DE69132563T2

DE69132563T2 - Ausgabeverfahren für fibrindichtungsmittel

Info

Publication number: DE69132563T2
Application number: DE69132563T
Authority: DE
Inventors: T. Mcnally; Brenda Morse Smith; Denise Turner
Original assignee: Cryolife Inc
Current assignee: Artivion Inc
Priority date: 1990-01-03
Filing date: 1991-01-02
Publication date: 2001-10-31
Anticipated expiration: 2011-01-03
Also published as: EP0509041A1; WO1991009641A1; JP3136157B2; AU641472B2; DE69132563D1; ES2155055T3; JPH05504950A; ATE199833T1; RU2104701C1; CA2072355A1; KR100197930B1; US5219328A; EP0509041B1; KR927003146A; EP0509041A4; AU7173391A; CA2072355C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Abgabe eines Fibrin-Versiegelungsmittels, das eine Verwendung einer einzelnen Abgabevorrichtung erlaubt. Das Verfahren kann für autologe, von einem Einzelspender, von in einem Pool zusammengefassten Spendern oder von einer Zellkultur abgeleitete Fibrin- Versiegelungsmittel für verschiedene am Menschen und an Tieren angewandte chirurgische Verfahren verwendet werden. Die Erfindung betrifft ferner einen Kit und eine Zusammensetzung für eine Verwendung in einem solchen Verfahren.

