DE69233479T2 - Substituierte Guanidine und Derivate hiervon als Modulatoren der Freisetzung von Neurotransmittern und neue Methode zur Identifizierung von Inhibitoren der Neurotransmitter-Freisetzung - Google Patents

Substituierte Guanidine und Derivate hiervon als Modulatoren der Freisetzung von Neurotransmittern und neue Methode zur Identifizierung von Inhibitoren der Neurotransmitter-Freisetzung Download PDF

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Description

  • Querverweis zu verwandten Anmeldungen
  • Die vorliegende Anmeldung ist eine Continuation-in-Part der US-Anmeldung mit der Seriennummer 07/652,104, die am 8. Februar 1991 eingereicht wurde.
  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung liegt auf dem Gebiet der medizinischen Chemie. Insbesondere betrifft diese Erfindung Modulatoren zur Neurotransmitter-Freisetzung und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese enthalten, die neuroprotektiven bzw. Nervenschützenden und anderen therapeutischen Nutzen besitzen. Die Erfindung betrifft auch Screening-Assays bzw. -Analysen für Verbindungen, die eine Neurotransmitter-Freisetzung inhibieren. Diese Erfindung betrifft weiterhin Verfahren, die die Verwendung derartiger Neurotransmitter-Freisetzungsmodulatoren zur Behandlung oder Verhinderung von bestimmten pathophysiologischen Zuständen involvieren, die durch die exzessive oder unangemessene Freisetzung von Neurotransmittern gekennzeichnet sind.
  • Hintergrund der Erfindung
  • In der Patentliteratur ist eine breite Vielfalt von substituierten Guanidinen offenbart. Zum Beispiel:
    1,411,731 und 1,422,506 offenbaren Diphenylguanidin als Vulkanisationsbeschleuniger;
    1,597,233 offenbart N-o-Tolyl-N'-phenyl-guanidin als Vulkanisationsbeschleuniger;
    1,672,431 offenbart N,N'-Di-o-methoxyphenyl-guanidin als nützlich für therapeutische Zwecke, insbesondere in Form von wasserlöslichen Salzen;
    1,730,338 offenbart N-p-Dimethyl-amino-phenyl-N'-phenyl-guanidin als Vulkanisationsbeschleuniger;
    1,795,738 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von N,N'-Dialkyl-di-substituierten Guanidinen, einschließlich N-Di-ethyl-N'-phenyl-guanidin, N-Diethyl-N-isoamylguanidin, N-Dimethyl-N'-isoamylguanidin und N-Dimethyl-N'-ethylguanidin;
    1,850,682 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von disubstituierten Guanidin-Vulkanisationsbeschleunigern, die einen zusätzlichen Substituenten am Imin-Stickstoffatom tragen;
    2,145,214 offenbart die Verwendung von disubstituierten Guanidinen, z. B. Diarylguanidinen, insbesondere Dixylylguanidin, als parasitentötende Mittel;
    2,254,009 offenbart sym-Di-2-octyl-guanidin, und 2,274,476 und 2,289,542 offenbaren sym-Dicyclohexylguanidin als Insektizide und Mottenlarven-Abstossungsmittel;
    2,633,474 offenbart 1,3-Bis-(o-ethylphenyl)guanidin und 1,3-Bis-(p-ethylphenyl)guanidin als Vulkanisationsbeschleuniger;
    3,117,994 offenbart N,N',N''-trisubstituierte Guanidine und deren Salze als bakteriostatische Verbindungen;
    3,140,231 offenbart N-Methyl- und N-Ethyl-N'-octylguanidine und deren Salze als antihypertonische Mittel;
    3,248,246 beschreibt (in Beispiel 5) ein 1,3-disubstituiertes Guanidin, dessen Substituenten hydrophobe Kohlenwasserstoffgruppen sind, von denen eine Naphthylmethyl ist und die andere n-Butyl ist;
    3,252,816 offenbart verschiedene N-substituierte und unsubstituierte Cinnamyl-Guanidine und generisch die entsprechenden N'- und N''-Alkyl-substituierten Verbindungen und deren Salze als antihypertonische Mittel;
    3,270,054 offenbart N-2-Adamantan-1-yl und N-2-Homoadamant-1-yl-oxy-ethylthioethyl- und -aminoethyl-guanidin-Derivate, die höchstens zwei niedere Alkylgruppen am N'- und/oder N''-Stickstoffatom tragen, als sympathikolytische und Antivirus-Mittel;
    3,301,755 offenbart N-ethylenisch unsubstituierte Alkyl-Guanidine und die entsprechenden N'- und/oder N''-niederen Alkylverbindungen als hypoglykämische und antihypertonische Mittel;
    3,409,669 offenbart N-Cyclohexylamino-(3,3-dialkyl-substituierte-propyl)-guanidine und die entsprechenden N'-Alkyl- und/oder N''-Alkyl-substituierten Verbindungen als hypotonische Mittel;
    3,547,951 offenbart 1,3-Dioxolan-4-yl-alkyl-substituierte Guanidine, die antihypertonische Aktivität besitzen, und offenbart niederes Alkyl, einschließlich n-Butyl als möglichen Substituenten an der anderen Aminogruppe;
    3,639,477 offenbart Propoxylguanidin-Verbindungen als Verbindungen, die die Eigenschaften eines Anorektikums haben;
    3,681,459; 3,769,427; 3,803,324; 3,908,013; 3,976,787; und 4,014,934 offenbaren aromatische substituierte Guanidin-Derivate, wobei der Phenylring Hydroxy- und/oder Halogen-Substituenten enthalten kann, zur Verwendung in der vasokonstriktorischen Therapie;
    3,804,898 offenbart N-Benzylcyclobutenyl- und N-Benzylcyclobutenyl-alkylguanidine und die entsprechenden N-Alkyl- und/oder N''-Alkyl-substituierten Verbindungen als hypotonische Mittel;
    3,968,243 offenbart N-Aralkyl-substituierte Guanidine und die entsprechenden N'-Alkyl-N''-alkyl- und N',N'-Aralkyl-Verbindungen als nützlich bei der Behandlung von kardialen Arrhythmien;
    3,795,533 offenbart o-Halo-benzyliden-amino-guanidine und deren Verwendung als Antidepressiva zur Bekämpfung psychischer Depression;
    4,007,181 offenbart verschiedene N,N'-disubstituierte Guanidine, die am Imin-Stickstoffatom durch ein Adamantyl substituiert sind, als antiarhythmische und diuretische Aktivitäten besitzend;
    4,051,256 offenbart N-Phenyl- und N-Pyridyl-N'-adamantyl- und -cycloalkylguanidine als Antivirusmittel;
    4,109,014 offenbart N-Hydroxy-substituierte Guanidine und die entsprechenden N-Methyl-disubstituierten Guanidine als vasokonstriktorische Mittel;
    4,169,154 offenbart die Verwendung von Guanidinen bei der Behandlung von Depression;
    4,393,007 offenbart N-substituierte und unsubstituierte, N-substituierte Methyl-N'-unsubstituierte, monosubstituierte(–) und disubstituierte -N''-unsubstituierte und substituierte Guanidine als Ganglien-blockende Mittel; und
    4,471,137 offenbart N,N,N',N''-Tetraalkyl-guanidine als sterisch gehinderte Basen, die in der chemischen Synthese nützlich sind.
    4,709,094 offenbart 1,3-disubstituierte Guanidine, z. B. 1,3-Dibutyl-guanidin und 1,3-Di-o-tolyl-guanidin (DTG), als Sigma-Hirn-Rezeptorliganden.
  • Bezüglich Beispielen für andere substituierte Guanidine vergleiche z. B. 1,422,506; 1,642,180; 1,756,315; 3,159,676; 3,228,975; 3,248,426; 3,283,003; 3,320,229; 3,479,437; 3,547,951; 3,639,477; 3,784,643; 3,949,089; 3,975,533; 4,060,640 und 4,161,541.
  • Geluk, H.W. et al., J. Med. Chem. 12:712 (1969) beschreiben die Synthese einer Vielzahl von Adamantyl-disubstituierten Guanidinen als mögliche Antivirusmittel, einschließlich N,N'-Di-(adamantan-1-yl)-guanidinhydrochlorid, N-(Adamantan-1-yl)-N'-cyclohexyl-guanidinhydrochlorid und N-(Adamantan-1-yl)-N'-benzyl-guanidinhydrochlorid.
  • Die PCT-Anmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. WO 88/00583 offenbart Diadamantylguanidin und N,N'-Di-(2-adamantyl)guanidin. Von diesen Verbindungen wird berichtet, dass sie bei der Behandlung von Schizophrenie, Psychose und Depression nützlich sind.
  • Vasilev, P., et al., Chem. Abstr. 93:150095u offenbart eine Verbindung mit der folgenden Formel:
  • Figure 00060001
  • Von dieser Verbindung wird berichtet, dass sie virustötende Aktivität besitzt. Ginsburg, V. A., et al., Chem. Abstr. 4518d (1962) und Ginsburg, V. A., et al., Zhurnal Organ. Khimii 7:2267-2270 (1971) offenbaren eine Verbindung mit der Formel:
  • Figure 00060002
  • Kreutzberger und Schuker, Arch Pharmz. Ber. Deut. Pharm. Ges. 305:400 – 405 (1975) offenbaren eine Verbindung mit der Formel:
  • Figure 00070001
  • Das deutsche Patent mit der Nr. DE 2,452,691 offenbart eine Verbindung mit der Formel:
    Figure 00070002
    wobei unter anderem
    R0 Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Alkoxy oder C1-C6-Alkyl ist;
    R1 und R2 Halogen, Hydroxy, C1-C4-Alkyl oder C1-C4-Alkoxy sind;
    R3, R3' und R3'' Wasserstoff oder C1-C4-Alkyl sind;
    R4 Wasserstoff, C1-C4-Alkyl, Hydroxy, C1-C4-Alkoxy oder eine Aminogruppe ist;
    R5 und R6 Wasserstoff, C1-C6-Alkyl oder eine Acylgruppe sind oder einen zyklischen Ring bilden. Besondere, in diesem Patentdokument offenbarte Verbindungen umfassen 1-(2,6-Dichlorphenyl)-2-(2,6-dichlorbenzylidin)aminoguanidin·HCl und 1-(2,6-Dichlorphenyl)-2-cyclohexyliden-aminoguanidin. Von diesen Verbindungen wird berichtet, dass sie antihypertonische Eigenschaften besitzen.
  • Sunderdiek, R., et al., Chem. Abstr. 81:91439m (1974) offenbaren eine Verbindung mit der Formel:
    Figure 00080001
    wobei R=Ph oder Cyclohexyl ist.
  • Bent, K. J., et al., Chem. Abstr. 74:63479m (1971) ist eine Zusammenfassung des deutschen Patents mit der Nr. 2,029,707. Dieses Patent offenbart Antivirus-Verbindungen mit der Formel:
    Figure 00080002
    wobei:
    R Amino(–), Methyl(–), iso-Butyl(–) oder p-substituierte Phenyle ist;
    R1 Wasserstoff, Methyl oder iso-Butyl ist;
    NRR1 Morpholino ist;
    R2 und R3 Wasserstoff, CHC6H3Cl2(2,4-), Isopropyl, C6H4p-Cl, CH(CH2)10CH3 oder 1-(4-Pyridyl)ethyliden sind.
  • Huisgen et al., Chem. Abstr. 63:2975d (1965) offenbaren eine Verbindung mit der Formel:
  • Figure 00080003
  • Kroeger, F., et al., Chem. Abstr. 60:9264f offenbaren Verbindungen mit den Formeln:
  • Figure 00090001
  • Heinisch, L., J. Pract. Chem. 329:290-300 (1987) offenbart eine Verbindung mit der Formel:
  • Figure 00090002
  • Kramer, C.-R., et al., Biochem. Physiol. Pflanzen. 178:469-477 (1983) offenbart eine Verbindung mit der Formel:
    Figure 00090003
    wobei Wasserstoff, Methyl, Butyl, Hexyl, Benzyl und Phenyl ist, und R' Wasserstoff oder Methyl ist. Von diesen Verbindungen wird berichtet, dass sie algizide Aktivität besitzen.
  • Prasad, R. N., et al., Can. J. Chem. 45:2247-2252 (1967) offenbaren eine Verbindung mit der Formel:
    Figure 00090004
    wobei R und R' Wasserstoff oder Cl2-CH-CO- sind, R2 Wasserstoff ist, und R' ein beliebiger einer Anzahl von Substituenten mit der allgemeinen Formel Alkyl=N- ist. Diese Verbindungen wurden auf ihre antibakterielle Aktivität untersucht.
  • Huisgen et al., Chem. Ber. 98:1476-1486 (1965) offenbaren eine Verbindung mit der Formel:
  • Figure 00100001
  • Podrebarac, E. G., et al., J. Med. Chem.:283 – 288 (1963) offenbaren Verbindungen mit der Formel:
    Figure 00100002
    wobei die R-Gruppen Wasserstoff oder Methyl sein können. Diese Verbindungen waren Zwischenverbindungen für die Herstellung von Methylglyoxal- bis(guanylhydrazon)-Analogen, die Aktivität gegen akute myelozytische Leukämie bei Erwachsenen haben können.
  • Kroger et al., Ber. 97:396 – 404 (1964) offenbaren eine Verbindung mit der Formel:
  • Figure 00110001
  • Durant, G. J., et al., J. Med. Chem.:22 – 27 (1966) offenbaren eine Verbindung mit der Formel:
    Figure 00110002
    wobei R eine Alkyl-, Halogen- oder Alkoxygruppe ist. Von diesen Verbindungen wird berichtet, dass sie entzündungshemmende Aktivität besitzen.
  • Von der Aminosäure L-Glutamat wird in weitem Maße vermutet, dass sie als chemische Transmittersubstanz an Erregungssynapsen innerhalb des Zentralnervensystems wirkt. Neuronale Antworten auf Glutamat sind komplex und scheinen durch wenigstens drei verschiedene Rezeptortypen vermittelt zu werden, d. h. KA-, QA- und NMDA-Subtypen, von denen jeder nach seinen relativ spezifischen Liganden benannt ist, d. h. Kainsäure, Quisaqualsäure bzw. N-Methyl-D-asparaginsäure. Eine Aminosäure, die einen oder mehrere dieser Rezeptortypen aktiviert, wird als Erregungsaminosäure (EAA) bzw. exzitatorische Aminosäure bezeichnet.
  • Der NMDA-Subtyp der Erregungsaminosäurerezeptoren wird während der normalen synaptischen Erregungstransmission im Hirn aktiviert. Eine Aktivierung von NMDA-Rezeptoren unter normalen Bedingungen ist für das Phänomen der Langzeitpotenzierung, ein Memory-ähnliches Phänomen, bei Erregungssynapsen verantwortlich. Eine exzessive Erregung von Neuronen findet bei epileptischen Anfällen statt, und es ist gezeigt worden, dass eine Überaktivierung von NMDA-Rezeptoren zur Pathophysiologie von Epilepsie beiträgt.
  • NMDA-Rezeptoren sind auch in starkem Maße beim Nervenzelltod involviert, der sich im Anschluss an eine Hirn- oder Rückenmark-Ischämie ereignet. Nach dem Auftreten von ischämischen Hirninsulten bzw. -anfällen, wie Schlaganfall, Herzanfall oder traumatischer Hirnverletzung, findet eine exzessive Freisetzung von endogenem Glutamat statt, was zu der Überstimulierung von NMDA-Rezeptoren führt. Mit dem NMDA-Rezeptor ist ein Ionenkanal verbunden. Die Erkennungsstelle, d. h. der NMDA-Rezeptor, ist außerhalb des Ionenkanals. Wenn Glutamat mit dem NMDA-Rezeptor wechselwirkt, verursacht es eine Öffnung des Ionenkanals, wodurch ein Kationenfluss durch die Zellmembran zugelassen wird, d. h. Ca2+ und Na+ in die Zelle und K+ aus der Zelle. Man glaubt, dass dieser Ionenfluss, insbesondere der Zufluss von Ca2+-Ionen, der durch die Wechselwirkung von Glutamat mit dem NMDA-Rezeptor verursacht wird, eine wichtige Rolle beim Nervenzelltod spielt. Vergleiche z. B. Rothman, S. M. und Olney, J. W., Trends in Neurosci. 10(7):299 – 302 (1987).
  • In vitro-Untersuchungen haben klar gezeigt, dass eine Aktivierung von KA-Rezeptoren eine neuronale Erregungsschädigung verursachen kann, obwohl hierfür längeres Ausgesetztsein erforderlich ist (Koh, J. Y. et al., J. Neurosci. 10: 693 – 705 (1990); und Frandsen, A. J. et al., J. Neurochem. 33: 297 – 299 (1989)). Der kompetitive KA-Rezeptor-Antagonist 2,3-Dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoylbenzochinozalin (NBQX) ist wirksam bei der Verhinderung einer verzögerten neuronalen Degeneration im Anschluss an eine vorübergehende Vorderhirn-Ischämie in Nagetieren (Sheardown, M. J. et al., Science 247: 571 – 574 (1990)). Jedoch erfordern derartige Wirkungen eine relativ große und potentiell toxische systemische Dosis an NBQX, anscheinend deshalb, weil diese Verbindung eine schlechte Durchdringung der Blut-Hirn-Schranke zeigt.
  • Derzeit besteht ein kritischer Bedarf an wirksamen Behandlungen, die das Ausmaß des Nervenzelltods im Anschluss an einen Schlaganfall oder eine traumatische Hirnverletzung begrenzen. Kürzliche Fortschritte beim Verständnis der diesem Nervenzelltod zugrundeliegenden Mechanismen haben Anlass zu der Hoffnung gegeben, dass eine Arzneimittelbehandlung entwickelt werden kann. Forschungs- und Entwicklungsbemühungen auf diesem Gebiet haben sich auf das Blockieren der Wirkungen von Glutamat konzentriert, die durch den NMDA-Rezeptor-Kanal-Komplex vermittelt werden. Zwei Ansätze sind gut entwickelt: Kompetitive NMDA-Rezeptor-Antagonisten (Choi, D. W. (1990) Cerebrov. Brain Metab. Rev. 1: 165 – 211; Watkins, J. C. and Olverman, H. J. (1987) Trends Neurosci. 10: 265 – 272) und Blocker des Ionenkanals des NMDA-Rezeptor-Kanalkomplexes (Meldrum, B. (1990) Cerebrovascular Brain Metab. Rev. 2: 27 – 57; Choi, D. W. (1990) Cerebrovascular Brain Metab. Rev. 2: 105 – 147; und Kemp, J. A. et al., Trends Neurosci. 10: 265 – 272 (1987)). Der Ionenkanal-Blocker MK-801 ist ein wirksames neuroprotektives bzw. nervenschützendes Mittel bei einer Vielzahl von in vivo Modellen von Schlaganfall (Meldrum, B. (1990) Cerebrovascular Brain Metab. Rev. 2: 27 – 57; Albers, G. W. et al., Annals Neurol. 25: 398 – 403 (1989)). Jedoch ist mit dieser Klasse von Verbindungen eine gewisse Toxizität verbunden (Olney, J. W. et al., Science 244: 1360 – 1362 (1989); Koek, W. and Colpaert, J. (1990) J. Pharmacol. Exp. Ther. 252: 349 – 357) und von NMDA-Antagonisten wurde gezeigt, dass sie den Memory-Erwerb inhibieren (Morris, R. G. M. (1988) in Excitat. A. A. 's in Health and Disease, D. Lodge ( Hrsg.), Wiley, 297 – 320). Diese Nebenwirkungen können die klinische Verwendung derartiger Mittel bei akuten Situationen begrenzen.
