JP2004089177A - 製紙スラッジから乳酸を生産する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】乳酸を経済的に大量生産すること。
【解決手段】乳酸を生産する方法は、製紙スラッジを加水分解する酵素反応工程と、酵素反応工程で生成されたグルコースを基質に使用して乳酸に変換させる発酵工程とを同時に行なうことに関するものである。この本発明の乳酸生産方法によれば、低価の製紙スラッジを使用することで生産費用を節減できるだけではなく、２工程を同時に行うことにより生産時間を短縮して、乳酸を大量生産できる。
【選択図】図２８
【解決手段】乳酸を生産する方法は、製紙スラッジを加水分解する酵素反応工程と、酵素反応工程で生成されたグルコースを基質に使用して乳酸に変換させる発酵工程とを同時に行なうことに関するものである。この本発明の乳酸生産方法によれば、低価の製紙スラッジを使用することで生産費用を節減できるだけではなく、２工程を同時に行うことにより生産時間を短縮して、乳酸を大量生産できる。
【選択図】図２８
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、製紙スラッジを利用して乳酸を生産する方法に関するものである。より詳細には、製紙スラッジを加水分解する酵素反応工程と酵素反応工程で生成されたグルコースを基質に使用して乳酸に変換させる発酵工程とを行ない、乳酸を生産する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
環境保存とエネルギー資源の需要を減少しようという世界的な努力の一環として、有機廃棄物の再使用が国内外的に活発になされている。有機廃棄物には、製紙類の再使用工程で廃棄される製紙スラッジ、穀物を収穫後に廃棄される澱粉及び繊維素がある。この中で韓国国内で廃棄される有機物中、廃紙は年間８３０ 万トンが発生し、この中で再活用される廃紙は、５００ 万トンと６０％ の再活用率を示している（ 環境統計年鑑 ２００１ 、１４号、環境部） 。そして、有機廃棄物の一つである飲食廃棄物は、年間４２０ 万トンが発生し、有機性スラッジ類は、５５０ 万トンが発生している（ 環境統計年鑑 ２００１ 、１４号、環境部） 。また、山林資源から得られる木質系及びその廃棄物を使用できる。上記有機廃資源は、生物工学的方法によって加水分解され、乳酸生産微生物の炭素源等、有用な生物資源に使用できる。一方、製紙類の再使用工程では、重さにして５ 〜４０％ の紙類が使用されないスラッジとして廃棄されている。このスラッジの３０〜４０％ は、短い繊維素が主流を成している。韓国の製紙産業から発生したスラッジの総量は、１９９２年基準で年間約 ９０２千トンにのぼる。このような莫大な量のスラッジは、主に焼却によって処理されているが、スラッジに相当量の水（６０％以上） が含まれているため、燃料を加えて焼却処理しなければならない。２００１年基準で廃棄物処理業者の委託製紙スラッジ処理費用は、平均的に１トン当たり約４０，０００ウォンであり、スラッジ処理費用に約４００ 億ウォン以上の費用がかかっている。
【０００３】
産業的に有用な有機酸として代表的な乳酸（Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ） は、３ 炭素からなる有機酸（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、ＣＯＯＨ−ＨＣＯＨ−ＣＨ３）で、ブドウ糖の嫌気性発酵によって生産される。乳酸の産業的用途は、工業用５５％ 、食品用４０％ 、医薬用５％で、食品用は主に酸味剤に使用され、工業用は、皮革産業と化粧品用湿潤剤に使用されている。医薬分野で最近注目されている用途開発は、生分解性高分子のポリ乳酸である。現在は、ポリ乳酸の価格が高く汎用使用されずにいるが、大量生産によって価格が下がれば、その膨大な需要が予測される。韓国の場合、生分解性高分子市場が近い将来に約５００ 億ウォンに達する展望であり、ポリ乳酸はこの市場の相当な部分を占めることができると予測されている。
【０００４】
しかし、今まで乳酸を手頃な価格で生産する方法が開発されておらず、現在はポリ乳酸の生産のための乳酸を全量輸入に依存している実情である。家畜飼料の機能性添加剤としての乳酸の産業的需要も増加している現実であり、これに対する手頃で大量的な乳酸生産方法の開発が急がれている。
【０００５】
そこで、本発明者達は、製紙スラッジ内のセルロースを加水分解してグルコースを生産し、該グルコースを基質に使用して経済的に乳酸を生産する方法を開発することによって、本発明を完成した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、経済的でありながらも、大量生産が可能に乳酸を生産するための方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、製紙スラッジから乳酸の基質であるグルコースを生産する酵素反応と、該グルコースを乳酸に変換させる発酵工程とを含む乳酸生産方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、製紙スラッジを加水分解する酵素反応工程と、該酵素反応工程で生成されたグルコースを乳酸に変換させる発酵工程とを含む乳酸生産方法を提供する。