HINTERGRUNDINFORMATIONEN

Das Blutgerinnungssystem ist eine komplexe Abfolge von Proteinen und Faktoren, die nacheinander aktiviert werden, um ein Fibringel oder -gerinnsel zu erzeugen. In den letzten Stufen des Prozesses wird Fibrinogen durch Thrombin gespalten, um Fibrin-Monomer zu erzeugen, das schnell polymerisiert und durch aktivierten Faktor XILI unter Bildung einer Fibrinmatrix quervernetzt wird.
Präparate von menschlichen Gerinnungsfaktoren, einschliesslich Fibrinogen und Thrombin, sind in der Chirurgie im Verlauf der letzten zehn Jahre umfassend verwendet worden (Schlag et al. (Hrsg.), Fibrin Sealant in Operative Medicine, Band 1-7, Springer Verlag, Heidelberg). Diese biologischen Fibrin-Versiegelungsmittel fördern Hämostase und Wundheilung, indem ein Lecken aus Geweben, Nähten, Klammern und Prothesen versiegelt wird, und sind während offener Herzchirurgie bei heparinisierten Patienten besonders nützlich. Die Versiegelungsmittel finden auch Verwendung als Klebstoff für das Verkleben von Geweben und sie verringern durch Kontrolle der Blutung während einer Operation die Menge an Blut, die für Transfusionen benötigt wird. Ihre Wirksamkeit spiegelt sich in dem weiten Bereich chirurgischer Anwendungen, für die sie verwendet worden sind, einschliesslich Herz-Kreislauf-Chirurgie, plastischer Chirurgie, Orthopädie, Urologie, Geburtshilfe und Gynäkologie, Zahnmedizin, Gesichts- und Kieferchirurgie und ophthalmischer Chirurgie, wieder.
Fibrin-Versiegelungsmittelprodukte, die aus Fibrinogen/Factor XIII aus gepooltem menschlichem Plasma hergestellt werden, sind in Europa kommerziell erhältlich (Tissucol/Tisseel, Immuno AG, Wien, Österreich, und Beriplast P, Hoechst, Westdeutschland), aber solche Produkte haben keine Zulassung durch die U. S. Food and Drug Administration erhalten. Als Alternative stellen einige Krankenhäuser Fibrin-Versiegelungsmittel im Hause unter Verwendung des eigenen Bluts des Patienten (autolog) oder von Plasma eines einzelnen Spenders (homolog) als Quelle von Fibrinogen und Faktor XIII her.
Die Plasma-Fibrinogen/Faktor XIII-Komponente eines Fibrin- Versiegelungsmittels wird typischerweise hergestellt, indem Plasma bei einer Temperatur unter -20ºC über Nacht eingefroren wird, das Material bei 0-4ºC langsam aufgetaut wird, zentrifugiert wird und das Kryopräzipitat zu einer Spritze oder einem Zerstäubungsbehälter transferiert wird (Dresdale et al., Ann. Thorac. Surg. 40: 385 1985; und U. S. -Patent 4,627,879). Die Thrombin-Komponente, die üblicherweise aus Rinderplasma gereinigt wird, kann kommerziell erworben werden und wird typischerweise in einer separaten Spritze oder einem separaten Zerstäubungsbehälter hergestellt. Bei einer Verwendung werden die zwei Lösungen gleichzeitig oder abwechselnd abgegeben, um an der Stelle der Wunde ein Fibrin-Versiegelungsmittel zu erzeugen; alternativ wird das Versiegelungsmittel auf eine Kollagenmatrix (z. B. Gelfoam oder Avitene) aufgebracht und dann gegen die Stelle gedrückt (Lupinetti et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 90: 502 1985; und U. S. -Patent 4,453,939).
Die Erzeugung eines Fibrin-Versiegelungsmittels an der Wundstelle kann unter Verwendung eines Zwei-Spritzen-Systems bewirktcverden. Eine Doppelspritzenvorrichtung wird z. B. in H. Redl et al., Adv. Biomaterials 3 (1982) 669-676 und U. S. 4,359,049 offenbart. Die Doppelspritze besteht aus zwei separaten Behältern, die einerseits Thrombin und andererseits Fibrinogen und Faktor XIII enthalten. Das Auslassmittel dieser Vorrichtung umfasst eine Mischnadel, die auf einen Sammelkopf, der die Koni der zwei Spritzen verbindet, gleitend geschoben ist.
