KR20020005200A - 목질계 당화액을 이용한 숙신산의 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 목질계 당화액(wood hydrolysate)을 이용한 숙신산의 생물학적 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 목질계 당화액을 이용한 숙신산의 생산방법은, 목질계 당화액을 탄소원으로 포함하는 배지에 숙신산 발효미생물을 접종하고, 발효시키는 공정을 포함한다. 본 발명에 의하면, 정제된 포도당 대신에 값싼 재생자원인 목질계 당화액을 탄소원으로 사용하여, 경제적으로 숙신산을 생산할 수 있다.

Description

목질계 당화액을 이용한 숙신산의 생산방법{Method for Producing Succinic Acid Using Wood Hydrolysate}
본 발명은 목질계 당화액(wood hydrolysate)을 이용한 숙신산의 생물학적 생산방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 목질계 당화액을 발효원료로 포함하는 배양배지에 숙신산 발효미생물을 접종하고 발효시킴으로써, 숙신산을 경제적으로 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
최근 환경규제의 강화로 인해 석유화학 제품 및 화학적 합성공정에 의한 생성물의 생산단가, 이용 및 처리비용 등이 급격히 상승한 반면, 미생물 배양기술과 유전공학적 기술의 획기적인 발달에 힘입어 생물학적 방법에 의한 생물학적 물질(biochemical)의 생산이 점차 관심을 끌고 있다. 이러한 생물학적 방법에 의한 생물학적 물질의 생산은 사용원료가 값싼 재생자원(renewable resource)이라는 측면에서 화학합성법보다 경제적인 우월성을 인정받고 있으며, 환경친화적 공정이라는 장점이 있으므로, 이를 대량생산에 적용하고 전체적인 원가절감 효과를 얻기 위하여 점차 연구가 확대되고 있는 추세이다(참조: Landucci et al., Appl. Biochem. Biotechnol., l45:678-696, 1994). 또한, 최근들어 생물학적 물질의 가격이 많이 하락하여 이에 대한 시장성이 매우 높아지고 있는 상태이며, 이러한 이유로 인해 미생물을 이용하여 생물자원(biomass)으로부터 젖산(lactic acid), 초산(acetic acid), 숙신산(succinic acid) 등의 유기산을 생물학적 방법에 의하여 생산하고자 하는 노력이 활발히 이루어지고 있다(참조: 임억규, 생물산업,5:60-75, 1992).
숙신산의 생물학적 생산에 대한 연구는 1938년 록우드(Lockwood) 등이 미생물 푸사리움 마티(Fusarium martii)를 이용하여, 당으로부터 18%의 수율로 숙신산을 생산한 것을 발표하면서 시작되었다. 그 후, 포도당대사를 통하여 숙신산을 최종산물로 생성하는 많은 종류의 혐기성 미생물이 보고된 이래(참조: Zeikus, Annu. Rev. Microbiol., 34:423-464, 1980), 최근에 이르러 과량의 탄소 존재시에 포도당으로부터 높은 농도와 수율로 숙신산을 생산하는 것으로 보고된 언에어로바이오스피리움 숙시니시프로두센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens)를 제외하고는, 산업적으로 유용한 높은 수율로 숙신산을 생산하는 균주는 보고되지 않았다.
생물학적 방법에 의한 숙신산의 생산방법에 대해서는 미국특허 제 5,143,833호 및 제 5,143,834호에서 혐기적 조건의 발효에 의한 숙신산의 생산방법 및 분리방법이 개시되어 있으나, 전기 발명에서는 미생물의 에너지원으로 정제된 포도당을 이용함으로써, 단순히 숙신산을 발효방법에 의하여 생산할 수 있다는 가능성을 제시하였을 뿐, 숙신산의 최적화된 생산방법이나 환경문제를 고려한 원료의 선택 등에 대한 고려는 포함되지 않았다.
숙신산은 현재 화학공정에 의한 생산방법과 비교하여 가격경쟁력을 가질 수 있는 것으로 예측되는 몇 가지 대체 생물학적 물질 중의 하나이므로, 일정량 이상의 당분이 함유된 재생자원을 이용하여 생물학적인 방법으로 숙신산을 생산할 수 있다면, 생산비용의 절감 및 자원의 재활용이라는 측면에서 각광받을 수 있겠으나, 아직 재생자원을 이용한 생물학적인 방법에 의한 숙신산의 생산방법에 대한 연구는 제대로 수행되지 않고 있는 실정이다.
