KR20040022283A - 제지 슬러지로부터 젖산을 생산하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제지 슬러지를 이용하여 젖산을 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 제지 슬러지를 가수분해하는 효소반응 공정 및 상기 효소반응 공정에서 생성된 글루코스를 기질로 사용하여 젖산으로 변환시키는 발효 공정을 동시에 수행하여 젖산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 젖산 생산방법은 저가의 제지 슬러지를 가수분해하여 글루코스를 생산하고 효소반응 공정 및 발효 공정을 동시에 수행함으로써 생산 비용을 절감할 뿐만 아니라 생산 시간을 단축하여 젖산의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

제지 슬러지로부터 젖산을 생산하는 방법{Method for producing lactic acid from paper sludge}
본 발명은 제지 슬러지를 이용하여 젖산을 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 제지 슬러지를 가수분해하는 효소반응 공정 및 상기 효소반응 공정에서 생성된 글루코스를 기질로 사용하여 젖산으로 변환시키는 발효 공정을 동시에 수행하여 젖산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
환경보존과 에너지자원의 수요를 감소하고자 하는 세계적인 노력의 일환으로 유기 폐기물의 재사용이 국내외적으로 활발하게 이루어지고 있다. 유기 폐기물에는 제지류의 재사용 공정에서 폐기되는 제지 슬러지, 곡물을 수확한 후에 폐기되는전분 및 섬유소가 있다. 이 중 국내에서 폐기되는 유기물 중, 폐지는 연간 830만톤이 발생하며, 이중 재활용되는 폐지는 500만톤으로 60%의 재활용율을 보이고 있다(환경통계연감 2001, 14호, 환경부). 그리고, 유기 폐기물의 하나인 음식 폐기물은 연간 420만톤이 발생하며, 유기성 슬러지류는 550만톤이 발생하고 있다(환경통계연감 2001, 14호, 환경부). 또한, 산림자원에서 얻을 수 있는 목질계 및 그 폐기물을 사용할 수 있다. 상기 유기 폐자원들은 생물공학적 방법에 의해 가수분해되어 젖산 생산 미생물의 탄소원 등 유용한 생물자원으로 사용될 수 있다. 한편, 제지류의 재사용공정에서는 무게로 5-40%의 지류가 사용가능하지 않은 슬러지로 폐기되며, 이 슬러지의 30-40%는 짧은 섬유소가 주류를 이루고 있다. 우리 나라의 제지산업에서 발생한 슬러지의 총량은 1992년 기준으로 연간 약 902천 톤에 이른다. 이러한 막대한 양의 슬러지는 주로 소각에 의해 처리되고 있는데 슬러지에 상당량의 물(60% 이상)이 포함되어 연료를 추가하여 소각 처리하여야 한다. 2001년 기준으로 폐기물 처리업체의 위탁 제지 슬러지 처리비용은 평균적으로 톤당 약 40,000원이므로 슬러지 처리비용으로 약 400억원 이상의 비용이 소요되었다.
산업적으로 유용한 유기산으로 대표적인 젖산(Lactic Acid)은 3탄소로 이루어진 유기산(2-Hydroxypropanoic acid, COOH-HCOH-CH3)으로서 포도당의 혐기성 발효에 의해 생산된다. 젖산의 산업적 용도는 공업용 55%, 식품용 40%, 의약용 5%로서 식품용은 주로 산미제로 사용되며, 공업용은 피혁산업과 화장품용 습윤제로 사용되고 있다. 의약분야에서 최근에 주목받고 있는 용도개발은 생분해성 고분자인 폴리락트산이다. 현재는 폴리락트산의 가격이 비싸 범용으로 사용되지 못하고 있지만 대량 생산에 의해 가격이 떨어질 경우, 그 수요는 엄청날 것으로 예측되고 있다. 우리나라의 경우, 생분해성 고분자 시장이 가까운 시일 내에 약 500억원에 이를 전망인데 폴리락트산은 이 시장의 상당부문을 차지할 수 있을 것으로 예측되고 있다.
하지만, 아직까지 젖산을 저렴하게 생산하는 방법이 개발되지 않고 있고, 현재는 폴리락트산의 생산을 위한 젖산을 전량 수입에 의존하고 있는 실정이다. 따라서, 가축 사료의 기능성 첨가제로서의 젖산의 산업적 수요도 증가하고 있는 현실에서 이에 대한 저렴하고 대량적인 젖산 생산방법의 개발이 시급한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 제지 슬러지 내의 셀룰로스를 가수분해하여 글루코스를 생산하고, 상기 글루코스를 기질로 사용하여 경제적으로 젖산을 생산하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 경제적이면서도 대량 생산이 가능한 젖산 생산을 위하여, 제지 슬러지를 가수분해하여 젖산의 기질인 글루코스를 생산하고, 상기 글루코스를 미생물과 함께 발효하여 젖산을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 락토바실러스 람노서스를 37℃에서 배양하였을 때 시간에 따른 세포 생장을 나타낸 그래프이다.
도 2는 락토바실러스 람노서스를 글루코스를 포함한 배지에서 배양하였을 때 시간에 따른 글루코스 소모 및 젖산 생산을 나타낸 그래프이다.
도 3은 락토바실러스 람노서스를 글루코스를 포함한 배지에서 여러 온도(32, 37, 42, 46 또는 50℃)로 배양하였을 때 시간에 따른 세포의 생장을 나타낸 그래프이다.
도 4는 락토바실러스 람노서스를 글루코스를 포함한 배지에서 여러 온도(32, 37, 42, 46 또는 50℃)로 배양하였을 때 시간에 따른 글루코스 소모를 나타낸 그래프이다.
도 5는 락토바실러스 람노서스를 글루코스를 포함한 배지에서 여러 온도(32, 37, 42, 46 또는 50℃)로 배양하였을 때 시간에 따른 젖산 생산을 나타낸 그래프이다.
도 6은 락토바실러스 람노서스를 글루코스를 포함한 배지에서 여러 pH(4.8,5.0, 5.5 또는 6.0)로 배양하였을 때 시간에 따른 세포의 생장을 나타낸 그래프이다.
도 7은 락토바실러스 람노서스를 글루코스를 포함한 배지에서 여러 pH(4.8, 5.0, 5.5 또는 6.0)로 배양하였을 때 시간에 따른 글루코스 소모를 나타낸 그래프이다.
도 8은 락토바실러스 람노서스를 글루코스를 포함한 배지에서 여러 pH(4.8, 5.0, 5.5 또는 6.0)로 배양하였을 때 시간에 따른 젖산 생산을 나타낸 그래프이다.
도 9는 락토바실러스 람노서스를 MRS 배지 또는 MRS 배지에 비해 질소원(N source)이 낮은 배지에서 37℃ 또는 42℃에서 배양하였을 때 시간에 따른 세포의 생장을 나타낸 그래프이다.
도 10은 락토바실러스 람노서스를 MRS 배지 또는 MRS 배지에 비해 질소원(N source)이 낮은 배지에서 37℃ 또는 42℃에서 배양하였을 때 시간에 따른 β-글루코시다제의 활성을 측정한 그래프이다.
도 11은 락토바실러스 람노서스를 MRS 배지 또는 MRS 배지에 비해 질소원(N source)이 낮은 배지에서 37℃ 또는 42℃에서 배양하였을 때 시간에 따른 FPase의 활성을 측정한 그래프이다.
도 12는 제지 슬러지에 셀룰라제 및 β-글루코시다제를 첨가하여 37℃ 또는 42℃에서 효소반응을 수행하였을 때 글루코스의 농도를 측정한 그래프이다.