Ein solches System ist jedoch aufgrund der Schwierigkeiten des Befüllens und Handhabens der Abgabevorrichtungen an der Wundstelle nicht zufriedenstellend. Zusätzlich ist das Spritzensystem von Problemen einer inadäquaten Mischung der zwei Lösungen begleitet, was zu der Bildung eines schwachen Gerinnsels führt. Alternativ können die zwei Spritzen in eine Haltevorrichtung eingesetzt werden, die so gestaltet ist, dass zugelassen wird, dass die Lösungen sich vor dem Eintreten in die Nadel mischen (U. S. -Patente 4,735,616, 4,359,049 und 4,631,055).
Ein Fibrin-Versiegelungsmittel, das in einem Zwei-Komponenten- System (Doppel-Spritze) hergestellt wird, in dem Thrombin getrennt von einer Mischung von menschlichem Fibrinogen und Faktor XIII gehalten wird, um eine Gerinnung und Fibrin-guervernetzung (d. h. durch Thrombin katalysierte Fibrinbildung aus Fibrinogen) zu vermeiden, wird in H. Redl et al., Adv. Biomaterials 3 (1982) 669-676, offenbart. Wenn das Fibrin-Versiegelungsmittel benötigt wird, wird Thrombin mit den anderen Komponenten (d. h. menschlichem Fibrinogen und Faktor XIII) zusammengebracht, indem die Inhalte der zwei getrennten Spritzen zusammengebracht werden (siehe U. S. 4,359,049). Obwohl die Festigkeit des unter Verwendung dieses Verfahrens erhaltenen Gerinnsels reproduzierbar ist, verstopft die Nadel häufig und muss wiederholt ersetzt werden.
Angesichts der den gegenwärtig für eine Abgabe von Fibrin- Versiegelungsmitteln zur Verfügung stehenden Methodiken innewohnenden Probleme ist der Bedarf an einer einfachen, reproduzierbaren Technik offensichtlich. Eine solche Technik muss bequem anzuwenden sein und muss zur Bildung eines Gerinnsels geeigneter Festigkeit an einer speziellen Stelle führen. Eine solche Abgabetechnik wird durch die hier offenbarte Erfindung bereitgestellt.
Speziell besteht das der Erfindung zugrundeliegende Problem darin, ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die in der Lage ist, ein Fibrin-Versiegelungsmittel an der Körperstelle zu bilden, bereitzustellen. Insbesondere sollte eine Zusammensetzung bereitgestellt werden, die bequem anzuwenden ist und in der Lage ist, das Fibrin-Versiegelungsmittel an der Körperstelle bereitzustellen, was zu einem Gerinnsel geeigneter Festigkeit führt. Ein weiteres Problem der Erfindung besteht darin, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die zu reproduzierbaren Ergebnissen, d. h. reproduzierbarer Gerinnselbildung, führt. Insbesondere sollten die aus dem Stand der Technik bekannten Probleme (z. B. nicht zufriedenstellende Bildung von Gerinnseln an der Wundstelle und die technischen Probleme, die auftreten, wenn ein Zwei-Komponenten-System verwendet wird, insbesondere häufiges Verstopfen der Nadel der verwendeten Spritze aufgrund Gerinnung) vermieden werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist ein allgemeines Ziel der Erfindung, ein Verfahren zum Bilden eines Fibrin-Versiegelungsmittels aus Blutgerinnungskomponenten bereitzustellen, das die mit den in diesem Fachgebiet bekannten Verfahren verbundenen Probleme überwindet.
Es ist ein spezielles Ziel der Erfindung, ein Verfahren zum Abgeben von Fibrin-Versiegelungsmittel an eine Wundstelle bereitzustellen, in welchem Verfahren ein an Fibrinogen/Faktor XIII angereichertes Präzipitat (oder eine Fibrinogen/Faktor XIII- Mischung) und Thrombin unter Bedingungen miteinander vermischt werden, dass eine Gerinnung bis zu dem Zeitpunkt verhindert wird, zu dem die Bildung des Versiegelungsmittels erwünscht ist.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, einen Kit, der für eine Verwendung in dem oben beschriebenen Verfahren geeignet ist, bereitzustellen.
