JP2003528148A

JP2003528148A - 損傷に際して神経細胞中に形成される新規カルシウム損傷電流の阻害は神経細胞死を抑制する

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Publication number: JP2003528148A
Application number: JP2001570272A
Authority: JP
Inventors: デロレンゾ、ロバート・ジェイ
Original assignee: デロレンゾ、ロバート・ジェイ
Priority date: 2000-03-28
Filing date: 2001-03-27
Publication date: 2003-09-24
Also published as: CA2404157A1; WO2001072311A1; US20050153930A1; EP1267896A1; AU2001247762A1

Abstract

(57)【要約】損傷に応答して神経細胞の膜に形成されるカルシウムチャンネルを開示する。この損傷誘導性カルシウムチャンネルをシャン遮断し、神経細胞への更なる損傷、及び／又は神経細胞死を防ぐための方法及び組成物が開示されている。開示されている該方法及び組成物は、神経細胞への急性又は慢性損傷を緩和するために使用し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明は、神経組織への急性及び慢性損傷に起因する神経細胞死を抑え又は軽
減するために、細胞の損傷又は疾病によって誘発されたカルシウムの流入に対し
て神経細胞の治療的処置を行うための組成物及び方法に関する。

【０００２】

【発明の背景】

外傷及び脳血管の損傷（卒中）から生じる脳又は神経組織の損傷は、米国及び
世界における主要な死因及び罹病原因となっている。脳及び神経系は、身体の中
で最も急性損傷の影響を受けやすい臓器であり、とりわけ血液又は酸素供給の減
少の影響を受けやすい。加えて、神経系は、慢性損傷及び老化による影響も非常
に受けやすい。損傷の後に、又は酸素若しくは血液供給が欠乏した後に脳及び神
経系を保護することは重要なので、脳及び神経系の他の成分を保護するための治
療術を開発することを目的として数多くの研究が行われてきた。この研究によっ
て、神経組織への急性、興奮毒性、加齢性、及び慢性損傷後の神経細胞内カルシ
ウムの上昇が、不可逆的な神経細胞死の主原因であることが確定されている。

【０００３】生体膜を介したカルシウムの輸送を可能とするカルシウムチャンネルが数多く
知られている。増加したカルシウムから神経細胞を保護するための戦略では、公
知のカルシウムチャンネルを通じたカルシウムの流入を遮断することに焦点が当
てられてきた。しかしながら、従来のカルシウムチャンネル遮断薬は、損傷初期
より以前に、又は損傷初期の最中に投与しなければ有効でないことが示されてい
る。研究によれば、効果を示すためには、損傷初期の５〜１０分以内に処置を施
さなければならないことが示されている（Ａｒａｋｉ，Ｔ．，Ｈ．Ｋａｔ
ｏａｎｄＫ．Ｋｏｇｕｒｅ，ＡｃｔａＮｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ
８０：５４８−３１９８９；Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ３６１：３１５−３２５，１９９３；Ｋｏｇｕｒｅ，Ｋ．ａｎｄ
Ｈ．Ｋａｔｏ，Ｉｎ：Ｓｔｒｏｋｅ：Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ
，ＤｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄＭａｎａｇｅｍｅｎｔ，ＮｅｗＹｏｒｋ
：ＣｈｕｒｃｈｉｌｌＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，１９９２，ｐ．６９−１０
１）。さらに、動物実験では、多くの成功結果が報告されているが、頭部外傷及
び卒中を有するヒトでは、これらの多数のカルシウムチャンネル遮断薬の使用は
有効でないようである。これらの公知のカルシウムチャンネル阻害剤は、神経系
への損傷の治療には有効ではなかった。

【０００４】現在利用されている薬剤は、受傷から１５分後に生じる細胞内カルシウムレベ
ルを低下させる上で有効でない。最近の研究によって、脳損傷後の長期のカルシ
ウム増加が神経細胞死の原因として役割を果たしていることが実証された（Ｃｈ
ｏｉ，Ｄ．Ｗ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ７：３６９−３７９，１９８７；
Ｃｈｏｉ，Ｄ．Ｗ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２３：１２６１−１２
７６，１９９２；Ｅｉｍｅｒｌ，Ｓ．ａｎｄＭ．Ｓｃｈｒａｍｍ，
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６２：１２２３−１２２６，１９９４；Ｈ
ｙｒｅ，Ｋ．，Ｓ．Ｄ．Ｈａｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｍ．Ｒｏｔｈｍａｎ，
ａｎｄＭ．Ｐ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．Ｓｃｉ１７
：６６６９−６６７７，１９９７）。興奮毒性を有する脳損傷の１０分後には
、海馬及び皮質の神経細胞はカルシウムを排泄する能力を喪失し、長期にわたっ
て高いカルシウムレベルが持続する（ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ
Ｄ．Ｄ．Ｊ．Ｌｉｍｂｒｉｃｋ，Ａｄｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．７１：３７
−４６，１９９６；Ｌｉｍｂｒｉｃｋ，Ｄ．Ｄ．Ｊ．，Ｓ．Ｂ．Ｃｈ
ｕｒｎ，Ｓ．Ｓｏｍｂａｔｉ，ａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ，
ＢｒａｉｎＲｅｓ．６９０：１４５−１５６，１９９５）。この長期に
わたるカルシウムの上昇は、終局的に神経細胞死をもたらす分子的現象のカスケ
ードを作動せしめる（ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄＤ．Ｄ．Ｊ．
Ｌｉｍｂｒｉｃｋ，Ａｄｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．７１：３７−４６，１９
９６；Ｌｉｍｂｒｉｃｋ，Ｄ．Ｄ．Ｊ．，Ｓ．Ｂ．Ｃｈｕｒｎ，Ｓ．
Ｓｏｍｂａｔｉ，ａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ，Ｂｒａｉｎ
Ｒｅｓ．６９０：１４５−１５６，１９９５；Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｄ．Ａ
．，Ｓ．ＳｏｍｂａｔｉａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ，Ｊ．
Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．６８：３６２−３７３，１９９２；Ｄｕｂ
ｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：６２３−６３１
，１９９３）。神経細胞死をもたらすカルシウムによって引き起こされた不可
逆的なカスケードと相俟って、細胞では長期神経細胞脱分極（ＥＮＤ、ｅｘｔｅ
ｎｄｅｄｎｅｕｒｏｎａｌｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）が持続し、同じ
く、細胞内カルシウムの慢性的な上昇に寄与することが示されている（Ｃｏｕｌ
ｔｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｓ．Ｓｏｍｂａｔｉ，ａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏ
ｒｅｎｚｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．６８：３６２−３７３，
１９９２；Ｓｏｍｂａｔｉ，Ｓ．，Ｄ．Ａ．Ｃｏｕｌｔｅｒ，ａｎｄ
Ｒ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ，ＢｒａｉｎＲｅｓ．５６６：３１６−
３１９，１９９１）。細胞内カルシウムの上昇と長期神経細胞脱分極は、何れ
も、興奮毒性及び無酸素性脳損傷に引き続いて起こり、これらのプロセスは、公
知のカルシウムチャンネル阻害剤又は他の有効な処置によっては阻害されない。

【０００５】このため、急性脳卒中、血管障害、外傷、心停止、代謝性昏睡、老化、慢性神
経損傷、又は神経組織に対するその他の種類の損傷の後に、神経細胞内へのカル
シウムの流入を制限するための治療的処置が必要とされている。さらに、損傷か
ら生じる神経細胞死を防ぎ、又は軽減するのに有効な処置であって、急性損傷か
ら最大数時間にわたって効果的に付与し得る処置、又はこれらの損傷後、患者が
日々の医療及び治療を受けている時期に慢性的に付与し得る処置も必要とされて
いる。

【０００６】

【発明の概要】

本発明は、脳及び神経組織の損傷後に脳を保護するための新規治療的アプロー
チを提供する。より具体的には、本発明は、大脳の損傷、無酸素症、血管障害等
の原因から生じる、又は変性疾患、老化、又は亜急性症状に起因する慢性損傷の
結果として生じる神経細胞組織への急性及び慢性損傷後のカルシウム流入を抑え
るための神経細胞に対する治療的処置に関する。

【０００７】本発明は、本発明者によって為された、急性及び慢性損傷の両者に応じて神経
細胞膜中に産生される新規カルシウムチャンネルの発見に基づいている。本新規
カルシウムチャンネルは、損傷誘導性カルシウムチャンネル（ＩＩＣＣ、ｉｎｊ
ｕｒｙｉｎｄｕｃｅｄｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌ）として同定された
。この新規損傷誘導性カルシウムチャンネルは、損傷後に開口して、開口状態を
保ち、細胞中のカルシウムを急増させる。

【０００８】本発明には、被損傷神経細胞中へのカルシウムの流入を制限する方法が含まれ
る。該方法は、被損傷神経細胞を有する患者に、損傷誘導性カルシウムチャンネ
ルを遮断又は阻害するのに有効である組成物を含む有効量の遮断薬を投与するこ
とを備える。

【０００９】本発明には、カルシウムの流入から神経細胞を保護する方法が含まれる。該方
法は、損傷誘導性カルシウムチャンネルを遮断するのに有効な組成物を含む有効
量の遮断薬を患者に投与することを備える。

【００１０】本発明には、急性又は慢性的に損傷を受けた神経細胞中へのカルシウムの流入
を制限するための組成物が含まれ、該組成物は、損傷誘導性カルシウムチャンネ
ルを遮断するのに有効な一定量のガドリニウム化合物と抗酸化剤とを含む。

【００１１】本発明には、急性又は慢性的に損傷を受けた神経細胞中へのカルシウムの流入
を制限するための組成物が含まれ、該組成物は、損傷誘導性カルシウムチャンネ
ルを遮断するのに有効な一定量のガドリニウム化合物と抗凝固剤とを含む。

【００１２】さらに、本発明には、急性又は慢性的に損傷を受けた神経細胞中へのカルシウ
ムの流入を制限するための組成物が含まれ、該組成物は、損傷誘導性カルシウム
チャンネルを遮断するのに有効な一定量のガドリニウム化合物と、抗酸化剤及び
抗凝固剤の両者とを含む。

【００１３】

【発明の詳細な記述】

本発明は、急性及び慢性の脳損傷、加齢性損傷（ａｇｉｎｇｉｎｊｕｒｙ）
、及び神経組織への損傷の初期段階の間に生じる新規カルシウム損傷電流の発見
、性質決定、及び阻害を含む。本明細書の以降において、損傷（ｉｎｊｕｒｙ）
という用語は、急性及び慢性の脳損傷、加齢性損傷、及び神経組織への損傷のう
ち何れか１つ、又はこれらの損傷の任意の組み合わせを意味するものとする。前
記カルシウム損傷電流は、急性及び慢性の細胞損傷後に神経細胞中に形成される
これまで知られていなかった損傷誘導性カルシウムチャンネル（ＩＩＣＣ）が関
連している。ＩＩＣＣは、分類が為されている既知のカルシウムチャンネルとは
異なり、カルシウムイオンに選択的であるというユニークな特性を有している。
これらのＩＩＣＣによって、神経損傷後の長期神経細胞脱分極中に起こる大部分
の陽イオンの移動が説明される。いったんＩＩＣＣが開口すると、細胞中へカル
シウムが流入して、通常のカルシウム恒常機構によっては基底状態のカルシウム
レベルを回復することが不可能となり、著しいカルシウムの流入によって神経細
胞が脱分極を続ける。ＩＩＣＣチャンネルの開口と該チャンネルを通じたこれに
よる絶え間のないカルシウムの流入とは、神経細胞死を引き起こす上で主要な役
割を果たしている。ＩＩＣＣが発見されるまでは、長期神経細胞脱分極中に起こ
る細胞内カルシウムの長期的な上昇に対する説明が得られておらず、この症状の
治療に対して何らかの効果を示す公知のカルシウムチャンネル遮断薬は存在しな
かった。

【００１４】本発明は、ＩＩＣＣを通じたカルシウム輸送を遮断する方法及び組成物を提供
する。損傷後最初の２〜３時間にＩＩＣＣを遮断又は阻害すると、終局的にアポ
トーシス又は壊死に至る神経細胞死をもたらす細胞内カルシウムの過剰が抑えら
れる。典型的には、これらの治療を与える機会がより長くなるように、これらの
組成物及び方法による治療の時間枠は２時間以上である。ＩＩＣＣ特異的な遮断
化合物はカルシウムの流入を防ぎ、細胞が静止状態のカルシウムレベルを回復す
ることによって神経の死を限定させ、急性及び慢性の脳及び神経組織の損傷を抑
える。

【００１５】ＩＩＣＣは、神経細胞に対する急性、加齢性、及び慢性の損傷中に発生する。

【００１６】公知のチャンネルを通じたカルシウム流を阻害する薬剤が損傷誘導性カルシウム
チャンネルに対しては何らの効果も示さないということを実証することによって
、ＩＩＣＣは、これまでに性質決定された他のカルシウムチャンネルと区別され
る。調べた公知のチャンネルには、電位作動型カルシウムチャンネルＬ、Ｔ、Ｎ
、及びＰが含まれる。電位作動型カルシウムチャンネルＬ、Ｔ、Ｎ、及びＰに対
する公知の阻害剤はＩＩＣＣに対して効果がなかった。さらに、ＮＭＤＡ、カイ
ニン酸、及びＡＭＰＡによって媒介されるグルタミン酸活性化チャンネルを通じ
たカルシウムの流入を阻害しても、損傷誘導性カルシウムチャンネルを通じたカ
ルシウムの輸送を減少させる効果はない。同じく、リアノジン及びＩＰ３を介し
た小胞体からのカルシウム放出を遮断しても、損傷誘導性カルシウムチャンネル
を通じた神経細胞内へのカルシウムの蓄積は遮断されなかった。さらに、カルシ
ウム漏出と伸張電流（ｓｔｒｅｔｃｈｃｕｒｒｅｎｔ）の阻害によって、及び
小胞体内へのカルシウムの取り込みの調節によって、ＩＩＣＣを介したカルシウ
ムの流入は遮断されなかった。本明細書に論述されている損傷誘導性カルシウム
チャンネルのこれら及びその他の特性によって、ＩＩＣＣは、これまでに知られ
ていたカルシウムチャンネル並びにカルシウムの取り込み及び隔絶（ｓｅｑｕｅ
ｓｔｒａｔｉｏｎ）系とさらに識別される。

