DE69015019T2

DE69015019T2 - Verfahren zur Fermentation und Isolierung von Bernsteinsäure.

Info

Publication number: DE69015019T2
Application number: DE69015019T
Authority: DE
Inventors: Rathin Datta; David A Glassner; Mahendra K Jain; John R Vick Roy
Original assignee: Michigan Biotechnology Institute
Current assignee: Michigan Biotechnology Institute
Priority date: 1989-06-28
Filing date: 1990-02-20
Publication date: 1995-07-20
Anticipated expiration: 2010-02-21
Also published as: EP0405707B1; NZ231413A; EP0405707A1; AU4938690A; US5168055A; JPH0330685A; AU626634B2; DE69015019D1; ATE115629T1; CA1338905C

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure, bei dem durch Fermentation von Kohlenhydrat ein Bernsteinsäuresalz gebildet, dieses anschließend in Bernsteinsäure umgewandelt und die Bernsteinsäure gereinigt wird.
Bernsteinsäure und ihre Derivate werden in großem Umfang als Spezialchemikalien zur Verwendung für Polymere, Nahrungsmittel, Pharmazeutika und Kosmetika benutzt. Darüber hinaus ist Bernsteinsäure ein wertvolles 4-Kohlenstoffatome enthaltendes Zwischenprodukt bei der Herstellung von 1,4-Butandiol, Tetrahydrofuran und Gamma-Butyrolacton.
Das Succination ist ein übliches Zwischenprodukt beim Stoffwechsel verschiedener anaerobischer Mikroorganismen. Succinat ist ein Zwischengrundstoff für anaerobische Fermentationen durch Propionat erzeugende Bakterien; es wird jedoch nur mit geringen Ausbeuten und in geringen Konzentrationen erzeugt.
Um zu einem technisch brauchbaren Verfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure durch Fermentation zu kommen, müssen verschiedene wichtige die Fermentation und die Reinigung des Produktes betreffende Kriterien erfüllt werden. Die Fermentation sollte mit einer hohen Ausbeute (Gew.-%) erfolgen und bei Verwendung von kostengünstigen Rohmaterialien und Nährstoffen zu einem hochkonzentrierten Endprodukt führen. Da anaerobische Fermentationen bei neutralen oder annähernd neutralen pH-Werten ablaufen, werden bevorzugt Salze organischer Säuren als die Säuren selbst erzeugt. Die Fermentationsbrühe enthält ferner Zellenmaterial, Protein und andere unerwünschte Stoffe. Das gewünschte Verfahrensprodukt ist die gereinigte Säure, die zur Herstellung spezieller oder üblicher chemischer Produkte benutzt werden kann. Um wirtschaftlich tragbar zu sein, muß daher ein wirtschaftliches Fermentationsverfahren mit hoher Ausbeute mit einem wirksamen Rückgewinnungs- und Reinigungsverfahren gekoppelt werden.
Aus der US-A-4564594 ist ein Fermentationsverfahren bekannt, bei dem Pilze der Gattung Rhizopus gezüchtet werden, um Carboxylsäuren, hauptsächlich Ameisensäure zu erzeugen; Calciumcarbonat wird im Überschuß verwendet, um den pH-Wert zu steuern und Calciumsalze der Produktsäuren zu bilden.
Aus der EP-A-249773 ist ein Fermentationverfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure bekannt, bei dem der Mikroorganismus Anaerobiospirillum succiniciproducens bei einem pH-Wert zwischen 5,8 und 6,5 benutzt wird. Gemäß Beispiel 4 dieser Druckschrift wird die Fermentation in einer Aufschlämmung von Ca(OH)&sub2; in Wasser ausgeführt und das Calciumsuccinat kann anschließend als kaum lösliches Calciumsalz abgetrennt werden.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure, bei dem
(a) ein ein Succinat erzeugender Mikroorganismus unter anaerobischen Bedingungen auf einem Kohlenhydratsubstrat in einem Fermentor mit CO&sub2; bei einem Partialdruck von wenigstens 0,1 Atmosphären gezüchtet wird, um ein Succinat mit hoher Ausbeute und hoher Konzentration herzustellen, wobei das Substrat eine Anfangskonzentration an Kohlenhydrat hat, die zwischen etwa 20 g/l und etwa 100 g/l liegt und Natriumionen enthält und einen pH-Wert aufweist, der zwischen etwa 5,8 und etwa 6,6 liegt,
(b) dem Fermentor Ca (OH)&sub2; oder Calciumoxid zugesetzt wird, um gleichzeitig die Brühe zu neutralisieren und das Succinat als Calciumsuccinat auszufällen,
(c) der anfallende Schlamm einer Filtration unterworden wird, um das ausgefällte Calciumsuccinat zu entfernen,
(d) das Calciumsuccinat mit Wasser aufgeschlämmt und der Schlamm mit Schwefelsäure behandelt wird, um ein wässriges Gemisch zu bilden, das Bernsteinsäure, unlösliches Calciumsulfat und alle restlichen Kationen und Anionen enthält,
(e) das unlösliche Calciumsulfat aus dem wässrigen Gemisch entfernt wird,
(f) das wässrige Gemisch mit einem stark sauren Kationaustauscher in der freien Säureform behandelt wird, um Verunreinigungen an Kationen zu entfernen und bei dem
(g) das wässrige Gemisch dann mit einem schwach basischen Anionenaustauscher in der freien Basenform behandelt wird, um alle stark anionischen Verunreinigungen zu entfernen und ein hoch gereinigtes Bernsteinsäureprodukt zu erhalten, das weniger als 1 % stickstoffhaltige Verunreinigungen und weniger als 5 ppm Sulfat enthält.
Die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung beschreiben ein neues Verfahren zur Herstellung von Succinat durch Fermentation, zur Umwandlung des Succinates in Bernsteinsäure und zur Reinigung der Bernsteinsäure zu einem Produkt mit hohem Reinheitsgrad.
Fig. 1 zeigt ein schematisches Fließbild des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, eine Kultur von Anaerobiospirillum succiniciproducens (ATCC 53488) anaerobisch bei einem gesteuerten pH-Wert zwischen etwa 5,8 bis 6,6 in einem Medium, das Kohlenhydrate, andere Nährstoffe, wie z. B. Getreideextrakt, Tryptophan und Natriumionen enthält, bei einem CO&sub2;-Partialdruck von wenigstens etwa 0,1 atm zu züchten bis eine Ausbeute von etwa 75 Gew.-% Succinatsalz, bezogen auf das Gewicht des Kohlenhydrats, erhalten wird und die Fermentationsbrühe wenigstens etwa 20 g/l Succinat enthält.
Der bevorzugte Stamm vergährt Kohlenhydrat in einem Medium, das hohe Acetatkonzentrationen (6-10 g/l Anfangskonzentration) enthält, was zu einer hohen Ergiebigkeit (2-6 g/l Std.) und hohen Succinatkonzentrationen (40-80 g/l) führt. Im Ergebnis ist es möglich, während der Fermentation mit Erfolg ein Calciumsuccinatprodukt in dem Fermentor auszufällen, indem Calciumhydroxid oder Calciumoxid zur Neutralisation benutzt wird. Die bevorzugte Verfahrensweise für die Fermentation und zum Ausfällen ermöglicht die Konzentration und die Reinigung eines verdünnten Produktes durch Filtration. Der Niederschlag hat günstige Filtriereigenschaften und ergibt eine hohe Filtrationsgeschwindigkeit von 0,23-0,57 l/sec. m² (20-50 gal/1 Std. ft²). Es können Fermentoren, die satzweise, mit Chargenbeschickung oder kontinuierlich arbeiten, zur gleichzeitigen Fermentation und zum Ausfällen des Calciumsuccinatproduktes mit Erfolg benutzt werden.