따라서, 재생자원을 이용한 생물학적 방법으로 숙신산을 생산할 수 있는 기술을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 재생자원을 이용한 생물학적 방법으로 숙신산을 생산할 수 있는 기술을 확립하고자 예의 연구노력한 결과, 종래의 숙신산의 발효공정에서 이용한 정제된 포도당 대신에, 포도당의 함량이 높은 재생자원인 목질계 당화액을 탄소원으로 사용하여 숙신산의 발효공정을 수행할 경우, 종래의 정제된 포도당을 탄소원으로 사용하는 방법으로 생산할 수 있는 숙신산 수율과 유사한 수율로 숙신산을 경제적으로 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 목질계 당화액을 탄소원으로 이용하여 숙신산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 21g/L의 포도당이 포함된 목질계 당화액과 폴리펩톤과 효모추출물을 이용한 회분식 발효의 특성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 27g/L의 포도당이 포함된 목질계 당화액과 폴리펩톤과 효모추출물을 이용한 회분식 발효의 특성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 21g/L의 포도당이 포함된 목질계 당화액과 옥수수 분해물을 이용한 회분식 발효의 특성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 27g/L의 포도당이 포함된 목질계 당화액과 옥수수 분해물을 이용한 회분식 발효의 특성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 20g/L의 정제된 포도당과 옥수수 분해물을 이용한 회분식 발효의 특성을 나타낸 그래프이다.
본 발명의 목질계 당화액을 이용한 숙신산의 생산방법은, 목질계 당화액을 탄소원으로 포함하는 배지에 숙신산 발효미생물을 접종하고, 발효시키는 공정을 포함한다.
이때, 사용되는 목질계 당화액은 목재를 펄프 또는 건축자재 등으로 가공할 때 생성되는 잔여부를 200 내지 100mesh, 바람직하게는 170 내지 130mesh, 가장 바람직하게는 150mesh가 되도록 세절하고, 이를 셀룰로스 분해효소로 처리하여 목재의 셀룰로스를 포도당으로 전환시킨 반응산물로서, 종래의 2차적인 효소반응에 의하여 알코올을 제조하는데 이용하였던 물질을 사용한다.
상기한 목질계 당화액을 살균하고, 별도의 전처리 과정 없이 바로 숙신산 생성을 위한 미생물 배지에 첨가하여 사용하는데, 발효를 위한 배양배지는 혐기성 미생물을 배양할 수 있는 배지라면 특별히 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 복합 질소원으로서 폴리펩톤, 효모추출물 또는 옥수수 분해물(corn steep liquor) 등을 포함하는 배지를 사용한다.
또한, 숙신산 발효미생물은 숙신산을 발효시킬 수 있는 미생물이라면 특별히 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 혐기성 숙신산 발효 미생물인 언에어로바이오스피리움 숙시니시프로두센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens,ATCC 29305)를 사용하고, 발효는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 회분식 발효를 수행함이 바람직한데, 30 내지 50℃, 바람직하게는 35 내지 45℃, 가장 바람직하게는 39℃의 온도 및, pH 6.0 내지 7.0, 바람직하게는 pH 6.3 내지 6.7, 가장 바람직하게는 pH 6.5의 조건에서, 탄산가스를 0.1 내지 0.4vvm, 바람직하게는 0.2 내지 0.3vvm, 가장 바람직하게는 0.25vvm의 유속으로 공급하면서 수행한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 :목질계 당화액(wood hydrolysate)을 이용한 회분식 발효
탄소원으로 목질계 당화액을 사용하고, 복합질소원으로 폴리펩톤과 효모추출물을 사용한 회분식 발효를 수행하여, 혐기적 미생물인 언에어로바이오스피리움 숙시니시프로두센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens,ATCC 29305)를 배양하였다.