Eine vollständigere Würdigung der Erfindung und der Vorteile derselben wird von einem Fachmann auf diesem Gebiet bei einem Lesen der folgenden Beschreibung leicht verstanden werden.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Fibrin-Versiegelungsmittel an einer Körperstelle bilden kann, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Lösung, die Fibrinogen und Faktor XIII enthält, mit reifem Thrombin in einem Behälter-Mittel unter Bedingungen mischt, dass die Thrombin- Gerinnungsaktivität inhibiert wird, wobei das Fibrin-Versiegelungsmittel durch Wiederherstellung der Thrombin-Gerinnungsaktivität vor oder bei Anwendung an der Körperstelle gebildet werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Kit zur Verwendung bei der Herstellung eines Fibrin-Versiegelungsmittels. Der Kit umfasst einen Applikator, der i) ein Behälter-Mittel, in dem eine Lösung untergebracht ist, die Fibrinogen, Faktor XIII und reifes Thrombin umfasst; und ii) ein Auslassmittel, das operabel mit dem Behälter-Mittel verbunden ist, umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine durch das genannte Verfahren erhaltene Zusammensetzung, die Fibrinogen, Faktor XIII und reifes Thrombin zusammen mit Mitteln, die die Thrombin-Gerinnungsaktivität inhibieren, umfasst.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abgeben der Komponenten eines Fibrin-Versiegelungsmittels (Calcium, reifes Thrombin (im Gegensatz zu Prothrombin) und das von Plasma abgeleitete Fibrinogen/Faktor XIII-Präzipitat) an eine Körperstelle auf solche Weise, dass eine Gerinnselbildung bewirkt wird, und einen Kit, der für eine Verwendung in einem solchen Verfahren geeignet ist. (Der Begriff "Körperstelle", wie er hier verwendet wird, umfasst das Gewebe in dem Bereich einer Wunde oder einer Schnittwunde wie auch implantierbare Gewebe oder Komponenten, die in den Bereich eingesetzt werden sollen, z. B. Gefässprothesen, Knochen oder Kollagenpolster.) In der folgenden Beschreibung versteht es sich, dass eine Kombination von isolierten Formen von Fibrinogen und Faktor XIII anstelle des von Plasma abgeleiteten Präzipitats verwendet werden kann.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden ein Fibrinogen/Faktor XIII-angereichertes Präzipitat und reifes Thrombin miteinander vermischt unter Bedingungen, dass Thrombin und/oder Faktor XIII inaktiviert wird/werden (oder unter Bedingungen, dass Thrombin in einer aktiven Form vorhanden ist, aber nichtverfügbar gemacht wird, wie in der unten beschriebenen Calcium- Depletions-Ausführungsform) und dadurch eine Gerinnung verhindert wird. Die Mischung wird dann an die Körperstelle unter Bedingungen abgegeben, dass die Enzymaktivität wiederhergestellt wird (oder die Thrombin-Verfügbarkeit wiederhergestellt wird).
In einer Ausführungsform wird die Mischung von Thrombin und Fibrinogen/Faktor XIII-Präzipitat in einem Puffer mit niedrigem pH hergestellt (wobei die Gerinnung von Fibrinogen durch Thrombin durch niedrigen pH (weniger als 5,5) inhibiert wird). In dieser Ausführungsform wird bei Neutralisierung der Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Puffer oder, alternativ, bei Kontakt der Mischung mit den eigenen Körperflüssigkeiten des Patienten die Thrombin-Aktivität wiederhergestellt und die Gerinnung rasch initiiert. Bei dieser Ausführungsform kann das