeitschrift ist in Russisch geschrieben. CAN 124: 49041). Es können eine Kombination oder Gemische von Inhibitoren eingesetzt werden.
  • Der bevorzugteste und wünschenswerteste Inhibitor der proteolytischen Enzyme ist ein Ovomucoidenzym, das aus Enteneiweiß oder Puteneiweiß (Hühnereier oder Eier anderen Geflügels) isoliert werden kann (s. UdSSR-Erfinderschein N 1404513, IPC C07K3/02. B. I. I 23 1988) oder das auf herkömmlichen Biosynthese-, Trennungs- und Reinigungswegen, gentechnisch oder andere geeignete Verfahrensweisen erhalten werden kann, die es gestatten, das Enzym zu isolieren, sammeln und reinigen. Der bevorzugteste Inhibitor ist das aus Enteneiweiß isolierte Ovomucoidenzym. Andere Inhibitoren und Hydrogel funktionalisierende Mittel können zum Schützen von Enzymen vor anderen Abbaumechanismen in Abhängigkeit von dem speziellen verwendeten Protein, seiner Anfälligkeit für einen Abbau unter besonderen Bedingungen und der Zielschranke für einen Übergang in das Kreislaufsystem geeignet sein.
  • Das Schützen eines bioaktiven Proteins vor der Wirkung der proteolytischen Enzyme durch die Verwendung geeigneter Inhibitoren ist ein kritischer, wichtiger Faktor dieser Erfindung. Die brauchbaren Inhibitoren sollten eine Zuckerstruktureinheit (Glykosid) enthalten und wenn diese einem Inhibitor fehlt, können derartige Struktureinheiten durch ihr kovalentes Binden an das Hydrogelpolymer oder durch ein Verknüpfungsmittel wie den Inhibitor selbst eingeführt werden. Es ist wichtig, daß das Schutzmittel in der Struktur des Hydrogels zurückgehalten wird. Daher umfaßt ein kritischer Aspekt der Erfindung das Binden des Inhibitors an das Hydrogel durch chemische Mittel. Dieser Effekt wird in den nachfolgenden Beispielen veranschaulicht. Der Inhibitor kann auch durch ein ausreichendes physikalisches Einschließen in die Polymermatrix immobilisiert werden. Selbst dies würde jedoch nicht zu einem tatsächlich erfolgreichen und wirkungsvollen Zufuhrsystem führen. Es ist weiter notwendig, die Assoziation des protein- oder peptidhaltigen Polymerhydrogels mit ausgewählten Transportschranken des Darms und/oder Eingeweide zu erhöhen, um den Zugang und Transport der therapeutischen Substanzen durch die Sperren und in das Kreislaufsystem zu erleichtern. Dies kann durch Einbauen eines funktionellen Mittels wie etwa ein Glykosid, ein zuckerhaltiges Molekül oder ein Bindemittel wie etwa Lectinbindemittel, das aber nicht darauf beschränkt ist und von dem bekannt ist, daß es mit der gewünschten Darmtransportschranke in Wechselwirkung tritt, bewerkstelligt werden. Es ist erneut notwendig, daß dieses assoziative Mittel oder die Funktionalität an das Hydrogel gebunden ist. Auf diese Weise bindet das Hydrogel vorzugsweise selbst an die Darmwände und erleichtert den Durchgang des therapeutischen Proteins oder Peptids in das Kreislaufsystem. Falls das assoziative Mittel nicht gebunden ist, kann es leicht von der Formulierung wegdiffundieren und seine Wirkung geht verloren. Diese Wirkung wird auch in den nachfolgenden Beispielen veranschaulicht.
  • Die funktionellen Mittel wie etwa Glykoside können chemisch in das polymere Hydrogel eingearbeitet werden. Beispiele derartiger Glykoside sind Glucoside, Fructoside, Galactoside, Arabinoside, Mannoside und ihre alkylsubstituierten Derivate und natürliche Glykoside wie etwa Arbutin, Phlorizin, Amygdalin, Digitonin, Saponin und Indican. Es gibt mehrere Wege, auf die ein typisches Glykosid an ein Polymer gebunden sein kann. Der Wasserstoff der Hydroxygruppen eines Glykosids oder anderen ähnlichen Kohlenhydrats kann zum Beispiel unter Bilden eines Ethers durch die Alkylgruppe aus dem Hydrogel ersetzt werden. Ferner können die Hydroxygruppen der Glykoside unter Verestern der Carboxygruppen des polymeren Hydrogels unter Bilden polymerer Ester in situ umgesetzt werden. Ein weiterer Weg wäre das Einsetzen einer Kondensation von Acetobromglucose mit Cholest-5-en-3.beta.-ol an einem Maleinsäurecopolymer. N-Substituierte Polyacrylamide können durch die Reaktion aktivierter Polymeren mit omega-Aminoalkylglykosiden synthetisiert werden: (1) (Kohlenhydrat-Abstandsgruppe)(n)-Polyacrylamid, "Pseudopolysaccharide"; (2) (Kohlenhydrat Abstandsgruppe)(n)-Phosphatidylethanolamin(m)-Polyacrylamid, Neoglykolipide, Phosphatidylethanolaminderivate; (3) (Kohlenhydrat-Abstandsgruppe)(n)-Biotin(m)-Polyacrylamid. Diese biotinylierten Derivate können an Lectine auf der Darmwand binden und die Absorption eingeschlossener Proteine und Peptide erleichtern.
  • Glykoproteine mit N,N'-Diacetylchitobiose und N-Acetyllactosamin können auf der Grundlage einer Radikalcopolymerisation n-pentenylierter Derivate mit Acrylamiden synthetisiert werden (siehe Macromolecules (1991), 24 (15), 4236–51, und On Tai Leung et al., New J. Chem. (1994), 18 (3), 349–63).
  • Es ist möglich und tatsächlich am bevorzugtesten, daß der Inhibitor des proteolytischen Enzyms auch das assoziative Bindemittel enthält. Aus diesem Grund ist Ovomucoid, das ein spezielles Beispiel einer Klasse Glykoproteine ist, der bevorzugteste Inhibitor eines proteolytischen Enzyms. Es weist ein Molekulargewicht von etwa 31000 auf. Die Aminosäurezusammensetzung des Proteinteils von Ovomucoid ist in Tabelle 1 angegeben. Ein Ovomucoidmolekül umfaßt 12,5 Gew.-% Glucosamin und 7,8 Gew.-% andere Zucker. Es ist bekannt, daß die Zotten und andere Strukturen der Darmschleimhaut Lectin (Zucker) tragende Rezeptoren enthalten. Somit ist die Anwesenheit an die Gelmatrix gebundener, lectinartiger Gruppen ein nützlicher Aspekt der Erfindung. Obschon das Gelmaterial getrennt funktionalisiert werden kann, um eine lectinartige Funktionalität und einen Proteininhibitor zu enthalten, verkörpert ein Ovomucoidmolekül beide Funktionalitäten und ergibt wie aus den Beispielen zu ersehen ist eine optimale Verstärkung der Zufuhr des enthaltenen Insulins. Von den verschiedenen Ovomucoiden, die benützt werden können, enthält Ovomucoid aus Enteneiern 3 aktive Zentren, die eine breite Vielfalt Enzyme binden können. Es ist das bevorzugteste Ovomucoid, aus Hühner- und Puteneiern stammendes Ovomucoid weist weniger Bindungszentren auf. Wenn ein Lectin enthaltender Enzyminhibitor zur Insulinzufuhr verwendet wird, ist es bevorzugt, daß bei dem Schutzenzyminhibitor der Zuckergehalt mindestens 3% ist, obschon ein niedrigerer Gehalt für einige Anwendungen und die Zufuhr einiger Therapeutika unter gewissen Umständen annehmbar sein kann. Es ist ein wichtiger Aspekt der Erfindung, daß der Enzyminhibitor, sei es Ovomucoid oder irgendein anderes Glykoprotein, daß einer ähnlichen Funktion dient, sowohl eine interaktive Funktionalität für die Zieltransportschranke als auch die chemischen und konformativen Merkmale enthält, die zum Schützen des therapeutischen Proteins notwendig sind, mit dem es innig vermischt und/oder in dem Hydrogel assoziiert ist. Es wird ferner gelehrt und ist ein wichtiger Aspekt der Erfindung, daß die Bindungsfunktionalität, sei es ein Lectinbindemittel oder irgendein anderes Mittel, getrennt in das Polymer aus dem Hydrogel eingebaut und funktionalisiert ist, wobei der schützende Enzyminhibitor dann an das polymere Matrixmaterial getrennt gebunden oder immobilisiert ist.
