DE69734205T2

DE69734205T2 - Reinigung von kohlenhydraten mittels umkehrosmose und nanofiltration

Info

Publication number: DE69734205T2
Application number: DE69734205T
Authority: DE
Inventors: Defrees
Original assignee: Neose Technologies Inc
Current assignee: Neose Technologies Inc
Priority date: 1996-10-10
Filing date: 1997-10-09
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2017-10-10
Also published as: WO1998015581A1; IL129363A0; IL129363A; US20020148791A1; CA2268168C; US20030029799A1; DE69734205D1; IL149275A; US6454946B1; AU5081698A; ATE304546T1; DK0931097T3; KR20000049057A; EP0931097A4; CA2268168A1; EP0931097B1; US20050269265A1; AU735695B2; KR100490507B1; EP0931097A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Synthese von Oligosacchariden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung verbesserte Verfahren zur Reinigung von Oligosacchariden mittels Nanofiltration und/oder Umkehrosmose.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Ein besseres Verständnis der Rolle von Kohlenhydraten als Erkennungselemente auf der Oberfläche von Zellen hat zu einem gesteigerten Interesse in der Herstellung von Kohlenhydratmolekülen mit definierter Struktur geführt. Verbindungen, die eine Oligosaccharid-Gruppierung, Sialyllactose, umfassen, waren beispielsweise als Neutralisierungsmittel für Enterotoxine aus Bakterien, wie z.B. Vibrio cholerae, Escherichia coli und Salmonella, interessant (siehe beispielsweise US-Patent 5.330.975). Sialyllactose ist auch zur Behandlung von Arthritis und verwandten Autoimmunerkrankungen erforscht worden. Insbesondere wird angenommen, dass Sialyllactose den Besetzungsgrad der Fc-Kohlenhydratbindungsstelle auf IgG hemmen oder unterbrechen kann und folglich die Bildung von Immunkomplexen verhindern kann (siehe US-Patent 5.164.374). Erst kürzlich sind Sialyl-α-(2,3)-galactoside, Sialyllactose und Sialyllactosamin zur Behandlung von Geschwüren vorgeschlagen worden, und die klinischen Prüfungen der Phase I wurden zur Verwendung der ersteren Verbindung in dieser Kapazität begonnen. Siehe Balkonen et al., FEMS Immunology and Medical Microbiology 7, 29 (1993), und BioWorld Today, S. 5, 4. April 1995. Als weiteres Beispiel sind Verbindungen, die Sialyl-Lewis-Liganden, Sialyl-Lewis^x und Sialyl-Lewis^a umfassen, in Leukozyten- und Nichtleukozyten-Zelllinien vorhanden, die sich an Rezeptoren, wie z.B. ELAM-1- und GMP-140-Rezeptoren, binden. Siehe Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6224 (1991), und Phillips et al., Science 250, 1130 (1990); siehe auch USSN 08/063.181.
Aufgrund des Interesses, gewünschte Kohlenhydratstrukturen herzustellen, wird gegenwärtig intensiv an Glykosyltransferasen und deren Rolle in der enzymkatalysier ten Synthese von Kohlenhydraten geforscht. Der Einsatz von Glykosyltransferasen zur enzymatischen Synthese von Kohlenhydraten ist gegenüber chemischen Verfahren aufgrund der von den Enzymen bereitgestellten fast vollständigen Stereoselektivität und Bindungsspezifität vorteilhafter (Siehe Ito et al., Pure Appl. Chem. 65, 753 (1993), die US-Patente 5.352.670 und 5.374.541). In der Folge werden Glykosyltransferasen immer häufiger als enzymatische Katalysatoren bei der Synthese einer Anzahl von Kohlenhydraten, die für therapeutische und andere Zwecke verwendet werden, angewandt.
Kohlenhydratverbindungen, die durch enzymatische Synthese oder andere Verfahren hergestellt werden, werden häufig in Form komplexer Gemische erhalten, die nicht nur die gewünschte Verbindung, sondern auch Verunreinigungen, wie z.B. unter anderem nicht umgesetzte Zucker, Salze, Pyruvat, Phosphat, PEP, Nucleoside, Nucleotide und Proteine, aufweisen. Die Gegenwart dieser Verunreinigungen ist bei vielen Anwendungen, für die Kohlenhydratverbindungen geeignet sind, unvorteilhaft. Zuvor angewandte Verfahren zur Reinigung von Oligosacchariden, wie z.B. Chromatographie, und zwar Ionenaustausch- und Größenausschlusschromatographie, weisen mehrere Nachteile auf. Chromatographische Reinigungsverfahren können beispielsweise nicht bei Reinigungen im großtechnischen Maßstab angewandt werden. Darüberhinaus sind die Reinigungsverfahren kostenaufwendig.
Die WO96/32491 betrifft die Synthese von Oligosacchariden und offenbart die Gewinnung von glykosylierten Sacchariden mittels Membranfiltration. Die Nanofiltration oder Umkehrosmose ist zur Verwendung bei der Entfernung von Salzen offenbart, indem die Saccharide in der Membran zurückgehalten wurden und die verunreinigenden Salze passieren gelassen werden.
Deshalb besteht die Notwendigkeit für Reinigungsverfahren, die schneller, effizienter und weniger kostenaufwendig als zuvor angewandte Verfahren sind. Die vorliegende Erfindung wird dieser und anderen Notwendigkeiten gerecht.
Stand der Technik
Ein Verfahren zur Verwendung einer Kombination aus Membranen zur Entfernung von unerwünschten Verunreinigungen aus einer zuckerhältigen Lösung, insbesondere melassebildende Ionen, die die Zuckerkristallisierung hemmen, ist im US-Patent 5.454.952 beschrieben. Das Verfahren, das eine Ultrafiltration gefolgt von einer Nanofiltration umfasst, wird als geeignet zur Verbesserung der Gewinnung von Kristallzucker aus Zuckerrohr- oder Zuckerrübenlösungen beschrieben.
Im US-Patent 5.403.604 ist die Entfernung der Fruchtsaftzucker aus Fruchtsäften mittels Nanofiltration zum Erhalten eines Retentats mit hohem Zuckergehalt und eines Permeats mit geringerem Zuckergehalt beschrieben.
Im US-Patent 5.254.174 ist die Anwendung von Chromatographie- und/oder Nanofiltrationsverfahren zur Reinigung von Inulidverbindungen der Formel GF_n (worin G für Glucose und F für Fructose steht) durch Entfernung von Salzen und Glucose, Fructose und Saccharose aus einem Fruchtsaft oder einem Sirup, der die Inulidverbindungen enthält, beschrieben.
Im US-Patent 4.956.458 ist die Anwendung von Umkehrosmoseverfahren beschrieben, um von Polydextrose, das ein zufällig vernetztes Glucanpolymer darstellt, welches durch die säurekatalysierte Kondensation von Glucose hergestellt wird, den Großteil von Fremdgeschmacksbestandteilen wie z.B. Anhydroglucose und von Furaldehydderivat-Polydextrose zu entfernen.
Im US-Patent 4.806.244 ist die Verwendung einer kombinierten Membran und eines Sorptionssystems beschrieben, worin Sulfat mittels Nanofiltration aus Wasser entfernt wird, wonach das Nitrat, das die Membran passiert hat, aus dem Permeat mittels Absorption an ein Ionenaustauschharz entfernt wurde.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Reinigung einer Sialylgalactosidverbindung aus einer Zuführlösung bereit, die eine unsialylierte Kohlenhydratverunreinigung aufweist. Die Verfahren umfassen das Kontaktieren der Zuführlösung mit einer Nanofiltrations- oder Umkehrosmosemembran, und zwar unter solchen Bedingungen, dass die Membran die gewünschte Sialylgalactosidverbindung zurückhält, während der Großteil der Verunreinigung die Membran passiert. Die Erfindung stellt Verfahren zur Reinigung von Sialylgalactosidverbindungen bereit, wie z.B. Sialyllactoside, Sialinsäure, NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)(Fucα1→3)Glc(R¹)β1-OR², worin R¹ OH oder NAc ist; R² Wasserstoff, Alkoxy, Saccharid, Oligosaccharid oder eine Aglycongruppe mit zumindest einem Kohlenstoffatom ist.
Es werden ebenfalls Verfahren zur Reinigung von Sialylgalactosidverbindungen bereitgestellt, die folgende Formeln aufweisen: NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)GlcN(R¹)β-OR², NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)GlcN(R¹)β(1→3)Galβ-OR², NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)(Fucα1→3)GlcN(R¹)β-OR² oder NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)(Fucα1→3)GlcN(R¹)β(1→3)Galβ-OR², worin R¹ ein Alkyl oder ein Acyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffen, 5,6,7,8-Tetrahydro-2-naphthamido; Benzamido; 2-Naphthamido; 4-Aminobenzamido; oder 4-Nitrobenzamido ist und R² ein Wasserstoff, Saccharid, Oligosaccharid oder eine Aglycongruppe mit zumindest einem Kohlenstoffatom ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zur Reinigung einer sialylierten Oligosaccharidverbindung aus einer Zuführlösung bereit, die ein Reaktionsgemisch umfasst, welches zur Synthese der Verbindung verwendet wird. Die Synthese kann enzymatisch oder chemisch oder eine Kombination davon sein. Die Verfahren umfassen das Entfernen jeglicher in der Zuführlösung befindlicher Proteine durch Kontaktieren der Zuführlösung mit einer Nanofiltrations- oder Umkehrosmosemembran, sodass die Proteine von der Membran zurückgehalten werden, während die sialylierte Oligosaccharidverbindung die Membran als Permeat passiert.
Das Permeat aus dem Nanofiltrations- oder Umkehrosmoseschritt wird anschließend mit einer Nanofiltrations- oder Umkehrosmosemembran kontaktiert, und zwar unter solchen Bedingungen, dass die Nanofiltrations- oder Umkehrosmosemembran die sialylierte Oligosaccharidverbindung zurückhält, während der Großteil der ungewünschten Verunreinigung die Membran passiert.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Entfernung von einer oder mehrerer unsialylierten Kohlenhydratverunreinigung aus einer Lösung bereit, die ein Sialylgalactosid von Interesse enthält. Die Verfahren umfassen das Kontaktieren der Lösung mit einer ersten Seite einer semipermeablen Membran, die über Rückweisungskoeffizienten verfügt, sodass das unsialylierte Kohlenhydrat zurückgehalten wird, während die Verunreinigung die Membran passiert. Die Membran ist aus einer Gruppe ausgewählt, die aus einer Nanofiltrationsmembran und einer Umkehrosmosemembran besteht, je nach Größe und Ladung des Kohlenhydrats von Interesse bezogen auf jene der Verunreinigungen. Die Membran trennt die Zuführlösung, die das Sialylgalactosid enthält, in einen Retentatanteil und einen Permeatanteil auf. Wenn der Rückweisungskoeffizient der Membran für das Sialylgalactosid größer ist als für die Verunreinigung, weist der Retentatanteil eine geringere Konzentration an Verunreinigungen im Vergleich zur Verunreinigungskonzentration in der Zuführlösung und im Allgemeinen auch einen höheren Anteil an Sialylgalactosid im Vergleich zu ungewünschter Verunreinigung auf. Im Gegensatz dazu kommt es bei einer Membran, die einen Rückweisungskoeffizienten für das Sialylgalactosid aufweist, der geringer als der für die Verunreinigung ist, zu einer Trennung, worin die Konzentration der Verunreinigung im Permeat geringer ist als in der Zuführlösung, und das Permeat weist einen höheren Anteil von Sialylgalactosidverunreinigung auf als die Zuführlösung. Wenn erwünscht, kann die Fraktion, welche das Sialylgalactosid enthält, für eine weitere Reinigung durch das Membransystem rezykliert werden.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Entfernen einer unsialylierten Kohlenhydratverunreinigung aus einem Gemisch bereitgestellt, das die Verunreinigung und ein Sialylgalactosid umfasst, wobei das Verfahren das Kontaktieren des Gemischs mit einer Nanofiltrations- oder Umkehrosmosemembran bei einem pH von 1 bis 7 über einen Zeitraum umfasst, der ausreicht, dass sich das Gemisch in eine Permeatfraktion, welche die unsialylierte Kohlenhydratverunreinigung umfasst, welche die Membran passiert hat, und eine Retentatfraktion, welche die Membran nicht passiert hat, auftrennen kann.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Synthese eines sialylierten Oligosaccharids bereitgestellt, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(a) Herstellen eines Reaktionsgemischs durch Kontaktieren eines Glykosylakzeptors mit einem Glykosyldonor und einer Glykosyltransferase, die zum Ligieren des Glykosyldonors an den Glykosylakzeptor fähig ist; und
(b) Kontaktieren des Reaktionsgemischs mit einer Nanofiltrations- oder Umkehrosmosemembran bei einem ersten pH über einen ersten Zeitraum, wodurch das Gemisch in eine erste Permeatfraktion, welche die Membran passiert hat, und eine erste Retentatfraktion, welche die Membran nicht passiert hat, aufgetrennt wird;
(c) auf Schritt (b) folgendes Kontaktieren der ersten Retentatfraktion mit einer Nanofiltrations- oder Umkehrosmosemembran bei einem zweiten pH, der sich vom ersten pH unterscheidet, über einen zweiten Zeitraum, wodurch die erste Retentatfraktion in eine zweite Permeatfraktion, welche die Membran passiert hat, und eine zweite Retentatfraktion, welche die Membran nicht passiert hat, aufgetrennt wird, wobei die zweite Retentatfraktion im Wesentlichen gereinigtes sialyliertes Oligosaccharid umfasst.