【０００９】
本発明では、乳酸を生産するための基質を大量生産するために、手頃に大量に得られる製紙スラッジを使用して乳酸の基質であるグルコースを生産する。製紙スラッジを再活用することによって、乳酸生産の費用を大幅に減らして、廃棄物の処理にかかる費用を節減できる。
【００１０】
本発明の乳酸生産方法は、製紙スラッジ内のセルロースからグルコースを生産する工程と、該グルコースを基質に使用して乳酸に変換させる発酵工程とに分けられる。
【００１１】
本発明の製紙スラッジ内のセルロースからグルコースを生産する方法は、セルロースを分解する酵素を添加して反応させることによって行なうことができる。上記セルロースを分解してグルコースを生産する酵素としては、エンド− グルカナーゼ（ｅｎｄｏ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）、エキソ− グルカナーゼ（ｅｘｏ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ） 及びβ−グルコシダーゼ（ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）で構成される群から選択した一つ以上の酵素を使用できるが、これに限定されるものではなく、セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ） 及びβ−グルコシダーゼ（ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を使用することが好ましい。セルラーゼは、エンド− グルカナーゼ（ｅｎｄｏ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）とエキソ− グルカナーゼ（ｅｘｏ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ） から構成される。セルラーゼは、これらのグルカナーゼの複合的機能によりスラッジ内のセルロースを分解してセロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）という二糖類を生成する。また、β−グルコシダーゼ（ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）は、前段階で生成されたセロビオースを分解してグルコースをつくるのに関与する。
【００１２】
上記酵素反応工程は、上記で使用した酵素が活性を示す温度及びｐＨの範囲内で行なうことができ、３２℃ないし５０℃で行なうことが好ましく、４２℃ないし４６℃で行なうことがさらに好ましい。ｐＨは、ｐＨ４．８ ないしｐＨ６．０ で行なうことが好ましく、ｐＨ５．０ で行なうことがさらに好ましい。酵素反応工程は、５０℃で行なうことが好ましいが、微生物が成長する温度は、３７℃が好ましいので二条件の中間点の４２℃ないし４６℃で反応を行なうことが、乳酸生産に最も好ましい温度である。また、酵素反応ｐＨは、ｐＨ５ で行なうことが好ましく、微生物の成長するｐＨは、ｐＨ６ が好ましいため、二条件の最適条件は、ｐＨ５ である。
【００１３】
本発明の方法では、上記酵素反応工程を通じて生成されたグルコースを基質に使用して、乳酸に変換させる発酵工程を行なう。本発明の発酵工程では、グルコースを基質に使用して乳酸を生産できる微生物を添加して培養することによって乳酸を生産できる。発酵工程に添加される微生物は、特別に限定されるものではないが、ラクトバシラス属またはリゾプス属微生物であることが好ましく、ラクトバシラスラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） 、リゾプスオリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ） 及びラクトバシラスデルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｌｂｒｅｕｋｉｌｌ）で構成された群から選んだ一つまたは二つ以上を添加して培養することがさらに好ましく、ラクトバシラスラムノーサスを使用することが最も好ましい。ラクトバシラスラムノーサスによって乳酸を生産する工程は、３７℃で行なうことが好ましい。また、ｐＨは、ｐＨ６．０ で行なうことが好ましい。また、培養速度は、スラッジの濃度によって１００ｒｐｍないし５００ｒｐｍで行なうことが好ましい。
【００１４】