Fibrinogen/Faktor XIII-Präzipitat bei einem niedrigen pH hergestellt werden oder, alternativ, kann ein Puffer mit niedrigem pH verwendet werden, um das Plasma-Präzipitat und das lyophilisierte Thrombin aufzulösen. In jedem der beiden Fälle kann die Mischung in einen Abgabebehälter (wie eine Zerstäuberflasche oder Spritze) überführt werden und direkt auf die Körperstelle aufgebracht werden, wenn die Bedingungen so sind, dass die Körperflüssigkeiten des Patienten ausreichend sind, um den pH bis zu einem Punkt zu erhöhen, bei dem eine Gerinnung auftritt. Wenn die Bedingungen so sind, dass die Körperflüssigkeiten des Patienten nicht ausreichend sind, um den pH der Präzipitat/Thrombin-Mischung bis zu einem Punkt zu erhöhen, bei dem die Thrombin-Aktivität wiederhergestellt wird, kann eine Abgabevorrichtung verwendet werden, die so gestaltet ist, dass, während die saure Mischung aus der Vorrichtung austritt, sie mit Puffersalzen, die als Beschichtung auf einem inneren Abschnitt der Vorrichtung aufgebracht sind, in Berührung gebracht wird. Die Puffersalze sind so auswählt, dass, wenn ein Kontakt mit der sauren Mischung hergestellt wird, eine Auflösung erfolgt mit dem Ergebnis, dass der pH bis zu einem Punkt erhöht wird, bei dem eine Gerinnung stattfindet. Beispielsweise kann eine Spritze als Abgabevorrichtung (Applikator) verwendet werden, wobei die Spritze mit einer Einwegspitze ausgestattet ist, deren innere Oberfläche mit geeigneten Puffersalzen beschichtet ist. Während die saure Mischung durch die beschichtete Spitze hindurchtritt, neutralisiert der Puffer (beispielsweise in Form von Kristallen oder eines Gels) die saure Mischung, wodurch die Thrombin-Aktivität wiederhergestellt wird und, die Bildung eines Gerinnsels an der gewünschten Stelle bewirkt wird. Sollte eine Gerinnselbildung in der Spitze auftreten, kann die Spitze einfach entfernt und eine neue beschichtete Spitze angefügt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann die Fibrinogen- und Faktor XIII-Präzipitat/Thrombin-Mischung in einem Puffer hergestellt werden, der an Calcium verarmt ist. Eine schnelle Gerinnselbildung erfordert die Anwesenheit von Calciumionen; folglich wird, wenn das Calcium entfernt ist, die Fibrin-Polymerisation inhibiert (siehe Carr et al. Biochem. J. (1986) 239: 513, Kaminski et al. J. Biol. Chem (1983) 258: 10530; Kanalde et al. (1982) 13: 229). Calcium-Chelatoren (Verbindungen, wie Natriumcitrat oder Ethylendiamintetraessigsäure, die Calcium fest binden und es unzugänglich machen) können der Lösung, die verwendet wird, um das Fibrinogen und den Faktor XIII zu präzipitieren, und/oder dem Auflösungspuffer zugesetzt werden. Um die Aktivität wiederherzustellen, kann der Behälter (beispielsweise eine Spritze) an eine sterile Einwegspitze angefügt werden, deren innere Oberfläche innen mit ausreichend Calciumsalz beschichtet ist, um den Chelator zu sättigen. Da die Konzentration an freiem Calcium beim Hindurchtreten der Mischung durch die Spitze steigt, wird an der Körperstelle eine Gerinnung bewirkt.