DE69735997T2 - Mikrobielles polyungesättigte fettsäure enthaltendes öl und verfahren zur herstellung eines öls aus pasteurisierter und granulierter biomasse - Google Patents

Mikrobielles polyungesättigte fettsäure enthaltendes öl und verfahren zur herstellung eines öls aus pasteurisierter und granulierter biomasse Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein mehrfach ungesättigte Fettsäure (MUFS) enthaltendes Öl, insbesondere ein reines und stabiles mikrobielles Öl, welches mindestens eine mehrfach ungesättigte Fettsäure enthält. Dieses Öl kann aus einer Biomasse oder einer Fermentationsbrühe erhalten werden, welche einer Pasteurisierung unterzogen wurde.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es gibt eine zunehmende Tendenz, Lipidprodukte, welche mehrfach ungesättigte Fettsäuren, die von Fermentationsverfahren abgeleitet sind, in verschiedenen Nahrungsmitteln einzuschließen. Von Bedeutung ist die neuerdings festgestellte Notwendigkeit, mehrfach ungesättigte Fettsäuren in Säuglingsfertignahrung einzubringen.
  • Verschiedene Verfahren sind für die fermentative Herstellung von Fett oder Öl, das mehrfach ungesättigte Fettsäuren enthält, beschrieben worden. Beispiele sind die EP-A-0 155 420 für die Herstellung von γ-Linolensäure-(GLA-)haltigem Lipid von Mortierella; die EP-A-0223960 , EP-A-0 276 541 und WO-A-92/13086 für die Herstellung von Arachidonsäure-(ARA-)haltigem Öl aus Mortierella und/oder Pythium; die WO-A-91/07498 und die WO-A-91/11918 für die Herstellung von Docosahexaensäure-(DHA-)haltigem Öl aus Crypthecodinium cohnii oder Thraustochytrium und die WO-A-91/14427 für die Herstellung von Eicosapentaensäure-(EPA-)haltigem Öl aus Nitzschia; und die US 5 539 133 für die Herstellung von ARA und EPA aus Mikroalgen.
  • Typischerweise wird eine mikrobielle Spezies, welche ein die gewünschten) mehrfach ungesättigten) Fettsäure(n) enthaltendes Lipid produziert, in einem geeigneten Medium gezüchtet, die Biomasse wird daraufhin geerntet und vorbehandelt, um die nachfolgende Extraktion von Lipid aus der mikrobiellen Biomasse mit einem geeigneten Lösungsmittel zu ermöglichen. Das so extrahierte Lipid liegt in Rohform vor und wird daher häufig mehreren Raffinationsschritten unterzogen.
  • Die Vorbehandlung des nassen Biomassekuchens erfolgt in der Regel durch Trocknen, wie durch Sprühtrocknen oder Lyophilisierung und/oder durch mechanisches Aufbrechen, wie Homogenisierung oder Mahlen. Das Trocknen der Biomasse ist erwünscht, um die Menge an Lösungsmittel zu verringern und um problematische Emulsionen zu verhindern. Wenn ein oxidations- und wärmeempfindliches Lipid, wie ein mehrfach ungesättigte Fettsäure enthaltendes Lipid, isoliert werden muss, muss besondere Sorgfalt verwendet werden, um sicherzustellen, dass eine Exposition an ungünstige Bedingungen, welche eine Sauerstoffinduzierte Zersetzung bzw. Verschlechterung stimulieren, soweit wie möglich vermieden wird. Allerdings verhindern die im Fachbereich angewandten Biomasse-Vorbehandlungsverfahren solche ungünstigen Bedingungen nicht.
  • Yamade et al., "Industrial applications of single cell oils" (Industrielle Anwendungen von Einzelzell-Ölen), Hrsg. Kyle und Ratledge, 118–138 (1992) beschreiben ein Arachidonsäure enthaltendes Öl, das aus Mortierella Alpina mit einem Triglycerid-Gehalt von 90 % gereinigt wurde. In dem Rückgewinnungsverfahren wird die Biomasse getrocknet und durch eine Kugelmühle vor der Hexan-Extraktion grob gemahlen. Dieses Verfahren minimiert die Exposition an ungünstige Bedingungen auch nicht.
  • Die EP-A-0 520 624 (Efamol) beschreibt ein natürliches oder synthetisches Glycerolöl, welches mindestens 20 % DLMG umfasst. Die WO-A-92/12711 (Martek) bezieht sich auf mikrobielle Ölmischungen zur Ergänzung von Säuglingsfertignahrungen, insbesondere Mischungen von ARA-, DHA- und EPO-haltigen Ölen. Die GB 1 466 853 (Alexander/Rosesdowns) bezieht sich auf die Extraktion von Öl aus Hefezellen durch Aufbrechen der Hefezellwände und das Ausformen des resultierenden Pulvers zu Pellets, welche danach geflockt werden.
  • Die FR-2 210 662 (British Petroleum) bezieht sich auf die Entfernung von Substanzen, wie von Kohlenwasserstoffen oder Lipiden, aus Mikroorganismusprodukten. Die FR-2 674 865 (Bioprox) bezieht sich auf ein Verfahren für die Herstellung eines Milchsäure enthaltenden Flüssigkonzentrats aus einem Laktose enthaltenden Ausgangsmaterial mit Herkunft aus Milch. Die US 5 411 873 (Genencor) bezieht sich auf Verfahren für die Herstellung heterologer Polypeptide, insbesondere von nicht-humanen Carbonylhydrolasen.
  • Daher werden mehrfach ungesättigte Fettsäure enthaltende Lipide, welche aus mikrobieller Biomasse gemäß im Fachbereich bekannten Verfahren isoliert werden, an oxidationsstimulierende Bedingungen ausgesetzt, welche die Qualität des Öls negativ beeinflussen.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein mikrobielles Öl bereitgestellt, das mindestens eine mehrfach ungesättigte Fettsäure (MUFS) umfasst, und das einen Triglycerid-Gehalt von 93 bis 97 % aufweist. Dieses Öl erwies sich als besonders stabil im Vergleich mit MUFS-haltigen Ölen des Stands der Technik. Die MUFS wird durch einen oder mehrere Mikroorganismen produziert, Geeigneterweise in einem Fermentationsverfahren. Die MUFS wird durch verschiedene Verfahrensschritte aus der Biomasse zurück gewonnen, welche im Wesentlichen das aus dem Fermentationsverfahren resultierende Material ist, in welchem die MUFS gebildet wird.
  • Da das Öl der vorliegenden Erfindung mikrobiell abgeleitet werden kann, ist ersichtlich, dass dieses Öl nicht synthetische Öle umfasst. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, nimmt der Anmelder an, dass es eine Reihe von Erklärungen dafür geben kann, warum das Öl der vorliegenden Erfindung stabiler ist als die vor der vorliegenden Erfindung beschriebenen.
  • Das Öl kann eine oder mehrere Verbindungen enthalten, welche in der Biomasse vorhanden waren. Dabei können mehrere dieser Verbindungen als Antioxidans fungieren. Alternativ oder zusätzlich hierzu, können eine oder mehrere der Verbindungen eine oder mehrere oxidierende (oder prooxidante) Substanzen, welche in dem Öl vorhanden sind, inaktivieren (teilweise, oder zumindest unterdrücken).
  • Eine Reihe von Substanzen kann für die Verschlechterung von MUFS-haltigen Ölen verantwortlich sein. Diese schließen Metalle ein, welche als Katalysatoren fungieren können, zum Beispiel Kupfer, Eisen und/oder Zink. Andere ähnliche Metalle können als Radikalbildner fungieren. Andere verschlechternde Einflüsse sind Licht und Wärme. Es kann eine oder mehrere Substanzen geben, welche zum Beispiel in der Lage sein können, mit einem dieser Metalle einen Komplex zu bilden, oder diese können als Radikalfänger fungieren.
  • Alternativ kann das Verfahren für den Erhalt des Öls der Erfindung eine oder mehrere oxidative oder oxidationsverursachende Substanzen entfernen, welche ursprünglich in der Biomasse vorhanden waren.
  • Man nimmt an, dass die Verschlechterung besonders hoch ist, wenn die MUFS ARA ist, und daher kann eine Substanz in dem Öl die Verschlechterung dieser MUFS unterdrücken oder verändern.
  • Das Verfahren für den Erhalt des Öls der Erfindung, das später ausführlicher beschrieben wird, kann die Bildung einer teilchenförmigen Granulatform oder gar von getrocknetem Granulat beinhalten, was die MUFS innerhalb des Granulats oder von Granulatformen für die Atmosphäre, und insbesondere Sauerstoff weniger zugänglich machen kann, wodurch die Chancen einer Oxidation verringert werden.
  • In dem Verfahren der Erfindung kann der Sterol-Gehalt verringert werden, so dass die maximale Menge an Sterolen (wie 5-Desmosterol) 1,5-Gew.-% ist.
  • Das Öl kann daher einen oder mehrere Radikalinhibitoren, Radikalfänger und/oder Antioxidanzien enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein mikrobielles, mehrfach ungesättigte Fettsäure (MUFS) enthaltendes Öl mit einem hohen Triglycerid-Gehalt und einer hohen Rancimat-Induktionszeit (zum Beispiel mindestens 5 Stunden bei 80°C). Die mehrfach ungesättigte Fettsäure kann eine C18-, C20- oder C22-ω-3 und C18-, C20- oder C22-ω-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure sein. Vorzugsweise ist diese eine C20- oder C22-ω-3 oder eine C20-ω-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure. Insbesondere ist die MUFS Arachidonsäure (MUFS), Eicosapentaensäure (EPA), Docosahexaensäure (DHA). Beispiele für solche Öle sind Arachidonsäure enthaltendes Öl aus Mortierella oder ein Docosahexaensäure enthaltendes Öl aus Crypthecodinium.
  • Das Öl der Erfindung kann vorteilhafterweise in Nahrungsmitteln, Lebensmitteln oder Nahrungsmittelzusammensetzungen verwendet werden oder als ein Nahrungsergänzungsmittel für Menschen sowie für Tiere dienen. Zusätzlich kann das Öl der Erfindung in Kosmetika verwendet werden. Die körnigen Teilchen können oder das Granulat kann als Nahrungsmittel- oder Futtermittelzusammensetzung oder -ergänzung Verwendung finden.
  • Das Öl der vorliegenden Erfindung enthält eine oder mehrere mehrfach ungesättigte Fettsäuren und hat einen Triglycerid-Gehalt von 93 bis 97 %. Dieses Öl verfügt über eine viel höhere oxidative Stabilität als die im Fachbereich beschriebenen mikrobiellen, mehrfach ungesättigte Fettsäure enthaltenden Öle.
  • Das Öl der Erfindung hat vorzugsweise einen Triglycerid-Gehalt von ≥ 95 %.
  • Dieses kann weiter eine Rancimat-Induktionszeit aufweisen, welche ≥ 5 Stunden bei 80°C ist, vorzugsweise ein Induktionszeit von 5–16 Stunden bei 80°C. Noch geeigneter kann es eine Induktionszeit von 7– 16 Stunden bei 80°C, gegebenfalls eine Induktionszeit von 10–16 Stunden bei 80°C aufweisen. Die Rancimat-Induktionszeiten werden bei einer Temperatur von 80°C gemessen, da diese Temperatur für mehrfach ungesättigte Fettsäuren enthaltende Öle besser geeignet ist. Wenn diese bei 100°C gemessen wird, kann das Öl der Erfindung eine Induktionszeit von 3–5 Stunden haben.
  • Es sollte darauf hingewiesen werden, dass die Rancimat-Induktionszeit des Öls der Erfindung ohne das Vorhandensein von exogen hinzugefügten stabilisierenden Verbindungen, wie Antioxidanzien, gemessen wird. Das Vorhandensein von stabilisierenden Additiven in einem Öl erhöht ganz eindeutig dessen Rancimat- Induktionszeit. Stabilisierende Additive, wie Antioxidanzien, können aus Hinzufügungen zu bestimmten Schritten des Ölrückgewinnungsverfahrens, zum Beispiel zu dem Medium, in welchem der Mikroorganismus gezüchtet wird, oder aus Hinzufügungen zu dem Öl selbst stammen. Der Rancimat-Test beinhaltet das Erwärmen der Substanz, während Luft darüber geblasen wird. Wenn die Substanz oxidiert, nimmt deren Gewicht zu, und in der Regel tritt eine Oxidation relativ schnell nach einer bestimmten Zeit auf. Diese Zeit kann daher einen Hinweis geben für die Stabilität der Substanz gegenüber Oxidation.
  • Zusätzliche Charakteristika des Öls der Erfindung können einen niedrigen Diglycerid-Gehalt, vorzugsweise von unter 2 %, und/oder einen niedrigen Monoglycerid-Gehalt von vorzugweise unter 0,1 % einschließen. Es kann eine helle Farbe haben, ein geringes Maß an Beigeschmack und/oder einen niedrigen Anisidin-Wert (Anisidin ist ein Test für Aldehyde, ein Abbauprodukt durch Oxidation).
  • Der Anisidin-Wert variiert typischerweise von 0,1 bis 5, vorzugsweise von 0,1 bis 2, stärker bevorzugt von 0,1 bis 1. Die Farbe des Öls der Erfindung ist typischerweise gelb bis hellgelb.
  • Das mikrobielle Öl der Erfindung ist typischerweise ein solches, welches vorwiegend (oder nur) eine spezielle mehrfach ungesättigte Fettsäure enthält, welches aber weiterhin kleinere Mengen anderer mehrfach ungesättigter Fettsäuren enthalten kann. Die vorliegende Erfindung zieht ebenfalls mikrobielle Öle in Betracht, in welchen mehr als eine mehrfach ungesättigte Fettsäure vorhanden ist.
  • Die mehrfach ungesättigten Fettsäuren, welche in dem mikrobiellen Öl der Erfindung vorliegen können, sind C20-ω-3 und C18-, C20- und C22-ω-6 mehrfach ungesättigte Fettsäuren. Insbesondere schließen diese γ-Linolensäure (GLA), Dihomo-γ-Linolensäure (DLA), Arachidonsäure (ARA), Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA) ein.
  • Die mikrobielle Biomasse, aus welcher das Öl der Erfindung erhalten wird, kann irgendeinen Typ eines Mikroorganismus umfassen oder davon stammen, welcher imstande ist, ein MUFS-haltiges Öl zu produzieren, zum Beispiel ein Bakterium, eine Hefe, einen Pilz oder eine Alge (oder eine Mischung davon).