도 13은 제지 슬러지에 셀룰라제 및 β-글루코시다제를 첨가하여 pH 4.8 또는 pH 5.6에서 효소반응을 수행하였을 때 글루코스의 농도를 측정한 그래프이다.
도 14는 제지 슬러지에 셀룰라제 및 β-글루코시다제를 첨가하여 45℃에서 pH 4.8 또는 pH 5.6에서 효소반응을 수행하였을 때 글루코스의 농도를 측정한 그래프이다.
도 15는 제지 슬러지에 셀룰라제 및 β-글루코시다제를 첨가하여 50℃에서 pH 4.9, pH 5.4 또는 pH 5.9에서 효소반응을 수행하였을 때 글루코스의 농도를 측정한 그래프이다.
도 16은 슬러지 함량에 따른 글루코스 생산 속도를 나타낸 그래프이다(○, ●: 2회 실험).
도 17은 여러 슬러지 함량(1, 3, 5 또는 7%)에 따른 글루코스 생산 속도를 나타낸 그래프이다.
도 18은 락토바실러스 람노서스 발효 배양물의 유기산 성분을 분석한 그래프이다.
도 19는 폐지 슬러지를 이용하여 40℃, pH 6에서 수행한 동시당화발효(simutaneous saccharification and fermentation; 이하 "SSF"라 약칭한다) 및 50℃에서 효소반응 수행 후 5시간 후에 발효공정을 수행한 순차발효(sequential fermentation; 이하 "SF"라 약칭한다)를 글루코스를 기질로 사용한 대조군과 비교하여 시간에 따른 글루코스 농도(A) 및 젖산 농도(B)를 비교한 그래프이다.
도 20은 셀룰라제 10 U/㎖ 및 β-글루코시다제 2 U/㎖를 첨가하여 여러 슬러지 함량(5, 6.7, 8.3 또는 10%)에서 SSF를 수행하였을 때 시간에 따른 글루코스 농도(A) 및 젖산 농도(B)를 측정한 그래프이다.
도 21은 셀룰라제 5 U/㎖ 및 β-글루코시다제 2 U/㎖를 첨가하여 여러 슬러지 함량(5, 6.7, 8.3 또는 10%)에서 SSF를 수행하였을 때 시간에 따른 글루코스 농도(A) 및 젖산 농도(B)를 측정한 그래프이다.
도 22는 셀룰라제 및 β-글루코시다제를 각각 다른 농도(셀룰라제 및 β-글루코시다제를 각각 5 및 2, 5 및 4, 5 및 6 U/㎖)로 첨가하여 SSF를 수행하였을 때 시간에 따른 글루코스 농도(A) 및 젖산 농도(B)를 측정한 그래프이다.
도 23a는 셀룰라제 및 β-글루코시다제를 각각 다른 농도(셀룰라제 및 β-글루코시다제를 각각 15 및 2, 10 및 2, 5 및 2, 2.5 및 2 U/㎖)로 첨가하여 SSF를 수행하였을 때 시간에 따른 글루코스 농도(A) 및 젖산 농도(B)를 측정한 그래프이다.
도 23b는 40, 42, 44 또는 46℃에서 SSF를 수행하였을 때 시간에 따른 글루코스 농도(A) 및 젖산 농도(B)를 측정한 그래프이다.
도 24는 SSF 수행 도중에 슬러지를 첨가하였을 때(↓) 시간에 따른 글루코스 농도(A) 및 젖산 농도(B)를 측정한 그래프이다.
도 25는 SSF 수행 도중에 슬러지를 첨가하거나(↓), 셀룰라제 및 β-글루코시다제를 첨가(↑)하였을 때 시간에 따른 글루코스 농도(A) 및 젖산 농도(B)를 측정한 그래프이다.
도 26은 SSF 수행 도중에 발효기에 슬러지를 첨가하거나(↓), 셀룰라제(5 U/㎖) 및 β-글루코시다제(1 U/㎖)를 첨가(↑)하였을 때 시간에 따른 글루코스 농도및 젖산 농도를 측정한 그래프이다.
도 27은 SSF 수행 도중에 발효기에 슬러지를 첨가하거나(↓), 셀룰라제(5 U/㎖) 및 β-글루코시다제(1 U/㎖)를 첨가(↑)하고, pH를 조절하지 않거나(A), pH를 조절하였을 때(B), 시간에 따른 글루코스 농도 및 젖산 농도를 측정한 그래프이다.
도 28은 pH 5.8(A), pH 5.4(B) 또는 pH 5.0(C)에서 SSF 공정을 수행하고, 상기 SSF 수행 도중에 발효기에 슬러지를 첨가하거나(↓), 셀룰라제(5 U/㎖) 및 β-글루코시다제(1 U/㎖)를 첨가(↑)하였을 때, 시간에 따른 글루코스 농도 및 젖산 농도를 측정한 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제지 슬러지로부터 젖산의 기질인 글루코스를 생산하는 효소반응 및 상기 글루코스를 젖산으로 변환시키는 발효 공정을 포함하는 젖산 생산방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 제지 슬러지를 가수분해하는 효소반응 공정 및 상기 효소반응 공정에서 생성된 글루코스를 젖산으로 변환시키는 발효 공정을 포함하는 젖산 생산방법을 제공한다.
본 발명에서는 젖산을 생산하기 위한 기질을 대량 생산하기 위하여 저렴하게 대량 획득할 수 있는 제지 슬러지를 사용하여 젖산의 기질인 글루코스를 생산함으로써, 젖산 생산의 비용을 대폭 줄이고, 제지 슬러지를 재활용함으로써 폐기물의 처리에 드는 비용을 절감할 수 있다.
본 발명의 젖산 생산방법은 제지 슬러지 내의 셀룰로스에서 글루코스를 생산하는 공정과 상기 글루코스를 기질로 사용하여 젖산으로 변환시키는 발효 공정으로 나뉠 수 있다.
본 발명에서 제지 슬러지 내의 셀룰로스에서 글루코스를 생산하는 방법은 셀룰로스를 분해하는 효소를 첨가하여 반응시킴으로써 행해질 수 있다. 상기 셀룰로스를 분해하여 글루코스를 생산하는 효소로는 엔도-글루카나제(endo-glucanase), 엑소-글루카나제(exo-glucanase) 및 β-글루코시다제(β-glucosidase)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 사용할 수 있으며 여기에 한정되는 것은아니며, 셀룰라제(cellulase) 및 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 사용하는 것이 바람직하다. 이 중 상기 셀룰라제는 엔도-글루카나제(endo-glucanase)와 엑소-글루카나제(exo-glucanase)로 구성되며, 이들의 복합적 기능으로 슬러지내의 셀룰로스를 분해하여 셀로바이오스(cellobiose)라는 이당류를 생성한다. 또한, 상기 β-글루코시다제(β-glucosidase)는 전 단계에서 생성된 셀로바이오스를 분해하여 글루코스를 만드는데 관여한다.
상기 효소반응 공정은 상기에서 사용한 효소가 활성을 나타내는 온도 및 pH의 범위 내에서 수행할 수 있으며, 32 내지 50℃에서 수행하는 것이 바람직하고, 42 내지 45℃에서 수행하는 것이 더욱 바람직하다. pH는 pH 4.8 내지 pH 6.0에서 수행하는 것이 바람직하고, pH 5.0에서 수행하는 것이 더욱 바람직하다. 효소 반응 공정은 50℃에서 수행하는 것이 바람직하나, 미생물이 자라는 온도는 37℃가 바람직하기 때문에 두 조건의 중간 지점인 42 내지 45℃에서 반응을 수행하는 것이 젖산 생산에 가장 바람직한 온도이다. 또한, 효소반응 pH는 pH 5에서 수행하는 것이 바람직하고, 미생물이 자라는 온도는 pH 6에서 바람직하며, 두 조건의 최적 조건은 pH 5이다.