Das so erhaltene Filtrat wird auf etwa 70º bis etwa 95 ºC erhitzt und zum Ausfällen zusätzliches Calciumsuccinat zugegeben und erneut gefiltert. Das erhitzte Filtrat kann mit Calciumsuccinat geimpft werden, falls dies erforderlich ist. Das Filtrat, das gelöste Nährstoffe enthält, wird vorzugsweise in den Fermentor rückgeführt.
Das gewünschte Bernsteinsäureprodukt wird aus dem ausgefällten Calciumsuccinat durch Ansäuern des Succinates mit Schwefelsäure und anschließende Filtration zur Entfernung des Calciumsulfats (Gips), das ausfällt, wiedergewonnen (150-300 g/l).
Das Ansäuern des Calciumsuccinats erfolgt durch Aufschwämmen des Calciumsuccinats mit Wasser, vorzugsweise etwa 33 Gew.-%, Zusatz von Schwefelsäure im Überschuß, um das Calciumsulfat auszufällen und anschließende sorgfältige Neutralisation der überschüssigen Säure mit Calciumhydroxid. Der Filterkuchen des Calciumsulfats wird mit einem Volumen an heißem Wasser, das gleich dem Volumen der Lösung ist, die durch den Filterkuchen erhalten wird, gewaschen, um die gesamte Bernsteinsäure aus dem Filterkuchen zu entfernen.
Der wässrige Strom der Bernsteinsäure (Filtrat) enthält nach der Entfernung des Calciumsulfats außerdem Calcium und andere Kationen, Sulfat und andere Anionen und stickstoffhaltiges Material. Da einige dieser Verunreinigungen in dem Bernsteinsäurestrom ionisch sind, war nicht vorauszusehen, daß die Verunreinigungen entfernt werden können, ohne die Bernsteinsäure selbst zu entfernen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der wässrige Bernsteinsäurestrom zunächst mit einem Kationenaustauscher (z. B. Dowex 50 WX8), der in der Lage ist, positiv geladene Ionen zu entfernen und anschließend mit einem schwach basischen Anionenaustauscher (z. B. Röhm & Haas Amberlit IRA-94) behandelt, der in der Lage ist, negativ geladene Ionen zu entfernen, ohne daß die Bernsteinsäure entfernt wird, die selbst ein ionisiertes Produkt ist, das bei dem Ionenaustauschprozeß verloren gehen könnte. Die geeignete Auswahl der benutzten Typen von Ionenaustauschharzen, die Reihenfolge der Anwendung und die Arbeitsbedingungen sind gleichzeitig notwendig, um die Verunreinigungen von dem wässrigen Strom der Bernsteinsäure zu entfernen, ohne die Bernsteinsäure zu entfernen. Diese Behandlung entfernt ferner einige kontaminierende stickstoffhaltige Verunreinigungen (Proteine und Aminosäuren).
Das Verfahren führt bei niedrigen Kosten zu einem Bernsteinsäureprodukt mit hohem Reinheitsgrad, das Verunreinigungen nur in geringen Konzentrationen enthält. Vorzugsweise enthält das Endprodukt etwa 80-99 % Bernsteinsäure, bezogen auf eine Trockenbasis, weniger als 1 % stickstoffhaltige Verunreinigungen und weniger als 10 ppm Sulfationen oder andere verunreinigende Ionen.
Das Kohlenhydrat, das bei der Fermentation benutzt wird, kann ein beliebiges Kohlenhydrat sein, das durch den benutzten Bakterienstamm fermentiert wird. Für A. succiniciproducens sind diese Kohlenhydratquellen Dextrose, Succharose, Fruktose, Lactose, lösliche Stärke und Getreideextrakte. Die Fermentation wird in einem wässrigen Medium durchgeführt, das Tryptophan, Natriumionen und gelöstes Kohlendioxid enthält. Andere Nährstoffe und Wachstumsfaktoren, die für das Wachstum und die Reproduktion der verwendeten Mikroorganismen benötigt werden, können ebenfalls dem Medium zugesetzt werden.
Die Konzentration des Kohlenhydrats in dem Medium liegt zwischen etwa 20 g/l bis etwa 100 g/l, vorzugsweise zwischen etwa 40 g/l und etwa 80 g/l. Konzentrationen an Kohlenhydrat Über etwa 100 g/l führen zu Lösungen mit derart hohen osmotischen Drucken, daß der Organismus nicht gut wächst. Obschon die Organismen sich in Lösungen vermehren, die weniger als 20 g Kohlenhydrat pro Liter enthalten, ist die Konzentration des Produktes so gering, daß ihre Wiedergewinnung sich gewöhnlich nicht lohnt.
Kohlendioxid kann dem Fermentationsmedium in unterschiedlicher Weise zugeführt werden. Das Medium kann mit CO&sub2;-Gas besprüht werden. Die Fermentation kann in einem unter Druck stehenden Reaktor durchgeführt werden, der Kohlendioxid unter Überdruck enthält. Ferner kann das CO&sub2; mit anderen Gasen gemischt werden, soweit die verwendeten Gase das Wachstum und den Stoffwechsel des benutzten Organismus nicht hemmen. Kohlendioxid kann ferner dem Fermentationsmedium durch Zusatz von Carbonaten oder Bicarbonaten, die dieses Gas unter den Fermentationsbedingungen erzeugen, zugegeben werden. Das Medium sollte gelöstes CO&sub2; im Gleichgewicht mit einem minimalen CO&sub2;-Partialdruck von etwa 0,1 atm enthalten. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird das Medium mit Kohlendioxid gesättigt und die Atmosphäre steht unter einem CO&sub2;-Partialdruck von 0,3 atm oder darüber.
Um Succinatsalz mit einer guten Ausbeute zu erhalten, wird der pH-Wert des Mediums etwa zwischen 5,8 und 6,6 aufrechterhalten. Bei höheren pH-Werten ist das Hauptprodukt eher Lactat als Succinat, während bei niedrigeren pH-Werten die Fermentation gehemmt wird. Der pH-Wert wird üblicherweise durch Zugabe von Alkalicarbonat, Calciumcarbonat, Calciumoxid oder Calciumhydroxid oder Mischungen dieser Stoffe aufrechterhalten.
Der Fermentationsprozeß gemäß vorliegender Erfindung wird bei einer Temperatur zwischen etwa 25 ºC und etwa 45 ºC ausgeführt. Optimales Wachstum des A. succiniciproducens Organismus liegt bei etwa 39 ºC vor. Da der bevorzugte Organismus streng anaerob ist, werden die Fermentationen, bei denen dieser Organismus benutzt wird, unter anaerobischen Bedingungen in einem Medium ausgeführt, das durch Erwärmung oder andere bei Fermentationen bekannte Methoden keimfrei gemacht ist.
Die praktische Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nachfolgend durch Beispiele erläutert.