  • Blocker für Neurotransmitter-Freisetzung haben ebenfalls eine gewisse Aufmerksamkeit als potentielle neuroprotektive bzw. nervenschützende Mittel erfahren. Zum Beispiel können Adenosinanaloge indirekt eine Neurotransmitter-Freisetzung über eine G-Protein-vermittelte Inhibierung von präsynaptischen Ca-Kanälen abschwächen (Meldrum, B. Cerebrovascular and Brain Metab. Rev. 2: 27 – 57 (1990); Dolphin, A. C. Nature 316: 148 – 150 (1985)). Es ist gezeigt worden, dass derartige Verbindungen während einer Ischämie in verschiedenen Nagetiermodellen mit Schlaganfall neuroprotektiv bzw. nervenschützend sind (Evans, M. C. et al. Neurosci. Lett. 83: 287 – 292 (1987)). Ault, B. and Wang, C. M. Br. J. Pharmacol. 87: 695 – 703 (1986) offenbaren, dass Adenosin eine epileptiforme bzw. Epilepsie-ähnliche Aktivität in hippokampalen Schnitten inhibiert.
  • Andere vermeintliche Blocker der Glutamat-Freisetzung wirken durch einen noch undefinierten Mechanismus. Von dem substituierten Piperidinderivat 2-(4-(p-Fluorbenzoyl)piperidin-1-yl)-2'-acetonaphthon (E-2001) (Kaneko, T. et al. Arzneim.-Forsch./Drug Res. 39: 445 – 450 (1989)) und der Verbindung PK 26124 (Riluzol, 2-Amino-6-trifluormethoxybenzothiazol) (Malgouris, C. et al. J. Neurosci. 9: 3720 – 3727 (1989)) wurde gezeigt, dass sie in Nagetieren neuroprotektiv bzw. nervenschützend wirken. PK 26124 scheint in therapeutischen Dosierungen in Ratten nicht MK-801-ähnliche Verhaltensnebenwirkungen in einem kontrollierten Vergleich seines Wirksamkeits-/Sicherheits-Verhältnisses mit dem von MK-801 zu erzeugen (Koek, J. W. and Colpaert, F. C., J. Pharmacol. Exp. Ther. 252: 349 – 357 (1990)). E-2001 verbessert die Degeneration von pyramidalen Neuronen in dem hippokampalen CA1-Sektor nach einer vorübergehenden Ischämie in mongolischen Wüstenspringmäusen. Darüber hinaus verbessert E-2001 die Schlaganfallsymptome, die durch eine permanente unilaterale Karotis-Arterien-Ligatur in Wüstenspringmäusen induziert werden, verlängerte die Überlebensdauer nach einer permanenten bilateralen Karotis-Arterien-Ligatur in Wüstenspringmäusen und Mäusen und verlängerte die Überlebensdauer nach einer intravenösen Injektion von KCN in Mäuse. Kaneko, T. et al., Arzneim.-Forsch./Drug Res. 39: 445 – 450 (1989).
  • Man glaubt, dass Glutamat-Neurotoxizität involviert ist bei akuten Verletzungen des Nervensystems, wie es beobachtet wurde bei Anfall, Hypoxie, Hypoglykämie und Trauma sowie bei chronischen degenerativen Erkrankungen, wie Huntington- Krankheit, olivopontozerebellare Atrophie, verbunden mit Glutamat-Dehydrogenase-Mangel und reduziertem Glutamat-Katabolismus, Guam-Amyotrophische Lateralsklerose/Parkinson-Demenz, Parkinson-Krankheit und Alzheimer-Krankheit. Choi, D. W., Neuron 1: 623 – 634 (1988); Choi, D. W., Cereb. Brain Met. Rev. 2: 105 – 147 (1990).
  • Langlais, P. L. et al., J. Neurosci 10: 1664 – 1674 (1990) offenbaren, dass Glutamat und GABA beim Pyrithiamin-induzierten Thiaminmangel (PTD) involviert sein können, der die Bildung von Thalamusläsionen und -anfällen verursacht. Eine Verabreichung des NMDA-Rezeptor-Antagonisten MK-801 während der letzten Stadien von PTD führte zu einer merklichen Abschwächung einer nekrotischen Schädigung am Thalamus und von Periaquedukt-Grau bzw. Periagueductal-Gray und einer Abnahme in der Anzahl und Größe von hämorrhagischen Läsionen. Da ein Thiaminmangel für eine ähnliche Schädigung beim Wernicke-Korsakow-Syndrom verantwortlich ist, schlagen Langlais et al. vor, dass diese Ergebnisse eine wichtige, vernünftige Erklärung für die Behandlung dieses neuropathischen Humanzustandes liefern.
  • Malgouris, C. et al., J. Neurosci. 9: 3720 – 3727 (1989) offenbaren, dass PK 26124 (Riluzol), eine Verbindung, die die Glutamat-Freisetzung aus Nervenenden inhibiert, Antikonvulsivum-Aktivität besitzt, die Schlafqualität in Nagetieren verbessert und darin wirksam ist, dass es das Nagetierhirn vor den zellulären und funktionalen Folgen einer Ischämie, einschließlich der Verhinderung von Gedächtnisverlust und hippokampaler neuronaler Schädigung, schützt.
  • Miller, et al., New Anticonvulsant Drugs, Meldrum, B. S. and Porter, R. J. ( Hrsg.), London: John Libbey, 165 – 177 (1986) offenbaren, dass der Glutamat-Freisetzungsblocker Lamotragin ein Antikonvulsivum ist.
  • Price, M. T. and Olney, J. W., Soc. Neacrosci. Abstr. 16: 377, Abstr. 161.16 (1990) offenbaren, dass die Verabreichung von EAA-Antagonisten vollständig eine Emesis in Frettchen, die einer Chemotherapie mit Cisplatin ausgesetzt waren, verhinderte. Die eingesetzten EAA-Antagonisten durchdrangen nicht die Blut-Hirn-Schranke, und es wurde daher vorgeschlagen, dass derartige Verbindungen Nausea, eine übliche Nebenwirkung während einer Krebs-Chemotherapie verhindern.
  • Calcium-Antagonisten, wie zum Beispiel Nimodipin, wirken sowohl als cerebrale Vasodilatoren (Wong, M. C. W. and Haley, E. C. Jr., Stroke 24: 31 – 36 (1989)) als auch als Blocker für einen Calciumeintritt in Neuronen (Scriabine, A. Adv. Neurosurg. (1990)). Eine bescheidene Verbesserung beim Ausgang von Schlaganfall ist in klinischen Versuchen beobachtet worden (Gelmers, H. J. et al., N. Eng. J. Med. 318: 203 – 207 (1988)). Während signifikante kardiovaskuläre Nebenwirkungen auftreten, scheint Nimodipin weniger toxisch als die NMDA-Antagonisten zu sein und es mag eine Rolle bei der chronischen Behandlung von Schlaganfall und anderen neurologischen Erkrankungen finden.
  • Es gibt mindestens 3 Unterklassen von Ca-Kanälen, „T", „N" und „L", die sich in ihrer Pharmakologie, ihrer Anordnung in neuronalen und nicht-neuronalen Geweben und ihren physiologischen Eigenschaften unterscheiden (Nowycky, M. C. et al. Nature 316: 440 – 443 (1985); Bean, B. P. Ann. Rev. Physiol. 51: 367 – 384 (1989)). Spannungs-sensitive Calciumkanäle (VSCC) in präsynaptischen Nervenenden steuern den Zufluss von Ca2+ und bestimmen dadurch die Quantität und Dauer des Transmitters, der durch die präsynaptischen Aktionspotenziale freigesetzt wird. Biochemische 45Ca-Tracer-Flussexperimente mit isolierten Nervenenden (Synaptosomen) zeigen an, dass der K+-Depolarisierungs-abhängige 45Ca-Eintritt aus schnellen vorübergehenden und langsamen anhaltenden Komponenten besteht. Von dem vorübergehenden Ca-Zufluss wurde bestimmt, dass er einen Kanal-vermittelten Prozess darstellt, wohingegen die anhaltende Komponente einen Ca-Eintritt über einen umgekehrten Na/Ca- Austausch reflektiert (Turner, T. and Goldin, S., J. Neurosci. S: 841 – 849 (1985); Suskziw, J. B. NATO ASI Series, H21: 286 – 291 (1988); Suszkiw, J. B. et al. J. Neurochem. 42: 1260 – 1269 (1989)).
  • Die europäische Patentanmeldung mit der Nr. 0 266 574 offenbart, dass Calcium-Überlastungsblocker nützlich bei der Behandlung von Anoxämie, Ischämie, Migräne und Epilepsie sein werden. Diese Anmeldung offenbart ebenfalls, dass bestimmte Piperidinderivate eine Aktivität gegen eine Calcium-Überlastung im Hirn besitzen und bei der Behandlung von Migräne verwendet werden können.
  • Dreyer, E. B. et al., Science 248: 364 – 367 (1990) offenbaren, dass das HIV-1 Hüllprotein gpl20 eine neuronale Zellverletzung erzeugt, die für die beim erworbenen Immunschwäche-Syndrom (AIDS) anzutreffende Demenz und Blindheit verantwortlich sein kann. Calcium-Kanal-Antagonisten verhinderten die gpl20-induzierte neuronale Verletzung von Retina-Ganglionzellen. Dreyer et al. schlugen vor, dass Calcium-Kanal-Antagonisten sich als nützlich bei der Linderung von mit HIV-1 zusammenhängender neuronaler Verletzung erweisen können.
  • US-A-4 906 779 betrifft bestimmte N,N'-disubstituierte Guanidine, die eine hohe Bindungsaffinität zu Phenylcyclidin (PCP)-Rezeptoren zeigen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, N,N',N'',N'''-tetrasubstituierte Hydrazindicarboximidamide bereitzustellen, die die Freisetzung von Neurotransmittern (z. B. Glutamat) aus neuronalen Zellen modulieren.
  • Einige Erkrankungen (z. B. neuronale Schädigung beim Schlaganfall) können durch Inhibierung der Freisetzung von EAAs, wie Glutamat, gelindert werden. Einige Er krankungen (z. B. Depression) können durch Inhibierung der Freisetzung von inhibitorischen Neurotransmittern, wie zum Beispiel Gamma-Aminobutansäure (GABA), gelindert werden. Darüber hinaus kann eine Inhibierung der Freisetzung eines Erregungsneurotransmitters (Glutamat) indirekt die Freisetzung oder die nachfolgenden Wirkungen eines inhibitorischen Transmitters (z. B. GABA) potenzieren und somit zur Behandlung von Erkrankungen dienen, von denen bekannt ist, dass sie durch eine direktere Potenzierung einer inhibitorischen Neurotransmission (in diesem Beispiel Angst und/oder Schlaflosigkeit) gelindert werden. Dies dient zur Veranschaulichung des breiten Umfangs des therapeutischen Potenzials der Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Daher kann jede Erkrankung, die aus einer Modulation eines besonderen Neurotransmittersystems resultiert, durch die N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamide der Erfindung bekämpft werden, die entweder auf die gleiche oder eine andere Klasse von Neurotransmittern wirken.
  • Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, Nervenzelltod zu behandeln oder zu verhindern, der aus Hypoxie, Hypoglykämie, Gehirn- oder Rückenmark-Ischämie, Gehirn- oder Rückenmark-Trauma, Schlaganfall, Herzanfall oder Ertrinken resultiert, durch die Verabreichung von wirksamen Mengen an N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamiden, die die Freisetzung von Neurotransmittern aus neuronalen Zellen inhibieren.
  • Es ist noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verschiedene neurodegenerative Erkrankungen, wie Huntington-Krankheit, Amyotrophische Lateralsklerose, Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom, Korsakow-Krankheit, olivopontozerebellare Atrophie, HIV-induzierte Demenz und Blindheit oder Multünfarktdemenz, durch die Verabreichung von wirksamen Mengen an N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamiden zu behandeln oder zu verhindern, die die Freisetzung von Neurotransmittern inhibieren.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamiden, die nützlich sind zur Behandlung oder Verhinderung von neurologischen Zuständen, wie zum Beispiel Epilepsie und Krämpfen (Convulsio), Kohlenmonoxid-Vergiftung, Cyanid-Vergiftung, toxische Gehirnschädigung, verursacht durch, zum Beispiel, Tetrodotoxin oder Schalentier-Toxine, Angst, Amnesie, Migräne, Fluss-Blindheit (bzw. river blindness) und Nausea, die aus einer Chemotherapie resultieren kann.
  • Ein nicht beanspruchter Screening-Assay umfasst die folgenden Schritte:
    • (a) Inberührungbringen von immobilisierten Synaptosomen, die radiomarkierte Neurotransmitter enthalten, mit einer Verbindung, von der vermutet wird, dass sie eine Neurotransmitter-Freisetzung inhibiert;
    • (b) durch Depolarisation Induzieren der Freisetzung von radiomarkiertem Neurotransmitter aus den immobilisierten radiomarkierten Synaptosomen, die in Schritt (a) erhalten werden;
    • (c) Waschen der in Schritt (b) erhaltenen, immobilisierten radiomarkierten Synaptosomen mit einem Puffer, der die Verbindung enthält, und alle 15 bis 500 msec Fraktionieren des Abflusses; und
    • (d) Detektieren bzw. Feststellen der relativen Menge an radiomarkiertem Neurotransmitter in jeder Fraktion, verglichen mit Kontrollsynaptosomen, die nicht der Verbindung von Interesse ausgesetzt worden sind;
    wobei eine verringerte Menge an freigesetztem radiomarkierten Neurotransmitter in den Fraktionen von mit der Verbindung behandelten Synaptosomen relativ zu den Kontrollsynaptosomen anzeigt, dass die Verbindung eine Neurotransmitter-Freisetzung inhibiert.
  • Der Screening-Assay kann in Anwesenheit oder Abwesenheit von Ca2+ zur Identifizierung derjenigen Verbindungen durchgeführt werden, die selektive Inhibitoren von einem oder mehreren Unterkomponenten einer Neurotransmitter-Freisetzung sind.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuer N,N',N'',N'''-tetrasubstituierter Hydrazindicarboximidamide sowie pharmazeutischer Zusammensetzungen davon.
  • Demgemäß stellt die Erfindung Verbindungen, wie in Anspruch 1 definiert, und eine pharmazeutische Zusammensetzung, wie in Anspruch 5 definiert zur Verfügung. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Ansprüchen 2 bis 4 definiert.
  • Nach einem weiteren Studium der Beschreibung und der anhängenden Ansprüche werden weitere Aufgaben und Vorteile dieser Erfindung dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Verschiedene andere Aufgaben, Merkmale und damit verbundene Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in vollem Maße erkannt werden, da die gleichen besser verstanden werden, wenn sie in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet werden, wobei:
  • 1 veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die 3H-Glutamat-Freisetzung aus Rattenhirn-Synaptosomen in Anwesenheit und Abwesenheit von 2,4 mM Ca2+ zeigt.
  • 2 veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die Wirkung von 0 μM, 10 μM, 30 μM und 100 μM N,N'-Di-(adamantan-1-yl)guanidin (nicht beansprucht) auf die Ca2+-abhängige 3H-Glutamat-Freisetzung aus Rattenhirn-Synaptosomen zeigt.
  • 3 veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die Wirkung von 0 μM, 1 μM, 3 μM und 10 μM N,N'-Di-(5-acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht) auf die Ca1+-abhängige Freisetzung von [3H]Glutamat aus radiomarkierten Synaptosomen nach K+-Depolarisation (zur Zeit 0) über die Zeit zeigt.
  • 4 veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die Korrelation zeigt zwischen einer Inhibierung einer synaptosomalen 45Ca-Aufnahme durch 10 μM N-(Adamantan-1-yl)-N'-(2-methylphenyl)guanidin (#1) (nicht beansprucht), N-(1-Naphthyl)-N'-(m-ethylphenyl)-N'-methylguanidin (#2) (nicht beansprucht), N,N'-Di-(1-naphthyl)guanidin (#3) (nicht beansprucht), N,N'-Di-(adamantan-1-yl)guanidin (#4) (nicht beansprucht), N,N'-Di-(adamantan-2-yl)guanidin (#5) (nicht beansprucht), N,N',N'',N'''-Tetracyclohexylhydrazindicarboximidamid (#6) und N,N'-Di-(5-acenaphthyl)guanidin (#7) (nicht beansprucht) und der Inhibierung der tonischen (persistenten) Ca-abhängigen Komponente der Glutamat-Freisetzung, d. h. der Komponente der Freisetzung, die nicht schnell zerfällt, sondern für wenigstens mehrere Sekunden nach der Depolarisation bestehen bleibt. 4 veranschaulicht weiterhin die Nichtkorrelation zwischen einer Inhibierung einer synaptosomalen 45Ca-Aufnahme durch 10 μM der oben erwähnten Verbindungen und der Inhibierung der phasischen Komponente der Glutamat-Freisetzung.
  • 5 veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die Wirkungen von verschiedenen Konzentrationen an N,N'-Di-(adamantan-2-yl)guanidin (nicht beansprucht) auf die Ga2+-abhängige Glutamat-Freisetzung zeigt, die mit dem Natriumkanal-Aktivator Veratridin stimuliert wurde.
  • 6 veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die Inhibierung einer Kalium-stimulierten Ca-Aufnahme von Synaptosomen durch N,N'-Di-(adamantan-2-yl)guanidin (∎) (nicht beansprucht), N,N'-Di-(1-naphthyl)guanidin (♦; ∙∙∙∙∙∙ IC50 = 9,1 μM, ----- IC50 = 16 μM) (nicht beansprucht), N,N',N'',N'''-Tetracyclohexylhydrazindicarboximidamid (•; _______·_ IC50 = 3,3 μM) und N,N'-Di-(adamantan-1-yl)guanidin (Δ; _______ IC50 = 6,6 μM) (nicht beansprucht) gegen die Prozent Ca-Aufnahme, verglichen mit Kontrollsynaptosomen zeigt.
  • 7 veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die Natrium-Kanal-Blockade durch N,N',Di-(5-acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht) in NIE-115-Zellen zeigt, verglichen mit nicht mit dem Arzneimittel behandelten Kontrollzellen. Das Stimulus-Protokoll ist oben auf der Figur gezeigt.
  • 8 veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die Ca-unabhängige und die Ca-abhängige Rückgewinnung von 3H-Glutamat-Freisetzung aus Synaptosomen über die Zeit zeigt.
  • 9 veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die Ca-unabhängige und die Ca-abhängige Wiederherstellung von 3H-Glutamat-Freisetzung aus Synaptosomen zeigt als Prozentsatz des ersten Pulses.
  • 10 veranschaulicht eine grafische Darstellung, die eine elektrophysiologische Untersuchung zu den Kanälen vom N-Typ von einzelnen Ochsenfrosch-Dorsalwurzel-Ganglionzellen zeigt, die mit 5 μM N,N'-Di-(acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht) behandelt wurden.
  • 11 veranschaulicht eine hippokampale Schnittpräparation, die eine stimulierende und aufzeichnende Elektrode enthält.
  • 12A veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die Ergebnisse von der Badanwendung von N,N'-Di-(5-acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht) auf die Populationsspitzen und Feld-EPSP (exzitatorisches postsynaptisches Potenzial) zeigt.
  • 12B veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die Ergebnisse von der Badanwendung von N,N'-Di-(5-acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht) auf die Feld-EPSP nach elektrischer Stimulation zeigt.