【００１７】ＩＩＣＣがこれまでに記述されている他の全てのカルシウムチャンネルとは異
なり、他のチャンネルを遮断する薬剤によっては阻害されないという事実によっ
て、公知のカルシウムチャンネルの阻害が脳損傷の治療に有効でない理由が説明
される。公知の薬剤は正常な神経細胞中で機能する生理的なカルシウムチャンネ
ル及び系に対して有効であるのに対して、ＩＩＣＣは損傷を受けた神経細胞に随
伴する。損傷によって、これらの新しい損傷誘導性カルシウムチャンネルがいっ
たん生じると、これまでに特定されたカルシウム遮断薬は何れもＩＩＣＣを遮断
することができず、損傷後に、カルシウムが細胞中に流入するのを抑えることが
できない。

【００１８】本発明は、損傷中に生じるＩＩＣＣを阻害することによって、急性又は慢性型
の脳、脊髄、又は神経損傷及び神経細胞の損傷を調節又は制御する方法及び組成
物を提供する。これらのＩＩＣＣは、細胞内カルシウムの異常な蓄積をもたらす
。これらのチャンネルによるカルシウム輸送は、従来のカルシウムチャンネル阻
害剤の使用によって抑えることができない。神経系に対する急性及び慢性型の損
傷は、何れも、最終的には、グルタミン酸の放出の増加と細胞内カルシウムの異
常な蓄積を引き起こすことが示されている。このグルタミン酸の異常な蓄積は、
神経系に対する急性損傷と慢性損傷の両者にとって共通な引き金であり、グルタ
ミン酸は、本研究において発見されたＩＩＣＣの産生を引き起こす主要な興奮性
神経伝達物質である。このように、ＩＩＣＣの形成は、それらの原因が何であれ
、多くの慢性及び急性損傷に応じて起こる。ＩＩＣＣの発生は、神経組織に特有
の性質の１つであって、このために神経組織は損傷に対して極めて弱くなってい
る。本発明は、複数の原因によって生じた急性及び慢性脳損傷の両者において、
ＩＩＣＣを通じたカルシウムの流入を阻害するための方法及び組成物を提供し、
損傷過程に際しての神経細胞内へのカルシウムの流入に起因する損傷を抑えるユ
ニークな能力を供与する。

【００１９】急性の中枢及び末梢神経系の損傷は、極めて早い時間枠の中で細胞死をもたら
すことができる、神経細胞への直接的損傷を与える破壊的現象によって引き起こ
される。本発明は、これらの形態の急性脳損傷に対して適時に応答する方法及び
組成物を提供する。組成物を適時に投与することによって、急性損傷の過程中に
及び過程後に、ＩＩＣＣを通じたカルシウムの流入が抑えられるであろう。以下
に記載されている結果は、急性損傷から最長２時間を経た場合でさえ、ＩＩＣＣ
を阻害しなければ当該損傷によって死滅していたはずの神経細胞を、ＩＩＣＣを
阻害することによって救済できることを実証している。従来のカルシウムチャン
ネル遮断薬はＩＩＣＣ（本明細書に記載されているカルシウムチャンネル）を通
じたカルシウムの流入を阻害しないので、従来のカルシウムチャンネル遮断薬を
使用してもこれらの条件下では神経保護的な効果を与えない。

【００２０】慢性型の脳損傷、加齢性損傷、及び神経組織に対する損傷は、長期にわたって
起こる。損傷の原因は徐々に細胞死を引き起こすので、ＩＩＣＣの形成は時間を
かけて起こり、最終的には、神経細胞内へのカルシウムの蓄積がベースラインカ
ルシウムレベルを復活させる細胞の能力を超え、神経細胞死が起こる程度まで大
量に増加する。本発明の方法及び組成物は、慢性損傷によってＩＩＣＣが発生す
るにつれて、ＩＩＣＣを長期間阻害することによって神経細胞を保護することが
できるように、長期にわたり定期的に投与してもよい。

【００２１】ＩＩＣＣを急性又は慢性的に阻害することによって、本発明は、極めて様々な
急性及び慢性型の神経系損傷及び神経細胞損傷を抑え、治療するための新規方法
を提供する。

【００２２】Ａ．ＩＩＣＣの形成に寄与する医学的条件脳、脊髄、又は神経の急性損傷の最も一般的な原因は、卒中である。脳および
神経系領域への血液供給が、虚血、血栓、又は出血による卒中またはくも膜下出
血等のいくつかの原因によって遮断されたときに卒中が生じる。血液供給の欠如
によって生じる神経細胞への最終的な損傷は、ＩＩＣＣの産生および神経細胞死
の発生である。ＩＩＣＣによるカルシウム流入を阻害することによって、卒中（
ｓｔｒｏｋｅ）の予後を改善し、卒中後に脳を全体的に保護することも可能とな
る。

【００２３】脳、脊髄、または神経の急性損傷および神経細胞死の他の形態は、脳への血液
供給の急停止の原因となる心停止によって引き起こされる。心停止は、心臓疾患
、心筋梗塞、電気ショック、不整脈、または心停止の原因となる数多くのその他
の心臓疾患若しくは医学的異常によって引き起こされ得る。心停止による血液供
給の欠如によって引き起こされる主な損傷は、神経細胞におけるＩＩＣＣの産生
および神経細胞死の発生である。心停止後のＩＩＣＣによるカルシウム流入を阻
害することによって、心停止によって生じる神経系への損害を緩和することが可
能である。

【００２４】脳、脊髄または神経の急性損傷および神経細胞死の他の形態は、頭部、脊髄ま
たは身体の外傷によって引き起こされる。神経細胞の損傷は、脳への血液供給の
急停止、血液による酸素供給（ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ）の減少、または脳若し
くは神経組織に対する、または中枢神経系に対する直接的損傷によって生じる。
神経系への外傷的損傷は、銃創、あらゆる原因による頭部または身体の外傷、自
動車事故、貫通性損傷（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇｉｎｊｕｒｉｅｓ）、腫瘍に
よる損傷、中枢神経系疾患の感染および神経系への直接的外傷または損傷を引き
起こすその他の任意の原因を含む多くの内的および外的原因によって生じ得る。
外傷によって生じた損傷の多くは、ＩＩＣＣ産生を開始させる。したがって、外
傷後にＩＩＣＣを阻害することによって、外傷による予後を改善し、神経系を保
護することが可能となろう。

【００２５】脳及び神経系の急性損傷および神経細胞死の他の形態は、低酸素症および／ま
たは無酸素症を引き起こし、中枢神経から酸素を失わせる血液の酸素供給の欠乏
によって引き起こされる。低酸素症または無酸素症を生じる症状は多い。このよ
うな症状の中には、肺が血液に酸素を供給できなくする任意の症状、たとえば肺
停止、薬物の過剰投与、気道閉塞、血液を酸素化する身体の能力を阻害する化学
薬品中毒、溺水、火煙（ｓｍｏｋｅｆｉｒｅ）、熱傷、肺感染、肺の腫瘍、急
性アレルギー反応、呼吸不全の原因となる急性および慢性肺疾患、麻酔または外
科的治療、銃創、様々な原因（ナイフ、器具、榴散弾、種々の武器）に起因する
傷によって生じた複数の原因による酸素化の欠如または損傷、化学兵器の薬剤、
神経ガスへの曝露、殺虫剤、薬物治療または毒物、ヘビ咬傷による酸素供給の妨
害、肺機能を妨害する数多くの医学的症状、および呼吸不全の原因となり、血液
の酸素供給を妨害するその他の状態が含まれる。血液への酸素供給の不能又は神
経組織の損傷を引き起こし得るこれら全ての症状によって生じる主な結果は、Ｉ
ＩＣＣの産生をもたらす現象の開始と神経細胞死の発生である。無酸素および／
または低酸素後にＩＩＣＣを阻害することによって、脳および中枢神経系を保護
することが可能である。

【００２６】脳、脊髄または神経の急性損傷および神経細胞死の他の形態は、神経系への急
性損傷の原因となり得る医学的疾患および神経疾患によって引き起こされる損傷
である。一般に神経系損傷を引き起こす医学的疾患および神経疾患には、低血糖
症、肝不全、腎不全、昏睡、反復性発作およびてんかん重積持続状態が含まれる
。中枢神経系への急性損傷の原因となり得る医学的疾患によって引き起こされる
主な損傷は、ＩＩＣＣの産生および神経細胞死の発生である。急性医学的疾患お
よび神経疾患の最中および疾患後にＩＩＣＣを阻害することによって、神経系を
保護することが可能である。

【００２７】脳、脊髄または神経の急性損傷および神経細胞死の他の形態は、麻酔および手
術などの医療処置の最中に発生し得る症状によって引き起こされる損傷である。
例えば、心臓、腹部、脳およびその他の組織に対する長時間または複雑な手術処
置は、手術及び麻酔が明らかな合併症を伴わずに進められたと思われるときであ
っても神経系に損傷を引き起こし得ることが明確に証明されている。血液の酸素
供給を損ない、神経系の潅流を低下させ、あるいは異常代謝または毒性効果の原
因となる手術および麻酔の最中には、神経系に多くの損傷が生じ得る。麻酔およ
び手術の最中に生じた損傷は、神経系への急性損傷の原因となる可能性があり、
グルタミン酸産生の増加およびＩＩＣＣの産生を引き起こし、神経細胞死を発生
させる。神経系への損傷の原因となる麻酔および手術の前後、および最中にＩＩ
ＣＣを阻害することによって、麻酔および手術中に神経系を保護することが可能
となろう。

【００２８】神経系の慢性損傷も、主要な罹患原因および死因である。中枢および末梢神経
系の慢性損傷も、重度の急性および慢性の痛み、身体障害の原因となる可能性が
あり、これらの状態はその性格上長期にわたるため社会的経済活動を壊滅させる
。慢性神経疾患の主な特徴は、神経細胞内の細胞内カルシウム濃度を徐々に変化
させ、最終的に細胞死を引き起こし得ることである。神経細胞の慢性的な損傷は
、神経細胞膜に長時間にわたった大量に蓄積するＩＩＣＣの産生によって生じ得
る。このため、急性損傷後に急速且つ爆発的にＩＩＣＣが発生する場合とは異な
り、慢性的な神経系の症状では、これらの損傷誘導性カルシウムチャンネルが徐
々に蓄積し、最終的には細胞がもはや細胞内カルシウムレベルを基底状態に回復
することができない不可逆的な状態となる臨界状態に到達し得る。このようにＩ
ＩＣＣが神経細胞膜中に臨界状態まで多量に存在するに至ると、神経細胞は死滅
してしまう。本発明は、神経細胞膜におけるＩＩＣＣの産生または形成を調節ま
たは制御し、最終的にこれらの慢性症状による神経細胞死の発生を遅らせるか、
または抑える方法または組成物を提供する。

【００２９】慢性的脳損傷および神経細胞死の主な原因は、ハンチントン舞踏病、アルツハ
イマー病、又はピック病、老年痴呆症、および多重梗塞性痴呆症等の任意の変性
性痴呆症、パーキンソン病、又は進行性核上性麻痺、変性性小脳疾患および変性
性脳幹疾患並びにシャイ−ドレーガー病等のパーキンソンの概念（Ｐａｒｋｉｎ
ｓｏｎ’ｓｉｄｅａ）を伴った任意の複合系統変性性疾患によって生じる損傷
である。これらの神経変性性痴呆症状および不能症状は、最終的にＩＩＣＣ産生
の漸増および神経細胞死の発生をもたらす。慢性的にＩＩＣＣを阻害することに
よって、これらの症状によって生じた神経系の慢性損傷およびその他多くの神経
変性性神経疾患を緩和することが可能である。

【００３０】慢性的脳損傷および神経細胞死の他の原因は、脊髄小脳変性性疾患、脊髄また
は神経系のその他の部分の変性性疾患、たとえばフリードライヒ失調症、神経障
害、多発神経障害、および小脳変性によって生じた損傷である。ＩＩＣＣを慢性
的に阻害することによって、これらの疾患並びに脳幹、脊髄および末梢神経組織
の変性状態を伴う他の多くの神経変性性神経疾患によって生じる神経系に対する
慢性損傷の予後を改善することが可能である。

【００３１】慢性的脳損傷および神経細胞死の他の原因は、筋萎縮性側索硬化、パーキンソ
ン症候群の痴呆症、オリーブ橋小脳萎縮症、神経変性性疾患のその他多くの希な
形態、てんかんを伴う反復性急発作、およびてんかん重積持続状態の長時間発作
によって生じる損傷を含むグルタミン酸の神経毒性によるものと考えられる神経
系への慢性損傷を引き起こすいくつかの状態によって生じた損傷である。これら
の症状は、最終的にＩＩＣＣ産生の漸増および神経細胞死の発生をもたらす。慢
性的にＩＩＣＣを阻害することによって、神経系および神経細胞への損傷を緩和
することが可能である。