Beispiele für Verunreinigungen, die aus den Lösungen, welche die Verbindung von Interesse enthalten, unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren entfernt werden können, umfassen, jedoch nicht ausschließlich, nicht umgesetzte Zucker, Pyruvat, Phosphat und Phosphoenolpyruvat.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Definitionen
Die folgenden Abkürzungen werden hierin verwendet:

Ara: = Arabinosyl
Fru: = Fructosyl
Fuc: = Fucosyl
Gal: = Galactosyl
GalNAc: = N-Acetylgalacto
Glc: = Glucosyl
GlcNAc: = N-Acetylgluco
Man: = Mannosyl
NeuAc: = Sialyl-(N-acetylneuraminyl)

Die Bezeichnung "Kohlenhydrat" umfasst chemische Verbindungen mit der allgemeinen Formel (CH₂OH)_n und umfasst Monosaccharide, Disaccharide, Oligosaccharide und Polysaccharide. Die hierin verwendete Bezeichnung "Oligo" bezieht sich auf ein polymeres Molekül, das aus 2 bis etwa 10 Resten besteht, z.B. Aminosäuren (Oligopeptid), Monosaccharide (Oligosaccharid) und Nucleinsäuren (Oligonucleotid). Die Bezeichnung "poly" bezieht sich auf ein polymeres Molekül, das mehr als etwa 10 Reste umfasst.
Von Oligosacchariden wird angenommen, dass sie ein reduzierendes Ende und ein nichtreduzierendes Ende besitzen, unabhängig davon, ob das Saccharid am reduzierenden Ende tatsächlich ein reduzierender Zucker ist. Gemäß der allgemein anerkannten Nomenklatur werden Oligosaccharide hierin mit dem nichtreduzierenden Ende links und dem reduzierenden Ende rechts dargestellt.
Alle hierin beschriebenen Oligosaccharide sind mit der Bezeichnung oder der Abkürzung für das nichtreduzierende Saccharid (z.B. Gal), gefolgt von der Anordnung der Glykosidbindung (α oder β), der Ringbindung, der Ringposition des in der Bindung involvierten reduzierenden Saccharids und der Bezeichnung oder Abkürzung für das reduzierende Saccharid (z.B. GlcNAc) beschrieben. Die Bindung zwischen zwei Zuckern kann beispielsweise als 2,3, 2→3 oder (2,3) ausgedrückt sein.
Eine Verbindung ist von einer ungewünschten Komponente in einer Lösung "im Wesentlichen gereinigt", wenn die Konzentration der ungewünschten Komponente nach der Reinigung nicht mehr als etwa 40% der Konzentration der Komponente vor der Reinigung beträgt. Vorzugsweise ist die Konzentration der ungewünschten Komponente nach der Reinigung weniger als etwa 20 Gew.-%, noch bevorzugter weniger als etwa 10%, der Konzentration vor der Reinigung.
Die hierin verwendete Bezeichnung "pharmazeutisch rein" bezieht sich auf eine Verbindung, die ausreichend genug von ungewünschten Verunreinigungen gereinigt ist, dass sich die Verbindung zur Verabreichung als pharmazeutisches Mittel eignet. Vorzugsweise ist die Verbindung so gereinigt, dass die ungewünschte Verunreinigung nach der Reinigung in einer Menge vorliegt, die etwa 5 Gew.-% oder weniger der Verunreinigungskonzentration in der Zuführlösung vor der Reinigung beträgt. Noch bevorzugter beträgt die Verunreinigungskonzentration nach der Reinigung etwa 1% oder weniger der Verunreinigungskonzentration vor der Reinigung und insbesondere etwa 0,5% oder weniger der Verunreinigungskonzentration vor der Reinigung.
Die "Zuführlösung" bezieht sich auf jede beliebige Lösung, die eine zu reinigende Verbindung enthält. Beispielsweise kann ein Reaktionsgemisch, das zur Synthese eines Oligosaccharids verwendet wird, als Zuführlösung eingesetzt werden, aus der das gewünschte Reaktionsprodukt unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt wird.
Ausführungsformen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur schnellen und effizienten Reinigung spezifischer Kohlenhydrat- und Oligosaccharidstrukturen zu einem hohen Reinheitsgrad bereit, und zwar unter Verwendung von semipermeablen Membranen, wie z.B. Umkehrosmose- und/oder Nanofiltrationsmembranen. Die Verfahren eignen sich insbesondere zur Auftrennung gewünschter Oligosaccharidverbindungen aus Reaktanten und anderen Verunreinigungen, die nach der Synthese oder dem Abbau der Oligosaccharide im Reaktionsgemisch zurückbleiben. Beispielsweise stellt die Erfindung Verfahren zur Auftrennung von Oligosacchariden aus Enzymen und/oder anderen Komponenten von Reaktionsgemischen bereit, die für enzymatische Synthesen oder den enzymatischen Abbau von Oligosacchariden verwendet werden. Ebenso bereitgestellt werden Verfahren zur Entfernung von Salzen, Zuckern und anderen Komponenten aus Zuführlösungen mittels Nanofiltration oder Umkehrosmose.
Mit diesen Verfahren können Saccharide (z.B. Sialyllactose, SLe^x und viele andere) mit bis zu im Wesentlichen 100%iger Reinheit hergestellt werden. Zudem sind die Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung effizienter, schneller und besser für Reinigungen im großtechnischen Maßstab geeignet als herkömmliche Kohlenhydratreinigungsverfahren.
Häufig kann eine gewünschte Reinigung in einem einzigen Schritt erzielt werden; zusätzliche Reinigungsschritte, wie z.B. Kristallisation und dergleichen, sind im Allgemeinen nicht erforderlich. Folglich stellt die vorliegende Erfindung Einschrittverfahren zur Reinigung von saccharidhältigen Verbindungen bereit.
Zur Reinigung von Sacchariden gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Membran ausgewählt, die sich zur Auftrennung des gewünschten Kohlenhydrats von den ungewünschten Komponenten der Lösung eignet, aus der das Kohlenhydrat zu reinigen ist. Das Ziel bei der Auswahl einer Membran ist die Optimierung des Molekulargewicht-Cutoffs (MWCO), der Membranzusammensetzung, der Durchlässigkeit und der Rückweisungseigenschaften für eine bestimmte Anwendung, nämlich die Gesamtkapazität der Membran, spezifische Moleküle zurückzuhalten, während Salze und andere, im Allgemeinen kleinere oder entgegengesetzt geladene Moleküle die Membran passieren. Der Rückhalteprozentsatz der Komponente i (R_i) wird durch die Formel R_i = (1 – C_ip/C_ir) × 100% dargestellt, worin C_ip die Konzentration der Komponente i im Permeat und C_ir die Konzentration der Komponente i im Retentat, jeweils in Gew.-%, ist. Der Rückhalteprozentsatz einer Komponente wird auch als Rückhalteeigenschaft oder als Membranrückweisungskoeffizient bezeichnet.
Für eine wirksame Auftrennung wird eine Membran ausgewählt, die ein hohes Rückweisungsverhältnis für Saccharide von Interesse, bezogen auf das Rückweisungsverhältnis für Verbindungen, aufweist, von denen die Auftrennung erwünscht ist. Wenn eine Membran ein hohes Rückweisungsverhältnis für eine erste Verbindung, bezogen auf eine zweite Verbindung, aufweist, wird die Konzentration der ersten Verbindung in der Permeatlösung, welche die Membran passiert, bezogen auf jene der zweiten Verbindung, gesenkt. Im Gegensatz dazu erhöht sich die Konzentration der ersten Verbindung, bezogen auf die Konzentration der zweiten Verbindung, im Retentat. Wenn eine Membran die Verbindung nicht zurückweist, bleibt die Konzentration der Verbindung sowohl im Permeat als auch in den zurückgewiesenen Abschnitten im Wesentlichen gleich wie in der Zuführlösung. Es ist auch möglich, dass eine Membran eine negative Rückweisungsrate für eine Verbindung aufweist, wenn die Konzentration der Verbindung im Permeat größer als die Konzentration der Verbindung in der Zuführlösung wird. Eine allgemeine Übersicht über die Membrantechnologie findet sich in "Membranes and Membrane Separation Processes" in der Enzyklopädie der industriellen Chemie von Ullmann (VCH, 1990); siehe auch Noble und Stern, Membrane Separations Technology: Principles and Applications (Elsevier, 1995).
Als Ausgangsmaterial wird im Allgemeinen eine Membran ausgewählt, die einen Molekulargewicht-Cutoff (MWCO, der häufig mit der Membranporengröße zusammenhängt) aufweist, von dem angenommen werden kann, dass er die gewünschten Verbindungen zurückhält, während die im Zuführstrom vorliegenden ungewünschten Verbindungen die Membran passieren. Der gewünschte MWCO beträgt im Allgemeinen weniger als das Molekulargewicht der zu reinigenden Verbindung und ist üblicherweise größer als das Molekulargewicht der ungewünschten Verunreinigung, die aus der Lösung entfernt werden muss, welche die zu reinigende Verbindung enthält. Zur Reinigung einer Verbindung mit einem Molekulargewicht von 200 Da würde eine Membran ausgewählt werden, die einen MWCO von weniger als etwa 200 Da aufweist. Eine Membran mit einem MWCO von 100 Da wäre beispielsweise ebenfalls ein geeigneter Kandidat. Die Membranen, welche in der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen, werden zum Teil, basierend auf ihrem MWCO, je nach gewünschter Auftrennung als Ultrafiltrationsmembranen (UF-Membranen), Nanofiltrationsmembranen (NF-Membranen) oder Umkehrosmosemembranen (UO-Membranen) klassifiziert. Für erfindungsgemäße Zwecke sind die UF-, NF-, und UO-Membranen, wie im Pure Water Handbook, Osmonics, Inc. (Minnetonka MN), definiert, klassifiziert. Die UO-Membranen weisen üblicherweise einen nominellen MWCO von weniger als etwa 200 Da auf und halten die meisten Ionen zurück, die NF-Membranen weisen üblicherweise einen nominellen MWCO von zwischen etwa 150 Da und etwa 5 kDa auf, und die UF-Membranen weisen üblicherweise einen nominellen MWCO von zwischen etwa 1 kDa und etwa 300 kDa (diese MWCO-Bereiche deuten auf ein saccharidähnliches Molekül hin) auf.
Ein zweiter zu berücksichtigender Parameter bei der Auswahl einer geeigneten Membran für eine bestimmte Auftrennung ist der Polymertyp der Membran. Die in jeder der Zonen verwendeten Membranen bestehen aus herkömmlichem Membranmaterial, unabhängig davon ob anorganisch, organisch oder anorganisch-organischgemischt. Typische anorganische Materialien umfassen Glase, Keramiken, Cermets, Metalle und dergleichen. Keramikmembranen, die für die UF-Zone bevorzugt werden, können beispielsweise so wie in den US-Patenten Nr. 4.692.354 an Asaeda et al., Nr. 4.562.021 an Alary et al. und anderen beschrieben hergestellt werden. Die für die NF- und UO-Zonen bevorzugten Materialien sind üblicherweise Polymere, entweder isotrop oder anisotrop, die auf entweder der Bohrseite oder der Hüllenseite der Fasern eine dünne Schicht oder "Haut" aufweisen. Bevorzugte Materialien für Fasern umfassen Polyamide, Polybenzamide, Polysulfone (einschließlich sulfonier tes Polysulfon und sulfoniertes Polyethersulfon, u.a.), Polystyrole, einschließlich styrolhältige Copolymere, wie z.B. Acrylonitril-Styrol-, Butadien-Styrol- und Styrol-Vinylbenzylhalogenid-Copolymere, Polycarbonate, zellulosische Polymere, einschließlich Celluloseacetat, Polypropylen, Poly(vinylchlorid), Poly(ethylenterephthalat), Polyvinylalkohol, Fluorkohlenwasserstoffe und dergleichen, wie z.B. jene in den US-Patenten Nr. 4.230.463, 4.806.244 und 4.259.183 offenbarten. Die NF- und UO-Membranen bestehen zusätzlich zu einer polymeren Trennungsschicht häufig aus einem porösen Trägersubstrat.
Von besonderer Wichtigkeit bei der Auswahl einer geeigneten Membranzusammensetzung ist die Membranoberflächenladung. Innerhalb des erforderlichen MWCO-Bereichs wird eine Membran ausgewählt, die eine Oberflächenladung aufweist, welche sich für die ionische Ladung des Kohlenhydrats und jener der Verunreinigungen eignet. Während der MWCO für eine bestimmte Membran im Allgemeinen unveränderlich ist, kann eine Veränderung des pH-Werts der Zuführlösung die Auftrennungseigenschaften einer Membran durch Veränderung der Membranoberflächenladung bewirken. Beispielsweise kann eine Membran, die bei neutralem pH eine negative Oberflächenladung aufweist, auf eine neutrale Nettoladung eingestellt werden, indem einfach der pH der Lösung gesenkt wird. Eine zusätzliche Wirkung der Einstellung des pH-Werts der Lösung umfasst die Modulation der ionischen Ladung auf den Verunreinigungen und dem Kohlenhydrat von Interesse. Deshalb kann durch Auswahl eines geeigneten Membranpolymertyps und pH-Werts ein System erhalten werden, worin sowohl die Verunreinigung als auch die Membran neutral ist, was das Passieren der Verunreinigung erleichtert. Wenn beispielsweise eine Verunreinigung bei neutralem pH negativ geladen ist, wird häufig eine Senkung des pH der Zuführlösung erwünscht, um die Verunreinigung zu protonieren. Die Phosphat-Entfernung wird beispielsweise erleichtert, indem der pH der Lösung auf etwa 3 gesenkt wird, was die Protonierung des Phosphatanions zur Folge hat und das Passieren der Membran ermöglicht. Wie in Beispiel 5 angeführt senkt eine Verringerung des pH-Werts von 7,5 auf 3,0 den Prozentsatz an GlcNAc, das die Polyamidmembran, wie z.B. einen Osmonics MX07, in 30 Minuten passiert, von 70% auf 28%, während der Passierungsprozentsatz des Phosphats von 10% auf 46% erhöht wird (siehe Bei spiel 6, Tabelle 5 für weitere Beispiele für die Wirkung einer pH-Veränderung auf die Passierungsrate von anderen Verbindung durch verschiedene Nanofiltrationsmembranen). Zur Reinigung eines anionischen Kohlenhydrats liegt der pH im Allgemeinen zwischen etwa einem pH von 1 und etwa einem pH von 7. Im Gegensatz dazu kann der pH der Zuführlösung bei einer Verunreinigung mit einer positiven Oberflächenladung zwischen etwa 7 und etwa 14 eingestellt werden. Das Erhöhen des pH-Werts einer Lösung, die eine Verunreinigung mit einer Aminogruppe (-NH₃ ⁺) enthält, macht die Aminogruppe beispielsweise neutral, wodurch das Passieren der Membran erleichtert wird. Folglich umfasst ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die Modulation einer Auftrennung durch Einstellen des pH einer Lösung, welche die Membran kontaktiert. Dies kann zur Veränderung der ionischen Ladung einer Verunreinigung führen und auch die Oberflächenladung der Membran beeinflussen, wodurch die Reinigung des gewünschten Kohlenhydrats erleichtert wird. Natürlich muss den Anweisungen des Herstellers hinsichtlich eines annehmbaren pH-Bereichs für eine bestimmte Membran Folge geleistet werden, damit Beschädigungen der Membran verhindert werden.