  • 12C veranschaulicht die Wirkung von 20 μM N,N'-Di-(5-acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht) auf die Amplitude der Antwort auf einen elektrischen Stimulus.
  • 13A veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die Ergebnisse von der Badanwendung von Adenosin auf die Feld-EPSP nach elektrischer Stimulation zeigt.
  • 13B veranschaulicht die Wirkung von Adenosin auf die Amplitude der Antwort auf ein elektrisches Signal.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung, dass bestimmte N,N',N'',N'''-tetrasubstituierte Hydrazindicarboximidamide die Fähigkeit besitzen, Neurotransmitter aus neuronalem Gewebe zu modulieren, d. h. zu inhibieren oder deren Freisetzung zu potenzieren oder den Zeitverlauf von deren Wirkung zu verlängern. Als Ergebnis davon können diese Verbindungen zur Behandlung oder Verhinderung derjenigen pathophysiologischen Zustände verwendet werden, die aus exzessiver oder inadäquater Freisetzung von Neurotransmittern resultieren. Wenngleich die Anmelder nicht an irgendeine bestimmte Theorie gebunden sein wollen, so scheint es, dass die N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamide der Erfindung die Inhibierung einer Neurotransmitter-Freisetzung durch Blockieren der präsynaptischen Calcium-Kanäle vermitteln.
  • Unerwarteterweise haben die Anmelder gefunden, dass es drei unterschiedliche Unterkomponenten der Glutamat-Freisetzung aus depolarisierten-stimulierten neuronalen Zellen gibt. Wie in 1 gezeigt, ist die erste Komponente eine schnell zerfallende Ca2+-abhängige phasische Komponente mit einer Zerfallszeitkonstante von <200 msec (genannt die phasische Komponente). Die zweite Komponente (genannt tonisch) ist Ca2+-abhängig und hält für wenigstens eine Sekunde und allgemein für die Dauer der Depolarisation an. Die dritte Komponente ist Ca2+-unabhängig und kann aus der Umkehrung des elektrogenen Na-abhängigen Glutamat-Aufnahmesystems resultieren. Wie in 4 gezeigt, korreliert die Blockierung der tonischen Ca2+-abhängigen Komponente gut mit der Blockierung der Calciumaufnahme. Der Calciumzufluss in die Nervenenden ist ein wichtiger Schritt in der Kaskade der Veränderungen, die beim neuronalen Zelltod von Ischämie stattfinden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamide der Erfindung ihr Versprechen halten, neuronalen Tod von Ischämie zu verhindern.
  • Die Inhibierung der Glutamat-Freisetzung scheint nicht mit irgendeiner Sigma-Rezeptor-Bindungsaktivität verbunden zu sein. Sowohl N,N'-Di-(adamantan-1-yl)guanidin (nicht beansprucht) als auch N,N'-Di-(adamantan-2-yl)guanidin (nicht beansprucht) besitzen ähnliche inhibitorische Wirkung auf die Glutamat-Freisetzung (55% bzw. 60% Inhibierung bei 30 μM), jedoch weit unterschiedliche Sigma-Rezeptor-Bindungsaktivitäten (IC50 = 16,5 nM bzw. 92,7 nM gegen 3H-DTG).
  • Die Identifizierung der drei Unterkomponenten der Inhibierung einer Glutamat-Freisetzung erlaubt das Screening von Verbindungen, die eine Selektivität für die Ca2+-abhängige persistente Komponente der Glutamat-Freisetzung zeigen. Die Identifizierung derartiger Verbindungen soll wirksamere Arzneimittel mit weniger Nebenwirkungen zur Verfügung stellen.
  • Allgemein schließen substituierte Guanidine, die die Neurotransmitter-Freisetzung modulieren können, Verbindung mit der Formel (I) ein:
    Figure 00250001
    wobei R und R' gleich oder verschieden sind und Cycloalkyl von 3 bis 12 Kohlenstoffatomen, z. B. Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cyclohexenyl, Cycloheptyl, 1,4-Methylencyclohexyl, 1- oder 2-Adamantyl, exo- oder endo-2-Norbornyl, exo- oder endo-2-Isobornyl, Menthyl, Cyclopentylmethyl, Cyclohexylmethyl, 1- oder 2-Cyclohexylethyl und 1-, 2- oder 3-Cyclohexylpropyl; carbocyclisches Aryl, Alkaryl, Aralkyl oder heterocyclisch, z. B. mit 6 bis 18 Kohlenstoffatomen und 1–3 getrennte oder kondensierte Ringe enthaltend und 0–5 O-, N- und/oder S-Ringatome in einem Aryl-, alicyclischen oder gemischten Ringsystem, z. B. Phenyl-, Benzyl-, 1- und 2- Phenylethyl, 1-, 2- oder 3-Phenylpropyl; o-, m- oder p-Tolyl, m,m'-Dimethylphenyl, o-, m- oder p-Ethylphenyl, m,m'-Diethylphenyl, m-Methyl-m'-ethylphenyl, o-Propylphenyl, p-Isopropylphenyl, p-tert-Butylphenyl, p-n-Propylphenyl, p-Cyclopropylphenyl, p-Cyclohexylphenyl, p-n-Butylphenyl; Naphthyl, z. B. 1- oder 2-Naphthyl; Biphenyl; oder eine heterocyclische Gruppe, wie zum Beispiel Indanyl, z. B. 4-Indanyl; Indenyl, z. B. 1- oder 4-Indenyl; Acenaphthyl, z. B. 3- oder 5-Acenaphthyl; Acenaphthylenyl, z. B. 5-Acenaphthylenyl; Indolyl, zum Beispiel 7-Indolyl; Benzthiazol, Chinolinyl, Isochinolinyl, Pyridyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Furanyl, Thienyl, Pyrrolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Imidazolyl und Cumarinyl sind; und
    R2 und R3 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, C1-C6-Alkyl, niederes C1-C6-Alkylamino, Aryl oder substituiertes Aryl sind; oder R und R2 oder R1 und R3 einen C4- bis C6-heterocyclischen Ring zusammen mit dem Guanidinstickstoff der an einen Benzolring kondensiert sein kann oder durch einen Benzolring substituiert sein kann, bilden.
  • Die Gruppen R, R1, R2 und R3 können mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein, einschließlich Hydroxy, Amino, Oxo, niederes C1-6-Alkyl, C1-C6-Cycloalkyl, niederes C1-C6-Alkylamino, C1-C6-Alkoxy, Nitro, Azido, Cyano, Isocyanato, Amido, Carbamido, Sulfonat oder Halogen, z. B. Fluor, Chlor, Brom oder Iod.
  • Die Verbindungen im Rahmen der Formel I umfassen N,N'-Di-(adamant-1-yl)guanidin, N,N'-Di-(adamant-2-yl)guanidin, N-(Adamantan-1-yl)-N'-(1-naphthyl)guanidin, N-(Adamantan-2-yl)-N'-(1-naphthyl)guanidin, N-(Adamantan-1-yl)-N'-(2-iodphenyl)guanidin, N-(Adamantan-1-yl)-N'-(2-methylphenyl)guanidin, N-(Adamantan-2-yl)-N'-(2-methylphenyl)guanidin, N-((±)-endo-2-Norbornyl)-N'-(2-iodphenyl)guanidin, N-(α-Naphthyl)-N'-(2-iodphenyl)guanidin, N-(3-Ethylphenyl)-N'-(1-naphthyl)guanidin, N-(1-Naphthyl)-N'-(m-ethylphenyl)-N'-methylguanidin, N,N'-Di-(4-n-Butylphenyl)guanidin, N,N'-Di-(4-Cyclohexylphenyl)guanidin, N,N'- Di-(4-biphenyl)guanidin, N,N'-Di-(4-neopentylphenyl)guanidin, N,N'-Di-(4-Cyclopropylphenyl)guanidin, N,N'-Di-(4-Isopropylphenyl)guanidin und N,N'-Di-(4-tert-Butylphenyl)guanidin.
  • Disubstituierte Guanidine im Rahmen der allgemeinen Formel (I) umfassen Verbindungen mit der Formel (II):
    Figure 00270001
    wobei der Guanidin-Stickstoff an jeder Position der Adamantylgruppen substituiert sein kann;
    R2 und R3 wie oben definiert sind;
    X1 und X2 gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, Acetat, Oxo, Amino, niederes C1-6-Alkyl, Amino, Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen, z. B. Methoxy, Ethoxy und Propoxy; niederes C1-6-Alkylamino, di-niederes-C2-12-alkylamino, Nitro, Azido, Sulfhydryl, Cyano, Isocyanato oder Halogen, z. B. Fluor, Chlor, Brom oder Iod; Amido, z. B. Acetamido, N-Ethylacetamido; Carbamido, z. B. Carbamyl, N-Methylcarbamyl, N,N'-Dimethylcarbamyl; etc., wobei wenigstens eines von X1 und X2 anders als Wasserstoff ist.
  • Die Guanidine im Rahmen der allgemeinen Formel (I) umfassen Verbindungen mit der Formel (III):
    Figure 00280001
    wobei R, R1, R2 und X1 wie oben definiert sind.
  • Die Verbindungen im Rahmen der allgemeinen Formel III umfassen N,N'-Di-(1-Acenaphthyl)guanidin, N,N'-Di-(3-Acenaphthyl)guanidin, N,N'-Di-(5-Acenaphthyl)guanidin, N,N'-Di-(Acenaphthylen-1-yl)guanidin, N-(Adamantan-1-yl)-N'-(5-acenaphthyl)guanidin; N-(Adamantan-2-yl)-N-(5-acenaphthyl)guanidin; N-(Adamantan-1-yl)-N-(3-acenaphthyl)guanidin; N-(Adamantan-2-yl)-N'-(3-acenaphthyl)guanidin; N-(Adamant-1-yl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(4-fluornaphthyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(4-fluornaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(4-hydroxynaphthyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(4-hydroxynaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(4-methoxynaphthyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(4-methoxynaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(4-nitronaphthyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(4-nitronaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(4-aminonaphthyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(4-aminonaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(4-azidonaphthyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(4-azidonaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(4-bromnaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(4-bromnaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N-(4-cyanonaphthyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N-(4-cyanonaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(4-amidonaphthyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(4-amidonaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-(4-iodnaphthyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-(4-iodnaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(7-fluornaphthyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(7- fluornaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(2-fluornaphthyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(2-fluomaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(2-methoxynaphthyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(2-methoxynaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(2-hydroxynaphthyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(2-hydroxynaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(2-aminonaphthyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(2-aminonaphthyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(4-isopropylphenyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(4-isopropylphenyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(4-n-propylphenyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(4-n-propylphenyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N-(2-isopropylphenyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N-(2-isopropylphenyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N-(4-cyclopropylphenyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N-(4-cyclopropylphenyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(cumarinyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(cumarinyl)guanidin; N-(3-Acenaphthyl)-N'-(chinolinyl)guanidin; N-(5-Acenaphthyl)-N'-(chinolinyl)guanidin; N-(4-Hydroxy-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(4-Hydroxy-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(4-Hydroxy-5-acenapthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(4-Hydroxy-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(4-Nitro-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(4-Nitro-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(4-Amino-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(4-Amino-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(4-Amino-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(4-Amino-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(4-Methoxy-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(4-Methoxy-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(4-Methoxy-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(4-Methoxy-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(4-Brom-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(4-Brom-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(4-Brom-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(4-Brom-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(1-Oxo-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(1-Oxo-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(1-Oxo-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(1-Oxo-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(2-Oxo-3- acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(2-Oxo-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(2-Oxo-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(2-Oxo-Sacenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(1-Brom-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(1-Brom-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(1-Brom-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(1-Brom-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(2-Brom-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(2-Brom-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(2-Brom-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(2-Brom-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(1-Hydroxy-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(1-Hydroxy-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(1-Hydroxy-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(1-Hydroxy-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(2-Hydroxy-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(2-Hydroxy-3-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(2-Hydroxy-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(2-Hydroxy-5-acenaphthyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(3-Acenaphthylenyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(3-Acenaphthylenyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N-(5-Acenaphthylenyl)-N'-(adamant-1-yl)guanidin; N-(5-Acenaphthylenyl)-N'-(adamant-2-yl)guanidin; N,N'-bis(4-Brom-3-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(4-Brom-5-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(4-Hydroxy-3-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(4-Hydroxy-5-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(4-Amino-3-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(4-Amino-5-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(4-Nitro-3-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(4-Nitro-5-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(1-Brom-3-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(1-Brom-5-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(2-Brom-3-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(2-Brom-5-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(1-Hydroxy-3-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(1-Hydroxy-5-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(2-Hydroxy-3-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(2-Hydroxy-5-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(1-Oxo-3-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(1-Oxo-5-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(2-Oxo-3-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(2-Oxo-5-acenaphthyl)guanidin; N,N'-bis(3-Acenaphthylenyl)guanidin; N,N1- bis(4-Azido-5-acenaphthyl)guanidin; N,N1-bis(4-Sulfonyl-5-acenaphthyl)guanidin; und N,N'-bis(5-Acenaphthylenyl)guanidin.
  • Andere substituierte Guanidine, die die Neurotransmitter-Freisetzung modulieren können, umfassen Verbindungen mit der Formel (IV):
    Figure 00310001
    wobei R, R1, R2 und R3 wie oben beschrieben sind, X3 und X4 die gleiche Bedeutung wie X1 und X2 haben; und
    x und y gleich oder verschieden sind und 0, 1, 2, 3 oder 4 sind.
  • Die substituierten Guanidine im Rahmen der allgemeinen Formel (I) schließen Verbindungen der Formel (V) ein:
    Figure 00310002
    wobei R2, R3, X1, X2, X3, X4, x und y wie oben beschrieben sind.
  • Die substituierten Guanidine im Rahmen der Formel (V) schließen ein N,N'-Di-(3-nitroadamantan-1-yl)guanidin; N,N'-Di-(3-hydroxyadamantan-1-yl)guanidin; N,N'-Di-(3-aminoadamantan-1-yl)guanidin; N,N'-Di-(3-nitroadamantan-2-yl)guanidin; N,N'-Di-(3-hydroxyadamantan-2-yl)guanidin; N,N'-Di-(3-aminoadamantan-2-yl)guanidin; N,N'-Di-(5-nitroadamantan-2-yl)guanidin; N,N'-Di-(5-hydroxyadamantan-2-yl)guanidin; N,N'-Di-(5-aminoadamantan-2-yl)guanidin; N,N'-Di-(methylenadamantan-1-yl)guanidin; N,N'-Di-(methylenadamantan-2-yl)guanidin; N-(adamantan-1-yl)-N'-(methylenadamantan-1-yl)guanidin; N-(adamantan-2-yl)-N'-(methylenadamantan-2-yl)guanidin; N-(adamantan-1-yl)-N'-(methylenadamantan-2-yl)guanidin; N-(adamantan-2-yl)-N'-(methylenadamantan-1-yl)guanidin; N,N'-Di-(methylen-(3-aminoadamantan-1-yl))guanidin; N,N'-Di-(methylen-(3-aminoadamantan-2-yl))guanidin; N,N'-Di-(methylen-(3-hydroxyadamantan-1-yl))guanidin; N,N'-Di-(methylen-(3-hydroxyadamantan-2-yl))guanidin; N,N'-Di-(methylen-(3-mercaptoadamantan-1-yl))guanidin; N,N'-Di-(methylen-(3-mercaptoadamantan-2-yl))guanidin; N,N'-Di-(methylen-(3-mercaptoadamantan-1-yl))guanidin; N,N'-Di-(methylen-(3-mercaptoadamantan-2-yl))guanidin; N,N'-Di-(methylen-(3-cyanoadamantan-1-yl))guanidin; N,N'-Di-(methylen-(3-cyanoadamantan-2-yl))guanidin; N,N'-Di-(methylen-(3-cyanoadamantan-1-yl))guanidin und N,N'-Di-(methylen-(3-cyanoadamantan-2-yl))guanidin.
  • Andere substituierte Guanidine, die die Neurotransmitter-Freisetzung modulieren können, schließen Verbindungen mit der Formel (VI) ein:
    Figure 00320001
    VI wobei R, R1, R2 und R3 wie oben definiert sind und R4 und R5 die gleiche Bedeutung wie R und R1 haben. Verbindungen mit der Formel (VI) können entweder symmetrische Dimere eines einzigen Guanidins oder Konjugate von verschiedenen Guanidinen sein.
  • Besonders bevorzugte Verbindungen im Rahmen der Formel (VI), und welche in der Praxis der Erfindung verwendet werden können, schließen ein N,N',N'',N'''-Tetracyclohexylhydrazindicarboximidamid, N,N',N'',N'''-Tetraphenylhydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(adamantan-1-yl)-N'',N'''-dicyclohexylhydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(adamantan-2-yl)-N'',N'''-dicyclohexylhydrazindicarboximidamid, N,N',N'',N'''-Tetra-(adamantan-1-yl)-hydrazindicarboximidamid, N,N',N'',N'''-Tetra-(adamantan-2-yl)-hydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(adamantan-1-yl)-N'',N'''-di-(adamantan-2-yl)-hydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(2-norbornyl)-N'',N'''-dicyclohexylhydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(2-isobornyl)-N'',N'''-dicyclohexylhydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(2-isobomyl)-N'',N'''-di-(adamantan-1-yl)hydrazindicarboximidamid und N,N'-Di-(2-isobornyl)-N'',N'''-di-(adamantan-2-yl)hydrazindicarboximidamid.
  • Andere substituierte Guanidine, die die Neurotransmitter-Freisetzung modulieren können, schließen Verbindungen mit der Formel (VII) ein:
    Figure 00340001
    wobei R, R1, R2, R3, X3, X4, x und y wie oben definiert sind. Die Verbindungen mit der Formel (VI) schließen Verbindungen ein, bei denen R und R' Adamantylgruppen sind.
  • Die Verbindungen der Erfindung sind Verbindungen der Formel (VII), wobei R2 und R3 beide Wasserstoff sind. Somit stellt die Erfindung chemische Verbindungen mit der Formel (VIII)
    Figure 00340002
    oder ein Tautomeres davon bereit;
    wobei R und R1 gleich oder verschieden sind und eine Cycloalkyl-Gruppe mit 3 bis 12 Kohlenstoffatomen; eine carbocyclische Aryl-, Alkaryl-, Aralkyl- oder heterocyclische Gruppe sind;
    X3 und X4 gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, einer Hydroxy-, Acetat-, Oxo-, Amino-, C1-6-Alkyl, C1-6-Alkylamino-Gruppe, Alkoxygruppe mit 1 – 6 Kohlenstoffatomen, Di-C2-12-alkylamino-, Nitro-, Azido-, Sulfhydryl-, Cyano-, Isocyanato-, Halogen-, Amido-, Sulfonato- oder Carbamido-Gruppe;
    wobei R und R1 wahlweise substituiert sind mit einer Hydroxy-, Acetat-, Oxo-, Amino-, C1-6-Alkyl-, C1-6-Alkylamino-Gruppe, Alkoxygruppe mit 1 – 6 Kohlenstoffatomen, Di-C2-12-alkylamino-, Nitro-, Azido-, Sulfhydryl-, Cyano-, Isocyanato-, Halogen-, Amino-, Sulfonato- oder Carbamido-Gruppe;
    x und y gleich oder verschieden sind und 0, 1, 2, 3 oder 4 sind, zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines Lebewesens bzw. Tieres.