실시예 1-1 :포도당의 함량이 21g/L인 목질계 당화액을 이용한 회분식 발효
먼저, 10g/L의 포도당, 2.5g/L의 폴리펩톤, 2.5g/L의 효모추출물, 3g/L의 K2HPO4, 1g/L의 NaCl, 1g/L의 (NH4)2SO4, 0.2g/L의 CaCl2·2H2O, 0.2g/L의 MgCl2·6H2O 및 1g/L의 Na2CO3로 구성된 전배양 배지를 제조하고, 이에 탄산가스를 0.25vvm의 유속으로 주입하여 혐기적 배양 환경을 조성한 다음, 100㎖배지에 언에어로바이오스피리움 숙시니시프로두센스를 접종하고, 39℃에서 12시간동안 전배양을 실시하였다. 그런 다음, 포도당의 함량이 21g/L인 목질계 당화액, 10g/L의 폴리펩톤, 10g/L의 효모추출물, 3g/L의 K2HPO4, 1g/L의 NaCl, 5g/L의 (NH4)2SO4, 0.2g/L의 CaCl2·2H2O, 0.4g/L의 MgCl2·6H2O, 5mg/L의 FeSO4·7H2O 및 5g/L의 Na2CO3로 구성된 본배양 배지를 제조하고, 2.5L의 발효조에 본배양 배지 0.9L를 주입한 다음, 39℃와 pH 6.5로 유지시키며, 100㎖의 전배양된 미생물을 접종하였으며, 혐기상태를 유지하기위하여 탄산가스를 0.25vvm의 유속으로 공급하면서 전기 미생물을 23시간동안 배양하였다. 발효 진행 중, 시간별로 발효기로부터 배지를 채취하고, 이로부터 세포농도, 숙신산, 포도당, 및 초산의 양을 측정하였다. 배양액 내의 세포농도는 분광광도계(spectrophotometer, Ultraspec3000, Pharmacia Biotech., Sweden)을 이용하여 측정하고, 숙신산, 포도당, 및 초산의 양은 HPLC(Aminex HPX-87H column, Bio-Rad, USA)를 이용하여 측정하였다(참조: 도 1). 도 1은 발효시간에 따른 세포농도(), 숙신산(), 포도당() 및 초산(◇)의 농도변화를 나타낸 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 얻어진 숙신산의 농도는 18.5g/L이고, 세포농도는 OD660기준으로 3.3까지 증가하였으며, 숙신산 수율은 88%임을 알 수 있었다. 이때, 숙신산의 수율은 생성된 숙신산의 양/소모된 당의 양이다.
실시예 1-2 :포도당의 함량이 27g/L인 목질계 당화액을 이용한 회분식 발효
포도당의 함량이 27g/L인 목질계 당화액을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 23시간 동안 배양하였다. 발효 진행 중, 시간별로 발효기로부터 배지를 채취하고, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 세포농도, 숙신산, 포도당, 및 초산의 양을 측정하였다(참조: 도 2). 도 2는 발효시간에 따른 세포농도(), 숙신산(), 포도당() 및 초산(◇)의 농도변화를 나타낸 그래프이다. 도 2에서 보듯이, 얻어진 숙신산의 농도는 23.7g/L이고, 세포농도는 OD660기준으로 4.2까지 증가하였으며, 숙신산 수율은 88%임을 알 수 있었다.
실시예 1의 결과는, 숙신산 발효균의 배지조성중 정제된 포도당대신에 목질계 당화액을 대체 탄소원으로 사용할 수도 있음을 시사한다.
실시예 2 :목질계 당화액과 옥수수 분해물을 이용한 회분식 발효
탄소원으로 목질계 당화액을 사용하고, 복합질소원으로 옥수수 분해물을 사용하여 회분식 발효를 수행하였다.
실시예 2-1 :포도당의 함량이 21g/L인 목질계 당화액을 이용한 회분식 발효
10g/L의 옥수수 분해물을 폴리펩톤과 효모추출물대신에 복합질소원으로 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 25시간 동안 배양하였다. 발효 진행 중, 시간별로 발효기로부터 배지를 채취하고, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 세포농도, 숙신산, 포도당, 및 초산의 양을 측정하였다(참조: 도 3). 도 3은 발효시간에 따른 세포농도(), 숙신산(), 포도당() 및 초산(◇)의 농도변화를 나타낸 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 얻어진 숙신산의 농도는 18.7g/L이고, 세포농도는 OD660기준으로 3.2까지 증가하였으며, 숙신산 수율은 89%임을 알 수 있었다.