Beispiele

Bei den Beispielen wurde für die Fermentationen A. succiniciproducens (ATCC 53488) benutzt; die Fermentationen wurden in einem preiswerten Medium durchgeführt, das, soweit nichts anderes erwähnt wurde, handelsübliche Dextrose, 50 g/l und Getreideextrakt 10 g/l (Trockenbasis) enthielt. Nach der Entkeimung wurde das Medium auf 39 ºC abgekühlt und 100 %iges CO&sub2; durch den Fermentor geblasen. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 3M Na&sub2;CO&sub3; eingestellt, soweit nichts anderes erwähnt ist. 25 ppm filtersterilisiertes Tryptophan wurden dem Medium, bevor dieses durch Zugabe von 0,125 g/l Crysteinhydrochlorid reduziert wurde, zugegeben. Die Fermentationen wurden bei 38± 1 ºC in einer Gasphase durchgeführt, die 1,0 atm CO&sub2; enthielt. Der pH-Wert wurde zwischen 6,0 und 6,3 mittels eines Schlammes eingestellt, der 25 Gew.-% eines Kalkes mit hohem industriellen Reinheitsgrad enthielt (Calciumhydroxid).
Die aus der Fermentationsbrühe ausgefällten festen, aus Calciumsuccinat bestehenden Stoffe wurden durch Filtration wiedergewonnen. Das Filtrat wurde dann 15 min. lang auf 80 ºC erhitzt, um weiteres Calciumsuccinat auszufällen, das durch Filtration wiedergewonnen wurde.
A. succiniciproducens-Fermentationen von Kohlenhydraten können in 1-2 l Fermentoren satzweise, mit Chargenzuführung und kontinuierlich durchgeführt werden. Die Fermentationen wurden auf ein Volumen von 80 l übertragen, um die Übertragbarkeit des Verfahrens auf einen größeren Maßstab ohne Beeinträchtigung der Ausbeute und der Produktivität zu überprüfen. Die Rückführung von verbrauchtem Filtrat erfolgte in satzweisen 2 l Fermentationen.
Das ausgefällte Calciumsuccinat wurde bei 39 ºC einer Vakuumfiltratin unterworfen. Brühen von 1 l und 2 l-Fermentationen wurden unter Verwendung von Filterpapier der Nr. 1 in einem keramischen Trichter mit einem Durchmesser von 17 cm gefiltert. Das Filtrat wurde in einem 2 l-Vakuumkolben gesammelt. Der Filterkuchen wurde mit dem minimalen Volumen, das für die Entfernung des gesamten Filtrates erforderlich ist, gewaschen. Für größere Fermentationen wurde zur Filtration ein 0,68 kg/m² (20 Unzen) Filtertuch aus Baumwolle in einem Trichter mit einem Durchmesser von 30-48 cm (12 inch) benutzt. Das Filtrat wurde dann auf 80 ºC erhitzt, mit Calciumsuccinat geimpft und 15 min. lang bis zur Einstellung des Gleichgewichtes gemischt. Der heiße Schlamm wurde anschließend filtriert. Der aus Calciumsuccinat bestehende Filterkuchen wurde mit einer ausreichenden Menge Wasser mit einer Temperatur von 80 ºC gewaschen, um das gesamte Filtrat zu entfernen.
Der gewaschene Calciumsuccinatkuchen wurde erneut bis auf einen Gehalt an Feststoffen von 33 Gew.-% mit Wasser aufgeschlämmt. Konzentrierte Schwefelsäure wurde mit einem Überschuß von 10 % bezogen auf die Menge, die erforderlich ist, um das gesamte Calciumsuccinat in Bernsteinsäure umzuwandeln, langsam zugegeben. Dem Schlamm wurde nach guter Durchmischung die Möglichkeit gegeben, vollständig zu reagieren. Anschließend wurde das erhaltene Gemisch aus Calciumsulfat (Gips) Feststoffen und einer Bernsteinsäurelösung auf 80 ºC erhitzt und im Vakuum unter Verwendung eines 0,68 kg/m²-Filtertuches aus Baumwolle filtriert. Der Filterkuchen wurde mit einer ausreichenden Menge an 80 ºC warmem Wasser gewaschen, um die gesamte Bernsteinsäure zu entfernen.
Nach dem Abfiltrieren des Calciumsulfats (Gips) waren in dem Bernsteinsäurefiltrat noch restliche Kationen, Anionen und stickstoffhaltige Stoffe vorhanden. Unter Verwendugen eines stark sauren Kationenaustauschharzes in der Säureform, wie z. B. Dowex 50Wx8 (Dow Chemical Co., Midland, MI), wurden das Calcium und andere kationische Verunreinigungen entfernt. Die Lösung wurde dann mit einem schwach basischen Anionenaustauschharz in der freien Basenform, Amberlit IRA-94 (z. B. Röhm & Haas Co., Philadelphia, PA) behandelt, das Sulfat und andere starke anionische Verunreinigungen entfernt, ohne die Bernsteinsäure zu entfernen.
Es wurden für die Reinigung des Bernsteinsäurestroms durch Kationenaustausch Glassäulen mit einem Durchmesser von 5,08 cm (2 inch) benutzt. Der Bernsteinsäurestrom wurde kontinuierlich in den Säulen bei Durchflußgeschwindigkeiten von 5-10 Bettvolumen/Std. behandelt. Die Säulen wurden jeweils mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung (1-2 M) oder Salzsäure regeneriert.