Bei einigen Anwendungen wird ein Gemisch zuerst einer Nanofiltration oder einer Umkehrosmose bei einem pH-Wert unterzogen, wonach das Retentat, welches das Saccharid von Interesse enthält, auf einen anderen pH eingestellt und einer zusätzlichen Membranreinigung unterzogen wird. Beispielsweise wird durch die Filtration eines Reaktionsgemischs, das zur Synthetisierung von Sialyllactose mittels einer Osmonics-MX07-Membran (eine Nanofiltrationsmembran mit einem MWCO von etwa 500 Da) verwendet wird, bei einem pH von 3,0 die Sialyllactose zurückgehalten und ein Großteil an Phosphat, Pyruvat, Salz und Mangan aus der Lösung entfernt, während auch ein Teil der GlcNAc, Lactose und Sialinsäure entfernt wird. Eine weitere Wiederzirkulierung durch die MX07-Membran nach Einstellung des pH-Werts des Retentats auf 7,4 entfernt einen Großteil des restlichen Phosphats, das gesamte Pyruvat, die gesamte Lactose, einiges an Sialinsäure und wesentliche Mengen des restlichen Mangans.
Wenn ein Saccharid aus einem Gemisch entfernt werden soll, das Proteine enthält, wie z.B. zur Synthetisierung eines gewünschten Oligosaccharids oder eines Nucleotidzuckers verwendete Enzyme, wird oft die Entfernung der Proteine als erster Schritt des Reinigungsvorgangs erwünscht. Für ein Saccharid, das kleiner als die Proteine ist, wird diese Auftrennung durch Auswahl einer Membran erzielt, die über einen MWCO verfügt, der weniger als die Molekularmasse des Proteins oder anderer aus der Lösung zu entfernender Makromoleküle beträgt, jedoch größer als die Molekularmasse des zu reinigenden Oligosaccharids ist (und zwar ist das Rückweisungsverhältnis in diesem Fall für das Protein höher als für das gewünschte Saccharid). Proteine und andere Makromoleküle, deren Molekularmasse größer als der MWCO ist, werden somit von der Membran zurückgewiesen, während die Saccharide die Membran passieren. Im Gegensatz dazu wird, wenn ein Oligosaccharid oder ein Nucleotidzucker von den Proteinen gereinigt werden muss, die kleiner als das Oligosaccharid oder der Nucleotidzucker sind, eine Membran verwendet, die einen größeren MWCO als die Molekularmasse des Proteins, aber einen kleineren MWCO als jenen des Oligosaccharids oder des Nucleotidzuckers aufweist. Im Allgemeinen werden bei der Trennung der Proteine von Kohlenhydraten Membranen eingesetzt, die herkömmlich als Ultrafiltrationsmembranen (UF-Membranen) bezeichnet werden. UF-Membranen, die sich zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren eignen, sind bei mehreren gewerblichen Herstellern erhältlich, einschließlich Millipore Corp. (Bedford, MA), Osmonics, Inc. (Minnetonka, MN), Filmtec (Minneapolis, MN), UOP, Desalination Systems, Advanced Membrane Technologies und Nitto.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Entfernung von Salzen und anderen niedermolekularen Komponenten mittels einer Nanofiltrationsmembran (NF-Membran) oder einer Umkehrosmosemembran (UO-Membran) aus einem Gemisch bereit, das ein Saccharid von Interesse enthält. Die Nanofiltrationsmembranen stellen eine Klasse von Membranen dar, deren Auftrennung auf dem Molekulargewicht und der ionischen Ladung basiert. Diese Membranen fallen hinsichtlich Größe der Spezies, welche die Membran passiert, üblicherweise in einen Bereich zwischen Umkehrosmosemembranen und Ultrafiltrationsmembranen. Nanofiltrationsmembranen weisen typischerweise Mikroporen oder Öffnungen zwischen den Ketten in einem gequollenen Polymernetzwerk auf. Die Molekulargewicht-Cutoffs für nichtionisierte Moleküle liegen üblicherweise in einem Bereich von 100 bis 20.000 Dalton. Für Ionen mit dem gleichen Molekulargewicht erhöht sich das Zurückhalten der Membranen (die Retentionen) schrittweise für ionische Ladungen auf 0, 1, 2, 3 etc. für eine bestimmte Membran, und zwar aufgrund der erhöhten Ladungsdichte (siehe beispielsweise Eriksson, P., "Nanofiltration Extends the Range of Membrane Filtration", Environmental Progress 7, 58–59 (1988)). Die Nanofiltration ist auch in Chemical Engineering Progress, S. 68–74 (März 1994), Rautenbach et al., Desalination 77, 73 (1990), und im US-Patent Nr. 4.506.244 beschrieben. In einer typischen Anwendung werden Saccharide von Interesse mittels Nanofiltrationsmembran zurückgehalten und verunreinigende Salze sowie andere ungewünschte Komponenten passieren die Membran. Eine Nanofiltrationsmembran, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignet, weist typischerweise eine Rückhalteeigenschaft für das Saccharid von Interesse von etwa 40% bis etwa 100%, vorzugsweise von etwa 70% bis etwa 100%, auf. Die in der Erfindung verwendete Nanofiltrationsmembran kann jede beliebige herkömmliche Nanofiltrationsmembran sein, wobei Polyamidmembranen insbesondere geeignet sind. Mehrere gewerbliche Hersteller, einschließlich unter anderen Millipore Corp. (Bedford, MA), Osmonics, Inc. (Minnetonka, MN), Filmtec, UOP, Advanced Membrane Technologies, Desalination Systems und Nitto, vertreiben Nanofiltrationsmembranen, die sich zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren eignen. Geeignete Membranen umfassen beispielsweise u.a. Osmonics-MX07-, YK-, GH(G-10)-, GE(G-5)- und HL-Membranen.
Umkehrosmosemembranen (UO-Membranen) ermöglichen auch einer Vielzahl von wässrigen gelösten Stoffen das Passieren, während ausgewählte Moleküle zurückgehalten werden. Im Allgemeinen bezieht sich Osmose auf einen Vorgang, wodurch eine reine Flüssigkeit (üblicherweise Wasser) eine semipermeable Membran in eine Lösung (üblicherweise Zucker oder Salz und Wasser) passiert, um die Lösung zu verdünnen und ein osmotische Gleichgewicht zwischen den zwei Flüssigkeiten zu erzielen. Im Gegensatz dazu stellt die Umkehrosmose einen druckbetriebenen Membranvorgang dar, worin die Ausübung eines äußeren Drucks auf das Membransystem zu einem Rückfluss führt, wobei Wassermoleküle aus einem Salz- oder Zu ckerlösungsbehälter in einen Behälter des Membransystems mit reinem Wasser passieren. Eine semipermeable und nichtporöse UO-Membran erfordert, dass eine wässrige Zugabe zu ihr bei einem Druck gepumpt werden muss, der über dem osmotischen Druck der im Wasser gelösten Substanzen liegt. Eine UO-Membran kann niedermolekulare Moleküle (< 200 Dalton) sowie Ionen aus dem Wasser wirksam entfernen. Vorzugsweise weist die UO-Membran eine Rückhalteeigenschaft für das Saccharid von Interesse von etwa 40% bis etwa 100%, vorzugsweise von etwa 70 bis etwa 100%, auf. Geeignete UO-Membranen umfassen, jedoch nicht ausschließlich, UO-Membranen von u.a. Filmtec BW-30, Filmtec SW-30, Filmtec SW-30HR, UOP, Desal, Osmonics, Advanced Membrane Technologies und Nitto. Ein Beispiel einer geeigneten UO-Membran ist die Millipore Kat.-Nr. CDRN500 60 (Millipore Corp., Bedford MA).
Die in der Erfindung verwendeten Membranen können in allen bekannten Membranformen verwendet werden. Die Membranen können beispielsweise flach, platten-, rahmen-, röhrenförmig oder spiralförmig gewickelt, Hohlfasern und dergleichen sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Membran spiralförmig gewickelt. Die Membranen können in jeder beliebigen Anordnung angewandt werden, einschließlich entweder einer Kreuzstrom- oder einer Tiefenanordnung. Bei der "Kreuzstrom"-Filtration, die für die Ultrafiltrations-, Nanofiltrations- und Umkehrosmosereinigungen gemäß der Erfindung bevorzugt wird, strömt die "Zuführlösung" oder Lösung, aus der das Kohlenhydrat von Interesse gereinigt werden soll, durch die Membrankanäle, und zwar entweder parallel oder tangential zur Membranoberfläche, und wird in einen Retentatstrom (auch als Rezyklierungs- oder Konzentratsstrom bezeichnet) und einen Permeatstrom aufgetrennt. Um eine wirksame Membran beizubehalten, sollte der Zuführstrom bei einer ausreichend hohen Geschwindigkeit parallel zur Membranoberfläche fließen, um Scherkräfte und/oder Turbulenzen zu erzeugen, wodurch die von der Membran zurückgewiesenen angesammelten Teilchen weggeschwemmt werden. Die Kreuzstromfiltration erfordert folglich drei Arten von Strömen, und zwar Zufuhr, Permeat und Retentat. Im Gegensatz dazu weist ein "Sackgassen-" oder "Tiefen"-Filter nur zwei Ströme auf, und zwar Zufuhr und Filtrat (oder Permeat). Der Rezyklierungs- oder Retentatstrom, der alle von der Membran zurückgewiesenen Teilchen und großen Moleküle zurückhält, kann vollständig zu einem Membranmodul rezykliert werden, worin der Rezyklierungsstrom erzeugt wird, oder er kann aus dem System teilweise entfernt werden. Wenn die erfindungsgemäßen Verfahren zur Reinigung von Sacchariden aus niedermolekularen Komponenten verwendet werden, sind die gewünschten Saccharide beispielsweise im Retentatstrom (oder bei einem Tiefenfilter im Zuführstrom) enthalten, während der Permeatstrom die entfernten Verunreinigungen enthält.
Die Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung können zusätzlich optimiert werden, indem der Druck, die Strömungsgeschwindigkeit und Temperatur bei der Durchführung der Filtration eingestellt werden. UF, NF und UO erfordern im Allgemeinen einen Druck über Umgebungsdruck, um den osmotischen Druck der durch die Membran passierenden Lösung zu überwinden. Den Anweisungen des Membranherstellers hinsichtlich maximalem und empfohlenem Betriebsdruck kann Folge geleistet werden, wobei weitere Optimierungen durch inkrementelle Einstellungen möglich sind. Der empfohlene Druck für OF liegt im Allgemeinen zwischen etwa 172,375 × 10³ Pa (25 psi) und etwa 689,5 × 10³ Pa (100 psi), für NF zwischen etwa 344,75 × 10³ Pa (50 psi) und etwa 10,3425 × 10⁶ Pa (1.500 psi) und für UO zwischen etwa 689,5 × 10³ Pa (100 psi) und etwa 10,3425 × 10⁶ Pa (1.500 psi). Zur Optimierung der gewünschten Reinigung können auch die Strömungsgeschwindigkeiten sowohl des Konzentrats (Zuführlösung) als auch des Permeats eingestellt werden. Wiederum dienen die Empfehlungen des Herstellers für die jeweilige Membran als Ausgangspunkt, an dem der Optimierungsprozess beginnt, indem inkrementelle Einstellungen vorgenommen werden. Typische Strömungsgeschwindigkeiten für das Konzentrat (P_c) liegen zwischen etwa 3,78 l/min (1 Gallone/min, GPM) und etwa 56,7 l/min (15 GPM), noch bevorzugter zwischen etwa 11,34 l/min (3 GPM) und etwa 26,46 l/min (7 GPM). Für das Permeat liegen die Strömungsgeschwindigkeiten (P_f) üblicherweise zwischen etwa 0,189 l/min (0,05 GPM) und etwa 37,8 l/min (10 GPM), wobei Strömungsgeschwindigkeiten zwischen etwa 0,756 l/min (0,2 GPM) und etwa 3,78 l/min (1 GPM) bevorzugt werden. Die Temperatur, bei der die Reinigung stattfindet, kann auch die Wirksamkeit und Geschwindigkeit der Reinigung beeinflussen. Temperaturen zwischen etwa 0 und etwa 100°C sind üblich, wobei Temperaturen zwischen etwa 20 und 40°C in den meisten Anwendungen bevorzugt werden. Höhere Temperaturen können bei manchen Membranen zu einer Erhöhung der Membranporengröße führen, womit ein zusätzlicher Parameter bereitgestellt wird, der zur Optimierung der Reinigung eingestellt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Filtration in einer Membranreinigungsmaschine, die eine Vorrichtung zur automatischen Kontrolle der Strömungsgeschwindigkeit, des Drucks, der Temperatur und anderer Parameter bereitstellen kann, die die Reinigung beeinflussen können. Die Membranreinigungsmaschine Osmonics 213T eignet sich beispielsweise zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren, wie auch jene Maschinen anderer oben angeführter Firmen.