본 발명의 방법에서는 상기 효소반응 공정을 통해 생성된 글루코스를 기질로 사용하여 젖산으로 변환시키는 발효공정을 수행한다. 본 발명의 발효공정을 위해서는 글루코스를 기질로 사용하여 젖산을 생산할 수 있는 미생물을 첨가하여 배양함으로써 젖산을 생산할 수 있다. 상기 발효 공정에 첨가되는 미생물은 글루코스를 기질로 사용하여 젖산을 생산할 수 있는 미생물로서 특별히 한정되는 것이 아니며, 락토바실러스 속 또는 라이조푸스 속 미생물인 것이 바람직하고, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 라이조푸스 오리지에(Rhizopus oryzae) 및 락토바실러스 델부르키(Lactobacillus dellbreukill)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 첨가하여 배양하는 것이 더욱 바람직하고, 락토바실러스 람노서스를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 락토바실러스 람노서스에 의해 젖산을 생산하는 공정은 37℃에서 수행할 수 있는 것이 바람직하다. 또한, pH는 pH 6.0에서 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 배양속도는 슬러지의 농도에 따라 100 내지 500 rpm에서 수행하는 것이 바람직하다.
구체적으로, L. 람노서스를 이용하여 글루코스로부터 젖산을 생산하는 발효 공정을 수행한 후, 상기 발효 공정을 통해 생성된 배양액(broth)의 성분을 분석하였다. 그 결과, HPLC 컬럼을 통과한 유기산은 시트르산(citric acid), 숙신산(succinic acid), 젖산, 포름산(formic acid), 아세트산(acetic acid), 프로피온산(propionic acid) 순으로 각각 10, 14, 15, 16, 21.5 min에서 검출되었고, 여러 가지 유용 유기산이 생산되었으나 97% 이상의 주요 생산물은 젖산이었다(도 18참조).
본 발명에서는 상기 효소반응 공정 및 발효 공정을 따로 분리하여 수행하거나, 효소반응 공정 및 발효 공정을 동시에 수행할 수 있다. 상기와 같이 효소반응 공정 및 발효 공정을 수행하기 위한 방법으로, 효소반응 공정 및 발효 공정을 따로분리하여 수행하는 순차발효(sequential fermentation; 이하 "SF"라 약칭한다) 또는 두 공정을 동시에 수행하는 동시당화발효(simultaneous saccharification and fermentation; 이하 "SSF"라 약칭한다) 방법이 이용될 수 있다. 본 발명의 젖산 생산방법은 SSF 방법으로 수행하는 것이 바람직하며, 유가식 배양(fed-batch) 또는 연속식 발효(continuous fermentation)로 수행하는 것이 더욱 바람직하다. 유가식 배양이란, 초기에 넣어준 기질이 소비되어 미생물이 더 이상 자랄 수 없게 되었을 때 기질을 발효기에 넣어 미생물이 더 자랄 수 있게 하는 방법이며, 본 실험에서는 제지 슬러지를 넣어 주어 제지 슬러지가 효소에 의해 포도당으로 전환되면, 기질로 이용될 수 있게 하였다.
SF는 효소반응과 발효를 분리하여 실시하는 방법이다. 상기 방법에서는 효소를 이용한 반응공정에서 생성된 반응액만을 따로 분리하여 발효공정에 적용하여, 슬러지 내에 가장 많이 포함되어 있는 애쉬(ash) 부분을 제거할 수 있다. 또한, 효소 반응과 발효를 분리하여 실시하면 최적 조건에서 공정이 이루어지기 때문에 각 공정에서의 생산성이 증가한다. 그러나, 효소반응 공정에서 과량의 슬러지를 가수분해하여도 교반 문제로 인해 슬러지 15% 이상을 가수분해할 수 없고, 경제적으로 장치적 부담 문제와 생산 시간 지연 등의 문제점으로 인한 단점이 있다.
이에 비하여 슬러지를 이용한 SSF 방법은 슬러지 내에 셀룰로스를 가수분해하여 글루코스를 생성하고, 동시에 발효를 통하여 젖산을 생산하는 것이다. SSF 방법은 장치의 단순화와 공정 시간 절약의 장점이 있으며, 효소를 이용한 가수분해에서 발생하는 기질저해반응을 줄임으로써, 젖산 생산 효율을 향상시킬 수 있는 장점을 가지고 있다. 따라서, SSF 방법은 SF 방법에 비해 공정 시간의 단축과 효소 반응에서 산물 저해(product inhibition)를 억제한다. 또한, 고농도 배양에 용이하고, 공정을 단순화할 수 있으며, 유가식 배양(fed-batch)시 슬러지 첨가로 인한 물질이동(mass transfer) 문제도 크지 않다. 처음부터 높은 농도의 슬러지를 첨가하게 되면, 발효액의 점도가 올라가기 때문에 교반이 쉽지 않게 된다. 상기 문제를 해결하기 위해 초기에 낮은 농도로 슬러지를 첨가하게 되면, 효소 바로 섬유소를 분해하기 때문에 교반에 큰 문제를 일으키지 않아, 물질이동에 효과적이다. 또한, 슬러지 내 불용성 부분인 잔해 부분은 젖산 생산 후에 미생물과 더불어 제거하는 것이 유리하다.
본 발명에서 효소반응 공정 및 발효 공정을 동시에 수행하는 SSF의 공정 조건은 42 내지 45℃에서 수행하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 반응 pH는 pH 4.8 내지 pH 6.0에서 수행하는 것이 바람직하고, pH 5.0 내지 pH 5.5에서 수행하는 것이 더욱 바람직하며, pH (5.0)에서 수행하는 것이 가장 바람직하다. 이는 미생물 생장과 효소반응 조건의 조합이 적절하기 때문입니다. 또한, 배양속도는 슬러지 농도에 따라 달라질 수 있으며, 100 내지 500 rpm에서 수행하는 것이 바람직하다. 또한, SSF 공정에 사용되는 제지 슬러지의 농도는 10% 이하인 것이 바람직하고, 5 내지 10%인 것이 더욱 바람직하며, 5 내지 8%인 것이 가장 바람직하다. 제지 슬러지의 농도가 높아지면, 반응기에서 교반이 쉽지 않아 상기와 같은 제지 슬러지 농도에서 반응을 수행하는 것이 바람직하다.
기질인 슬러지 양이 많을수록 초기 생성속도는 증가한다(표 1참조). 그러나, 일정량 이상의 기질이 첨가될 경우엔 슬러지와 효소간의 원활한 컴플렉스(complex) 형성이 어렵다. SSF 공정에서 슬러지의 농도는 물질 이동을 위해 적정 농도에서 실시해야 하고, 임펠러와 전력(power) 등의 문제점에 의해 교반이 잘 되지 않기 때문에 교반과 물질 이동이 용이한 범위 내에서 가수분해 단계를 수행하여야 한다. 임펠러는 발효기 내에 물질을 교반시켜 주는 장치이다.
효소반응 공정에서 효소량이 증가함에 따라 글루코스 농도가 증가하나, 그 증가량에 비해 젖산 생산량은 차이가 거의 없다. 이는 적은 량의 효소로도 셀룰로스를 충분하게 가수분해할 수 있음을 보여준다. 또한, 미생물 생장이 효소반응에 비해 늦게 시작되기 때문에 발효공정을 앞당김으로서 보다 높은 젖산 생산 수율을 얻을 수 있다.