Beispiele 1 und 2

In Tabelle 1 sind Ergebnisse von Vergleichsversuchen zusammengefaßt, die bei Fermentationen erhalten wurden, die bei zwei unterschiedlichen pH-Werten von 6,1 und 6,8 durchgeführt wurden. Die Fermentoren wurden mit 100 %igen CO&sub2; mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min. begast. Das Fermentationsmedium wurde durch 25 ppm Tryptophan ergänzt. Wie sich aus Tabelle 1 ergibt, ist das Spektrum des Fermentationsproduktes bei diesen beiden pH-Werten unterschiedlich. Lactat ist das Hauptprodukt, wenn die Fermentation bei einem pH-Wert von 6,8 durchgeführt wird; bei einem pH-Wert von 6,1 ist das Hauptfermentationsprodukt Succinat bei einer Ausbeute von 87 Gew.-%. Unter diesen Bedingungen wird immer Acetat als hauptsächliches Nebenprodukt erzeugt. Ein Wachsen oder Substratverbrauch des Organismus bei einem pH-Wert von 5,5 oder darunter wurde nicht festgestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Fermentationen bei einem pH-Wert zwischen 5,8 und 6,6 durchgeführt werden müssen, um eine hohe Ausbeute an Succinat zu erhalten. Die Succinatausbeute, bezogen auf den Dextroseverbrauch bei optimalem pH-Wert bei der Fermentation liegt bei 87-90 Gew.-%. Tabelle 1 Vergleich von Succinatfermentation (Charge 2 Liter) bei unterschiedlichen pH-Werten; Neutralisation mit Calciumhydroxid Beisp. Dextrose (Beginn), g/l Dextrose (Ende), g/l Fermentationszeit, Std. Produkte, Succinat, g Acetat, g Formiat, g Lactat, g Succinatausbeute, Gew.-% Lactatausbeute, Gew.-% Fermentationsbedingungen: (1) Temperatur 39 ºC (2) Partialdruck CO&sub2; 1,0 atm

Beispiele 3, 4 und 5

Ergebnisse von Chargenfermentationen mit unterschiedlichen Partialdrucken von Kohlendioxid (CO&sub2;) in der Gasphase des Fermentors sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Die Fermentationen wurden bei einem gesteuerten pH-Wert von 6,2 ± 0,1 durchgeführt, wobei die Gasgeschwindigkeit 10 ml/min. betrug. Das Medium wurde ergänzt durch 25 ppm Tryptophan. Die Substratfermentation und die Succinatausbeute werden beeinträchtigt durch den Partialdruck von CO&sub2; in der Gasphase. Mehr Substrat wird fermentiert bei einer Erhöhung des CO&sub2;-Partialdruckes in der Gasphase. Der Gesamtverbrauch des Substrates und die maximale Succinatausbeute wurde nur erreicht bei einem 100 %igen CO&sub2;-Gehalt bei atmospärischen Druck in der Gasphase. Daraus ergibt sich, daß der Partialdruck des CO&sub2; in der Gasphase außerordentlich wichtig ist, um eine vollständige Fermentation des Substrats und eine hohe Konzentration und Ausbeute an Succinat zu erhalten. Tabelle 2 Vergleichende Succinatfermentationen (Chargenbetrieb, 2-Liter) bei unterschiedlichen CO&sub2;-Partialdrucken in der Gasphase; Einstellung des pH-Wertes auf 6,2 mit Calciumhydroxid) Beisp. CO&sub2; Partialdruck atm Dextrose (Beginn), g/l Dextrose (Ende), g/l Fermentationszeit /Std. Produkte, Succinat, g/l Acetat, g/l Formiat, g/l Lactat, g/l Succinatausbeute, Gew.-% Fermentationsbedingungen (1) Temperatur 39 ºC.