Die Membranen können gleich nach der Verwendung oder nachdem die Durchlässigkeit der Membran nachgelassen hat gereinigt werden. Die Reinigung kann, wenn erwünscht, bei einer leicht erhöhten Temperatur erfolgen, wobei mit Wasser oder einer Ätzlösung gespült werden kann. Wenn die Ströme geringe Enzymmengen enthalten, kann das Spülen in Gegenwart geringer Mengen eines Tensids, z.B. ULTRASIL^®, hilfreich sein. Es können auch Vorfilter (100 bis 200 μm) verwendet werden, um die kostenaufwendigeren Nanofiltrationsmembranen zu schützen. Es können bei Wunsch auch andere Reinigungsmittel verwendet werden. Die Auswahl des Reinigungsverfahrens hängt von der zu reinigenden Membran ab, und die Anweisungen des Herstellers sollten berücksichtigt werden. Das Reinigen kann mittels Vorwärtsspülen oder Rückwärtsspülen erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren können allein oder in Kombination mit anderen Verfahren zur Reinigung von Kohlenhydraten eingesetzt werden. Ein Ionenaustauschharz kann beispielsweise verwendet werden, um bestimmte Ionen aus einem Gemisch zu entfernen, das ein Saccharid von Interesse enthält, entweder vor oder nach einer Nanofiltration oder Umkehrosmose, oder sowohl vor und nach der Filtration. Ein Ionenaustausch ist insbesondere dann erwünscht, wenn Ionen wie z.B. Phosphate und Nucleotide, die nach der ersten Nanofiltration oder Umkehrosmose zurückbleiben, entfernt werden sollen. Im Falle der Sialyllactosesynthese kann dies, wie oben behandelt, erreicht werden, indem beispielsweise ein Anionenaustauschharz, wie z.B. AG1X-8 (Acetatform, BioRad; siehe z.B. BioRad-Katalog für andere Ionenaustauschharze), zu einem Retentat zugesetzt wird, das einen pH von etwa 3,0 oder geringer aufweist, bis die Phosphatkonzentration auf eine gewünschte Konzentration verringert wird. In diesem Vorgang wird Essigsäure freigesetzt, sodass dem Ionenaustausch wünschenswerterweise eine zusätzliche Reinigung durch das Nanofiltrations- oder Umkehrosmosesystem folgt. Die Lösung mit einem pH von 3,0 oder weniger kann mittels eines Osmonics MX07 oder einer ähnlichen Membran zirkuliert werden, bis die Leitfähigkeit des Permeats gering und stabilisiert ist. Der pH der Lösung kann sodann mit NaOH auf 7,4 erhöht und die Lösung durch die gleiche Membran erneut zirkuliert werden, um restliches Natriumacetat und Salz zu entfernen. Kationen können auf ähnliche Weise entfernt werden. Zur Entfernung von Mn²⁺ kann beispielsweise ein saures Ionenaustauschharz, wie z.B. AG50WX8 (H⁺) (BioRad), verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren eignen sich insbesondere zur Reinigung von Oligosacchariden, die mittels enzymatischer Synthese hergestellt worden sind. Eine enzymatische Synthese unter Verwendung von Glykosyltransferasen stellt ein wirkungsvolles Verfahren zur Herstellung von Oligosacchariden bereit. Bei einigen Anwendungen ist es erwünscht, das Oligosaccharid aus den Enzymen und anderen Reaktanten im enzymatischen Synthesereaktionsgemisch zu entfernen. Bevorzugte Verfahren zur Herstellung vieler Oligosaccharide umfassen Glykosyltransferasezyklen, die zumindest ein Mol anorganisches Pyrophosphat für jedes Mol des gebildeten Produkts herstellen und üblicherweise in Gegenwart eines zweiwertigen Metallions ausgeführt werden. Beispiele für Glykosyltransferasezyklen sind Sialyltransferasezyklen, die ein oder mehrere Enzyme sowie andere Reaktanten einsetzen. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5.374.541, WO 9425615 A, PCT/US96/04790 und PCT/US96/04824. Eine Reaktion, die zur Synthese von sialylierten Oligosacchariden verwendet wird, kann beispielsweise eine Sialyltransferase, eine CMP-Sialinsäuresynthetase, eine Sialinsäure, einen Akzeptor für die Sialyltransferase, CTP und ein lösliches zweiwertiges Metallkation enthalten. Eine exemplari sche α-(2,3)-Sialyltransferase, die als α-(2,3)-Sialtransferase (EC 2.4.99.6) bezeichnet wird, überträgt die Sialinsäure zum nichtreduzierenden Gal-Ende eines Galβ1→3Glc-Disaccharids oder -Glykosids. Siehe Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem. 256, 3159 (1981), Weinstein et al., J. Biol. Chem. 257, 13845 (1982), und Wen et al., J. Biol. Chem. 267, 21011 (1992). Eine weitere exemplarische α-2,3-Sialyltransferase (EC 2.4.99.4) überträgt Sialinsäure zum nichtreduzierenden Gal-Ende des Disaccharids oder Glykosids. Siehe Rearick et al., J. Biol. Chem. 254, 4444 (1979), und Gillespie et al., J. Biol. Chem. 267, 21004 (1992). Weitere exemplarische Enzyme umfassen Gal-β-1,4-GlcNAc-α-2,6-Sialyltransferase (siehe Kurosawa et al., Eur. J. Biochem. 219, 375–381 (1994)). Das Reaktionsgemisch enthält auch einen Akzeptor für die Sialyltransferase, vorzugsweise mit einer Galactosyleinheit. Geeignete Akzeptoren umfassen beispielsweise Galβ1→3GalNAc, Lacto-N-tetraose, Galβ1→3GlcNAc, Galβ1→3Ara, Galβ1→6GlcNAc, Galβ1→4Glc (Lactose), Galβ1→4Glcβ1-OCH₂CH₃, Galβ1→4Glcβ1-OCH₂CH₂CH₃, Galβ1→4Glcβ1-OCH₂C₆H₅, Galβ1→4GlcNAc, Galβ1-OCH₃, Melibiose, Raffinose, Stachyose und Lacto-N-neotetraose (LNnT). Die im Reaktionsgemisch vorliegende Sialinsäure kann nicht nur Sialinsäure selbst (5-N-Acetylneuraminsäure; 5-N-Acetylamino-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulsonsäure; NeuAc, manchmal auch als AcNeu oder NANA abgekürzt) enthalten, sondern auch 9-substituierte Sialinsäuren, wie z.B. ein 9-O-C₁-C₆-Acyl-NeuAc wie 9-O-Lactyl-NeuAc oder 9-O-Acetyl-NeuAc, 9-Desoxy-9-fluor-NeuAc und 9-Azido-9-desoxy-NeuAc. Die Synthese und Verwendung dieser Verbindungen in einem Sialylierungsverfahren ist in der internationalen Anmeldung WO 92/16640, veröffentlicht am 1. Oktober 1992, beschrieben.
In bevorzugten Ausführungsformen kann das Reaktionsmedium außerdem ein CMP-Sialinsäure-Rezyklierungssystem umfassen, das zumindest Folgendes umfasst: 2 Mol Phosphatdonor pro Mol Sialinsäure und katalytische Mengen des Adeninnucleotids, eine Kinase, die fähig ist, Phosphat aus dem Phosphatdonor zu den Nucleosiddiphosphaten zu übertragen, und eine Nucleosidmonophosphatkinase, die fähig ist, das Endphosphat aus einem Nucleosidtriphosphat zu einem CMP zu übertragen. Ein geeignetes CMP-Sialinsäure-Regenerationssystem umfasst beispielsweise Cytidin monophosphat (CMO), ein Nucleosidtriphosphat (z.B. Adenosintriphosphat (ATP)), einen Phosphatdonor (beispielsweise Phosphoenolpyruvat oder Acetylphosphat), eine Kinase (z.B. Pyruvatkinase oder Acetatkinase), die fähig ist, ein Phosphat aus dem Phosphatdonor zu Nucleosiddiphosphaten zu übertragen, und eine Nucleosidmonophosphatkinase (z.B. Myokinase), die fähig ist, das Endphosphat aus einem Nuclosidtriphosphat zu einem CMP zu übertragen. Die zuvor behandelte α-(2,3)-Sialyltransferase und CMP-Sialinsäuresynthetase kann auch formal als Teil eines CMP-Sialinsäure-Regenerationssystems angesehen werden. Für Ausführungsformen, worin kein CMP-Sialinsäure-Rezyklierungssystem verwendet wird, umfasst das Reaktionsmedium vorzugsweise zudem eine Phosphatase.
Pyruvat ist ein Nebenprodukt des Sialyltransferasezyklus und kann in einer anderen Reaktion verwendet werden, worin N-Acetylmannosamin (ManNAc) und Pyruvat in Gegenwart einer NeuAc-Aldolase (EC 4.1.3.3) umgesetzt werden, um eine Sialinsäure zu bilden. Alternativ dazu kann die Isomerisierung von GlcNAc zu ManNAc genützt werden, und das weniger kostenaufwendige GlcNAc kann als Ausgangsmaterial für die Sialinsäurebildung verwendet werden. Folglich kann die Sialinsäure durch ManNAc (oder GlcNAc) und eine katalytische Menge von NeuAc-Aldolase ersetzt werden. Obwohl NeuAc-Aldolase auch die Umkehrreaktion katalysiert (NeuAc zu ManNAc und Pyruvat), wird das hergestellte NeuAc mittels CMP-NeuAc, das durch die CMP-Sialinsäuresynthetase katalysiert wird, irreversibel in den Reaktionszyklus aufgenommen. Zudem kann das Ausgangsmaterial, ManNAc, auch mittels chemischen Überführens von GlcNAc unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren (siehe z.B. Simon et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 7159 (1988)) hergestellt werden. Die enzymatische Synthese von Sialinsäure und deren 9-substituierten Derivaten sowie die Verwendung einer resultierenden Sialinsäure in einem anderen Sialylierungsreaktionsschema ist in der internationalen Anmeldung WO 92/16640, veröffentlicht am 1. Oktober 1992, offenbart und hierin durch Verweis aufgenommen.
Wenn eine Galactosyltransferase für die enzymatische Synthese eines Oligosaccharids verwendet wird, enthält das Reaktionsmedium vorzugsweise zusätzlich zu einer Galactosyltransferase, einem Donorsubstrat, einem Akzeptorzucker und einem zweiwertigen Metallkation ein Donorsubstrat-Rezyklierungssystem, das zumindest Folgendes umfasst: 1 Mol Glucose-1-phosphat pro Mol Akzeptorzucker, einen Phosphatdonor, eine Kinase, die fähig ist, Phosphate aus dem Phosphatdonor zu Nucleosiddiphosphaten zu übertragen, und eine Pyrophosphorylase, die fähig ist, UDP-Glucose aus UTP und Glucose-1-phosphat zu bilden, und katalytische Mengen von UDP und eine UDP-Galactose-4-epimerase. Beispiele für Galactosyltransferasen umfassen α-(1,3)-Galactosyltransferase (E. C. Nr. 2.4.1.151, siehe z.B. Dabkowski et al., Transplant Proc. 25, 2921 (1993), und Yamamoto et al., Nature 345, 229–233 (1990)) und β-(1,4)-Galactosyltransferase (E. C. Nr. 2.4.1.38).
Oligosaccharide, die mittels anderer enzymatischer Verfahren synthetisiert werden, können auch anhand der erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt werden. Die Verfahren eignen sich beispielsweise zur Reinigung von Oligosacchariden, die in nichtzyklischen oder teilzyklischen Reaktionen wie z.B. mittels einfacher Inkubation eines aktivierten Saccharids und eines geeigneten Akzeptormoleküls mit einer Glykosyltransferase unter Bedingungen hergestellt werden, die wirksam sind, um das Saccharid auf das Akzeptormolekül zu übertragen und daran zu binden. Glykosyltransferasen, die jene z.B. im US-Patent 5.180.674 und in den internationalen Patentanmeldungen Nr. WO 93/13198 und WO 95/02683 beschriebenen sowie die von Ios-Locus von Neisseria (siehe US-Patent 5.545.553) kodierten Glykosyltransferasen umfassen, können an eine Zelloberfläche gebunden oder ungebunden sein. Oligosaccharide, die unter Einsatz dieser Glykosyltransferasen erhalten werden können, umfassen beispielsweise unter vielen anderen Galα(1→4)Galβ(1→4)Glc, GlcNAcβ(1,3)Galβ(1,4)Glc, Galβ(1→4)GlcNAcβ(1→3)Galβ(1→4)Glc und GalNAcβ(1→3)Galβ(1→4)GlcNAcβ(1→3)Galβ(1→4)Glc.
Unter den Verbindungen, die mittels der beschriebenen Verfahren gereinigt werden können, befinden sich Sialinsäure und jeder beliebige Zucker mit einer Sialinsäu regruppierung. Diese umfassen Sialylgalactoside, einschließlich Sialyllactoside sowie Verbindungen mit der Formel: NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)GlcN(R¹)β-OR oderNeuAcα(2→3)Galβ(1→4)GlcN(R')β(1→3)Galβ-OR
In diesen Formeln ist R' ein Alkyl oder ein Acyl mit 1 bis 18 Kohlenstoffen, 5,6,7,8-Tetrahydro-2-naphthamido; Benzamido; 2-Naphthamido; 4-Aminobenzamido; oder 4-Nitrobenzamido. R ist ein Wasserstoff, ein C₁-C₆-Alkyl, ein Saccharid, ein Oligosaccharid oder eine Aglycongruppe mit zumindest einem Kohlenstoffatom. Die Bezeichnung "Aglycongruppe mit zumindest einem Kohlenstoffatom" bezieht sich auf eine Gruppe -A-Z, worin A für eine Alkylengruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen steht, die gegebenenfalls mit Halogen, Thiol, Hydroxy, Sauerstoff, Schwefel, Amino, Imino oder Alkoxy substituiert ist. Z ist Wasserstoff, -OH, -SH, -NH₂, -NHR¹, -N(R¹)₂, -CO₂H, -CO₂R¹, -CONH₂, -CONHR¹, -CON(R¹)₂, -CONHNH₂ oder -OR¹, worin die R¹ unabhängig voneinander eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen sind. Zusätzlich kann R
sein, worin n, m, o = 1 bis 18 sind; (CH₂)_n-R² (worin n = 0 bis 18 ist), worin R² ein unterschiedlich substituierter aromatischer Ring, vorzugsweise eine Phenylgruppe, ist, mit einer oder mehreren Alkoxygruppen substituiert, vorzugsweise Methoxy oder O(CH₂)_mCH₃ (worin m = 0 bis 18 ist), oder eine Kombination davon ist. R kann auch 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propyl sein.
Die vorliegende Erfindung eignet sich auch zur Reinigung einer Vielzahl von Verbindungen, die Selektin bindende Kohlenhydratgruppierungen umfassen. Diese Selektin bindenden Gruppierungen weisen folgende allgemeine Formel auf: R¹Galβ1,m(Fucα1,n)GlcNR⁰(R²)_p- worin R⁰ (C₁-C₈-Alkyl)carbonyl, (C₁-C₈-Alkoxy)carbonyl oder (C₂-C₉-Alkenyloxy)carbonyl und R¹ ein Oligosaccharid oder eine Gruppe mit folgender Formel ist:
R³ und R⁴ können gleich oder unterschiedlich und H, C₁-C₈-Alkyl, Hydroxy-(C₁-C₈-Alkyl), Aryl-(C₁-C₈-Alkyl) oder (C₁-C₈-Alkoxy)-(C₁-C₈-Alkyl) sein, und zwar substituiert oder unsubstituiert. R² kann H, C₁-C₈-Alkyl, Hydroxy-(C₁-C₈-Alkyl), Aryl-(C₁-C₈-Alkyl), (C₁-C₈-Alkyl)aryl, Alkylthio, α1,2Man, α1,6GalNAc, β1,3Galβ1, 4Glc, α1,2Man-R⁸, α1,6GalNAc-R⁸ und β1,3Gal-R⁸ sein. R⁸ kann H, C₁-C₈-Alkyl, C₁-C₈-Alkoxy, Hydroxy-(C₁-C₈-Alkyl), Aryl-(C₁-C₈-Alkyl), (C₁-C₈-Alkyl)aryl oder Alkylthio sein. In der Formel sind m und n ganze Zahlen, die entweder 3 oder 4 sein können; p kann 0 oder 1 sein.
Die oben angeführten substituierten Gruppen können mit Hydroxy-, Hydroxy(C₁-C₄-alkyl)-, Polyhydroxy(C₁-C₄-alkyl)-, Alkanoamido- oder Hydroxyalkanoamidosubstituenten substituiert sein. Bevorzugte Substituenten umfassen Hydroxy-, Polyhydroxy(C₃-alkyl)-, Acetamido- und Hydroxyacetamidosubstituenten. Ein substituierter Rest kann mehr als eine Substitution aufweisen, die gleich oder unterschiedlich sein kann.
Bei Ausführungsformen, worin R¹ ein Oligosaccharid ist, ist das Oligosaccharid vorzugsweise ein Trisaccharid. Bevorzugte Trisaccharide umfassen NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,3 oder NeuGcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,3.
Für Ausführungsformen, worin R¹ die Gruppe mit der Formel:
ist, bilden R³ und R⁴ einen einzelnen Rest mit der Formel: -R⁵- oder-(R⁶)_q-O-(R⁷)_r- worin R⁵ ein zweiwertiges C₃-C₇-Alkyl, substituiert oder unsubstituiert, ist, R⁶ und R⁷ gleich oder unterschiedlich und ein zweiwertiges C₁-C₆-Alkyl, substituiert oder unsubstituiert, sind. In der Formel sind q und r ganze Zahlen, die gleich oder unterschiedlich und entweder 0 oder 1 sein können. Die Summe von q + r ist zumindest 1.
Eine bevorzugtere Struktur eines einzelnen durch R3 und R4 gebildeten Rests ist eine mit der folgenden Formel: -(R⁶)-O- worin R⁶ ein zweiwertiges C₃-C₄-Alkyl, substituiert oder unsubstituiert, ist. Beispielsweise kann R⁶ die Formel -CH₂-CH₂-CH₂-CH₂- aufweisen, vorzugsweise substituiert. Der Rest kann mit Hydroxy, Polyhydroxy-(C₃-Alkyl) und substituierten oder unsubstituierten Alkanoamidogruppen, wie z.B. Acetamido oder Hydroxyacetamido, substituiert sein. Die substituierte Struktur bildet üblicherweise ein Monosaccharid, vorzugsweise eine Sialinsäure, wie z.B. NeuAc oder NeuGc, die α2,3 an den Gal-Rest gebunden sind.
In der obigen allgemeinen Formel ist sowohl m als auch n eine ganze Zahl und kann entweder 3 oder 4 sein. Folglich ist in einer Reihe von Strukturen Galβ1,4 und Fucα1,3 an GlcNAc gebunden. Diese Formel umfasst das SLe^x-Tetrasaccharid. SLe^x weist die Formel NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1- auf. Diese Struktur wird selektiv von LECCAM tragenden Zellen erkannt. Die SLe^x-Verbindungen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt werden können, umfassen NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1-Gal-OEt, NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1,4Galβ1-OEt und andere, die in der internationalen Anmeldung WO 91/19502 beschrieben sind. Andere Verbindungen, die unter Verwendung der Verfahren gereinigt werden können, umfassen jene im US-Patent 5.604.207 beschriebenen mit der Formel:
worin Z Wasserstoff, C₁-C₆-Acyl oder ist.
Y ist aus der aus C(O), SO₂, HNC(O), OC(O) und SC(O) bestehenden Gruppe ausgewählt.
R¹ ist aus der aus einer Aryl-, einer substituierten Aryl- und einer Phenyl-C₁-C₃-Alkylengruppe bestehenden Gruppe ausgewählt, worin der Arylsubstituent aus der aus Halogenid-, Trifluormethyl-, Nitro-, C₁-C₁₈-Alkyl-, C₁-C₁₈-Alkoxy-, Amino-, Mono-C₁-₁₈-Alkylamino-, Di-C₁-C₁₈-Alkylamino-, Benzylamino-, C₁-C₁₈-Alkylbenzylamino-, C₁-C₁₈-Thioalkyl- und C₁-C₁₈-Alkylcarboxamidogruppen bestehenden Gruppe ausgewählt ist; oder
R¹Y ist ein Allyloxycarbonyl oder ein Chloracetyl;
R² ist aus einer aus Monosaccharid (einschließlich β1,3Gal-OR, worin R=H, Alkyl, Aryl oder Acyl ist), Disaccharid, Wasserstoff, unverzweigtem, verzweigtem oder zyklischem C₁-C₁₈-Hydrocarbyl, C₁-C₆-Alkyl, 3-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)propyl, C₁-C₅-Alkylen-ω-Carboxylat und ω-trisubstituiertem Silyl-C₂-C₄-Alkylen bestehenden Gruppe ausgewählt, worin das ω-trisubstituierte Silyl eine Silylgruppe ist, die drei Substi tuenten aufweist, welche unabhängig voneinander aus der aus C₁-C₄-Alkyl und Phenyl bestehenden Gruppe ausgewählt sind;
oder die OR² bilden zusammen ein unverzweigtes, verzweigtes oder zyklisches C₁-C₁₈-Hydrocarbylcarbamat;
R³ ist Wasserstoff oder C₁-C₆-Acyl;
R⁴ ist Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl oder Benzyl;
R⁵ ist aus der aus Wasserstoff, Benzyl, Methoxybenzyl, Dimethoxybenzyl und C₁-C₆-Acyl bestehenden Gruppe ausgewählt;
R⁷ ist Methyl oder Hydroxymethyl; und
X ist aus der aus C₁-C₆-Acyloxy, C₂-C₆-Hydroxyacyloxy, Hydroxy, Halogen und Azido bestehenden Gruppe ausgewählt.
Eine verwandte Reihe von Strukturen, die in der allgemeinen Formel enthalten ist, ist jene, worin Galβ1,3 gebunden ist und Fucα1,4 gebunden ist. Beispielsweise wird das Tetrasaccharid, NeuAcα2,3Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAcβ1-, das hierin als SLe^a bezeichnet ist, durch Selektinrezeptoren erkannt. Siehe Berg et al., J. Biol. Chem. 266, 14869–14872 (1991). Insbesondere zeigen Berg et al., dass Zellen, die mit E-Selektin-cDNA transformiert sind, Neoglykoproteine selektiv binden, die SLe^a umfassen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich auch zur Reinigung von Oligosaccharidverbindungen mit der allgemeinen Formel Galα1,3Gal-, einschließlich Galα1,3Galβ1,4Glc(R)β-O-R¹, worin R -(CH₂)_n-COX ist, wobei X=OH, OR² oder -NHNH₂ ist, R=OH oder NAc ist, und R² ist Wasserstoff, ein Saccharid, Oligosaccharid oder eine Aglycongruppe mit zumindest einem Kohlenstoffatom, und n ist eine ganze Zahl von 2 bis 18, noch bevorzugter von 2 bis 10. Beispielsweise kann eine Verbindung, die die Formel Galα1,3Galβ1,4GlcNAcβ-O-(CH₂)₅-COOH aufweist, unter Verwendung von in den Beispielen 7 bis 8 beschriebenen Verfahren gereinigt werden. Unter den Verbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung gereinigt werden können, befinden sich auch Lacto-N-neotetraose (LNnT), GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glc (LNT-2), Sialyl(α2,3)-lactose und Sialyl(α2,6)-lactose.
In den obigen Beschreibungen werden die Bezeichnungen im Allgemeinen gemäß ihren Standardbedeutungen verwendet. Die hierin verwendete Bezeichnung "Alkyl" bezieht sich auf einen verzweigten oder unverzweigten, gesättigten oder ungesättigten, einwertigen oder zweiwertigen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffen, einschließlich Niederalkyle mit 1 bis 8 Kohlenstoffen, wie z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Butyl, n-Hexyl und dergleichen, Cycloalkyle (3 bis 7 Kohlenstoffe), Cycloalkylmethyle (4 bis 8 Kohlenstoffe) und Arylalkyle. Die Bezeichnung "Alkoxy" bezieht sich auf Alkylreste, die an den Rest des Moleküls durch Sauerstoff gebunden sind, z.B. Ethoxy, Methoxy oder n-Propoxy. Die Bezeichnung "Alkylthio" bezieht sich auf Alkylreste, die an den Rest des Moleküls durch Schwefel gebunden sind. Die Bezeichnung "Acyl" bezieht sich auf einen Rest, der durch Entfernung der Hydroxylgruppe aus einer organischen Säure stammt. Beispiele umfassen Acetyl, Propionyl, Oleoyl und Myristoyl.
Die Bezeichnung "Aryl" bezieht sich auf einen Rest, der durch Entfernung eines Atoms aus einem aromatischen Kohlenwasserstoff stammt, z.B. Phenyl von Benzol. Der aromatische Kohlenwasserstoff kann mehr als einen ungesättigten Kohlenstoffring aufweisen, z.B. Naphthyl.
Die Bezeichnung "Alkoxy" bezieht sich auf Alkylreste, die an den Rest des Moleküls durch Sauerstoff gebunden sind, z.B. Ethoxy, Methoxy oder n-Propoxy.
Die Bezeichnung "Alkylthio" bezieht sich auf Alkylreste, die an den Rest des Moleküls durch Schwefel gebunden sind.
Ein "Alkanoamido"-Rest weist die allgemeine Formel -NH-CO-(C₁-C₆-Alkyl) auf und kann substituiert oder nicht substituiert sein. Wenn substituiert, ist der Substituent typischerweise Hydroxyl. Die Bezeichnung umfasst insbesondere zwei bevorzugte Strukturen, und zwar Acetamido, -NH-CO-CH₃, und Hydroxyacetamido, -NH-CO-CH₂-OH.
Die Bezeichnung "heterozyklische Verbindungen" bezieht sich auf Ringverbindungen mit 3 oder mehr Atomen, worin zumindest eines der Atome kein Kohlenstoff ist (z.B. N, O, S, Se, P oder As). Beispiele für solche Verbindungen umfassen Furane (einschließlich die Furanoseform von Pentosen, wie z.B. Fucose), Pyrane (einschließlich die Pyranoseform von Hexosen, wie z.B. Glucose und Galactose), Pyrimidine, Purine, Pyrazine und dergleichen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich nicht nur zur Reinigung von Kohlenwasserstoffen, die neu synthetisiert sind, sondern auch für solche, die Abbauprodukte, z.B. enzymatischen Abbaus, darstellen. Siehe z.B. Sinnott, M. L., Chem. Rev. 90, 1171–1202 (1990), für Beispiele von Enzymen, die den Abbau von Oligosacchariden katalysieren.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Reinigung von Nucleotiden, Nucleotidzuckern und verwandten Verbindungen bereit. Beispielsweise kann ein Nucleotidzucker, wie z.B. GDP-Fucose, GDP-Mannose, CMP-NeuAc, UDP-Glucose, UDP-Galactose, UDP-Galactose, UDP-N-Acetylgalactosamin und dergleichen, anhand der hierin beschriebenen Verfahren gereinigt werden. Die Verfahren eignen sich auch zur Reinigung von Nucleotiden und Nucleotiden in verschiedenen Zuständen der Phosphorylierung (z.B. CMP, CDP, CTP, GMP, GDP, GTP, TMP, TDP, TTP, AMP, ADP, ATP, UMP, UDP, UTP) sowie von Desoxyformen dieser und anderer Nucleotide.
Die nachstehenden Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung oder Definition der Erfindung.
BEISPIELE
Die Beispiele 1 bis 5 stellen die Synthese von Sialyllactose und dessen Reinigung mittels Nanofiltration und Ionenaustausch dar. Zusammengefasst wurde N-Acetyl-D-mannosamin (ManNAc) aus N-Acetyl-D-glucosamin (GluNAc) unter basischen Bedingungen gewonnen. Das ManNAc wurde mit Natriumpyruvat kondensiert, um eine Sialylsäure enzymatisch herzustellen. Der Sialyltransferasezyklus wurde eingesetzt, um die Sialinsäure in Sialyllactose zu überführen, die anschließend mittels Nanofiltration und Ionenaustausch gereinigt wurde. Beispiel 6 stellt die Auftrennung der organischen und anorganischen Salze mittels Nanofiltration dar. Beispiel 7 stellt die Auftrennungseigenschaften der Polybenzamid-Nanofiltrationsmembranen dar. Beispiel 8 stellt die Auftrennungseigenschaften der Polyamid-Nanofiltrationsmembranen dar.
BEISPIEL 1
Synthese und Reinigung von Sialinsäure
Dieses Beispiel stellt ein Verfahren zur Reinigung von Sialinsäure unter Verwendung eines relativ kostengünstigen Substrats, GlcNAc, statt des kostenaufwendigeren ManNAc oder einer Sialinsäure dar. Es wurde ein Verfahren angewandt, das dem in Simon et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 7159 (1988), beschriebenen ähnlich ist, um GlcNAc in ManNAc zu überführen. Kurz gefasst wurde GlcNAc (1.000 g, 4,52 mol) in Wasser (500 ml) gelöst. Der pH wurde mit 50%iger NaOH (~115 ml) auf 12,0 eingestellt. Die Lösung wurde 7,5 Stunden lang unter Argon gerührt, anschließend in einem Eisbad abgekühlt und der pH mit konzentrierter HCl (~200 ml) auf 7,7 eingestellt. Die Sialinsäure wurde sodann durch die Aldolkondensation von ManNac hergestellt.
Um eine Sialinsäure zu erhalten, wurde das im vorigen Schritt hergestellte ManNAc einer Aldolkondensation unterzogen, die durch N-Acetylneuraminsäurealdolase (Neu5Ac-Aldolase) und Brenztraubensäure vermittelt wurde. Zu einer wässrigen Lö sung (1,5 l), die etwa 57 g (0,258 mol) ManNAc und 193 g GlcNAc aus einer basenkatalysierten Epimerisation enthielt, wurden 123,8 g Natriumpyruvat (1,125 mol), 1,5 g Rinderserumalbumin und 0,75 g Natriumazid zugesetzt. Der pH wurde auf 7,5 eingestellt, und es wurden 11.930 U der Sialinsäurealdolase zugesetzt. Die Lösung wurde 7 Tage lang bei 37°C inkubiert. Die HPLC-Analyse an einer Aminex-HPX87H-Säule (BioRad) (0,004 M H₂SO₄, 0,8 ml/min, Überwachen bei A₂₂₀) ergab, dass die Lösung 0,157 M Sialinsäure (91%ige Umsetzung von ManNac, 0,235 mol) enthielt.
BEISPIEL 2
Synthese von Sialyllactose unter Verwendung des Sialyltransferasezyklus
Zu der in Beispiel 1 hergestellten Sialinsäure wurde Lactosemonohydrat (79,2 g, 0,22 mol), 0,7 g Rinderserumalbumin, Phosphoenolpyruvatmonokaliumsalz (37 g, 0,22 mol) zugesetzt, und der pH wurde auf 7,5 eingestellt. CMP (2,84 g, 0,0088 mol), ATP (0,54 g, 0,0009 mol) wurden zugesetzt und der pH wieder auf 7,5 eingestellt. Es wurde Natriumazid (0,35 g) sowie die folgenden Enzyme zugesetzt: Pyruvatkinase (19.800 U), Myokinase (13.200 U), CMP-Sialinsäuresynthetase (440 U) und Sialyltransferase (165 U). 66 ml von 1 M MnCl₂ wurden zugesetzt, und das Endvolumen wurde mit Wasser auf 2,2 l eingestellt. Die Umsetzung erfolgte bei Raumtemperatur.