SSF 공정에서 효율적인 젖산 생산을 위해서는 유가식 배양(fed-batch) 및 연속식 발효(continuous fermentation)로 수행할 수 있다. 젖산 생산에 있어 많은 양의 슬러지 농도에 비해 생산되는 젖산은 낮은 농도이며, 이를 해결하기 위해서는 발효 중간에 슬러지를 첨가해 주는 유가식 배양 방법을 이용할 수 있다. 배치 방법은 회분식 배양 방법이라고도 하는데, 이는 초기에 기질과 미생물, 효소를 한 번에 넣어 젖산을 생산하는 방법이다. 또한, 유가식 배양은 초기에 기질, 미생물 효소를 넣어주고, 발효 중간에 기질이 고갈됨에 따라 기질 및 효소를 넣어 주는 것이다. 연속식 발효는 연속 배양이라고도 하며, 기질 및 효소를 연속적으로 넣어주는 방법이다. 이 중 유가식 배양은 기질이 소비되지 않게 기질을 넣어주는 것이 중요하며, 미생물 생장 속도에 따라 기질을 첨가해 주는 방법이 있다. 본 발명에서는 효소 반응 속도에 의해 제지 슬러지 내에 섬유소가 70-80% 분해되는 시점에 기질을 첨가하였다.
유가식 방법은 초기에 물질 이동을 고려할 수 있다. 즉, 슬러지로 인한 배양액의 혼합이 원활하지 않은 현상을 초기에 적은 양의 슬러지를 첨가함으로써 극복할 수 있다. 초기에 적은 농도의 슬러지는 효소에 의해 셀룰로스가 가수분해되면서 배양액이 원활하게 교반할 수 있기 때문이다. 그리고, 중간에 첨가하는 양도 적은 농도의 슬러지를 첨가할 경우에도 교반에 지장을 초래하지 않는 범위에서 SSF 방법을 실시할 수 있다. 또한, 미생물이 정지기에 도달했을 때 슬러지를 첨가함으로써 젖산 생산을 극대화하였다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 유가식 배양 방식으로 SSF를 수행하였다. 슬러지의 초기 농도를 8%로 작동하였으며, 배양 중간에 효소를 첨가하여 제지 슬러지 내의 셀룰로스 가수분해를 보다 빠르게 하였다. 그 결과, 초기에는 효소반응이 빠르기 때문에 글루코스 생성이 크게 증가하였으나, 반응 후 12시간 이후에는 글루코스 생성 속도는 감소하며, 그에 반하여 글루코스가 소비되는 속도가 증가한다. 이는 미생물이 지수기에서 정지기로 변하면서 많은 양의 글루코스가 젖산으로 변화됨을 나타낸다. 이 시기에는 오히려, 글루코스가 부족하기 때문에 젖산 생산 속도가 줄어들었다(도 25참조). 반응 50 시간 이후에는 미생물이 정지기를 유지하다가 사멸기(death phase)로 접어드는 시기이고, 이 시기는 젖산 생산은 꾸준하나 또한 글루코스가 전부 고갈되지 못하고 5g/L 내외로 남아 있었다. 이 시기에는 미생물의 활성이 높지 못하여 글루코스를 젖산으로 전화할 수 없거나, 이미 발효 배양액에 젖산 농도가 높기 때문에 젖산에 의한 저해영향 때문이다. 상기 결과로부터 미생물의 지수기와 정지기에 충분한 양의 기질을 첨가하는 경우에 빠른 속도로 젖산을 생산할 수 있음을 알 수 있다. SSF 방법으로 젖산 생산시에 제지 슬러지를 첨가하는 시간을 앞당김으로써 정지기에 도달한 미생물들이 글루코스를 얻어 젖산으로의 전환을 용이하게 할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 락토바실러스 람노서스( Lactobacillus rhamnosus )로부터의 젖산(lactic acid) 생산
본 발명자들은 젖산 생산을 위한 균주로 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 사용하였고, 상기 락토바실러스 람노서스가 젖산을 생산하기 위한 최적조건을 알아보았다. L. 람노서스는 L-(+)-젖산을 생산하는 균주로서 광학 순도(optical purity)가 약 95%에 이르며, 글루코스 대비 약 95%의 생산 수율을 가진다. L. 람노서스를 배양하기 위해 MRS 배지(D-(+)-glucose(Sigma Co.), yeast extract(Difco Lab.), (NH4)2SO4(Sigma Chemical Co.),KH2PO4(Shinyo Pure Chemicals Co.), MgSO4·7H2O(Shinyo Pure Chemicals Co.), K2HPO4(Shinyo Pure Chemicals Co.), FeSO4·7H2O(Duksan Pharmaceutical Co.))를 이용하였으며, 종균배양은 플라스크를 이용하여 쉐이킹 배양기(shaking incubator)에서 배양하였다. 젖산 생산 수율을 높이기 위한 본배양은 발효기(fermentor)를 이용하여 배양하였다. 배양 조건은 종균배양의 경우 37℃, 100rpm에서 배양하였으며, 본배양에서도 같은 조건에서 배양하였다. pH의 조절은 Na2OH를 이용하여, pH 4.8 - 6.0의 범위를 주었다.
분석방법은 시료를 채취하여 세포 농도, 글루코스 농도, 젖산 농도를 분석하였다. 세포 농도는 스펙트로포토미터(spectrophotometry; GENESYS 5, Spectronic Instruments, Inc.)로 600 nm에서 측정하였다. 글루코스와 젖산 농도는 글루코스 분석기(glucose analyzer; YSI 2700 SELECT, Yellow Springs Instrument Co.)로 측정하였다.
젖산 생산을 위한 L. 람노서스의 종균배양은 250 ㎖ 플라스크에 100㎖의 MRS 배지를 넣고, 여기에 1%의 L. 람노서스를 접종하여, 쉐이킹 배양기에서 24시간 배양한 후(종균배양은 본배양의 10%), 2.5 L 발효기에 1 L의 MRS 배지를 넣고, 여기에 종균배양한 플라스크를 접종하였다.
도 1은 L. 람노서스의 세포생장을 OD 값을 측정하여 분석한 것이며,도 2는 발효 중 글루코스 소모량과 젖산 생성량을 나타낸 것이다. L. 람노서스는 접종 후약 13시간 후에 정지기(stationary phase)에 도달하였다. 글루코스 농도는 배양을 시작한 후 20시간이 되었을 때 전부 소모되어 젖산을 생산하였다. 젖산 생산수율은 약 73%이었다. L. 람노서스에 의한 젖산 생산의 최적조건은 37℃, 100rpm이었다.
<실시예 2> 락토바실러스 람노서스의 젖산 생산에서 온도의 영향
L. 람노서스에 의한 젖산 생산에서 여러 온도에 따른 세포 생장, 글루코스 소모량, 젖산 생산량을 측정함으로써, 향후 젖산 생산을 위한 발효 조건을 최적화하는 실험을 실시하여 복합생물공정 기술 개발에 있어서 기초자료로 이용하고자 하였다.
구체적으로, 젖산 생산을 위한 L. 람노서스의 배양 방법 및 배지 조성은 동일하였으며, 다만 온도만을 다르게 하여 2.5 L 발효기에서 배양하였다. 온도는 32, 37, 42, 46 또는 50℃로 하였다. 이는 L. 람노서스의 배양 최적 온도가 37℃이고, 효소 반응의 최적 온도는 50℃이기 때문이다. SSF 공정의 최적화를 위해 37-50℃ 사이의 적합한 온도를 구하기 위한 실험을 수행하였다. 본 실험에서 각각의 온도에 따른 세포 생장, 글루코스의 농도, 젖산의 농도를 측정하여 그 수치를 비교하였다.