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Gerinnungsaktivität von Thrombin in der Präzipitat/Thrombin-Mischung inhibiert werden, indem ein photosensitiver Inhibitor verwendet wird. Beispielsweise können lichtempfindliche Cinnamoylderivate verwendet werden, um Thrombin bei Raumtemperatur in Abwesenheit von Licht für mehr als 26 Stunden zu inaktivieren (Turner et al. J. Am. Chem. Soc. 109: 1274-1275 (1987); Turner et al. J. Am. Chem. Soc. 110: 244-250 (1988)). Eben diese Thrombin-Inhibitor- Komplexe können aktives Thrombin innerhalb von 1-2 Sekunden Bestrahlung (geringe Intensität) erzeugen. Diese Inhibitoren bilden bekannterweise Acyl-Enzym-Komplexe, die die Serin- Hydroxylgruppe des aktiven Zentrums (SER 195) mit einbeziehen. Bei einer Bestrahlung durchläuft das Cinnamoylderivat eine Photoisomerisierung unter Freisetzung von Cumann und Regeneration der aktiven Serin-Hydroxylgruppe. Da Cumarinderivate keine guten Thrombin-Inhibitoren sind, entfernt diese Photocyclisierungsreaktion wirksam Inhibitor aus der Enzymlösung. Folglich kann eine Lösung des Fibrinogen/Faktor XIII-angereicherten Präzipitats mit lyophilisiertem Inhibitor:Thrombin-Komplex in einer dunklen Umgebung (wie einer lichtundurchlässigen oder gefärbten Spritze oder einem lichtundurchlässigen oder gefärbten Behälter) gemischt und an die Wundstelle abgegeben werden. Eine Aktivierung des Enzyms und folglich eine Gerinnselbildung tritt bei Abgabe an die Wunde aufgrund der Exposition der Lösung gegenüber normalem Raumlicht auf. Alternativ kann die Aktivierung durch eine Lichtquelle, beispielsweise eine, die direkt in den Applikator eingebaut ist, gesteuert werden, so dass Variationen bei den Belichtungsbedingungen nicht zu variablen Gerinnungszeiten führen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Kit, der für eine Verwendung in dem oben beschriebenen Verfahren zum Abgeben von Fibrin-Versiegelungsmittel-Komponenten an eine Wundestelle geeignet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Kit einen Applikator, der so gestaltet ist, dass er das Mischen des Fibrinogen/Faktor XIII-Präzipitats und von Thrombin in einem einzelnen System erlaubt. Der Applikator kann einer sein, der das Auftragen beispielsweise eines Films oder einer dünnen Linie der Komponenten des Fibrin-Versiegelungsmittels an der Körperstelle erlaubt. Alternativ kann ein Pump- oder Aerosol-Zerstäubungsapplikator verwendet werden.
Wie oben vorgeschlagen, kann der Applikator beispielsweise die Form einer Glas- oder Kunststoffspritze mit Einwegspitzen einnehmen. Die Gestalt der Spitze wird die Form bestimmen, in der die Komponenten abgegeben werden. Eine Spitze mit einem flachen, breiten Ende kann verwendet werden, um einen dünnen breiten Streifen aus Fibrin-Versiegelungsmittel abzugeben, wohingegen ein enges röhrenförmiges Ende verwendet werden kann, um einen runden Faden von Versiegelungsmittel abzugeben. Ein Ausüben von Druck, um die Mischung durch eine Spitze, die beispielsweise mit einem Maschensieb verengt ist, zu treiben, kann eingesetzt werden, um einen Sprühnebel zu erzeugen, was zu einer feinen Glasur aus Fibrin-Versiegelungsmittel führt. In einer anderen Ausführungsform, die besonders für eine Verwendung mit dem oben beschriebenen photosensitiven Thrombininhibitor geeignet ist, kann der Applikator die Form einer Pump- oder Aerosol-Zerstäubungsvorrichtung mit einer eingebauten Lichtquelle, die so angeordnet ist, dass, wenn die Versiegelungsmittel-Komponenten aus der Vorrichtung austreten, sie mit dem Licht bestrahlt werden, einnehmen. Die Wellenlänge des verwendeten Lichts würde von dem Photosensibilisator abhängen.
Der Kit kann so aufgebaut sein, dass er individuelle Aufbewahrungsbehälter für die getrennten Fibrin-Versiegelungsmittelkomponenten umfasst. Der Kit kann auch einen oder mehrere andere Aufbewahrungsbehälter, in denen jegliche notwendige Reagenzien, einschliesslich Lösemitteln, Puffern u. s. w., untergebracht sind, umfassen.
Die Erfindung wird detaillierter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verstanden.