  • Die Menge des Initiators, das heißt des Inhibitors eines proteolytischen Enzyms, der auch ein Lectinbindemittel enthält, die in die Zusammensetzung dieser Erfindung aufgenommen werden muß, schwankt in Abhängigkeit von (a) dem speziellen Inhibitor (z. B. der Ovomucoidquelle wie etwa aus Enteneiern, Puteneiern, Hühnereiern oder Eiern anderen Geflügels oder aus Kartoffelknollen), (b) der Anzahl in dem Molekül vorhandener funktioneller Gruppen, die zum Einführen einer zur Copolymerisation mit den ein Hydrogel bildenden Monomeren notwendigen ethylenischen Ungesättigtheit umgesetzt werden können, und (c) der Anzahl der Lectingruppen wie etwa Glykoside, die in dem Inhibitormolekül vorhanden sind. Sie kann auch von dem speziellen therapeutischen Protein abhängen, das in das Kreislaufsystem eingeführt werden soll. Allgemein gesagt sollte die Menge zum Liefern der gewünschten, ein proteolytisches Enzym hemmenden Funktion (Schutz des Therapeutikums) und der gewünschten Bindungswirkung mit den Darmrezeptoren ausreichend sein. Es kann notwendig sein, einige Routinetests auszuführen, um die optimale Menge zu bestimmen, aber dies ist für den Fachmann offensichtlich.
  • Eine brauchbare Menge eines Ovomucoids beträgt von 0,1 mg je ml Gel bis 50 mg je ml Gel und vorzugsweise von 0,2 mg je ml Gel bis 25 mg je ml Gel. Der vorstehende bevorzugte Bereich ist insbesondere anwendbar, wenn aus Enteneiern isoliertes Ovomucoid verwendet wird. Die Verwendung von Ovomucoid in einer größeren Menge als 25 mg je ml Gel verursacht jedoch keinen besonderen Schaden und kann eine größere Lagerdauer oder Langzeitstabilität der vorformulierten Materialien liefern. Außerdem können größere Ovomucoidkonzentrationen zusätzliche Vorteile in Form einer Langzeitfreisetzung einiger Materialien liefern.
  • Wenn die Inhibitorfunktion und die Bindungswirkungsfunktion getrennt in das Polymerhydrogel eingebaut oder daran gebunden sind (d. h. sie sind nicht Teil desselben Moleküls wie im Fall eines Ovomucoids), wird die Menge jedes Bestandteils, der an das Polymer gebunden werden muß, auf ähnliche Weise wie vorstehend beschrieben bestimmt.
  • Ovomucoid ist repräsentativ und der wichtigste Inhibitor eines proteolytischen Enzyms der Erfindung. Aus Enteneiweiß isoliertes Ovomucoid ist ein Glykoprotein, das 12,5% Glucosamin (21,6 Mol je Mol Protein) und 7,8% andere Zucker enthält, die eine Reaktion mit Phenolschwefelsäure geben.
  • Die durch das Lichtstreuverfahren bestimmte Molmasse des Ovomucoids ist 30900 ± 400, nahe bei den aus der Aminosäureanalyse und Kohlenhydratzusammensetzung berechneten (31 500) und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat und β-Mercaptoethanol (30500 ± 1000) bestimmten Werten. Seine Zusammensetzung ist in Tabelle 1 angegeben. TABELLE 1 AMINOSÄUREGEHALT VON OVOMUCOID AUS ENTENEIWEISS
    AMINOSÄURE RESTE JE MOLEKÜL
    Asp 30.14(30)
    Thr 17.98(18)
    Ser 12.98(13)
    Glu 23.63(24)
    Pro 10.24(10)
    Gly 19.75(20)
    Ala 10.45(10)
    ½Cys 13.56(14)
    Val 14.77(15)
    Met 6.32(6)
    Ile 3.59(2)
    Leu 12.76(13)
    Tyr 9.53(10)
    Phe 5.00(5)
    Lys 16.36(16)
    His 4.23(4)
    Arg 1.95(2)
    Trp 0
    Summe (212)
    M, Reste 25,178.0
  • Damit die Zusammensetzung dieser Erfindung als orales Zufuhrsystem für die therapeutischen Proteine und Peptide wirksam ist, ist es notwendig, die Zusammensetzung auf einem besonderen Weg herzustellen und die notwendigen Bestandteile nicht einfach zusammenzumischen. Wie vorstehend angemerkt ist eine wichtige Funktion des Inhibitors eines proteolytischen Enzyms, das Schützen des Proteins oder des Peptids vor der Zersetzung durch das Enzym. Von Ovomucoid ist bekannt, daß es ein Proteolyseinhibitor ist, falls aber ein Protein und Ovomucoid einfach zusammengemischt werden und zum Beispiel in Wasser gegeben werden, diffundieren beide und das Ovomucoid ist nicht in der Lage, das Protein vor dem Abbau zu schützen. Derartige Formulierungen sind nicht als interaktives Zufuhrsystem zum Zuführen eines Therapeutikums über die Darmschranke brauchbar. Somit ist ein wichtiger Aspekt dieser Erfindung die spezifische Kombination des Inhibitors eines proteolytischen Enzyms und eines Bindemittels mit einem polymeren Hydrogel. Dies wird durch das chemische Modifizieren des Polymerhydrogels mit einem Material bewerkstelligt, das sowohl einen proteolytischen Inhibitor als auch ein Bindemittel (z. B. Ovomucoid) enthält, das den Inhibitor und das Bindemittel immobilisiert, indem es sie zum Teil des vernetzten Polymernetzwerks macht. Es ist ferner möglich, das Gel getrennt mit einem interaktiven Mittel wie etwa einem glykosidhaltigen Molekül und einem Inhibitor eines proteolytischen Enzyms, der kein Glykosid enthält, chemisch zu modifizieren.
  • Allgemein gesagt wird zuerst der Inhibitor funktionalisiert, das heißt eine geeignete reaktionsfähige Gruppe wird an den Inhibitor chemisch angefügt, sehr häufig wird eine ethylenisch polymerisierbare Gruppe angefügt und der funktionalisierte Inhibitor wird anschließend mit Monomeren und einem Vernetzer durch Anwenden eines Standardpolymerisationsverfahrens wie etwa eine Lösungspolymerisation (üblicherweise in Wasser), Emulsions-, Suspensions- oder Dispersionspolymerisation copolymerisiert. Genauer sollte das Funktionalisierungsmittel eine genügend hohe Konzentration funktioneller oder polymerisierbarer Gruppen aufweisen, um sicherzustellen, daß mehrere Stellen auf dem Inhibitor funktionalisiert sind. Im Ovomucoid gibt es zum Beispiel dreizehn Aminstellen, die funktionalisiert werden können und es ist bei dieser Erfindung bevorzugt, daß wenigstens fünf derartige Stellen funktionalisiert sind. Nach der Funktionalisierung wird der funktionalisierte Inhibitor mit den Monomeren und einem Vernetzer gemischt, der die Reagenzien umfaßt, aus denen das Polymergel gebildet wird. In diesem Medium wird anschließend eine Polymerisation ausgelöst, um ein den gebundenen Inhibitor enthaltendes polymeres Gel zu erzeugen. Das Gel wird anschließend mit Wasser oder anderen geeigneten Lösungsmitteln gewaschen und auf andere Weise gereinigt, um Spuren unumgesetzter Verunreinigungen zu entfernen und nötigenfalls durch physikalische Mittel wie etwa Rühren, Treiben durch ein Sieb, Ultrabeschallung oder andere geeignete Mittel auf die bevorzugte Teilchengröße gemahlen oder getrennt. Das Lösungsmittel, üblicherweise Wasser, wird anschließend auf eine solche Weise entfernt, daß der Inhibitor nicht denaturiert wird. Das bevorzugte Verfahren ist die Lyophilisierung (Gefriertrocknen), aber andere Verfahren stehen zur Verfügung und können verwendet werden (z. B. Vakuumtrocknen, Lufttrocknen, Sprühtrocknen usw.). Eine genauere Beschreibung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wird in Beispiel 3 gegeben.