具体的に、Ｌ．ラムノーサスを利用してグルコースから乳酸を生産する発酵工程を行なった後、発酵工程を通じて生成された培養液（ｂｒｏｔｈ） の成分を分析した。その結果、ＨＰＬＣカラムを通過した有機酸は、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ） 、コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ） 、乳酸、蟻酸（ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ） 、酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ） 、プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）の順に各々１０、１４、１５、１６、２１．５ｍｉｎ で検出された。色々な有用有機酸が生産されたが、９７％ 以上の主要生産物は乳酸だった（ 図１８参照） 。
【００１５】
本発明では、酵素反応工程と発酵工程を別々に分離して行なったが、酵素反応工程と発酵工程を同時に行なうこともできる。上記のように酵素反応工程及び発酵工程を行なうための方法として、酵素反応工程及び発酵工程を別々に分離して行なう順次発酵（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； 以下「ＳＦ」と略称する） または二工程を同時に行なう同時糖化発酵（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；以下「ＳＳＦ 」と略称する） 方法が利用できる。本発明の乳酸生産方法は、ＳＳＦ 方法で行なうことが好ましく、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ） または連続式発酵（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ） で行なうことがさらに好ましい。流加培養というのは、初期に入れた基質が消費され、微生物がそれ以上成長できなくなった時に、基質を発酵器に入れて微生物がさらに成長できるようにする方法である。本実験では、製紙スラッジを入れて製紙スラッジが酵素によってブドウ糖に転換されると、基質として利用できるようにした。
【００１６】
ＳＦは、酵素反応と発酵を分離して実施する方法である。ＳＦ法では、酵素反応工程で生成された反応液だけを別に分離して発酵工程に適用して、スラッジ内に最も多く含まれているアッシュ（ａｓｈ） 部分を除去できる。また、酵素反応工程と発酵工程を分離して実施すると最適条件で各工程が行なわれるため、各工程での生産性が増加する。しかし、酵素反応工程で過剰量のスラッジを加水分解しても撹拌の困難さによってスラッジの１５％ 以上を加水分解できず、条件を満たすために装置にかかる経済的負担と生産時間遅延等の問題点がある。
【００１７】
それに比べて、スラッジを利用したＳＳＦ 法は、スラッジ内のセルロースを加水分解してグルコースを生成し、同時に発酵を通して乳酸を生産する。ＳＳＦ 方法は、装置の単純化と工程時間節約の長所があり、酵素を利用した加水分解から生じる基質阻害反応を減らすことによって、乳酸生産効率を向上せられる長所を持っている。したがって、ＳＳＦ 方法は、ＳＦ方法に比べて工程時間の短縮と酵素反応での産物阻害（ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を抑制できる。また、高濃度培養が容易で、工程を単純化でき、流加培養（ ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ） 時のスラッジ添加による物質移動（ｍａｓｓｔｒａｎｓｆｅｒ） の問題も大きくない。始めから高い濃度のスラッジを添加すれば、発酵液の粘度が上昇するため撹拌が困難となる。この問題を解決するために、初期に低い濃度スラッジを添加するようにすると、酵素がすぐに繊維素を分解するため、撹拌に大きな問題が起きず、物質移動に効果的である。また、スラッジ内の不溶性部分であるアッシュ部分は、乳酸生産後に微生物と一緒に除去することが有利である。
【００１８】
本発明で、酵素反応工程及び発酵工程を同時に行なうＳＳＦ の工程条件は、４２℃ないし４６℃で行なうことが最も好ましい。また、反応ｐＨは、ｐＨ４．８ ないしｐＨ６．０ で行なうことが好ましく、ｐＨ５．０ ないしｐＨ５．５ で行なうことがさらに好ましく、ｐＨ５．０ で行なうことが最も好ましい。これは、微生物生長と酵素反応条件の組み合わせが適切であるためである。また、培養速度は、スラッジの濃度によって変えられ、１００ｒｐｍないし５００ｒｐｍで行なうことが好ましい。また、ＳＳＦ 工程に使用される製紙スラッジの濃度は、１０％ 以下であることが好ましく、５％ないし１０％ であることがさらに好ましく、５％ないし８％であることが最も好ましい。製紙スラッジの濃度が高くなると、反応器での撹拌がたやすくなく、上記のような製紙スラッジ濃度で反応を行なうことが好ましい。
【００１９】