Beispiele 6 und 7

Zusätzlich zu der Zufuhr des korrekten CO&sub2;-Druckes für eine erfolgreiche Fermentation durch A. succiniciproducens erfordert die Fermentation ferner die Anwesenheit von Natriumionen. In Tabelle 3 sind Ergebnisse von Succinat-Vergleichsfermentationen zusammengefaßt, die in Anwesenheit und Abwesenheit von Natriumionen in dem Medium erhalten wurden. Tabelle 3 Vergleichende Succinatfermentationen (Chargenbetrieb, 2-Liter) in Anwesenheit und Abwesenheit von Natriumionen; Einstellung des pH-Wertes auf 6,2 mit Calciumhydroxid Beisp. Natriumchlorid g/l Dextrose (Beginn), g/l Dextrose (Ende), g/l Produkte, g/l Succinat Acetat Formiat Lactat Succinatausbeute, Gew.-%
Bei einer Fermentation ohne Zusatz von Natriumionen wurde ein Wachstum oder Substratverbrauch nicht festgestellt. Die Fermentation des Substrates zu Succinat lief daher nur ab, wenn eine geeignete Menge von Natriumionen dem Medium zugefügt wurde. Dies ist auch dem Ergebnissen zu entnehmen, die in den Tabellen 1 und 2 wiedergegeben sind, wenn Natriumionen in Form von Natriumcarbonat zugefügt wurden, um Natriumionen ebenso wie gelöstes Kohlendioxid vorzusehen. Die Ergebnisse zeigten, daß der Zusatz von Natriumionen sehr kritisch war für das Anlaufen und die vollständige Durchführung einer Succinatfermentation mit hoher Ausbeute.
Wenn Fermentationen bei einem Anfangsgehalt von Dextrose von 50-60 g/l ohne Zusatz von Tryptophan durchgeführt wurden, war das Wachstum von A. succiniciproducens sehr gering. Es wurden weniger als 10 g/l Substrat verbraucht. Bei Anwesenheit von Tryptophan in einer Menge von 25 ppm wurde eine vollständige Fermentation der Dextrose bei hoher Ausbeute und Produktivität erhalten. Die Ergebnisse zeigen, daß der Zusatz von Tryptophan notwendig ist, um Succinat mit hoher Ausbeute und eine vollständige Fermentation des Substrats zu erzielen.

Beispiel 8

Fermentation mit Rückführung von verbrauchtem Filtrat

Die Fermentation mit Rückführung von verbrauchtem Filtrat wurde in 2-Liter Fermentoren und einem Gehalt von 100 % CO&sub2; in der Gasphase durchgeführt. Der pH-Wert wurde auf 6,2 ± 0,1 mit 25 Gew.-% Calciumhydroxidschlamm eingestellt. Verbrauchtes Filtrat wurde von einem vorhergehenen Fermentationsdurchlauf erhalten. Verbrauchtes Filtrat wurde dem Fermentationsmedium in einer Menge von 1:1 zugesetzt und es wurden Nährstoffe in angepaßten Mengen zugegeben.
Tabelle 4 faßt die Ergebnisse von Chargenfermentationen mit Rückführung des Filtrats zusammen. Die Ergebnisse zeigten eine vollständige Fermentation von Dextrose. Unerwarteterweise wurde ein Höchstbedarf an Substrat von 5,5 g/l Std. bei einer Gesamtproduktivität von 2,3 g/l Std. erhalten. Die Succinatausbeute bei Fermentationen mit Rückführung des Filtrates lag bei 87 %. Das verbrauchte Filtrat, das den rückgeführten Fermentationen zugefügt wurde, enthält Acetat. Auf diese Weise wurde wegen des anfänglich vorhandenen Acetats eine höhere Konzentration an Acetat am Ende der Rückführungsfermentationen erwartet. Die Ergebnisse zeigen, daß die Substratfermentation durch Rückführung von verbrauchtem Filtrat bei sehr hoher Geschwindigkeit ohne nachteilige Effekte durch höhere Acetatkonzentrationen ablief. Es wurden auch die Kosten des Mediums verringert, weil stickstoffhaltige oder andere lösliche Verunreinigungen rückgeführt wurden und in geringerem Umfang dem Fermentationsmedium zugesetzt werden mußten. Tabelle 4 Succinatfermentation mit Rückführung von verbrauchtem Filtrat bei einem pH-Wert von 6,2; Neutralisation mit Calciumhydroxid Beisp. Dextrose (Beginn), g Dextrose (Ende), g Höchstbedarf an Substrat, g/l Std. Gesamtproduktivität, g/l Std. Produkte Succinat, g Acetat, g Formiat, g Succinatausbeute (Gew.-%) Fermentationsbedingungen: (1) CO&sub2;-Partialdruck 1,0 (2) Temperatur 39 ºC
Für einen wirtschaftlichen Prozeß werden eine hohe Ausbeute und eine hohe Produktivität bei niedrigen Kosten des Mediums in Verbindung mit wirksamen Rückgewinnungs- und Reinigungsstufen benötigt. Es wurde eine sehr hohe Ausbeute und Produktivität an Succinat bei einem preisgünstigen Medium, unabhängig von der Art der Fermentation (insbesondere satzweise, mit Chargenbeschickung in kleinem Maßstab, in großem Maßstab, mehrstufig kontinuierlich) und mit oder ohne Rückführung von verbrauchtem Filtrat erzielt. Der Zusatz von verbrauchtem Filtrat zu der Fermentation bis zu einem Gehalt von 50 % verringerte die Succinatausbeute nicht und erhöhte damit die Produktivität der Fermentation.

Beispiel 9

Rückgewinnung von Calciumsuccinat

Gleichzeitige Kohlenhydratfermentationen mit Ausfällung von Succinatprodukt als Calciumsuccinat wurde in der Fermentationsstufe erreicht. Die erste Stufe bei der Konzentration und Reinigung des Succinatschlammes war die Filtration. Das Filtrat und der Filterkuchen wurden beide für die weitere Verarbeitung gesammelt.