  • Beim Funktionalisieren des Inhibitorproteins ist der Zweck das Einführen einer funktionellen Gruppe auf die Oberfläche des Inhibitorproteins, die nachfolgend bei einer Polymerisation reagieren kann oder auf andere Weise das Inhibitorprotein an das Hydrogel kuppeln kann. Als Beispiele des Einführens polymerisierbarer Gruppen kann man aus dem Proteininhibitor verfügbare Amino-, Hydroxy- und Thiolgruppen mit ungesättigte Gruppen enthaltenden Elektrophilen umsetzen. Zum Beispiel gehören ungesättigte Monomeren, die N-Hydroxysuccinimidylgruppen, aktive Carbonate wie etwa p-Nitrophenylcarbonat, Trichlorphenylcarbonate, Tresylat, Oxycarbonylimidazole, Epoxid, Isocyanate und einen Aldehyd enthalten und ungesättigte Carboxymethylazide und ungesättigtes o-Pyridyldisulfid dieser Reagenzienkategorie an. Anschauungsbeispiele ungesättigter Reagenzien sind Allylglycidylether, Allylchlorid, Allylbromid, Allyliodid, Acryloylchlorid, Allylisocyanat, Allylsulfonylchlorid, Maleinanhydrid, Copolymere von Maleinanhydrid und Allylether.
  • Alle lysinaktiven Derivate außer Aldehyd können im allgemeinen mit anderen Aminosäuren wie etwa Imidazolgruppen von Histidin und Hydroxygruppen von Tyrosin und den Thiolgruppen von Cystin reagieren, wenn die örtliche Umgebung die Nukleophilie dieser Gruppen verstärkt. Aldehydhaltige Funktionalisierungsreagenzien sind gegenüber Lysin spezifisch. Diese Typen von Reaktionen mit verfügbaren Gruppen aus Lysinen, Cystinen und Tyrosin sind in der Literatur ausgiebig dokumentiert und dem Fachmann bekannt.
  • Im Fall von Ovomucoid, das Amingruppen enthält, ist es bequem, derartige Gruppen mit einem Acyloylchlorid wie etwa Acryloylchlorid umzusetzen und die polymerisierbare Acrylgruppe in das Ovomucoid einzuführen. Anschließend wird das funktionalisierte Ovomucoid bei der Herstellung des polymeren Hydrogels wie etwa während des Vernetzens des Copolymers aus Acrylamid und Acrylsäure über die Acrylgruppen an dem Polymer angebracht und wird daran gebunden.
  • Die therapeutischen Bestandteile, die unter Einsetzen des Zufuhrsystems und der Zusammensetzungen dieser Erfindung oral verabreicht werden können, sind Proteine und Peptide einschließlich Monopeptiden, Dipeptiden, Tripeptiden und Polypeptiden. Ferner können Proteine oral verabreicht werden, die modifiziert wurden, um als Träger für biologisch aktive Materialien einschließlich Antisense-Oligonukleotiden, Genen und Virusvektor-Wirkstoffträgern und viele herkömmliche organische Verbindungen niedriger Stabilität, Löslichkeit und folglich niedriger oraler Bioverfügbarkeit wirksam zu sein.
  • Anschauungsbeispiele therapeutischer Proteine sind Nucleoprotein, Glykoprotein, Lipoprotein, Immuntherapeutika, Schweinesomatotropin zum Erhöhen des Wirkungsgrads der Futterverwertung beim Schwein, Wachstumshormon, Buserelin, Leuprolid, Interfe ron, Gonadorelin, Olamin, Calcitonin und andere bioaktive Proteine und rekombinante Proteinprodukte.
  • Anschauungsbeispiele von Peptiden sind Cyclosporin, Lisinopril, Captopril, Delapril, Cimetidin, Ranitidin, Famotidin (Pepcid), Gewebeplasminogenaktivator, Epidermiswachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor (sauer oder basisch), aus Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor, transformierender Wachstumsfaktor (alpha oder beta), vasoaktives Darmpeptid, Tumornekrosefaktor, Hormone wie etwa Glucagon, Calcitonin, adrecosticotrophes Hormon, Aldoetecon, follikelstimulierendes Hormon, Enkephaline, β-Endorphin, Somatostin, Gonadotrophin, α-melanozytenstimulierendes Hormon. Weitere Beispiele sind Bombesin, atrial natriuretische Peptide Peptide und Luteinisierungshormon freisetzendes Hormon (LHRH), Substanz P, Vasopressin, α-Globuline, Transferrin, Fibrinogen, β-Lipoproteine, β-Globuline, Prothrombin (Rind), Ceruloplasmin, α2-Glykoproteine, α2-Globuline, Fetuin (Rind), α1-Lipoproteine, α1-Globuline, Albumin und Präalbumin.
  • Die Wachstumshormone, die mittels der Erfindung oral zugeführt werden können, können im Handel erhältliches humanes Wachstumshormon, Rinderwachstumshormon, Schweinewachstumshormon oder andere repräsentative tierische Wachstumshormone sein, die aus natürlichen Quellen extrahiert wurden oder gentechnisch und durch verwandte Fermentationsherstellungsverfahren, die alle wohlbekannt und auf dem Gebiet der Protein- und Peptidherstellung beschrieben sind, hergestellt wurden.
  • Proteine, die durch Einsetzen der Zusammensetzung dieser Erfindung oral verabreicht werden können, sollten von einem kleineren Molekulargewicht als 1000000 Dalton und vorzugsweise weniger als 200000 sein. Üblicherweise ist das Molekulargewicht der Proteine weniger als 65000 und oft unter 32500 und insbesondere weniger als 10000 Dalton. Üblicherweise weisen sie ein Molekulargewicht von wenigstens 300 Dalton auf.
  • Die Zusammensetzung dieser Erfindung, das heißt eine an die orale Verabreichung anderer Proteine oder Peptide als Insulin angepaßte Zusammensetzung, die ein polymeres Hydrogel umfaßt, das vorzugsweise vernetzt wurde und das durch einen Inhibitor eines proteolytischen Enzyms und ein Bindemittel modifiziert wurde und ein Protein oder ein Peptid enthält, kann in Gelform verabreicht werden. Im allgemeinen kann an einen Menschen oder ein Tier jede gewünschte Dosis verabreicht werden. Die tatsächlich zugeführte Dosis kann auf der Grundlage der Menge des in einer Gewichts- oder Volumeneinheit des Gels enthaltenen biologisch aktiven therapeutischen Materials berechnet werden. Wenn jedoch ein Gel, das ein ungebundenes Therapeutikum enthält, in den Magen eingeführt wird, der kein freies Therapeutikum enthält, dann besteht eine kinetische Triebkraft, die zu einem raschen Verlust des Therapeutikums aus dem Gel führen muß. Zum Beispiel verliert Insulin enthaltendes Hydrogel, das sich in pH-eingestellter Kochsalzlösung befindet, in 15 Minuten 90% des enthaltenen Insulins. Solange nicht ein rasches und reproduzierbares Ablassen des Mageninhalts in den Darm sichergestellt werden kann, werden von einem Patient zum anderen und von einer Verabreichung zur nächsten schwankende und unzuverlässige Dosen zugeführt, was es schwierig macht, kontrollierbare therapeutische und biologische Wirkungen sicherzustellen.
  • Es ist daher bequemer und bevorzugt, die ein Therapeutikum enthaltende Zusammensetzung dieser Erfindung in Tablettenform oder Gelkapseln wie in der Technik wohlbekannt zu verabreichen. Wenn die Tablette oder Gelkapsel in dieser Form verabreicht wird, ist sie vorzugsweise magensaftresistent beschichtet. Die magensaftresistente Beschichtung stellt sicher, daß die therapeutikumhaltige Zusammensetzung in den Darmtrakt übergeht, ohne im Magen bedeutsam beeinflußt oder teilweise abgebaut zu werden, ungeachtet des zeitlichen Profils der Zufuhr an den Darm. Im Darmtrakt löst sich die Beschichtung auf und die Zusammensetzung ist wie vorstehend beschrieben wirksam.
  • Bei der vorliegenden Erfindung brauchbare magensaftresistente Beschichtungsmaterialien schließen die Beschichtungsmaterialien ein, die gegenüber einem Abbau im Magen beständig sind, sich aber in der Umgebung des Darmtrakts zersetzen und das beschichtete Material freilegen. Derartige magensaftresistente Materialien schließen die folgenden Bestandteile entweder einzeln oder in Kombination ein:
    Hydroxypropylmethylcellulosephthalat, Polyethylenglykol 6000 und Schellack und sie können in Lösungsmitteln einschließlich Dichlormethan, Ethanol und Wasser, Cellulosephthalat oder Polyvinylacetatphthalat gelöst sein.
  • Ein brauchbares magensaftresistentes Beschichtungsmaterial zum Beschichten von Insulin umfaßt 4,5 Gewichtsteile Hydroxymethylcellulose auf 0,5 Teile Schellack auf 0,5 Teile Polyethylenglykol 6000. Dieses Material wird in 47,3 Teilen Dichlormethan und 37,8 Teilen Ethanol gelöst. Das magensaftresistente Beschichtungsmaterial wird anschließend mit Wasser auf eine optimale Konzentration verdünnt und auf die Zusammensetzungen der Erfindung angewandt.