  • Zum Beispiel kann Öl der Erfindung Docosahexaensäure (DHA), die vorzugsweise aus Algen oder Pilzen erhalten wird, umfassen. Algen schließen Dinoflagellaten (z. B. der Gattung Crypthecodinium) ein. Der Pilz kann von der Gattung Mucorales, z. B. Thraustochytrium sein, γ-Linolensäure (GLA), Dihomo-γ-linolen oder Arachidonsäure (ARA) können vorzugsweise aus Pilzen, wie Mortierella, Pythium oder Entomophthora erhalten werden, oder ein Eicosapentaensäure-(EPA)-haltiges Öl kann vorzugsweise aus Algen, wie Porphyridium oder Nitzschia isoliert werden. Typischerweise enthalten die aus diesen Organismen erhaltenen Öle vorwiegend eine bestimmte mehrfach ungesättigte Fettsäure. Allerdings können diese weiterhin andere mehrfach ungesättigte Fettsäuren in geringeren Mengen enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Isolieren des mehrfach ungesättigte Fettsäure enthaltenden Öls des ersten Aspekts der Erfindung aus mikrobieller Biomasse; hier kann die mikrobielle Biomasse vor der Extraktion des Öls vorbehandelt werden. Gemäß den relativ milden Bedingungen des Vorbehandlungsverfahrens werden die wärme- und oxidationsempfindlichen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren, die in dem Öl vorhanden sind, möglicherweise nicht eine Verschlechterung verursachenden Bedingungen ausgesetzt.
  • Mithin wird gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für den Erhalt eines Öls bereitgestellt, welches mindestens eine mehrfach ungesättigte Fettsäure (MUFS) aus einer mikrobiellen Biomasse (welche Organismen umfasst, die die MUFS gebildet haben) umfasst, wobei das Verfahren Folgendes einschließt:
    • a) Bereitstellen oder Erhalt einer Biomasse mit einem Trockengehalt von 25 bis 80 %;
    • b) Granulieren der Biomasse in körnige Teilchen;
    • c) Trocknen der körnigen Teilchen, so dass getrocknetes Granulat entsteht; und;
    • d) Extrahieren oder Isolieren des Öls aus dem getrockneten Granulat.
  • Vorzugsweise hat die teilchenförmige Granulatform einen durchschnittlichen Trockengehalt von 30 bis 70 %. Das aus (c) resultierende getrocknete Granulat hat geeigneterweise einen durchschnittlichen Trockengehalt von mindestens 80 %.
  • In einem dritten Aspekt wird ein Verfahren für die Isolation von einer oder mehreren Verbindungen aus einer mikrobiellen Masse bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
    • a) Züchten von Mikroorganismen in einer Fermentationsbrühe unter Bedingungen, durch welche die Verbindung gebildet wird (durch die Mikroorganismen);
    • b) Pasteurisieren entweder der Fermentationsbrühe oder einer mikrobiellen Biomasse, die von der Brühe abgeleitet ist; und
    • c) Extrahieren, Isolieren oder Rückgewinnung der Verbindung aus der mikrobiellen Biomasse.
  • Die Pasteurisierung in (b) soll zumindest teilweise eine oder mehrere die Substanz verschlechternde Verbindungen inaktivieren, welche in der Biomasse oder Brühe vorhanden sein können. Solche Substanzen können Proteine, wie Enzyme (z. B. Proteasen) einschließen. Insbesondere versucht man, zumindest teilweise Lipasen, Phospholipasen und/oder Lipoxygenasen zu inaktivieren.
  • Die Verbindung umfasst vorzugsweise ein Triglycerid, wie eines der zuvor genannten MUFSs.
  • Die Pasteurisierung beendet üblicherweise die Fermentation. Vorzugsweise erfolgt diese Pasteurisierung vor irgendeinem Granulieren (oder Zerbröseln oder Kneten). Geeigneterweise wird die Pasteurisierung mit der Fermentationsbrühe durchgeführt, obwohl diese mit der aus der Brühe erhaltenen mikrobiellen Biomasse durchgeführt werden kann.
  • Vermutlich können mindestens einige der Substanzen, welche eine Verschlechterung der Verbindung (wie eine MUFS) bewirken können, mit einer Pasteurisierung vermieden werden. Diese Pasteurisierung kann zumindest teilweise zu den MUFSs von hoher Qualität beitragen, welche durch die vorliegende Erfindung erhalten werden können.
  • Mithin kann die Pasteurisierung vorteilhaft sein, weil sie nicht nur den Mikroorganismus abtöten kann, sondern was viel wichtiger ist, ein oder mehrere Enzyme inaktivieren kann, welche die Verbindung nachteilig beeinflussen können. Zum Beispiel kann eine Pasteurisierung verschiedene Lipasen inaktivieren, und diese können Fettsäuren von einem Triglycerid-Grundgerüst abspalten. Dies ist für MUFSs von Nachteil, wo ein hoher Triglycerid-Gehalt bevorzugt ist.
  • Nach der Pasteurisierung aber vor der Extraktion in (c) kann man ein Granulieren (für den Erhalt körniger Teilchen) und Trocknen der körnigen Teilchen wie weiter oben in den Stufen (b) und (c) gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung beschrieben durchführen. Bevorzugte Merkmale eines Aspekts der Erfindung sind ebenso, wo zutreffend, auf andere Aspekte anwendbar.
  • In dem Verfahren der Erfindung wird der Mikroorganismus zuerst unter Bedingungen fermentiert, die die Bildung der mehrfach ungesättigten Fettsäure oder -säuren, die gebildet werden sollen, erlauben.
  • Solche Fermentationsverfahren sind im Fachbereich allgemein bekannt: Der Mikroorganismus wird in der Regel mit einer Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zusammen mit einer Reihe zusätzlicher Chemikalien oder Substanzen zugeführt, welche das Wachstum des Mikroorganismus und/oder die Bildung der MUFS ermöglichen. Geeignete Fermentationsbedingungen sind in Beispiel 22 angegeben.
  • Das aus der Fermentation resultierende Material (welches häufig als die Brühe bezeichnet wird) kann danach filtriert werden oder auf eine andere Weise behandelt werden, um zumindest einen Teil der wässrigen Komponente zu entfernen. Geeigneter weise wird ein großer Anteil des Wassers entfernt, um einen Biomassekuchen zu erhalten. Die Biomasse hat in dieser Stufe vorzugsweise einen Trockengehalt von 25 bis 80 %. Die Biomasse kann dann zu körnigen Teilchen granuliert werden. Dies wird vorzugsweise durch Extrusion erreicht. Jedoch, welche Technik auch immer für die Granulierung gewählt wird, es ist bevorzugt, dass die Zellzerstörung entweder verhindert oder minimiert wird. Die körnigen Teilchen können danach getrocknet werden. Das Granulat kann die Effizienz des nachfolgenden Trocknungsschritts signifikant erhöhen. Das resultierende (getrocknete) Granulat ist danach besonders geeignet für eine Eintauch- oder Perkolations-Extraktion. Die Teilchengrößen des Granulats können für optimales Trocknen und Extraktionszusätze eingestellt werden.
  • Die Granulationsbedingungen (wie diejenigen eines Extrusionsverfahrens) werden vorzugsweise so gewählt, dass sie die Zerstörung der mikrobiellen Zelle minimieren. Dies kann die Beständigkeit gegenüber Verschlechterung erhöhen, da die nicht zerstörte Zelle häufig die beste Form des Schutzes vor einer oxidativen Verschlechterung der intrazellulär lokalisierten mehrfach ungesättigten Fettsäure ist.
  • Vorzugsweise wird die MUFS aus dem getrockneten Granulat unter Verwendung eines Lösungsmittels extrahiert. Es kann jegliches geeignete Lösungsmittel, das dem Duchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt ist, zum Einsatz kommen. Jedoch wird geeigneterweise ein nicht-polares Lösungsmittel verwendet, zum Beispiel ein C1-6-Alkan, zum Beispiel Hexan. Es ist auch möglich, Lösungsmittel in einem superkritischen Zustand zu verwenden, zum Beispiel flüssiges Kohlendioxid.
  • Das Verfahren der Erfindung kann eine kostenwirksame und effiziente Extraktion des PUPA-Öls ermöglichen und ein Öl mit einer besonders hohen Qualität bereitstellen. Zum Beispiel gibt einem die getrocknete Granulatform (der Biomasse) die Möglichkeit, das Perkolations-Extraktionsverfahren anzuwenden, welches besonders effizient ist. Weiterhin lässt das Granulat die Verwendung einer relativ niedrigen Temperatur für die Extraktion zu, was nicht notwendigerweise die Ausbeute der MUFS verringert. Darüberhinaus kann das getrocknete Granulat verringerte Mengen an Lösungsmittel für das Extraktionsverfahren erfordern. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Freisetzung des eingesetzten Lösungsmittels aus der Biomasse effizienter erreicht werden kann (dieses Verfahren wird häufig als Desolventisierungs-Toasten bezeichnet).
  • Der nach der (Lösungsmittel-) Extraktion (und sogar dem Desolventisierungs-Toasten) erhaltene Rückstand kann als Futtermittel oder als eine Futterkomponente (wie für Tiere) genutzt werden.
  • Die MUFS (Öl), welche extrahiert wurde, kann in diesem Zustand ohne weitere Verarbeitung verwendet werden, oder sie kann einem oder mehreren weiteren Raffinierungsschritten unterworfen werden. Da das MUFS-Öl, welches aus dem getrockneten Granulat extrahiert wird, eine relativ hohe Qualität besitzt, wird jegliches nachfolgende Raffinieren, das notwendig ist, nicht nur leichter gemacht, sondern kann auch minimiert werden. Das Raffinieren des Öls kann mit Hilfe von Standardtechniken durchgeführt werden. Zum Beispiel kann das Öl einer Entgummierung, Entsäuerung, einem Bleichen und/oder einer Deodorisierung unterworfen werden. Das MUFS enthaltende Öl der vorliegenden Erfindung hat einen Triglycerid-Gehalt von 93 % bis 97 %. Es ist besonders geeignet für Nahrungsmittelzwecke. Es kann daher zu Nahrungsmitteln (entweder zu dem Endnahrungsmittel oder zugesetzt während der Herstellung des Nahrungsmittels) hinzugefügt werden. Es kann als Nahrungsergänzungsmittel dienen, zum Beispiel wenn es in einer geeigneten Kapsel, zum Beispiel einer Gelatinekapsel, verkapselt wird. Das MUFS-Öl kann daher in Nahrungsmittelzusammensetzungen entweder für Menschen oder Tiere verwendet werden. Beispiele schließen Milch, Gesundheitsgetränke und Brot ein. Die Öle der Erfindung sind besonders geeignet für den Einschluß in Säuglingsfertignahrung. Darüber hinaus können die Öle in Kosmetika verwendet werden.
  • Ein dritter Aspekt der Erfindung betrifft daher eine Zusammensetzung, welche das mikrobielle Öl des ersten Aspekts umfasst. Diese Zusammensetzung kann ein Nahrungsmittel oder ein Futtermittel oder ein Nahrungsergänzungsmittel entweder für Menschen und/oder für Tiere sein. Eine solche Zusammensetzung, wenn es sich um eine Nahrungsmittelzusammensetzung handelt, ist vorzugsweise eine Säuglingsfertignahrung. Alternativ kann diese eine kosmetische Zusammensetzung sein.
  • Durch die Verwendung von getrocknetem Granulat der Biomasse kann eine höhere Ausbeute als erwartet von der Verbindung, die isoliert werden soll, erreicht werden. Dies, so nimmt man an, ist auf die Struktur des Granulats zurückzuführen, welche den Zugang des Lösungsmittels, das für die Extraktion verwendet werden soll, maximieren kann. Selbstverständlich kann, wenn die Teilchen zu groß sind, der Oberflächenbereich geringer sein, was zu einer entsprechend geringeren Ausbeute führt. Allerdings sollten die Teilchen nicht zu klein sein, da anderenfalls diese den Filter verstopfen können, welcher während der Extraktion zum Einsatz kommt. Aus diesem Grund schlieft das Verfahren der Erfindung nicht einen Mahl-, Flockungs- oder einen Feinzerkleinerungsschritt oder -stufen ein.
  • Der Wassergehalt in verschiedenen Stufen kann ebenfalls die Ausbeuten beeinflussen. Ein zu hoher Trockengehalt, und die Biomasse zerkrümelt und kann Feinstteilchen oder Staub bilden, was von Nachteil ist, wenn ein Filtrations-Extraktionsverfahren zum Einsatz kommt. Allerdings erhält man bei einem zu hohen Wassergehalt eine Aufschlämmung, welche zu feucht ist, um zu Granulat verarbeitet zu werden.
  • Verfahren zum Granulieren von Substanzen sind im Fachbereich bekannt. Allerdings werden diese häufig mit einem Mahlen oder Flocken in irgendeiner Stufe kombiniert, was die oben stehend erläuterten Nachteile mit sich bringt. In der vorliegenden Erfindung ist es das getrocknete Granulat, welches für die Extraktion der Verbindung verwendet wird, und nicht eine gemahlene oder geflockte Form. Zusätzlich kann durch eine Granulation eine Beschädigung der Zellen in der Biomasse minimiert werden, was wiederum zur Erhöhung der Ausbeuten der Verbindung beitragen kann. In der US 5 340 594 wird die Extrusion einer Biomasse offenbart, doch wird hier die extrudierte Form als eine Tiernahrung genutzt: Es gab keine Einschätzung darüber, dass die Granulatform hohe Ausbeuten bei einer Extraktion einer speziellen Verbindung aus der Granulatform ergeben würde.
  • Durch Verarbeiten der Biomasse zu körnigen Teilchen kann man das Trocknungsverfahren unterstützen. Das Trocknen kann wesentlich einfacher und effizienter sein, nachdem die Biomasse zu einer Granulatform verarbeitet worden ist.
  • Ferner stellte es sich heraus, dass das getrocknete Granulat besonders stabil ist, insbesondere bei Umgebungs- oder Raumtemperaturen. Die Biomasse kann für eine beträchtliche Zeitdauer in dieser Form ohne eine Verschlechterung aufbewahrt werden. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird vermutet, dass es dazu kommt, weil die Verbindung sich innerhalb des Granulats befindet und daher zumindest teilweise vor der Umgebung geschützt wird, die für bestimmte Verbindungen eine Verschlechterung durch Oxidation bewirken kann.
  • Das getrocknete Granulat stellt, wie festgestellt wurde, ein besonders stabile Form von Biomasse dar. Dieses kann über Wochen gelagert werden, wenn nicht über Jahre (z. B. bei Raumtemperaturen), mit geringer oder ohne Verschlechterung oder geringen oder ohne Veränderungen von deren Eigenschaften. Dies bedeutet, dass die Verbindung(en), die es enthält, ebenfalls in beständiger Weise gelagert werden können (oder sogar transportiert werden können). Darüber hinaus kann diese bei Raumtemperatur gelagert werden, was das Erfordernis des Einfrierens oder der Lagerung bei besonders niedrigen Temperaturen umgeht, was der Fall ist für Biomassematerialien des Stands der Technik. Ganz klar ist eine solche Stabilität von Vorteil, da die Lagerungsbedingungen wesentlich billiger sind.