【００３２】慢性的脳損傷および神経細胞死の他の原因は、老化プロセスによって生じる損
傷である。老化プロセスによって、カルシウムを漏出し、細胞内カルシウムの利
用が困難な神経細胞および細胞が生じるという証拠が増えつつある。したがって
、老化プロセスは神経細胞膜におけるＩＩＣＣの慢性的な蓄積に関与しており、
結果的に正常な機能が変化し、最終的に細胞死がもたらされる。最終的にＩＩＣ
Ｃ産生の漸増および神経細胞死の発生を引き起こす老化プロセスは、ＩＩＣＣを
阻害することによって慢性的に調節することが可能である。

【００３３】Ｂ．実験結果本発明には、これまで知られていなかったカルシウムチャンネルの同定および
該チャンネルによるカルシウム流を遮断する方法および組成物の同定が含まれる
。本発明の基礎となる実験操作は、主たる３つの構成要素を有する。これらには
、（ｉ）急性的および慢性的に損傷を受けた神経細胞を実験的に作製し、カルシ
ウムの挙動および長期神経細胞脱分極（ＥＮＤ）を特徴付けるための方法を確立
することと、（ｉｉ）新規のカルシウムチャンネルの性質を決定することと、（
ｉｉｉ）該新規カルシウムチャンネルによるカルシウム輸送を遮断し、急性、老
化および慢性神経細胞死を妨害し得る組成物を同定することが含まれる。

【００３４】（ｉ）被損傷神経細胞の作製及び性質決定海馬神経細胞における興奮毒性グルタミン酸曝露。海馬神経細胞を興奮毒性グ
ルタミン酸に曝露すると、細胞内カルシウムの実質的な上昇がもたらされる。急
性および慢性（少量グルタミン酸の反復曝露）損傷は、何れもこれらの損傷モデ
ルを有する若い神経細胞集団および老化した神経細胞集団において起こり得る。
さらに、非常に老化した神経細胞は死滅してしまうので、崩壊時に評価して、こ
のプロセスにおけるＩＩＣＣでのカルシウムの役割を測定することができる。こ
れらの神経細胞系は、急性、加齢性、または慢性神経損傷において損傷を受けた
神経細胞の細胞内カルシウムを持続的に上昇させるきっかけとなるグルタミン酸
の生理学的な増加のモデルとなる。標準化したレシオ測定用カルシウム指示薬Ｉ
ｎｄｏ１およびＡＣＡＳＵｌｔｉｍａ共焦点レーザー走査サイトメーターを
使用して、海馬神経細胞における細胞内カルシウムを測定した。さらに、若い神
経細胞および老化した神経細胞の両者を使用して、本明細書において老化プロセ
スに対して発見された処置および組成物の役割を評価した。本明細書で説明した
慢性状態の多くに見られるように、少量のグルタミン酸に反復的に慢性曝露した
神経細胞を長期に渡る慢性損傷のモデルとして使用した。この慢性モデルを使用
して、本明細書で説明した慢性グルタミン酸損傷に対する処置および組成物の影
響を評価した。培養した海馬神経細胞の静止細胞内カルシウム濃度は、７５〜１
７５ｎＭの範囲であった。図１Ａに示したように、神経細胞を１００μＭのグル
タミン酸および１０μＭのグリシンに１分間曝露した。この曝露によって、細胞
内カルシウムが約２．４μＭまで増加した。１分間グルタミン酸に曝露すると、
短時間のグルタミン酸曝露が終了した後も、細胞内カルシウムは上昇を続け、そ
の後カルシウム濃度は２０分以内に基底状態に戻った。

【００３５】１分間の曝露とは対照的に、１０分間のグルタミン酸処理に曝露した神経細胞
では、細胞内カルシウムのピークが約２．４μＭのカルシウムに達したが、図１
Ｂで示したように、このカルシウムレベルは基底レベルに戻ることはなく、細胞
は高い細胞内カルシウムレベルを維持した。最初にグルタミン酸処理してから２
時間経っても、カルシウムは１μＭを上回ったままであった。グルタミン酸に１
５分間、２０分間、および３０分間曝露すると同様の結果が得られ、上昇したカ
ルシウムレベルのピークは約２〜３μＭに達した。Ｉｎｄｏ−１は親和性の高い
カルシウム指示薬であり、２μＭの濃度で飽和する。実際のカルシウム濃度をよ
り正確に評価するために、カルシウムに対する親和性は低いが、カルシウムレベ
ルが３μＭを上回って上昇する場合Ｉｎｄｏ−１よりも有用なカルシウム指示薬
であるＦｕｒａ−ＦＦを使用した。Ｆｕｒａ−ＦＦ指示薬を使用すると、損傷中
に産生されたカルシウムの絶対濃度は２０〜４０μＭであった。興奮毒性グルタ
ミン酸に曝露した後、両指示薬で４時間後までモニターしたところ、細胞内カル
シウムレベルは実質的に無期限に上昇した状態を保った。このような細胞内カル
シウムの長期上昇は、最終的に神経細胞を死に至らしめる分子現象カスケードの
引き金を引くことに関与していることが示された。ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ、Ｒ．Ｊ
．ａｎｄＤ．Ｄ．Ｊ．Ｌｉｍｂｒｉｃｋ、Ａｄｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．７１：３７
〜４６、１９９６、Ｌｉｍｂｒｉｃｋ、Ｄ．Ｄ．Ｊ．、Ｓ．Ｂ．Ｃｈｕｒｎ、Ｓ
．Ｓｏｍｂａｔｉ、ａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ、ＢｒａｉｎＲｅｓ
．６９０：１４５〜１５６、１９９５。

【００３６】これまでの研究によって、グルタミン酸曝露後に静止カルシウムレベルを基底
レベルまで回復することができない神経細胞は遅延型神経細胞死を発生させるこ
とが示されている。ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ、Ｒ．Ｊ．ａｎｄＤ．Ｄ．Ｊ．Ｌｉｍ
ｂｒｉｃｋ、Ａｄｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．７１：３７〜４６、１９９６、Ｌｉｍｂｒ
ｉｃｋ、Ｄ．Ｄ．Ｊ．、Ｓ．Ｂ．Ｃｈｕｒｎ、Ｓ．Ｓｏｍｂａｔｉ、ａｎｄＲ
．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ、ＢｒａｉｎＲｅｓ．６９０．１４５〜１５６、１
９９５。したがって、細胞内カルシウム濃度が基底レベルまで回復できないこと
は、死滅すべき神経細胞のマーカーとなる。最大約８分までグルタミン酸に曝露
した神経細胞は、まだカルシウムを基底状態まで回復させることができた。Ｄｅ
Ｌｏｒｅｎｚｏ、Ｒ．Ｊ．ａｎｄＤ．Ｄ．Ｊ．Ｌｉｍｂｒｉｃｋ、Ａｄｖ．Ｎ
ｅｕｒｏｌ．７１：３７〜４６、１９９６、Ｌｉｍｂｒｉｃｋ、Ｄ．Ｄ．Ｊ．、
Ｓ．Ｂ．Ｃｈｕｒｎ、Ｓ．Ｓｏｍｂａｔｉ、ａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚ
ｏ、ＢｒａｉｎＲｅｓ．６９０．１４５〜１５６、１９９５。グルタミン酸曝
露時間に対する感受性は培養毎にやや異なっていたが、１０〜３０分の曝露に特
徴的な遅延型神経細胞死をもたらす興奮毒性的な曝露と、神経細胞の大部分が通
常基底カルシウムレベルに戻り、死に至る結果をもたらさない１乃至８分間の曝
露との間には明白な違いがある。この細胞内カルシウムの上昇は、統計学的に極
めて有意に細胞死の発生と相関していた。

【００３７】興奮毒性神経損傷および神経脱分極。興奮毒性グルタミン酸への１０分間の曝
露の神経細胞膜電位に対する影響を評価するために実験を実施した。神経細胞の
静止膜電位を、図２に示したように、グルタミン酸曝露前後、および曝露中に記
録した。神経細胞の基底静止電位は−７０ｍＶと−５５ｍＶの間にあった。１０
０μＭのグルタミン酸と１０μＭのグリシンに１分間曝露した後、神経細胞は約
２〜５ｍＶの静止電位まで脱分極し、１分間曝露終了後に迅速に−６５ｍＶまで
回復した。基底静止電位への回復は、基準カルシウムレベルへの回復よりもさら
に速やかであった。

【００３８】図２Ａに示したように、海馬神経細胞を１００μＭのグルタミン酸と１０μＭ
のグリシンに１０分間曝露すると、細胞の脱分極が引き起こされ、＋５ｍＶのレ
ベルに達した。しかし、神経細胞は無期限に、たとえば測定期間中ずっと（実験
によってはグルタミン酸除去後２時間にもわたった）−１５ｍＶ乃至０ｍＶの間
で脱分極したままであった。これらの結果によって、興奮毒性グルタミン酸に曝
露した神経細胞は、基底カルシウムレベルに回復できないだけでなく、静止膜電
位を正常値に回復することもできないことが示された。静止膜電位レベルへの回
復不能を長期神経細胞脱分極（ＥＮＤ）と称した。Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｄ．Ａ．、
Ｓ．Ｓｏｍｂａｔｉ、ａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐ
ｈｙｓｉｏｌ．６８：３６２〜３７３、１９９２。

【００３９】老化した神経細胞に関する研究によって、損傷に対する神経細胞の感受性およ
びＥＮＤ発生能力が老化によって徐々に増大することが示された。神経細胞が非
常に老化すると、ＥＮＤを発生して死んでしまう。幼弱な神経細胞と比較して、
より老化した神経細胞は、ずっと低レベルのグルタミン酸損傷においてＥＮＤを
生じた。さらに、より短時間、またはより低濃度のグルタミン酸を曝露して、微
弱なグルタミン酸損傷を複数回与えても最終的にＥＮＤが発生し、反復慢性損傷
の蓄積によって最終的にＥＮＤが発生し得ることが示された。

【００４０】興奮毒性神経細胞損傷後のカルシウム流入。図１に示したように、興奮毒性グ
ルタミン酸曝露後における遅延型カルシウム上昇に対する細胞外カルシウムの影
響を調べるために、カルシウムイメージング法を使用した。Ｉｎｄｏ−１をカル
シウム指示薬として使用して、細胞を興奮毒性グルタミン酸条件に曝露した。グ
ルタミン酸に１０分間曝露している間に細胞内カルシウムの長期上昇が発生して
から、細胞を通常の洗浄溶液またはカルシウム無しの溶液に曝露した。対照とし
て使用した通常の洗浄液に細胞を曝露すると、細胞内カルシウムの長期上昇が表
れた。しかし、カルシウム無しの洗浄液で処理した細胞のカルシウムレベルは、
速やかに基底レベルの状態に回復した。したがって、この上昇相の最中に細胞外
のカルシウムを除去すると上昇した細胞外カルシウムが迅速に低下するので、興
奮毒性を有するグルタミン酸への曝露によって生じた細胞内カルシウムの慢性的
な上昇は、細胞外カルシウムの流入によって影響を受けたものであった。

【００４１】グルタミン酸に１０分間曝露してカルシウムが上昇した後、図１Ｂに示したよ
うに、カルシウム無しで洗浄した調製物は３０分以内に基底カルシウムレベルに
回復した。通常の対照溶液で洗浄した神経細胞は全て、標準的な基底カルシウム
レベルまで回復しなかった。このデータは、細胞外カルシウムの流入が興奮毒性
をグルタミン酸への曝露後に見られる細胞内カルシウムの長期上昇の一因となる
ことを示した。この結果は、カルシウムの流入が細胞内カルシウムの長期上昇の
一因となる直接的な証拠である。

【００４２】老化した神経細胞に関する研究から、老化によって神経細胞の損傷に対する感
受性が徐々に増加し、神経細胞が老化するにつれてカルシウム流入の増加および
細胞内カルシウム濃度の長期上昇が発生することが示された。神経細胞が非常に
老化すると、細胞死に至る細胞内カルシウムレベルの長期上昇が発生した。若い
神経細胞と比較して、老化した神経細胞では、ずっと低濃度のグルタミン酸損傷
でもカルシウム流入および細胞内カルシウム濃度の長期上昇が発生した。

【００４３】この結果は、時間をかけて最終的に著しい損傷となるグルタミン酸曝露によっ
てもたらされた僅かな慢性損傷が、カルシウムレベルの上昇および神経細胞死の
原因となることも実証していた。短い曝露時間または低濃度のグルタミン酸で曝
露する僅かなグルタミン酸損傷を多数与えた場合にも、最終的にカルシウム流入
の増加および細胞内カルシウムレベルの長期上昇が生じた。慢性損傷が最終的に
神経細胞のカルシウムレベルの増加を引き起こすと、その神経細胞は死滅した。
これらの結果は、慢性損傷が複数蓄積することによって、最終的にカルシウム流
入の増加および細胞内カルシウムレベルの長期上昇を発生させることを示してい
た。

【００４４】長期神経細胞脱分極に寄与するカルシウムの流入。前述のカルシウムイメージ
ング実験によって興奮毒性損傷後の神経細胞における細胞内カルシウムレベルの
上昇は細胞外カルシウムの長期流入によって影響を受けることが示されたので、
カルシウム上昇との関連が認められる長期神経細胞脱分極も、カルシウム流入に
よって影響を受けるかどうかを決定するために研究を実施した。１００μＭ−グ
ルタミン酸に１０分間曝露した後、神経細胞を対照溶液または低カルシウム溶液
で洗浄した。図２Ａで示したように、培地を含有した通常カルシウムで洗浄した
細胞ではＥＮＤが維持された。しかし、０−カルシウム溶液で洗浄した細胞では
、図２Ｄで示したように、迅速に静止膜電位が基準レベルの−７０ｍＶ乃至−５
０ｍＶの範囲に回復した。老化および慢性グルタミン酸損傷によって生じたカル
シウムレベル上昇の評価においても、前述した結果と同様の結果が得られた。