  • Viele andere für pharmazeutische Zubereitungen brauchbare Beschichtungsmaterialien sind wohlbekannt und in der Industrie verfügbar. Sie schließen wie im US-Patent 5 175 285 offenbarte Umwandlungsprodukte von Polysuccinimid, Acrylpolymere wie die aus Niederalkylestern von Acryl- und Methacrylsäure abgeleiteten, die mit anderen copolymerisierbaren Monomeren, wie etwa die Carboxy- oder quaternäre Ammoniumgruppen enthaltenden, und/oder wie im US-Patent 5 422 121 und US-Patent 4 644 031 beschrieben mit Acryl- oder Methacrylsäure copolymerisiert sein können.
  • Andere wohlbekannte Bestandteile können ebenfalls eingearbeitet sein. Beispiele sind Bindematerialien wie etwa verschiedene Typen Cellulose und ihre Derivate, Providon und Polyethylenglykolfettsäureestergruppen; Füllstoffe wie etwa Gummiarabicum, kristalline Cellulose, Hydroxypropylcellulose und Hydroxypropylmethylcellulose; Tensidmaterialien wie etwa kationische, anionische oder nichtionische Tenside, die durch Natriumlaurylsulfat, Stearylamin, Polyglycerinfettsäureester und viele andere Fettsäuren und Fettsäureester veranschaulicht werden und Emulgatoren wie etwa Cholesterin, Stearin-, Palmitin- und Ölsäure und ihre Natriumsalze, Salicylsäuren, Salze oder Ester, verschiedene Stearate und Polysorbate (20, 40, 60, 80), Propylenglykoldiacetat und antimikrobielle Mittel wie etwa Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Phenol, Dehydroacetsäure, Phenylethylalkohol, Natriumbenzoat, Sorbinsäure, Thymol, Thimerosal, Natriumdehydroacetat, Benzylalkohol, Butylparaben, Kresol, p-Chlor-m-kresol, Chlorbutanol, Phenylquecksilberacetat, Phenylquecksilberborat, Phenylquecksilbernitrat und Benzalkoniumchlorid.
  • Die Erfindung wird unter Bezug auf die folgenden Beispiele weiter verstanden und veranschaulicht.
  • Beispiel 1
  • Isolierung von Ovomucoid
  • Einem mit einem Rührer versehenen Kolben wurden 100 g Eiweiß zugefügt. Als nächstes wurde dem Kolben ein 70 g Ethylalkohol und 30 g einer 2,7 g Trichloressigsäure und 27,3 g destilliertes Wasser umfassenden Lösung umfassendes Gemisch mit einer Geschwindigkeit von 3 bis 5 ml/min unter Rühren zugefügt. Nach der Zugabe der gesamten Menge des angegeben Gemisches wurde die Reaktionsmasse bei einer Temperatur, die von 15 bis 25°C reichen kann, 40 min weiter gerührt. Der Niederschlag wurde filtriert und von der restlichen Lösung entfernt. Dieser Niederschlag wurde verworfen, da er keinen weiteren Wert besaß. Das Filtrat aus diesem Schritt wurde anschließend in einen zweiten Kolben überführt und mit 550 g Ethylalkohol gemischt. Der Niederschlag aus diesem letzten Schritt wurde anschließend unter Verwenden von destilliertem Wasser dialysiert und anschließend durch Lyophilisierung getrocknet. Die Ausbeute aus diesem Verfahren war etwa 0,8 g Ovomucoid.
  • Das vorstehende Verfahren ist für das Isolieren von Ovomucoid aus Enteneiern spezifisch. Dasselbe Verfahren kann jedoch zum Erhalten von Ovomucoid aus anderen Quellen unter Verwenden des Eiweißes anderen Geflügels oder anderer Protein und Glykoprotein enthaltender Quellen durch Ersetzen der im vorstehenden Schritt eins verwendeten 100 g Eiweiß verwendet werden. In Abhängigkeit von dem Quellenmaterial und Veränderlichkeit des Ovomucoids in dem Quellenmaterial kann mehr oder weniger Ovomucoid erhalten werden. Außerdem können die Extraktions- und Fällungsbedingungen bei der Temperatur und Zeit geändert werden und die Mengen und Typen Lösungsmittel können ebenfalls zum Optimieren der Extraktion von Ovomucoid aus unterschiedlichem Material verändert werden.
  • Beispiel 2
  • Funktionalisierung von Ovomucoid
  • In einem 20-ml-Becherglas wurden 10 ml NaHCO3-Pufferlösung bei pH 8 gerührt. Isoliertes Ovomucoid (100 mg) wurde zugefügt und unter Rühren gelöst. Dieser Lösung wurde bei Raumtemperatur Acryloylchlorid (10 μl) zugefügt und gerührt, bis die Reaktion abgeschlossen war.
  • Beispiel 3
  • Polymerherstellung
  • Der in Beispiel 2 erhaltenen Lösung wurde Acrylamid (1 g) [wenn eine kommerzielle Acrylamidqualität verwendet wird, enthält es bis etwa 1,5% Acrylsäure] und N,N-Methylenbis(acrylamid) (0,1 g) zugefügt. Dieser Lösung wurden zum Starten der Polymerisation 10 mg (NH4)2S2O8 und 10 μl TMEDA (Tetramethylethylendiamin) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde gerührt, um ein gutes Mischen sicherzustellen, aber unmittelbar vor dem Trübungspunkt der Polymerisation angehalten. Das sich daraus ergebende Gel wurde durch ein Nylonsieb gesiebt. Die Teilchen wurden mit NaHCO3-Pufferlösung gewaschen und anschließend bis zur Trockene lyophilisiert.
  • Beispiel 4 (Referenz)
  • Allgemeines Verfahren zum Herstellen einer oral aktiven Insulinzusammensetzung
  • Für Insulintherapeutika wird eine repräsentative Zusammensetzung auf die folgende Weise hergestellt: 0,01–1,0 g vorgetrocknetes, 4,5% vernetztes Polymer, das mit 0,2–25 mg Sojabohnen-Trypsininhibitor je ml gequollenes Gel modifiziert war, und 0,2–25 mg eines Glykosids je ml gequollenes Gel werden 1 Stunde bei Raumtemperatur in 0,3–3,0 ml Insulinlösung (bequemerweise in gepufferter Kochsalzlösung) gegeben, wobei das Insulin eine Konzentration von 0,01 bis 3 mg/ml Flüssigkeit hat (die Insulinaktivität kann von 0,25–100 IE/ml reichen). Während dieser Zeit quillt das Polymer vollständig, wobei es die insulinhaltige Lösung aufnimmt und ein Gleichgewicht erreicht und gebrauchsfertig ist. Diese Verfahrensweise zur Herstellung ist nicht auf die spezielle angegebene Zeit beschränkt und kann in Abhängigkeit von einer Anzahl Veränderlichen wie etwa der Vernetzungsdichte des Polymers und der Temperatur, unter der das Aussetzen des Hydrogels durchgeführt wird, über einen Zeit- und Temperaturbereich vernünftig verändert werden. Das Polymer kann auch größeren oder kleineren Werten der Insulinkonzentration und/oder Flüssigkeitsmengen ausgesetzt werden und selbstverständlich kann die Gesamtmenge des verarbeiteten Materials durch Verändern der bei dem Verfahren verwendeten Menge insulinhaltige Lösung und Hydrogel erhöht oder erniedrigt werden.
  • Es folgen die bei den folgenden Beispielen und den in den Tabellen 2 bis 5 mitgeteilten Tabellen verwendeten Polymeren. Diese vernetzten Hydrogelpolymeren wurden gemäß dem Verfahren des Beispiels 3 hergestellt.
    PAA – Polyacrylamid
    PMA – Polymethacrylamid
    PHEMA – Polyhydroxyethylmethacrylat
    PVP – Polyvinylpyrrolidon
    PAAC – Polyacrylsäure
  • BEISPIEL 5
  • Allgemeines Verfahren zum Herstellen und Verabreichen oraler Formulierungen
  • Das Polymer wurde gemäß Beispiel 3 unter Verwenden des Vernetzers in einer Menge von 0,5% der anfänglichen Monomerlösung hergestellt. 0,1 g eines vorgetrockneten, vernetzten Polyacrylamidpolymers (das möglicherweise bis zu 3 Gew.-% Acrylsäure enthält), das mit (solange nicht anders angegeben aus Enteneiweiß isoliertem) Ovomucoid modifiziert war, werden in einen Überschuß wäßrige Wachstumshormonlösung in einer Konzentration von 1,0 mg/ml Kochsalzlösung bei Raumtemperatur gegeben. Das Polymer wird der Lösung über einen Zeitraum von 1 Stunde ausgesetzt. Nach diesem Zeitraum erreicht das Aufnehmen der wachstumshormonhaltigen Lösung ein Gleichgewicht und das Polymer ist vollständig gequollen. Die Polymeren, die eine meßbare Wirkung zeigen, haben mindestens 0,5 g wäßrige Lösung des Wachstumshormons absorbiert. Die Formulierung wurde aus der Wachstumshormonlösung entfernt und war gebrauchsfertig.