  • Das bevorzugte Verfahren zum Granulieren der Biomasse ist die Extrusion. Diese kann die Zerstörung der Zellen minimieren. Die Stabilität der Biomasse erwies sich als besser bei einer minimalen Zerstörung der Zellen, mit anderen Worten, das Verfahren der Erfindung kann eingestellt werden, um die Zahl der Zellen zu optimieren, die intakt bleiben. Dies steht im Gegensatz zu zahlreichen Extraktionen des Stands der Technik, in welchen die Zellen zerstört werden, um die Verbindung zu isolieren.
  • Ein Verfahren, das mit der vorliegenden Erfindung angewandt werden kann, betrifft die Isolierung von einer oder mehreren MUFSs aus Biomassegranulat, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • a) Bereitstellen von getrocknetem Granulat mit einem Trockengehalt von mindestens 80 %, wobei das Granulat von einer mikrobiellen Biomasse abgeleitet wurde, welche Mikroorganismen umfasst, die eine MUFS produziert haben; und
    • b) Extrahieren oder Isolieren der oder jeder MUFS aus dem getrockneten Granulat durch Lösungsmittel-Extraktion.
  • Das bevorzugte Extraktionsverfahren ist der Einsatz eines Lösungsmittels, in welchem geeigneterweise die Verbindung löslich ist. Das bevorzugte Extraktionsverfahren ist die Anwendung einer Perkolation: Hier kann das Lösungsmittel über eine Granulatschicht geleitet werden. Für diese Technik wird geschätzt, dass die Teilchen nicht zu klein sein sollten (zum Beispiel sollten sie nicht gemahlen oder fein zerkleinert werden), da man anderenfalls man zu viel „Staub" (oder Feinstpartikel) erhält, welcher den Filter verstopft. Große Teilchen sind ebenfalls zu vermeiden, doch zwischen diesen zwei Extremen kann man einen optimalen Oberflächenbereich erhalten, so dass vorzugsweise das Granulat größer ist als die Poren des Filters. Die Teilchen sind vorzugsweise hoch porös um einen leichten Zugang des Lösungsmittels zu der zu extrahierenden Verbindung zu ermöglichen.
  • Die Vorbehandlung von mikrobiellem Biomassekuchen zur Bildung von körnigen Teilchen kann das nachfolgende Trocknungsverfahren signifikant verbessern. Die resultierende getrocknete granulierte Biomasse kann besonders geeignet sein entweder für die Eintauch- oder die Perkolations-Extraktion. Die Teilchengröße kann spezifisch für optimale Trocknungs- und Extraktionsbedingungen eingestellt werden. Durch den Einsatz von Biomasse, die gemäß der Erfindung vorbehandelt wurde, wird die gewünschte Verbindung vorteilhafterweise extrahiert ohne das Erfordernis, die Zellen vor der Extraktion zu zerstören.
  • Das Verfahren der Erfindung kann zur Herstellung von körnigen Teilchen oder getrocknetem Granulat aus nahezu jedem Typ von Mikroorganismus verwendet werden. Der Mikroorganismus kann in Filamentform vorliegen, wie Pilze oder bestimmte Bakterien, oder als einzelne Zellen, wie Hefen, Algen und Bakterien. Somit kann die Biomasse Mikroorganismen umfassen, welche Hefen, Pilze, Bakterien oder Algen sind. Bevorzugte Pilze sind von der Ordnung Mucorales. Zum Beispiel kann der Pilz von der Gattung Mortierella, Phycomyces, Blakeslea oder Aspergillus sein. Bevorzugte Pilze sind von der Spezies Mortierella alpines, Blakeslea trispora und Aspergillus terreus.
  • Was Hefen angeht, so sind diese vorzugsweise von der Gattung Pichia, wie von der Spezies Pichia ciferrii.
  • Bakterien können von der Gattung Propionibacterium sein.
  • Wenn die Biomasse eine Alge umfasst, ist diese vorzugsweise ein Dinoflagellat und/oder gehört zu der Gattung Crypthecodinium. Bevorzugte Algen sind von der Spezies Crypthecodinium cohnii.
  • Die Verbindung, die von der mikrobiellen Biomasse, welche gemäß der Erfindung hergestellt wird, isoliert werden soll, kann intrazellular angeordnet sein, verbunden mit der Zellmembran oder Zellwand, oder extrazellulär gebildet werden (sie kann dann in Wasser unlöslich sein).
  • Die zu isolierende Verbindung kann entweder hydrophil oder hydrophob (z. B. lipophil) sein. Beispiele für solche Verbindungen sind intrazelluläre Proteine oder Enzyme, Lipide, sekundäre Metabolite wie Vitamine (z. B. Vitamin B12), Makrolid- oder Polyen-Antibiotika, aromagebende Substanzen oder Karotenoide. Vorzugsweise ist die aus mikrobieller Biomasse zu isolierende Verbindung eine lipophile Verbindung.
  • Die aus der Biomasse, die gemäß der Erfindung behandelt wird, extrahierte Verbindung kann von hoher Qualität sein, da sie wenig, falls überhaupt, einer Verschlechterung ausgesetzt war aufgrund der milden Bedingungen, die in dem Behandlungsverfahren angewandt werden. Daher ist die Erfindung besonders geeignet für die Herstellung von mikrobieller Biomasse, aus welcher wärme- und/oder oxidationsempfindliche Verbindung(en) isoliert werden müssen.
  • Der zweite Aspekt der Erfindung ist für die Herstellung mikrobieller Biomasse für die Isolierung von Verbindungen mit einem hohen Grad an Ungesättigtheit geeignet, wie Lipide, welche mehrfach ungesättigte Fettsäuren (MUFS) enthalten. Vorzugsweise ist die HUFS eine C18-, C20- oder C22-ω-3 oder -ω-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure. Zum Beispiel kann die Verbindung Docosahexaensäure (DHA) (aus Algen oder Pilzen, wie das Dinoflagellat Crypthecodinium oder der Pilz Thraustochytrium), γ-Linolensäure (GLA), Dihomo-γ-linolen oder Arachidonsäure (ARA) (aus Pilzen, wie Mortierella, Pythium oder Entomophthora) oder Eicosapentaensäure (EPA) (aus Algen, wie Porphyridium oder Nitzschia) sein. Es können jegliche dieser MUFSs entweder allein oder, was üblicher ist, in der Form eines Lipids isoliert werden.
  • Weitere Beispiele für Verbindungen, welche isoliert werden können, schließen β-Karotin, wie aus pilzlichen Gattungen, z. B. von der Ordnung Mucorales, z. B. Phycomyces oder Blakeslea, Astaxanthin aus der Hefe Phaffia Rhodozyma, Tetraacetyl-Phytosphingosin (TAPS) aus der Hefe Pichia ciferrii, und/oder Vitamin B12 Propionibakterien ein.
  • Andere Verbindungen, die extrahiert werden können, schließen lipophile/nicht-polare, wie Lovastatin, Cyclosporin und Laidlomycin, ein. Von diesen werden die ersten zwei entweder extrazellulär produziert oder sind mit der Zellwand verbunden. Geeignete Lösungsmittel schließen daher Heptan, Hexan, Aceton, Methanol und Toluol sowie Ethanol ein. Jedoch kann man für die letzten zwei Verbindungen Isopropyl-Alkohol oder Butylacetat für Cyclosporin, und Ethanol oder Methanol für Laidlomycin verwenden. Allgemein gesprochen ist Hexan für lösliche Antibiotika geeignet, wie jene, die von den Organismen der Gattung Streptomyces produziert werden.
  • Andere Verbindungen schließen Polyketide, oder Metabolite, die von Polyketiden abgeleitet sind, ein, was zahlreiche Antibiotika einschließt. Bevorzugte Polyketide sind jene, die nicht Stickstoff enthalten, und können aromatisch sein, und enthalten vorzugweise mindestens einen 6-gliedrigen Ring. Bevorzugte Polyketide sind Statine, was Lovastatin, Simvastatin, Pravastatin und Compactin einschliesst. Andere bevorzugte Verbindungen sind HMG-CoA-Reduktaseinhibitoren. Diese können Cholesterol-Spiegel im Blut senken.
  • Eine andere Klasse von Verbindungen, die extrahiert werden können, schließen Steroide und Sterole, wie Ergosterol, ein. Diese werden von Hefen und Schimmel produziert.
  • Die gemäß dem Verfahrenden Verfahren Zusammensetzungen der Erfindung isolierten Verbindungen eignen sich für den Einsatz in menschlichen oder tierischen Nahrungsmitteln (z. B. Säuglingsfertignahrung) oder anderen eßbaren Zusammensetzungen, sowie in Kosmetika, Gesundheitspflegezusammensetzungen oder Ergänzungsmitteln oder pharmazeutischen Zusammensetzungen.
  • In dem Verfahren der Erfindung kann der Mikroorganismus der Wahl zuerst fermentiert werden, um eine ausreichende Menge an Biomasse für die nachfolgende Extraktion der Verbindung zu erhalten. Die Fermentationsbedingungen hängen von dem verwendeten Organismus ab und können für einen hohen Gehalt der Verbindung in der resultierenden Biomasse optimiert werden.
  • Nach Beendigung des Fermentationsverfahrens kann die Fermentationsbrühe in Abhängigkeit von dem Typ der zu isolierenden Verbindung pasteurisiert werden, um den Produktionsorganismus abzutöten und um jegliche unerwünschte Enzyme zu inaktivieren. Falls gewünscht, können Ausflockungsmittel und/oder andere Verfahrenshilfsmittel der Brühe zur Verbesserung ihrer Filtrierbarkeit hinzugefügt werden.
  • Geeignete Flockungsmittel schließen CaCl2, Al2(SO4)3 und polare kationische Polyamide ein. Diese können mit 0,1 bis 2-Gew.-% vorliegen.
  • Vorzugsweise wird die Biomasse (oder Brühe) pasteurisiert. Nach der Fermentation kann eine Pasteurisierung notwendig sein, um eine Aufschlämmung zu erhalten, welche auf hygienische Weise verarbeitet werden kann. Die Pasteurisierung von Biomasse im Fermenter kann mehrere Vorteile haben. Erstens wird der Produktionsorganismus nicht an die Umwelt ausgesetzt. Ferner können unerwünschte enzymatische Aktivitäten, welche die Qualität der Zielverbindung beeinflussen, inaktiviert werden.
  • Je nach der Spezies des Produktionsorganismus wird die Pasteurisierung bei Temperaturen von 60 bis 100°C durchgeführt. Die Pasteurisierung kann durch Erwärmen (direkt) mit Dampf in den Fermenter oder durch (indirektes) Erwärmen unter Einsatz eines Mediums mittels Wärmetauschern entweder durch die Wand oder mit Kühlschlangen oder einem externen Wärmetauscher, wie bekannten Plattenwärmetauschern oder anderen geeigneten Wärmetauschern, durchgeführt werden.
  • Die folgenden bevorzugten Pasteurisierungsbedingungen können angewandt werden, insbesondere für Organismen von der Gattung Mortierella.
  • Die Fermentationsbrühe (oder Biomasse) wird pasteurisiert, um den Mikroorganismus abzutöten und um Enzymaktivität zu inaktivieren. Dies kann etwa 144 Stunden nach der Inokulation des Hauptfermenters erfolgen. Die Biomasse (oder Brühe) wird geeigneterweise bei 50 bis 95°C, vorzugsweise 60 bis 75°C, und optimalerweise zwischen 63 bis 68°C pasteurisiert. Dies kann 30 bis 90 Minuten, vorzugsweise 50 bis 75 Minuten, optimalerweise 55 bis 65 Minuten dauern. Dabei kann es sich um jedwede geeignete Heizungseinrichtung handeln, doch handelt es sich vorzugsweise um eine direkte Dampfeinleitung, wie in den Hauptfermentationsbehälter.
  • Nach der Pasteurisierung lässt man die Brühe abkühlen oder sie wird abgekühlt. Dies kann etwa 4 Stunden, geeigneterweise auf etwa 25°C, beanspruchen.
  • Wenn zwei oder mehrere Organismen aus unterschiedlicher Biomasse oder unterschiedlichen Fermentationsbrühen beteiligt sind, kann jede Biomasse (oder Brühe) einzeln pasteurisiert werden, oder diese können nach dem Mischen pasteurisiert werden.
  • Allerdings ist das Erstgenannte bevorzugt, da unterschiedliche Pasteurisierungsbedingungen dann für die unterschiedlichen Organismen angewandt werden können.
  • In der Regel erfolgt die Pasteurisierung in dem Fermentationsbehälter, in welchem die Fermentation stattgefunden hat. Allerdings ist es für einige Organismen (wie Bakterien) häufig bevorzugt, die Mikroorganismen zuerst aus dem Kessel zu entfernen und dann zu pasteurisieren (zum Beispiel vor dem Sprühtrocknen in einem Agglomerations-Granulationsverfahren).
  • Wie eingeschätzt, tötet die Pasteurisierung in der Regel die meisten, wenn nicht alle der Mikroorganismen ab. Daher wurden in dem getrockneten Granulat mindestens 95 %, wie mindestens 98 %, wenn nicht 95 %, der Mikroorganismen abgetötet (das heisst, diese sind nicht mehr lebendig).
  • Für einige Organismen (z. B. Pichia) wird vorzugsweise keine Pasteurisierung durchgeführt.
  • Um eine erneute Kontamination von pasteurisierter Biomasse während der nachfolgenden Verarbeitungsschritte zu verhindern, können Bedingungen gestaltet werden, um das Risiko von Wachstum zu verringern. Eine Möglichkeit ist das Ansäuern der Brühe mit einer geeigneten Säure. – Um den Auswuchs zahlreicher mikrobieller Spezies zu verhindern, ist ein PH-Bereich von 3 bis 4 in Kombination mit einer niedrigen Verfahrenstemperatur ausreichend.
  • Auch können andere Biostatikmittel, wie Alkohole, Sorbate etc. für diesen Zweck eingesetzt werden.
  • Für thermisch stabile Produkte kann eine Verarbeitung bei höheren Temperaturen (60–100°C) angewandt werden.
  • Vorzugsweise sind die Ansäuerungsbedingungen (z. B. für Organismen von der Gattung Mortierella) wie folgt.
  • Der pH-Wert der pasteurisierten Brühe wird auf 2 bis 5 eingestellt, um die mikrobiologische Stabilität zu verbessern, vorzugsweise auf einen pH-Wert im Bereich von 3 bis 4, und optimalerweise einen pH-Wert von etwa 3,5.
  • Die Ansäuerung der Brühe (vor oder nach der Pasteurisierung) kann weitere Vorteile haben. Wenn die Verbindung ein Polyketid ist, zum Beispiel ein Statin, kann die Ansäuerung zu einer Ausfällung der Verbindung führen. Für zahlreiche Verbindungen, insbesondere wasserlösliche, ist eine Ausfällung vor weiteren Verarbeitungsschritten erwünscht, damit die Verbindung nicht verloren geht, wenn die Brühe zur Entfernung von Wasser filtriert wird. Daher kann vor oder nach der Pasteurisierung eine Verbindung ausgefällt werden (wie durch Ansäuerung, obwohl jegliches andere Mittel, das dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, zum Einsatz kommen kann).