基質であるスラッジ量が多いほどグルコースの初期生成速度は、増加する（ 表１ 参照） 。しかし、一定量以上の基質が添加された場合には、スラッジと酵素間の円滑なコンプレックス（ｃｏｍｐｌｅｘ） 形成が難しい。ＳＳＦ 工程でスラッジの濃度は、物質移動のために適正濃度でなければならず、高濃度ではインペラーと電力（ｐｏｗｅｒ） 等の問題点によって撹拌がうまく行かないため、撹拌と物質移動が容易な濃度範囲内で加水分解を行なわなければならない。インペラーは、発酵器内の物質を撹拌する装置である。
【００２０】
酵素反応工程で酵素量が増加するにつれて、グルコース濃度が増加するが、その増加量に比べて乳酸生産量の差はほとんど無い。これは、少ない量の酵素でもセルロースを充分に加水分解できることを示している。また、微生物生長が酵素反応に比べて遅くに始まるため、発酵工程を先行させることによってより高い乳酸生産収率が得られる。
【００２１】
ＳＳＦ 工程で効率的な乳酸生産は、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ） 及び連続式発酵（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ） によって行なえる。乳酸生産において、スラッジ濃度が高い濃度であるのに比べ、生産される乳酸は、低い濃度であり、これを解決するために、発酵途中にスラッジを添加する流加培養方法を利用できる。バッチ方法は、回分式培養方法とも言うが、これは、初期に基質と微生物、酵素を一度に入れて、乳酸を生産する方法である。また、流加培養は、初期に基質、微生物酵素を入れて、発酵途中に基質が枯渇するにしたがって基質及び酵素を入れることである。連続式発酵は連続培養とも言い、基質及び酵素を連続的に入れる方法である。流加培養では、基質が一定の濃度を維持するように基質を連続的に入れることが重要であり、微生物生長速度に基づいて基質を添加する。本発明では、酵素反応速度によって製紙スラッジ内の繊維素が７０〜８０％ 分解された時点で基質を添加した。
【００２２】
流加方法は、初期の物質移動を考慮できる。つまり、スラッジによって培養液の混合が困難となる現象を、初期に添加するスラッジを少量にすることによって克服できる。初期の低濃度のスラッジにより、酵素によってセルロースが加水分解されつつ、培養液が円滑に撹拌できる。そして、途中で添加する量も、低濃度のスラッジを添加する場合、その量を撹拌に支障をきたさない範囲にして、ＳＳＦ 方法を実施できる。また、微生物が静止期に到達した時、スラッジを添加することによって乳酸生産を極大化する。
【００２３】
本発明の好ましい実施例では、流加培養方式でＳＳＦ を行なった。スラッジの初期濃度を８％にし、培養途中に酵素を添加して製紙スラッジ内のセルロース加水分解をより速くした。その結果、初期には酵素反応が速いためグルコース生成が大きく増加したが、反応１２時間以後にはグルコース生成速度は減少し、それに反してグルコースが消費される速度が増加した（ 図２６Ａ 参照） 。これは、微生物が指数期から静止期に変化しながら多くの量のグルコースが乳酸に変化されたことを示している。この時期には、グルコースが不足するため、かえって乳酸生産速度が落ちた（ 図２６Ｂ 参照） 。反応５０時間以後には、微生物が静止期を維持したあと死滅期（ｄｅａｔｈ ｐｈａｓｅ） に近づく時期であり、この時期は、乳酸生産は一貫している。またグルコースは全部枯渇しないで５ｇ／Ｌ前後で残っていた。その理由は、この時期には、微生物の活性が高くなくグルコースを乳酸に転換できないか、すでに発酵培養液の乳酸濃度が高いための乳酸による阻害影響のためである。上記結果から、微生物の指数期と静止期に充分な量の基質を添加した場合に、速い速度で乳酸を生産できることが分かった。ＳＳＦ 方法では、乳酸生産時に製紙スラッジを添加する時間を先行させることによって、静止期に到達した微生物がグルコースを得て乳酸へ容易に転換できる。
【００２４】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
但し、下記実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】
＜ 実施例 １＞ ラクトバシラスラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） からの乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ） 生産