【００４５】これらの結果によって、細胞外カルシウムの流入は急性、加齢性、および慢性
損傷における興奮毒性グルタミン酸曝露後に見られる長期神経細胞脱分極に寄与
する主要な陽イオンであり、ＥＮＤの発生に著しく寄与していることが示された
。前記データは、ＥＮＤの最中のカルシウム流入がＥＮＤの発生に寄与する主要
因子であったことを示している。

【００４６】生理学的条件下で神経細胞の脱分極に通常利用される主要な陽イオン、ナトリ
ウムはＥＮＤの発生に有意には関与しないことが示されたことは重要であった。
図２Ｂおよび図３に示したように、１０分間グルタミン酸に曝露してＥＮＤを発
生させた後、ナトリウムを塩化コリンまたは塩化ＮＭＤＧと置換してナトリウム
を０にした以外は培地の全成分を含有する対照溶液で神経細胞を洗浄した。ナト
リウム無しで処理しても、神経細胞は静止膜電位に回復できなかった。曝露およ
び無ナトリウム溶液での洗浄後、神経細胞は＋５ｍＶから約−１０ｍＶになった
。さらに、ナトリウムの溶液を同濃度の塩化コリンまたは塩化ＮＭＤＧ溶液に置
換しても、３０分後に細胞は基底静止電位まで回復しなかった。したがって、主
要な細胞外陽イオンであるナトリウムを除去、または置換しても、ＥＮＤに有意
な影響はなく、興奮毒性損傷発生後に、細胞外培地中のナトリウムの除去または
置換によっては長期脱分極を元に戻し得ないことが示された。

【００４７】これは、図２Ｄおよび図３に示したように、細胞外カルシウムの除去によって
ＥＮＤを元に戻すことができるという事実と際立って対照的である。さらに、図
２Ｃおよび図３に示したように、グルタミン酸曝露後に使用した洗浄液からナト
リウムおよびカルシウムを除去すると、同じく神経細胞が基底膜電位に回復する
ことが可能であった。これらの結果は、ナトリウムの流入ではなくカルシウムの
流入がＥＮＤの維持に寄与していることの証拠となる。これらの結果は、急性、
、加齢性、および慢性損傷によって生じる損傷プロセス中に、カルシウム損傷電
流が形成され得ることも示唆している。

【００４８】細胞内カルシウムの長期上昇およびＥＮＤを遮断する薬剤。カルシウムの流入
はカルシウムレベルの長期上昇およびＥＮＤの発生に寄与するので、急性、加齢
性、または慢性損傷によって引き起こされる興奮毒性による細胞死の後に生じる
細胞内カルシウムの長期上昇およびＥＮＤの長期上昇を遮断する組成物を同定で
きるかどうかを決定するために実験を実施した。比較的大きなイオン半径を有す
るイオン、すなわちガドリニウムを選択した。ガドリニウム化合物は、核磁気共
鳴映像法（ＭＲＩ）研究の造影剤として使用されているので、ヒトに使用しても
安全である。塩化ガドリニウムが培養した海馬神経細胞のＥＮＤを元に戻す能力
を評価する実験を実施した。

【００４９】興奮毒性を与えるレベルのグルタミン酸に曝露した後、図４および図５に示し
たようにガドリニウムを洗浄液に添加した。対照調製物はｉｎｄｏ−１を用いる
と細胞内カルシウムレベルが約１〜２μＭに持続されており、１時間以上ＥＮＤ
を発現させた。しかし、グルタミン酸への曝露後にガドリニウムで処理すると、
細胞内カルシウムとＥＮＤがより迅速に減少し、約３０〜４０分で基底レベルに
回復した。これらの結果は、細胞外カルシウムが浸漬溶液から侵入することをガ
ドリニウムが遮断することができ、したがって神経細胞を静止カルシウムレベル
および静止膜電位に回復させることができることを示している。ガドリニウムは
、図５に示したように、無カルシウム細胞外洗浄液のようにＥＮＤを元に戻すこ
とができた。ガドリニウムのその他の形態および化合物もまた、効果的な阻害剤
であることが明らかとなった。したがって、ガドリニウム化合物は、カルシウム
によって惹起された毒性および損傷後のカルシウム流入の阻害剤であることが明
らかとなった。

【００５０】ガドリニウムは、老化時にに長期的に投与すると、カルシウムの流入とＥＮＤ
の発生を遮断した。ガドリニウムは、神経細胞の寿命の延長に顕著に有効であっ
た。さらに、ガドリニウムの長期投与は、慢性損傷モデルにおけるカルシウム流
入と蓄積およびＥＮＤの発生を阻害した。

【００５１】ガドリニウム化合物による処理は、損傷後に認められるカルシウムの長期上昇
に対してＥＮＤに対するのと同様の効果を発揮した。これらの結果は、細胞外カ
ルシウムによって影響を受けるＥＮＤおよび細胞内カルシウムの上昇はいずれも
ガドリニウムによって阻害されることを実証した。これらの結果は、急性、加齢
性、および慢性神経細胞損傷後のカルシウムの流入をガドリニウムで阻害するこ
とによって、ＥＮＤおよび細胞内カルシウムの長期上昇の両者を阻害することが
でき、神経細胞死を抑え、又は減少させ得ることの強固な証拠を与える。

【００５２】ＥＮＤを元に戻すためにその他の試みがなされており、それには亜鉛、ベプリ
ジル、およびＳＫＦ−９６３６５による処理が含まれた。図６に示したように、
電位作動型カルシウムチャンネルを阻害する５μＭの亜鉛はＥＮＤを元に戻すの
に効果がなかった。図６に示したように、ナトリウム／カルシウム交換ポンプの
強力な阻害剤であるベプリジルはＥＮＤを元に戻すのに効果がなかった。さらに
ＫＦ−９６３６５を用いて、カルシウム放出によって活性化される電流をさらに
阻害しても、ＥＮＤを元に戻す効果はなかった。これらの結果は、さらに、ＥＮ
Ｄが急性、加齢性、および慢性神経細胞損傷の間に発生する新規カルシウム損傷
電流によって維持されることを示している。

【００５３】（ｉｉ）神経細胞損傷後の新規カルシウム電流の発生。

【００５４】細胞外カルシウムを除去すると、ＥＮＤおよび細胞内カルシウムの長期上昇が
何れも著しく影響を受けるので、急性、加齢性、および慢性神経細胞損傷に際し
て新規のカルシウム電流が発生する可能性を探った。

【００５５】興奮毒性損傷後の神経細胞中へのカルシウムの流入におけるＩＩＣＣ電流の役
割を評価するために、対照神経細胞から、並びに前述のように興奮毒性グルタミ
ン酸に急性曝露した、グルタミン酸に加齢性及び慢性曝露した神経細胞から細胞
内の記録を取った。これらの条件での電流電圧の関係を−９０ｍＶから＋６０ｍ
Ｖの間隔で測定した。図７は、急性損傷後の対照およびＥＮＤ神経細胞の電流／
電圧の関係を表している。この実験は、対照神経細胞の勾配電流が非常に小さい
（２５０ピコジーメンス）ものであることを示している。しかし、ＥＮＤが生じ
ている間は、５０ナノジーメンスという非常に大きな勾配電流が生じた。この結
果から、カルシウムイメージングによる研究、およびＥＮＤが著しい内向き損傷
電流を起こすことを示唆した膜電位記録の研究が確認された。図７に示したもの
と本質的に同一な結果が、最終的にＥＮＤを与える加齢性および慢性グルタミン
酸損傷の電流電圧の関係で認められた。

【００５６】記録溶液からカルシウムを除去することによって、ＥＮＤで認められた内向き
の電流の特徴がさらに決定された。これによって、このカルシウム損傷電流が完
全に遮断された。さらに、この電流の大きさの発生における細胞外カルシウム濃
度の増加および減少の影響を評価することによって、この電流を媒介する上での
カルシウムの役割を調べた。この電流の電流電圧の関係は、カルシウムの増加ま
たは減少に比例してシフトした。このことは、カルシウム電流であることの強力
な証拠である。電圧固定法の結果によって、急性興奮毒性損傷後に新規カルシウ
ム流が発生する電気生理学的証拠がもたらされる。この電流はこれまでに記載さ
れておらず、神経細胞損傷中に発生したチャンネル、例えばＩＩＣＣの生物物理
的特徴の新たな発見である。

【００５７】ＥＮＤを発生する神経細胞を用いると、重篤度の低い加齢性および慢性グルタ
ミン酸損傷の結果、急性損傷と同様の結果が得られた。ＩＩＣＣは神経細胞の老
化中に神経細胞膜中に発生することが発見され、老化した神経細胞では、若い神
経細胞に比べ、グルタミン酸と応答して劇的にＩＩＣＣが発生した。さらに、低
濃度短期間のグルタミン酸による微弱な慢性的損傷では、神経細胞膜中に時間を
かけて徐々にこれらのチャンネルが蓄積した。これらの結果は、ＩＩＣＣが加齢
性および慢性損傷の発症において役割を担っていることを示しており、これらの
損傷誘導性カルシウムチャンネルが徐々に蓄積すると、最終的にこれらのチャン
ネルが高レベルとなって結果的に急性損傷の場合と同じ効果をもたらし、最終的
に細胞死に至ることを示している。

【００５８】損傷によって誘導されるカルシウム電流の性質決定。前述の損傷によって誘導
されるカルシウム電流の特性を調べるため、さらに性質決定を進めた。

【００５９】興奮毒性神経細胞損傷後に、あるいは対照神経細胞に対して、様々な置換溶液
を用いて電位固定による試験を行い、このカルシウム損傷電流のイオン依存性を
評価した。細胞外ナトリウムを除去しても、又は細胞外ナトリウムを塩化コリン
又はＮＭＤＧで置換しても、損傷電流は減少せず、損傷電流が、細胞外ナトリウ
ムにほとんど影響されないことが示された。これらの結果は、この新しい電流又
はチャンネルがナトリウムよりもカルシウムに対して選択性があることを示す。
加齢及び慢性グルタミン酸損傷により生じる損傷後も同じ結果が得られた。

【００６０】また、急性、加齢性、及び慢性グルタミン酸損傷によって誘発されるＥＮＤ後
の膜電位を制御する際に、ナトリウム／カルシウム交換ポンプが果たしうる役割
を調べる実験を行った。ベプリジルの存在下で行なった実験では、ＥＮＤにおい
て認められたカルシウム損傷電流を遮断する効果は見られなかった。さらに、公
知の電位依存性カルシウムチャンネル阻害剤を用いて、３種類の損傷におけるこ
の電流の薬理学的な性質決定を実施した。ニフェジピン、コナトキシン（ｃｏｎ
ａｔｏｘｉｎ）、及びカドミウムの効果を調べた。これらカルシウムチャンネル
遮断薬はいずれも、カルシウム漏出電流に対して効果がなかった。

【００６１】グルタミン酸受容体アンタゴニスト及びチャンネル阻害剤の効果も、３種類の
損傷すべてのＩＩＣＣ電流について調べた。ＣＮＱＸ、ＮＢＱＸ、ＡＰＶの効果
を調べた。いずれのグルタミン酸受容体アンタゴニストもＩＩＣＣ電流の規模に
影響しなかった。ＩＩＣＣ電流の規模と発生に対する他の神経刺激性分子の効果
について調べた。塩素電流及びカリウム電流の抑制は、ＩＩＣＣ電流に影響しな
かった。カルシウム放出によって影響を受ける電流を抑制しても、ＩＩＣＣ電流
には影響しなかった。

【００６２】ＩＩＣＣ電流の特性を明らかにするこれらの試験に基づき、データはこの電流
がこれまでに記述されていない新規なカルシウム電流であることを示す。興奮性
アミノ酸で活性化されたカルシウム侵入遮断薬及び電位依存性カルシウムチャン
ネル遮断薬をともに含む、これまでに知られ記述されているカルシウムチャンネ
ルアンタゴニストは、ＩＩＣＣ電流に対して効果がなかった。また、カルシウム
に対するＩＩＣＣの選択性、及び他の公知のイオンを通さないことが証明された
。これらの結果は、この電流が、急性興奮毒性損傷、これよりは重篤度の低い加
齢性及び慢性の興奮毒性損傷後に発生する独特なタイプのＩＩＣＣ電流であるこ
とを強く示唆するものである。

【００６３】 (iii)ＩＩＣＣによるカルシウム輸送を遮断する組成物ガドリニウムはＩＩＣＣの阻害剤である。ガドリニウムはＥＮＤ及び細胞内カ
ルシウムの長期上昇を効果的に戻したことから、ＩＩＣＣ電流に対するガドリニ
ウムの効果を評価する試験を開始した。ガドリニウムは、図８に示したように、
ＩＩＣＣ電流を効果的に抑制し、神経細胞を基底状態に戻した。ＩＩＣＣ電流を
遮断することに加え、ガドリニウムは、ＥＮＤを元に戻す上でも有効であった。
ガドリニウムはさらに、興奮毒性グルタミン酸曝露によって生じる興奮毒性損傷
及び細胞死後の細胞内カルシウムの長期上昇を戻すことにも有効であった。. ＩＩＣＣのガドリニウムによる阻害は、遅延型神経細胞死を防止する結果とな
った。ガドリニウムを使用すると、ＩＩＣＣ電流が抑制され、興奮毒性神経損傷
の影響が抑えられた。ガドリニウムは、興奮毒性損傷後１時間以内に投与すると
、細胞死の防止に効果的であった。さらに、ガドリニウム存在下で興奮毒性損傷
に曝露された神経細胞は死に至らなかった。