  • Der pH-Wert kann durch irgendein geeignetes Mittel eingestellt werden, z. B. 85%-ige Phosphorsäure, vorzugsweise verdünnte 55%-ige Phosphorsäure und optimalerweise mit verdünnter 33%-iger Phosphorsäure.
  • In dieser Stufe hat man eine Brühe, welche möglicherweise pasteurisiert worden ist. Die nächste Stufe ist der Erhalt einer Biomasse durch Abtrennen der Mikroorganismen von dem umgebenden Medium.
  • Eine Fest/Flüssig-Trennungstechnik kann zum Trennen der Biomasse von der Fermentationsbrühe durchgeführt werden. Diese (gewonnene) Biomasse hat in der Regel einen Trockengehalt, der von 20 bis 35 % in Abhängigkeit vom Typ des Mikroorganismus variiert.
  • Allerdings sollte für die Extrusion (und das nachfolgende Trocknen) die Biomasse typischerweise einen Trockengehalt haben, welcher im Bereich von 25 % bis 80 % liegt.
  • Wenn der Wassergehalt der Biomasse zu hoch ist (z. B. für die Extrusion und/oder nachfolgende Trocknung) kann diese entwässert werden und/oder es kann deren Trockengehalt erhöht werden. Dies kann durch eine Reihe von Verfahren erreicht werden. Zuerst kann die Biomasse einer (zusätzlichen) Entwässerung unterzogen werden. Es kann jegliches dem Fachmann auf dem Gebiet bekannte Entwässerungsverfahren angewandt werden; der gewünschte Trockengehalt kann 25 oder 30 bis 80 % betragen.
  • Vorzugsweise kommt ein mechanisches Entwässerungsverfahren zur Anwendung. Der maximale Trockengehalt, welcher durch mechanische Entwässerung erreicht werden kann, variiert jedoch in Abhängigkeit von dem Typ des Mikroorganismus. Für bestimmte Mikroorganismen, z. B. Hefe, darf der Trockengehalt der Biomasse nach der mechanischen Entwässerung einen Anteil von 35 bis 40 % nicht überschreiten, während das gleiche Verfahren, durchgeführt mit Biomasse von bestimmten lipid-reichen Mikroorganismen, zu einem höheren Trockengehalt von 45 bis 60 führen kann.
  • Ein bevorzugtes Verfahren ist der Einsatz einer Membranfilterpresse (Platten- und Rahmenfilterpresse mit sich zusammenpressenden Membranen), was eine Fest/Flüssig-Trennung mit mechanischer Entwässerung kombinieren kann und sich besonders dafür eignet, den gewünschten Trockengehalt zu erhalten.
  • Alternativ oder zusätzlich hierzu kann der gewünschte Trockengehalt der mikrobiellen Biomasse durch die Hinzufügung von konsistenzerhohenden (oder Trocknungs-) Mitteln erhöht werden. Diese konsistenzerhöhenden Mittel sind geeigneterweise trocken und beeinträchtigen vorzugsweise nicht das Extraktionsverfahren und/oder die Eigenschaften der Verbindung. Zum Beispiel können konsistenz-erhöhende Mittel Stärke und/oder Pflanzenfasern, wie Hafer oder Weizenkleie oder Zellulose umfassen. Selbst eine andere Biomasse (mit einem geringeren Wassergehalt) kann verwendet werden. Solche Substanzen können auf irgendeine Art hinzugefügt werden, wenn dies die Extrudierbarkeit verbessert.
  • Manchmal, z. B. nach der Fest/Flüssig-Trennung und/oder der mechanischen Entwässerung, kann die Biomasse große Kuchen bilden. Dies ist möglicherweise für die Granulation (z. B. Extrusion) nicht zweckmäßig. Um die Biomasse auf eine Größe zu verringern, welche die Granulation ermöglichen kann (z. B. eine effiziente Zufuhr in den Extruder) wird die Biomasse in geeigneter Weise zerkrümelt, geknetet und/oder gemischt. Dieses Zerkrümeln und/oder Kneten kann durch (kurze) Behandlung in einem Hochschermischer erreicht werden. Optional kann das oder jedes konsistenzerhöhende Mittel während dieses Teil des Verfahrens hinzugefügt werden.
  • Die dann vorliegende (gegebenenfalls zerkrümelte oder geknete) Biomasse kann anschließend dem Granulationsverfahren unterworfen werden, was zu Bildung von körnigen Teilchen führt. Die Granulation kann auf einer Reihe von unterschiedlichen Wegen bewirkt werden.
  • Ein weiteres Verfahren zur Verringerung des Wassergehalts (oder zur Erhöhung des Trockengehalts) ist die Verwendung einer Spülung mit einem Salz (z. B. Kochsalzlösung), entweder der Biomasse oder (vorzugsweise) nach der Abtrennung der Biomasse von der Brühe, wie die Anwendung einer Waschfiltration.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die gewünschte Teilchenstruktur und -größe durch ein Extrusionsverfahren erhalten. Die Teilchencharakteristika, wie die Struktur und Größe, können von Bedeutung sein, um das Trocknungs- und/oder Extraktionsverfahren zu optimieren. Während des Trocknungsschritts können die Teilchen, wenn diese zu klein sind, zu Problemen führen, da sie Staub und Feinstpartikel erzeugen können, wohingegen zu große Teilchen nicht verwirbeln und zu einer schlechten Trocknungsleistung führen können. Während der Extraktion kann eine zu kleine Granulatgröße möglicherweise nicht die Anwendung eines Perkolationsverfahrens zulassen, da der Druckabfall über der Biomasseschicht zu hoch sein wird. Zu viele Feinstpartikel können Probleme in den nachfolgenden Reinigungsschritten entstehen lassen. Ein zu große Größe kann das effiziente Eindringen von Lösungsmittel während der Extraktion behindern. Darüber hinaus sollte die Teilchenstruktur ausreichend kompakt sein, um ein Aufbrechen während des Trocknens und der Extraktion zu verhindern, doch besitzen die Teilchen (getrocknetes Granulat) vorzugsweise eine Porosität, welche ein (effizientes) Eindringen von Lösungsmittel während der Extraktion erlaubt.
  • Die Extrusionsbedingungen können durch einen Fachmann so eingestellt werden, dass körnige (Biomasse-) Teilchen mit der gewünschten Struktur und Größe erhalten werden.
  • Die Extrusionsbedingungen können eingestellt werden, um die Zellzerstörung zu minimieren. Eine minimale Zellzerstörung kann einen optimalen Schutz von labilen, oxidationsempfindlichen Verbindungen gegenüber einer durch Oxidation induzierten Verschlechterung schützen. Die Extrusion wird daher vorzugsweise bei niedrigeren Temperaturen durchgeführt, ohne irgendein Mittel zum Erwärmen. Vorzugsweise geschieht dies im Bereich von 20 bis 30°C, wie etwa bei Raumtemperatur. Während der Extrusion können sich die körnigen Teilchen auf natürliche Weise bilden, wobei das "Extrudat" unter seinem eigenen Gewicht von der Düsenplatte durch den Einfluss der Schwerkraft abfällt, wodurch Teilchen gebildet werden. Wenn jedoch die Biomasse von einer Beschaffenheit ist, durch welche nach der Extrusion durch die Düsenplatte lange Stränge wie Spaghetti gebildet werden, können die Spaghetti zerschnitten werden unter Erhalt von Teilchen mit einer gewünschten Größe.
  • Die Temperatur der Biomasse beeinflusst, wie festgestellt wurde, die Beschaffenheit der körnigen Teilchen, die bei der Extrusion gebildet werden. Vorzugsweise hat die Biomasse eine Temperatur von 6 bis 15°C vor der Extrusion. Jedoch kann im Extruder die Temperatur der Biomasse auf 10 bis 60°C ansteigen, obgleich diese vorzugsweise 15 bis 30°C ist. Der Temperaturanstieg hängt von dem auf die Biomasse ausgeübten Druck und von deren Trockengehalt ab.
  • Während der Extrusion wird die Biomasse in der Regel durch eine Trommel zu der Düsenplatte hin gepresst, und zwar häufig durch eine Schnecke. Diese Trommel wird vorzugsweise nicht erwärmt. De facto ist es vorteilhaft, dass diese gekühlt wird. Geeigneterweise beträgt die Temperatur des Kühlmittels (z. B. eine wässrige Lösung wie Wasser) 1 bis 4°C, wie etwa 2°C.
  • Allgemein gesprochen verändert die Extrusion den Wassergehalt nicht. Dies liegt daran, weil in der Stufe (b) der Trockengehalt der gleiche ist wie in der Stufe (a). Hingegen verändern, wie man einsehen wird, andere Granulationstechniken (wie die später beschriebenen) den Wassergehalt und können diesen verringern (mit anderen Worten, sie erhöhen den Trockengehalt). Für eine Biomasse, welche einen Pilz, beispielsweise der Ordnung Mucorales, enthält (insbesondere einen, welcher eine MUFS produziert) ist der Trockengehalt der Biomasse in (a), welche in der Regel die gleiche ist wie bei den körnigen Teilchen, die bei einer Granulierung erzeugt werden (in diesem Fall Extrusion), geeigneterweise zwischen 35 und 60 %, vorzugsweise 50 bis 60 %. Nach dem Trocknen hat das trockene Granulat vorzugsweise einen Trockengehalt von mindestens 90 %, wie mindestens 95 %.
  • Die bevorzugte Granulationstechnik ist der Einsatz eines Extruders. Ein guter Überblick über Extruder ist von W. Pietsch („Size Enlargement by Agglomeration (Erhöhung der Größe durch Agglomeration): Wiley & Sons 1991, Seite 385) angegeben. Das Gerät kann ein Chargenextruder oder ein kontinuierlicher Extruder sein. Für kontinuierliche Extruder können einfache Einschneckenextruder (sowohl axialer als auch radialer Transport) genannt werden. Auch gibt es Doppelschneckenextruder, die entweder im Gleichdrall betrieben werden oder gegenläufig sind. Die zu extrudierende Biomasse wird transportiert, teilweise kompaktiert und durch eine perforierte (Düsen-)Platte gepresst. Eine weitere Gruppe von Extrudern schliesst Pelletisierungsmaschinen ein. Hier rollt ein zylindrisches Presswerkzeug über eine Schicht aus auf einer perforierten Platte abgeschiedem Material.
  • Wenn das Granulat durch Extrusion erhalten wird, muss die Biomasse in einer extrudierbaren Form vorliegen. Der Wassergehalt kann bei Bedarf eingestellt werden, je nach dem Zustand der Biomasse, den eingesetzten Mikroorganismen und den Extrusionsbedingungen. Wasser kann entweder entfernt werden, oder der Trockengehalt kann erhöht werden durch die Zugabe von Festsubstanzen, zum Beispiel von Stärke. Die Biomasse kann auf diese Weise auf die korrekte Konsistenz eingestellt werden, welche in der Regel diejenige einer Paste ist.
  • Obwohl das Granulat für die Extraktion der Verbindung verwendet werden kann, ist es zusätzlich eine stabile Form der Biomasse, die gelagert werden kann. Das Granulat kann andere Verwendungszwecke haben: Zum Beispiel kann es bei der Herstellung von Säuglingsfertignahrung genutzt werden, wobei die Biomasse eine oder mehrere mehrfach ungesättigte Fettsäuren (MUFSs) enthält.
  • Die vorliegende Erfindung zieht auch andere Granulationsverfahren in Betracht, welche die Bildung von (körnigen) Teilchen ermöglichen. Zum Beispiel kann ein mehrstufiges Trocknungsverfahren eine Kombination aus Sprühtrocknen und einer Wirbelschicht umfassen und kann auch körnige Teilchen ergeben.
  • Andere Typen von Granulationstechniken können zum Einsatz kommen. Allgemein ist die Granulation der Vorgang des Erhalts von Feststoffen in einer Granulatform entweder durch Erhöhung der Größe oder Verringerung der Größe. Im Allgemeinen wird eine Erhöhung der Größe angewandt. Ein guter Überblick über den Typ der Granulationsverfahren, die zur Verfügung stehen, ist bei W. Pietsch („Size Enlargement by Agglomeration": Wiley & Sons 1991, wie oben) beschrieben. Innerhalb von diesem gibt es zahlreiche unterschiedliche Techniken, die für die Granulation zur Verfügung stehen, und dies schliesst mehrere Agglomerationsverfahren ein, welche beschrieben werden. Hier führt die Agglomeration zu kleinen Teilchen, welche aneinander haften (agglomerieren) unter Bildung großer Teilchen (in diesem Fall der körnigen). Aus diesem Grund kann, wenn eine erste Technik dazu führt, dass die Teilchen zu klein sind, eine Agglomerationstechnik angewandt werden, um größere (körnige) Teilchen zu ergeben.
  • Eine Trommelagglomeration wird in der Regel mit Hilfe eines Trommelns erreicht und/oder mit Hilfe einer Rotationstrommel oder eines Kegeltrockners mit einem Pulver mit Hafteigenschaften (so dass die Teilchen aneinander haften). In einigen Fällen kann ein extra hinzugefügtes Bindemittel damit vermischt werden. Durch diesen Mechanismus können kugelförmige Teilchen gebildet werden.
  • Die Druckagglomeration ist in der Regel durch hohe Kräfte charakterisiert, welche auf eine Masse aus einer Teilchensubstanz einwirken. Im Allgemeinen wird dieses Verfahren mit feinen Pulvern oder mit "plastischen" (nicht-elastischen) Materialien durchgeführt. Dieses Verfahren wird normalerweise für pulverförmige Materialien angewandt. (Jedoch wird es ebenfalls bei der Herstellung von Trockenhefe für Teige mit einer bestimmten Konsistenz eingesetzt). Die geformten Teilchen können auf einen geeigneten Trockengehalt für die optimale Aufbewahrung getrocknet werden. Die Druckagglomeration kann durch einen Kolben, eine Walze, isotaktische und/oder Extruderpressen bewerkstelligt werden. Eine gute Beschreibung dieses Gerätschaftstyps ist in dem weiter oben genannten Buch von Pietsch angegeben.
  • Extrusionspressen machen in der Regel von der Wandreibung Gebrauch, wobei ein Widerstand gegenüber der Strömung des plastischen Materials durch Bohrlöcher und Düsen mit offenem Ende erzeugt wird. Insbesondere bei Schneckenextrudern erfolgt ein intensives Mischen, und es werden hohe Scherkräfte angewandt.
  • Im Allgemeinen können Materialien mit niedrigen Schmelz- oder Erweichungstemperaturen direkt agglomeriert werden.
  • Andere Agglomerationstechniken sind möglich. Zum Beispiel ein Sprühtrocknen in Kombination mit einem Wirbelschicht-Agglomerator. Zu Beginn kann die Biomasse durch Zerstäubung durch eine Düse oder unter Einsatz eines Drehrads in einem Sprühtrockner getrocknet werden. Feine Teilchen werden in den Sprühabschnitt recycelt. Das resultierende klebrige Pulver wird weiter in einem Wirbelschichtabschnitt agglomeriert. In einigen Fällen kann eine Neubefeuchtung des Pulvers das Agglomerationsverfahren verbessern. Diese beschriebene Technik ist als mehrstufiges Trocknen bekannt.