  • Andere substituierte Guanidine, die die Neurotransmitter-Freisetzung modulieren können, schließen Verbindungen mit der Formel (IX) ein:
    Figure 00350001
    wobei R, R1, R2 und R3 wie oben beschrieben sind und R6 Wasserstoff, eine C1-C6-Alkyl-, C3-C12-Cycloalkyl-, carbocyclische Aryl-, Nitril-, C1-C6-Alkoxycarbonyl-, C1-C6-Acyl- oder Benzoyl-Gruppe ist.
  • Andere substituierte Guanidine, die die Neurotransmitter-Freisetzung modulieren können, schließen Verbindungen mit der Formel (X) ein:
    Figure 00360001
    wobei R, R1, R2, R3, R6, X3, X4, x und y wie oben definiert sind.
  • Die Verbindungen im Rahmen der Formel (X) schließen ein N,N'-Dicyclohexyl-N''-aminoguanidin, N,N'-Di-(adamantan-1-yl)-N''-aminoguanidin, N,N'-Di(adamantan-2-yl)-N''-aminoguanidin, N,N'-Di-(2-norbornyl)-N''-aminoguanidin und N,N'-Di-(2-isobornyl)-N''-aminoguanidin.
  • 0, 1, 2, 3 oder mehr polare Gruppen, die durch X1 und X2 definiert sind, können an den R-Gruppen der Verbindungen mit den Formeln (I) bis (X) vorliegen. Die Verbindungen der Formeln (I) bis (X) schließen Verbindungen ein, bei denen wenigstens einer von R und R1 eine 1- oder 2-substituierte Adamantylgruppe oder eine 3- oder 5-Acenaphthylgruppe ist. Andere Verbindungen sind diejenigen mit erhöhter Löslichkeit in Wasser. Derartige Verbindungen sind solche, bei denen wenigstens eines von X1 oder X2 eine polare Gruppe ist oder wenigstens eines von R und R1 durch eine polare Gruppe substituiert ist. Die in diesem Absatz erwähnten Ausführungsformen sind bevorzugte Ausführungsformen für die Verbindungen der Erfindung.
  • Die N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamide der Erfindung können als ein beliebiges Isomeres einer Anzahl von tautomeren Isomeren existieren. Jedes Isomere dieser tautomeren Isomeren liegt im Rahmen der Verbindungen, die in der beanspruchten Erfindung nützlich sind.
  • Die N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamide der Erfindung sind wirksame Modulatoren einer Neurotransmitter-Freisetzung aus ischämischen neuro nalen Zellen. Eine Modulation von Neurotransmitter-Freisetzung involviert entweder die Inhibierung einer Neurotransmitter-Freisetzung, die Potenzierung einer Neurotransmitter-Freisetzung oder die Modulation des Zeitverlaufs der Wirkung von Neurotransmittern.
  • Die Verbindungen der Erfindung sind wirksame Inhibitoren, wenn sie wenigstens eine 50%-ige Inihibierung einer Neurotransmitter-Freisetzung bei einer Konzentration von etwa 100 μM gemäß dem hierin offenbarten Protokoll bewirken. Mehr bevorzugt bewirken die Verbindungen eine wenigstens 50%-ige Inhibierung einer Neurotransmitter-Freisetzung bei einer Konzentration von etwa 30 μM. Die Verbindungen der Erfindung sind wirksame Potenzierer einer Neurotransmitter-Freisetzung, wenn sie wenigstens eine 50%-ige Potenzierung einer Neurotransmitter-Freisetzung bei einer Konzentration von etwa 100 μM bewirken. Stärker bevorzugt bewirken die Verbindungen wenigstens eine 50%-ige Potenzierung einer Neurotransmitter-Freisetzung bei einer Konzentration von etwa 30 μM. Die Verbindungen der Erfindung sind wirksame aufwärts oder abwärts gerichtete Modulatoren einer Neurotransmitter-Zerfallskinetik, wenn sie eine Verdopplung bzw. Halbierung der Neurotransmitter-Freisetzungskinetik bewirken. Zum Beispiel können wirksame, aufwärts gerichtete Modulatoren einer Neurotransmitter-Freisetzungskinetik eine Verdoppelung der Zerfallskinetik von 100 msec (wie für die Ca2+-abhängige tonische Komponente einer Glutamat-Freisetzung beobachtet) auf 200 msec bewirken.
  • Die Neurotransmitter, die die Neurotransmitter-Freisetzung modulieren können, umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Glutamat, Dopamin, Norepinephrin, Glycin, Aspartat und Serotonin. Ein Fachmann auf diesem Gebiet kann diejenigen Verbindungen, die wirksame Modulatoren einer Neurotransmitter-Freisetzung sind, unter Anwendung der hierin beschriebenen Arbeitsweisen mit nicht mehr als Routineexperimenten identifizieren.
  • Die vielversprechendsten Verbindungen zur Behandlung oder Verhinderung von neuronalem Tod können in vivo in einer oder mehreren Variationen des Ratten-Mittel-Zerebralarterien-Okklusionsmodells bewertet werden. Derartige Modelle werden allgemein als besonders voraussagend für die neuroprotektive Wirksamkeit bei Schlaganfall angesehen (Ginsburg, M. D. and Busto, R. B., Stroke 20: 1627 – 1642 (1989)).
  • Parallel dazu kann die Wirksamkeit von Spitzenkandidaten in dem in weitem Maße akzeptierten 4-Gefäß-Okklusionsmodell einer globalen Ischämie bewertet werden (Pulsinelli, W. A. and Buchan, A. M., Stroke 19: 913 – 941 (1988)). Am Anfang werden Klammern um jede gewöhnliche Carotisarterie von anästhesierten Ratten herum angebracht, und die Vertebralarterien werden elektrokoaguliert. Nach 24 Stunden werden die Klammern für 10 – 30 Minuten fest angezogen und dann gelockert, um eine Reperfusion zu erlauben. Drei Tage später werden die Tiere getötet und die Hirne werden histologisch untersucht.
  • Zahlreiche Untersuchungen haben die Bedeutung einer Verabreichung von neuroprotektiven Arzneimitteln sehr bald nach der ischämischen Verletzung betont (Ginsburg, M. D. and Busto, R. B., Stroke 20: 1627 – 1642 (1989)). Daher können in beiden Modellen Kandidatenverbindungen intravenös oder intraperitoneal zu variierenden Zeitintervallen innerhalb 1 Stunde nach dem Einsetzen der Ischämie verabreicht werden, um das optimale Fenster der therapeutischen Wirksamkeit zu beurteilen.
  • Disubstituierte Guanidine sind der Gegenstand der mitanhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 07/237,367, die am 29. August 1988 eingereicht wurde, und des US-Patents mit der Nr. 4,709,094. Die bevorzugten Guanidine in dem US-Patent Nr. 4,709,094 werden darin durch die Formel beschrieben:
    Figure 00380001
    wobei R und R1 unabhängig voneinander eine Alkyl-, Cycloalkyl-, carbocyclische Aryl-, Alkaryl- oder Aralkyl-Gruppe sind. Als eine Klasse werden diese Verbindungen in diesem Patent als Verbindungen beschrieben, die eine hoch selektive Bindungsaktivität zum Sigma-Hirn-Rezeptor zeigen. In der mitanhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 07/237,367 ist offenbart, dass zusätzliche spezifische Glieder dieser Klasse von disubstituierten Guanidinen eine hohe Bindungsaktivität für den PCP-Rezeptor zeigen.
  • Diese N,N'-disubstituierten Guanidine der Formel III können leicht durch herkömmliche chemische Umsetzungen hergestellt werden, z. B. wenn R und R1 gleich sind, durch Umsetzung des entsprechenden Amins mit Cyanogenbromid. Andere Verfahren, die eingesetzt werden können, umfassen die Umsetzung eines Amins mit einem vorgebildeten Cycloalkyl- oder Arylcyanamid. Vergleiche Safer, S. R. et al., J. Org. Chem. 13: 924 (1948). Dies ist die Methode der Wahl zur Herstellung asymmetrischer N,N'-disubstituierter Guanidine. Bezüglich einer neuen Synthese von asymmetrischen Guanidinen vergleiche G. J. Durant et al., J. Med. Chem. 28: 1414 (1985) und C. A. Maryanoff et al., J. Org. Chem. 51: 1882 (1986).
  • Die Verbindungen mit den Formeln (VI) und (VII) können durch Umsetzung eines symmetrischen oder asymmetrischen Carbodiimids mit Hydrazin in einem organischen Lösungsmittel (vergleiche die Beispiele) hergestellt werden. Die Verbindungen mit den Formeln (IX) und (X) können durch Umsetzung eines symmetrischen oder asymmetrischen Carbodiimids mit Hydrazin unter Erhalt eines 1:1-Addukts hergestellt werden. Vergleiche Beispiel 2; Weygand und Hilgetag in Preparative Organic Chemistry, Hilgetag and Martini (Hrsg.), John Wiley & Sons, New York, NY, Seite 408 (1972); oder Vasilev, P. et al., Chem. Abstr. 93: 150095u.
  • Die Verbindungen der Erfindung, die R- und R1-Gruppen mit polaren Substituenten tragen, können unter Verwendung der oben erwähnten Verfahren hergestellt werden, wobei das Ausgangsmaterial (R-NH2 oder R1-NH2) eine polare Gruppe oder eine geschützte Form davon enthält. Verfahren zur Herstellung derartiger Ausgangsmaterialien werden zum Beispiel gelehrt in US-Patent Nr. 4,649,222, Morat and Rassat, Tet. Lett.: 4561 – 4564 (1979); Sollott and Gilbert, J. Org. Chem. 45: 5405 – 5408 (1980); und Zajac, W. W. et al., J. Org. Chem. 54: 2468 – 2471 (1989).
  • N,N'-disubstituierte-N''-Aminoguanidine können gemäß jedem der Verfahren, die in der Technik wohlbekannt sind, hergestellt werden. Vergleiche zum Beispiel, deutsches Patent Nr. DE 2,452,691 , Sunderdiek, R., et al., Chem. Abstr. 81: 91439m (1974), Bent, K. J., et al., Chem. Abstr. 74: 63479m (1971), deutsches Patent Nr. 2,029,707, Huisgen et al., Chem. Abstr. 63: 2975d (1965), Kroeger, F. et al., Chem. Abstr. 60: 9264f Heinisch, L.,J Pract. Chem. 329: 290 – 300 (1987), Kramer, C.-R. et al., Biochem. Physiol. Pflanzen. 178: 469 – 477 (1983), Prasad, R. N., et al., Can. J. Chem. 45: 2247-2252 (1967), Huisgen, et al., Chem. Ber. 98: 1476 – 1486 (1965), Podrebarac, E. G., et al., J. Med. Chem. 6: 283 – 288 (1963), Kroger et al., Ber. 97: 396 – 404 (1964) und Durant, G. J. et al., J. Med. Chem. 9: 22 – 27 (1966).
  • Unter einem Aspekt, der die Zusammensetzung betrifft, betrifft diese Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung in Einheitsdosierungsform, die an eine systemische Verabreichung an ein Subjekt angepasst ist, zum Beispiel einen Menschen, wobei diese pro Einheitsdosierung eine Menge eines N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamids der Erfindung enthält, die zur Modulierung der Freisetzung eines Neurotransmitters wirksam ist. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Neurotransmitter um Glutamat. Derartige Verbindungen sind vorzugsweise wirksame Modulatoren einer Neurotransmitter-Freisetzung aus ischämischen neuronalen Zellen.
  • Unter einem weiteren Aspekt, der die Zusammensetzung betrifft, betrifft diese Erfindung ein neuroprotektives N,N',N'',N'''-tetrasubstituiertes Hydrazindicarboximidamid der Erfindung, das die Freisetzung eines Neurotransmitters, insbesondere Glutamat, moduliert, und die physiologisch verträglichen Salze davon. Vorzugsweise sind derartige Verbindungen wirksame Inhibitoren einer Neurotransmitter-Freisetzung aus ischämischen neuronalen Zellen.
  • Unter einem Verfahrensaspekt ist eine Methode zur Behandlung oder Verhinderung bestimmter neurologischer Erkrankungen beschrieben, einschließlich Nausea, resultierend aus einer Chemotherapie, den Folgen von Schlaganfall oder traumatischer Hirnverletzung, Epilepsie oder neurologischen Erkrankungen, Kohlenmonoxid-Vergiftung, Cyanid-Vergiftung, toxische Hirnschädigung, die zum Beispiel durch Tetrodotoxin oder Schalenfischtoxine verursacht wurde, Angst und Flussblindheit, wobei die Methode die Verabreichung einer wirksamen Menge eines N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamids der Erfindung, das die Freisetzung eines Neurotransmitters inhibiert, an ein Subjekt umfasst, das einer derartigen Behandlung bedarf. Derartige N,N',N'',N'''-tetrasubstituierte Hydrazindicarboximidamide der Erfindung können nicht-kompetitive Blocker einer Neurotransmitter (z. B. Glutamat)-Freisetzung sein. Vorzugsweise sind die Verbindungen wirksame Inhibitoren einer Neurotransmitter-Freisetzung aus ischämischen neuronalen Zellen.
  • Unter einem weiteren Verfahrensaspekt ist eine Methode zur Verbesserung der neurotoxischen Wirkung von Ischämie beschrieben, wobei die Methode die Verabreichung eines N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamids der Erfindung, das die Freisetzung eines Neurotransmitters inhibiert, an ein Subjekt, z. B. einen Menschen, der Symptome einer derartigen Ischämie zeigt oder für eine derartige Ischämie anfällig ist, in einer Menge umfasst, die zur Verbesserung der neurotoxischen Wirkung wirksam ist.
  • Unter einem anderen Verfahrensaspekt ist eine Methode zur Behandlung der Korsakow-Krankheit, eines chronischen, durch Alkoholismus induzierten Zustands beschrieben, die die Verabreichung eines N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamids der Erfindung an einen Säuger in einer Menge, die zur Behandlung der Krankheit wirksam ist, umfasst. Eine Vorbehandlung von Lebewesen mit den N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamiden der Erfindung kann das Ausmaß von Zellverlust, Hämorrhagien und Aminosäureänderungen in einem Rattenmodell mit Korsakow-Krankheit deutlich vermindern. Vergleiche Langlais, P. J. et al., Soc. Neurosci. Abstr. 14: 774 (1988).
  • Unter einem anderen Verfahrensaspekt ist eine Methode zur Behandlung oder Verhinderung von HIV-induzierter Demenz und Blindheit beschrieben, die das Verabreichen eines N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamids der Erfindung in einer zur Behandlung der Krankheit wirksamen Menge an einen Säuger umfasst. Wie durch Dreyer et al., Science 248: 364 – 367 (1990) offenbart ist, ist gpl120-Neurotoxizität mit erhöhten Werten an Ca2+ verbunden, die anscheinend durch Erregungsaminosäuren vermittelt werden, die an die NMDA-Rezeptorstelle binden. Daher werden die N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamide bei der Behandlung oder Verhinderung von HIV-induzierter Demenz und Blindheit durch Verhinderung der Freisetzung von exzessivem Glutamat von Nutzen sein.
  • Die substituierten Guanidine, Aminoguanidine und N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamide werden bei der Behandlung oder Verhinderung von Zuständen, die durch die Blockade von Natriumionenkanälen behandelbar sind, wie z. B. Epilepsie, von Nutzen sein. Obwohl der Mechanismus einer Blockade einer Neurotransmitter-Freisetzung durch PK 26124 noch nicht klar definiert ist, kann diese Verbindung nicht die präsynaptischen Calciumkanäle antagonisieren, sondern statt dessen die Natriumkanäle in den oder nahe den Nervenenden. Vergleiche Hays, S. J. et al., Abstr. 201st Amer. Chem. Soc. Natl. Meeting, Med. Chem. Abstr. No. 14 (1991). Darüber hinaus blockieren bestimmte antiepileptische Mittel, zum Beispiel Phenytoin (ibid; McLean and MacDonald, J. Pharmacol. Exp. Ther. 227: 779 (1990)) und Lamotrigin (Leach, M. J. et al., Epilepsia 27: 490 – 497 (1986)) Natriumkanäle in einer verwendungsabhängigen Weise. Insbesondere inhibieren sie die Fähigkeit von Neutronen, wiederholt auftretendes Brennen bzw. Heizen aufrecht zu erhalten, und ihre maximale Wirksamkeit liegt in Situationen vor, in denen das Bersten bzw. Brechen bzw. Sprünge von Natriumkanal-vermittelten Wirkungsgpotenzialen stattfindet, wie zum Beispiel bei Epilepsie. In 7 ist gezeigt, dass N,N'-Di-(5-acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht) Natriumkanäle blockiert, zusätzlich zu den präsynaptischen Calciumkanälen. Diese doppelte Wirkung kann eine wünschenswerte Eigenschaft von neuroprotektiven Mitteln sein, da sie wirksamere Blocker einer Neurotransmitter-Freisetzung sein können. Darüber hinaus können die Abhängigkeit von der Verwendung, die Fähigkeit zur Blockierung einer Freisetzung von Glutamat und anderen Neurotransmittern unter Zuständen, die ein Aufrechterhalten der Depolarisation von Neutronen und/oder wiederholt auftretendes Feuern von Aktionspotenzialen verursachen, wünschenswerte Eigenschaften von neuroprotektiven Mitteln sein.
  • Die Verbindungen der Erfindung sind auch bei der Behandlung von Amnesie von Nutzen. Bei dem Glutamat-Freisetzungsblocker Riluzol wurde gezeigt, dass er einen Gedächtnisverlust in ischämischen Lebewesen verhindert. Daher ist es zu erwarten, dass die N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamide der Erfindung auch bei der Behandlung oder Verhinderung von Gedächtnisverlust nützlich sind.
  • Die Verbindungen der Erfindung finden auch Anwendung bei der Behandlung von Migräne. Von dem in EP 0 266 574 offenbarten Calcium-Kanalblocker wird berichtet, dass er für die Behandlung von Migräne nützlich ist. Daher ist zu erwarten, dass die N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamide der Erfindung auch bei der Behandlung oder Verhinderung von Migränen nützlich sind.
  • Beschrieben wird auch die Behandlung oder Verhinderung von Multünfarktdemenz, einer progressiven Verschlechterung der Gehirnfunktion und des Intellekts aufgrund von mehrfachen kleinen Schlaganfällen im Laufe der Zeit. Von den N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamiden der Erfindung erwartet man, dass sie bei der Behandlung von älteren Patienten, die an Multünfarktdemenz leiden, sowie Arteriosklerose nützlich sind.
  • Die beschriebenen Methoden können an jedem Lebewesen, insbesondere Säugern und stärker bevorzugt Menschen, praktiziert werden. Jedoch ist beabsichtigt, dass jedes Lebewesen, das aus der Verabreichung der N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamide der Erfindung einen Vorteil erfahren kann, im Bereich der Lebewesen liegt, die behandelt werden können.
  • Eine (nicht beanspruchte) Arzneimittel-Screening-Methode erlaubt die Identifizierung von Arzneimitteln, die Antagonisten des präsynaptischen Calciumkanals sein können, und die bestimmte Unterkomponenten einer Neurotransmitter-Freisetzung aus neuronalem Gewebe, das einer Ischämie ausgesetzt ist, inhibieren.