本発明者達は、乳酸生産のための菌株にラクトバシラスラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） を使用し、上記ラクトバシラスラムノーサスが乳酸を生産するための最適条件を調べた。Ｌ．ラムノーサスは、Ｌ−（＋）−乳酸を生産する菌株で光学純度（ｏｐｔｉｃａｌ ｐｕｒｉｔｙ）が約９５％ 、およびグルコース対比約９５％ の生産収率を持っている。Ｌ．ラムノーサスを培養するためにＭＲＳ 培地（Ｄ−（＋）−ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．） 、ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ．） 、（ＮＨ４）２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．） 、ＫＨ２ＰＯ４（Ｓｈｉｎｙｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．） 、ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２Ｏ（Ｓｈｉｎｙｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．） 、Ｋ２ＨＰＯ４（Ｓｈｉｎｙｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．） 、ＦｅＳＯ４ ・７Ｈ２Ｏ（Ｄｕｋｓａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．））を使用した。種菌培養は、フラスコを利用してシェーキング培養器（ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ） で培養した。乳酸生産収率を高めるための本培養は、発酵器（ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ） を利用して培養した。培養条件は、種菌培養の場合３７℃、１００ｒｐｍで培養し、本培養でも同じ条件で培養した。ｐＨの調節は、ＮａＯＨを利用して、ｐ Ｈ４．８ 〜６．０ の範囲とした。
【００２６】
分析方法は、試料を採取して細胞濃度、グルコース濃度、乳酸濃度を分析した。細胞濃度は、分光測定器（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ； ＧＥＮＥＳＹＳ ５ 、Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．） で、６００ｎｍ で測定した。グルコースと乳酸濃度はグルコース分析器（ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎａｌｙｚｅｒ； ＹＳＩ ２７００ ＳＥＬＥＣＴ、Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）で測定した。
【００２７】
乳酸生産のためのＬ．ラムノーサスの種菌培養は、２５０ｍｌ フラスコに１００ｍｌ のＭＲＳ 培地を入れ、そこに１％のＬ．ラムノーサスを接種して、シェーキング培養器で２４時間培養した（ 種菌培養は、本培養の１０％）。その後、本培養は、２．５Ｌ発酵器に１ＬのＭＲＳ 培地を入れ、そこに種菌培養したＬ．ラムノーサス培養液を接種した。
【００２８】
図１ は、Ｌ．ラムノーサスを細胞生長のＯＤ値を測定して分析したものである。図２ は、発酵中グルコース消耗量と乳酸生成量を示したものである。Ｌ．ラムノーサスは、接種後約１３時間後に静止期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ）に到達した。グルコースは、培養を始めてから２０時間後、全部消耗され、乳酸が生じた。乳酸生産収率は、約７３％ だった。 Ｌ． ラムノーサスによる乳酸生産の最適条件は、３７℃、１００ｒｐｍだった。
【００２９】
＜ 実施例 ２＞ ラクトバシラスラムノーサスの乳酸生産に温度がおよぼす影響
Ｌ． ラムノーサスによる乳酸生産において色々な温度による細胞生長、グルコース消耗量、乳酸生産量を測定することによって、その後の乳酸生産の為の発酵条件を最適化する実験を実施して、複合生物工程技術開発における基礎資料に利用しようとした。
【００３０】
具体的に、乳酸生産のためのＬ．ラムノーサスの培養方法及び培地組成は、実施例１と同一にし、温度だけを変えて２．５Ｌ発酵器で培養した。温度は３２、３７、４２、４６または５０℃にした。これは、Ｌ．ラムノーサスの培養最適温度が３７℃で、酵素反応の最適温度は５０℃だからである。ＳＳＦ 工程の最適化の為に適する温度を求めるために３７〜５０℃間の温度条件で実験を行なった。本実験で各々の温度による細胞生長、グルコースの濃度、乳酸の濃度を測定してその数値を比較した。
【００３１】
その結果、細胞生長においては、３７℃で最も早く静止期に到達し、残りの３２、４２、４６℃も培養を開始後約２０時間後に静止期に到達した。しかし、５０℃の場合細胞生長が他の温度に比べて非常に低かった（ 図 ３） 。グルコース濃度もやはり３７℃で培養後２０時間経過後すべて消耗され、３２、４２℃の場合は類似の速度で約４０時間以後に全部消耗された（ 図 ４） 。細胞生長中４６、５０℃の場合は、グルコースの消耗速度が遅いだけではなく、培養が完全に終了した５０時間以後にも２０〜２３ｇ／Ｌ のグルコースが消費されなかった。培養中に乳酸は、最も早い細胞の生長及びグルコース消耗量を見せた３７℃で最も多く生産され、３２℃と４２℃では３７℃より遅いけれど類似の量の乳酸生産が見られた。しかし、４６℃と５０℃ではグルコース消耗量が少ないためさらに少ない乳酸生産が見られた（ 図 ３〜 ５） 。