  • BEISPIELE 6–7
  • ZUFUHR VON ORALEM WACHSTUMSHORMON
  • Eine Probe unmodifiziertes Polyacrylamidgel (PAA) wird dazu veranlaßt, ungefähr 100 Zählwerte radioaktiv markiertes humanes Wachstumshormon (HGH) aufzunehmen, das mit einer normalen therapeutischen Dosis Wachstumshormon (10 μg/kg) vermischt ist. Die Verfahrensweise für die Absorption wird in Beispiel 5 angegeben. Die Probenzählwerte werden bestimmt und die Probe wird Ratten als Kontrolle oral verabreicht (Beispiel 6). Nach 2 Stunden wird durch einen Radioimmuntest im Blut kein Wachstumshormon-Zählwert beobachtet. Eine weitere Probe wie in Beispiel 3 beschrieben mit Ovomucoid modifiziertes PAA wird ähnlich behandelt, gemessen und verabreicht. Es wurde bestimmt, daß ungefähr einhundert Zählwerte in der Probe vor der Verabreichung vorhanden waren. Nach 2 Stunden können unter Verwenden derselben Radioimmuntesttechniken wie in Beispiel 6 verwendet ungefähr 25 Zählwerte gemessen werden, die die Darmschranke passiert hatten und in das Kreislaufsystem eingedrungen waren. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 dargestellt.
  • Figure 00320001
  • Aus den Daten in Tabelle 2 ist eindeutig zu erkennen, daß die Formulierung der beanspruchten Erfindung, das heißt, wenn ein Inhibitor proteolytischer Enzyme chemisch an die Polymermatrix gebunden wurde, die Fähigkeit aufweist, den Wachstumshormonabbau im Magen-Darm-Trakt zu verhindern und den Übergang einer bedeutenden, wirksamen Menge Wachstumshormon in den Blutstrom der Wirtstiere ermöglicht.
  • BEISPIEL 8
  • Die Schutzwirkung von Ovomucoid auf Proteine mit einem von 16000 bis weit über 300 000 Dalton reichenden Molekulargewicht wird in Tabelle 3 dargestellt. Bei den in Tabelle 3 mitgeteilten Versuchen wurde Trypsin, ein proteolytisches Enzym, im angegeben Molverhältnis mit dem Protein eingebaut, um die physiologischen Bedingungen im Darmtrakt zu simulieren, wo ein lytisches Enzym die Hydrolyse des Proteins auslöst. Es ist eindeutig zu erkennen, daß eine sehr kleine Menge Initiator eine große Menge Protein (über das 300fache seiner molaren Menge) gegen einen proteolytischen Abbau schützen kann. Es ist leicht zu erkennen, daß während mehr als 90 Prozent des Proteins in Anwesenheit eines schützenden Inhibitors unabgebaut bleiben, gefunden wird, daß weniger als ein Prozent nach nur 2 Stunden übrig bleiben, wenn kein Ovomucoidinhibitor vorhanden ist. Die Wirkung des Einbauens von Ovomucoid ist das Verstärken des zu physiologisch bedeutsamen Zeitpunkten vorhandenen aktiven Proteins um den Faktor von mehr als 10 und bei vielen untersuchten Materialien um ungefähr 100 oder mehr über den der Einnahme folgenden Zeitraum von zwei Stunden.
  • TABELLE 3 SCHUTZWIRKUNG VON OVOMUCOID(a)
    Figure 00340001
  • Vorstehend wurde ausgeführt, daß der Proteaseinhibitor chemisch an das Hydrogelpolymer gebunden (immobilisiert) sein muß. Ein weiteres Verfahren des Bindens (Immobilisieren) des Proteaseinhibitors an das Hydrogelnetzwerk ist das Einschließen des Proteaseinhibitors in das Netzwerk durch physikalische Mittel statt des kovalenten Bindens. Auf diese Weise ist das durch Vernetzen gebildete Netzwerk solcherart, daß der Proteaseinhibitor innerhalb der Netzstruktur aufgrund seiner dreidimensionalen Struktur, die größer als die dreidimensionalen Öffnungen des Hydrogelnetzwerks ist, eingeschlossen ist. Andere Assoziationsverfahren wie etwa Wasserstoffbindung, Salzassoziation und hydrophobe Assoziation, die den Rückhalt des Proteaseinhibitors innerhalb der Hydrogelmatrix bewirken, sind dem Fachmann bekannt und können bei dieser Erfindung ebenfalls zum Binden (Immobilisieren) eingesetzt werden.
  • Die Schutzwirkung von Ovomucoid auf Proteine, deren Molekulargewicht von 16000 bis über 300000 Dalton reicht, wird in Tabelle 4 dargestellt. Bei den mitgeteilten Versuchen wurde α-Chymotrypsin, ein proteolytisches Enzym, im angegebenen Molverhältnis mit dem Protein inkubiert, um die physiologischen Bedingungen im Darmtrakt zu simulieren, wo ein proteolytisches Enzym die Hydrolyse des Proteins auslöst. Es wurden zwei Hydrogele hergestellt. Ein Ovomucoid enthaltendes Gel wurde wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt und eines wurde ohne Ovomucoid hergestellt. 2,5 mg Protein je ml gequollenes Hydrogel wurde in das gequollene Hydrogel eingeführt und anschließend wurde α-Chymotrypsin zugesetzt. Das Verhältnis Protein : α-Chymotrypsin war 200 : 1. Die Protein/Hydrogel/α-Chymotrypsin-Lösung wurde 1 h bei 30°C in einem Phosphatpuffer (pH 7,4) inkubiert. Die Proteolyseprodukte wurden mittels Phosphatpuffer (10faches Volumen) vom Hydrogel gewaschen. Der Hydrolysegrad wurde durch HPLC abgeschätzt, um die Menge des abgebauten Proteins gegenüber dem nicht abgebauten Protein darzustellen.
  • Aus Tabelle 4 ist leicht zu erkennen, daß mehr als 90% des Proteins in Anwesenheit des Schutzhydrogels unabgebaut bleiben. Ohne die Umgebung des Schutzgels werden über 90% des Proteins abgebaut. Die Wirkung des Einbauens von Ovomucoid ist das Verstärken des zu physiologisch bedeutsamen Zeitpunkten vorhandenen aktiven Proteins um den Faktor von mehr als 10 und bei vielen untersuchten Materialien um ungefähr 100 oder mehr über den der Einnahme folgenden Zeitraum von zwei Stunden. TABELLE 4 PROTEIN/PEPTID-HYDROLYSE MIT CHYMOTRYPSIN
    Figure 00350001
    • I
    physikalisch immobilisiertes Protein in nicht modifiziertem Polyacrylamidhydrogel
    II
    physikalisch immobilisiertes Protein in mit Ovomucoid modifiziertem Polyacrylamidhydrogel
  • Tabelle 5 und 6 zeigen, daß Gelformulierungen innerhalb der Erfindung Protein- und Peptidwirkstoffe wirkungsvoll zuführen können. Tabelle 5 zeigt zum Beispiel, daß ein mit Ovomucoid modifiziertes, oral verabreichtes Polyacrylamidhydrogel wirkungsvoll einen Dosiswert Glucagon zuführen kann, der gegenwärtig durch subkutane Injektion zugeführt werden muß. Glucagon ist ein 29-Element-Proteinmolekül niedrigen Molekulargewichts, von dem bekannt ist, daß es beim Freisetzen in den Blutstrom eine dramatische Zunahme des Glucosespiegels verursacht. Es bewerkstelligt dies durch Stimulieren des Abspaltens von Glykogen in der Leber. Wegen dieser Wirkung ist es beim Behandeln gewisser Formen von Hypoglykämie brauchbar. Da es ein Protein ist, kann es oral nicht wirkungsvoll zugeführt werden. Tabelle 6 zeigt die Wirkung des Verabreichens von Calcitonin mittels oraler Dosierungsformen der Erfindung. Kaninchen sind in beiden Fällen die Testtiere. In beiden Fällen wird die angegebene Menge des aktiven Proteinwirkstoffs mit dem Gel wie vorstehend beschrieben vermischt. Es wird eine Lösung des Wirkstoffs in Wasser hergestellt. Der pH kann zum Verbessern der Stabilität oder anderer Eigenschaften des Wirkstoffs eingestellt werden, dies ist aber nicht notwendig. Die Lösung wird anschließend dem trockenen Polymer in einer Menge von 1 ml wirkstoffhaltiger Lösung auf 100 mg trockenes Polymer zugefügt, obschon andere Mengen des trockenen Polymers verwendet werden können (z. B. 50 mg je ml Lösung).