  • Derartige Verbindungen, die die Neurotransmitter-Freisetzung inhibieren, können durch eine Methode bestimmt werden, die umfasst:
    • (a) Inberührungbringen von immobilisierten Synaptosomen, die einen radiomarkierten Neurotransmitter enthalten, mit einer Verbindung, von der vermutet wird, dass sie die Neurotransmitter-Freisetzung inhibiert;
    • (b) durch Depolarisation Induzieren der Freisetzung von radiomarkiertem Neurotransmitter aus den immobilisierten radiomarkierten Synaptosomen, die in Stufe (a) erhalten werden;
    • (c) Waschen der immobilisierten radiomarkierten, in Stufe (b) erhaltenen Synaptosomen mit einem Puffer, der die Verbindung enthält, und alle 15 bis 500 msec Fraktionieren des Ausflusses; und
    • (d) Nachweisen bzw. Detektieren der relativen Menge an radiomarkiertem Neurotransmitter in jeder Fraktion im Vergleich zu Kontrollsynaptosomen, die nicht der interessierenden Verbindung ausgesetzt worden sind;
    wobei eine verringerte Menge an freigesetztem radiomarkiertem Neurotransmitter in den Fraktionen aus Synaptosomen, die mit der Verbindung behandelt wurden, relativ zu den Kontrollsynaptosomen anzeigt, dass die Verbindung eine Neurotransmitter-Freisetzung inhibiert.
  • Diese Arzneimittel-Screening-Methode verlangt, dass die eingeschlossenen Synaptosomen in einer Superfusionskammer mit einem sehr kleinen Totvolumen aufgenommen werden, um eine Zeitauflösung unter einer Sekunde zu erlauben. Derartige Superfusionskammern werden zum Beispiel gelehrt in US-Patent Nr. 4,891,185 und von Turner, T. J. et al., Anal. Biochem. 178: 8 – 16 (1989).
  • Diese Methode erlaubt auch das Screening von Arzneimitteln, die selektiv eine Ca2+-abhängige oder Ca2+-unabhängige Unterkomponente einer Neurotransmitter-Freisetzung inhibieren. Wie in 1 gezeigt, gibt es sowohl phasische als auch tonische Komponenten einer Glutamat-Freisetzung in Anwesenheit von Ca2+ und einer Ca2+-unabhängigen Komponente, was bei der Abwesenheit von Ca2+ ersichtlich ist. Vorzugsweise werden Arzneimittel identifiziert, die selektiv die Ca2+-abhängige tonische Komponente einer Glutamat-Freisetzung inhibieren. Derartige Arzneimittel können identifiziert werden, indem man den Assay in Anwesenheit von Ca2+ und des in Frage stehenden Arzneimittels laufen lässt. Vorzugsweise beträgt die Konzentration an Ca2+ etwa > 50 μM. Stärker bevorzugt beträgt die Konzentration an Ca2+ etwa 2 mM. Die selektive Inhibierung der tonischen Komponente einer Neurotransmitter-Freisetzung zeigt an, dass das Arzneimittel besonders wirksam bei der Verhinderung eines neuronalen Verlustes aufgrund von Ischämie und bei der Behandlung anderer pathophysiologischer Zustände sein kann, die die Folge von erhöhten Werten einer Freisetzung von Neurotransmittern, wie zum Beispiel Glutamat, sind.
  • Vorzugsweise sind die Synaptosomen immobilisiert. Methoden zur Herstellung immobilisierter Zellen werden zum Beispiel gelehrt in US-Patent Nr. 4,390,627, 4,212,943 und 4,337,313. Am bevorzugtesten werden die Synaptosomen in eine Filtermatrix eingeschlossen, wie es unten genauer beschrieben wird, in einem Gehäuse mit einem sehr kleinen Totvolumen und ein physiologischer Puffer wird hindurchgeleitet. Der Ausfluss wird dann über sehr kurze Zeiträume (15 bis 500 msec) fraktioniert und die relativen Mengen an radiomarkiertem Neurotransmitter (vorzugsweise Glutamat) in jeder Fraktion werden bestimmt. Ein Diagramm der Menge an radiomarkiertem Glutamat über die Zeit gibt ein Maß für die Fähigkeit der Verbindung, eine Neurotransmitter-Freisetzung zu inhibieren. Ein Beispiel eines derartigen Diagramms ist in 2 gezeigt.
  • Ein detaillierteres, jedoch nicht beschränkendes Protokoll ist wie folgt:
    • (a) Inberührungbringen von Hirnsynaptosomen mit radiomarkiertem Glutamat für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um eine Aufnahme des radiomarkierten Glutamats über das Na-abhängige Glutamat-Aufnahmesystem zu erlauben, unter Erhalt von radiomarkierten Synaptosomen;
    • (b) Herstellen einer Suspension der in Stufe (a) erhaltenen, radiomarkierten Synaptosomen in einem physiologischen Puffer und Leiten der Suspension durch eine Filtermatrix, um die radiomarkierten Synaptosomen einzuschließen;
    • (c) Waschen der eingeschlossenen, radiomarkierten, in Stufe (b) erhaltenen Synaptosomen mit einem physiologischen Puffer;
    • (d) Inberührungbringen der in Stufe (c) erhaltenen, eingeschlossenen, radiomarkierten Synaptosomen mit einer Verbindung, von der vermutet wird, dass sie ein Inhibitor für die Glutamat-Freisetzung ist;
    • (e) Depolarisieren der Membranen der in Stufe (d) erhaltenen, eingeschlossenen, radiomarkierten Synaptosomen;
    • (f) Waschen der in Stufe (e) erhaltenen, eingeschlossenen, radiomarkierten Synaptosomen mit einem physiologischen Puffer, der die interessierende organische Verbindung enthält, und alle 15 bis 500 msec Fraktionieren des Ausflusses; und
    • (g) Bestimmen bzw. Detektieren der relativen Menge an radiomarkiertem Glutamat in jeder Fraktion im Vergleich zu einem Kontrollausfluss, der nicht der interessierenden Verbindung ausgesetzt worden ist.
  • Wo eine verringerte Menge an radiomarkiertem Glutamat in den Ausflussfraktionen von Synaptosomen, die mit der Verbindung behandelt wurden, relativ zu den Kontroll-Synaptosomen vorliegt, handelt es sich bei der Verbindung um einen Inhibitor einer Glutamat-Freisetzung. Wie oben diskutiert, kann der Assay in Anwesenheit oder Abwesenheit von Ca2+ durchgeführt werden, und die Kinetik der Ca-abhängigen Komponente der Neurotransmitter-Freisetzung kann analysiert werden, um die Wirkung der Verbindung auf die drei Unterkomponenten einer Glutamat-Freisetzung zu bestimmen.
  • Bei der obigen Methode werden Synaptosomen isoliert und radioisotopisch mit radiomarkiertem Neurotransmitter markiert. Die radiomarkierten Synaptosomen werden dann in einer Filtermatrix eingeschlossen und man lässt sie mit einer physiologischen Pufferlösung äquilibrieren, die in die Probenkammer durch ein Ventil fließt. Dieses Ventil wird dann geschlossen, gleichzeitig mit dem Öffnen eines zweiten Ventils, das einer physiologischen Lösung, die die organische Testverbindung enthält, erlaubt, durch die Filtermatrix zu fließen und die eingeschlossenen Synaptosomen zu berühren. Das zweite Ventil wird dann geschlossen gleichzeitig mit dem Öffnen eines dritten Ventils, das eine Substanz enthält, mit oder ohne Ca2+, die eine Depolarisation der Synaptosommembranen verursacht, zusammen mit der organischen Testverbindung. Das dritte Ventil wird dann geschlossen gleichzeitig mit dem Öffnen des zweiten Ventils. Während der gesamten Superfusionsdauer wird der Ausfluss, der je physiologischen Puffer, Testverbindung und radiomarkiertes Glutamat enthält, kontinuierlich fraktioniert. Diese Methode erlaubt die schnelle kinetische Messung von radiomarkierter Glutamat-Freisetzung aus Synaptosomen. Wahlweise können eine oder mehrere der Testlösungen, die > 50 μM Ca2+ enthalten, durch das dritte Ventil gefördert werden.
  • Die Synaptosomen können von jedem Lebewesen stammen, einschließlich der Ratte. Sie können gemäß Beispiel 3 hierin oder gemäß Gray and Whittaker, J. Anat. 96: 79 – 88 (1962); oder Suszkiw et al., J. Neurosci. 6: 1349 – 1357 (1986) isoliert werden.
  • Jede radiomarkierte Form des Neurotransmitters kann bei der Durchführung des Screening-Assays eingesetzt werden, einschließlich 3H- und 14C-markiertem Neurotransmitter. Sowohl 3H- als auch 14C-markiertes Glutamat sind im Handel erhältlich.
  • Die eingeschlossenen Synaptosomen werden mit dem radiomarkierten Neurotransmitter für eine Zeit in Berührung gebracht, die ausreichend ist, um eine Aufnahme des radiomarkierten Neurotransmitters durch die Synaptosomen zu erlauben. Eine bevorzugte Zeitdauer beträgt etwa 10 Minuten.
  • Der physiologische Puffer kann jeder Puffer sein, von dem der Fachmann auf diesem Gebiet weiß, dass er mit Synaptosomen verträglich bzw. kompatibel ist. Vergleiche Beispiel 3 (Basalpuffer); Gray and Whittaker, J. Anat. 96: 79 – 88 (1962); oder Suszkiw et al., J. Neurosci. 6: 1349 – 1357 (1986).
  • Filter, die zum Einschließen der Synaptosomen verwendet werden können, sind Matrizes von zufallsorientierten Fasern oder Perlen, die gepresst, gewunden oder anderweitig zu einem gewundenen Gewirr von Flusskanälen zusammengebunden sind (Definition erhalten von Millipore Corp. Catalogue and Purchasing Guide, Lit. Nr. PA085, gedruckt 9/85). Ein Tiefenfilter ist in der Lage, das Substrat in einer dreidimensionalen Matrix zu fangen, was die Beladung einer maximalen Menge von Synaptosomen auf dem Filter erlaubt, ohne dass eine Blockierung (Verstopfung) des Lösungsstromes verursacht wird. Die bevorzugten Tiefenfilter sind Glasfaserfilter, wie zum Beispiel Whatman GF/F-Filter; keramische Filter können ebenfalls verwendet werden. Glasfaserfilter sind insbesondere aufgrund ihrer Flexibilität, chemischen Reaktionsträgheit und niedrigen Kosten wünschenswert. Ein Millipore SC-Filter kann zur Aufrechterhaltung der Unversehrtheit der Glasfaserfilter verwendet werden. Bezüglich einer genauen Beschreibung des Superfusionssystems und der Filterkonfiguration zum Einschließen von Synaptosomen vergleiche Turner, T. J. et al., Anal. Biochem. 178: 8 – 16 (1989).
  • Die Konzentration der organischen Testverbindung in dem physiologischen Puffer kann von 0 bis etwa 1 mM reichen, stärker bevorzugt von 0 bis etwa 100 μM. Wenn das Guanidin in dem physiologischen Puffer nicht löslich ist, dann kann eine äquivalente Menge eines löslichen pharmakologisch verträglichen Salzes der organischen Verbindung, wie hierin offenbart, verwendet werden. Alternativ können die Verbindungen aus einem geeigneten organischen Lösungsmittel verdünnt werden.
  • Die Strömgungsgeschwindigkeiten der physiologischen Lösungen und Testlösungen sollten wenigstens 0,1 ml/sec betragen. Vorzugsweise beträgt die Strömungsgeschwindigkeit etwa 1,0 ml/sec.
  • Eine Induktion der Neurotransmitter-Freisetzung kann durch Depolarisieren der Synaptosommembranen durch Kontakt mit relativ hohen Konzentrationen an Kationen, wie zum Beispiel K+, oder durch Anwendung einer Spannung entlang der Synaptosomen erreicht werden. Alternativ kann die Freisetzung des Neurotransmitters durch Inberührungbringen der Synaptosomen mit Veratramin induziert werden. Die zur Herbeiführung einer Depolarisation erforderliche Konzentration an K+ kann von etwa 10 bis etwa 150 mM reichen. Eine bevorzugte Konzentration beträgt etwa 110 mM (als KCl). Die entsprechende, zur Herbeiführung einer Depolarisation erforderliche Transmembranspannung reicht von etwa –40 mV bis etwa 60 mV.
  • Die Ausflussfraktionen können unter Verwendung beliebiger Mittel bzw. Vorrichtungen gesammelt werden, die das Sammeln von Fraktionen über Zeitdauern von nur etwa 15 msec erlauben. Die Fraktionen können in einer Reihe eines getrennten Rohres gesammelt werden oder sie können kontinuierlich auf ein absorbierendes Substrat, wie zum Beispiel Filterpapier, aufgebracht werden. Vorzugsweise werden die Fraktionen erhalten und mit dem Superfusion-Instrument gesammelt, das in den vorliegenden Beispielen beschrieben ist und in US-Patent Nr. 4,891,185 offenbart ist. Im Allgemeinen wird der Ausfluss in Glasfläschchen bzw. Ampullen gesammelt, die als Spirale oder Kreis auf einem Drehtisch angeordnet sind, der mit 16, 33, 45 und 78 U/min dreht, was 3,75, 1,82, 1,33 und 0,77 Sekunden pro Umdrehung ergibt. Fünfzig Sammelglasfläschchen bei jeder einzelnen Umdrehung erlauben das Sammeln von Fraktionen für bis zu 66 msec oder nur 15 msec.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung können intranasal, oral oder durch Injektion, z. B. intramuskuläre, intraperitoneale oder intravenöse Injektion, oder durch transdermale, intraokulare oder enterale Mittel verabreicht werden. Die optimale Dosis kann durch herkömmliche Mittel bzw. Vorrichtungen bestimmt werden. Da viele der in dieser Erfindung eingesetzten substituierten Guanidine im Wesentlichen wasserunlöslich sind, werden sie üblicherweise in der protonierten Form verabreicht, z. B. als ein pharmazeutisch verträgliches Salz einer organischen oder anorganischen Säure, z. B. Hydrochlorid, Sulfat, Hemisulfat, Phosphat, Nitrat, Acetat, Oxalat, Citrat, Malat.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung können im Gemisch mit herkömmlichen Exzipienten, d. h. pharmazeutisch verträglichen organischen oder anorganischen Trägersubstanzen, die für eine parenterale, enterale oder intranasale Anwendung geeignet sind, die nicht nachteilig zu den aktiven Verbindungen reagieren, eingesetzt werden. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Wasser, Salzlösungen, Alkohol, Pflanzenöle, Polyethylenglykole, Gelatine, Lactose, Amylose, Magnesiumstearat, Talk, Kieselsäure, viskoses Paraffin, Parfümöl, Fettsäuremonoglyceride und -diglyceride, petroethrale Fettsäureester, Hydroxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon. Die pharmazeutischen Zubereitungen können sterilisiert werden und, falls gewünscht, mit Hilfsmitteln vermischt werden, z. B. Gleitmitteln, Konservierungsstoffen, Stabilisatoren, Netzmitteln, Emulgatoren, Salzen zur Beeinflussung des osmotischen Druckes, Puffern, Farbstoffen, Geschmacksstoffen und/oder aromatischen Substanzen und dergleichen, die nicht nachteilig mit den aktiven Verbindungen reagieren.
  • Für eine parenterale Anwendung sind insbesondere Lösungen geeignet, vorzugsweise ölige oder wässrige Lösungen sowie Suspensionen, Emulsionen oder Einlagen bzw. Implantate, einschließlich Suppositorien. Ampullen sind geeignete Einheitsdosierungen.
  • Für eine enterale Verabreichung sind besonders geeignet Tabletten, Dragees oder Kapseln mit Talk und/oder einem Kohlenhydrat-Trägerbindemittel oder dergleichen, wobei der Träger vorzugsweise Lactose und/oder Maisstärke und/oder Kartoffelstärke ist. Ein Sirup, Elixier oder dergleichen kann dort verwendet werden, wo ein gesüßtes Vehikel eingesetzt wird. Zusammensetzungen mit beständiger Freisetzung können formuliert werden, einschließlich derjenigen, bei denen die aktive Komponente mit differenziell abbaubaren Überzügen, z. B. durch Mikroeinkapselung, Mehrfachüberzüge, geschützt ist.
  • Eine intravenöse oder parenterale Verabreichung, z. B. subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre, sind bevorzugt. Die Verbindungen dieser Erfindung sind besonders wertvoll bei der Behandlung von Säugersubjekten, z. B. Menschen. Typischerweise schließen diese Subjekte diejenigen ein, die an Nervensystem-Dysfunktionen leiden, die zum Beispiel von einer Epilepsie oder Nervenzellen-Degeneration stammen, die das Ergebnis einer Hypoxie, Hypoglykämie, Gehirn- oder Rückenmarktrauma oder Hirn- oder Rückenmarkischämie ist, oder bei denen es wahrscheinlich ist, dass sie daran leiden. Typische Kandidaten für eine Behandlung umfassen Patienten mit Herzanfall, Schlaganfall, Gehirn- oder Rückenmarkverletzung, Patienten, die sich einer Hauptoperation unterziehen, bei denen Hirnischämie eine potenzielle Komplikation ist, Patienten [Taucher], die an einer Dekompressionskrankheit leiden aufgrund von Gasembolie im Blutstrom, ertrinkende Opfer und Patienten, die an Kohlenmonoxid-Vergiftung, Cyanid-Vergiftung und toxischer Hirnschädigung von einer Ingestion von Tetrodotoxin oder Schalenfischtoxin leiden. Andere Kandidaten umfassen Patienten, die an Amnesie, Migräne und Multünfarktdemenz leiden. Weitere Kandidaten zur Behandlung umfassen diejenigen Patienten, die an neurodegenerativen Krankheiten, wie Huntington-Krankheit, Amyotrophische Lateralsklerose, Alz heimer-Krankheit, Down-Syndrom, olivopontozerebellare Atrophie und Korsakow-Krankheit leiden. Darüber hinaus können HIV-infizierte Individuen mit den N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamiden der Erfindung zur Behandlung oder Verhinderung von Blindheit und mit HIV-verbundener Demenz behandelt werden. Überdies können die N,N',N'',N'''-tetrasubstituierten Hydrazindicarboximidamide der Erfindung denjenigen Patienten verabreicht werden, die für eine verallgemeinerte Angsterkrankung (GAD) empfänglich sind, zur Behandlung oder Verhinderung der Angst.
  • Die Verbindungen der Erfindung können auch in Tieftemperatur-Konservierungslösungen für Gewebe, Organe und Lebewesen eingesetzt werden. Die Verbindungen der Erfindung in derartigen Lösungen können wirksam sein zur Verringerung des Ausmaßes an neuronalem Verlust, der mit dem Gefrieren der Gewebe, Organe und Lebewesen verbunden ist.
  • Es versteht sich, dass die tatsächlich bevorzugten Mengen an aktiven Verbindungen gemäß der spezifischen verwendeten Verbindung, der besonderen formulierten Zusammensetzungen, der Art der Anwendung und der spezifischen Verabreichungsstelle variieren werden. Optimale Verabreichungsraten für ein gegebenes Protokoll einer Verabreichung können leicht vom Fachmann auf diesem Gebiet unter Einsatz herkömmlicher Dosierungsbestimmungstests, die bezüglich der vorangegangenen Richtlinien durchgeführt wurden, ermittelt werden.
  • Wie die Guanidine der US-Patente mit den Nrn. 1,411,713, 1,422,506 und 1,597,233 können die substituierten Guanidine und verwandten Verbindungen der vorliegenden Erfindung ebenfalls als Vulkanisationsbeschleuniger verwendet werden.