실시예 2-2 :포도당의 함량이 27g/L인 목질계 당화액을 이용한 회분식 발효
10g/L의 옥수수 분해물을 폴리펩톤과 효모추출물대신에 복합질소원으로 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1-2와 동일한 방법으로 32시간 동안 배양하였다. 발효 진행 중, 시간별로 발효기로부터 배지를 채취하고, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 세포농도, 숙신산, 포도당, 및 초산의 양을 측정하였다(참조: 도 4). 도 4는 발효시간에 따른 세포농도(), 숙신산(), 포도당() 및 초산(◇)의 농도변화를 나타낸 그래프이다. 도 4에서 보듯이, 얻어진 숙신산의 농도는 23.7g/L이고, 세포농도는 OD660기준으로 4.0까지 증가하였으며, 숙신산 수율은 88%임을 알 수 있었다.
실시예 2의 결과를 실시예 1의 결과와 비교하면, 숙신산 발효균의 배지조성 중, 옥수수 분해물을 복합질소원으로 사용할 수 있음을 알 수 있다.
비교실시예 1 :정제된 포도당과 옥수수 분해물(corn steep liquor)을 이용한 회분식 발효
본 발명의 목질계 당화액을 이용하여 숙신산을 제조하는 방법과 종래의 방법을 숙신산의 수율면에서 비교하기 위하여, 포도당의 함량이 21g/L인 목질계 당화액 대신에 20g/L의 정제된 포도당을 탄소원으로 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 13.5시간 동안 배양하였다. 발효 진행 중, 시간별로 발효기로부터 배지를 채취하고, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 세포농도, 숙신산, 포도당, 및 초산의 양을 측정하였다(참조: 도 5). 도 5는 발효시간에 따른 세포농도(), 숙신산(), 포도당() 및 초산(◇)의 농도변화를 나타낸 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 얻어진 숙신산의 농도는 18.7g/L이고, 세포농도는 OD660기준으로 3.5까지 증가하였으며, 숙신산 수율은 89%임을 알 수 있었다.
상기 결과를 목질계 당화액을 사용하여 생산한 숙신산의 수율이 89%임을 나타낸 실시예 2-1의 결과와 비교해 보면, 생산에 소요되는 시간이 증가하였으나, 숙신산의 제조수율은 동일함을 알 수 있었다. 따라서, 동일한 균주를 사용하여 숙신산을 생산할 경우, 정제된 포도당 대신에 목질계 당화액을 사용함으로써, 종래의 방법에 비하여 경제적으로 숙신산을 제조할 수 있음을 알 수 있다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 목질계 당화액을 발효원료로 포함하는 배양배지에 숙신산 발효미생물을 접종하고 발효시킴으로써, 숙신산을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 정제된 포도당 대신에 값싼 재생자원인 목질계 당화액을 탄소원으로 사용하여, 경제적으로 숙신산을 생산할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. 목질계 당화액을 탄소원으로 포함하며 혐기성 미생물을 배양할 수 있는 배지에 숙신산 발효미생물을 접종하고, 발효시키는 공정을 포함하는 목질계 당화액을 이용한 숙신산의 생산방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    목질계 당화액은 목재를 가공한 후, 생성되는 잔여부를 200 내지
    100mesh로 세절하고, 이를 셀룰로스 분해효소로 처리하여, 목재의
    셀룰로스를 포도당으로 전환시킨 반응산물인 것을 특징으로 하는
    목질계 당화액을 이용한 숙신산의 생산방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    배지의 질소원으로서, 폴리펩톤, 효모추출물 또는 옥수수 분해물(corn
    steep liquor)을 사용하는 것을 특징으로 하는
    목질계 당화액을 이용한 숙신산의 생산방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    숙신산 발효미생물은 언에어로바이오스피리움 숙시니시프로두센스
    (Anaerobiospirillum succiniciproducens,ATCC 29305)인 것을
    특징으로 하는
    목질계 당화액을 이용한 숙신산의 생산방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    회분식 발효에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는
    목질계 당화액을 이용한 숙신산의 생산방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    발효는 30 내지 50℃의 온도와 pH 6.0 내지 7.0에서 탄산가스를
    0.1 내지 0.4vvm의 유속으로 공급하면서 수행하는 것을 특징으로 하는
    목질계 당화액을 이용한 숙신산의 생산방법.
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KR20150036951A (ko) 2013-09-30 2015-04-08 한국생산기술연구원 탄산무수화 효소가 포함된 숙신산 고생산성 악티노바실러스 숙시노게네스 배양용 배지

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