【００６４】また、神経細胞の老化につれて、神経細胞に長期にわたり投与したガドリニウ
ム化合物は、老化プロセスに付随する加速度的な細胞死から老化神経細胞を保護
することができた。長期にわたり投与したガドリニウムは、ＩＩＣＣの発生を妨
ぎ、神経細胞を延命し、したがって、神経細胞の損失に対する老化の影響を排除
し又は減少させることができた。さらに、より低濃度又はより短期間の多数の少
量慢性グルタミン酸損傷中に、長期にわたってガドリニウムに曝露すると、ＩＩ
ＣＣの生成が妨げられ、慢性損傷から神経細胞死が徐々に生じるのが防止された
。このようにガドリニウムは、加齢性及び慢性反復損傷が細胞死を引き起こす影
響を排除し、軽減させることに有効であった。

【００６５】抗酸化剤及び抗凝固剤は、ガドリニウムの効果を増進する。

【００６６】抗酸化剤、例えば、ビタミンＥ（α−トコフェロール）、ビタミンＣ（アスコ
ルビン酸）、メチルプレドニゾロン、α−リポ酸（チオクト酸、１，２−ジチオ
ラン−３−ペンタン酸、１，２−ジチオラン−３−バレリアン酸、及び６，８−
ジチオオクタン酸）、パルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸ジラウリル、
β−カロテン、ニゾフェノン、及びチリラザドメシレート、並びに抗凝固剤、例
えば、ヘパリン、ヘパリン誘導体、低分子量ヘパリン、及びクマリンを、１０分
間のグルタミン酸曝露後に、単独又は併用投与しても、神経細胞の生存には有意
な効果はなかった。しかし、抗酸化剤又は抗凝固剤の何れかを、ガドリニウムと
併用して投与すると、神経細胞損傷を阻止する際のガドリニウムの効果が増大し
た。ガドリニウムに抗酸化剤及び／又は抗凝固剤を添加すると、ＩＩＣＣを遮断
し、また神経細胞死を防止するガドリニウムの効果が増大した。さらに、ガドリ
ニウムに抗酸化剤又は抗凝固剤を添加すると、ガドリニウムが損傷を戻すことが
できる、又は防止することができる損傷後の時間が延長された。抗酸化剤又は抗
凝固剤とガドリニウムとを併用すると、損傷を回復させる時間が急性興奮毒性損
傷後最長２時間まで延びた。

【００６７】ガドリニウムと抗酸化剤及び抗凝固剤とを投与すると、興奮毒性損傷後２時間
半以内に投与すれば、損傷を元に戻し、細胞死を防止するのに有効であった。こ
れらの発見は、抗酸化剤又は抗凝固剤のうち何れかをガドリニウムと併用するこ
とは、ガドリニウム単体よりも効果的であることを示す。さらに、抗酸化剤及び
抗凝固剤とガドリニウムとの併用は、神経細胞損傷を元に戻し又は防止するのに
最も効果的な処置であった。

【００６８】ガドリニウムと抗酸化剤、ガドリニウムと抗凝固剤、又はガドリニウムと抗酸
化剤及び抗凝固剤の両者とを、神経細胞の老化につれて、長期にわたって神経細
胞に投与すると、ガドリニウム単体よりも効果的に、老化プロセスに付随する加
速度的な細胞死から老化した神経細胞を保護することができた。ガドリニウムと
抗酸化剤、ガドリニウムと抗凝固剤、又はガドリニウムと抗酸化剤及び抗凝固剤
の両者は、より効果的に長期にわたってＩＩＣＣの生成を阻害し、神経細胞を延
命させ、それによってＩＩＣＣの発生と神経細胞死に起因する老化の影響を軽減
することができた。

【００６９】さらに、より低濃度又はより短期間の多数の少量慢性グルタミン酸損傷を通じ
て、ガドリニウムと抗酸化剤、ガドリニウムと抗凝固剤、又はガドリニウムと抗
酸化剤と抗凝固剤に、長期間曝露すると、慢性損傷で認められるＩＩＣＣと神経
細胞死の漸増を、より効果的に防ぐことができた。したがって、ガドリニウムと
抗酸化剤、ガドリニウムと抗凝固剤、及びガドリニウムと抗酸化剤と抗凝固剤は
、ＩＩＣＣの発生に対して、及び細胞死の誘導において、加齢性及び慢性反復損
傷の影響を排除し、又は軽減する点で、ガドリニウム単体よりも効果的であった
。

【００７０】Ｂ．神経細胞の治療的処置のための方法及び組成物本発明の方法及び組成物は、損傷誘導性カルシウムチャンネルを遮断又は阻害
することによって、神経細胞に対する急性、加齢性、及び慢性損傷を何れも緩和
した。治療用組成物は、急性、加齢性、及び慢性神経細胞損傷を治療するのに有
用であるが、その投与の方法は、急性又は慢性症状での治療を最適化するために
変わり得る。さらに、本発明で記載される治療方法及び組成物はヒトと動物の何
れの患者に対しても使用することができ、患者という用語を使用する場合、ヒト
及び動物をともに含むということが、当業者によって理解されるであろう。

【００７１】急性中枢及び末梢神経系損傷は、非常な短時間で細胞死に至り得る損傷を神経
細胞に即時に与える突発的な事象により引き起こされる。急性損傷過程中及び急
性損傷直後に急性損傷治療をするために、ＩＩＣＣを通るカルシウムの流入を防
止する組成物の迅速な投与を含む急性脳損傷治療方法が望ましい。実験結果から
、急性損傷から遅くとも２時間以内にＩＩＣＣを阻害すれば、ＩＩＣＣの阻害が
なければ損傷により死滅したはずの神経細胞を救うことができることが実証され
る。従来のカルシウムチャンネル遮断薬は、損傷後５〜１０分を経過してから使
用すると神経保護効果がなく、また、損傷後にカルシウムを流入させ、神経細胞
中のカルシウム濃度を上昇させるＩＩＣＣを遮断する効果を何ら示さない。

【００７２】慢性型の脳損傷は、長期にわたって発生する。慢性型の損傷には、神経細胞の
老化と多数の微弱なグルタミン酸損傷によって生じる損傷が含まれ、それらは徐
々にＩＩＣＣを発生させ、神経細胞死を招く。ＩＩＣＣの形成は、慢性損傷にお
いて、時間の経過につれて徐々に起こり、神経細胞中に蓄積し、最終的には細胞
が基底カルシウムレベルを回復する能力を超えて、神経細胞死を生じる。加齢性
その他の慢性型損傷を治療するための方法及び組成物は、時間をかけて徐々に投
与され、慢性損傷によって発生するＩＩＣＣを長期にわたって阻害することによ
り、神経細胞を保護できることが好ましい。

【００７３】神経細胞損傷は、興奮性の神経伝達物質であるグルタミン酸、及び他の作用物
質の蓄積と共に、神経細胞環境に変化をもたらす誘因である。本研究では、これ
らの作用物質が過剰に蓄積すると、急性損傷に対して速やかに応答して、あるい
は老化及び他の慢性損傷に対して徐々に応答して形成される可能性があるＩＩＣ
Ｃの形成がもたらされることが見出された。ＩＩＣＣは、神経細胞にカルシウム
を流入させ、異常なレベルの細胞内カルシウムを生じ、神経細胞損傷及び細胞死
を引き起こすことになる。したがって、神経細胞への損傷を阻止し、又は元に戻
すために、ＩＩＣＣの形成とＩＩＣＣを通るカルシウム流入とを抑制することが
望ましい。従来のカルシウムチャンネル阻害剤は、これらのＩＩＣＣに影響しな
い。したがって、公知のカルシウムチャンネル遮断剤は、損傷に応答してＩＩＣ
Ｃがいったん発生すると、神経細胞損傷を防ぐのには有効でない。

【００７４】本発明は、ＩＩＣＣを遮断する化合物であって、かつ、標準的なカルシウムチ
ャンネル阻害剤及び薬剤に現在は抵抗性のある急性及び慢性状態において、細胞
を損傷する濃度のカルシウムが神経細胞中に蓄積することを防止する化合物を輸
送することができる組成物を提供する。ＩＩＣＣを阻害する、又はＩＩＣＣの阻
害という文言は、ＩＩＣＣの形成を阻害すること、又はＩＩＣＣを通って輸送さ
れるカルシウムを阻害することの何れかを意味するものとする。いずれの場合も
、最終的な結果は、ＩＩＣＣを介して神経細胞へ流入するカルシウムを遮断する
ことである。急性損傷には遮断剤を迅速に輸送する必要があり、慢性損傷及び老
化は遮断剤を長期的に輸送する輸送システムを必要とする。

【００７５】損傷後数時間が経過した場合でさえ、ＩＩＣＣの阻害は、神経細胞損傷を元に
戻すのに有効であり得ることが見出され、このことは、ＩＩＣＣを阻害すること
により、神経系に対する急性損傷を治療する重要な機会を与えるものである。ま
た、予期に反して、ＩＩＣＣの阻害は、従来ＩＩＣＣがいったん発生すると効果
がなかった他の神経保護薬、例えば抗酸化剤や抗凝固剤等に対して、神経細胞を
感応する状態にさせることも見出された。したがって、神経保護薬とＩＩＣＣ阻
害剤との併用は、急性、加齢性、及び他の慢性神経細胞損傷を処置することがで
きるという、新しい予想外の能力を提供するものである。

【００７６】本発明は、損傷から発生して神経細胞死を引き起こすＩＩＣＣを阻害すること
によって、ガドリニウム組成物が、損傷が生じてから数時間にわたって、損傷の
影響を元に戻し、神経系に対するさらなる損傷を防止することができるという予
想外の発見を利用するものである。ＩＩＣＣの阻害は、急性、加齢性、及び神経
系に対するその他の慢性的損傷を治療し、防止するための新しい予想外の方法で
ある。

【００７７】ガドリニウム組成物は、ＩＩＣＣを阻害する遮断薬として機能しうる組成物の
実施態様の一例である。本発明で使用される遮断薬は、ＩＩＣＣを阻害すること
ができる任意の組成物である。遮断薬は、急性損傷の処置において、損傷に応答
して投与してもよいし、損傷後数時間以内の期間に投与してもよい。あるいは、
遮断薬は、神経細胞損傷に至る可能性を有する慢性状態にある神経細胞の治療に
おいて、周期的に全身投与することもできる。加齢性及びその他の慢性神経性損
傷は長期にわたって起こるため、遮断薬の全身投与は、様々な慢性的神経性損傷
における細胞死の最終原因である神経細胞中へのカルシウムの長期蓄積を防止す
る。本発明の遮断薬を長期にわたって輸送するためには、長期的輸送システム、
又は徐放性若しくは持続放出性の輸送システムを使用してもよい。さらに、遮断
薬は、損傷を見越して、あるいは、例えば医学的処置又は手術の前などの損傷が
起きやすい状態において投与することができる。

【００７８】抗酸化剤及び抗凝固剤は単体では、過剰の細胞内カルシウムを有する神経細胞
を処置するには有効ではない。しかし、抗酸化剤及び抗凝固剤は、神経細胞を処
置する際に、遮断薬の効率を向上させることが予期に反して見出された。

【００７９】遮断薬と抗酸化剤及び／又は抗凝固剤は、損傷の重篤度、患者の年齢、及び投
与の経路に応じて併用することができる。例示的な実施態様では、これらの併用
には、例えば、ガドリニウムと抗酸化剤、ガドリニウムと抗凝固剤、及びガドリ
ニウムと抗酸化剤と抗凝固剤、とが含まれる。何れの併用を採用するかを決定す
る際には、損傷の重篤度、投与の経路、処方の有効性、及び患者の容態が考慮さ
れる。

【００８０】例示的な実施態様では、ガドリニウム化合物を遮断薬として使用する。具体的
な処方は、治療の最終目標、神経系の急性又は慢性損傷のいずれを治療するのか
、投与の経路、及び所与の投与経路における親化合物の毒性によって決定される
。ガドリニウムは多数の化合物として入手可能である。ガドリニウムイオンは水
溶性であるため、薬学的に許容される有機又は無機酸の塩としてイオンの形で投
与することができ、例えば、塩化物（ＧｄＣｌ_３、ＧｄＣｌ_３・６Ｈ_２０）、フ
ッ化物（ＧｄＦ_３）、臭化物（ＧｄＢｒ_３）、ヨウ化物（ＧｄＩ_２、ＧｄＩ_３）
、酸化物（Ｇｄ_２０_３）、硫化物（Ｇｄ_２Ｓ_３）、セレン化物（ＧｄＳｅ）、テ
ルル化物（Ｇｄ_２Ｔｅ_３）及び窒化物（ＧｄＮ）等が使用できる。ガドリニウム
化合物が、当業者に公知の様々な処方及び輸送システムにおいて使用できること
は、当業者であれば理解できるであろう。

【００８１】さらに、ガドリニウム錯体（ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍｃｏｍｐｌｅｘ）も使用
することができる。ガドリニウム錯体は、血液脳関門の変質のために損傷を受け
た神経組織に選択的に入ると期待されている。ガドリニウムキレートは、様々な
異種の錯化剤でガドリニウムイオンをキレートすることによって形成される。そ
の製造には、ガドリニウムと錯化剤のメタレーション工程が含まれる。錯化剤を
ガドリニウム酸化物と加熱水性媒体中で反応させると、ガドリニウムとのメタレ
ーションが進行する。ガドリニウムキレートの例には、ＧｄＤＴＰＡ、Ｇｄ
ＤＰＴＡ−ＢＭＡ、ＧｄＤＰＴＡ−ＭＭＡ、Ｇｄ−Ｄ０３Ａ−ブトロール（ｂ
ｕｔｒｏｌ）、Ｇｄ−Ｄ０３Ａ−ＨＰ、Ｇｄ−ＤＯＴＡメグルミン、Ｇｄ−Ｂ
ＯＰＴＡ／Ｄｉｍｅｇ、ＧｄＨＰ−Ｄ０３Ａ等がある。