  • Die Erfindung betrifft auch radiomarkierte Derivate der Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise handelt es sich bei der Radiomarkierung um 3H, 11C, 14C, 18F, 125I, 131I, 15N, 35S oder 32P. Diese radiomarkierten Verbindungen können zur Untersuchung der Rezeptoren, die für ihre pharmakologische Aktivität verantwortlich sind, als auch zum Abbilden von Gewebeproben zur Verteilung der Rezeptoren für diese Verbindungen verwendet werden.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verbindungen der Erfindung in Form pharmazeutisch verträglicher Salze, z. B. Salzen mit pharmazeutisch verträglichen Säuren, wie zum Beispiel Salz-, Schwefel-, Essig-, Hydroxybernstein-, Phosphor- oder Bernsteinsäure.
  • Es wird davon ausgegangen, dass der Fachmann auf diesem Gebiet ohne weitere Ausarbeitung unter Verwendung der vorangegangenen Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem vollem Ausmaß nutzen kann. Die folgenden bevorzugten spezifischen Ausführungsformen sind daher nur als rein veranschaulichend zu verstehen und nicht in irgendeiner Weise als beschränkend für den Rest der Offenbarung zu verstehen.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Synthese von N,N'-(Adamantan-2-yl)guanidin-Hydrochlorid (nicht beansprucht)
  • 2-Adamantylcyanamid. 2-Adamantanamid-Hydrochlorid (25 g, 133,2 mmol, Aldrich) wurde zwischen 200 ml Toluol und 200 ml 1N NaOH aufgeteilt und das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde mit Toluol (75 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser (100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und das sich ergebende Filtrat wurde verwendet wie es war (die Menge an 2-Adamantanamin wurde mit 133 mmol angenommen). Zu dieser eiskalten Lösung wurde tropfenweise unter Rühren eine Lösung von Bromcyan (8,74 g, 82,5 mmol) in 25 ml Toluol zugegeben. Im Laufe der Zugabe bildete sich ein Niederschlag. Nachdem die Zugabe von Bromcyan beendet war, ließ man das Reaktionsgemisch zur Erwärmung auf Raumtemperatur stehen und zusätzliche zwei Stunden rühren. Der Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum unter Erhalt von 10 g eines hellgelben Feststoffs aufkonzentriert. Das Rohprodukt wurde umkristallisiert (Methanol/Wasser) und das Produkt im Vakuum (1 Torr, über P2O5/KOH) unter Erhalt von 9,04 g (62 % Ausbeute) des gewünschten Produkts getrocknet.
  • N,N'-(Adamantan-2-yl)guanidin-Hydrochlorid (nicht beansprucht). Ein Gemisch von 2-Adamantylcyanamid (3,4 g, 19,35 mmol) und 2-Adamantanamid-Hydrochlorid (2,9 g, 15,48 mmol) wurde in einem Ölbad bei 205 °C unter Argonatmosphäre erhitzt. Das Gemisch schmolz allmählich zu einem halbfesten Rückstand (ergab aber nie eine klare Schmelze) und verfestigte sich dann. Man ließ das Reaktionsgemisch abkühlen und Methanol (30 ml) und Wasser (30 ml) wurden dann zu dem Feststoff zugegeben. Das Gemisch wurde filtriert und der erhaltene Feststoff wurde mit Methanol (150 ml) erwärmt und das unlösliche Material wurde durch Schwerkraftfiltration entfernt. Das Filtrat wurde mit Aktivkohle geklärt und im Vakuum unter Erhalt eines weißen Feststoffs aufkonzentriert. Dieses Material wurde in 150 ml siedendem Ethanol gelöst und die resultierende Lösung wurde über einer heißen Platte unter Erhalt von 60 ml aufkonzentriert. Beim Abkühlen fand eine Kristallisation statt, wobei 3 g eines Produkts erhalten wurden, das wiederum umkristallisiert wurde, dieses Mal aber aus Ethanol und Wasser unter Erhalt (nach Trocknen im Vakuum über P2O5 bei 65 °C für 24 h) von 2,92 g (nicht beanspruchtem) N,N'-(Adamantan-2-yl)guanidin-Hydrochlorid. Smp. > 340 °C, Analyse berechnet für C21H34N3Cl: C, 67,08; H, 9,11; N, 11,18. Gefunden: C, 67,21; H, 9,26; N, 11,34.
  • Beispiel 2: Synthese von N,N',N'',N'''-Tetracyclohexylhydrazindicarboximidamid
  • DCC (1,03 g, 4,97 mmol) wurde in Tetrahydrofuran (15 ml) gelöst. Hydrazin (135 mg, 4,22 mmol) wurde über eine Spritze zugegeben. 30-stündiges Rühren bei Raumtemperatur ergab ein klares gelbes Gemisch, das zu einem weißen Pulver (922 mg) eingedampft wurde. Eine Lösung dieses Pulvers in Diethylether, Filtration und Ansäuerung mit HCl (60 ml gesättigtes Et2O) ergab einen gelb-weißen Niederschlag (856 mg). Zwei Umkristallisationen (EtOH in einer Et2O-Kammer) ergaben weiße Prismen (133 mg, 18 %, Smp. 288 – 290 °C). Der niedrige Stickstoff-Prozentanteil in der Elementaranalyse dieser Verbindung zeigt an, dass zwei DCC-Äquivalente zu Hydrazin reagiert haben, wobei die Titelverbindung gebildet wurde. 1H-NMR ([2H]-CH3OH) δ 3,21 (s, 4, N-tragendes Cyclohexyl), 2,0 – 1,5 (m, 44, Cyclohexyle). 13C-NMR ([2H]-CH3OH) δ 154,1 (Guanidin), 51,7 (N-tragendes Cyclohexyl), 32,4 und 24,8 (Cyclohexyle). IR zeigt Peaks bei 1639 und 1589 cm–1. Elementaranalyse (C26N6H50Cl2:1/2 H2O). Theor. C 59,30, H 9,76, N 15,96, gefunden C 58,94, H 9,76, N 16,01.
  • Beispiel 3: Synthese von N,N'-Bis(5-acenaphthyl)guanidin-Hydrobromid (nicht beansprucht)
  • 5-Aminoacenaphthen. 40 g (Aldrich Lot # CY 02301 HX, enthaltend 15 % des 3-Nitroisomers) 5-Nitroacenaphthen wurden in einem Gemisch von Tetrahydrofuran (150 ml) und Essigsäure (25 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 1,0 10%-iges Pd/C zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur hydriert (40 psi). Nach 2 Stunden wurde das Gemisch durch ein Celit-Bett filtriert und das Filtrat wurde im Vakuum aufkonzentriert unter Erhalt eines Gemisches eines Feststoffs, der, wenn man ihn der Luft aussetzte, sich beträchtlich verdunkelte (zu purpur). Dieses Material wurde dann wieder in Methylenchlorid gelöst und mit Aktivkohle entfärbt und dann wurde das Produkt aus einem Gemisch von Cyclohexan:Ethylacetat (3:1) umkristallisiert unter Erhalt von 8,3 g eines klaren Materials, wobei nur das Haupt-5- Aminoisomer gemäß TLC vorlag. Dieses Material wurde so, wie es erhalten wurde, direkt in der nächsten Stufe verwendet.
  • N,N'-Bis(5-acenaphthyl)guanidin-Hydrobromid (nicht beansprucht): Zu einer umgerührten Lösung von 5-Aminoacenaphthen (8,1 g, 49 mmol) in Ethanol (35 ml) wurde tropfenweise unter Rühren eine Lösung von Bromcyan (2,6 g, 24,5 mmol) in Ethanol (25 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde dann 6 h am Rückfluss gekocht und man ließ es 48 h geeigneterweise stehen. Die Kristalle wurden durch Filtration gesammelt und mit ein wenig Ethanol und dann Ether unter Erhalt von 7,7 g Rohprodukt gewaschen. Dieses Material wurde mit einer kleineren 1,1 g Charge vereinigt und die Gesamtmenge wurde in siedendem Ethanol (etwa 1 l) gelöst und mit Aktivkohle entfärbt. Die Aktivkohle wurde durch Schwerkraftfiltration entfernt und das Filtrat über einer heißen Platte auf 200 ml aufkonzentriert. Beim Abkühlen schieden sich weiße Kristalle ab, die im Vakuum bei 100 °C unter 1 Torr getrocknet wurden unter Erhalt von 5,9 g;
    Smp. 288 – 290 °C.
    Analyse berechnet für C25H22N3Br (444,35); C, 67,56; H, 4,99; N, 9,46.
    Gefunden: C, 67,46; H, 5,06; N, 9,21.
    HPLC (Umkehrphase): MeCN/H2O (50:50 mit 0,1 % TFA), einzelne Komponente Rt = 12,91 Minuten.
  • Beispiel 4: Synthese von N,N'-Bis(3-acenaphthyl)guanidin-Hydrobromid (nicht beansprucht)
  • 3-Aminoacenaphthen. Eine 25 g Probe eines im Handel erhältlichen 5-Nitroacenaphthens (enthaltend 15 % des 3-Nitroisomers) wurde chromatographiert (600 g Siliciumdioxidgel, 230 – 400 Mesh, Hexan/Ethylacetat (10:1)) unter Erhalt von 400 mg des 3-Nitroisomers. Bei dem Rest der Fraktionen handelte es sich um ein Gemisch beider Isomeren und diese Methode wurde als eine Methode zur Auftrennung der zwei Isomeren aufgegeben. Die 400 mg Probe wurde hydriert (40 psi, 10 % Pd/C, 5 % Essigsäure in THF) auf einer Parr-Apparatur unter Erhalt der Aminoverbindung, die nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum sich verfestigte. Dieses Material wurde direkt in der nächsten Stufe verwendet.
  • N,N'-Bis(3-acenaphthyl)guanidin-Hydrobromid (nicht beansprucht): Zu einer Lösung von 3-Aminoacenaphthen in 15 ml absolutem Alkohol wurde 85 mg Bromcyan zugegeben. Die Lösung wurde unter einer Stickstoffatmosphäre 11 Stunden am Rückfluss erhitzt. Die Lösung wurde im Vakuum auf ~8 ml aufkonzentriert und das Gemisch wurde in einem Eisbad unter Erhalt von 120 ml Rohprodukt abgekühlt. Dieses Material wurde aus Ethanol unter Erhalt von 60 mg Produkt, Smp. 291 – 293 °C, umkristallisiert. Die HPLC dieses Materials zeigte die Anwesenheit einer einzigen Verunreinigung (15 %). Daher wurde dieses Material zwischen einer 10 %-igen wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat und Ethylacetat aufgeteilt mit der Absicht, es zu der freien Base umzuwandeln und dann eine Präp- bzw. präparative TLC laufen zu lassen. Jedoch bildete ein guter Teil des Materials eine Emulsion in der organischen Schicht. Dieser Feststoff wurde durch Filtration gesammelt und es stellte sich heraus, dass er frei von der Verunreinigung war. Er wurde in 0,7 M HCl in Methanol wieder aufgelöst und im Vakuum aufkonzentriert unter Erhalt eines creme-weißen Feststoffs; Gewicht 20 mg; Smp. 210 (s bzw. langsam) – 230 °C (langsame Zersetzung). Dieser Schritt hätte möglicherweise weggelassen werden können, da es schwierig ist vorherzusagen, ob es sich bei dem Material um ein Hydrochlorid oder Hydrobromid handelt. Da wir eine derartig kleine Menge an dem Material hatten und es gemäß TLC und HPLC sauber ist, machten wir keinen Versuch, eine Elementaranalyse durchzuführen.
    HPLC: C18-Umkehrphase, MeCN:H2O 50:50 mit 0,1 % TFA, Rt = 16,7 min. (98,85 %), Verunreinigungen bei 4,62 min. (,625 %) und 15,83 min. (,517 %).
  • Beispiel 5: Synthese von N-(3- und 5-Acenaphthyl)-N'-(4-isopropylphenyl)guanidin·HCl(nicht beansprucht)
  • Ein Gemisch von 3- und 5-Nitroacenaphthen (5 g) wurde in EtOAc gelöst und in einen Hydrierkolben eingebracht, der Palladium auf Aktivkohle (10 %, 0,5 g) enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 h bei 40 psi hydriert. Der Wasserstoffdruck fiel aufgrund des Verbrauchs an Wasserstoff und er wurde einige male während der Reaktion auf 50 psi zurückgebracht. Sobald das gesamte Ausgangsmaterial verbraucht worden war, wurde der Wasserstoff abgeblasen und die resultierende Lösung wurde durch ein Celit-Kissen bzw. -Pad filtriert und mit EtOAc (20 ml) gewaschen. Das klare Filtrat wurde aufkonzentriert und unter Vakuum getrocknet unter Erhalt eines Gemisches von 3- und 5-Aminoacenaphthen als braunem Feststoff (4,2 g, 100 % Ausbeute).
    TLC (SiO2, CH2Cl2): Rf = 0,2
  • 3- und 5-Aminoacenaphthen·HCl (nicht beansprucht)
  • Ein Gemisch von 3- und 5-Aminoacenaphthen (0,8 g) in MeOH (40 ml) wurde mit HCl/MeOH (0,5 M, 20 ml) behandelt, und das Reaktionsgemisch wurde 30 min. bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Lösung aufkonzentriert und getrocknet unter Vakuum unter Erhalt eines Gemisches von 3- und 5-Aminoacenaphthen·HCl als grauem Feststoff.
  • Isoproylphenylcyanamid
  • Eine Lösung von Bromcyan (1,59 g, 15 mmol) in Diethylether (20) wurde tropfenweise zu einer Lösung von 4-Isopropylanilin (3,24 g) in Diethylether (50 ml) bei 4 °C unter Rühren zugegeben. Nach der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 18 h unter Rühren gehalten. Dann bildete sich eine Lösung mit weißen Niederschlägen und die Niederschläge wurden durch Filtration entfernt. Die Etheratlösung wurde mit wässriger HCl (1 N, 30 ml, zweimal) als auch Salzlösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet, filtriert und aufkonzentriert und getrocknet unter Vakuum unter Erhalt von 4-Isopropylphenylcyanamid (2,0 g, 84 %).
    TLC (SiO2, CH2Cl2): Rf = 0,2
    IR(CH2Cl2): 2220 cm–1.
  • Synthese von Di-(3- und 5-Acenaphthyl)-N'-(4-isopropylphenyl)-guanidin·HCl (nicht beansprucht)
  • Einer gerührten Lösung von 4-Isopropylphenylcyanamid (160 mg) in Chlorbenzol (35 ml) wurde ein Gemisch von 3- und 5-Aminoacenaphthen·HCl (230 mg, 1 mmol) bei 25 °C unter Argon zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Ölbad bei 150 °C für 20 h erhitzt. Es wurde eine homogene Lösung erhalten und diese Lösung wurde bis zur Trockne durch Rotavap aufkonzentriert. Das erhaltene Produkt wurde weiterhin durch präparative TLC aufgereinigt unter Erhalt von N-(3- und 5-Acenaphthyl)-N'-(4-isopropylphenyl)-guanidin·HCl (nicht beansprucht) als hellbraunem Feststoff (0,28 g, 71 % Ausbeute).
    TLC (SiO2, CH2Cl2/MeOH = 9/1): Rf = 0,36
    IR(CH2Cl2): 1660 cm–1 (Guanidin-Peak).
    1H-NMR(CD3OD) ppm: 1,07 (d, J = 8,57 Hz, 6H), 2,76 (m, 1H), 3,24 (m, 4H), 7,08 – 7,52 (m, 9H).
    13C-NMR(CD3OD) ppm: 24,30, 30,94, 31,54, 35,01, 118,48, 120,35, 121,35, 126,45, 126,86, 127,61, 128,38, 128,98, 129,53, 130,24, 133,85, 141,63, 147,99, 148,76, 149,68, 149,87, 157,30.
  • Hochauflösende Massenspektroskopie: C22H23N3 329,1892 (berechnet), 329,1889 (exp.).
  • Beispiel 6: Synthese von N-(3- und 5-Acenaphthyl)-N'-(4-fluornaphthyl)-guanidin·HCl (nicht beansprucht)
  • 3- und 5-Acenaphthylcyanamid:
  • Eine Lösung von Bromcyan in CH3CN (5 M, 5,1 ml, 25,6 mmol) wurde langsam in eine gerührte Lösung von 3- und 5-Aminoacenaphthen (41 mmol) in Diethylether (65 ml) und EtOAc (10 ml) bei 0 °C zugegeben. Nach der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch 23 h bei Raumtemperatur gerührt. Schließlich wurde das Reaktionsgemisch eine grüne Lösung mit grauen Niederschlägen; die Niederschläge wurden durch Filtration entfernt. Das grüne Filtrat wurde weiter gewaschen mit wässriger HCl (1N, dreimal), Wasser (100 ml) und Salzlösung (200 ml). Dann wurde die Lösung über MgSO4 getrocknet, filtriert, aufkonzentriert und getrocknet im Vakuum unter Erhalt von 3- und 5-Acenaphthylcyanamid. Bei dem Produkt handelte es sich um einen braunen Feststoff (3,64 g; 92 % Ausbeute).
    TLC (SiO2, CH2Cl2/MeOH = 9/1): Rf = 0,67
  • 4-Fluor-1-aminonaphthalin
  • 4-Fluor-1-nitronaphthalin (1 g) wurde in EtOAc (20 ml) gelöst und in einen Hydrierkolben eingebracht, der Palladium auf Aktivkohle (10 %, 0,3 g) enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde 5 h bei 50 psi hydriert. Während der Reaktion fiel der Wasserstoffdruck aufgrund des Verbrauchs an Wasserstoff und er wurde einige Male auf 50 psi zurückgebracht. Schließlich stoppte die Reaktion, sobald das gesamte Ausgangsmaterial verbraucht worden war. Die resultierende Lösung wurde durch ein Celit-Kissen bzw. -Pad filtriert und mit EtOAc (20 ml) gewaschen. Das klare Filtrat wurde aufkonzentriert und getrocknet im Vakuum unter Erhalt von 4-Fluor-1-aminonaphthalin.
    TLC (SiO2, CH2Cl2): Rf = 0,33
  • 4-Fluor-1-aminonaphthali·HCl: Zu 4-Fluor-1-aminonaphthalin in MeOH (5 ml) wurde HCl/MeOH (0,5 M, 20 ml) zugegeben, dann wurde das Reaktionsgemisch 30 min. bei Raumtemperatur gerührt. Während der Umsetzung bildete sich ein weißer Niederschlag; der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet unter Erhalt von 4-Fluor-1-aminonaphthali·HCl als weißem Feststoff (0,81 g; 80 % Ausbeute).
  • N-(3- und 5-Acenaphthyl)-N'-(4-fluornaphthyl)guanidi·HCl (nicht beansprucht) Ein Gemisch von 3- und 5-Acenaphthylcyanamid (516 mg, 2,66 mmol) und 4-Fluor-1-aminonaphthali·HCl (500 mg, 2,53 mmol) in Chlorbenzol (15 ml) wurde auf 150 °C für 24 h unter Rühren erhitzt. Nachdem das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt worden war, wurde Diethylether (50 ml) zugegeben und ein weißer Niederschlag bildete sich. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, in Methanol wieder aufgelöst, mit Norit für 30 min. behandelt, filtriert und aufkonzentriert unter Erhalt des Rohprodukts. Das Rohprodukt wurde weiter umkristallisiert in EtOH/Et2O unter Erhalt von reinem (nicht beanspruchtem) (N-(3- und 5-Acenaphthyl)-N'-(4-fluornaphthyl)guanidi·HCl (0,52 g, 53 % Ausbeute).
    TLC (SiO2, CH2Cl2/MeOH = 9/1): Rf = 0,37.