【００３２】
Ｌ．ラムノーサスの温度による生長及び乳酸生産を見てみると、細胞生長の場合３７℃で最大を示したが、乳酸生産の場合は４２℃で３７℃より若干高い生産量が見られたが、乳酸生産速度は３７℃の方が速いため、乳酸生産のためのＬ．ラムノーサスの最適温度は３７℃だった（ 図 ５） 。
【００３３】
＜ 実施例 ３＞ ｐＨによる発酵の影響
Ｌ． ラムノーサスによる乳酸生産で温度とともに重要な影響を及ぼす因子は、ｐＨである。一般的にＬ．ラムノーサスの最適ｐＨは６．０ で、酵素加水分解の最適ｐＨは４．８ である。したがって、本実験では、ｐＨ４．８ とｐＨ６．０ 間で最も最適な条件を探し出そうとした。本実験は、このような研究の基礎資料として色々なｐＨ条件での実験を行なった。
【００３４】
具体的に、Ｌ．ラムノーサスの培養条件及び培養培地の組成は、実施例１と同一にし、温度は３７℃に固定した。各々の培養でｐＨを変えて調節して実験した。ｐＨの調節の為に１０Ｎ ＮａＯＨを使用した。ｐＨは４．８ 、５．０ 、５．５ 、６．０ で実施し、試料採取後、細胞の濃度、グルコース消耗量及び乳酸生産量を測定して比較した。
【００３５】
その結果、実際、乳酸生産でのｐＨの影響が多くの実験を通して分かった。各ｐＨに対する対する細胞生長は、ｐＨ６．０ の場合に最も高く、ｐＨ４．８ と５．５ の場合に類似の結果を得た。ｐＨ５．０ の時に多少低い細胞生長を示した。グルコース消耗量もまたｐＨ６．０ の場合は全部消耗されたが、ｐＨ５．５ の時には約８ｇ／Ｌ程度が消費されなかった。ｐＨ４．８ と５．０ の時は、３０〜４０ｇ／Ｌ 程度のグルコースが消費されなかった。乳酸生産はｐＨ６．０ の場合に約８２ｇ／Ｌ 生産された。ｐＨ５．５ の場合に７２ｇ／Ｌ 程度生産された。ｐＨ４．８ と５．０ の場合は５０〜６０ｇ／Ｌ 程度の類似の生産を示した（ 図 ６、図 ７及び図 ８） 。
【００３６】
＜ 実施例 ４＞ 発酵による酵素分解
ＳＳＦ法では、発酵時に酵素を一緒に添加するため、本実験では、発酵条件による酵素不活性化（ｅｎｚｙｍｅ ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ） がどの程度であるか調べた。
【００３７】
具体的に、温度を変えた二つの恒温槽（３７ ℃、４２℃） に二種類の培地（ＭＲＳ、ＭＲＳ 培地に比べて窒素源の濃度を５ｇ／Ｌに低めた培地） を利用して、酵素が分解される程度と細胞濃度を測定した。細胞濃度はＯＤ値（６００ｎｍ） を測定して分析した。酵素活性は、ＤＮＳ（ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）方法を使用した。
一般的に、糖は非還元糖と還元糖に別れ、ＤＮＳ 方法は還元糖の分析方法であり、還元糖であるぶどう糖がＤＮＳ で発色反応を起こすことを吸光度測定機で分析した。（Ｇｈｏｓｅ， Ｔ．Ｋ． Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ． Ｃｈｅｍ． １９８７ 年、第５９巻、Ｐ．５７−２６８、Ｗｏｏｄ， Ｔ．Ｍ． ａｎｄ Ｋ．Ｍ． Ｂｈａｔ． 、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， １９８８ 年、Ｍａｎｄｅｌｓ， Ｍ． ａｎｄ Ｒ．Ｅ． Ａｎｄｒｅｏｔｔｉ．， Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９７８年、第１２巻、Ｐ．６−１３）。
【００３８】
ＭＲＳ 培地は、酵母抽出物とペプトンが添加され窒素源の比率が高い。産業的に乳酸を生産するためには窒素源の量を減らす必要がある。そこで窒素源の濃度を５ｇ／Ｌに下げた産業培地とＭＲＳ 培地を使用して、乳酸生産比較実験を実施した。また、少ない量の窒素源を添加することによって、微生物が酵素を窒素源に転換して使用するかどうかついて調査した。
【００３９】
その結果、全般的にＭＲＳ 培地に比べて窒素源が低い培地がＭＲＳ 培地よりも、各々の温度で高い細胞濃度を示した。上記二種類の培地は両方が４２℃でよりも３７℃で高い細胞濃度を示した。
【００４０】
酵素分解程度は、ＦＰａｓｅ 活性測定に基づいて評価する。ＦＰａｓｅ 活性測定は、フィルターペーパーが加水分解される程度を示して酵素の活性を測定するフィルターペーパー（ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ）活性測定方法で行なう。ＦＰａｓｅ 活性は温度４２℃で減少するように見えるが（図１１）、酵素分解はＬ．ラムノーサスの生長によっては大きく影響を受けないことを示している。また、微生物が酵素を窒素源に使用する比率が少ないことを間接的に確認した。むしろ、セルロース及びアッシュ（ａｓｈ） によるセルロースの不活性化が大きいことを示している（ 図 １０ 及び図 １１）。