Die Umsetzung wurde täglich mittels Dünnschichtchromatographie (DC) überprüft, und [Mn²⁺] wurde mittels Ionenchromatographie bestimmt. Zugaben und Einstellungen wurden wie in Tabelle 1 angeführt vorgenommen. Tabelle 1

Tag 2	44 ml 1 M MnCl₂ zugesetzt
Tag 4	43 ml 1 M MnCl₂ zugesetzt
Tag 6	zugesetzt: 34,3 ml 1 M MnCl₂, 37 g PEP; pH auf 7,5 eingestellt; Pyruvatkinase (19.800 U), Myokinase (13.200 U), CMP-Sialinsäuresynthetase (440 U) und Sialyltransferase (165 U)
Tag 7	31,7 ml 1 M MnCl₂

Tag 8	24,6 ml 1 M MnCl₂
Tag 9	44 ml 1 M MnCl₂
Tag 10	30,8 ml 1 M MnCl₂
Tag 11	31,7 ml 1 M MnCl₂
Tag 12	24,6 ml 1 M MnCl₂, pH auf 7,5 eingestellt
Tag 13	440 U CMP-Sialinsäuresynthetase, 82,5 U Sialyltransferase
Tag 14	pH auf 7,5 eingestellt
Tag 16	37,7 ml 1 M MnCl₂, 19.800 U Pyruvatkinase, 13.200 U Myokinase
Tag 17	26 g Phosphoenolpyruvat, Trinatriumsalz

Die Sialyllactoseausbeute betrug wie mittels DC bestimmt etwa 70 bis 80%.
BEISPIEL 3
Synthese von Sialyllactose unter Verwendung des Sialyltransferasezyklus
Dieses Beispiel stellt die Herstellung von α-N-Acetylneuraminsäure-(2,3)-β-galactosyl-(1,4)-glucose unter Verwendung des Sialyltransferasezyklus dar, wobei die Manganionenkonzentration gesteuert wird.
In einem Polypropylengefäß wurden Phosphoenolpyruvattrinatriumsalz (285,4 g, 1,22 mol) und Sialinsäure (197 g, 0,637 mol) in 5 l Wasser gelöst, und der pH wurde mit 6 M NaOH auf 7,1 eingestellt. Es wurden Cytidin-5'-monophosphat (5,14 g, 15,9 mmol) und Kaliumchlorid (7,9 g, 0,106 mol) zugesetzt, und der pH wurde mit 6 M NaOH auf 7,45 eingestellt. Dazu wurden Pyruvatkinase (28.000 U), Myokinase (17.000 U), Adenosintriphosphat (0,98 g, 1,6 mmol), CMP-NeuAc-Synthetase (1.325 U), α2,3Sialyltransferase (663 U) und MnCl₂·4H₂O (52,4 g, 0,265 mol) zugesetzt und vermischt. Zu 3,7 l des resultierenden Gemischs wurden Lactose (119 g, 0,348 mol) und Natriumazid (1,75 g) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur gehalten und täglich mittels Dünnschichtchromatographie (DC) und Ionenchromatogrphie überprüft. Nach 2 Tagen wurden zusätzliche Enzyme wie folgt zugesetzt: Pyruvatkinase (38.100 U), Myokinase (23.700 U), CMP-NeuAc-Synthetase (935 U) und α-2,3-Sialyltransferase (463 U). Der pH wurde regelmäßig mit 6 M NaOH auf 7,5 eingestellt. Zudem wurde die Manganionenkonzentration gemessen und wie in nachstehender Tabelle 2 ergänzt.
Tabelle 2
An Tag 9 war die Umsetzung im Wesentlichen gemäß DC beendet. Wie aus den Ergebnissen der Tabelle hervorgeht, führte die Abreicherung von Mn⁺⁺ zum fast täglichen Zusetzen von zusätzlichen Mengen von MnCl₂·4H₂O, um die Metallionenkonzentration beizubehalten. Manganion ist ein erforderlicher Cofaktor für zumindest ein Enzym im Sialyltransferasezyklus. Das Manganion und das anorganische Phosphat bilden jedoch einen Komplex mit sehr geringer Löslichkeit. Aufgrund dieser eingeschränkten Löslichkeit kann der Transferasezyklus fortschreiten, jedoch bei reduzierten Reaktionsgeschwindigkeiten. Indem die Manganionen, die mittels Ausfällen mit Pyrophosphat verloren gehen, ergänzt werden, kann die Reaktionsgeschwindigkeit beibehalten werden. Wenn die Manganionenkonzentration folglich in einem optimalen Bereich gehalten wird, kann der Sialyltransferasereaktionszyklus vollständig beendet werden.
BEISPIEL 4
Reinigung von Sialyllactose mittels Ionenaustausch und Umkehrosmose
Dieses Beispiel stellt die Aufarbeitung und Reinigung des in Beispiel 2 hergestellten Trisaccharids dar, gefolgt von Peracetylierung und Veresterung. Eine Lösung (2 l) von Natrium-5-acetamido-3,5-didesoxy-α-D-glycero-D-galacto-nonulopyranosylonat-(2-3)-O-β-D-galactopyranosyl-(1-4)-O-β-D-glucopyranose, die aus der Wirkung einer Sialyltransferase in Gegenwart der geeigneten Cofaktoren auf Lactose (55 g) hergestellt wurde, wurde papierfiltriert. Das Filtrat wurde durch eine Membran mit einem Molekulargewicht-Cutoff von 3.000 oder 10.000 passieren gelassen, um das Protein aus dem gewünschten Produkt zu entfernen. Das Eluat wurde eingeengt und entsalzt, indem es in einer geeigneten Vorrichtung (Kat.-Nr. CDRN500 60, Millipore, Bedford, MA) durch eine Polyamidumkehrosmosemembran passieren gelassen wurde. Das Produkt enthaltende Retentat wurde zu einem dicken Sirup eingeengt. Gegebenenfalls kann das Retentat mit einem chelatbildenden Harz behandelt werden, um die zweiwertigen Kationen zu entfernen. Nach dem Filtrieren enthielt das Filtrat das gewünschte Produkt, welches, wie die ¹HMR-Spektroskopie zeigt, im Wesentlichen frei von Salzen und in einem hohen Reinheitszustand war. Ansonsten wurde der Sirup auf solche Weise mit Pyridin (2 × 200 ml) eingeengt. Der Einengungskolben wurde mit einer Lösung von N,N-Dimethylaminopyridin (2,2 g) in Pyridin (1,2 l) befüllt. Essigsäureanhydrid (0,83 l) wurde 1 Stunde lang zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde 24 bis 48 Stunden lang langsam bei Raumtemperatur rotieren gelassen. Die Umsetzung wurde mittels DC (Methanol:Dichlormethan 1:9) überprüft. Nach der vollständigen Umsetzung wurde ein Vakuum angelegt und die Lösung eingeengt, um einen Rückstand zu ergeben.
Der Rückstand wurde in Ethylacetat (1,5 l) gelöst. Diese Lösung wurde mit 5%iger wässriger Salzsäure (1,5 l) gewaschen, gefolgt von gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat (1,5 l) und schließlich Wasser (1,5 l). Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde zu einem halbfesten Rückstand eingeengt. Das per-O-acetylierte Lactontrisaccharid (69 g) wurde in Methanol (350 ml) gelöst, und eine Natriummethoxidlösung (17,5 ml, 25%ige Lösung in Methanol) wurde zugesetzt, gefolgt von Wasser (3,5 ml). Wenn die mit Isopropanol:Ammoniumhydroxid:Wasser 7:1:2 entwickelte DC die Beendigung der Umsetzung anzeigte, wurde zu der Lösung Essigsäure (2 ml) zugesetzt. Zum Ausfällen des Produkts wurde zu der Lösung Ethylether (180 ml) zugesetzt. Dieser Fest stoff wurde filtriert und in Wasser (350 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurde Aktivkohle (24 g) zugesetzt und 1 Stunde lang auf 60°C erhitzt. Diese Lösung wurde auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen und filtriert. Die Einengung des Filtrats ergab das feste Produkt (34 g). Die ¹H-NMR-Spektroskopie ergab, dass dieser Feststoff eine reine Sialyllactose ist, die 11 Gew.-% Natriumacetat enthält.
BEISPIEL 5
Reinigung von Sialyllactose mittels Nanofiltration
Ein dem in Beispiel 2 ähnliches Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einem MWCO von 10 kDa einer Filtration unterzogen, um die Proteine zu entfernen. Die Phosphatkonzentration [PO₄ ^3–] betrug, wie durch ein nachstehend beschriebenes Standardphosphortestverfahren ermittelt, mehr als 2,8 mM.

Die Lösung wurde mit konzentrierter HCl (~500 ml) auf einen pH von 3,0 eingestellt. Diese wurde dann auf der Osmonics-231T-Membranreinigungsmaschine (Membrantyp MX07) bei einem pH von 3 5 Stunden lang gereinigt, bis die Leitfähigkeit der Permeatlösung unverändert blieb. Die Lösung wurde sodann aus der Maschine ausgespült, und die vereinigte Spülungs- und Zuführlösung wurde mit NaOH behandelt, bis ein pH von 7,4 erreicht wurde. Die Mn²⁺-Konzentration wurde, wie unten beschrieben, mittels HPLC gemessen. Die Nanofiltrationsparameter waren wie folgt:

Betriebsdruck:	P_f = 689,5 × 10³ Pa (100 psi)
Konzentratfließgeschwindigkeit:	Q_c = 18,9 l/min (5 GPM)
Permeatfließgeschwindigkeit:	Q_f = 26,46 l/h (7 GPM)
Temperaturbereich:	20 bis 40°C
Volumen:	18,9 l (5 Gallonen)

Die Leitfähigkeit des anfänglichen Permeats betrug 28,1 mS. Nach 5 Stunden erneuter Zirkulation fiel die Leitfähigkeit auf 115 μS, die Phosphatkonzentration [PO₄ ^–3] verringerte sich auf 770 μM, und die Mangankonzentration [Mn²⁺] betrug 3,4 mM.