【００８２】本発明には、ガドリニウム等の遮断薬を抗酸化剤及び／又は抗凝固剤と様々に
併用して投与すると、より効果的な神経細胞保護効果を生じ、製剤が損傷を防止
するのに有効な損傷後の時間を延長するという予想外の発見が含まれる。これら
の抗酸化剤及び／又は抗凝固剤は、遮断薬の不在下において単体で与えられると
、損傷が起きた後の損傷に対しては効果がなかった。加えて、これらの薬剤は、
神経細胞中への損傷誘導性カルシウム流入と、それによる細胞損傷及び細胞死を
抑制することができなかった。しかし、抗酸化剤及び／又は抗凝固剤を遮断薬と
併用すると、遮断薬の保護効果が、遮断薬単体の場合よりも著しく増大した。

【００８３】抗酸化剤には、例えば、ビタミンＥ（α−トコフェロール）、ビタミンＣ（ア
スコルビン酸）、メチルプレドニゾロン、α−リポ酸（チオクト酸、１，２−ジ
チオラン−３−ペンタン酸、１，２−ジチオラン−３−吉草酸、及び６，８−ジ
チオオクタン酸）、パルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸ジラウリル、β
−カロテン、ニゾフェノン、及びチリラザドメシレートが挙げられる。これらの
化合物は、脂質過酸化及び遊離基生成を減少させるのに有効である。本発明の予
想外の発見は、これらの抗酸化剤を、遮断薬によるＩＩＣＣの阻害と組み合わせ
たときに、神経細胞損傷から生じた状態を、遮断薬単体から予想される以上に著
しく改善したことである。本発明による別の予想外の発見は、抗酸化剤を遮断薬
と共に投与すると、前記治療が神経細胞死及び神経系に対する損傷の防止又は軽
減に有効となる損傷後の時間が延びたことである。

【００８４】抗凝固剤は、血液成分の凝固を防止又は軽減し、したがって血餅の生成を軽減
又は防止する。一般的な抗凝固剤には、ヘパリン、ヘパリン誘導体、低分子量ヘ
パリン、及びクマリン等が挙げられる。ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパリン
誘導体は、小胞体内のカルシウム被誘導型カルシウム放出系を活性化するＩＰ３
受容体の阻害剤として作用する利点をさらに有している。本発明の予想外の発見
は、遮断薬と併用される抗凝固剤が、遮断薬単体から予想される以上に神経細胞
損傷から生じた状態を著しく改善したことである。さらに、抗凝固剤を遮断薬と
併用投与すると、治療が神経細胞死及び神経系への損傷の防止又は軽減に有効と
なる損傷後の時間が予想外に延びた。

【００８５】本発明の方法及び組成物は、具体的な必要性に応じて、遮断薬を単体で或いは
抗酸化剤及び／又は抗凝固剤と併用して使用する。使用する組成物の剤形は、多
くの因子、例えば、患者の容態、神経細胞損傷の性質、患者の年齢と性別、好ま
しい輸送方法、化合物の毒性、到達経路の利用可能性に依存するであろう。

【００８６】遮断薬は、単体で、或いは抗酸化剤及び／又は抗凝固剤と様々に併用して、薬
学的製剤として投与することができる。薬学的製剤は、遮断薬のみ、或いは抗酸
化剤及び抗凝固剤のうち少なくとも一つと遮断薬とを含むことができる。製剤の
成分は、ひとつの純粋な化合物として存在してもよいし、薬学的に許容される一
以上の担体と組み合わせてもよい。許容される担体とは、製剤の成分と相溶し、
かつ患者に対して有害ではない担体を意味する。

【００８７】本発明の組成物は、損傷の性質、及び短期的又は長期的投与経路のいずれによ
り投与するかに応じて、幾つかの経路で投与することができ、その経路には、動
脈内；静脈内；くも膜下腔内；腹腔内；筋肉内；経口；舌下腺；頬；エアロゾル
（局所又は吸入）；点鼻；皮下；点眼；点耳；頭蓋内；局所(パッチとして、及
び直接に、皮膚及び内臓に対して使用)；心臓内；電気泳動；座薬；体外（透析
、潅流溶液、投薬血液器官で使用）；膣内等がある。最も適した経路は、例えば
、投与の安全性、患者の容態、レシピエントの疾患、及び治療される症状の急性
又は慢性的性質により決定される。薬剤を最も効果的な経路で投与する安全で迅
速な方法を提供するために、特定のキットを使用することができる。これらのキ
ットは、損傷を起こす特異的な条件、及び様々な目的のために開発することがで
きる。

【００８８】使用する製剤は、簡便には単位投薬形態で提供することができ、薬学の分野で
周知である任意の標準的な多数の方法よっても調製することができる。一般には
、製剤は、遮断薬を、又は抗酸化剤及び抗凝固剤のうち少なくとも一つと組み合
わせた遮断薬を、液体担体又は微細に粉砕した固体担体或いはその両者と、密に
かつ均一に混合し、次いで必要に応じ、最終生成物を損傷神経細胞に最適に輸送
できるように所望の剤形に形作る。

【００８９】非経口投与用の製剤は、緩衝液、静菌薬、抗酸化剤、及び製剤をレシピエント
の血液と等張にする溶質を含有可能な水系及び非水系無菌注入液、並びに増粘剤
及び懸濁剤等を含有可能な水系及び非水系無菌懸濁液を含む。即時調合注入液及
び懸濁液は、後記の無菌粉体、顆粒、錠剤から調製することができる。使用する
製剤は、密閉したアンプル、バイアル、又は注入ボトルとして、単回投与又は反
復投与容器に入れて作成することができ、液体状態で、或いは使用直前に注入用
生理食塩水又は水等の活性化用無菌液体担体の添加が必要なフリーズドライした
（凍結乾燥）状態で保存することができる。

【００９０】経口投与に適した本発明の製剤は、カシェ剤、カプセル、又は錠剤等の個別ユ
ニットとして作成することができ、個々が所定量の遮断薬、或いは抗酸化剤及び
抗凝固剤のうち少なくとも一つと遮断薬とを含有する。前記製剤は、粉体又は顆
粒として、水中油滴型液体エマルジョンとして、或いは水系液体又は非水系液体
の溶液又は懸濁液として提供することができる。遮断薬は、又は抗酸化剤と抗凝
固剤のうちの少なくとも一つ及び遮断薬は、ペースト、舐剤、又は巨丸剤として
も供することができる。

【００９１】本発明の製剤はまた、迅速に又は長期にわたって損傷を処置する短期又は長期
ベースで服用することができる錠剤の形でもよい。錠剤は、必要に応じて遮断薬
を又は遮断薬及び抗酸化剤と抗凝固剤のうち少なくとも一つを、圧縮又は成形し
て作成することができる。圧縮により作成される錠剤は、遮断薬を、又は遮断薬
及び抗酸化剤と抗凝固剤のうち少なくとも一つを、顆粒又は粉体等の易流動性の
形で、好ましくはバインダー、不活性希釈剤、バインダー、潤滑剤、界面活性剤
、又は分散剤と混合して、適当な機械で圧縮することにより調製することができ
る。成形錠剤は、液状の不活性希釈剤で湿らせた粉体化合物の混合物を適当な機
械で成形することにより作成することができる。錠剤は、コートしてもよいし、
刻み目を入れてもよく、さらに、錠剤中の遮断薬を、又は抗酸化剤及び抗凝固剤
の少なくともひとつと遮断薬を、調節して又は徐放できるように処方することが
できる。

【００９２】口への局所投与の調合物には、ショ糖、アカシア、又はトラガカント等で風味
を付けた、遮断薬、又は抗酸化剤及び抗凝固剤の少なくともひとつと遮断薬を含
む口内錠、並びにグリセリン、ゼラチン、又はショ糖及びアカシア等の素地中に
活性成分を含む香錠等がある。これらの製剤は、頬又は舌下から吸収されるであ
ろう。

【００９３】直腸又は膣用製剤は、ポリエチレングリコール又はカカオ脂等の標準的な担体
を用いた坐薬として作成できる。

【００９４】単回投与製剤は、有効量の遮断薬、又は抗酸化剤及び抗凝固剤のうち少なくと
もひとつと遮断薬を含有する製剤であることが好ましい。

【００９５】詳細に前述した成分に加え、本発明の製剤が、当業者に公知の他の薬剤を含む
ことができ、例えば、経口薬剤用の製剤に香味料を使用することができるし、ま
た、静脈内又は動脈内投与には、独特の輸送システムを有する特別なキットを使
用することができることを理解しなければならない。

【００９６】遮断薬は、又は抗酸化剤及び／又は抗凝固剤のうち少なくとも一つと遮断薬は
、以下の用量で投与される。すなわち、内部には、１ｐｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ
で、局所には、持続的又は迅速な輸送又は放出用の化合物又は混合物として処方
されて０.０００１％〜１００％である。本発明の投与計画には、巨丸剤として
、或いは一定の静注又は他の注入による点滴として、１日当たり１〜１０回の個
別投与、長期にわたる反復投与、短期の単回投与が含まれる。遮断剤と共に投与
される抗酸化剤及び／又は抗凝固剤の用量は、使用する成分の組成と組み合わせ
に応じて変わるであろう。

【００９７】患者への投与量は、最終的には本発明を施す医師が責任を負うものである。使
用用量は、患者の体重、年齢、性別、損傷の重篤度、投与の経路、損傷が急性で
あるか又は慢性的であるか、及び損傷を起こす詳細な疾患を含む幾つかの因子に
依存する。さらに、投与の経路は、症状の性質及び疾病の重篤度を含む多くの因
子に応じて変わる。

【００９８】例以下の例は、傷害誘導性カルシウムチャンネルの発見及び傷害誘導性カルシウ
ムチャンネルの治療的処置のための組成物及び方法の発明に関連する研究で使用
した方法及び操作を例示するために記載されたものである。

【００９９】例１培養海馬神経細胞の調製法ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ外（参考文献として、その全体が本明細書中に援用される
）、Ｂａｎｋｅｒ、Ｇ．Ａ．及びＷ．Ｍ．Ｃｏｎａｎ、ＢｒａｉｎＲｅｓ．
１２６：３９７−４２、１９７７；ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ、Ｒ．Ｊ．、Ｓ．Ｐａｌ
、及びＳ．Ｓｏｍｂａｔｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．９５：１４４８２−１４４８７、１９９８の記載に従い、Ｂａｎｋｅｒ及び
Ｃｏｎａｎの改変法によって初代海馬培養を調製した。２日齢の新生仔ＳＤラッ
ト（Ｈａｒｌａｎ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から海馬の神経細胞及びその他
の細胞を切除し、予め２μＬのＭａｔｒｉｇｅｌＭａｔｒｉｘ（Ｂｅｃｔｏｎ
ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＬａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）をコートした
＃１カバーグラスチャンバースライド（Ｎｕｎｃ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ
）上に、２×１０^５細胞／チャンバーの密度で蒔いた。５％ＣＯ_２／９５％空気
雰囲気中、３７℃で培養物を維持し、ＭＥＭ、２ｍＭＬ−グルタミン、１０ｍ
Ｍグルコース、５μＭ／ｍＬインシュリン、１００μＭ／ｍＬトランスフ
ェリン、１００μＭプトレッシン、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、２０ｎ
Ｍプロゲステロン（ＩＣＮ、ＣｏｓｔａＭｅｓａ、ＣＡ）、１ｍＭピルビ
ン酸ナトリウム、０．１％オボアルブミン、（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｐｉｔｔｓｂｕ
ｒｇｈ、ＰＡ）、２０ｎｇ／ｍＬトリヨードチロシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ
、ＬａＪｏｌｌ、ＣＡ）、及び４０ｎｇ／ｍＬコルチコステロン（ＩＣＮ、
ＣｏｓｔａＭｅｓａ、ＣＡ）を含有する神経細胞用飼料を週に３回加えた。ア
ストログリアの支持細胞層はこれらの培養物中に存在しなかったので、アストロ
グリアの稠密培養から馴化培地を採集し、（容積の２０％になるように）神経細
胞用飼料に加えた。非神経細胞の増殖を確実に阻害するために、第一の神経細胞
用飼料には、５μＭのシトシンアラビノシドを含めた。培養から１４〜１７日後
の神経細胞に対して微蛍光測定分析と電気生理学的研究を行った。

【０１００】例２細胞内カルシウム濃度測定ｉｎｄｏ−１またはＦｕｒａ−ＦＦの細胞へのローディング：海馬神経細胞に
ｉｎｄｏ−ＩまたはＦｕｒａＦＦをロードするために、神経細胞用飼料を除去
し、ＩμＭｉｎｄｏ−１ＡＭ、またはＩμＭＦｕｒａ−ＦＦＡＭを含有
するレコーディング溶液（１４５ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１０ｍ
ＭＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコース、２ｍＭＣａＣｌ_２、１ｍＭＭｇＣ
ｌ_２、ｐＨ７．３、ショ糖で浸透圧を３２５に調節）に置換した。Ｐａｌ、Ｓ．
、Ｌｉｍｂｒｉｃｋ，Ｄ．Ｄ．、ａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ．Ｃ
ｅｌｌＣａｌｃｉｕｍ２８：１８１−１９３、２０００。３７^ｏＣ、1
時間で細胞へのローディングを行った。次に細胞を３回洗浄し、さらに１５分間
インキュベーションを行い、細胞のエステラーゼによりｉｎｄｏ−１ＡＭまた
はＦｕｒａ−ＦＦを分解させて遊離酸型にした。