  • Tabelle 5 zeigt, daß die einfache Gabe von physiologischer Kochsalzlösung oder selbst einer normalen subkutanen Injektionsdosis Glucagon in Lösung als orale Zwangsgabe an das Tier keine Wirkung auf den Blutzucker aufweist. In beiden Fällen bleibt der Blutzucker konstant und bei normalen Werten während des zeitlichen Verlaufs des Versuchs. Die Gabe derselben Dosis in Form einer subkutanen Injektion verursacht jedoch einen steilen Anstieg des Blutzuckers. Von dem im Blut gemessenen Glucagon wurde gezeigt, daß es sich nach der Injektion dieser Glucagonmenge erhöhte. Schließlich zeigt Tabelle 5 eindeutig, daß wenn dieselbe Menge Glucagon (0,5 mg) Kaninchen mit einer der aktiven Formulierungen der Erfindung (in diesem Fall mit Ovomucoid modifiziertes Polyacrylamidhydrogel) verabreicht wird, der Blutzucker- und Blutglucagonspiegel in einer zu der im Fall der subkutanen Kontrollinjektion sehr ähnlichen Weise ansteigt. Die Formulierung ist beim Verstärken der oralen Glucagonzufuhr eindeutig aktiv.
  • Tabelle 6 zeigt die Wirkung einer Gabe einer therapeutischen Standardinjektionsdosis an Calcitonin durch orale Mittel. Calcitonin ist ein Protein niedrigen Molekulargewichts, das gegenwärtig durch Injektion verabreicht wird, und von ihm ist bekannt, daß es den Calciumumsatz erhöht und beim Behandeln einer Anzahl von Krankheiten wirksam sein kann, an denen Calcium beteiligt ist, wie etwa das Brüchigwerden von Knochen, Erkrankungen der Schilddrüse und andere Krankheiten, von denen bekannt ist, daß Calcium eine entscheidende Rolle spielt. Tabelle 6 veranschaulicht, daß eine einzige, mit einer Gelformulierung, die immobilisiertes Ovomucoid enthält, oral gegebene Calcitonindosis nach 60 Minuten ungefähr dieselbe Wirkung wie eine subkutane Injektion aufweist.
  • Tabelle 6 zeigt Daten für mMol Ca2+/l im Blut eines Kaninchens nachdem 1 mg Calcitonin subkutan und oral in einem Polyacrylamidgel verabreicht wurde, das mit aus Enteneiweiß isoliertem Ovomucoid modifiziert worden war. Die vorstehend beschriebenen Verfahren wurden zur Herstellung der modifizierten Polymeren und zum Absorbieren von Calcitonin in das Gel verwendet. Die Calciumkonzentration im Blut wurde durch ein Standardverfahren unter Verwenden einer selektiven Elektrode bestimmt. Die Daten bestätigen, daß Calcitonin, durch das mit Ovomucoid modifizierte Hydrogel geschützt wird, wenn es oral verabreicht wird.
  • Figure 00380001
  • TABELLE 6
    Figure 00390001
  • Die nachstehend aufgeführten Proteine/Peptide wurden wie nachstehend beschrieben getestet, um die Höhe des Transports durch das Polyacrylamid und (Concanavalin A) Con-A-haltige Polyacrylamidhydrogel zu bestimmen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 8–13 mitgeteilt.
  • TABELLE 7 PROTEIN UND PEPTIDE
    Figure 00400001
  • Polyacrylamidhydrogele wurden durch Polymerisieren wäßriger Lösungen von Acrylamid (10%) und N,N'-Methylenbisacrylamid (0,5%) unter der Wirkung von Redoxkatalysator-Ammoniumpersulfat-N,N.N',N'-Tetramethylethylendiamin synthetisiert. Modifizierte Hydrogele wurden durch Polymerisieren desselben Monomergemisches in Gegenwart von 1,0% eines ungesättigten Derivats von Ovomucoid oder Sojabohnen-Trypsininhibitor (STI) hergestellt. Nachdem die Polymerisation abgeschlossen war, wurden die Hydrogele durch Pressen durch Nylonsiebe auf eine kleine Größe reduziert, mit destilliertem Wasser gewaschen, bis unumgesetzte Verbindungen vollständig entfernt waren, und einem lyophilen Trocknen unterzogen. Es wurde die Fraktion mit einem Durchmesser ≤ 0,05 mm genommen. Protein/Peptid enthaltende Zubereitungen wurden durch Quellen in einer wäßrigen Protein/Peptid-Lösung mit einer Konzentration von 3,0 mg/ml lyophil getrockneten, unmodifizierten oder modifizierten Polyacrylamidhydrogelteilchen erhalten.
  • Der zum Untersuchen der Protein/Peptid-Durchlässigkeit verwendete Reaktor stellt ein Gefäß mit einem Innendurchmesser von 2,0 cm und aus Polyurethanschaum gefertigten Wänden mit einer Dicke von 0,7 cm dar, die die mechanische Festigkeit des Systems liefern (1). Die offenen Poren des Polyurethanreaktors waren Con-A, was die Schleimhautmembran des Darms simulierte. Die Wände des Reaktors waren mit einer wäßrigen Lösung der Monomeren (3% Acrylamid, 0,3% N,N'-Methylenbisacrylamid) und einem Polymerisationskatalysator imprägniert. Nach der Polymerisation wurde ein viskoses Polyacrylamidgel erhalten, das keine mechanische Festigkeit zeigte und in den Polyurethanporen gleichmäßig verteilt war. Zum Herstellen eines Con-A enthaltenden Polyacrylamidhydrogels zum Simulieren der Schleimhautmembran des Darms enthielt die anfängliche Monomerenlösung 2 mg Con-A je ml Polymerisationslösung. Con-A wurde mit Acryloylchlorid geringfügig acyliert (Molverhältnis Con-A Acryloylchlorid = 1 : 10).
  • Die untersuchten 2 g Protein/Peptid enthaltendes Gel wurden in den Reaktor eingebracht, der in ein 12 ml destilliertes Wasser enthaltendes Glasgefäß gestellt wurde. Die Konzentration des freigesetzten Proteins/Peptids wurde durch Messen der optischen Dichte der Lösung mittels eines Spektrophotometer-Instruments Hitachi-3410 (Japan) bei einer Wellenlänge von 280 nm bestimmt.
  • Die Protein/Peptid-Konzentration im Gleichgewicht entspricht 1/7 der in den 2-ml-Reaktor eingebrachten Anfangskonzentration (in den Einheiten mg Protein/ml Hydrogel). Die Lösung in dem Glasgefäß (Permeatseite der Schranke) wird kontinuierlich durch das Spektrophotometer, das ein Füllvolumen von etwa 0,3 ml aufweist, im Kreis geführt. Jede Standardlaboratorium-Flüssigkeitspumpe des analytischen Typs mit niedriger Scherkraft kann zum Durchführen der Messung auf diese Weise eingesetzt werden.
  • Jeder in Tabelle 8–13 mitgeteilte Wert ist das Mittel aus zwei verschiedenen Messungen.
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Kritisch für das Bewerten der in Tabelle 8–14 dargestellten Ergebnisse der Transportuntersuchungen sind die anfänglichen Diffusionsraten (die Proteinmenge, die in den ersten 10 Minuten der Messung durch die Schranke hindurchgeht) und die Wirkung der verstärkten Aktivität auf Proteine hohen Molekulargewichts, die bekanntermaßen schwer durch irgendein anderes Mittel als Injektion zuzuführen sind. Diese Wirkung wird in den 2, 3 und 4 zusammengefaßt und veranschaulicht. In 5 der 6 untersuchten und in Tabelle 8–13 und 14A mitgeteilten und durch die in den Figuren enthaltenen Kurven dargestellten Kombinationen aus Zufuhrgelen und Schranken fehlt entweder der Schranke oder dem Zufuhrsystem wenigstens eine Schlüsselkomponente der Erfindung, die zum Verstärken des Transports erforderlich ist. Diese werden als nicht-aktivierte Systeme bezeichnet.