Die Lösung wurde sodann auf einen pH von 7,4 eingestellt und auf der Membranreinigungsmaschine (Osmonics, Membrantyp MX07) etwa 1 Stunde lang gereinigt, bis die Leitfähigkeit der Permeatlösung unverändert blieb. Die Lösung wurde sodann aus der Membranmaschine ausgespült. Die Nanofiltrationsparameter waren wie folgt:

Betriebsdruck:	P_f = 689,5 × 10³ Pa (100 psi)
Konzentratfließgeschwindigkeit:	Q_c = 18,9 l/min (5 GPM)
Permeatfließgeschwindigkeit:	Q_f = 1,134 l/min (0,3 GPM)
Temperaturbereich:	20 bis 40°C
Volumen:	18,9 l (5 Gallonen)

Die Ergebnisse der Filtration waren wie folgt:

Leitfähigkeit:	anfängliche Permeatleitfähigkeit: 2,01 mS nach 5-stündiger erneuter Zirkulation: 93,7 μS
Phosphatkonzentration:	[PO₄ ^–3] = 410 μM
Mangankonzentration:	[Mn²⁺] = 3,0 mM

Die obige Lösung (22,68 l (6 Gallonen)) wurde anschließend mit AG50WX8-(H⁺)-Harz (BioRad, 1,18 kg) behandelt und 2 Stunden lang gerührt, bis ein pH von 2,0 erreicht war. Das Harz wurde sodann filtriert, was eine sehr hellgelbe Lösung ergab. Es wurde lediglich eine minimale Menge von [Mn²⁺] mittels HPLC detektiert. Die Lösung wurde anschließend mit NaOH (50 Gew.-%) auf einen pH von 7,4 neutralisiert.

Vor der Harzbehandlung: [Mn²⁺] = 3 mM; [PO₄ ^–3] = 410 μM

Nach der Harzbehandlung: pH = 3,[Mn²⁺] = 1,23 mM; pH = 2, [Mn²⁺] = 6,8 μM; [PO₄ ^–3] = 190 μM
Ein kleiner Anteil der obigen Lösung wurde mit AG1X8-Harz (Acetatform) behandelt, um die Entfernung des Phosphats voranzutreiben. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle 3 angeführt:
Tabelle 3

Die Lösung wurde durch erneute Zirkulierung der Lösung unter Einsatz einer Osmonic-Membranreinigungsmaschine (Osmonic MX07) 5 Stunden lang unter folgenden Bedingungen gereinigt:

Betriebsdruck:	P_f = 689,5 × 10³ Pa (100 psi)
Konzentratfließgeschwindigkeit:	Q_c = 18,9 l/min (5 GPM)
Permeatfließgeschwindigkeit:	Q_f = 0,756 l/min (0,2 GPM)
Temperaturbereich:	20 bis 40°C
Volumen:	18,9 l (5 Gallonen)

Die Ergebnisse waren wie folgt:

Permeatleitfähigkeit: anfängliche Permeatleitfähigkeit: 0,136 mS nach 5-stündiger Auftrennung: 45 μS
Die Lösung wurde sodann auf 3 bis 4 l eingeengt, wonach Aktivkohle (J. T. Baker, 180 g) zugesetzt wurde. Die Suspension wurde 2 Stunden lang bei 55°C erhitzt. Die Aktivkohle wurde anschließend mittels Filtration entfernt, was eine sehr hellgelbe Lösung ergab, die zu einem weißen Feststoff lyophilisiert wurde.
Die Analysedaten für die Sialyllactoselösung, die wie oben beschrieben gereinigt wurde, sind in Tabelle 4 angeführt. Tabelle 4

¹ Phosphattestverfahren

Die unbekannte Probe (100 μl) wurde mit entionisiertem Wasser (775 μl) verdünnt. Die Lösung wurde dann mit 100 μl saurem Molybdat (durch Lösen von 1,25 g Ammoniummolybdat in 100 μl 2,5 N H₂SO₄ hergestellt) und 25 μl Fiska-Subha-Row-Lösung (von Sigma in Pulverform erworben und gemäß den Anweisungen des Herstellers zubereitet) behandelt. Das Gemisch wurde 7 min lang bei 100°C erhitzt und die Absorption bei 810 nm aufgezeichnet. Die Konzentration wurde durch Vergleichen der Absorption mit einer Phosphatstandardkurve bestimmt.

2HPLC-Test zur Bestimmung der Mn²⁺-Konzentration:

Säule:	Alltech Universal Cation, 0,46 × 10 cm
Detektor:	Alltech Modell 320 Leitfähigkeitsdetektor
mobile Phase:	3 mM Phthalsäure, 0,5 mM Dipicolinsäure
Fließgeschwindigkeit:	1,5 ml/min
Säulenofentemperatur:	35°C

BEISPIEL 6
Auftrennung von organischen und anorganischen Salzen mittels Nanofiltration
Es wurden verschiedene Nanofiltrationsmembranen auf deren Fähigkeit zur Auftrennung von verschiedenen organischen Verbindungen und anorganischen Salzen aus einer wässrigen Lösung getestet. Die Membranen wurden bei zwei unterschiedlichen pH-Werten getestet, um zu zeigen, dass das Auftrennungsprofil durch Einstellung der Ionenladung bei bestimmten Verbindungen moduliert werden kann. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angeführt.
Die getesteten Nanofiltrationsmembranen waren: MX07, SX12 und B006, hergestellt von Osmonics, Inc. (Minnetonka MN), und die DL2540 wurde von Osmonics, DeSalination Systems hergestellt. Die MX07-Membran wurde wie in obigem Beispiel 5 beschrieben verwendet. Die Parameter für die restlichen Membranen waren wie in Tabelle 6 angeführt.
Tabelle 5 Prozentsatz der in 30 Minuten die Membran passierenden Verbindung
Bemerkungen:

^a Passierungsprozentsatz nach 30-minütiger Auftrennungszeit
^b Temperatur getestet bei 20°C und 40°C
GluNAc: N-Acetyl-D-Glucosamin
PEP: 2-Phosphoenolpyruvattrinatriumsalz
CMP: Cytidin-5'-monophosphat Membranen MX07, SX12 und B006 von Osmonics, Inc., DL2540 von Osmonics, Desalination Systems (Escondido, CA).

Tabelle 6
BEISPIEL 7
Auftrennungseigenschaften der Polybenzamid-Nanofiltrationsmembranen
Dieses Beispiel beschreibt Versuche, die darlegen, dass eine Polybenzamidmembran (YK, Osmonics) zur Reinigung von Zuckern, sowohl bei plattenartigen als auch spiralgewickelten Formen, wirksam ist. Die Membran wurde bei verschiedenen pH-Werten auf das Durchlassen oder das Zurückhalten von Zuckern und Salzen getestet.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
A) Plattenartiger und spiralförmig gewickelter Maschinenbetrieb und Membranherstellung
Eine Desal-Membranmaschine (Osmonics, Desalination Systems, Escondido, CA) mit einer YK-Membran wurde zuerst durch 4- bis 5-maliges Spülen der Maschine gründlich gewaschen, und zwar jeweils mit etwa 1 l destilliertem Wasser. Das Wasser wurde in einen Zuführbehälter geleert, etwa 1 Minute lang zirkuliert (689,5 × 10³ Pa (~100 psi)) und mit einem Ablassventil entleert, das gegen den Uhrzeigersinn zu einer offenen Stelle gedreht wurde. Das Ventil wurde nach der Entleerung geschlossen und dieser Vorgang 4- bis 5-mal wiederholt. Nach dem Spülen wurde etwa 1 weiterer Liter Wasser zugesetzt. Das System wurde bei einem Druck von 1.034,25 × 10³ Pa (~150 psi) 30 Minuten lang erneut zirkuliert und dann entleert. Das System, einschließlich Membran, wurde dann in den darauf folgenden Versuchen verwendet.
Nach Beendigung der einzelnen Versuche wurde die Maschine, wie oben beschrieben, 3- bis 4-mal gewaschen. Dann wurde etwa 1 l Wasser etwa 15 bis 20 Minuten lang bei 689,5 × 10³ bis 1.034,25 × 10³ Pa (100 bis 150 psi) erneut zirkuliert und aus der Maschine entfernt. Manchmal folgte diesem Schritt ein zusätzlicher kurzer Waschvorgang, wenn noch einige Reste der Testverbindung in der Maschine vermutet wurden. Die Leitfähigkeit wurde immer überprüft, um sicherzustellen, dass alle Proben entfernt worden waren. Wenn die Leitfähigkeit hoch blieb, wurde die Maschi ne so lange gewaschen, bis die Verunreinigungen praktisch nicht mehr nachweisbar waren. Der größte Anteil der ionischen Verbindungen wurde leicht entfernt, mit der Ausnahme von MnCl₂, das 1 oder 2 zusätzliche kurze Waschgänge erforderte.
B) Überprüfen der Salze
Zur Bestimmung der Rückhalteeigenschaften verschiedener Salze wurden 10-mM-Lösungen der folgenden Salze mit plattenförmigen Membranen getestet: MnCl₂, NaH₂PO₄, NaC₃H₃O₃, NaOAc, Na₄P₂O₇, Natriumbenzoat, MgSO₄, NaN₃ und NaCl. Eine 1-Liter-Lösung eines der Salze wurde in den Zuführbehälter geleert und bei 689,5 × 10³ Pa (100 psi) etwa 15 Minuten lang wiederzirkuliert. An diesem Punkt wurden Proben sowohl des Permeats als auch des Konzentrats gesammelt und unter Verwendung eines Leitfähigkeitsmessers gemessen. Die Proben wurden anschließend alle 5 Minuten gesammelt, wobei die Gesamtmenge der Sammlungen bei jedem Probendurchlauf zumindest drei betrug. Der Prozentsatz von Salz, der die Membran passiert (der "Passierungsprozentsatz"), wurde ermittelt, indem die Leitfähigkeit des Permeats durch die Leitfähigkeit des Konzentrats dividiert wurde.
Nach Beendigung des ersten Durchlaufs wurde anschließend der pH der Lösung auf einen pH von 3,0 verringert, und falls möglich unter Verwendung einer konjugierten Säure des zu testenden Salzes. Die Lösung wurde wiederzirkuliert, während der pH eingestellt wurde, um sicherzustellen, dass die Lösung innerhalb der Maschine ebenfalls vermischt wurde. Der Testvorgang wurde wiederholt, wobei die Leitfähigkeit sowohl des Permeats als auch des Konzentrats bestimmt wurde. Die Lösung wurde dann mit einer konjugierten Base auf einen pH von etwa 7,0 gebracht, und der Durchlauf wurde erneut bei einem neuen pH wiederholt, wonach die Leitfähigkeit sowohl des Permeats als auch des Konzentrats wieder bestimmt wurde.
C) Überprüfen der Zucker
Die getesteten Zucker umfassten Sialyllactose, Lactose, N-Acetylglucosamin, NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1,4Galβ1-OEt (Verbindung I), Galα1,3Galβ1,4GlcNAcβ-O-(CH₂)₅-COOH (Verbindung II), LNT-2, LNnT, CMP, Cytidin und Sialinsäure. Eine Zuckerlösung (1 l) wurde in das Zuführgefäß geleert und bei 689,5 × 10³ Pa (100 psi) zumindest 10 Minuten lang wiederzirkuliert. Proben des Permeats und des Konzentrats wurden nach 10 Minuten genommen, und eine weitere Probe des Permeats wurde nach 15 Minuten entnommen. Die Proben wurden mittels DC visuell verglichen. Jegliche pH-Einstellungen erfolgten unter Einsatz von HCl und/oder NaOH.
ERGEBNISSE
A) Plattenförmige Membran
Die Rückhalteeigenschaften für verschiedene Salze und Zucker einer plattenförmigen Polybenzamid-Nanofiltrationsmembran (YK 002 auf YV+-Trägermaterial aus Papier (Osmonics)) sind in Tabelle 7 angeführt. Die Versuche wurden bei einer Temperatur von 25 bis 35°C und einer Permeatfließgeschwindigkeit von 2 bis 8 ml/min durchgeführt. Tabelle 7

* der Passierungsprozentsatz bezieht sich auf das Verhältnis zwischen der Menge des Materials im Permeat und der Menge des Materials im Konzentrat.
** "pH 5" liegt in einem Bereich von 4,8 bis 5,6, "pH 7" liegt in einem Bereich von 6,1 bis 7,4
*** Visuell mittels DC bestimmt

B) Spiralförmig gewickelte Membran
Die Rückhalteeigenschaften für verschiedene Salze und Zucker einer spiralförmig gewickelten Polybenzamid-Nanofiltrationsmembran (YK181CZA; Osmonics) sind in Tabelle 8 angeführt. Die Versuche wurden bei einer Temperatur von 25 bis 35°C und einer Permeatfließgeschwindigkeit von 3 ml/s durchgeführt. Tabelle 8