Beispiel 10

Umwandlung von Calciumsuccinat in Bernsteinsäure

Der aus Calciumsuccinat bestehende Filterkuchen wurde mit Schwefelsäure angesäuert und dann der aus festem Calciumsulfat (Gips) und Bernsteinsäurelösung bestehende Schlamm filtriert, um den Gips zu entfernen.
Eine Menge an Schwefelsäure, die um 10 % höher war als für die vollständige Reaktion mit dem Calciumsuccinat erforderlich, wurde zugegeben, um den Filterkuchen vollständig anzusäuern. Nach Ablauf der für die vollständige Reaktion erforderlichen Zeit wurde die überschüssige Schwefelsäure mit Calciumhydroxid neutralisiert. Der Schlamm wurde auf 80 ºC erhitzt und der Gips durch Filtration entfernt.
Anschließend wurde das Calciumsulfat durch Filtration entfernt. Die Filtrationsgeschwindigkeit betrug 64 gal/Std. ft². Der Filterkuchen wurde mit einem Volumen an heißem Wasser gewaschen, das dem Volumen der in dem Filterkuchen enthaltenen Lösung entsprach, um die gesamte Bernsteinsäure zu entfernen. Die Konzentration an Bernsteinsäure in dem löslichen Produkt lag in Abhängigkeit von dem Reinheitsgrad des anfänglich gesammelten Calciumsuccinatkuchens zwischen 10 und 30 Gew.-%.
Der Reinheitsgrad der Bernsteinsäure wurde von 52,1 % auf 89,6 % durch Ansäuern und Filtration verbessert. Das Calciumion wurde von 36,6 % auf 1,6 % (d.b.) durch den Ansäuerungs- und Filtrationsprozeß reduziert. Stickstoffhaltige Verunreinigungen (Protein) wurden von etwa 10 Gew.-% Succinat auf 1,67 Gew.-% Succinat reduziert.