    1H-NMR(CD3OD) ppm: 3,33 – 3,38 (m, 4H), 7,22 – 8,10 (m, 11H).
    13C-NMR(CD3OD) ppm: 30,97, 31,55, 110,64, 118,41, 120,39, 121,45, 122,09, 123,38, 125,84, 127,23, 127,68, 128,02, 128,44, 128,97, 129,56, 129,84, 130,37, 133,18, 141,67, 148,09, 149,19, 158,43, 160,13 (d, j = 253,4 Hz).
    Hochauflösende Massenspektroskopie: C23H18N3 F 355,1484 (berechnet),
    355,1479 (exp.).
  • Beispiel 7: Synthese von N-(3- und 4-Acenaphthyl)-N'-(4-methoxynaphthyl)guanidin·HCl (nicht beansprucht)
  • 4-Methoxy-1-aminonaphthalin
  • Ein Gemisch von 4-Methoxy-1-nitronaphthalin (2 g, 9,84 mmol) wurde in EtOAc (100 ml) gelöst und in einen Hydrierkolben eingebracht, der Palladium auf Aktivkohle (10 %, 0,2 g) enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 h bei 50 psi hydriert. Während der Reaktion fiel der Wasserstoffdruck einige Male aufgrund des Verbrauchs an Wasserstoff und der Druck wurde auf 50 psi zurückgebracht. Sobald das Ausgangsmaterial verbraucht war, wurde die Reaktion gestoppt und der Wasserstoff wurde abgeblasen. Die resultierende Lösung wurde durch ein Celit-Kissen filtriert und mit EtOAc (20 ml) gewaschen. Das klare Filtrat wurde aufkonzentriert und getrocknet im Vakuum unter Erhalt von 4-Fluor-1-aminonaphthalin (100 % Ausbeute).
    TLC (SiO2, CH2Cl2): Rf = 0,24.
  • 4-Methoxy-1-aminonaphthalin·HCl
  • 4-Methoxy-1-aminonaphthalin (0,53 g, 3,1 mmol) wurde in HCl/MeOH (0,5 M, 15 ml) gelöst, dann wurde das Reaktionsgemisch 60 min. bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockne aufkonzentriert unter Erhalt des Rohpro dukts als Feststoff. Der Feststoff wurde weiter gewaschen mit EtOAc, durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet unter Erhalt von 4-Methoxy-1-aminonaphthalin·HCl als weißem Feststoff (0,61 g; Ausbeute: 96 %).
  • N-(3- und 5-Acenaphthyl)-N'-(4-methoxynaphthyl)guanidin·HCl (nicht beansprucht)
  • Ein Gemisch von 3- und 5-Acenaphthylcyanamid (243 mg, 1,25 mmol) und 4-Methoxy-1-aminonaphthalin·HCl (250 mg, 1,19 mmol) in Chlorbenzol wurde auf 150 °C für 7 h unter Rühren erhitzt. Nachdem das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt worden war, wurde es ein Gemisch von einer braunen Lösung und weißen Niederschlägen. Die Niederschläge wurden durch Filtration gesammelt, gründlich mit CH2Cl2 (30 ml) sowie EtOAc (15 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet unter Erhalt von (nicht beanspruchtem) N-(3- und 5-Acenaphthyl)-N'-(4-methoxynaphthyl)guanidimHCl (0,41 g, 86 % Ausbeute) als weißem Pulver.
    TLC (SiO2, CH2Cl2/MeOH = 9/1): Rf = 0,33
    1H-NMR(CD3OD) ppm: 3,32 – 3,36 (m, 4H), 3,96 (s, 3H),
    6,89 – 8,24 (m, 11H).

    13C-NMR(CD3OD) ppm: 30,96, 31,55, 104,76 118,44, 120,37, 121,42, 122,79, 123,64, 123,82, 123,86, 127,08, 127,31, 127,77, 128,32, 128,87, 128,98, 130,06, 132,62, 141,67, 148,07, 149,13, 157,62, 158,57.
    Hochauflösende Massenspektroskopie: C24H21N3O
    367,1685 (berechnet),
    367,1686 (exp.).
  • Beispiel 8: Grundprotokoll zur Herstellung von Synaptosomen und Superfusion
  • Lösungen:
    0,32 M Sucroselösung
    0,80 M Sucroselösung Der Basalpuffer hat die folgende Zusammensetzung:
    NaCl 147 mM
    KCl 3 mM
    HEPES 10 mM
    Dextrose 10 mM
    MgCl2 1,2 mM
    EGTA-TRIS 1 mM
    pH 7,4
    Puffer mit hohem K+-Gehalt
    NaCl 95 mM
    KCl 55 mM
  • Der Rest der Komponenten in dem Puffer mit hohem K+-Gehalt ist von der gleichen Zusammensetzung wie der Basalpuffer. Zur Untersuchung der gesamten 3H-Glutamat-Freisetzung wird Ca+2 zu dem Puffer mit hohem K+-Gehalt bei 2,4 mM zugegeben.
  • Zur Untersuchung der Freisetzung von präsynaptischem 3H-Glutamat wurden Synaptosomen von jungen Ratten verwendet. Männliche CD-Ratten von 4 bis 6 Wochen (50 – 75 g) wurden zur Herstellung von Synaptosomen verwendet. Die Ratten wurden durch Enthauptung mit einer Guillotine getötet und der Schädelknochen wurde mit dem spitzigen Messer von Sezierscheren im Zentrum geöffnet. Der Knochen wird dann mit einem Knochenschneider abgeschält und das Hirn mit einem Mikrospatel herausgeholt. Das Zerebellum wird entfernt und der Rest des Gehirns wird in 35 ml 0,32 M Sucroselösung eingebracht und in einem Thomas-Glas-Teflon-Homogenisator C bei der maximalen Leistungseinstellung (etwa 450 U/min) mit 16 Schlägen homogenisiert. Der Pistill wird mit 5 ml Sucroselösung abgespült und zu dem Homogenat zugegeben. Das Homogenat wird 10 min. bei 3500 U/min. (1500 g) in einem SS-34 Rotor in Sorvall RC-5B zentrifugiert. Das sich ergebende Pellet (P1) wird verworfen und der Überstand (S1) wird nochmals 20 min. bei 8700 U/min. (8500 g) zentrifugiert. Der Überstand (S2) wird verworfen und das Pellet (P2) wird in 5 ml 0,32 M Sucrose resuspendiert und mit 4 Schlägen (Thomas C) handhomogenisiert und das Volumen wird auf 8 ml ergänzt. Dieses Homogenat wurde auf 20 ml 0,8 M Sucroselösung in zwei Zentrifugenröhrchen geschichtet und für 25 min. bei 8700 U/min. (8500 g) schnell gedreht. Am Ende dieses schnellen Drehens befindet sich das meiste Myelin an der Zwischenphase von 0,32 M und 0,8 M Sucrose und die Mitochondrien pelletisieren sich als braunes Pellet. Die Synaptosomen werden in der 0,8 M Sucrose dispergiert. Unter Verwendung einer 10ml Pipette wird die 0,8 M Sucroseschicht gesammelt (ohne Störung der oberen Myelinschicht oder des Pellets) und langsam mit dem gleichen Volumen an gekühltem Basalpuffer verdünnt, während vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette umgerührt wird. Diese verdünnte Lösung wird 10 min. bei 10.000 U/min. (12.000 g) zentrifugiert und das Pellet wird in 1,5 ml Basalpuffer resuspendiert und in einem 7 ml Wheaton-Glas-Glas-Homogenisator mit 8 Schlägen handhomogenisiert.
  • VERDÜNNUNG DER SYNAPTOSOM-ZUBEREITUNG FÜR DIE SUPERFUSION
  • Das synaptosomale Homogenat wird 1 ml zu 10 ml mit Basalpuffer verdünnt. Diese Verdünnung ergibt eine Proteinkonzentration von 500 bis 600 μg/ml. Einhundert μl dieser verdünnten Zubereitung mit 50 – 60 μg Protein werden für jeden Superfusions vorgang verwendet. Diese Menge an Protein erwies sich als optimal für ein schnelles Auswaschen von freigesetzter Markierungssubstanz bzw. Tracer. Die verdünnte synaptosomale Lösung wurde bis zum Ende des Experiments auf Eis gehalten.
  • BELADEN VON SYNAPTOSOMEN MIT 3H-GLUTAMAT
  • 3H-Glutamat (erworben von NEN) wird im Kühlschrank aufbewahrt. Pipettiere 6 μl (6 Ci; 40 bis 55 Ci/mmol) in ein Einmal-Teströhrchen. Gib 100 μl verdünnte Zubereitung hinzu und mische vorsichtig auf Vortex und inkubiere für 10 min. bei 30 °C. 3H-Glutamat wird durch den Natrium-gekoppelten Glutamattransporter aufgenommen, der in synaptosomalen Membranen vorliegt. Verdünne nach 10 min. das Inkubationsgemisch mit 690 μl Basalpuffer. Diese Lösung wird dann in einen Tygon-Schlauch übergeführt, der mit der Synaptosomen-Füllkammer verbunden ist. Unter Verwendung eines Spritzenfüllapparats mit Luft wird die Lösung durch das Millipore SC-GF/F – Millipore SC-Filter-Sandwich gezwungen. Diese Filter halten die Synaptosomen zurück und die Lösung fließt hindurch.
  • FÜLLKAMMER
  • Die Füllkammer wird aus einem „General Valve" („allgemeines Ventil")-Röhrchen-Röhrchen-Verbindungsstück zusammengebaut. Ein Ende ist mit einem Stachelfitting bzw. -verbindungsstück verbunden, das wiederum mit einem 12 g Tygon-Röhrchen verbunden ist und als Einlass in die Kammer dient. Am anderen Ende des Verbindungsstückes ist es an die Filteranordnung angebracht. Die Filteranordnung besteht aus einem Edelstahlwäscher mit einer flachen Seite, die dem Filter gegenüberliegt, einem SC-Millipore-Filter, einer GF/F Whatman-Glasfaserfilterscheibe mit einem Gitter, das in Richtung der Strömung liegt, einem weiteren SC-Filter, gefolgt von einem Edelstahlsieb und einem Edelstahlwäscher, wobei die flache Seite dem Sieb gegenüberliegt. Diese gesamte Anordnung wird mit einer Teflonmutter gesichert.
  • Nachdem die Synaptosomen beladen worden sind, kann das Filter-Sandwich durch Aufschrauben der Mutter und Auslaufenlassen auf den Arbeitstisch entfernt werden.
  • SUPERFUSION
  • Eine wichtige Komponente des Superfusionsaufbaus ist die mit Drei-Ventil-Solenoid betriebene, Maß-Edelstahl-„General Valve" („allgemeines Ventil")-Superfusionskammer mit einem Auslass für den Ausfluss. Die drei Einlässe sind mit Edelstahl-Pufferreservoirs verbunden, die (1) Waschpuffer, (2) Kontrollpuffer und (3) experimenteller Puffer enthalten, die über Teflon-Schlauchverbindungen unter 40 psi Stickstoffgas gehalten werden. Die Superfusion wird durch ein Menü-angetriebenes Programm auf einem Apple IIe-Computer gesteuert. Vergleiche Turner, J. T. et al., Anal. Biochem. 178: 8 – 16 (1989) und US-Patent Nr. 4,891,185.
  • Die Superfusionskammer hat ein Teflon-Übergangsstück und einen Edelstahlwäscher, fixiert mit der flachen Oberfläche, die den Filtern gegenüberliegt. Eine GF/B-Filterscheibe wird zuerst in der Kammer platziert, um schaltungsbezogene Artefakte auszuschließen. Das mit den Synaptosomen beladene Sandwich wird dann eingebracht, so dass es den Synaptosomen in die Strömung hinein gegenüberliegt, gefolgt von einem RA-Filter, einem Edelstahlsieb und einem Wäscher, mit der flachen Seite dem Sieb gegenüberliegend. Diese Anordnung wird mit einer Teflonmutter gesichert, die zwei Schichten Teflonschlauch enthält, im Inneren mit Epoxy fixiert ist, um das Totvolumen zu verringern und die Ausflussströmung zu verbessern.
  • Das Zeitprotokoll kann den Bedürfnissen des jeweiligen Experiments entsprechend variiert werden. Vor der Superfusion werden die Synaptosomen zwei 5 sec-Wäschen mit Basalpuffer unterworfen bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 1,2 ml/sec und der Ausfluss wird zur radioaktiven Entsorgung gesammelt. Nach dem Waschen mittet sich der Auslass auf den Fraktionssammelglasfläschchen ein. Ein typisches Protokoll (mit 16 U/min.) besteht aus einem ersten 1,08 sec-Superfusionslauf bzw. -Superfuse mit Basalpuffer und Umschalten auf einen Puffer mit hohem K+-Gehalt für 2,1 sec und einem Zurückschalten auf Basalpuffer für die verbleibende Zeit. Durch Wählen von „Do the superfusion" („Führe die Superfusion aus") aus dem Menü und Aktivieren durch Return fließt der Ausfluss in die Glasfläschchen auf einer sich drehenden Drehtischplatte.
  • SAMMELN DES AUSFLUSSES
  • Dies wird durchgeführt unter Verwendung eines Drehtisches, der sich bei 16, 33, 45 und 78 U/min. dreht, was 3,75, 1,82, 1,33 und 0,77 sec für jede Drehung ergibt. Auf dem Drehtisch befindet sich eine Platte mit 50 gleichmäßig gebohrten Löchern um einen Kreis, um die Glasfläschchen den Ausfluss sammeln zu lassen. So kann man in Abhängigkeit von den U/min. des Drehtisches eine Fraktion von bis 66 msec oder von nur 15 msec sammeln.
  • Der Superfusionsvorgang und das Sammeln der Fraktionen werden mit einem magnetischen Riet- bzw. Reet- bzw. Blattschalter synchronisiert, der durch einen permanent fixierten Magneten an dem Drehtisch aktiviert wird. Wenn die Strömungsgeschwindigkeit 1,25 ml/sec beträgt, umfasst jede Fraktion bei 33 U/min. 45 μl.
  • Zu den Fraktionen wird ein ml „Hydrofluor" (National Diagnostics, Manville, NJ) zugegeben, und die Fraktionen werden in einem Flüssig-Szintillationszähler gezählt. Nach der Superfusion werden alle Filter in der Kammer entnommen und in 1 ml Zählfluid suspendiert und gezählt, nachdem sie über Nacht auf eine Schüttelplattform platziert worden sind, und am nächsten Tag gezählt.
  • DATENANALYSE
  • Eine Lotus 123 Spreadsheet-Software wird zur Analyse der Daten verwendet. Der Flüssig-Szintillationszähler gibt direkt die gemittelten cpm an. Unter Verwendung eines Spreadsheets werden die Zähleranzeigen bzw. Zählimpulse gegen die Zeit (und Fraktionsnummer) eingegeben. In der nächsten Spalte wird der Zählhintergrund für jede Fraktion abgezogen. Alle Zähleranzeigen werden summiert, einschließlich derjenigen, die auf dem Filter zurückgehalten wurden. Dies stellt die von den Synaptosomen aufgenommene Gesamtmenge dar. Aus dieser Summe wird für jede Fraktion die Freisetzung in Prozent berechnet und gegen die Zeit aufgetragen. Dieses Diagramm würde klar das Grundlinienmuster, das Ventilöffnen und die Tracer-Freisetzung zeigen. Ein Auftragen dieser Nettoergebnisse gegen die Ventil-3-Zeit ergibt die Nettofreisetzung an radiomarkiertem Guanidin als Antwort auf den experimentellen Puffer als Funktion der Zeit.
  • 1 veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die 3H-Glutamat-Freisetzung aus Rattenhirn-Synaptosom zeigt, das für 10 min. bei 30 °C mit 3H-Glutamat beladen worden ist. Die Synaptosomen (50 μg Protein) wurden in die Superfusionskammer geladen und für 10 min. mit dem Basalpuffer gewaschen, der 145 mM NaCl und 5 mM KCl enthielt. Die Superfusion wurde dann sofort begonnen. Zur Zeit 0 wurden die Synaptosomen durch Schalten auf einen Puffer mit hohem K-Gehalt (40 mM NaCl, 110 mM KCl) depolarisiert. Die obere Kurve in 1 stellt die in Anwesenheit von 2,4 mM Ca2+ herbeigeführte Freisetzung dar. Die untere Kurve stellt die in Ca-freiem Puffer herbeigeführte Freisetzung dar. Die Daten sind in Prozent des gesamten 3H-Glutamat-Pools ausgedrückt, der in jeder gesammelten 72 msec-Fraktion freigesetzt wurde. Die Fehlerbalken stehen für Dreifachbestimmungen.
  • Beispiel 9: Assay bzw. Analyse zur Inhibierung von Glutamat-Freisetzung
  • Die experimentellen Arzneimittel werden zuerst in Methanol zur Herstellung eines Ansatzes bzw. einer Stammlösung von 20 mM gelöst. Diese Lösung wird dann in den Basalpuffer als auch den Puffer mit hohem K+-Gehalt verdünnt, um die erforderliche Konzentration an diesem Arzneimittel zu ergeben. Alle Lösungen, einschließlich der Kontrollen, werden so hergestellt, dass sie die gleiche Konzentration an Methanol haben. Die Methanolkonzentration überschritt nie 0,3 % (V/V) an Puffern. Die Synaptosomen wurden zuerst den Arzneimitteln während des Waschens vor der Superfusion und auch während des gesamten Superfusionsprotokolls ausgesetzt. Die Gesamtzeit-Synaptosomen wurden den organischen Testverbindungen ausgesetzt, bevor die Glutamat-Freisetzung <25 sec war.
  • 2 veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die Wirkung von 0 μM, 10 μM, 30 μM und 100 μM (nicht beanspruchtem) N,N'-Di-(adamantan-1-yl)guanidin auf die Freisetzung von 3H-Glutamat aus Rattenhirn-Synaptosomen zeigt. Die gleichen Konzentrationen an Guanidin wurden in allen Superfusionslösungen aufrechterhalten. Die Ergebnisse sind in Form der kumulativen Menge an Glutamat-Freisetzung in einem einzelnen K+-depolarisierenden 2,1 Sekunden-Puls in Prozent des gesamten, auf die Synaptosomen aufgegebenen radioaktiven Glutamats dargestellt. Wie aus 2 klar ist, führten steigende Konzentrationen an N,N'-Di-(adamantan-1-yl)guanidin (nicht beansprucht) zu abnehmender Freisetzung an Glutamat aus Synaptosomen.
  • Die obige Arbeitsweise befolgend wurde eine Anzahl von zusätzlichen Verbindungen auf ihre die Glutamat-Freisetzung inhibitorische Aktivität gescreent. Die relativen Werte an Glutamat-Freisetzung in Anwesenheit dieser Verbindungen erscheinen in Tabelle I.
  • TABELLE I
    Figure 00720001
    • 1 Konzentration
    • 2nd = nicht durchgeführt
  • 3 veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die Wirkung von 0 μM, 1 μM, 3 μM und 10 μM N,N'-Di-(5-acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht) auf die Ca2+-abhängige Freisetzung von [3H]Glutamat aus radiomarkierten Synaptosomen nach K+-Depolarisation (zur Zeit 0) über die Zeit zeigt. 3 zeigt an, dass diese Verbindung ein potenter Inhibitor für die Glutamat-Freisetzung aus Hirnnervenenden-Zubereitungen ist. Bei Konzentrationen von 3 – 10 μM blockiert er die persistente Komponente der Ca2+-abhängigen Glutamat-Freisetzung mehr als die anfängliche Übergangskomponente.