  • Um das mehrstufige Trocknen ausführlicher zu beschreiben, wird die Biomasse zuerst sprühgetrocknet. Dies kann zu einem feinen Pulver führen. Die Temperatur des Sprühtrocknens (Lufteinlasstemperatur) ist in der Regel 160°C bis 260°C und/oder die Luftauslasstemperatur ist 75 bis 90°C. Hier wird die Biomasse durch eine schnell rotierende Scheibe oder eine Düse, welche kleine Teilchen erzeugt, gesprüht. Die Teilchen können dann unter der Schwerkraft auf den Boden eines Sprühtrocknungsturms fallen. Hier kann eine Wirbelschicht vorgesehen sein, welche Heißluft verwenden kann, um das Trocknen zu bewirken (geeigneterweise bei 90 bis 95°C). Hier kann die Agglomeration erfolgen, und die Teilchen können zusammenkleben. Im Anschluß werden die agglomerierten (körnigen) Teilchen einem Trocknen unterworfen, zum Beispiel auf einer Förderband-Trocknungsschicht oder auf einer Subwirbelschicht. Zu Beginn des Verfahrens kann eine Biomasse einen Trockengehalt von unter 30 % aufweisen. Nach dem Sprühtrocknen kann dieser auf 75 bis 90 % ansteigen, und nach der Agglomerisierung kann dieser 90 bis 95 % betragen. Nach dem Trocknen kann dieser auf mindestens 95 % ansteigen.
  • Eine weitere Technik ist die Verwendung eines Wirbelschicht-Agglomerators. Hier kann Pulver in einem Gasstrom verwirbelt werden. In der Teilchenschicht wird ein Fluid mit Wasser besprüht, welches das Pulver feucht macht und die Agglomeration verstärkt.
  • Im Allgemeinen sind die beschriebenen Agglomerationsverfahren für Trockenpulver gedacht, welche erweicht werden können. Eine Ausnahme ist das Trocknen auf einem mehrstufigen Trockner. Diese Kombination des Sprühtrocknens in Kombination mit einer Wirbelschicht-Nachtrockner eignet sich für die Agglomeration zahlreicher verschiedener Typen von Biomasse. Allerdings ist das Verfahren nicht immer für wärmelabile Produkte oder Produkte, die gegenüber Oxidation durch (Heiss-)Luft empfindlich sind, geeignet. Ein guter Weg zur Herstellung einer körnigen Trocken-Biomasse ist die Extrusion eines mechanisch entwässerten Filterkuchens, gefolgt von einem geeigneten Trocknungsschritt, wie einem Wirbelschicht- oder Subwirbelschicht-Trocknen.
  • Ein weiterer Weg der Agglomeration von (getrockneter) Biomasse kann durch das erneute Benetzen von (sprüh)getrocknetem Produkt durchgeführt werden, gefolgt von einem Extrusionsschritt und einem erneuten Trocknen, z. B. in einem Wirbelschicht-Trockner. Pulver mit einem niedrigen Schmelzpunkt oder einer niedrigen Erweichungstemperatur (oder im Falle bestimmter getrockneter Biomassen mit einer hohen Menge an intrazellulärem Öl, welches teilweise schmilzt aufgrund der in dem Extruder wirkenden Kräfte) können extrudiert werden. Geeignete Pellets bilden sich in der Düsenplatte.
  • Wie in (c) weiter oben kann die (extrudierte oder anderweitig) granulierte Biomasse getrocknet werden, geeigneterweise unter Bedingungen, welche ein Intaktbleiben der Teilchen ermöglichen. Die Teilchenstruktur und -größe der Biomasse nach dem Granulationsverfahren soll das effiziente Trocknen der Biomasse ermöglichen. Das Trocknen kann mit Hilfe verschiedener Trockner, z. B. einem Bandtrockner, einem Vakuum- oder einem Vakuum-Bandtrockner, einem Wirbelschicht- oder einem Subwirbelschicht-Trockner durchgeführt werden. Der Fachmann kann zwischen einem satzweisen oder einem kontinuierlichen Verfahren wählen.
  • Der Einsatz eines Wirbelschicht- oder Subwirbelschicht-Trockners ist besonders bevorzugt in dem Verfahren der Erfindung. Das Trocknen kann in Luft oder unter Stickstoff erfolgen. Mit einem Wirbelschicht- und Subwirbelschicht-Trocknen kann die Temperatur in der Schicht auf voreingestellte Werte angepasst werden. Diese Werte können in einem weiten Bereich liegen, zum Beispiel von 35° bis 120°C, wie 50 bis 90°C, gegebenenfalls von 60 bis 80°C. Wenn eine labile Verbindung von der Biomasse isoliert werden muss, kann die Temperatur des Trocknungsverfahrens leicht auf die niedrigeren Bereiche eingestellt werden, um das Risiko einer Oxidation oder einer Verschlechterung zu mindern.
  • Alternativ oder zusätzlich kann ein Vakuum-Trocknungsverfahren angewandt werden, z. B. mit 1 bis 2 Stunden.
  • Mehrere Vorteile können sich aus dem Trocknungsschritt ergeben. Erstens kann das Trocknen der Biomasseteilchen (unter Bildung von Granulat) zu einem Zwischenprodukt führen, welches in stabiler Weise über einen langen Zeitraum gelagert werden kann. Hier kann ein (relativ) hoher Trockengehalt der Biomasse eine Verschlechterung der Verbindung, die von der Biomasse isoliert werden soll, verhindern. Auf diese Weise kann das getrocknete Granulat als eine stabile Formulierung der Verbindung angesehen werden, die innerhalb der Biomasse vorliegt oder mit dieser verbunden ist.
  • Zum Beispiel kann das Granulat als Träger für ein Enzym fungieren, wodurch das Enzym innerhalb des Granulats durch Mischen einer geeigneten Menge eines Vernetzungsmittels, z. B. Glutaraldehyd, in die Biomasse vor der Extrusion immobilisiert werden kann.
  • Weiterhin kann das getrocknete Granulat in vorteilhafter Weise so wie es ist, eingesetzt werden, zum Beispiel als Nahrung oder als Futtermittelzusammensetzung oder Additiv.
  • Die Teilchen und/oder das Granulat (z. B. durch Extrusion hergestellt) können die folgenden Eigenschaften haben.
  • Das Granulat kann die Form von Schokoladen-Konfetti haben. Der Durchmesser des (extrudierten) Granulats kann von 0,1 bis 12 mm, wie von 0,3 bis 10 mm schwanken. Stärker bevorzugt ist dieser 1,5 mm bis 6 mm und optimalerweise (für die Extraktion im Trockenzustand) ist der Durchmesser 2 bis 3 mm. Die Länge des Granulats kann etwa das 2- bis 5- oder 6-Fache des Durchmessers betragen. Es kann dann leicht beim Verpacken gehandhabt werden und mit kommerziell verfügbaren Extraktoren verwendet werden (um die Durchlässigkeit der Schicht zu garantieren). In der Regel hat der größte Teil, wenn nicht im Wesentlichen das ganze Granulat die gleiche Größe, und in der Tat kann man überaus gleichmäßiges oder homogenes Granulat erhalten, wo mindestens 80 %, wie mindestens 90 % des gesamten Granulats eine spezielle Eigenschaft innerhalb des spezifizierten Bereichs aufweisen.
  • Das Granulat ist vorzugsweise frei fließend. Dieses kann eine in etwa zylinderförmige Form haben. Dies lässt sich mit Hilfe einer Extrusion erreichen. Die Teilchen können dann einen Durchmesser haben, welcher ungefähr der gleiche ist (obwohl dieser etwas größer sein kann) wie die Löcher der für die Extrusion gewählten Düsenplatte. Während dieses Verfahrens können Teilchen sich automatisch beim Verlassen der Düsenplatte bilden. In diesem Fall ist die Länge der Teilchen variabel. Allerdings kann die Teilchenlänge zum Beispiel beeinflusst werden, wenn man ein Schneidegerät einsetzt, zum Beispiel ein Messer (z. B. ein oder mehrere in der Nähe der Düsenplatte befindliche rotierende Blätter), woraufhin die meisten (wenn nicht alle) der Teilchen im Wesentlichen dieselbe Länge haben werden. Bevorzugte Längen solcher Teilchen sind mindestens 2 mm, wie mindestens 3 mm. Geeigneterweise hat das Granulat eine Größe und einen Wassergehalt, welche ein "Schütten" von diesem erlaubt, was eine leichtere Lagerung und Transport von diesem ermöglicht. Obwohl allgemein gesprochen die meisten Teilchen ein längliche Beschaffenheit haben, können einige in etwa kugelförmig sein. Der bevorzugte Lipidgehalt des Granulats ist vorzugsweise 30 bis 50-Gew.-%.
  • Die Schüttdichte des Granulats ist in der Regel 400 bis 1100 kg/m3.
  • Wie bereits erläutert wurde, ist das Granulat vorzugsweise porös, um einen Zugang des Lösungsmittels zu der zu extrahierenden Verbindung zu erlauben. Vorzugsweise besitzt das Granulat hohle Kanäle, und diese können sich in Richtung zu und in das Zentrum des Granulats erstrecken. Die Zahl der Kanäle kann derart sein, dass 40 bis 60 %, wie 45 bis 55 %, optimalerweise etwa 50 %, auf Volumenbasis des Granulats, hohl sind (Luft). Was die Kanäle angeht, so können diese eine Länge des 10- bis 20-Fachen von derjenigen ihres durchschnittlichen Durchmessers haben. Das Granulat ist allgemein gesprochen homogen in seiner Zusammensetzung, dadurch, dass das Äußere des Granulats im Wesentlichen das gleiche Material ist wie dasjenige im Zentrum. Dies steht im Gegensatz zu den Hefezusammensetzungen des Stands der Technik, welche ein relativ festes Äußeres haben, jedoch einen relativ luftigen Kern besitzen.
  • Das Granulat kann in beständiger Weise bei einer Temperatur gelagert werden, die optimal ist für die am Ende zu extrahierende Verbindung.
  • Der bevorzugte Trockengehalt des getrockneten Granulats ist mehr als 80 %, stärker bevorzugt mindestens 85 %; am meisten bevorzugt mindestens 90 %, und liegt optimalerweise im Bereich von 93 bis 97 %. Wenn ein wassermischbares Lösungsmittel für die Extraktion genutzt werden soll, kann Granulat mit einem niedrigeren Trockengehalt verwendet werden.
  • Das (getrocknete) Granulat ist daher in der Regel porös, sodass bei der Extraktion verwendete Lösungsmittel einen leichten Zugang zu dem (Inneren des) Granulat(s) erlangen können. Somit kann während der Extrusion und des Trocknens die Menge an Staub minimiert werden (was die Ausbeute erhöht), und dadurch kann eine zusätzliche Filtration des (Lösungsmittel-) Extrakts vor der Eindampfung des Extrakts vermieden werden.
  • Die Porosität des Granulats hängt von dem (Wasser- oder) Trockengehalt der körnigen Teilchen ab. Häufig wird das Wasser in den körnigen Teilchen beim Trocknen verdunstet, wodurch eine (hohle) Pore zurückbleibt. Die Porosität des getrockneten Granulats ist vorzugsweise 15 bis 50 %, wie 20 bis 40 %, optimalerweise 25 bis 35 %.
  • Vorzugsweise ist der größte Teil (wenn nicht im Wesentlichen die Gesamtheit) der Zellen in dem Granulat intakt (das bedeutet, sie sind nicht zerbrochen). Das Granulat insbesondere von einer pilzlichen Biomasse kann vollständig aus Biomasseteilchen bestehen, welche einen Durchmesser von 0,3 bis 10 mm, vorzugsweise einen Durchmesser von 0,7 bis 5 mm, gegebenenfalls von 1 bis 3 mm haben. Üblicherweise bilden sich die Teilchen automatisch in der gewünschten Länge. Anderenfalls können die Teilchen auf die gewünschte Länge geschnitten werden. Wenn die Granulierung durch Extrusion erfolgte, können die Löcher in der Düsenplatte des Extruders allgemein den Durchmessern des Granulats entsprechen.
  • Gegebenenfalls können Antioxidanzien vor oder während des Granulierungsverfahrens hinzugefügt werden. Diese können Tocopherol und Ascorbylpalmitat, Z. B. mit bis zu 0,1 % (auf Gewichtsbasis) einschließen.
  • Ein Biomassematerial mit Charakteristika, welche eine kostengünstige und effiziente Extraktion von Verbindungen ermöglichen, wird auf diese Weise bereitgestellt. Die Verbindung(en), die vorliegt (vorliegen), kann (können) dann gereinigt, isoliert oder (vorzugsweise) extrahiert werden. Das Verfahren erlaubt die Anwendung eines Perkolations-Extraktionsverfahrens. Der durch dieses Extraktionsverfahren ermöglichte Vorteil ist anscheinend auf die Struktur und die Größe sowie einen hohen Trockengehalt zurückzuführen. Ein Trockenextrudat erfordert eine verringerte Menge an Lösungsmittel für die Extraktion der wertvollen Verbindung aus diesem. Außerdem kann das Verfahren des Desolventisierungs- Toastens, d. h. der Freisetzung von eingesetztem Lösungsmittel aus der Biomasse, besser und effizienter mit Biomasse in der Form eines Extrudats durchgeführt werden.
  • Der nach dem Verfahren des Desolventisierungs-Toastens erhaltene Extrudat-rückstand kann vorteilhafterweise als eine Futterkomponente genutzt werden.
  • Ein Trockengehalt des Extrudats von mehr als 90 bis 95 % kann eine stabile Lagerung des Extrudats ermöglichen, wohingegen ein Trockengehalt von über 85 % bereits einen signifikanten Vorteil in dem nachfolgenden Extraktionsverfahren ergeben kann.
  • Die Extraktion wird vorzugsweise unter Verwendung eines Lösungsmittels durchgeführt. Das eingesetzte Lösungsmittel hängt von der zu extrahierenden Verbindung ab, doch können insbesondere C1-10-Alkylester (z. B. Ethyl- oder Butylacetat), Toluol, C1-3-Alkohole (z. B. Methanol, Propanol) und C3-6-Alkane (z. B. Hexan) und/oder ein superkritisches Fluid (z. B. flüssiges CO2 oder superkritisches Propan) erwähnt werden. In den Techniken des Stands der Technik wurde das Lösungsmittel direkt auf die Mikroorganismen in der Brühe angewandt. Jedoch kann man durch die Durchführung einer Extraktion bei dem Granulat die Menge des erforderlichen Lösungsmittels signifikant verringern. In einigen Experimenten des Anmelders wurde 20- bis 30-mal weniger Lösungsmittel benötigt, um die Extraktion durchzuführen. Dies führt nicht nur zu einer signifikanten wirtschaftlichen Einsparung, weil weniger Lösungsmittel eingesetzt wird, sondern minimiert auch Emissionsprobleme. Durch die Verwendung von Granulat kann die für das Lösungsmittel verfügbare Oberfläche besonders hoch sein, und daher kann man gute Ausbeuten erzielen.