BEISPIEL

Ein Fibrinogen und Faktor XIII enthaltendes Präzipitat wurde, wie folgt, hergestellt:
Vierhundertfünfzig Mikroliter einer 1 M Zinksulfat-Stammlösung wurden zu 5 ml von mit Antikoagulans versetztem (Citrat-Phosphat- Dextrose-Adenin (CPDA-1)) menschlichem Plasma zugesetzt. Die Lösung wurde ohne Vortexen gut gemischt und bei 2000 bis 9000 g für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert und verworfen.
Inhibition der Gerinnung und Reaktivierung wurden durch eine der folgenden Methoden erzielt:
A. Säureinhibition - Lyophilisiertes Rinder-Thrombin wurde in Citratpuffer (500 mM Citronensäure, 150 mM NaCl und 20 mM EACA, pH 4, 5) auf eine Endkonzentration von 100 U/ml gelöst. Präzipitiertes Fibrinogen wurde in Tris-Puffer (50 mM Tris, 250 mM Natriumcitrat, 150 mM Natriumchlorid, 50 mM Arginin (Arg) und 20 mM α-Aminocapronsäure (EACA), pH 7,4) auf eine Konzentration von annähernd 15,0 mg/ml gelöst. Diese Fibrinogen-Stammlösung wurde dann 25-fach in Citratpuffer verdünnt. Die Gerinnungszeit für 200 Mikroliter dieser Fibrinogenlösung plus 100 Mikroliter Thrombin überschritt in einem Becton Dickinson BBL-Fibrosystem-Fibrometer unter Standardbedingungen 90 Sekunden, was keine Gerinnselbildung anzeigt. Eine Zugabe von 70 Mikrolitern 1 N Natriumhydroxid führte zu einer Gerinnselbildung in 3,8 Sekunden (Durchschnittswert von 10 Proben).
Die folgenden Vorgehensweisen können für ein Auftragen auf eine Wundstelle verwendet werden:
Wo Körperflüssigkeiten ausreichend sind, um die saure Mischung aus Präzipitat und Thrombin zu neutralisieren, kann die Mischung direkt auf die Wundstelle aufgetragen werden. Alternativ kann die Abgabevorrichtung mit Einwegspitzen, die innen mit einem neutralisierenden Salz oder Gel (z. B. Tris) beschichtet sind, verbunden werden. Eine Neutralisierung der sauren Lösung durch die Puffersalze aktiviert Thrombin und stellt die Gerinnungsaktivität wieder her.
B. Chelator-Inhibition - Präzipitiertes Fibrinogen und lyophilisiertes Rinder-Thrombin wurden in Tris-Puffer (50 mM Tris, 250 mM Natriumcitrat, 150 mM Natriumchlorid, 50 mM Arg und 20 mM EACA, pH 7,4) auf eine Konzentration von annähernd 15,0 mg/ml bzw. 100 U/ml gelöst. Die Fibrinogen-Stammlösung wurde dann 25-fach in Tris-Puffer, der 500 mM Natriumcitrat enthielt, verdünnt. Die Gerinnungszeit für 200 Mikroliter dieser Fibrinogenlösung plus 100 Mikroliter Thrombin überschritt in einem Becton Dickinson BBL-Fibrosystem-Fibrometer unter Standardbedingungen 90 Sekunden. Eine Zugabe von 50 Mikrolitern einer 1 M CaCl&sub2;-Lösung führte in 1,8 Sekunden zu einer Gerinnselbildung (Durchschnittswert von 10 Proben).
Die folgende Vorgehensweise kann für ein Auftragen auf eine Wundstelle verwendet werden:
Die Abgabevorrichtung wird mit Einwegspitzen, die innen mit einem Calciumsalz oder -gel beschichtet sind, verbunden. Während die Mischung durch die Spitze hindurchtritt, sättigt der molare Überschuss von Calcium den Chelator, und dadurch wird die Gerinnung gefördert.
C. Photosensitive Inhibition - In Abwesenheit von Licht wurde ein 5- bis 20-facher Überschuss von 4-Amidinophenyl-2-hydroxy-4- diethylamino-alpha-methylcinnamathydrochlorid (Porter et al., J. Amer. Chem. Soc. 111 : 7616 (1989)) Thrombin in Puffer (ungefähr 100 U/ml in 50 mM Tris, 250 mlvi Natriumchlorid, 250 mM Natriumcitrat, 20 mM EACA, 50 mM Arginin (oder Harnstoff), pH 7,4, Methanol-Endkonzentration < 10%) zugesetzt. Man liess die Inhibition mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur fortschreiten.
Eine minimale Menge dieser Lösung wurde verwendet, um das präzipitierte Fibrinogen/Faktor XIII zu lösen. Dieses Versiegelungsmittel benötigte ungefähr 2 bis 3 Minuten Beleuchtung unter Standard-Operationslampen, um vollständig zu gerinnen, wohingegen eine Probenmischung, die im Dunkeln gehalten wurde, nach 90 min keine Gerinnung zeigte.
Die folgende Vorgehensweise kann für ein Auftragen auf eine Wundstelle verwendet werden:
Der photosensitive Inhibitor-Thrombin-Komplex kann mit dem präzipitierten Fibrinogen/Faktor XIII in einer gefärbten Abgabevorrichtung, die Licht der aktivierenden Wellenlängen nicht hindurchlässt, gemischt werden. Eine Abgabe der Mischung an eine beleuchtete Wundstelle führt zu einer Gerinnselbildung.
D. Zwei-Phasen-Suspension (nur zur Information) - Lyophilisiertes Rinder-Thrombin wird in einem Emulgiermittel bis zu einer Endkonzentration von ungefähr 100 U/ml gelöst. Präzipitiertes Fibrinogen/Faktor XIII wird in einem minimalen Volumen Puffer (50 mM Tris, 150 mlvi Natriumchlorid, 250 mM Natriumcitrat, 20 mM EACA, 50 mM Arg, pH 7,4) gelöst. Es wird eine Suspension der nicht mischbaren Flüssigkeiten gebildet. Auf einer Wundoberfläche können Körperflüssigkeiten ausreichend sein, um beide Komponenten zu lösen und ein ordentliches Mischen und eine Gerinnselbildung zu fördern.

Claims

für alle Vertragsstaaten außer Es:

1. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Fibrin-Versiegelungsmittel an einer Körperstelle bilden kann, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Lösung, die Fibrinogen und Faktor XIII enthält, mit reifem Thrombin in einem Behälter-Mittel unter Bedingungen mischt, dass die Thrombin-Gerinnungsaktivität inhibiert wird, wobei das Fibrin-Versiegelungsmittel durch Wiederherstellung der Thrombin-Gerinnungsaktivität vor oder bei Anwendung an der Körperstelle gebildet werden kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die wässrige Lösung ferner eine Menge eines pharmazeutisch verträglichen Calciumsalzes umfasst, die ausreicht, um die Bildung des Fibrin- Versiegelungsmittels zu bewirken, wenn die Thrombin-Gerinnungsaktivität wiederhergestellt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Mischen bei einem pH- Wert von weniger als 5, 5 durchgeführt wird, wobei die Thrombin-Gerinnungsaktivität inhibiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Fibrin-Versiegelungsmittel durch Erhöhung des pH-Wertes der pharmazeutischen Zusammensetzung gebildet werden kann, so dass die Thrombin- Gerinnungsaktivität wiederhergestellt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der pH-Wert der pharmazeutischen Zusammensetzung beim Kontakt der Zusammensetzung mit Körperflüssigkeiten des Patienten, die an der Körperstelle vorliegen, erhöht wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der pH-Wert der pharmazeutischen Zusammensetzung bei Kontakt mit einem Puffer erhöht wird, der den pH-Wert erhöhen kann.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Lösung eine Menge eines photosensitiven Inhibitors der Thrombin-Gerinnungsaktivität einschließt, die ausreicht, um die Thrombin-Gerinnungsaktivität zu inhibieren.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Thrombin-Gerinnungsaktivität durch Bestrahlung der pharmazeutischen Zusammensetzung mit Licht einer Wellenlänge wiederhergestellt wird, die den photosensitiven Inhibitor inaktiviert.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Bedingungen so gewählt sind, dass die Thrombin-Gerinnungsaktivität durch Abwesenheit von Calciumionen inhibiert wird, die ausreicht, um die Bildung des Fibrin-Versiegelungsmittels zu bewirken.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Fibrin-Versiegelungsmittel durch Anwesenheit von Calciumionen gebildet wird, die ausreicht, um die Thrombin-Gerinnungsaktivität wiederherzustellen.

11. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Lösung eine Menge eines Calcium-Chelators in einer Menge einschließt, die ausreicht, um die freien Calciumionen in der Lösung auf einen Anteil zu reduzieren, der nicht ausreicht, um die Bildung des Fibrin-Versiegelungsmittels zu bewirken.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die pharmazeutische Zusammensetzung mit einer Menge an Calciumionen in Kontakt gebracht wird, die ausreicht, um die Bildung des Fibrin- Versiegelungsmittels zu bewirken.

13. Kit zur Verwendung bei der Herstellung Pines Fibrin-Versiegelungsmittels, das einen Applikator umfasst, der

i) ein Behälter-Mittel umfasst, in dem eine Lösung untergebracht ist, die Fibrinogen, Faktor XIII und reifes Thrombin umfasst und

ii) ein Auslassmittel umfasst, das operabel mit dem Behälter-Mittel verbunden ist.

14. Kit nach Anspruch 13, bei dem die Lösung ferner einen Calcium-Chelator umfasst.

15. Kit nach Anspruch 14, bei dem das Auslassmittel ein darin untergebrachtes Calciumsalz enthält.

16. Kit nach Anspruch 13, bei dem die Lösung einen pH-Wert von weniger als etwa 5,5 hat.

17. Kit nach Anspruch 16, bei dem das Auslassmittel ein darin untergebrachtes neutralisierendes Puffersalz enthält.

18. Kit nach Anspruch 13, bei dem die Lösung ferner einen photosensitiven Inhibitor der Thrombin-Gerinnungsaktivität umfasst, wobei das Behälter-Mittel und das Auslassmittel aus einem Material hergestellt sind, das Licht einer Wellenlänge, gegenüber dem der Inhibitor sensitiv ist, nicht überträgt.

19. Kit nach Anspruch 18, bei dem das Auslassmittel, eine Lichtquelle einschließt, die, wenn sie aktiviert ist, Licht einer Wellenlänge emittiert, die den photosensitiven Inhibitor inaktiviert.

20. Zusammensetzung, die gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 erhalten ist, die Fibrinogen, Faktor XIII und reifes Thrombin zusammen mit Mitteln umfasst, die die Thrombin-Gerinnungsaktivität inhibieren.

21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, bei der das Thrombin-inhibierende Mittel eine Säure mit einem pH-Wert von weniger als 5,5 ist.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 20, bei der das Thrombin-inhibierende Mittel ein photosensitiver Inhibitor ist.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 20, bei der das Thrombin-inhibierende Mittel die Abwesenheit von Calciumionen ist.