그 결과, 세포 생장에 있어서는 37℃에서 가장 먼저 정지기에 도달하였으며, 나머지 32, 42, 46℃도 배양 시작 후 약 20시간 후에 정지기에 도달하였다. 다만50℃의 경우 세포 생장이 다른 온도에 비하여 매우 낮았다(도 3). 글루코스 농도 역시 37℃에서 배양 후 20시간이 지난 뒤 모두 소모되었으며 42, 46℃의 경우 비슷한 속도로 약 40시간 이후에 전부 소모되었다(도 4). 세포 생장 중 46, 50℃의 경우는 글루코스의 소모 속도가 느렸을 뿐만 아니라, 배양이 완전히 끝난 50시간 이후에도 20-23 g/L의 글루코스가 소비되지 않았다. 배양 중 젖산은 가장 빠른 세포의 생장 및 글루코스 소모량을 보인 37℃에서 가장 높게 생산되었고, 32℃와 42℃에서는 37℃보다 느리지만 비슷한 양의 젖산 생산을 보였다. 다만, 46℃와 50℃에서는 글루코스 소모량이 적었기 때문에 더 적은 젖산 생산을 보였다(도 3및도 4).
L. 람노서스의 온도에 따른 생장 및 젖산 생산을 보면, 세포 생장의 경우 37℃에서 최대를 보였지만, 젖산 생산의 경우는 42℃가 37℃보다 약간 높은 생산량을 보였다. 따라서 젖산 생산을 위한 L. 람노서스의 최적 온도는 37℃이었다(도 5).
<실시예 3> pH에 따른 발효의 영향
L. 람노서스에 의한 젖산 생산에서 온도와 함께 중요한 영향을 미치는 인자는 pH이다. 일반적으로 L. 람노서스의 최적 pH는 6.0이고, 효소 가수분해의 최적 pH는 4.8이다. 따라서, 본 실험에서는 pH 4.8과 6.0 사이에서 가장 최적인 조건을 찾아내고자 하였다. 본 실험은 이러한 연구의 기초 자료로서 여러 가지 pH 조건에서의 실험을 수행하였다.
구체적으로, L. 람노서스의 배양 조건 및 배양 배지의 조성은 동일하며, 온도는 37℃로 고정하였다. 각각의 배양에서 pH를 달리 조절하여 실험하였으며, pH의 조절을 위해 10N NaOH가 사용되었다. pH는 4.8, 5.0, 5.5, 6.0에서 실시하였으며, 시료 채취 후 세포의 농도, 글루코스 소모량 및 젖산 생산량 등을 측정하여 비교하였다.
그 결과, 실제 젖산 생산에서 pH의 영향이 많음을 실험을 통하여 알 수 있었다. 각 pH에 대한 세포 생장은 pH 6.0인 경우에 가장 높았으며, pH 4.8과 5.5인 경우에 비슷한 결과를 얻었다. 다만, pH 5.0일 때 다소 낮은 세포 생장을 나타내었다. 글루코스 소모량 역시 pH 6.0인 경우는 전부 소모가 되었고, pH 5.5일 때 약 8 g/L 정도가 소비되지 않았으며, pH 4.8과 5.0이었을 때는 30-40 g/L 정도의 글루코스가 소비되지 않았다. 젖산 생산에서 pH 6.0인 경우 약 82 g/L 생산되었고, pH 5.5일 경우 72g/L 정도 생산되었다. pH 4.8과 5.0인 경우는 50-60 g/L 정도로 비슷한 생산을 보였다(도 6,도 7및도 8).
<실시예 4> 발효에 의한 효소 분해
SSF를 위해서는 발효시 효소를 함께 첨가하는데, 본 실험은 발효 조건에 의한 효소 불활성화(enzyme deactivation)가 어느 정도인지 알아보았다.
구체적으로, 온도를 달리한 두 개의 항온조(37, 42℃)에 두 가지 배지(MRS, MRS 배지에 비해 질소원의 농도를 5 g/L 로 낮춘 배지)를 이용하여 효소가 분해되는 정도와 세포 농도를 측정하였다. 세포 농도는 OD값(600nm)을 측정하여 분석하였으며, 효소 활성은 DNS(dinitrosalicylic acid) 방법을 사용하였다.
MRS 배지는 효모 추출물과 펩톤이 첨가되어 질소원의 비율이 높다. 산업적으로 젖산을 생산하기 위해서는 질소원의 양을 줄일 필요가 있다. 이에 질소원의 농도를 5 g/L 로 낮춘 산업 배지와 MRS 배지를 사용하여 젖산 생산 비교 실험을 실시하였다. 또한, 적은 양의 질소원을 첨가함으로써 미생물이 효소를 질소원으로 전환하여 사용하는지에 대해 조사하였다.
그 결과, 전반적으로 MRS 배지에 비해 질소원이 낮은 배지가 MRS 배지보다 각각의 온도에서 높은 세포 농도를 보였다. 배양 조건 중 온도가 37℃일 때 세포 농도가 42℃일 때의 값보다 두 배지 모두에서 높은 결과를 보였다(도 9).
효소 분해 정도는 온도 42℃에서 FPase 활성이 감소되는 것으로 보이며, L. 람노서스의 생장에 의한 효소의 분해는 크게 영향을 받지 않는 것으로 보여진다. FPase 활성 측정은 필터 페이퍼(filter paper) 활성 측정 방법으로, 필터 페이퍼가 가수분해되는 정도를 나타내어 효소의 활성을 측정하는 방법이다. 또한, 미생물이 효소를 질소원으로 사용하는 비율이 적음을 간접적으로 확인하였다. 오히려 셀룰로스 및 잔해(ash)에 의한 셀룰로스의 불활성화가 클 것으로 보인다(도 10및도 11).
<실시예 5> 효소(β-글루코시다제, 셀룰라제)을 이용한 슬러지의 당화
본 발명자들은 이전실험을 통해 밝혀진 효소의 최적조건(pH 4.8, 온도 50℃)을 바탕으로 SSF(simultaneous saccharification and fermentation)를 위해 L. 람노서스의 생존까지 고려한 효소의 최적조건을 알아내고, 또한 이러한 효소에 의한 초기 가수분해 속도(initial hydrolysis rate)와 효소의 활성이 어느 정도까지 유지되는지 알아보기 위한 반감기(half-life)를 측정하였다.
구체적으로, 소듐 아세테이트 버퍼(Sodium acetate buffer) 17 ㎖(pH 4.8)에 3.28 g의 슬러지를 넣고 37, 42, 45, 50℃의 항온조에 10 유니트의 셀룰라제(0.061g)와 5 유니트(0.21㎖)의 β-글루코시다제를 넣어 반응시킨 후 생성된 글루코스의 농도를 분석하였다. 슬러지가 알칼리성을 띄므로 버퍼의 pH가 4.8이지만 혼합 후 실험시 pH 5.6까지 상승하였다. 이를 다시 pH 4.8로 조정 후 기존실험과 비교하였다. 슬러지 1, 3, 5, 7%에 약간의 아세트산을 첨가하여 pH 4.8로 조정한 후 10유니트의 셀룰라제(0.061g)와 5유니트(0.21㎖)의 β-글루코시다제를 넣어 기질의 양에 따른 초기 가수분해 속도를 측정하였다.
그 결과, 5℃의 온도 차이로 효소 반응을 수행해서 글루코스 농도를 측정해 보면, 37℃에서는 44%의 전환율을 보였고 42℃에서는 45%의 전환율을 보였다. 초기엔 어느 정도 속도차이를 보이지만 반응시간을 길게 하면 그 차이는 미미하였다(도 12).
pH 5.6에서 전환율은 45%인 반면 pH 4.8에서는 전환율이 67%정도로 높았다. 45℃와 50℃에서의 전환율 차이는 크지 않았으며 42℃에서 수행한 실험과도 큰 차이를 보이지 않았다. 온도의 영향보다는 오히려 pH의 영향을 더 많이 받는 것으로보인다. 그러므로 동시당화는 40-42℃에서 수행하는 것이 좀더 유리한 방법으로 보인다(도 13,도 14및도 15).