  • Beispiel 10: Korrelation zwischen der Inhibierung der Ca-Aufnahme mit der Inhibierung der Glutamat-Freisetzung
  • Mehrere Verbindungen wurden ebenfalls getestet, um zu bestimmen, ob die Ca2+-abhängigen und -unabhängigen Komponenten der Glutamat-Freisetzung zur Blockierung der 45Ca-Aufnahme Bezug haben. Die Calciumaufnahme ist ein Schritt in der Kaskade von Vorgängen, die beim neuronalen Zelltod von Ischämie stattfinden. Vergleiche Bassaclough und Leach, Current Patents Ltd., 2 – 27 (19_). Das Ca-Fluss-Protokoll ist wie folgt: Rattenhirn-Synaptosomen wurden hergestellt gemäß Hajos, Brain Res. 93: 485 (1975). Die Synaptosomen wurden in „LK"-Puffer mit niedrigem Kaliumgehalt (enthaltend 3 mM KCl) bei 2 mg/ml suspendiert. Die Arzneimittel in LK wurden zu den Synaptosomen zu einer Endkonzentration von 10 μM zugegeben und für 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die 45Ca-Aufnahme wurde dann gemessen durch Zugabe von Isotopen in entweder LK oder Puffer mit hohem Kaliumgehalt (150 mM KCl). Nach 5 Sekunden wurde der 45Ca-Fluss mit 0.9 ml Quench-Lösung (LK + 10 mM EGTA) gestoppt. Die Lösung wurde unter Vakuum filtriert und die Filter wurden mit 15 ml Quench-Puffer gewaschen. Die Wirkung des Arzneimittels ist ausgedrückt in Inhibierung (oder Blockierung) des Kalium-stimulierten Kontroll- 45Ca-Zustroms. Diese Methode ist eine Anpassung der Methode, die von Nachsen and Blaustein, J. Physiol. 361: 251 – 268 (1985) offenbart wurde.
  • Wie in 4 gezeigt, besteht eine fast lineare Korrelation zwischen der Inhibierung von synaptosomaler 45Ca-Aufnahme und der Inhibierung der persistenten Komponente (^) der Glutamat-Freisetzung durch N-(Adamantan-1-yl)-N'-(2-methylphenyl)guanidin (#1) (nicht beansprucht), N-(1-Naphthyl)-N'-(methylphenyl)-N'-methylguanidin (#2) (nicht beansprucht), N,N'-Di-(1-naphthyl)guanidin (#3) (nicht beansprucht), N,N'-Di-(adamantan-1-yl)guanidin (#4) (nicht beansprucht), N,N'-Di-(adamantan-2-yl)guanidin (#5) (nicht beansprucht), N,N',N'',N'''-Tetracyclohexylhydrazindicarboximidamid (#6) und N,N'-Di-(5-acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht). Im Gegensatz dazu bestand keine Korrelation zwischen der Inhibierung von synaptosomaler 45Ca-Aufnahme und der Inhibierung der phasischen Komponente
    Figure 00740001
    der Glutamat-Freisetzung (4). Eine Ausnahme ist N,N'-Di-(5-acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht), das die persistente Komponente der Glutamat-Freisetzung in einem größeren Ausmaß inhibiert, als es durch seine Fähigkeit zur Inhibierung der 45Ca-Aufnahme vorhergesagt wurde.
  • 6 veranschaulicht eine grafische Darstellung, die die Inhibierung der Kaliumstimulierten Ca-Aufnahme von Synaptosomen durch N,N'-Di-(adamantan-2-yl)guanidin (∎) (nicht beansprucht), N,N'-Di-(1-naphthyl)guanidin (♦); ∙∙∙∙∙∙∙∙ IC50 = 9,1 μM, ----- IC50 = 16 μM) (nicht beansprucht), N,N',N'',N'''-Tetracyclohexylhydrazindicarboximidamid (•; ______·__ IC50 = 3,3 μM) und N,N'-Di-(adamantan-1-yl)guanidin (Δ; IC50 = 6,6 μM) (nicht beansprucht) gegen die Prozent der Ca-Aufnahme im Vergleich zu Kontroll-Synaptosomen zeigt. Wie in 6 gezeigt, verursachten die Arzneimittel eine Inhibierung der Kalium-stimulierten Ca-Aufnahme in einer Dosis-abhängigen Weise.
  • Eine Anzahl von zusätzlichen (nicht beanspruchten) Verbindungen (bei 10 μM) wurde auf ihre Aktivität bei der Inhibierung/Potenzierung der Kalium-stimulierten Aufnahme von Calcium in Synaptosomen getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt:
  • TABELLE II
    Figure 00750001
  • Tabelle III zeigt die prozentuale Inhibierung der synaptosomalen 45Ca-Aufnahme durch bestimmte N,N'-disubstituierte Guattidine.
  • TABELLE III Inhibierung von synaptosomaler 45Ca-Aufnahme durch substituierte Guanidine und verwandte Verbindungen
    Figure 00760001
  • Tabelle IV zeigt die prozentuale Inhibierung der Glutamat-Freisetzung (persistente Komponente) durch bestimmte N,N'-disubstituierte Guanidine. TABELLE IV Inhibierung der Glutamat-Freisetzung (persistente Komponente) durch substituierte Guanidine und verwandte Verbindungen
    Figure 00770001
  • Beispiel 11 : Inhibierung der Glutamat-Freisetzung von mit Veratridin depolarisierten Synaptosomen
  • Als nächstes wurde die Wirkung unterschiedlicher Konzentrationen an N,N'-Di-(adamantan-2-yl)guanidin (nicht beansprucht) auf die Ca2+-Freisetzung von mit Veratridin depolarisierten Synaptosomen beurteilt. Wie in 5 gezeigt, verursachten steigende Konzentrationen an N,N'-Di-(adamantan-2-yl)guanidin (nicht beansprucht) eine Inhibierung der Glutamat-Freisetzung in einer dosisabhängigen Weise.
  • Beispiel 12: Die Wirkung von N,N'-Di-(5-acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht) auf Natriumströme in Neuroblastomzellen
  • Die Natriumströme von ganzen bzw. unversehrten Zellen wurden in Spannungseingeklemmten NIE-115 Neuroblastomzellen hervorgerufen unter Verwendung des oben in 7 gezeigten Stimulusprotokolls. Ein Druckauswurf von 30 μM N,N'-Di-(5-acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht) auf diese Zellen (N = 5) blockierte die Natriumströme nach innen um durchschnittlich 40 % (49 % Inhibierung in der gezeigten Zelle, die Ergebnisse davon sind in 7 veranschaulicht). Die Wirkungen dieses Arzneimittels wurden teilweise im Anschluss an das Auswaschen umgekehrt.
  • Beispiel 13: Überwachen der Abhängigkeit von der Verwendung mit dem Superfusionssystem
  • 3H-Glutamat-beladene Synaptosomen wurden für 10 sec gewaschen, um die äußere Radioaktivität auszuwaschen und die Superfusion wurde begonnen. Die Superfusion bestand aus einem 2 sec-Fluss mit Puffer mit niedrigem K+-Gehalt (3 mM), gefolgt von einem 1 sec-Fluss mit hohem K+-Gehalt (55 mM). Dies wurde drei weitere Male wiederholt, gefolgt von 2 sec mit Puffer mit niedrigem K+-Gehalt. Die Ergebnisse sind in 8 und 9 gezeigt. Die Ca-unabhängige und Ca-abhängige Glutamat-Freisetzung in den letzteren Pulsen wurde in Prozent der anfänglichen Flüsse ausgedrückt. 8 und 9 zeigen, dass die Ca-unabhängige Glutamat-Freisetzung völlig konstant ist, wohingegen die Ca-abhängige Komponente zerfällt und Zeit zur Erholung benötigt.
  • Beispiel 14: Elektrophysiologie-Untersuchungen zu den Kanälen vom N-Typ
  • Einzelne Ochsenfrosch-Dorsalwurzel-Ganglionzellen, die ω-Conotoxin-sensitive Calciumkanäle vom N-Typ ausdrücken, wurden mit 5 μM N,N'-Di-(acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht) behandelt. Die Lösung enthielt auch (in mM) 90 CsCl; 5 Creatinphosphat, 5 MgATP; 0,3 Tris-GTP; 10 EGTA; 10 HEPES; pH 7,2. Wie in 10 gezeigt, inhibierte diese Verbindung etwa 40 % des Stroms. Bei 20 μM inhibierte diese Verbindung fast den gesamten Strom (nicht gezeigt). Die meiste Inhibierung kehrte sich in etwa 6 Minuten um (nicht gezeigt). Das Herunterfahren bzw. der Rundown der Calciumkanäle während der Aufzeichnungsdauer kann für den Mangel an vollständiger Umkehrung der Inhibierung verantwortlich sein. Dies stützt weiter die Hypothese, dass bestimmte substituierte Guanidine die Neurotransmitter-Freisetzung durch Stoppen präsynaptischer Calciumkanäle inhibieren.
  • Beispiel 15: Elektrophysiologie-Untersuchungen zur exzitatorischen synaptischen Transmission
  • Transversalschnitte bzw. -Sectios von Hippokampus wurden aus 4 – 6 Wochen alten Sprague-Dawley-Ratten erhalten und unter Standardbedingungen gehalten. Wie in 11 gezeigt, wurden die synaptischen Potenziale durch Anwendung von konstanten elektrischen Strömungsstimuli hervorgerufen, die durch konzentrische bipolare Platin/Iridium-Elektroden abgegeben wurden, die in der Stratum Radiatum zur Sicherstellung einer vollen Stimulation der Schaffer-Kollateralen platziert waren. Extrazelluläre exzitatorische postsynaptische Potenziale (EPSPs) wurden durch Platzieren einer mit Kochsalzlösung gefüllten Glasmikroelektrode in entweder der Stratum Radiatum oder Stratum Lacunosum aufgezeichnet. Populationsspitzen wurden durch Platzieren einer Elektrode in der Stratum Pyramidole aufgezeichnet.
  • Wie in 12A gezeigt, eliminierte die Badanwendung von N,N'-Di-(5-acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht) vollständig Populationsspitzen. Diese Wirkung ist im Anschluss an das Auswaschen völlig reversibel. Das nach oben gehende Feld-EPSP wurde ebenfalls reversibel durch eine Badperfusion des Arzneimittels blockiert.
  • Wie in 12B gezeigt, eliminierte die Badanwendung von N,N'-Di-(5-acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht) fast vollständig die Feld-EPSP. Diese Wirkung ist im Anschluss an ein Auswaschen völlig reversibel. Kleine Populationsspitzen sind ebenfalls ersichtlich, überlagert in der späten Phase der EPSP. Die Badperfusion dieser Verbindung blockierte ebenfalls diese Populationsspitzen reversibel.
  • 12C veranschaulicht die Wirkung von 20 μM N,N'-Di-(5-acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht) auf die Amplitude der Antwort auf einen elektrischen Stimulus. Die EPSP-Amplitude wurde zwischen 80 – 90 % verringert und die Antwort wurde im Anschluss an ein Auswaschen vollständig wieder erhalten.
  • 13 veranschaulicht zwei grafische Darstellungen, die die Wirkung von 1 mM Adenosin (einem bekannten präsynaptischen Transmitter-Freisetzungsblocker) auf die EPSP-Amplitude in hippokampalen Schnitten zeigen. 13A zeigt, dass die Badanwendung von Adenosin fast vollständig die Feld-EPSPs in einer voll reversiblen Weise eliminierte. Es bestand ein bemerkenswertes Hinausschießen im Anschluss an die Wiederherstellung. Populationsspitzen, die sich während der späten Phase der EPSP ereigneten, wurden vollständig durch Adenosin blockiert, jedoch schienen sie im Anschluss an ein Auswaschen nicht zurückzukehren. Die Anwesenheit und Dauer des präsynaptischen Stroms bzw. Volleys wurde durch Adenosin nicht berührt; jedoch schien eine kleine reversible Änderung in der Amplitude zu sein. Während die Transmitter-Freisetzung blockiert werden kann, gibt es keine messbare Wirkung auf den afferenten Strom bzw. Volley. Darüber hinaus kann dieses experimentelle Paradigma bzw. Musterbeispiel nicht zwischen präsynaptisch und postsynaptisch vermittelten Reduktionen von extrazellulär gemessenen synaptischen Potenzialen unterscheiden.
  • 13B zeigt die Wirkung von 1 mM Adenosin auf eine normierte EPSP-Amplitude (gemessene EPSP-Amplitude geteilt durch die maximale EPSP- Amplitude in Millivolt) über die Zeit. Eine Badanwendung von Adenosin verursachte eine 90%-ige Verringerung bei der EPSP-Amplitude der Feld-EPSP (erste Antwort auf gepaarte Stimuli hier gezeigt). Diese Wirkung ist im Anschluss an ein Auswaschen voll reversibel mit etwas, in diesem Schnitt ersichtlichen Hinausschießen.
  • Die Ergebnisse der Aufzeichnungen der hippokampalen Schnitte führen zu den folgenden Schlussfolgerungen. Die Badanwendung von N,N'-Di-(5-acenaphthyl)guanidin (nicht beansprucht) (20 μM) verringerte wesentlich und reversibel die Amplitude von sowohl Feld-EPSPs als auch Populationsspitzen um 80 – 90 %. Die Wirkungen dieser Verbindung waren voll reversibel. Die Wirkungen dieser Verbindung ähneln qualitativ den Wirkungen von Adenosin, einem Agonisten der präsynaptischen Adenosin-Rezeptoren, von dem bekannt ist, dass er die Glutamat-Freisetzung blockiert. Dies stimmt mit der präsynaptischen Inhibierung der Neurotransmitter-Freisetzung durch die Verbindung überein.
  • Die vorangegangenen Beispiele können mit ähnlichem Erfolg wiederholt werden durch Einsetzen der generisch oder spezifisch beschriebenen Reaktanten und/oder Betriebsbedingungen dieser Erfindung an Stelle von denjenigen, die in den vorhergehenden Beispielen verwendet wurden.
  • Aus der vorangegangenen Beschreibung kann der Fachmann auf diesem Gebiet leicht die wesentlichen Eigenschaften dieser Erfindung ermitteln und ohne vom Geist und Umfang davon abzuweichen, verschiedene Änderungen und Modifizierungen der Erfindung durchführen, um sie an verschiedene Anwendungen und Zustände anzupassen.

Claims (5)

  1. Chemische Verbindungen mit der Formel
    Figure 00820001
    oder ein Tautomeres davon; wobei R und R1 gleich oder verschieden sind und eine Cycloalkyl-Gruppe mit 3 bis 12 Kohlenstoffatomen; eine carbocyclische Aryl-, Alkaryl-, Aralkyl- oder heterocyclische Gruppe sind; X3 und X4 gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, einer Hydroxy-, Acetat-, Oxo-, Amino-, C1-6-Alkyl-, C1-6-Alkylamino-Gruppe, Alkoxygruppe mit 1 – 6 Kohlenstoffatomen, Di-C2-12-alkylamino-, Nitro-, Azido-, Sulfhydryl-, Cyano-, Isocyanato-, Halogen-, Amido-, Sulfonato- oder Carbamido-Gruppe; wobei R und R1 wahlweise substituiert sind mit einer Hydroxy-, Acetat-, Oxo-, Amino-, C1-6-Alkyl-, C1-6-Alkylamino-Gruppe, Alkoxygruppe mit 1 – 6 Kohlenstoffatomen, Di-C2-12-alkylamino-, Nitro-, Azido-, Sulfhydryl-, Cyano-, Isocyanato-, Halogen-, Amido-, Sulfonato- oder Carbamido-Gruppe; x und y gleich oder verschieden sind und 0, 1, 2, 3 oder 4 sind, zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung eines Lebewesens bzw. Tieres.
  2. Chemische Verbindungen wie in Anspruch 1 definiert, wobei x und y 0 sind.
  3. Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N,N'-Di-(adamantan-1-yl)-N'',N'''-dicyclohexylhydrazindicarboximidamid, N,N',N'',N'''-Tetra-(adamantan-1-yl)hydrazindicarboximidamid, N,N',N'',N'''-Tetra-(adamantan-2-yl)-hydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(adamantan-1-yl)-N'',N'''-di(adamantan-2-yl)hydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(2-norbornyl)-N'',N'''-dicyclohexylhydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(2-isobornyl)-N'',N'''-dicyclohexylhydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(2-isobornyl)-N'',N'''-di-(adamantan-1-yl)hydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(2-isobornyl)-N'',N'''-di-(adamantan-2-yl)hydrazindicarboximidamid, N,N',N'',N'''-Tetra-(acenaphth-5-yl)hydrazindicarboximidamid, N,N',N'',N'''-Tetra-(acenaphthylen-5-yl)-hydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(acenaphth-5-yl)-N'',N'''-di-(acenaphthylen-5-yl)hydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(2-norbornyl)-N'',N'''-di-(acenaphth-5-yl)hydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(2-norbornyl)-N'',N'''-di-(acenaphthylen-5-yl)hydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(2-isobornyl)-N'',N'''-di-(acenaphth-5-yl)hydrazindicarboximidamid, N,N'-Di-(2-isobornyl)-N'',N'''-di-(acenaphthylen-5-yl)hydrazindicarboximidamid, N,N'-Dicyclohexyl-N'',N'''-di-(acenaphth-5-yl)hydrazindicarboximidamid, N,N'-dicyclohexyl-N'',N'''-di-(acenaphthylen-5-yl)hydrazindicarboximidamid, N,N',N'',N'''-Tetraphenylhydrazindicarboximidamid und N,N',N'',N'''-Tetracyclohexylhydrazin-di-carboximidamid; oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
  4. Chemische Verbindungen wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, wobei die therapeutische Behandlung ausgewählt ist aus einem Modulieren oder Inhibieren der Freisetzung von endogenem Neurotransmitter, einer Behandlung oder Verhinderung einer Erkrankung des Nervensystems, bei dem die Pathophysiologie der Erkrankung eine exzessive Freisetzung eines Neurotransmitters aus neuronalen Zellen umfasst, und einem Blockieren spannungsempfindlicher Natrium- oder Kalziumkanäle von neuronalen Zellen von Säugern, insbesondere wobei die Erkrankung ausgewählt ist aus neurodegenerativen Erkrankungen einschließlich Huntington-Krankheit, Amyotrophischer Lateralsklerose, Alzheimer-Krankheit, Down-Syndrom, Korsakow-Krankheit, olivopontozerebellarer Atrophie, HIV-induzierte Demenz, HIV-induzierte Blindheit und Multünfarktdemenz, Nausea bzw. Übelkeit, die resultieren kann aus Chemotherapie, Epilepsie, Krämpfen (Konvulsion), Kohlenmonoxid-Vergiftung, Cyanid-Vergiftung, toxischer Gehirnschädigung, verursacht durch Tetrodotoxin oder Schalenfischtoxine, Amnesie, Migräne oder Fluss-Blindheit (bzw. river blindness), Resultate aus Nervenzelltod, der aus Hypoxie, Hypoglykämie, Gehirn- oder Rückenmarkischämie, Gehirn- oder Rückenmarktrauma, Schlaganfall, Herzanfall oder Ertrinken resultiert.
  5. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert und einen pharmazeutisch verträglichen Träger; insbesondere wobei die Verbindung in radiomarkierter Form vorliegt; insbesondere wobei die Radiomarkierung aus 3H, 11C, 14C, 18F, 125I, 131I, 15N, 35S und 32P ausgewählt ist.
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