  • Wenn die Verbindung, die extrahiert werden soll, hydrophob ist, wird vorzugsweise ein apolares Lösungsmittel verwendet. Für hydrophile Verbindungen wird geeigneterweise ein polares Lösungsmittel (wie ein Alkohol) eingesetzt.
  • Die Extraktion kann unter Anwendung einer Vielzahl von Techniken durchgeführt werden. Das bevorzugte Verfahren ist die Perkolations-Extraktion unter Einsatz eines Filters. Hier kann eine Säule mit dem getrockneten Granulat gefüllt werden. Das Lösungsmittel (Hexan) wird dann hinzugefügt, um das Granulat zu bedecken. Obwohl das Lösungsmittel einmal durch die Säule und über das getrocknete Granulat geleitet werden kann, wird es vorzugsweise rezirkuliert (entweder als ein geschlossenes oder offenes System). Geeigneterweise wird das Lösungsmittel 3 bis 7 Mal, wie etwa 5 Mal, geeigneterweise während eines Zeitraums von einer halben Stunde bis zu eineinhalb Stunden, wie etwa einer Stunde, rezirkuliert. Die 3 zeigt eine geeignete Perkolations-Extraktions-Apparatur. Das Lösungsmittel wird in dem Behälter vor der Zugabe zu dem Perkolationsextraktor, welcher das getrocknete Granulat enthält, gehalten. Das Lösungsmittel wird mittels der Pumpe zirkuliert. Der Polierfilter soll Feinstpartikel entfernen.
  • Andere Perkolations-Extraktoren können zum Einsatz kommen. Diese können eine Gegenstrom- oder Querstromkonstruktion aufweisen. Bei den Erstgenannten kann das getrocknete Granulat in einem rotierenden Zylinder (wie einem Karussell), der in verschiedene Sektoren aufgeteilt ist, gehalten werden. Das Lösungsmittel wird durch das Granulat in einem Sektor in eine Richtung geleitet, und dann wird es (vorzugsweise in derselben Richtung) durch Granulat in einem anderen (wie einem benachbarten) Sektor geleitet. Diese Geräte werden häufig als Karussellextraktoren bezeichnet und sind von Kripp, Deutschland verfügbar.
  • Bei einer anderen Technik kann das Granulat zum Beispiel auf ein sich bewegendes (z. B. poröses) Band oder ein Förderband gegeben werden, welches sich im Wesentlichen in entgegengesetzter Richtung zu dem Lösungsmittel bewegt. Dies kann bedeuten, dass frisches Granulat mit Lösungsmittel extrahiert wird, das bereits durch anderes Granulat hindurchgeleitet wurde, und dass frisches Lösungsmittel auf Granulat angewandt wird, das zuvor mit dem Lösungsmittel extrahiert wurde. Diese Anordnung kann die Effizienz maximieren.
  • Bei einer Querstromtechnik werden getrennte Chargen des Granulats mit Portionen von frischem Lösungsmittel extrahiert.
  • Das Verfahren kann auch dazu angewandt werden, um eine Mischung von zwei oder mehreren Verbindungen aus unterschiedlichen Mikroorganismen zu erhalten durch Herstellung körniger Teilchen oder von Granulat aus einer Mischung von zwei oder mehreren Mikroorganismen. Diese Mischung von Mikroorganismen kann durch Mischen der Fermentationsbrühen von zwei oder mehreren unterschiedlichen Mikroorganismen erhalten werden, und zwar direkt nach Beendigung, oder durch Kombinieren der Biomasse von zwei oder mehreren Mikroorganismen unmittelbar vor der Granulation (z. B. Extrusionsverfahren). Es ist auch möglich, zwei oder mehrere verschiedene mikrobielle Extrudate vor dem Extraktionsverfahren zu vermischen.
  • Ein bevorzugtes Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann somit wie folgt aussehen:
    • a) Fermentieren von einem oder mehreren Mikroorganismen in einem geeigneten Medium unter Bedingungen, welche dem Mikroorganismus die Bildung der gewünschten Verbindung ermöglichen, was zu einer Brühe (der Mikroorganismen in dem umgebenden Medium) führen kann;
    • b) Falls notwendig, Ausfällen oder Verfestigen der Verbindung, wie durch Ansäuerung;
    • c) Abtrennen der Mikroorganismen von dem Medium in der Brühe, was durch Fest/Flüssig-Trennung, wie durch Filtration, erreicht werden kann, um eine Biomasse zu erhalten;
    • d) Pasteurisierung, entweder der aus (a) erhaltenen Biomasse oder der aus (c) erhaltenen Biomasse;
    • e) Falls notwendig, Erhöhen des Trockengehalts der Biomasse, Z. B. durch Hinzufügen von Trockenmasse oder trockenen Substanzen, oder durch Verringern des Wassergehalts, z. B. durch eine Entwässerungs- oder Trocknungstechnik;
    • f) Zerkrümeln und/oder Kneten der resultierende Biomasse (und gegebenenfalls Erhöhen des Trockengehalts durch Hinzufügen von einer oder mehreren trockenen Substanzen);
    • g) Granulieren der Biomasse, wodurch körnige Teilchen entstehen, wie durch Extrusion;
    • h) Trocknen der körnigen Teilchen, wodurch getrocknetes Granulat entsteht; und
    • i) Extrahieren von einer oder mehreren der Verbindungen, wie durch den Gebrauch eines geeigneten Lösungsmittels.
  • Die isolierten Verbindungen können von hoher Qualität sein und können für die Verwendung in menschlicher oder tierischer Nahrung geeignet sein. Insbesondere sind mehrfach ungesättigte Fettsäure (MUFS) enthaltende isolierte Lipide für Nahrungsmittelzwecke, insbesondere für die Einbringung in Säuglingsfertignahrung, geeignet.
  • Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele beschrieben, welche zu Erläuterungszwecken angegeben sind. Diesen sind die folgenden Zeichnungen beigefügt, in welchen:
  • die 1 eine Kurve der Temperatur und der Trockenmasse (%) gegenüber der Zeit ist, welche das Trocknungsverhalten unterschiedlicher Mengen von extrudierter Biomasse bei verschiedenen Temperaturen zeigt;
  • die 2 eine Kurve der Ölausbeute gegenüber der Temperatur ist, wie sie sich aus extrudierten Biomassen bei unterschiedlichen Temperaturen zeigt;
  • die 3 ein Fließdiagramm eines (bekannten) Perkolations-Extraktionsverfahrens ist; und
  • die 4 eine Kurve der Ölausbeute gegenüber der Zeit ist, welche das Verhältnis zwischen der extrahierten Menge an Öl und dessen Extraktionszeit zeigt.
  • BEISPIELE 1 BIS 6
  • Verarbeitung von Mortierella-Fermentationsbrühe
  • 160 l einer Fermentationsbrühe von Mortierella alpina, die zuvor pasteurisiert wurde (68°C während 1 Stunde) (palettisiertes Wachstum) wurden in einer standardmäßigen Dieffenbach-Platten- und Rahmenfilterpresse (Stoff-Typ: Nycot 2794) filtriert. Die Brühe wurde mit einem maximal angewandten Druck von 1,0 Bar filtriert. Innerhalb von 20 Minuten wurden 160 1 Brühe über einer Gesamtfilterfläche von 4,35 m2 filtriert, was in einer durchschnittlichen Strömung von etwa 110 l/m2h resultierte. Der Filterkuchen wurde mit etwa 3 Kuchenvolumina (= 150 l) Brauchwasser gewaschen.
  • Etwa 30 kg Nasskuchen wurden mit einem Trockengehalt von etwa 25 % erhalten. Es kamen drei Arten von Trocknungsverfahren zur Anwendung.
  • Vakuumtrocknen:
  • 10 kg Filterkuchen wurden unter Vakuum bei 35°C in einem Vakuum(etwa 50 mBar)-Plattentrockner bzw. Trockenschrank (etwa 1 m2 Trocknungsfläche) während 24 Stunden getrocknet, wodurch etwa 2,5 kg Trockenbiomasse mit einem Trockengehalt von etwa 94 % erhalten wurden. Die Trockenbiomasse bestand aus zerkrümelter Biomasse und einigen großen Klumpen. Das Vakuumtrocknen war zeitaufwändig, vermutlich wegen der großen Klumpen.
  • Ventilations-Plattentrockner:
  • 10 kg Filterkuchen wurden unter Stickstoff während 24 Stunden bei 35°C in einem Ventilations-Plattentrockner (etwa 1 m2 Trocknungsfläche) getrocknet. Insgesamt etwa 2,5 kg Trockenbiomasse wurden mit einem Trockengehalt von etwa 93 % rückgewonnen. Die Trockenbiomasse bestand aus zerkrümelter Biomasse und einigen großen Klumpen. Das Ventilationsplatten-Trocknen war zeitaufwändig, vermutlich wegen der große Klumpen.
  • Wirbelschicht-Trockner:
  • 5 kg Filterkuchen wurden in einem Wirbelbett-Trockner im Labormaßstab von AEROMATIC (Typ MP-1) bei einer Einlasslufttemperatur von etwa 200°C getrocknet. Die Austrittstemperatur war etwa 40°C. In etwa 45 Minuten wurde die nasse Biomasse getrocknet, wodurch etwa 1 kg Trockenbiomasse mit einem Trockengehalt von etwa 81 % erhalten wurde.
  • Das durch dieses letzte Verfahren rückgewonnene getrocknete Material wurde für die Extraktion von Öl mittels Hexan bei sechs unterschiedlichen Temperaturen verwendet (von daher die Beispiele 1 bis 6). 150 g der Trockenbiomasse wurden mit 1500 ml Hexan (bis zum Refluxieren erwärmt) unter einer Stickstoffdecke während 90 Minuten extrahiert. Die Zellmasse wurde abfiltriert und das Lösungsmittel in den resultierenden Micellen wurde in einem Rotationsverdampfer unter Vakuum verdampft. Dies führte zu einem MUFS-Rohöl. Die Resultate sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Extraktion bei Raumtemperatur ergab geringere Ausbeuten; bessere Ausbeuten wurden bei erhöhten Temperaturen erhalten. Tabelle 1 Extraktion von Öl aus Biomasse
    Experiment Nr. Biomasse/Hexan-Verhältnis Temperatur in °C Extraktionszeit in Minuten g Öl pro 100 g getrocknete Biomasse
    1 300 80 30 19,2
    2 100 23 30 16,4
    3 150 45 60 22,6
    4 200 23 120 17,1
    5 200 23 30 11,8
    6 100 23 120 13,5
  • Das Triglycerid-reiche Öl war ein helles gelbes Öl und enthielt etwas festes Material.
  • BEISPIEL 7 UND VERGLEICHSBEISPIEL 8
  • Verarbeitung von Mortierella-Fermentationsbrühe
  • 500 l Brühe (zuvor pasteurisiert wie in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben) wurden in einer Membranfilterpresse (SCHULE) bei einem Druckunterschied von etwa 0,5 Bar filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 10 Kuchenvolumina Brauchwasser gewaschen und danach während 30 Minuten bei 5,5 Bar zusammengepresst. Der erhaltene Kuchen hatte einen Trockengehalt von etwa 46 %. Der auf diese Weise zurückgewonnene Kuchen wurde in einem Pilotextruder (ODEKERKE, Durchmesser der Trommel 50 mm, trommelprofiliert) extrudiert. Die Düsenplatte hatte 10 Löcher mit einem Durchmesser von jeweils 1,6 mm. Insgesamt wurden 19 kg Filterkuchen in etwa 45 Minuten extrudiert.
  • Das auf diese Weise zurückgewonnene Extrudat wurde in einem Pilotanlagen-Wirbelschicht-Trockner (T4 AEROMATIC, 0,26 m2 Trocknungsfläche) getrocknet.
  • Innerhalb etwa 45 Minuten wurde das Extrudat bei 65°C getrocknet, was einen Trockengehalt von etwa 85 % ergab (Beispiel 7).
  • Während des gleichen Experiments wurde etwas Filterkuchen nicht extrudiert (Vergleichsbeispiel 8) und in einem Vakuum-Plattentrockner bei 40°C getrocknet. Das Trocknen war sehr zeitaufwändig wegen der großen Klumpen.
  • Beide Materialien wurden mit Hilfe von Hexan extrahiert. Die folgenden Charakteristika wurden bei den Materialien festgestellt:
    Getrocknetes Extrudat: Beispiel 7 hauptsächlich Pellets, Extraktionsverfahren ziemlich einfach
    Vakuumgetrocknete Biomasse: (Vergleichsbeispiel 8) Pellets und Klumpen, viele Feinstpartikel, Extraktionsverfahren schwierig; schlechte Filtrationseigenschaften
  • BEISPIELE 9 und 10
  • Extrusionsexperimente unter Verwendung derselben Brühe von Beispiel 7 wurden mit Hilfe der folgenden Extruder durchgeführt:
  • LALESSE (Arnheim, Niederlande):
  • In Beispiel 9 wurde ein LALESSE-Einzelschnecken-Universalextruder eingesetzt. Dieser Typ von Extruder wird normalerweise bei der Herstellung von Nahrungsmittel-Snacks eingesetzt. Gemahlener Mais (Trockengehalt etwa 95 %) wurde zuerst als ein Test in den Extruder zugeführt, und unter Druck und Erwärmung wurde der Mais extrudiert; nach dem Verlassen der Düse dehnte sich das Extrudat aus.
  • Die Trommel dieses Typs von Extruder war eine profilierte Trommel, um den verarbeiteten Mais zu transportieren. Der Typ der bei der Extrusion verwendeten Schnecke hängt von der Art des verarbeiteten Materials ab. Die Schnecke war eine universale Förderschnecke oder eine Kompressionsschnecke mit einem Durchmesser von 48 mm.
  • Das LALESSE-Gerät ist ein 7,5-KW-Pilotgerät (Antriebsleistung). Der Gesamtstrombedarf des Geräts ist 12,1 KW. Die Trommel des Extruders konnte erwärmt oder gekühlt werden. Düsenplatten mit 1 bis 4 Löchern mit Durchmessern von 1,8, 2,0 und 2,2 mm wurden während der Extrusion von Biomasse verwendet.
  • Die Kapazität für das Ausbreiten der Mortierella-Biomasse (gekühlte Trommel) war etwa 40 kg/h. Bei der Extrusion wurde das Länge/Durchmesser-(L/D)-Verhältnis des Lochs in der Düsenplatte variert.