표 1과 같이 기질인 슬러지 양이 많을수록 초기 생성속도는 증가한다. 그러나, 일정량 이상의 기질이 첨가될 경우엔 슬러지와 효소간의 원활한 컴플렉스(complex) 형성이 어렵다. 이로 인해 반응 초기에 글루코스 생성이 이뤄지지 않아 초기 가수분해 속도 측정에 무리가 따른다. 일련의 실험을 통해표 2와 같은 결과를 얻을 수 있었다(도 16및도 17). SSF 수행을 위한 적절한 조건은 pH 5-5.2, 온도 40-42℃이다. 상기 실험은 두 단계를 나눠 얻은 결과이므로 실제 SSF 실험결과와는 약간의 오차를 보일 수 있다.
슬러지 함량에 따른 슬러지 가수분해 속도
1%(0.656g) 3%(1.968g) 5%(3.28g) 7%(4.592g)
V(g/h) 0.025 0.0557 0.0938 0.1173
가수분해, 발효 또는 SSF를 수행하기 위한 적정 공정 조건
pH 온도
가수분해 4.8 50℃
발효 6 37℃
SSF 5-5.2 40-42℃
<실시예 6> 락토바실러스 람노서스를 이용한 발효 배양액의 성분 분석
본 발명자들은 L. 람노서스를 이용한 발효 공정에서 생산되는 유용 유기산의 정확한 성분 분석을 하였다.
구체적으로, 유기산 생산을 위한 균주는 L. 람노서스를 이용하였으며 배양기간은 50시간이었다. 배양 조건은 온도 37℃, 100rpm이고, pH 조절은 위한 버퍼는 10N NaOH를 사용하여 pH 6이었다. 유기산 분석은 HPLC를 이용하였다. 사용한 컬럼은 HPX-87H(Biorad Co.), 이동상(mobile phase)은 0.08N H2SO4, 유속(flow rate)은 0.5 ㎖/min이다. UV 검출기(detector)는 워터스(Waters) 486 모델로 사용하였으며, 파장은 210nm이다.
발효 공정을 통해 생성된 배양액(broth)의 성분 분석을 한 결과, HPLC 컬럼을 통과한 유기산은 시트르산(citric acid), 숙신산(succinic acid), 젖산, 포름산(formic acid), 아세트산(acetic acid), 프로피온산(propionic acid) 순으로 각각 10, 14, 15, 16, 21.5min에서 검출되었다. 이러한 결과는 플라스크를 통한 실험에서도 유사하였다. 여러 가지 유용 유기산이 생산되나 주요생산물은 젖산이었다(도 18). 두 실험 모두 글루코스 대비 97% 이상의 젖산이 생산되었다.
<실시예 7> 제지 슬러지로부터 젖산 생산
<7-1> SSF 및 SF에 의한 젖산 생산
젖산 생산을 위해서는 젖산의 기질인 글루코스가 필요하다. 이에 본 발명자들은 제지 슬러지 내의 셀룰로스를 가수분해하여 저렴한 가격으로 글루코스를 대량생산하였다. 상기에서 셀룰로스를 가수분해하여 글루코스를 생산하기 위하여, 셀룰라제 및 β-글루코시다제를 이용한 제지 슬러지의 가수분해 정도는 제지 슬러지 농도에 따라 결정된다. 가수분해 가능한 제지 슬러지의 농도가 15%인 경우, 글루코스를 37 g/L까지 생산하였다. 그러므로 배치(batch)시 제지 슬러지내 셀룰로스를 가수분해하여 얻을 수 있는 글루코스의 농도는 슬러지 내에 35%의 셀룰로스가 있음을 감안하고, 글루코스가 젖산으로 90% 전환되면 젖산 33g/L가 생산된다. SF 공정을 유가식 배양(fed-batch)으로 실시하면, 효소 반응액 내 글루코스 함량이 적기 때문에 효소 반응액을 다시 증류하는 공정이 필요하며, 이는 장치를 추가해야 하는 경제적 부담을 초래하게 된다. 회분식(batch) 배양은 한 번에 생산을 실시하기 때문에, 슬러지 농도가 높아야 젖산 생산이 높다. 따라서, 높은 제지 슬러지 농도에 의해 교반이 어려우며, 낮은 농도의 젖산을 생산할 수밖에 없다. 유가식 배양은 발효 중간에 계속 기질을 첨가하여 주기 때문에 하나의 발효기에서 최적의 생산성과 생산 농도를 얻을 수 있는 장점이 있다. 연속식 배양에서는 제지 슬러지의 농도를 높게 할 수 없기 때문에 젖산 생산 농도가 낮으며, 제지 슬러지가 고체이기 때문에 운전상에 어려움이 많다.
결론적으로, SSF 공정은 SF 공정에 비해 공정 시간의 단축과 효소 반응에서 산물저해(product inhibition)를 억제한다. 또한, 고농도 배양에 용이하고, 공정을 단순화할 수 있으며, 유가식 배양시 슬러지 첨가로 인한 물질 이동 문제도 크지 않았다. 또한, 제지 슬러지 내 불용성 부분인 잔해 부분은 젖산 생산 후에 미생물과 더불어 제거하는 것이 유리하다.
젖산생산을 위하여 L. 람노서스를 배양하기 위한 배지조성은 다음과 같다. 폐지 슬러지, 효모 추출물(Difco Lab.), (NH4)2SO4(Sigma Chemical Co.), KH2PO4(Shinyo Pure Chemicals Co.), MgSO4·7H2O(Shinyo Pure Chemicals Co.), K2HPO4(Shinyo Pure Chemicals Co.). 종균배양은 쉐이킹 배양기에서 20시간 배양하였으며, SSF를 위한 실험은 100㎖ 플라스크에서 작동 부피(operation volume) 20-30㎖에서 실시하였다. 배양 조건은 종균배양의 경우 37℃, 150rpm에서 배양하였으며, 본배양에서는 효소 작용을 고려하여 42℃, 150rpm에서 배양하였다. 분석방법은 시료를 채취하여 글루코스 농도, 젖산 농도를 분석하였다. 글루코스 농도와 젖산 농도는 글루코스 분석기(YSI 2700 SELECT, Yellow Springs Instrument Co.)로 측정하였다.
젖산 생산을 위하여 SSF 또는 SF 방법으로 수행하였고, 글루코스 소비 및 젖산 생산을 비교하였다. SSF는 40℃ pH 6에서 실시를 하였으며, pH 조절은 하지 않았다. 또한 SF 공정은 효소 반응 50℃에서 실시하였으며, 5시간 후 발효공정을 실시하였다. 대조군은 글루코스를 기질로 이용하였다.
그 결과, 글루코스 소비와 젖산 생산이 비슷하게 나타났다. SF 공정의 이점은 효소 반응과 발효를 분리하여 실시함으로써, 각 최적조건에서 공정을 실시하는데 있다. 그러나, 실험을 통한 결과 SSF 공정과 비교하여 젖산 생산과 생산 수율이 크게 차이가 나지 않음을 알 수 있었다(도 19). 이에 따라 장치적 이점을 가지고 있는 SSF 공정을 선택하여 최적화 실험을 수행하였다.