【０１０１】顕微蛍光測定：既に説明したように、共焦点ＡＣＡＳＵｌｔｉｍａＩｎ
ｔｅｒａｃｔｉｖｅＬａｓｅｒＣｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＭｅｒｉｄｉａｎＩ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｏｋｅｍｏｓ、ＭＩ）の蛍光比プログラム（Ｃａ^２＋イ
メージングモード）を使用して［Ｃａ^２＋］_ｉを測定した。Ｌｉｍｂｒｉｃｋ
，Ｄ．Ｄ．Ｊ．、Ｓ．Ｂ．Ｃｈｕｒｎ、Ｓ．Ｓｏｍｂａｔｉ、ａｎｄＲ
．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ、ＢｒａｉｎＲｅｓ．６９０：１４５−１５６、
１９９５；Ｗａｄｅ、Ｍ．Ｈ．、Ｆ．Ａ．ｄｅ、ａｎｄＭ．Ｋ．Ｆｒａ
ｍｅ、ＭｅｔｈｏｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．３７：１１７−１４１、
１９９４。簡潔に説明すると、オリンパスＩＭＴ−２倒立顕微鏡（Ｌａｋｅ
Ｓｕｃｃｅｓｓ、ＮＹ）に取り付けたオリンパス１００ＵＶ／３４０油
浸対物レンズ（ＬａｋｅＳｕｃｃｅｓｓ、ＮＹ）に、１００ｍＷ、３６０ｎｍ
輝線のアルゴンレーザーを通した。発光波長は口径２２５ｐｍのピンホールを通
ってから光電子増倍管（ＰＭＴ）に到達させた。次に、コンピュータ駆動データ
収集システムにより、各ＰＭＴ（３５％にセット）からの光電流を測定した。４
０５ｎｍ（ｉｎｄｏ−１−カルシウム複合体）および４８５ｎｍ（遊離ｉｎｄｏ
−１）における発光波長の蛍光比をモニターし、相対的な遊離カルシウム濃度を
示した。カルシウム指示薬、Ｆｕｒａ−ＦＦを使用して行った実験では、既に説
明したように、二波長励起イメージング（波長３４０および３８０ｎｍ）に光学
系をセットし、集光する発光波長を５１０ｎｍに設定した。Ｐａｌ，Ｓ．、Ｌ
ｉｍｂｒｉｃｋ、Ｄ．Ｄ．、ａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ．Ｃｅｌ
ｌＣａｌｃｉｕｍ２８：１８１−１９３、２０００。Ｈｙｒｅ、Ｋ．、
Ｓ．Ｄ．Ｈａｎｄｒａｎ、Ｓ．Ｍ．Ｒｏｔｈｍａｎ、ａｎｄＭ．Ｐ．Ｇｏｌ
ｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．Ｓｃｉ．１７：６６６９−６６７７、１９９７
；Ｌｉｍｂｒｉｃｋ、Ｄ．Ｄ．Ｊ．、Ｓ．Ｂ．Ｃｈｕｒｎ、Ｓ．Ｓｏｍｂａ
ｔｉ、ａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ、ＢｒａｉｎＲｅｓ．６９０
：１４５−１５６、１９９５。

【０１０２】実際の遊離［Ｃａ^２＋］_ｉ値は、既に記載された通りに作成したＣａ^２＋検定
曲線に対して蛍光比の値を対応させることによって導いた。Ｐａｌ、Ｓ．、Ｌ
ｉｍｂｒｉｃｋ、Ｄ．Ｄ．、ａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ．Ｃｅ
ｌｌＣａｌｃｉｕｍ２８：１８１−１９３、２０００。１６サンプル／ポイ
ントにおいてデータを収集し、スキャン強度を１０〜２５％に設定し、ｉｎｄｏ
−１の蛍光褪色を防ぐために１％ニュートラルデンシティーフィルターを使用
した。レーザーパルスの間隔（ステップサイズ）は、単一または複数細胞を同時
にモニターし個々に解析できるように、０．５〜３．０μＭの間に設定した。実
験は全て摂氏３５〜３６度のレコーディング溶液中において実施した。

【０１０３】カルシウム検定曲線：蛍光比をＣａ^２＋濃度に変換するために、水溶液中で
ｉｎｖｉｔｒｏカルシウム検定曲線を作成した。Ｐａｌ、Ｓ．、Ｌｉ
ｍｂｒｉｃｋ，Ｄ．Ｄ．、ａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ．Ｃｅｌｌ
Ｃａｌｃｉｕｍ２８：１８１−１９３、２０００。Ｌｉｍｂｒｉｃｋ、
Ｄ．Ｄ．Ｊ．、Ｓ．Ｂ．Ｃｈｕｒｎ、Ｓ．Ｓｏｍｂａｔｉ、ａｎｄＲ．Ｊ
．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ、ＢｒａｉｎＲｅｓ．６９０：１４５−１５６、１９
９５；Ｗａｄｅ、Ｍ．Ｈ．、Ｆ．Ａ．ｄｅ、ａｎｄＭ．Ｋ．Ｆｒａｍ
ｅ、ｍｅｔｈｏｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．３７：１１７−１４１、１
９９４；Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ、Ｇ．、Ｍ．Ｐｏｅｎｉｅ、ａｎｄ
Ｒ．Ｙ．Ｔｓｉｅｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３４４０−３４５０
、１９８５。実験的パラメーターおよび機器設定は、細胞培養実験に使用したも
のと同一であり、使用する緩衝液は、細胞内イオンバランスに類似するように設
定した（１００ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＥＧＴＡ、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７．２）。既に記載されているように、両指示薬を含有する緩衝液に対して既知
量のＣａ^２＋を添加した後、蛍光変化を測定して検定曲線を作成した。Ｐａｌ，
Ｓ．、Ｌｉｍｂｒｉｃｋ、Ｄ．Ｄ．、ａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ
．ＣｅｌｌＣａｌｃｉｕｍ２８：１８１−１９３、２０００。Ｋｄ値は、文
献で報告されている値を使用して推定した。Ｐａｌ、Ｓ．、Ｌｉｍｂｒｉｃｋ
、Ｄ．Ｄ．、ａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ．ＣｅｌｌＣａｌｃｉｕ
ｍ２８：１８１−１９３、２０００。Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｓ、Ｇ．、
Ｍ．Ｐｏｅｎｉｅ、ａｎｄＲ．Ｙ．Ｔｓｉｅｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６０：３４４０−３４５０、１９８５；Ｉａｔｒｉｄｏｕ、Ｈ．、Ｅ
．Ｆｏｕｋａｒａｋｉ、Ｍ．Ａ．Ｋｕｈｎ、Ｅ．Ｍ．Ｍａｒｃｕｓ、Ｒ．Ｐ．
Ｈａｎｇｌａｎｄ、ａｎｄＨ．Ｅ．Ｋａｔｅｒｉｎｏｐｏｕｌｏｓ、Ｃｅｌ
ｌＣａｌｃｉｕｍ１５：１９０−１９８、１９９４。本発明者らは静止［Ｃａ ^２＋］_ｉのレベルが７５〜２００ｎＭの間であるものを健常神経細胞として定義
し、初期ベースライン［Ｃａ^２＋］_ｉ値が２００ｎＭより高い神経細胞は異常
であるとして解析しなかった。

【０１０４】例３電気生理学的実験各パッチクランプ実験の前に、培養液をレコーディング溶液（前記）に交換し
た。次に、位相差光学系を装備したオリンパスＩＸ−７０倒立顕微鏡（Ｌａｋｅ
Ｓｕｃｃｅｓｓ、ＮＹ）のステージに培養物を移した。インビトロで１３−１
７日間増殖させ、相が明瞭な中型から大型の海馬錐体神経細胞に対して実験を行
った。各実験を通じて、培養物を１ｍｌ／分の流速で継続して灌流し、加熱ステ
ージを用いて摂氏３０度に維持した。パッチ電極（抵抗２−７Ｍｏｈｍｓ）は
、ＢｒｏｗｎＦｌａｍｉｎｇＰＣ−８０ガラス電極作成器（ＳｕｔｔｅｒＩ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）を用いてホウケイ酸ガラスキャピ
ラリー（ＷＰＩ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）から作製した。記載されているよう
に、ホールセルパッチクランプ形式で電気生理学的記録を実施した。Ｃｏｕｌｔ
ｅｒ、Ｄ．Ａ．、Ｓ．Ｓｏｍｂａｔｉ、ａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚｏ
、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．６８：３６２−３７３、１９９２；Ｓｏｍ
ｂａｔｉ、Ｓ．、Ｄ．Ａ．Ｃｏｕｌｔｅｒ、ａｎｄＲ．Ｊ．ＤｅＬｏｒｅｎｚ
ｏ、ＢｒａｉｎＲｅｓ．５６６：３１６−３１９、１９９１。Ａｘｏｃｌａｍ
ｐ２Ａａｍｐｌｉｆｉｅｒ（ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｏｓｔ
ｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）のブリッジモードを用いて、電流クランプ実験を行った
。Ｎｅｕｒｏｃｏｒｄｅｒ（Ｎｅｕｒｏｄａｔａ、ＣｙｇｎｕｓＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、ｃｉｔｙ、ｓｔａｔｅ）を用いてデータをデジタル化し、ビデ
オテープに記録し、解析を行うためにＤａｓｈＩＶｃｈａｒｔｒｅｃｏｒ
ｄｅｒ（Ａｓｔｒｏ−Ｍｅｄ、Ｗａｒｗｉｃｋ、ＲＩ）で再生した。Ａｘｏｐ
ａｔｃｈ１Ｄａｍｐｌｉｆｉｅｒ、およびｐＣＬＡＭＰ６．０４ソフトウェ
ア（ともにＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓより）を用いて、電圧クランプ実
験を行った。直列抵抗補償回路を用いて約７５〜８０％の直列抵抗を解消した。

【０１０５】例４溶液全実験において、前述したようにまず対照レコーディング溶液で培養系を灌流
した。グルタミン酸（１００〜５００μＭ）をレコーディング溶液中に溶解し、
グリシン１０μＭと共に１０分間培養系に与えた。グルタミン酸の洗浄は、対照
レコーディング溶液、レコーディング溶液＋溶解した薬物、またはＮａ^＋を含ま
ないレコーディング溶液のいずれかで行った。実験によっては、Ｎａ^＋を含まな
いレコーディング溶液に薬物を添加した。Ｎａ^＋を含まないレコーディング溶液
は、ＮａＣｌを塩化コリンまたはＮ−メチル−Ｄ−グルタミンクロライドで等モ
ル置換することにより調製した。次に挙げるものを除いて、薬物は全てＳｉｇｍ
ａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）より入手した。Ｓｉｇｍａ以外から入手したもの
は、ＡＰＶ（ＲＢＩ）、ＣＮＱＸ（ＲＢＩ）、ＭＣＰＧ（Ｔｏｃｒｉｓ、ＵＫ
）、ＳＫＦ−９６３６５（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＣＡ）、およびテトロドトキ
シン（ＡｌｏｍｏｎｅＬａｂｓ、Ｊｅｒｕｓｅｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）であっ
た。パッチクランプ実験に使用するために、細胞内／電極液は１４０Ｋ^＋グル
コン酸塩、１０ＨＥＰＥＳ、1 ＭｇＣｌ_２ｐＨ７．２（単位はｍＭ）を含
有し、ショ糖で浸透圧を３１０ｍｏｓｍに調整した。

【０１０６】例５データ解析Ｍｅｒｌｉｎ（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｏｕｒｃｅｓ）およびＳｉ
ｇｍａＰｌｏｔ（ＪａｎｄｅｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃｉｔｙ、ＣＡ）ソフ
トウェアを用いて、または以前に記載されているようにして、［Ｃａ^２＋］_ｉデ
ータを解析した。Ｐａｌ，Ｓ．、Ｌｉｍｂｒｉｃｋ、Ｄ．Ｄ．、及びＲ．Ｊ．Ｄ
ｅＬｏｒｅｎｚｏ．ＣｅｌｌＣａｌｃｉｕｍ２８：１８１−１９３、２００
０。電圧クランプデータはＣＬＡＭＰＥＸを用いて取得し、ＣＬＡＭＰＦＩＴを
用いて解析を行った（共にｐＣＬＡＭＰ６．０４、ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ）。Ｏｒｉｇｉｎ（ＭｉｃｒｏｃａｌＳｏｆｔｗａｒｅ、Ｎｏｒｔｈａ
ｍｐｔｏｎ、ＭＡ）を用いて、電流−電圧グラフを作成した。ＳｉｇｍａＳｔ
ａｔ（ＪａｎｄｅｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて統計解析を行った。

【０１０７】データ解析手段ＳｉｇｍａＰｌｏｔおよびＳｉｇｍａＳｔａｔｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｊａ
ｎｄｅｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳａｎＲａｆａｅｌ、ＣＡ）を用いて、未
処理［Ｃａ^２＋］_ｉ値および［Ｃａ^２＋］_ｉタイムコースのグラフ解析的および
統計的解析を行った。Ｗａｄｅ、Ｍ．Ｈ．、Ｆ．Ａ．ｄｅ、ａｎｄＭ．Ｋ
．Ｆｒａｍｅ、ＭｅｔｈｏｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．３７：１１７−１
４１、１９９４。いくつかの神経細胞を同時にモニターする実験において、各細
胞における［Ｃａ^２＋］_ｉレベルを個別に定量した。

【０１０８】場合によっては、［Ｃａ^２＋］_Ｉ調節カイネティクスを比較するために［Ｃ
ａ^２＋］_ｉ値を標準化した。グルタミン酸曝露後の［Ｃａ^２＋］_ｉ値全てをグル
タミン酸曝露中に得られた最大［Ｃａ^２＋］_ｉ値で除することによって、［Ｃａ ^２＋］_ｉデータ（複数の神経細胞の［Ｃａ^２＋］_ｉ値の平均）の標準化を行っ
た。Ｃａ^２＋の持続的流入に対する薬理学的阻害剤の効果を分析するために、細
胞外Ｃａ^２＋存在下および非存在下で記録した［Ｃａ^２＋］_ｉ値を標準化し、細
胞外Ｃａ^２＋存在下で記録した標準化された［Ｃａ^２＋］_ｉ値から細胞外Ｃａ^２ ^＋非存在下で記録した標準化された［Ｃａ^２＋］_ｉ値を差し引いた。この差し引
きを行うことにより、［Ｃａ^２＋］_ｉ上昇を持続させる流入成分の推定に役立つ
、全体の［Ｃａ^２＋］_ｉに対する細胞外Ｃａ^２＋の効果を評価できる。逆に、細
胞外Ｃａ^２＋非存在下では、Ｃａ^２＋流入はこれらの条件下で消失するため、記
録された標準化［Ｃａ^２＋］_ｉ曲線によって神経細胞が細胞内遊離Ｃａ^２＋を排
出または隔離する能力を推定することができた。