  • Bei der sechsten Kombination wird Ovomucoid als kritisches Bindeelement bei der Gelbildung verwendet (seine Rolle ist sowohl das Protein zu schützen als auch interaktive Elemente in der Darmschranke zu binden), während Concanavalin A (Con-A) (ein wohlbekanntes Lectinbindemittel) innerhalb der Transportschranke immobilisiert ist, um die Lectinbindung und andere, in verschiedenen Teilen der Transportschranke vorhandene aktive Mittel zu simulieren. Zu Beschreibungszwecken wird dieses System als ein aktiviertes System bezeichnet, das gemäß der Erfindung ein Transportverstärkung für in der Formulierung enthaltene Proteine zeigen sollte, an die das Ovomucoid oder andere bindende Einheit gebunden ist. Tabelle 14B beschreibt eine getrennte Untersuchung an nur zwei Proteinen, die zeigt, daß die aktivierende Verknüpfung nicht Teil des Inhibitormoleküls sein muß und getrennt in die Formulierung eingebaut sein kann. Bei dieser Tabelle ist eine Polydextranfunktionalität getrennt an das Hydrogel zusammen mit Sojabohnen-Trypsininhibitor (STI) gebunden. Dieses System, bei dem dieses Gel mit der Con-A enthaltenden Schranke verwendet wird, ist ebenfalls ein aktiviertes System gemäß der Erfindung.
  • In Tabelle 8–14 und 2–4 beziehen sich die Probennummern and dasselbe wie in Tabelle 7 aufgeführte Protein, obschon in Tabelle 14B nur zwei Proteine bewertet werden.
  • 2 zeigt die Anfangstransportraten für jedes untersuchte System für jedes bewertete Protein in der Reihenfolge des zunehmenden Molekulargewichts. Es ist ziemlich offensichtlich, daß bei allen nicht-aktivierten Systemen (bei denen die Schranke und das Zufuhrgel keine gebundenen Gruppen enthalten, die in Wechselwirkung treten) die anfänglich transportierte Proteinmenge bei allen untersuchten Proteinen sehr ähnlich ist. Diese reicht von etwa 40–45% in den ersten 10 Minuten des Vertreters mit dem niedrigsten MG bis etwa 17–22% für den Vertreter mit dem höchsten MG. Wenn Ovomucoid jedoch an das Zufuhrgel gebunden ist und ein Bindungsligand wie etwa Con-A chemisch an der Schranke immobilisiert ist, ist die Wirkung auf alle Proteine dramatisch. Die Anfangsraten für Vertreter mit niedrigem MG sind auf etwa 60–70% Übertritt erhöht, während sich die für Vertreter mit höherem MG auf den Bereich von 40–50% erhöht.
  • Diese Wirkung und ihre Größenordnung über den Bereich der untersuchten Molekulargewichte wird in 3 und 4A deutlich dargestellt, die jeweils die gegenüber dem Durchschnitt aller nicht-aktivierter Systeme (3) gemessene Wirkung des aktivierten Systems und dieselben beiden Kurven zusammen mit dem Verhältnis des aktivierten Systems zu den nicht aktivierten Systemen (4A). Nicht nur ist die Wirkung bei allen untersuchten Proteinen dramatisch, sondern sie erhöht sich auch tatsächlich bei den höchsten Molekulargewichten, so daß der anfängliche Transport dieser Vertreter mehr als 200% desjenigen desselben, mittels der nicht-aktivierten Systeme transportierten ist.
  • 4B vereinigt die Ergebnisse in 3 mit den in Tabelle 15 veranschaulichten Ergebnissen. Erneut wurde in der Figur nur der Proteintransport in den ersten 10 Minuten verwendet. Probe 2 und 12 wurden unter Verwenden zweier Kombinationen von Zufuhrgel und Schranke untersucht, um zu zeigen, daß die Aktivierung des Gels zu einer verstärkte Proteinzufuhr durch vollständiges Befolgen der Lehren der Erfindung und nicht nur durch Aktivieren mit Ovomucoid bewerkstelligt werden kann. Bei diesem Beispiel wurden Calcitonin (Probe 2) und Fibrinogen (Probe 12) mit einem STI-modifizierten Gelzufuhrsystem in Kombination mit einer Con-A-modifizierten Schranke (Tabelle 14A) untersucht. In einem Fall ist jedoch Dextran wie beschrieben an die STI-modifizierte Schranke gebunden. Im anderen Fall ist es nur in ungebundener Form im Gemisch enthalten. Es wird deutlich, daß wenn Dextran an das Gel gebunden ist, der Transport der Proteine verstärkt wird. Wie im Fall des an das Gel gebundenen Ovomucoids zeigt das Dextran/STI-gebundene Gel eine größere Verstärkung bei den Proteinen höheren Molekulargewichts. Dies zeigt eindeutig den breiten Umfang der Erfindung, d. h. solange das Hydrogel mit einem Inhibitor und einem Glucosid modifiziert ist, erfolgt eine Verstärkung des Transports von Proteinen höheren Molekulargewichts, die sowohl überraschend als auch ziemlich eindrucksvoll ist. Dies wird in 2 dargestellt.
  • TABELLE 14A ZUSAMMENFASSUNG DER DATEN
    Figure 00510001
  • TABELLE 14A (FORTSETZUNG) ZUSAMMENFASSUNG DER DATEN
    Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Es ist ersichtlich, daß in dem Fall einer Diffusion durch das inerte polymere Hydrogel der Wert der Protein/Peptid-Anreicherung in der das Polyurethangefäß umgebenden Flüssigkeit praktisch unabhängig entweder von der Natur des Inhibitors oder der Anwesenheit des Inhibitors in den Polymerteilchen ist und nur durch das Molekulargewicht des Proteins/Peptids gesteuert wird.
  • Praktisch ähnliche Abhängigkeiten wurden bei der Untersuchung der Protein/Peptid-Freisetzung aus den unmodifizierten und durch STI modifizierten Polymerteilchen und ihrer Diffusion durch die mit Hydrogel mit Con-A gefüllten Poren beobachtet.
  • Für die mit Ovomucoid modifizierten Polymerteilchen sind die Anfangswerte der Protein/Peptid-Anreicherung bei der Anreicherung in der umgebenden Lösung abnormal hoch.
  • Somit umfaßt bei der oralen Verabreichung der Wirkungsmechanismus der in den Teilchen eines durch Ovomucoid modifizierten Polymerhydrogels immobilisierten Proteine/Peptide die Hemmung der Protein/Peptid-Proteolyse aufgrund der Neutralisierung der proteolytischen Enzyme durch Ovomucoid und die Zunahme des Wertes der Protein/Peptid-Diffusion aus den Teilchen des Ovomucoid enthaltenden Hydrogels durch die Wände des Dünndarms. Letzteres ist mit einer spezifischen Reaktion zwischen dem Glykosidteil des chemisch an das Hydrogel gebundenen Ovomucoids mit in der Darmschleimhautmembran enthaltenem Lectin zurückzuführen. Diese Reaktion führt direkt zur Zunahme der örtlichen Protein/Peptid-Konzentration in der Schleimhautmembran und im Ergebnis wachsen ihre Diffusionsgeschwindigkeiten in den Blutstrom an.
  • In Tabelle 14B wurde Dextran unter Einsetzen des für die Formulierung N2 auf Tabelle 5 folgend beschriebenen Verfahrens kovalent mit Hydrogel verknüpft. Die verwendete Apparatur war dieselbe wie durch 1 dargestellt. Eine Lösung eines Proteins wurde in das innere Polyurethangefäß gegossen und Messungen wurden an den angegebenen Zeiträumen durchgeführt, um den Prozentsatz Protein zu bestimmen, der aus dem Polyurethangefäß, das das wie in der Tabelle angegeben modifizierte Hydrogel enthielt, übergetreten war.
  • Tabelle 6 zeigt Daten der mMol Ca2+/l Blut in einem Kaninchen nachdem 1 mg Calcitonin subkutan und oral in einem Polyacrylamidgel verabreicht wurden, das mit aus Enteneiweiß isoliertem Ovomucoid modifiziert worden war. Zur Herstellung des modifizierten Polymers und zum Absorbieren von Calcitonin in das Gel wurden beschriebene Verfahren verwendet. Die Calciumkonzentration im Blut wurde durch ein Standardverfahren unter Verwenden einer ionenselektiven Elektrode bestimmt. Die Daten bestätigen, daß Calcitonin durch das mit Ovomucoid modifizierte Hydrogel geschützt wird, wenn es oral verabreicht wird.