Beispiel 11

Reinigung von Bernsteinsäure durch Ionenaustausch

Der Bernsteinsäurestrom enthielt nach der Gipsfiltration Calcium und andere Kationen, Sulfat und andere Anionen und stickstoffhaltige Verunreinigungen. Tabelle 10 zeigt die Zusammensetzung des Stromes an dieser Stelle des Verfahrens.
Sorgfältig ausgewählte Ionenaustauschverfahren wurden benutzt, um die kontaminierenden Ionen zu entfernen. Stark saures Kationenaustauschharz Dowex 50Wx8 (Dow Chemical Co., Midland, MI) im H&spplus;-Zyklus wurde in einer kontinuierlichen Strömungssäule benutzt, um das restliche Calcium und andere Kationen zu entfernen. Die Bernsteinsäure wird in diesem Harz nicht ausgetauscht.
Zufällig und völlig unerwartet wurden auch einige stickstoffhaltige Verunreinigungen (Aminosäuren und Proteine) gleichzeitig mit den Calciumionen entfernt.
Der Produktstrom von der Reinigungsstufe mit dem Kationenaustauscher enthält noch anionische Verunreinigungen wie z. B. Sulfat (SO&sub4;&supmin;&supmin;) und stickstoffhaltige Verunreinigungen (Proteine und Aminosäuren). Die Entfernung der anionischen Verunreinigungen aus der Bernsteinsäure, die das Succinat-Anion enthielt, ist deswegen schwierig, weil die Ionenaustauschstellen mit dem Succinat-Anion gesättigt werden können und die anionische Verunreinigung nicht entfernen. Es wurde jedoch gefunden, daß bestimmte schwach basische Anionenaustauschharze, unter diesen Amberlit IRA-94 (Röhm & Haas Co., Philadelphia, PA) im freien Basenzyklus zur Entfernung der verunreinigenden Anionen in Anwesenheit von Succinat-Anionen geeignet sind. Das Harz wurde in einer kontinuierlichen Durchflußsäule benutzt. Das verunreinigende (SO&sub4;&supmin;&supmin;)-Anion wurde bis unter die Bestimmungsgrenze von 5 ppm entfernt, während die Bernsteinsäure nicht ausgetauscht wurde. Einige der restlichen stickstoffhaltigen Verunreinigungen wurden entfernt und es wurde ein Bernsteinsäureprodukt erhalten, das weniger als 1 % stickstoffhaltiges Material enthielt. Der wässrige Strom enthielt 14 bis 30 Gew.-% Bernsteinsäure an dieser Stelle des Verfahrens.
Der Gesamtprozeß wird im folgenden in Zusammenhang mit dem auf Fig. 1 dargestellten Fließschema beschrieben. Getreideextrakt, falls notwendig ein Reduktionsmittel und ein Natriumsalz, werden kontinuierlich durch Erhitzung keimfrei gemacht und mit einem fermentierbaren Kohlenhydrat gemischt, das der Mischung als kontinuierlich in der Hitze keimfrei gemachtes Konzentrat zugeführt wird. Das Gemisch wird gekühlt und dem ersten (Zucht)-Fermentor 11 zugeführt. Das Tryptophan wird, falls erforderlich, keimfrei gemacht und mit den anderen Komponenten des Mediums nach Kühlung vermischt und ebenfalls dem Fermentor 11 zugegeben. Kohlendioxid wird kontinuierlich einer Sterilfiltration unterworfen und dem Fermentor 11 zugegeben. Zusätzlich wird ein steriler Schlamm mit 20 bis 50 % w/w Calciumhydroxid oder Calciumoxid (Kalk) in den Fermentor 11 gegeben, falls dies zur Steuerung des pH-Wertes notwendig ist.
Das fertige Medium in dem Fermentor 11 enthält 25-80 g/l d.b. Kohlenhydrat, 5-20 g/l d.b. Getreideextrakt oder eine andere komplexe Proteinquelle, 5-50 ppm Tryptophan und Natriumsalze in einer eingestellten Konzentration. Wenn der Prozeß läuft, bildet verbrauchtes Filtrat, das in den Fermentor 11 zurückgeleitet wird, 0-90 % v/v der gesamten Beschickung.
Die optimalen Bedingungen für die Fermentation hängen von dem ausgewählten Mikroorganismus ab. Der bevorzugte Organismus A. succiniciproducens wird wegen seiner hohen Ausbeute und der hohen Ergiebigkeit bei hohen Succinatkonzentrationen ausgewählt. Für A. succiniciproducens sind folgende Bedingungen optimal:
Fermentationstemperatur 32-42 ºC, pH-Wert 5,8.-6,6 und ein positiver Kohlendioxiddruck (Überdruck).
Zurückkommend auf Fig. 1 wird Calciumhydroxid dem Zucht-Fermentor 11 und im Bedarfsfall dem Hauptfermentor 12 zugeführt, um den pH-Wert in dem gewünschten Bereich zu halten. Den Fermentoren 11 und 12 wird ferner Kohlendioxid kontinuierlich zugegeben, um den Bedarf an CO&sub2; für den Stoffwechsel zu decken und die anaerobischen Bedingungen aufrechtzuerhalten. Die Strömungsgeschwindigkeit des Kohlendioxid beträgt 0,1 bis 2,0 Fermentorvolumen pro Stunde.
Fig. 1 zeigt ein zweistufiges kontinuierliches Fermentationsverfahren. Jedoch wurde festgestellt, daß Fermentationen, die satzweise, mit Chargenzufuhr und kontinuierlich durchgeführt wurden, sämtlich zu einer hohen Ausbeute bei hoher Ergiebigkeit führten. Auf dieser Basis könnte die Fermentation im Chargenbetrieb oder kontinuierlich durchgeführt werden. Es können auch kombinierte Verfahren für die Fermentation angewandt werden. Die zweistufige kontinuierliche Verfahrensweise ergibt eine hohe Succinatausbeute ohne Zeitverluste, die zwischen Chargenfermentationen erforderlich sind.
Der Fermentationsprozeß erzeugt einen Schlamm aus Calciumsuccinat in Fermentationsbrühe. Das Calciumsuccinat wird konzentriert und von der Fermentationsbrühe durch Filtration getrennt. Der anfallende Filterkuchen wird mit einem äquivalenten Volumen einer gesättigten Calciumsuccinatlösung oder Wasser bei 37 ºC gewaschen, um die gesamte Filtratbrühe aus dem Kuchen zu entfernen.
Wie sich aus Fig. 1 weiterhin ergibt, wird in der Stufe, in der das Calciumsuccinat wiedergewonnen wird, der endgültige Fermentationsschlamm aus dem Hauptfermentor 12 abgezogen und zunächst einem Zyklon-Trenner 13 oder einem Absetzgefäß zugeführt, in dem die aus Calciumsuccinat bestehenden Feststoffe von der überschüssigen Lösung getrennt werden. Die überschüssige Lösung wird nach Verlassen der Trenneinrichtung 13 auf 70-95 ºC erhitzt, um weiteres Calciumsuccinat auszufällen; der anfallende Schlamm wird einer zweiten Trenneinrichtung 14 zugeführt. Die Feststoffe, die in beiden Trenneinrichtungen 13 und 14 anfallen, werden gemeinsam auf ein Filter 15 aufgegeben. In diesem wird ein 30-60 Gew.-% Succinat enthaltender Kuchen aus dem Filtrat abgetrennt und mit einem Feststoffvolumen einer heißen (70-95 ºC) mit Calciumsuccinat gesättigten Lösung oder einem Heißwasserstrom gewaschen. Das Waschen ist notwendig, um Verunreinigungen aus dem Filterkuchen zu entfernen. Das Filtrat wird mit der überschüssigen Lösung aus der zweiten Trenneinrichtung 14 vereint und der Strom in zwei Portionen aufgeteilt. Ein Teil (0-90 %) dieses verbrauchten Filtrats wird zurück zu dem Zucht-Fermentor 11 geleitet. Der Rest des Filtrats wird anaerobisch behandelt, um Kohlendioxid und Methan aus den restlichen organischen Säuren herzustellen. Das aus dem Kuchen ausgewaschene Filtrat wird in die zweite Trenneinrichtung 14 rückgeführt.
Die Wiedergewinnung der Bernsteinsäure aus der Calciumsuccinat enthaltenden Portion des Verfahrens gemäß Fig. 1 wird nachfolgend beschrieben.
Der aus Calciumsuccinat bestehende Filterkuchen wird mit Schwefelsäure angesäuert, um Bernsteinsäure und Calciumsulfat zu erzeugen. Das Calciumsulfat fällt als Gips (CaSO&sub4; x 2H&sub2;O) aus und wird aus der Bernsteinsäure durch Filtrieren entfernt.
Auf einer stöchometrischen Basis wird etwa 5 bis etwa 10 % überschüssige Schwefelsäure zur Ansäuerung zugegeben. Nach einer geeigneten Wartezeit zum Einstellen vollständig angesäuerter Bedingungen wird die überschüssige Schwefelsäure mit Calciumhydroxid neutralisiert. Der Schlamm wird auf einer Temperatur von 70-95 ºC gehalten und der Gips durch Filtrieren entfernt.
Gemäß Fig. 1 wird der gewaschene, aus Calciumsuccinat bestehende Filterkuchen aus dem Filter 15, insbesondere einer Bandfilterpresse, herausgenommen und mit Wasser in einem Gefäß 16 auf 20-40 % w/v Feststoffe aufgeschlämmt und einem Ansäuerungsgefäß 17 zugeführt. Konzentrierte Schwefelsäure wird langsam in 5-10 %igem Überschuß zugegeben, um das Calciumsuccinat in dem Schlamm vollständig in Bernsteinsäure umzuwandeln. Die Bernsteinsäure geht in Lösung, während Calciumsulfat (Gips) aus dem Gemisch ausfällt. Die restliche Schwefelsäure wird mit 40-55 %igem industriellen Kalkschlamm in einem Neutralisationsgefäß 18 neutraliesiert. Der Schlamm wird auf 70-95 ºC erhitzt und der ausgefallene Gips durch ein Filter 19 geleitet. Der Filterkuchen wird mit seinem eigenen Volumen mit 70-95 ºC heißem Wasser gewaschen, um die gesamte Succinatsäure wiederzugewinnen und Filtrat und Waschlösung werden vereint. Der gewaschene Gipskuchen ist ein Nebenprodukt.
Der Bernsteinsäurestrom enthält nach dem Abfiltrieren des Calciumsulfates (Gips) Calcium, Sulfat, stickstoffhaltige Verbindungen und Essigsäure als hauptsächliche Verunreinigungen. Durch die Behandlung mit Ionenaustauschern werden die aus Calcium und Sulfat bestehenden Verunreinigungen bis auf unterhalb der Bestimmungsgrenze liegende Konzentrationen entfernt. Gleichzeitig werden einige stickstoffhaltige Stoffe entfernt.
Ein stark saurer Kationenaustauscher, z. B. Dowex 50Wx8 im H&spplus;-Zyklus wird in einer kontinuierlichen Durchflußsäule verwendet, um Calcium und andere Kationen zu entfernen. Ein schwach basischer Anionenaustauscher, z. B. Amberlit IRA-94 im freien Basenzyklus wird verwendet, um Verunreinigungen zu entfernen, die in Form von Sulfat und anderen Anionen vorliegen. Ein sorgfältig gesteuerter Ionenaustauschprozeß macht es möglich, die anionischen Verunreinigungen ohne gleichzeitige Entfernung von Bernsteinsäure zu entfernen.
Nachfolgend wird der Teil der Fig. 1 beschrieben, der sich auf die Reinigung der Bernsteinsäure durch Ionenaustausch bezieht.
Die Bernsteinsäurelösung aus der Bandfilterpresse 19 wird einer Kolonne 20 zugeführt, die mit einem stark sauren Kationenaustauschharz im Wasserstoffzyklus gefüllt ist. Calcium und andere Kationen werden durch diesen Ionenaustauscher entfernt. Die Lösung tritt dann durch eine Kolonne 21 mit einem schwach basischen Anionenaustauscher, in der das Harz bis zu seiner Grenze mit starken Anionen beladen wird, um Verluste an Bernsteinsäure zu vermeiden. Dieses Harz ist in der freien Basenform. Sowohl die Kationen als auch die Anionenharze können mit üblichen Methoden regeneriert werden. Das Bernsteinsäureprodukt, das auf diese Weise erhalten wird, enthält weniger als 1 % stickstoffhaltige Verunreinigungen (Protein) und Kationen, wie Calcium und Anionen, z. B. Sulfat in nicht nachweisbaren Konzentrationen.
Die geringen Konzentrationen an Verunreinigungen macht das Produkt besonders geeignet für die Verwendung als spezielle oder übliche Chemikalien. Zur Umwandlung in übliche Zwischenprodukte kann die Lösung weiter durch Verdampfung konzentriert werden. Ein zusätzlicher Reinheitsgrad, falls erforderlich, kann durch Kristallisation, Kohlenstoffabsorbtion, elektrochemische Methoden, Veresterung und nachfolgende Destillation der flüchtigen Ester erhalten werden. Die verdampfte Lösung kann einer weiteren Erwärmung unterworfen werden, um Bernsteinsäureanhydrid zu erzeugen, das flüchtig ist und durch Destillation und Kondensation des Anhydrids wiedergewonnen werden kann.
Für den Fachmann liegt auf der Hand, daß die wirtschaftliche Herstellung von Bernsteinsäure aus Kohlenhydraten für die Verwendung als spezielle und übliche Chemikalien einen Fermentationsprozeß erfordert, bei dem kostengünstige Nährböden benutzt werden, der bei großer Produktivität zu einem Produkt mit hoher Konzentration führt und eine wirksame und kostengünstige Reinigung ermöglicht. Das erfindungsgemäße Verfahren erfüllt diese Erfordernisse.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure, bei dem