  • ALMEX (Zutphen, Niederlande):
  • In Beispiel 10 wurde unter Verwendung der Mortierella-Biomasse von Beispiel 7 ein Expander-Extruder von der Firma ALMEX eingesetzt. Dieser Extrudertyp kommt bei der Herstellung von Haustiernahrung zum Einsatz. Dieser hatte eine glatte Trommel mit Stiften bzw. Nadeln, welche den Transport der Biomasse ermöglichten. Diese Stifte besitzen die gleiche Funktion wie die Profile in der Trommel des LALESSE-Extruders. Die Schnecke des Expander-Extruders war eine modulare Schnecke.
    Technische Daten: ALMEX Contivar 150 L/D von 10 (Verhältnis der Länge der Schnecke und des Durchmessers der Schnecke) Max. Schneckengeschwindigkeit 180 U/min 22 KW (Antriebsleistung) Schneckendurchmesser 150 mm Kühlung mit Leitungswasser Düsenplatten: 3 Ringe mit Löchern von jeweils 1,8 mm Durchmesser
  • Die Temperatur der Biomasse wurde auf etwa 25°C während der Verarbeitung angehoben. Die Leistung des Geräts war etwa 250 kg Mortierella-Extrudat pro Stunde.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 11
  • Vergleich Fest/Flüssig-Trennung, durchgeführt mit unterschiedlichen Verfahren
  • Dekantierapparat bzw. -gefäß:
  • 350 l Brühe, die aus einer Fermentation von Mortierella alpina erhalten wurden, wurden in dem "FLOTTWEG"-Dekantierapparat (Typ Z 23-3/441) dekantiert. Die Geschwindigkeit wurde auf etwa 4000 U/min eingestellt. Der Differenzialgeschwindigkeitsbereich wurde während des Betriebs von 7,5–20 U/min variiert.
  • Die Zufuhr wurde auf 400 l/h eingestellt. Die Biomasse wurde nicht gewaschen. Insgesamt wurden 350 l Brühe dekantiert. Die Temperatur der Zufuhr war 8°C und diejenige des Überstands war 15°C. Der Trockengehalt der zurückgewonnenen Biomasse war etwa 25 %.
  • Dekantierapparat + Vakuum-Trommelfilter:
  • 120 kg der Biomasse aus dem Dekantierapparat-Experiment weiter oben mit einem Trockengehalt von 25 % wurden in 500 l Brauchwasser suspendiert, in welchem 10 kg NaCl gelöst waren. Die resultierende Aufschlämmung wurde auf einem Vakuum-Trommelfilter mit Förderbandabwurf (PAXMAN, Stofftyp: 865.912 K/5 Polyprop) ohne weiteres Waschen filtriert. Die Geschwindigkeit der Trommel wurde auf 1 U/min und der Druckunterschied auf ein Maximum von 600 mBar eingestellt. Insgesamt wurden 400 l innerhalb von 15 Minuten filtriert. Die reine Filterfläche war etwa 0,3 m2, was zu einer durchschnittlichen Strömung von 5000 l/m2h (Filteroberfläche) führte. Die Filtrationsrate war sehr gut, doch die "Kuchenbildung" war ziemlich schlecht. Der Trockengehalt der zurückgewonnenen filtrierten Biomasse war etwa 35 %.
  • Platten- und Rahmen-Filterpresse:
  • 500 l Brühe wurden in einer Platten- und Rahmen-Filterpresse (Standard R&B, Stofftyp: Nycot 2794) filtriert. Die Brühe wurde mit einem Druckunterschied von 0,3 Bar filtriert. Innerhalb von 35 Minuten wurden 500 l Brühe über einer Gesamtfilterfläche von 5 m2 filtriert, was zu einer durchschnittlichen Strömung von ± 175 l/m2h führte. Der Filterkuchen wurde in 30 Minuten mit etwa 2,5 Kuchenvolumina Brauchwasser gewaschen, was zu einer durchschnittlichen Strömung von 400 l/m2h führte.
  • Der Kuchen wurde durch Luft 30 Minuten lang trockengeblasen, was zu einem Trockengehalt der zurückgewonnenen Biomasse von etwa 25 % führte.
  • Membranfilterpresse:
  • 700 l Brühe wurden in einer Membranfilterpresse (SCHULE, Stofftyp: Propex 46K2) filtriert. Die Brühe wurde mit einem Druckunterschied von 0,3 Bar filtriert. Innerhalb von 30 Minuten wurden 700 l Brühe über einer Gesamtfilterfläche von 6,8 m2 filtriert, was zu einer durchschnittlichen Strömung von etwa 205 l/m2h führte.
  • Der Filterkuchen wurde in 7 Minuten mit etwa 3 Kuchemvolumina (= 300 l) Brauchwasser gewaschen, was zu einer durchschnittlichen Strömung von 375 l/m2h führte.
  • Der Vorteil einer Membranfilterpresse gegenüber einer Platten- und Rahmen-Filterpresse ist, dass der Kuchen nach der Filtration bei hohem Druck zusammengepresst werden kann, sodass der Trockengehalt des Kuchens zunimmt. Der Kuchen wurde bei 5,5 Bar während 30 Minuten zusammengepresst, was zu einem Trockengehalt der zurückgewonnenen Biomasse von etwa 45 führte.
  • In einem weiteren Experiment wurden 1100 l Brühe in einer Membranfilterpresse (SCHULE, Stofftyp: Propex 46K2) filtriert. Die Brühe wurde mit einem Druckunterschied von 0,3 Bar filtriert. Innerhalb von 45 Minuten wurden 1100 l Brühe über eine Gesamtfilterfläche von 12,3 m2 filtriert, was zu einer durchschnittlichen Strömung von etwa 120 l/m2h führte. Der Filterkuchen wurde in 18 Minuten mit 3 Kuchenvolumina (= 600 l) einer 1%-igen NaCl-Lösung gewaschen, was zu einer durchschnittlichen Strömung von 162 l/m2h führte.
  • Der Kuchen wurde bei 6 Bar während 30 Minuten zusammengepresst, was zu einem Trockengehalt des zurückgewonnenen Filterkuchens von etwa 55 % führte.
  • Sowohl das Zusammenpressen als auch das Waschen des Kuchens mit einer 1%-igen Salzlösung hatte eine signifikante Auswirkung auf den Trockengehalt des Filterkuchens.
  • BEISPIEL 12
  • Extrusion von Biomasse mit unterschiedlichen Trockengehalten
  • Die Extrusion wurde mit Biomasse mit unterschiedlichen Trockengehalten durchgeführt, welche durch das in Beispiel 7 angegebene Verfahren erhalten wurden (siehe Tabelle 2). Die Extrusion wurde unter Verwendung eines Einzelschneckenextruders mit einer profilierten Trommel und einer Universalschnecke durchgeführt. Die in der Extrusion angewandten Düsenplatten hatten eine unterschiedliche Anzahl von Löchern und die Durchmesser der Löcher lagen im Bereich von 2 mm.
  • Der Durchmesser der nach der Extrusion erhaltenen Teilchen war etwa 2 mm.
  • Die Leistung und die Extrudatqualität hängen von dem Prozentsatz an Trockensubstanz bzw. Trockenmasse der Biomasse, der für die Extrusion verwendet wird, ab. Obwohl eine 25%-ige Trockensubstanz die schlechtesten Ergebnisse ergab, kann ein solcher niedriger Trockengehalt für andere Mikroorganismen akzeptabel sein. Tabelle 2. Resultate von Extrusionsexperimenten mit Biomasse mit unterschiedlichen Trockengehalten
    % Trockensubstanz Extrusionsleistung Qualität des Extrudats
    25 schlecht sehr klebriges Material
    35 gut klebriges Material
    45 sehr gut nicht klebriges Extrudat
    55 sehr gut loses Extrudat
  • BEISPIELE 13 UND 14 UND VERGLEICHSBEISPIEL 15
  • Trocknen von herkömmlicher und extrudierter Biomasse
  • von Mortierella alpina
  • Vakuumtrocknen:
  • Auf herkömmliche Weise zurück gewonnene Biomasse (Vergleichsbeispiel 15, nicht extrudiert) wurde in einem Vakuum-Plattentrockner getrocknet, aber es nahm etwa 50 Stunden bei 40°C in Anspruch. Das Trocknen erfolgte sehr langsam aufgrund von Klumpen. Der Trockengehalt der auf diese Weise getrockneten Biomasse war etwa 92,5 %.
  • Zum Vergleich wurden etwa 20 g Extrudat (von Beispiel 11, ⌀Teilchen von 2 mm) mit einem Trockengehalt von 55 % in einem Rotationsverdampfer im Labormaßstab getrocknet. Die Temperatur des Wasserbades war 68°C und der angewandte Druck war 40 mBar. Die Trocknungsleistung war angemessen, außer dass die getrocknete Biomasse an der Wand anhaftete und ein wenig Öl ausschwitzte. Der Trockengehalt nach dem Trocknen war 92,3 %.
  • Wirbelschicht-Trocknen:
  • In Beispiel 13 wurde das Trocknen mit Biomasse bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt. Wo keine Vorbehandlung der Biomasse erfolgt ist, wurden große Klumpen von Biomasse nicht völlig trocken. In diesem Fall war die getrocknete Biomasse sehr inhomogen, was die Teilchengröße angeht.
  • Wenn die Biomasse vor dem Trocknen durch Extrusion vorbehandelt wurde, verbesserte sich die Trocknungsleistung wesentlich. In diesem Fall war die Teilchengröße der getrockneten Biomasse gleichmäßiger.
  • Die Schlussfolgerung aus diesen Resultaten ist, dass das Wirbelschicht-Trocknen mit unterschiedlichen Formen von isolierter Biomasse durchgeführt werden kann, dass aber das Trocknen unter Verwendung eines Extrudats verbessert wird.
  • In einem weiteren Experiment (Beispiel 14) wurde das Trocknen von unterschiedlichen Mengen (15 und 30 kg) Extrudat in einem Wirbelschicht-Trockner mit Luft (8000 Nm3/m2h) durchgeführt. Während des Trocknens wurden Proben genommen, und der Trockengehalt wurde berechnet. In 1 ist das Verhältnis zwischen der Temperatur und dem Trockengehalt der (zwei) unterschiedlichen Mengen aufgeführt.
  • Die Schichttemperatur wurde auf 80°C eingestellt. Der Durchmesser der extrudierten Biomasse war 1,3 mm. Der Trockengehalt der extrudierten Biomasse nach dem Trocknen war etwa 96 %.
  • BEISPIEL 16
  • Extraktion von Lipid aus getrocknetem Extrudat von Mortierella alpina
  • Rührextraktion von getrocknetem Extrudat bei unterschiedlichen Temperaturen:
  • Proben von 100 g getrocknetem Extrudat mit 93,4 bzw. 97,8 % Trockensubstanz wurden während 3 Stunden mit 500 ml Hexan oder 500 ml Propanol-2 bei Temperaturen von 20°, 35° und 50°C für Hexan und 20°, 40° und 70°C für Propanol-2 extrahiert. Die Aufschlämmung wurde mit Hilfe eines Zwei-Blatt-Rührers in einem "Vierhals"-Rundkoben gerührt und mit Hilfe eines Heizmantels erwärmt. Am Ende wurde verdampftes Hexan oder Propanol-2 durch einen Rückflusskühler recycelt.
  • Während der Extraktion wurde alle 30 Minuten eine 15-ml-Probe des Überstands aus dem Kolben entnommen, nachdem der Rührer gestoppt wurde und die Teilchen sich abgesetzt hatten. 1 ml der Proben wurde in vorgewogene 2-ml-Eppendorf-Röhrchen pipettiert. Nach einem Trocknen über Nacht unter Vakuum bei 40°C wurden die Eppendorf-Röhrchen gewogen, und es wurde das Gesamtöl berechnet. Die Resultate der Experimente sind in 2 gezeigt.
  • Schlussfolgerung für die Hexan-Extraktion:
    • – die Temperatur hatte keine Auswirkung auf die Gesamtmenge an Lipid, die extrahiert werden kann, d. h. eine relativ niedrige Extraktionstemperatur ergibt eine gute Ausbeute an Lipid;
    • – die Temperatur hatte nur eine geringe Auswirkung auf die Zeit, in welcher die Gesamtmenge an Lipid extrahiert werden kann;
    • – die Gesamtmenge an Lipid wurde innerhalb von 30 Minuten aus der Biomasse mit 5 Volumina Hexan bei einer Temperatur von über 20°C extrahiert.
  • Schlussfolgerung für die Propanol-2-Extraktion:
    • – die Temperatur hatte eine signifikante Auswirkung auf die Gesamtmenge an Lipid, die extrahiert werden kann;
    • – die Temperatur hatte eine signifikante Auswirkung auf die Zeit, in welcher die Gesamtmenge an Lipid extrahiert werden kann;
    • – die Gesamtmenge an Lipid wurde innerhalb von 2 Stunden aus der Biomasse mit 5 Volumina Propanol-2 bei 73°C extrahiert.
  • Die Zusammensetzung des Öls hing von dem bei der Extraktion verwendeten Lösungsmittel ab (siehe Tabelle 3). Je polarer das Extraktionslösungsmittel ist, umso mehr Phospholipide wurden extrahiert. Die Polarität des Lösungsmittels kann gewählt werden, um die Zusammensetzung des Öls zu optimieren. Tabelle 3 Extraktion von getrockneter Mortierella-Biomasse bei Raumtemperatur unter Verwendung von zwei verschiedenen Lösungsmitteln
    Substanz Hexanöl Propanol-2-Öl
    Triglyceride 93 % 85 %
    Diglyceride 2 % 2 %
    Monoglyceride 2 % 2 %
    Sterole 3 % 3 %
    Phospholipide 2 % 6,5 %
  • In größerem Maßstab wurden Probleme mit der Filtration der Micellen beobachtet aufgrund des Aufbrechens des Extrudats in kleine Teilchen als Folge der hohen Rührergeschwindigkeit während des Extraktionsverfahrens.
  • Diese Probleme wurde mit Hilfe der Perkolations-Extraktion an Stelle der Rührextraktion umgangen.
  • Perkolations-Extraktion von getrocknetem Extrudat mit Hexan:
  • Mehrere Perkolations-Extraktionen wurden im Versuchsmaßstab durchgeführt (siehe 3 wegen eines Diagramms des Verfahrens). Etwa 40–45 kg getrocknete extrudierte Biomasse wurden mit Hexan extrahiert (anfängliches Hexan/Biomasse-Verhältnis von 4,4 l/kg) bei 20°C. Die Strömung der Zahnradpumpe wurde auf 1,5 m3/h eingestellt. Es gab eine kleine Stickstoffspülung bei dem Betriebsinhaltbehälter von etwa 0,1 Bar.
  • Die Extraktion wurde während 4 Stunden durchgeführt (Temperaturanstieg während der Extraktion von 18 auf 25°C). Alle 30 Minuten wurden Proben von den Micellen entnommen. Von jeder Probe wurden 100 ml im Labormaßstab in einem Rotationsverdampfer (TWasserbad war 64°C) während 20 Minuten unter Vakuum (etwa 50 mBar) eingeengt. Die Ölmenge wurde geschätzt. Die Ergebnisse sind in 4 angegeben. Es lässt sich erkennen, dass nach 2 Stunden ein "Gleichgewicht" erreicht war. Danach wurde die extrahierte Biomasse mit etwa 0,6 Schichtvolumina Hexan gewaschen. Während der Extraktion veränderte sich die Schichthöhe nicht.