  • Es ist wohlbekannt und wurde vorstehend erwähnt, daß Enzyme einschließlich Pepsin im allgemeinen alle Proteine und Peptide zersetzen. Ovomucoid ist selbst ein Protein. Daher kann man erwarten, daß Ovomucoid zersetzt werden kann, wenn es Pepsin ausgesetzt wird. Tabelle 15 zeigt jedoch, daß Ovomucoid, wenn es in einem Hydrogel immobilisiert ist, durch Pepsin nicht zersetzt wird. Bei den in Tabelle 15 mitgeteilten Versuchen wurden 10 g Polyacrylamidhydrogele, die 7,1 mg immobilisiertes Ovomucoid je 1 g (wie vorstehend beschrieben hergestelltes) Hydrogel enthielten, mit 20 ml Pepsinlösung (pH 2,0, 0,01 M HCl, 0,2 mg Pepsin/ml) 0,5, 1,0 und 1,5 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Hydrogele mit destilliertem Wasser und 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gewaschen, um das Pepsin zu entfernen. Anschließend wurden die Hydrogele mit 50 ml Trypsinlösung (pH 7,5, 2,3 mg Trypsin/ml) 1,0 Stunden inkubiert und wurden mit derselben Pufferlösung (10faches Gelvolumen) gewaschen. Die Menge an das mit Ovomucoid gebundenes Trypsin wurde als Unterschied zwischen der Anfangsmenge Trypsin und der Trypsinmenge in der Lösung nach der Inkubation und Waschen der Gele mit dem 10fachen Volumen Trispuffer bestimmt. Dies wurde mit Gelen verglichen, die nicht Pepsin ausgesetzt worden waren. Diese in Tabelle 15 mitgeteilten Daten zeigen, daß das gebundene Ovomucoid (das ein Protein ist), das meiste seiner Trypsinhemmaktivität selbst dann behält, nachdem es der Pepsinlösung für bis zu eineinhalb Stunden ausgesetzt worden war.
  • TABELLE 15 TRYPSINKAPAZITÄT VON MIT OVOMUCOID MODIFIZIERTEM HYDROGEL NACH DEM AUSSETZEN GEGENÜBER PEPSIN
    Figure 00560001
  • Weitere Anschauungsbeispiele therapeutischer oder physiologisch aktiver Materialien, die eine verhältnismäßig niedere Bioverfügbarkeit aufweisen, wenn sie an einen Menschen oder ein Tier verabreicht werden, werden in den nachstehenden Tabellen 16 und 17 aufgeführt. Diese physiologisch aktiven Materialien können bequem unter Einsetzen des Zufuhrsystems und somit des Verfahrens dieser Erfindung verabreicht werden. Die Bioverfügbarkeit dieser Materialien wird erhöht, wenn sie mittels des Verfahrens dieser Erfindung verabreicht werden.
  • TABELLE 16a THERAPEUTIKA MIT NIEDRIGER ORALER BIOVERFÜGBARKEIT
    Figure 00560002
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • (Goodman & Gillmans, The Pharmacological Basis of Therapeutics*, Hardman, J. G. (Hrsg.) & Limbird, L. E. (Hrsg.), neunte Ausgabe (1996) McGraw-Hill, New York)
  • Figure 00580002
  • Figure 00590001
  • TABELLE 16b Weitere Beispiele von Wirkstoffen mit niedriger Bioverfügbarkeit aus Cho (US-Patent 4 849 227), die in Tabelle 7a oder sonst im Text nicht spezifisch aufgeführt werden
    Figure 00600001
  • TABELLE 17 EINIGE PROTEINE UND PEPTIDE NIEDRIGEN MOLEKULARGEWICHTS, DIE EINER ORALEN ZUFUHR DURCH ZUSAMMENSETZUNG DER ERFINDUNG ZUGÄNGLICH SIND
    Figure 00600002
  • Figure 00610001

Claims (9)

  1. Therapeutikumhaltige Zusammensetzung, die an die orale Verabreichung eines anderen biologisch aktiven Materials als Insulin angepaßt ist, umfassend (a) ein wasserunlösliches, aber wasserquellbares, hydrophiles Polymer, daß chemisch modifiziert ist, um mindestens einen Inhibitor eines proteolytischen Enzyms und eine chemische Funktionalität zu enthalten, die eine interaktive Affinität auf Target-Rezeptoren aufweist, die sich auf den Transportsperrwänden des Verdauungstrakts der bestimmungsgemäßen Tierart befinden, wobei die chemische Funktionalität ein lectinbindendes Mittel oder ein Glykosid ist; (b) ein oder mehr therapeutische Materialien, die aus einem Wachstumshormon, einem Interleukin, einem das Blutzellenwachstum stimulierenden Faktor, Erythropoietin (EPO), parathyroidem Hormon (PTH), Selenoprotein P, Cystatin B, Megakaryozytenstimulierungsfaktor (MGDF), Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor, Tumorinvasionshemmfaktoren, transaktivierenden Regulatorproteinen (TAT) des HIV und anderer Retroviren und dem transaktivierenden Regulatorprotein BPC 157, fettreduzierenden Hormonen, Calcitonin und Glucagon ausgewählt sind, und (c) Wasser.
  2. Zusammensetzung des Anspruchs 1, wobei das Polymer ein teilweise vernetztes Gel ist, das ein hydrophiles Polymer bildet.
  3. Zusammensetzung des Anspruchs 1, wobei der Inhibitor des proteolytischen Enzyms Ovomucoid ist und er durch Umsetzen von Ovomucoid mit einem polymerisierbaren Material funktionalisiert wurde.
  4. Zusammensetzung des Anspruchs 1, wobei die Affinitätsfunktionalität eine Zuckerstruktureinheit ist, die an das hydrophile Polymer gebunden ist.
  5. Zusammensetzung der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, wobei das hydrophile Polymer ein Homopolymer oder ein Copolymer ist, das aus einem oder mehreren aus Acryl- und Methacrylsäure, Acrylamid, Methacrylamid, Hydroxyethylacrylat und -methacrylat und Vinylpyrrolidonen ausgewählten Monomeren hergestellt wurde, das Therapeutikum ein Protein oder ein Peptid mit einem Molekulargewicht von weniger als 100000 Dalton ist und der Inhibitor durch sein Umsetzen mit Acryloylchlorid funktionalisiert wurde.
  6. Zusammensetzung des Anspruchs 1, wobei die Affinitätsfunktionalität Teil des Inhibitors proteolytischer Enzyme ist und durch lectinbindende Gruppen von Zuckern oder verwandten Sacchariden dargestellt wird.
  7. Zusammensetzung der Ansprüche 1, 3, 4, 5 oder 6, die mit einer magensaftresistenten Beschichtung umschlossen ist und gegebenenfalls pharmakologisch annehmbare antimikrobielle Mittel, Stabilisatoren, Salze und andere Formulierungshilfsmittel enthält.
  8. Verfahren zum Herstellen einer Zusammensetzung des Anspruchs 1, umfassend die Schritte des (a) Funktionalisierens eines Inhibitors proteolytischer Enzyme durch Umsetzen des Inhibitors mit einer Verbindung, die eine polymerisierbare Vinylgruppe und eine funktionelle Gruppe aufweist, die gegenüber dem Inhibitor reaktionsfähig ist, (b) Polymerisierens eines Gemisches, das 75 bis 99 Gewichtsprozent eines oder mehrerer polymerisierbarer Monomeren, 0,1 bis 20 Gewichtsprozent eines Vernetzungsmittels und 0,01 bis 5 Gewichtsprozent eines in Schritt (a) erhaltenen funktionalisierten Inhibitors eines proteolytischen Enzyms umfaßt, unter Liefern eines hydrophilen Polymers und (c) Tauchens des hydrophilen Polymers in eine wäßrige Lösung eines therapeutischen Materials, das aus einem Wachstumshormon, einem Interleukin, einem das Blutzellenwachstum stimulierenden Faktor, Erythropoietin (EPO), parathyroidem Hormon (PTH), Selenoprotein P, Cystatin B, Megakaryozytenstimulierungsfaktor (MGDF), Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierendem Faktor, Tumorinvasionshemmfaktoren, transaktivierenden Regulatorproteinen (TAT) des HIV und anderer Retroviren und dem transaktivierenden Regulatorprotein BPC 157, fettreduzierenden Hormonen, Calcitonin und Glucagon ausgewählt ist.
  9. Zusammensetzung des Anspruchs 1, wobei das Polymer ein vernetztes hydrophiles Gel ist und der Inhibitor innerhalb der Polymermatrix physikalisch eingeschlossen ist.
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