(a) ein ein Succinat erzeugender Mikroorganismus unter anaerobischen Bedingungen auf einem Kohlenhydratsubstrat in einem Fermentor mit CO&sub2; bei einem Partialdruck von wenigstens 0,1 Atmosphären gezüchtet wird, um ein Succinat mit hoher Ausbeute und hoher Konzentration herzustellen, wobei das Substrat eine Anfangskonzentration an Kohlenhydrat hat, die zwischen etwa 20g/l und etwa 100g/l liegt und Natriumionen enthält und einen pH-Wert aufweist, der zwischen etwa 5,8 und etwa 6,6 liegt,

(b) dem Fermentor Ca (OH)&sub2; oder Calziumoxid zugesetzt wird, um gleichzeitig die Brühe zu neutralisieren und das Succinat als Calziumsuccinat auszufällen, dadurch gekennzeichnet, daß

(c) der anfallende Schlamm einer Filtration unterworden wird, um das ausgefällte Calciumsuccinat zu entfernen,

(d) das Calciumsuccinat mit Wasser aufgeschlämmt und der Schlamm mit Schwefelsäure behandelt wird, um ein wässriges Gemisch zu bilden, das Bernsteinsäure, unlösliches Calciumsulfat und alle restlichen Kationen und Anionen enthält,

(e) das unlösliche Calciumsulfat aus dem wässrigen Gemisch entfernt wird,

(f) das wässrige Gemisch mit einem stark sauren Kationaustauscher in der freien Säureform behandelt wird, um Verunreinigungen an Kationen zu entfernen und daß

(g) das wässrige Gemisch dann mit einem schwach basischen Anionenaustauscher in der freien Basenform behandelt wird, um alle stark anionischen Verunreinigungen zu entfernen und ein hoch gereinigtes Bernsteinsäureprodukt zu erhalten, das weniger als 1% stickstoffhaltige Verunreinigungen und weniger als 5 ppm Sulfat enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Filtrat, das in der Stufe (c) erhalten wird, auf eine Temperatur von etwa 70 bis etwa 95 ºC erhitzt wird, um das gesamte verfügbare Calciumsuccinat niederzuschlagen, das dann durch Filtration entfernt wird, und daß das Nährboden enthaltende Filtrat in den Fermentor zurückgeführt wird.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung chargenweise durchgeführt wird.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung mit chargenweiser Zugabe durchgeführt wird.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung kontinuierlich durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus die typischen Eigenschaften von Anaerobiospirillum succiniciproducens ATCC 53488 hat.