【０１０９】当業者であれば、本発明を幅広い用途及び応用に供し得ることが理解できるで
あろう。本発明および前述の説明によって示唆されるように、本発明の本質また
は範囲から逸脱せずに、本明細書中に記載されているもの以外の本発明の多くの
実施態様および改変、並びに多くの変更、修正が可能であることが明白かつ妥当
であろう。したがって、本明細書中では、代表的な実施態様において本発明を詳
細に説明したが、この開示は本発明を例示および具体化するものにすぎず、本発
明の完全かつ実施可能な開示を提供するためのものにすぎないことが理解される
であろう。前述の説明は、本発明を限定し、または他の実施態様、変法、変更、
修正を排除することを意図しておらず、またそのように解釈すべきものでもなく
、本発明は本明細書に添付された特許請求の範囲及びその均等物のみによって限
定されるものである。

【図面の簡単な説明】

本発明は、添付の図面と合わせて、本発明の好ましい実施態様についての以下
の詳細な説明を読むことによって、より完全に理解することができる。これらの
記載において、同じ参照記号は同じ要素を指し示すために使用されている。

【図１】図１は、培養海馬神経細胞における細胞内カルシウムレベルのベースラインへ
の復帰に対する、細胞外カルシウムの存在下（黒）又は不存在下（白）における
１分（Ａ）及び１０分（Ｂ）のグルタミン酸への曝露（１００μＭグルタミン
酸及び１０μＭグリシン）の効果を示す。グルタミン酸への曝露によって、神
経細胞は、２．４μＭの最高細胞内カルシウムレベルに到達した。グルタミン酸
を除去（時間、０）すると、１分（Ａ）のグルタミン酸曝露後には、２０分以内
に、ベースライン細胞内カルシウムレベルに達したが、１０分（Ｂ）のグルタミ
ン酸曝露後には、ベースラインカルシウムレベルに戻らなかった。グルタミン酸
曝露後に細胞外カルシウムを除去すると、１分（Ａ）及び１０分（Ｂ）のグルタ
ミン酸曝露後の両者で、より早くベースラインカルシウムレベルに復帰した。曲
線は、細胞外カルシウムありの場合、２１の神経細胞に対する平均細胞内カルシ
ウムレベルを表しており、細胞外カルシウムなしの場合、１１の神経細胞を表し
ている。細胞内カルシウムレベル［Ｃａ^２＋］_ｉは比として表されている。値１
は２．５μＭのカルシウムを表しており、Ｉｎｄｏ−１をカルシウム指示薬とし
て使用した。

【図２】図２は、興奮毒性グルタミン酸曝露に応じた海馬神経細胞における長期神経細
胞脱分極（ＥＮＤ）と、Ａ．ＥＮＤ後に対照溶液、Ｂ．ＥＮＤ後に無ナトリウム
（０Ｎａ^＋）溶液、Ｃ．ＥＮＤ後に無ナトリウム及び無カルシウム（０Ｎａ ^＋／０Ｃａ^２＋）、並びにＤ．ＥＮＤ後に無カルシウム（０Ｃａ^２＋）の効
果とを示している。１００μＭのグルタミン酸と１０μＭのグリシンに１０分間
曝露することによってＥＮＤを誘導した後に、細胞を洗浄し、対照（Ａ）又は実
験溶液（Ｂ−Ｄ）中に細胞を置いた。

【図３】図３は、対照（Ｃｔｒｌ）、無ナトリウムと塩化コリン（０Ｎａ^＋、ｃｈｏ
ｌ）、無ナトリウムとＮＭＤＡ（０Ｎａ^＋、ＮＭＤＡ）、無カルシウム（０
Ｃａ^２＋）、及び無ナトリウムと無カルシウム（０Ｃａ^２＋、０Ｎａ^＋）に
よる３０分の処置後に興奮毒性グルタミン酸曝露を行った後の膜電位を示してい
る。データは、測定値の平均±ＳＥＭを表している。^＊ｐ＜０．０１。図は、外
部洗浄溶液が無カルシウムであるとＥＮＤから元に戻すことができるが、無ナト
リウムでは元に戻すことができないということを示している。

【図４】図４は、ＥＮＤを元に戻す塩化ガドリニウムの効果を示している。データは、
ｎ＝１１の平均±ＳＥＭを表している。^＊ｐ＜０．０１。

【図５】図５は、ガドリニウムが無カルシウムと同様にＥＮＤを元に戻すのに有効であ
ったことを示している。データは、ｎ＝８の平均±ＳＥＭを表している。^＊ｐ＜
０．０１。

【図６】図６は、ＥＮＤに対する塩化亜鉛、ベプリジル、及びＳＫＦ−９６３６５の効
果を示している。データは、ｎ＝６の平均±ＳＥＭを示している。５μＭのＺｎ
Ｃｌ_２で電位作動型カルシウムチャンネルを阻害しても、ＥＮＤは抑制されなか
った。Ｎａ／Ｃａ^２＋交換体の阻害剤であるベプリジルはＥＮＤを遮断しなかっ
た。ＳＫＦ−９６３６５によるカルシウム放出被活性化型チャンネルの阻害は、
ＥＮＤに対して影響を与えなかった。

【図７】図７は、対照（黒四角）とＥＮＤ（黒丸）に対する−９０〜＋６０ｍＶの電圧
段階の電流／電圧相関を示している。データは、ｎ＝７の平均±ＳＥＭを表して
いる。対照条件における勾配電流は２５０ピコシーメンスであり、ＥＮＤにおけ
る勾配電流は５０ナノシーメンスであった。

【図８】図８は、塩化ガドリニウムの不存在（黒丸）又は存在下（白三角）での対照（
黒四角）とＥＮＤに対する−９０〜＋６０ｍＶの電圧段階の電流／電圧相関を示
している。データは、ｎ＝６の平均とＳＥＭを表している。データは、ガドリニ
ウムがＥＮＤからベースライン（対照）条件へと神経細胞を回復させることを示
している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/41 Ａ６１Ｋ 31/41 31/573 31/573 31/727 31/727 33/24 33/24 Ａ６１Ｐ 7/02 Ａ６１Ｐ 7/02 9/00 9/00 25/00 25/00 25/02 25/02 25/28 25/28 43/00 １２１ 43/00 １２１ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C084 AA17 AA19 AA23 MA02 NA05 NA14 ZA012 ZA021 ZA161 ZA201 ZA541 ZC751 4C086 AA01 AA02 BA09 BA18 BA19 BC38 DA10 EA27 HA05 MA01 MA02 MA03 MA04 NA05 NA14 ZA01 ZA02 ZA16 ZA20 ZA54 ZC75 4C206 AA01 AA02 BA02 MA01 MA02 MA03 MA04 NA05 ZA01 ZA02 ZA16 ZA20 ZA54 ZC75

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】複数の被損傷神経細胞中へのカルシウムの流入を制限する方
法であって、前記被損傷神経細胞を有する患者に有効量の遮断薬を投与すること
を備え、前記遮断薬が損傷誘導性カルシウムチャンネルを遮断するのに有効な組
成物を含む方法。
【請求項２】前記被損傷神経細胞が急性損傷中に作り出される請求項１の
方法。
【請求項３】前記急性損傷が、卒中、外傷、心停止、低酸素症、酸素欠乏
症、酸素供給の欠乏、毒物、神経薬への曝露、化学兵器への曝露、溺水、火煙、
火傷、急性アレルギー反応、呼吸器系疾病、呼吸不全、麻酔、及び手術のうちの
少なくとも１つから生じる請求項２の方法。
【請求項４】前記被損傷神経細胞が慢性症状の結果として作り出される請
求項１の方法。
【請求項５】前記慢性症状が、アルツハイマー病、多発脳梗塞性痴呆、変
性脳、小脳、脳幹疾患、末梢神経疾患、脊髄疾患、パーキンソン病、ハンチント
ン舞踏病、老化過程、反復性発作、癲癇重積症、及び癲癇のうちの少なくとも１
つである請求項４の方法。
【請求項６】前記遮断薬が所定の一定間隔で投与される請求項４の方法。
【請求項７】前記組成物がガドリニウム化合物を含む請求項１の方法。
【請求項８】前記組成物がガドリニウム化合物と抗酸化剤及び抗凝固剤の
うち少なくとも１つとを含む請求項１の方法。
【請求項９】損傷誘導性カルシウムチャンネルを通じた神経細胞へのカル
シウムの流入から神経細胞を保護する方法であって、有効量の遮断薬を患者に投
与することを備え、前記遮断薬が前記損傷誘導性カルシウムチャンネルの遮断に
有効な組成物を含む方法。
【請求項１０】前記患者が医学的措置を受けている請求項９の方法。
【請求項１１】前記患者が急性損傷を有する請求項９の方法。
【請求項１２】前記急性損傷が、卒中、頭部外傷及び心停止、低酸素症、
酸素欠乏症、酸素の欠乏、毒物、神経薬への曝露、化学兵器への曝露、溺水、ヘ
ビ咬傷、火、火傷、急性アレルギー反応、呼吸器系疾病、呼吸不全、麻酔、及び
手術のうちの少なくとも１つから生じる請求項１１の方法。
【請求項１３】前記患者が神経細胞に対して有害な慢性症状を有する請求
項９の方法。
【請求項１４】前記慢性症状が、アルツハイマー病、多発脳梗塞性痴呆、
変性脳、小脳、脳幹疾患、末梢神経疾患、脊髄疾患、パーキンソン病、ハンチン
トン舞踏病、老化過程、反復性発作、癲癇重積症、及び癲癇のうちの少なくとも
１つである請求項１３の方法。
【請求項１５】前記遮断薬が所定の一定間隔で投与される請求項１３の方
法。
【請求項１６】前記組成物がガドリニウム化合物を含む請求項９の方法。
【請求項１７】前記組成物がガドリニウム化合物と抗酸化剤及び抗凝固剤
のうち少なくとも１つとを含む請求項９の方法。
【請求項１８】神経細胞を神経細胞死から保護する方法であって、有効量
の遮断薬を患者に投与することを備え、前記遮断薬が神経細胞の損傷誘導性カル
シウムチャンネルを遮断するのに有効な組成物を含む方法。
【請求項１９】前記患者が急性損傷を有する請求項１８の方法。
【請求項２０】前記急性損傷が、卒中、頭部外傷及び心停止、低酸素症、
酸素欠乏症、酸素の欠乏、毒物、神経薬への曝露、化学兵器への曝露、溺水、ヘ
ビ咬傷、火、火傷、急性アレルギー反応、呼吸器系疾病、呼吸不全、麻酔、及び
手術のうちの少なくとも１つから生じる請求項１９の方法。
【請求項２１】前記患者が神経細胞に対して有害な慢性症状を有する請求
項１８の方法。
【請求項２２】前記患者が、アルツハイマー病、多発脳梗塞性痴呆、変性
脳、小脳、脳幹疾患、末梢神経疾患、脊髄疾患、パーキンソン病、ハンチントン
舞踏病、老化過程、反復性発作、癲癇重積症、及び癲癇の症状のうちの少なくと
も１つを有する請求項２１の方法。
【請求項２３】前記遮断薬が所定の一定間隔で投与される請求項２１の方
法。
【請求項２４】前記患者が医学的措置を受けている請求項１８の方法。
【請求項２５】前記組成物がガドリニウム化合物を含む請求項１８の方法
。
【請求項２６】前記組成物がガドリニウム化合物と抗酸化剤及び抗凝固剤
のうちの少なくとも１つとを含む請求項１８の方法。
【請求項２７】神経細胞中へのカルシウムの流入を制限するための組成物
であって、複数の損傷誘導性カルシウムチャンネルを遮断するのに有効な一定量
のガドリニウム化合物と抗酸化剤とを含む組成物。
【請求項２８】前記抗酸化剤が、ビタミンＥ、ビタミンＣ、メチルプレド
ニゾロン、α−リポ酸、パルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸ジラウリル
、β−カロテン、ニゾフェノン、及びチリラザドメシレートからなる群から選択
される請求項２７の組成物。
【請求項２９】神経細胞中へのカルシウムの流入を制限するための組成物
であって、複数の損傷誘導性カルシウムチャンネルを遮断するのに有効な一定量
のガドリニウム化合物と抗凝固剤とを含む組成物。
【請求項３０】前記抗凝固剤が、ヘパリン、ヘパリン誘導体、低分子量ヘ
パリン、及びクマリンからなる群から選択される請求項２９の組成物。
【請求項３１】神経細胞中へのカルシウムの流入を制限するための組成物
であって、複数の損傷誘導性カルシウムチャンネルを遮断するのに有効な一定量
のガドリニウム化合物と抗酸化剤及び抗凝固剤とを含む組成物。
【請求項３２】前記抗凝固剤が、ヘパリン、ヘパリン誘導体、低分子量ヘ
パリン、及びクマリンからなる群から選択される請求項３１の組成物。
【請求項３３】前記抗酸化剤が、ビタミンＥ、ビタミンＣ、メチルプレド
ニゾロン、α−リポ酸、パルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸ジラウリル
、β−カロテン、ニゾフェノン、及びチリラザドメシレートからなる群から選択
される請求項３１の組成物。