【００４１】
＜ 実施例 ５＞ 酵素（ β−グルコシダーゼ、セルラーゼ） を利用したスラッジの糖化
本発明者達は、以前の実験を通じて明らかにした酵素の最適条件（ｐＨ４．８、温度５０℃） をパターンとして使用し、ＳＳＦ（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ） によってＬ．ラムノーサスの生存まで考慮した酵素の最適条件を調べ、またこのような酵素による初期加水分解速度（ｉｎｉｔｉａｌ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｒａｔｅ） と酵素の活性がどの程度まで維持されるのか調べるための半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ） を測定した。
【００４２】
具体的に、ナトリウムアセテート緩衝液（Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）１７ｍｌ（ｐＨ ４．８） に３．２８ｇ （６４％ウェットスラッジ）のスラッジを入れ、最終５ ％（ｗ／ｖ）含量になるようにして３７、４２、４５、５０℃の恒温槽に１０ユニットのセルラーゼ（０．０６１ｇ）と５ ユニット（０．２１ｍｌ）のβ−グルコシダーゼを入れ、反応させた後、生成されたグルコースの濃度を分析した。スラッジがアルカリ性を帯びているため、緩衝液のｐＨは４．８ であるが、混合後の実験時にはｐＨ５．６ まで上昇した。これを再びｐＨ４．８ に調整後、既存実験と比較した。スラッジ１ 、３ 、５ 、７％に若干の酢酸を添加してｐＨ４．８ に調整した後、１０ユニットのセルラーゼ（０．０６１ｇ）と５ ユニット（０．２１ｍｌ）のβ−グルコシダーゼを入れ、基質の量による初期加水分解速度を測定した。
【００４３】
スラッジを添加して培養し生成されたグルコース量を測定後、下記の数式１によりスラッジ内セルロース当たりのブドウ糖転換率を計算した。
本発明で使用したスラッジ（６４％ウェットスラッジ）に含まれているセルロースの量は、乾燥スラッジの重量の３５％である。
スラッジ内セルロース当たりブドウ糖転換率（％）＝
（グルコース生産量／添加したスラッジ内セルロース量）×１００ …（１）
５ ℃の温度差で酵素反応を行なって培養終了後最終時間のスラッジ内セルロース当たりブドウ糖転換率を計算した結果、３７℃では４４％ のセルロース当たりブドウ糖転換率を示し、４２℃では４５％ のセルロース当たりブドウ糖転換率を示した。初期にはある程度の速度差が見られたが、反応時間を長くすればこの差は微微たるものとなった（ 図 １２）。
【００４４】
また、培養終了後最終時間のｐＨ５．６ でのセルロース当たりブドウ糖転換率は、４５％ である反面、ｐＨ４．８ ではセルロース当たりブドウ糖転換率が６７％ 程度と高かった。４５℃と５０℃でのセルロース当たりブドウ糖転換率差は、大きくなく、４２℃で行なった実験とも大差が見られなかった。温度の影響よりもむしろｐＨの影響をさらに多く受けるようである。従って、同時糖化は、４０〜４２℃で行なうことがもう少し有利な方法であるように思われる（ 図 １３ 、図 １４ 及び図 １５）。
【００４５】
以下の表１ のように、基質であるスラッジ量が多いほど初期生成速度は増加する。しかし、一定量以上の基質が添加された場合には、スラッジと酵素間の円滑なコンプレックス（ｃｏｍｐｌｅｘ） 形成が難しい。そのため反応初期にグルコース生成が起きず初期加水分解速度測定に無理が伴う。一連の実験を通じて表２ の結果を得ることができた（ 図１６及び図１７） 。ＳＳＦ を行なうための適切な条件は、ｐＨ５ 〜５．２ 、温度４０〜４２℃である。上記実験は、二段階に分けて得た結果であるので実際ＳＳＦ 実験結果とは若干の誤差が見られる。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【表２】
【００４８】
＜ 実施例 ６＞ ラクトバシラスラムノーサスを利用した発酵培養液の成分分析
本発明者達は、Ｌ．ラムノーサスを利用した発酵工程で生産される有用有機酸の正確な成分分析をした。
【００４９】
具体的に、有機酸生産のための菌株は、Ｌ．ラムノーサスを利用した。培養期間は、５０時間とした。培養条件は、温度３７℃、１００ｒｐｍで、１０Ｎ ＮａＯＨを使用してｐＨ調節しｐＨ６ とした。有機酸分析は、ＨＰＬＣを利用した。使用したカラムは、ＨＰＸ−８７Ｈ（Ｂｉｏｒａｄ Ｃｏ．） 、移動相（ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）は、０．０８Ｎ Ｈ２ＳＯ４ 、流速（ｆｌｏｗ ｒａｔｅ） は、０．５ｍｌ／ｍｉｎ である。ＵＶ検出器（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）はウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）４８６ モデルを使用し、波長は、２１０ｎｍ である。