<7-2> 제지 슬러지 농도에 따른 젖산 생산
SSF 공정을 위해서는 제지 슬러지를 가수분해한 후 생성된 글루코스를 바로 젖산으로 전환해야 한다. SSF 공정에서 제지 슬러지의 농도는 물질 이동을 위해 적정 농도에서 실시해야 한다. 임펠러와 전력(power) 문제 등의 문제점에 의해 교반이 잘 되지 않기 때문에 교반과 물질 이동이 용이한 범위 내에서 가수분해를 실시해야 한다. 따라서 슬러지 농도에서 적정 값을 찾고자 하는 실험이 필요하다. 이를 위해서 슬러지 5-10%에서 SSF 공정을 실시하여 그 적정값을 구하는 실험을 실시하였다.
그 결과를도 20및도 21에 나타내었다. 효소 첨가량은도 20에서는 천연 셀룰라제 10U/㎖과 β-글루코시다제 2U/㎖로 하였고,도 21에서는 천연 셀룰라제 5U/㎖, β-글루코시다제 2U/㎖로 하였다. 효소 농도에 따른 젖산 생산은 큰 차이가 없었다. 슬러지 5-10%에 따라 가수분해되어 생성되는 글루코스의 농도 및 L. 람노서스에 의해서 글루코스가 소모되는 것을 보여주고 있다. 제지 슬러지의 농도가 10%인 경우에 가수분해 속도가 감소하였다. 이는 제지 슬러지 농도가 증가함에 따라 점도가 증가하여 물질 이동에 영향을 주어 가수분해가 용이하지 않음을 보여준다. 젖산 생산은 농도가 증가함에 따라 일정하게 증가하였다. 즉, 셀룰로스의 가수분해를 위해서는 제지 슬러지가 낮은 농도이어야 하나, 발효조건에서는 제지 슬러지 10% 농도에서도 SSF 방법으로 수행하여 젖산을 생산하는 것이 가능하였다. 그러나, 이는 플라스크에서 실험을 실시한 것이고, 발효기를 이용한 SSF 공정시에는 제지 슬러지 농도를 효율적으로 조절할 필요가 있다.
<7-3> 제지 슬러지의 가수분해
제지 슬러지의 가수분해를 위해서는 효소가 필요하다. 그리고, 제지 슬러지의 가수분해에 있어 적정 효소의 첨가가 필요하며, 또한 최적 pH, 온도가 있다. SSF를 위해서 pH 5.5와 적정온도인 42℃, 슬러지 농도는 5%에서 실시하였다. SSF에서 효소 반응보다는 미생물 생장이 더 중요한 인자로 보인다. 즉, 공정 초기에는 글루코스가 생성되는 속도보다 글루코스가 소비되어 젖산로 전환되는 속도가 느리기 때문이다. 반응 초기에는 효소 반응이 빠르기 때문에 글루코스가 증가하며, 10시간 이후에는 미생물이 지수기(exponential phase)에서 정지기(stationary phase)로 가는 단계에 있기 때문에 글루코스 소모 속도가 증가되어 글루코스가 생산되는 속도보다 빠르게 된다. 일정 슬러지 농도에서 셀룰라제와 β-글루코시다제를 다양한 양으로 첨가하여 SSF를 실시하였다.
β-글루코시다제를 변화를 주어 실험한 결과는도 22에 나타냈으며, 셀룰라제를 변화한 결과는도 23a에 나타내었다. 효소 반응은 효소량이 증가함에 따라글루코스 농도가 증가하나, 그 증가량에 비해 젖산 생산은 차이가 거의 없다. 이는 적은 양의 효소로도 셀룰로스를 충분하게 가수분해할 수 있으며, 젖산으로 전환할 수 있음을 보인다. 따라서 이 후 실험은 천연 셀룰라제 5 U/㎖과 β-글루코시다제 2 U/㎖에서 SSF 공정을 수행하였다. 또한, 미생물 생장이 효소반응에 비해 늦게 시작되기 때문이며, 이로 인해 SSF에 영향 인자는 발효공정이라 볼 수 있으며, 발효공정을 앞당김으로서 보다 높은 수율을 얻을 수 있다.
또한, 효소 반응 공정과 발효 공정을 조합하여 공정을 실시할 경우에 온도와 pH에 대한 고려가 필요하다. 이에 반응온도 42 내지 46℃에서 글루코스 및 젖산 생산량을 비교하며 보면, 글루코스 생산량 및 젖산 생산량이 비슷하였으며, 이는 제지 슬러지를 이용한 젖산 생산 공정에서 최적 온도는 42 내지 46℃임을 알 수 있다(도 23b).
<7-4> 유가식 배양 방법에 의한 젖산 생산 1
효율적인 젖산 생산을 위해서는 유가식 배양(fed-batch) 또는 연속식 발효(continuous fermentation)가 필요하다. 젖산 생산에 있어 많은 양의 제지 슬러지 농도에 비해 생산되는 젖산은 낮은 농도이며, 이를 해결하기 위해서 발효 중간에 슬러지를 첨가해주는 유가식 배양 방법을 이용할 수 있다.
유가식 배양 방법은 초기에 물질 이동을 고려할 수 있다. 즉, 슬러지로 인한 배양액의 혼합이 원활하지 않은 현상을 초기에 적은 양의 슬러지를 첨가함으로써 극복할 수 있다. 초기에 적은 농도의 슬러지는 효소에 의해 셀룰로스가 가수분해되면서 배양액이 원활하게 교반할 수 있기 때문이다. 그리고, 중간에 첨가하는 양도 적은 농도의 슬러지를 첨가할 경우에도 교반에 지장을 초래하지 않는 범위에서 SSF를 실시할 수 있다. 미생물이 정지기에 도달했을 때 기질인 제지 슬러지를 첨가함으로써 젖산 생산을 극대화하였다.
그 결과를도 24에 나타내었으며, 대조군은 배지에 글루코스 첨가하여 측정하였다. 대조군의 경우는 글루코스 소모와 젖산 생산이 낮았다. 이는 플라스크 상에 실험으로 pH 조절의 어려움에 따라 pH 조절을 하지 않아 발효 배양액이 pH 3.5까지 떨어져 세포생장에 저해를 줬기 때문이다. 제지 슬러지를 첨가한 경우에는 제지 슬러지 내에 포함되어 있는 애쉬 중에 버퍼링(buffering) 효과를 내는 여러 이온 물질이 있기 때문에 pH를 유지시켰으며 최종 pH는 4.5였다. 제지 슬러지의 버퍼링 효과로 인해 발효기를 이용한 발효시 pH 조절에 용이하다.
<7-5> 유가식 배양 방법에 의한 젖산 생산 2
본 발명자들은 유가식 배양에서 슬러지를 첨가하는 농도를 운전부피를 기준으로 7% 슬러지로 젖산 생산을 수행하였다. 슬러지의 초기 농도를 8%로 작동하였으며, 배양 중간에 효소를 첨가하여 제지 슬러지 내의 셀룰로스 가수분해를 보다 빠르게 할 수 있게 하였다.
그 결과를도 25에 나타내었다. 초기에는 효소반응이 빠르기 때문에 글루코스가 생성되는 것을 볼 수 있다. 반응 후 12시간 이후에는 글루코스 생성 속도는 떨어지며, 그에 반하여 글루코스가 소비되는 속도가 빨라진다. 즉, 미생물이 지수기에서 정지기로 변하면서 많은 양의 글루코스가 젖산으로 변화됨을 알 수 있었다. 이 시기에는 오히려, 글루코스가 부족하기 때문에 젖산 생산 속도가 줄어드는 것을 볼 수 있다(도 25의A). 반응 50 시간 이후에는 미생물이 정지기를 유지하다가 사멸기(death phase)로 접어드는 시기임을 알 수 있다. 이 시기는 젖산 생산은 꾸준하나 또한 글루코스가 전부 고갈되지 못하고 5g/L 내외로 남아 있다. 이 시기에는 미생물의 활성이 높지 못하여 글루코스를 젖산으로 전화할 수 없거나, 이미 발효 배양액에 젖산 농도가 높기 때문에 젖산에 의한 저해 영향이라 추측할 수 있다. 상기 결과, 미생물의 지수기와 정지기에 충분한 양의 기질을 첨가한 경우에는 빠른 속도로 젖산을 생산하였다.