* der Passierungsprozentsatz bezieht sich auf das Verhältnis zwischen der Menge des Materials im Permeat und der Menge des Materials im Konzentrat.
** "pH 5" liegt in einem Bereich von 4,8 bis 5,2, "pH 7" liegt in einem Bereich von 6,6 bis 7,0, "pH 3" liegt in einem Bereich von 2,8 bis 3,4
*** Visuell mittels DC bestimmt Die Bezeichnung "Spuren" ist als mit freiem Auge mittels DC kaum detektierbar definiert.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die plattenförmige YK002-Membran und die spiralförmig gewickelte YK1812CZA-Membran Sialyllactose sowie die Verbindungen I und II, LNT-2 und LNnT zurückhielten, während die ionischen Verbindungen passieren gelassen wurden, was diese Membran zu einem Typ macht, der sich zur Reinigung solcher Saccharide gut eignet.
BEISPIEL 8
Auftrennungseigenschaften von Polyamid-Nanofiltrationsmembranen
In diesem Beispiel wird die Bewertung mehrerer Polyamidmembranen zur Verwendung bei der Reinigung von Zuckern beschrieben, sowohl plattenförmige als auch spiralförmig gewickelte. Die Membranen wurden bei unterschiedlichen pH-Werten auf Durchlassen oder Zurückhalten von Zuckern und Salzen getestet.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
A) Plattenartiger und spiralförmig gewickelter Maschinenbetrieb und Membranherstellung
Eine Desal-Membranmaschine (Osmonics, Desalination Systems) mit einer Polyamidmembran G-5 (GE; Osmonics) wurde zuerst durch 4- bis 5-malige Spülung der Maschine gut gewaschen, und zwar jeweils mit etwa 1 l destilliertem Wasser. Das Wasser wurde in einen Zuführbehälter geleert, etwa 1 Minute lang zirkuliert (689,5 × 10³ Pa (~100 psi)) und unter Verwendung eines Ablassventils entleert. Das Ventil wurde nach der Entleerung verschlossen und dieser Vorgang 4- bis 5-mal wiederholt. Nach dem Spülen wurde etwa 1 weiterer Liter Wasser zugesetzt. Das System wurde bei einem Druck von 1.034,25 × 10³ Pa (~150 psi) 30 Minuten lang wiederzirkuliert und dann entleert. Das System, einschließlich Membran, war sodann für die Anwendungstests bereit.
Nach Beendigung der einzelnen Versuche wurde die Maschine, wie oben beschrieben, 3- bis 4-mal gewaschen. Dann wurde etwa 1 l Wasser etwa 15 bis 20 Minuten lang bei 689,5 × 10³ bis 1.034,25 × 10³ Pa (100 bis 150 psi) wiederzirkuliert und die Maschine entleert. Manchmal folgte diesem Schritt ein extrakurzer Waschvorgang, wenn noch einige Reste der Verbindung in der Maschine vermutet wurden. Die Leitfähigkeit wurde immer überprüft, um sicherzustellen, dass alle Proben entfernt worden waren. Wenn die Leitfähigkeit hoch blieb, wurde die Maschine so lange gewaschen bis die Verunreinigungen praktisch nicht mehr nachweisbar waren. Der größte Anteil der ionischen Verbindungen wurde leicht entfernt, mit der Ausnahme von MnCl₂, das 1 oder 2 zusätzliche kurze Waschgänge erforderte.
B) Überprüfen der Salze
Es wurden 10-mM-Lösungen der folgenden Salze mit plattenförmigen Membranen getestet: MnCl₂, NaH₂PO₄, NaC₃H₃O₃ und NaCl. Eine 1-Liter-Lösung eines der Salze wurde in den Zuführbehälter geleert und bei 689,5 × 10³ Pa (100 psi) etwa 15 Minuten lang wiederzirkuliert. An diesem Punkt wurden Proben sowohl des Permeats als auch des Konzentrats gesammelt und unter Verwendung eines Leitfähigkeitsmessers gemessen. Die Proben wurden anschließend alle 5 Minuten gesammelt, wobei die Gesamtmenge der Sammlungen bei jedem Probendurchlauf zumindest drei betrug. Der Prozentsatz von Salz, der die Membran passiert (der "Passierungsprozentsatz"), wurde ermittelt, indem die Leitfähigkeit des Permeats durch die Leitfähigkeit des Konzentrats dividiert wurde. Nach Beendigung des ersten Durchlaufs wurde anschließend der pH der Lösung auf 3,0 verringert, und falls möglich unter Verwendung einer konjugierten Säure des zu testenden Salzes. Die Lösung wurde wiederzirkuliert, während der pH eingestellt wurde, um sicherzustellen, dass die Lösung innerhalb der Maschine ebenfalls vermischt wurde. Der Testvorgang wurde wiederholt, wobei Daten wie zuvor gesammelt wurden. Die Lösung wurde dann mit einer konjugierten Base auf einen pH von etwa 7,0 gebracht, und der Durchlauf wurde erneut bei einem neuen pH wiederholt, wonach die Maschine wie oben beschrieben entleert und gespült wurde.
C) Überprüfen der Zucker
Die getesteten Zucker umfassten Sialyllactose, Lactose, NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1,4Galβ1-OEt (Verbindung I), Galα1,3Galβ1,4GlcNAcβ-O-(CH₂)₅-COOH (Verbindung II), LNT-2 und LNnT. Eine Zuckerlösung (1 l) wurde in das Zuführgefäß geleert und bei 689,5 × 10³ Pa (100 psi) zumindest 10 Minuten lang wiederzirkuliert. Proben des Permeats und des Konzent rats wurden nach 10 Minuten genommen, und eine weitere Probe des Permeats wurde nach 15 Minuten entnommen. Die Proben wurden mittels DC visuell verglichen. Jegliche pH-Einstellungen erfolgten unter Einsatz von HCl und/oder NaOH. Nachdem der Zucker getestet worden war, wurde dieser in einen Pyrex-Kolben übertragen, um für andere Membranen wiederverwendet zu werden.
ERGEBNISSE
A) Plattenförmige Membran
Die Rückhalteeigenschaften für verschiedene Salze und Zucker einer plattenförmigen Polyamid-Nanofiltrationsmembran (G-10 (GH; Osmonics)) sind in Tabelle 9 angeführt. Der A-Wert der Membran betrug 10,0, und der Transmissionsprozentsatz des Leitungswassers betrug 62,8 (getestet unter Einsatz von 2.000 ppm MgSO₄ bei Umgebungstemperatur). Die Versuche wurden bei einer Temperatur von 25 bis 35°C und einer Permeatfließgeschwindigkeit von 5 bis 8 ml/min durchgeführt. Tabelle 9

* der Passierungsprozentsatz bezieht sich auf das Verhältnis zwischen der Menge des Materials im Permeat und der Menge des Materials im Konzentrat.
** "pH 5" liegt in einem Bereich von 4,8 bis 5,6
*** Visuell mittels DC bestimmt
^#Die Bezeichnung "Spuren" ist als mittels DC kaum sichtbar definiert.

In einem weiteren Versuch wurde eine G-10-Polyamidmembran (GH) mit einem A-Wert von 8,0 und einem Transmissionsprozentsatz von Leitungswasser von 38,9 getestet. Der Versuch wurde bei einer Temperatur von 25 bis 35°C und einer Permeatfließgeschwindigkeit von 6 bis 8 ml/min durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 angeführt. Tabelle 10

* der Passierungsprozentsatz bezieht sich auf das Verhältnis zwischen der Mange des Materials im Permeat und der Menge des Materials im Konzentrat.
** "pH 5" liegt in einem Bereich von 4,8 bis 5,6
*** Visuell mittels DC bestimmt

Eine G-5-Polyamidmembran (GE) mit einem A-Wert von 3,9 und einem Transmissionsprozentsatz von Leitungswasser von 33,9 wurde ebenfalls getestet. Der Versuch wurde bei einer Temperatur von 25 bis 35°C und einer Permeatfließgeschwindigkeit von 3 bis 5 ml/min durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 angeführt. Tabelle 11

* der Passierungsprozentsatz bezieht sich auf das Verhältnis zwischen der Menge des Materials im Permeat und der Menge des Materials im Konzentrat.
** "pH 5" liegt in einem Bereich von 4,8 bis 5,6
*** Visuell mittels DC bestimmt

Die Zucker- und Salzrückhalteeigenschaften einer HL-Polyamidmembran (Osmonics) sind in Tabelle 12 angeführt. Die Versuche wurden bei einer Temperatur von 25 bis 35°C und einer Permeatfließgeschwindigkeit von 8 bis 13 ml/min durchgeführt. Tabelle 12

* der Passierungsprozentsatz bezieht sich auf das Verhältnis zwischen der Menge des Materials im Permeat und der Menge des Materials im Konzentrat.
** "pH 5" liegt in einem Bereich von 4,5 bis 5,8
*** Visuell mittels DC bestimmt

B) Spiralförmig gewickelte Membran
Die Rückhalteeigenschaften für verschiedene Salze und Zucker auf mehreren spiralförmig gewickelten Polyamidmembranen wurden ebenfalls bestimmt. Eine GH1812CZA-Membran (Osmonics) wurde bei einer Temperatur von 25 bis 35°C und einer Permeatfließgeschwindigkeit von 1,5 bis 2 ml/s getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 angeführt. Tabelle 13

* der Passierungsprozentsatz bezieht sich auf das Verhältnis zwischen der Menge des Materials im Permeat und der Menge des Materials im Konzentrat.
** "pH 5" liegt in einem Bereich von 4,5 bis 5,6, "pH 7" liegt in einem Bereich von 6,1 bis 7,4
*** Visuell mittels DC bestimmt
^# Die Bezeichnung "Spuren" ist als mittels DC kaum sichtbar definiert.

Die Ergebnisse der bei 25 bis 35°C und einer verringerten Permeatfließgeschwindigkeit von 0,9 ml/s getesteten spiralförmigen GE1812CZA-Polyamidmembran (Osmonics) sind in Tabelle 14 angeführt. Tabelle 14

* der Passierungsprozentsatz bezieht sich auf das Verhältnis zwischen der Menge des Materials im Permeat und der Menge des Materials im Konzentrat.
** "pH 5" liegt in einem Bereich von 4,8 bis 5,6
*** Visuell mittels DC bestimmt
^# Die Bezeichnung "Spuren" ist als mittels DC kaum sichtbar definiert.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die plattenförmige G-10-Membran (GH; A-Wert = 10) und die plattenförmige G-10-Membran (GH; A-Wert = 8) sowie die spiralförmig gewickelte GH1812CZA-Membran Ionen passieren ließen, die Sialyllactose oder ähnliche Trisaccharide jedoch nicht wirksam zurückhielten. Die plattenförmige G-5-Membran (GE; A-Wert = 3,9) und die spiralförmig gewickelte GE1812CZA-Membran hielten Sialyllactose sowie die Verbindungen I und II, LNT-2 und LNnT zurück, während ionische Verbindungen passieren gelassen wurden.
Alle in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen, Patente und Patenanmeldungen sind hierin im gleichen Ausmaß durch Verweis aufgenommen, wie wenn jede einzelne Veröffentlichung, jedes Patent oder jede Patentanmeldung spezifisch und individuell bezeichnet worden wäre, dass diese(s) hierin durch Verweis aufzunehmen wäre.
Die obige Beschreibung dient nur zur Veranschaulichung und ist nicht als Einschränkung zu verstehen. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung sind viele Veränderungen der Erfindung nach einer Durchsicht der vorliegenden Offenbarung offensichtlich.

Claims

Verfahren zum Entfernen einer unsialylierten Kohlenhydratverunreinigung aus einem Gemisch, das die Verunreinigung und ein Sialylgalactosid umfasst, wobei das Verfahren das Kontaktieren des Gemischs mit einer Nanofiltrations- oder Umkehrosmosemembran bei einem pH von 1 bis 7 über einen Zeitraum umfasst, der ausreicht, dass sich das Gemisch in eine Permeatfraktion, welche die unsialylierte Kohlenhydratverunreinigung umfasst, welche die Membran passiert hat, und eine Retentatfraktion, welche die Membran nicht passiert hat, auftrennen kann.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner folgenden Schritt umfassend: Kontaktieren der Retentatfraktion mit einer zweiten Nanofiltrations- oder Umkehrosmosemembran bei einem zweiten pH, der sich vom ersten pH unterscheidet, über einen zweiten Zeitraum, wodurch die Retentatfraktion in eine zweite Permeatfraktion, welche die Membran passiert hat, und eine zweite Retentatfraktion, welche die Membran nicht passiert hat, aufgetrennt wird, wobei die zweite Retentatfraktion gereinigtes Sialylgalactosid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, worin der erste pH niedriger ist als der zweite pH.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der erste pH etwa 3 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, 3 oder 4, worin der zweite pH etwa 7,4 beträgt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Sialylgalactosid Sialyllactose ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die unsialylierte Kohlenhydratverunreinigung Lactose ist.
Verfahren zur Synthese eines sialylierten Oligosaccharids, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Herstellen eines Reaktionsgemischs durch Kontaktieren eines Glykosylakzeptors mit einem Glykosyldonor und einer Glykosyltransferase, die zum Ligieren des Glykosyldonors an den Glykosylakzeptor fähig ist; und (b) Kontaktieren des Reaktionsgemischs mit einer Nanofiltrations- oder Umkehrosmosemembran bei einem ersten pH über einen ersten Zeitraum, wodurch das Gemisch in eine erste Permeatfraktion, welche die Membran passiert hat, und eine erste Retentatfraktion, welche die Membran nicht passiert hat, aufgetrennt wird; (c) auf Schritt (b) folgendes Kontaktieren der ersten Retentatfraktion mit einer Nanofiltrations- oder Umkehrosmosemembran bei einem zweiten pH, der sich vom ersten pH unterscheidet, über einen zweiten Zeitraum, wodurch die erste Retentatfraktion in eine zweite Permeatfraktion, welche die Membran passiert hat, und eine zweite Retentatfraktion, welche die Membran nicht passiert hat, aufgetrennt wird, wobei die zweite Retentatfraktion im Wesentlichen gereinigtes sialyliertes Oligosaccharid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das sialylierte Oligosaccharid ein sialyliertes Galactosid ist.