  • Die Micellen wurden vor dem Eindampfen polierfiltriert. Während der Extraktion wurde bemerkt wir, dass die Micellen immer klarer wurden aufgrund der Tiefenfiltration über die Schicht von Teilchen.
  • BEISPIEL 17
  • Rückgewinnung von DHA-Öl aus Crypthecodinium
  • Biomasse von 7 l einer Fermentationsbrühe (zuvor pasteurisiert, 65°C während 1 Stunde) der Alge Crypthecodinium cohnii wurde unter Verwendung einer Zentrifuge im Labormaßstab des Typs BECKMANN JM/6E gewonnen. Die Brühe wurde in Portionen von 800 ml während 2 Minuten bei 5000 U/min zentrifugiert, wodurch ein klarer Überstand erhalten wurde.
  • Insgesamt 224 g Biomasse mit einem Trockengehalt von 13 % wurden zurückgewonnen. Dies bedeutet eine Biomassenkonzentration bei Erhalt der Fermentationsbrühe von etwa 4 g/kg. Zu dieser zurückgewonnen Biomasse wurden 300 g Stärke (ROQUETTE, Charge Nr. 10EV0024) hinzugefügt, um den Trockengehalt zu erhöhen. Der auf diese Weise zurückgewonnene Kuchen wurde mittels eines Einzelschnecken-Laborextruders unter Verwendung einer Universalschnecke und einer profilierten Trommel extrudiert. Der Durchmesser des Lochs in der Düsenplatte war 2 mm, und die Dicke der Düsenplatte war 6 mm, was ein L/D der Düsenplatte von 3 ergab. Das resultierende glatte Extrudat wurde unter Vakuum über Nacht bei 50°C getrocknet, was zu einem spratzgetrockneten Extrudat führte. Der Trockengehalt der auf diese Weise getrockneten Biomasse war etwa 94 %.
  • Eine Probe von etwa 180 g des getrockneten Extrudats wurde mit Hexan extrahiert (Anfangsvolumen/Biomasse-Verhältnis von 5 l/kg). Nach 3 Stunden Extraktion bei 60°C wurden die Micellen über einem Whatman-Filter filtriert. Die resultierende extrahierte Biomasse wurde einmal mit 1000 ml frischem Hexan gewaschen. Die auf diese Weise zurückgewonnenen filtrierten Micellen wurden bei 68°C (TWasserbad) eingedampft. Auf diese Weise wurde ein DNA-haltiges Rohöl zurückgewonnen. Die DNA-Konzentration in dem Öl war 32,6 %, analysiert durch GC. Das auf diese Weise zurückgewonnene Öl enthielt etwa 67 % Triglyceride, 12 % Diglyceride, 3,7 % Sterole und etwa 0,2 % Antischaummittel (NMR). Eine andere Charakteristik des Öls war der Anteil an Karotenoiden (0,15 mg/ml β-Karotin und 5 mg/ml γ-Karotin).
  • BEISPIEL 18
  • Coextrusion C. cohnii und M. alpines
  • 10 l einer Fermentationsbrühe des Pilzes Mortierella alpines und 10 l einer Fermentationsbrühe von Crypthecodinium cohnii wurden zusammen gemischt. Um die Filtrierbarkeit der gemischten Brühe zu verbessern, wurde CaCl2 hinzugefügt (Endkonzentration 5 g/l). Die gemischte Brühe wurde filtriert, und der resultierende Kuchen wurde mechanisch entwässert unter Verwendung einer typischen Fruchtpresse (Zitrusfruchtpresse, HAFICO).
  • Der auf diese Weise zurück gewonnene Kuchen wurde durch einen Einzelschnecken-Laborextruder unter Verwendung einer Universalförderschnecke in einer profilierten Trommel und einer Düsenplatte mit einem Loch von 2 mm extrudiert. Der Durchmesser des Extrudats war etwa 2 mm. Das auf diese Weise zurück gewonnene Extrudat wurde in einem Wirbelschicht-Trockner im Labormaßstab getrocknet (TLuft = 40°C, Trocknungszeit von etwa 1 Stunde, Luftströmung von 150 Nm3/h, AEROMATIC MP-1). Der Trockengehalt der auf diese Weise getrockneten Biomasse war etwa 92 %.
  • Eine Probe von etwa 100 g getrocknetem Extrudat wurde für die Extraktion mit Hexan verwendet (Anfangsvolumen/Biomasse-Verhältnis von 4 l/kg). Nach 2 Stunden Extraktion bei Umgebungstemperatur wurden die Micellen mittels Vakuumfiltration zurückgewonnen. Das zurückbleibende extrahierte Extrudat wurde mit 4 Volumina frischem Hexan gewaschen (Anfangsvolumen/Biomasse-Verhältnis von 4 l/kg). Das gewaschene Hexan wurde mit den Micellen gemischt, und die resultierenden Micellen wurden bei 50°C (TWasserbad) eingedampft. Auf diese Weise wurde ein MUFS-Rohöl zurück gewonnen, welches ARA (C20:4 ω-6) und DHA (C22:6 ω-3) enthielt.
  • Das Rohöl kann gemäß den für Speise/Pflanzenöle üblichen Verfahren raffiniert werden.
  • VERGLEICHSBEISPIEL 19
  • Die verschiedenen Züchtungsbedingungen, die für den Erhalt der in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Biomassen und Brühen verwendet wurden, werden nun in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • FERMENTATIONSTECHNIKEN BETREFFENDE REFERENZEN
    • Maister H.G., Rogovin S.P., Stodola F.H., Wickerham L.J., "Formation of Extracellular Sphingolipids by Microorganisms. IV. Pilot Production of Tetraacetylphytosphingosin of Hansenula ciferrii" (Bildung von extrazellulären Sphingolipiden durch Mikroorganismen. IV Pilotanlagen-Herstellung von Tetraacetylphytosphingosin durch Hansenula ciferrii): Appl. Microbiol., 10, 401–406. (1962)
    • Zu-Yi Li, Yingyin Lu, Yadwad V.B., Ward O.P., "Process for Production of Arachidonic Acid Concentrate by Strain of Mortierella alpina" (Verfahren für die Herstellung von Arachidonsäurekonzentrat durch die Gattung Mortierella alpina)
    • Can. J. Biochem. Eng. 73, 135–139 (1995) Finkelstein M., Huang C-C., Byng G.S., Tsau B-R., Leach J., "Blakeslea trispora mated culture capable of increased beta-carotene production" (mit Blakeslea trispora gepaarte Kultur, die zur Steigerung der Betakarotin-Produktion fähig ist), US-Patent 5 422 247 (1995)
    • Kojima I., Kouji K., Sato H., Oguchi Y., "Process for the producing Vitamin B12 by the fermentation technique, and Vitamin B12-producing microorganism" (Verfahren für die Herstellung von Vitamin B12 durch die Fermentationstechnik, und Vitamin B12 produzierender Mikroorganismus). US-Patent 4 544 633 (1985) Kyle D.J., Reeb S.E., Sicotte V.J., "Production of decosahexaenoic acid by dinoflagellates" (Herstel lung von Decosahexaensäure durch Dinoflagellaten). US-Patent 5 407 937 (1995)
  • BEISPIEL 20
  • Analyse von rohem und raffiniertem Öl
  • Chargen von Rohöl waren durch die in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt worden (Wirbelschichttrocknen und Hexan-Extraktion).
  • Alle Analysen, die auf die Öle angewandt werden, werden gemäß den durch die American Oil Chemist Society (AOCS) beschriebenen Verfahrensweisen durchgeführt. Die Tri-, Di- und Monoglycerid- und die Phospholipid-Gehalte werden durch H-NMR mit Hilfe eines 600-MHz-Instruments bestimmt.
  • Das Rohöl hatte die folgende Zusammensetzung:
    Charge a b c
    Triglyceride (%) 96,6 96,5 96,6
    Säurezahl mg/g) 1,7 0,3 0,2
    Peroxid-Zahl mÄqu./kg 2,7 1,3 1,3
    AnisidinZahl < 1,0 0,3 0,1
  • Das Rohöl wurde durch die Standardverfahren, wie sie in der Speiseölverarbeitung bekannt sind, raffiniert.
  • Kurz gesagt, das Öl wurde behutsam auf 80–90°C unter Ausschluss von Lufteinschluss erwärmt. Dem Öl wurde eine verdünnte Lösung von NaOH hinzugefügt (125 der stöchiometrischen Menge, die der Menge an freien Fettsäuren entspricht). Nach 30 Minuten Reaktionszeit wurde die Wasserphase durch Zentrifugieren abgetrennt.
  • Das Öl wurde mit Wasser gewaschen bis zu einer neutralen Reaktion von Phenolphthalein. (Für diesen Zweck waren 3 Waschungen mit 10 % des Ölvolumens ausreichend). Die Wasserschichten wurden durch Zentrifugation entfernt. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Öl in vacuo bei 70°C getrocknet. Das getrocknete Öl wurde durch die Hinzufügung der Bleicherde Tonsil Supreme FF gebleicht. (2 % auf Gewichtsbasis wurden hinzugefügt). Die Bleicherde wurde während einer Stunde bei 60°C bei einem Druck von 10–15 mBar kontaktiert. Nach der Reaktionszeit wurde die Bleicherde durch Filtrieren auf einem Blattfilter bei einem Druck von 1 Bar (mit Stickstoff) entfernt. Das filtrierte Öl wurde satzweise in Vakuum bei 180°C bei 2– 5 mBar während 2 Stunden desodorisiert. Dampf wurde als Stripp-Medium verwendet. Der Dampf wurde auf diese Weise in situ aus Wasser, das dem Öl hinzugefügt wurde, gebildet. Nach der Reaktionszeit wurde das Öl gekühlt.
  • Der Druck in dem Reaktor wurde auf 1 Bar gebracht durch die Hinzufügung von Stickstoffgas.
  • Das Ergebnis dieses Verfahrens war ein klares Öl mit der folgenden Zusammensetzung:
    Charge a b c
    Phospholipide (%) < 0,05 < 0,05 < 0,05
    Triglyceride (%) 96,6 96,5 96,6
    Diglyceride (%) 1,6 1,3 1,0
    Säurezahl mg/g 0,2 0,15 0,1

Claims (27)

  1. Mikrobielles Öl, das mindestens eine mehrfach ungesättigte Fettsäure (MUFS) umfasst, die einen Trigiycerid-Gehait von 93% bis 97% hat.
  2. Öl gemäß Anspruch 1, wobei die mehrfach ungesättigte Fettsäure eine C18-, C20- oder C22-o-3 oder eine C18-, C20- oder C2{sup}2{/sup}-w-6 mehrfach ungesättigte Fettsäure ist.
  3. Öl gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die MUFS eine C20- oder C22-w-3 oder eine C20-&ggt;6 mehrfach ungesättigte Fettsäure ist.
  4. Öl gemäß einem dervorstehenden Ansprüche, wobei die MUFS Arachidonsäure (ARA), Eicosapentaensäure (EPA) und/oder Docosahexaensäure (DHA) ist.
  5. Öl gemäß, Anspruch 4, wobei die MUFS Arachidonsäure (ARA) ist.
  6. Öl gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die MUFS von einem Pilz produziert wird.
  7. Öl gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, wobei die MUFS von einer Alge produziert wird.
  8. Öl gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, das von einem Pilz der Gattung Mortierelia produziert wird.
  9. Öl gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 7, das von einer Alge der Gattung Crypthecodinium produziert wird.
  10. Öl gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, das einen Triglycendgehalt von &ggt; 95% aufweist
  11. Öl gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, das bei 80°C eine Rancimat-induktionszeit von &ggt; 5 Stunden hat.
  12. Verfahren zum Erhalt eines Öls, das mindestens eine mehrfach ungesättigte Fettsäure (MUFS) umfasst, von einer mikrobiellen Biomasse, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellen einer Biomasse mit einem Trockengehalt von 25 bis 80%; b) Granulieren der Biomasse in körnige Teilchen; c) Trocknen der kömigen Teilchen, so dass getrocknetes Granulat entsteht; und; d) Extrahieren oder Isolieren des Öls aus dem getrockneten Granulat.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die körnigen Teilchen einen durchschnittlichen Trockengehalt von 30 bis 70% haben und/oder das getrocknete Granulat einen durchschnittlichen Trockengehalt von mindestens 80% hat.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei das Öl unterVerwendung eines geeigneten Lösungsmitteis extrahiert wird und/oder das Verfahren zusätzlih das Raffinieren des extrahierten Öls umfasst.
  15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei in (b) das Granulieren durch Extrudieren der Biomasse erfolgt und/oder die Biomasse vor dem Granulieren zerkrümelt oder geknetet wird.
  16. Verfahren gemäß einem derAnsprüche 12 bis 15, wobei die Biomasse in (a) durch Fest-/Plüssig-Trennung erhalten wird, die mit einer Ferrentationsbrühe durchgeführt wird, gegebenenfalls in Verbindung mit mechanischem Entwässem.
  17. Verfahren gemaS einem der Ansprüche 12 bis 18, wobei: (i) die Biomasse mit einem Trockengehalt von 25 bis 80% durch Hinzufügen eines festen Materials zu der Biomasse erhalten wird; und/oder (ii) das Trocknen der Granuiierungsbiomasse in (c) auf einen Trockengehalt von mindestens 80% durch Wirbelschicht- oder Subwirbelschicht-Trocknen durchgeführt wird.
  18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei die Biomasse einen Pilz oder eine Alge umfasst oder von einem Pilz oder einer Alge stammt
  19. Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei der Pilz zur Ordnung Mucorales gehört oder die Alge ein Dinoflagellat ist und/oder zur Gattung Crypthecodinium gehört.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei der Pilz zur Gattung Morterella gehört.
  21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei der Pilz Mortierella alpina und/oder die Alge Crypthecodinium cohnii ist.
  22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 21, wobei die mehrfach ungesättigte Fettsäure (MUFS) in einem Lipid enthalten ist.
  23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 22, wobei die mehrfach ungesättigte Fettsäure wie in einem der Ansprüche 2 bis 5 definiert ist.
  24. Verwendung eines mikrobiellen Öls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung einer Nahrungsmittel- oder Kosmetikzusammensetzung oder eines Nahrungsergänzungsmittels.
  25. Verwendung gemäß Anspruch 24, wobei die Nahrungsmittelzusammensetzung eine Säuglingsfertignahrung umfasst.
  26. Nahrungsmittel oder Kosmetikzusammensetzung oder Nahrungsergänzungsmittel für Menschen oder Tiere, die/das ein wie in einem der Ansprüche 1 bis 11 definiertes Öl umfasst.
  27. Nahrungsmittelzusammensetzung gemäß Anspruch 26, die eine Säuglingsfertignahrung ist.
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