<7-6> 발효기를 사용한 젖산 생산
위 실험에서 소규모에서 SSF 공정을 실행하여 발효조건 및 반응조건을 구하였으며, 미생물의 생장시간을 고려하여 슬러지를 첨가하였다. L. 람노서스 배양에 있어서20g/L 글루코스인 경우 8시간에 정지기에 도달한다. 그러므로, 슬러지의 피딩(feeding) 시간을 8시간부터 시작하였다. 초기 작동 부피는 1L에서 실시하였으며, 유가식 배양 후 최종 부피는 1.9L로 측정되었다. pH는 5N NH4OH를 이용하여 5.0을 유지하였다.
유가식 배양의 결과는도26에 나타내었다. 젖산 생산은 62g/L로 플라스크에 비해 낮았다. 이는 슬러지의 첨가에 의한 부피증가로 더 이상 작동을 할 수 없었기 때문이다. 그러나, 총 슬러지의 첨가량은 총 부피에 22%이었으며, 본 실험에서 측정한 슬러지 내에 포함된 셀룰로스가 35%였으며, 이 경우 77g/L 셀룰로스가 첨가됨을 알 수 있다. 이 결과는 젖산 전환율이 80%임을 보이며, 슬러지내에 셀룰로스를 글루코스로 90% 전환하였을 경우에, 가수분해된 글루코스가 젖산으로 약 90% 전환했음을 보여준다. 또한, 생산성은 배양 32시간을 기준으로 하여 1.64g/L·h로 플라스크에서 배양한 결과인 0.98g/L·h보다 높은 결과를 보였다. 이는 슬러지 첨가시간을 앞당김으로써 정지기에 도달한 미생물들이 글루코스를 얻어 젖산으로 전환을 용이하게 한 것으로 보인다. 또한, 초기 작동 부피를 낮추어 실험을 시행하면, 보다 높은 생산과 생산성을 얻을 수 있을 것이다.
이전의 실험에서는 효소 반응과 발효의 최적 조건을 각각 구했으며, SSF 방법 수행시에는 대량생산에 부합하는 pH 및 온도 최적화가 필요하다. 이에 따라, SSF에서 젖산 생산을 위해서 pH에 따른 젖산 생산 결과 측정하였다. 기존 실험에서는 슬러지의 첨가량을 운전 부피에 7% 슬러지로 첨가하여 실험하였다. 이 결과, 운전 초기에는 불용성 부분이 많지 않아 물질 이동에 큰 영향을 주지 않았으나, 운전 말기에는 불용성 부분이 많아져 물질 이동에 영향을 미쳐 슬러지를 첨가한 직후에 효소가 슬러지내 셀룰로스를 가수분해하기가 용이하지 않았다. 이의 해결을 위해서 슬러지의 첨가량도 운전 부피 5% 슬러지로 줄여 첨가하였다.
<7-7> pH 조절에 의한 젖산 생산
기존 실험에서 슬러지는 pH 버퍼링 효과가 있었기 때문에 이번 실험은 pH 조절을 하지 않는 조건과 발효 조건에서 최적인 pH 6에 가까운 pH 5.8에서 발효를 비교하였다. 초기 운전 부피는 0.65L였으며, 최종 운전 부피는 1.5L였다.
그 결과, pH를 조절하지 않는 경우에는 젖산 생산이 81.2g/L이었으며, pH를 5.8로 조절한 경우에는 68.8g/L까지 생산하였다(도 27). pH를 조절하지 않는 경우, 배양 24시간에서 40시간까지는 pH가 떨어지는 것을 볼 수 있으며, 이 시기에는 발효 조건에 악 영향을 미쳐 젖산 생산이 줄어들었으며, 또한 글루코스 소비가 줄어드는 것을 볼 수 있다. 이는 pH 5 이상의 조건에서 발효를 실시해야 젖산 생산 및 글루코스 가수분해가 용이할 것으로 보인다. pH를 5.8로 조절한 경우, 발효조건에는 별 이상이 없으나 셀룰로스 가수분해가 pH를 조절하지 않는 경우보다 효과적으로 일어나지 않아 결과적으로 젖산 생산이 적었음을 볼 수 있다. 그러므로, pH 5.0-5.5 사이에 SSF 공정을 실시해야 할 것으로 보인다. pH를 조절하지 않은 경우 슬러지 내 셀룰로스 비율이 35%임을 감안하면, 총 105g/L 셀룰로스가 첨가됐음을 알 수 있다. 이에 따른 셀룰로스 당 젖산 전환율은 77.5%였으며, 셀룰로스가 글루코스로 전환되는 비율이 90%일 경우, 글루코스 당 젖산 전환율은 약 86%임을 알 수 있다. 배양 50시간을 기준으로 젖산 생산성은 1.48g/L·h였다. 최종적으로 첨가된 효소양은 천연 셀룰로스 17.1 U/㎖, β-글루코시다제는 3.8U/㎖이었다.
SSF 유가식 배양시에 첨가하는 슬러지는 65%가 물을 포함하고, 나머지가 고형분으로 존재하기 때문에 연속적으로 첨가하는 것이 어려우며, 기계적 장치를 이용하여 연속적으로 슬러지를 첨가할 경우에는 보다 효율적으로 공정을 수행할 수 있다.
또한, SSF 공정에서 유가식 배양으로 pH를 조절하여 공정을 실시한 결과, 최적 pH는 pH 5.0이었다(도 28). 상기와 같은 결과는 젖산 생산에서는 다소 불리하나, 효소 반응 공정에 유리하며 SSF 공정에서는 유리한 조건임을 알 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 제지 슬러지로부터 젖산을 생산하는 방법은 제지 슬러지의 셀룰로스를 가수분해하는 효소반응 공정 및 상기 효소반응 공정에서 생성된 글루코스를 기질로 사용하여 젖산으로 변환시키는 발효 공정을 포함하고 있으며, 저렴한 제지 슬러지를 이용하여 젖산의 기질인 글루코스를 생산함으로써 저렴하게 젖산을 생산할 있고, 상기 두 공정을 동시에 수행할 수 있게 공정 조건을 최적화함으로써 젖산을 대량 생산하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (7)

  1. 제지 슬러지를 가수분해하는 효소반응 공정 및 상기 효소반응 공정에서 생성된 글루코스를 젖산으로 변환시키는 발효 공정을 포함하는 젖산 생산방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 효소반응 공정은 셀룰라제(cellulase) 및 β-글루코시다제(glucosidase)를 첨가하여 제지 슬러지의 셀룰로스를 가수분해하는 것을 특징으로 하는 젖산 생산방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 발효 공정은 락토바실러스 속 또는 라이조푸스 속 미생물을 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 젖산 생산방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 효소반응 공정 및 발효 공정을 동시(simutaneous saccharification and fermentation)에 수행하는 것을 특징으로 하는 젖산 생산방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 방법은 유가식 배양(fed-batch)으로 수행하는 것을 특징으로 하는 젖산 생산방법.
  6. 제 4항에 있어서, 42 내지 46℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4항에 있어서, pH 5.0 내지 pH 5.5에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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