【００５０】
発酵工程を通じて生成された培養液（ｂｒｏｔｈ） の成分分析をした結果、ＨＰＬＣカラムを通過した有機酸は、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ） 、コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ） 、乳酸、蟻酸（ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ） 、酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ） 、プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）の順に各々１０、１４、１５、１６、２１．５ｍｉｎ で検出された。このような結果は、フラスコを使った実験でも類似だった。色々な有用有機酸が生産されたが主要生産物は、乳酸だった（ 図 １８）。二実験ともグルコース対比９７％ 以上の乳酸が生産された。
【００５１】
＜ 実施例 ７＞ 製紙スラッジからの乳酸生産
＜７−１＞ ＳＳＦ 及びＳＦによる乳酸生産
乳酸生産のためには乳酸の基質であるグルコースが必要である。それで本発明者達は、製紙スラッジ内のセルロースを加水分解して手頃な価格でグルコースを大量生産した。セルロースを加水分解してグルコースを生産するために、セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを利用した製紙スラッジの加水分解程度が、製紙スラッジ濃度によって決定される。加水分解可能な製紙スラッジの濃度が１５％ の場合、グルコースは３７ｇ／Ｌ まで生産された。故に、回分式（ｂａｔｃｈ） 培養時、製紙スラッジ内セルロースを加水分解して得られるグルコースの濃度はスラッジ内に３５％ のセルロースがあることをふまえて、グルコースが乳酸に９０％ 転換されると、乳酸３３ｇ／Ｌ が生産される。ＳＦ工程を流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ） で実施した場合、酵素反応液内グルコース含量が少ないために酵素反応液を再び蒸留する工程が必要であり、これは、装置を追加しなければならない経済的負担を招来する。回分式（ｂａｔｃｈ） 培養は、一度に生産を実施するため、スラッジ濃度が高ければ乳酸生産が高い。しかし、製紙スラッジ濃度が高いために撹拌が難しく、低い濃度の乳酸しか生産できない。流加培養には、発酵途中に継続して基質を添加するので、一つの発酵器で最適の生産性と生産濃度を得られるという利点がある。連続式培養では、製紙スラッジの濃度を高くすることができないため乳酸生産濃度が低く、製紙スラッジが固体であるため運転上の難しさが多い。
【００５２】
結論として、ＳＳＦ 工程は、ＳＦ工程に比べて工程時間を短縮し、酵素反応での産物阻害（ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を抑制する。また、高濃度培養が容易で、工程を単純化でき、流加培養時のスラッジ添加による物質移動の問題も大きくない。また、製紙スラッジ内不溶性部分であるアッシュ部分を、乳酸生産後に微生物とともに除去することが有利である。
【００５３】
乳酸生産のためにＬ．ラムノーサスを培養するための培地組成を下記に示す。廃紙スラッジ、酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ．）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．） 、ＫＨ２ＰＯ４（Ｓｈｉｎｙｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．） 、ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２Ｏ（Ｓｈｉｎｙｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．） 、Ｋ２ＨＰＯ４（Ｓｈｉｎｙｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．） 。種菌培養は、シェーキング培養器で２０時間培養した。ＳＳＦ のための実験は、１００ｍｌ フラスコで運転体積（ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ）２０〜３０ｍｌで実施した。培養条件は、種菌培養の場合３７℃、１５０ｒｐｍで培養した。本培養では酵素作用を考慮して４２℃、１５０ｒｐｍで培養した。分析方法は、試料を採取してグルコース濃度、乳酸濃度を分析した。グルコース濃度と乳酸濃度は、グルコース分析機（ＹＳＩ ２７００ ＳＥＬＥＣＴ、Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）で測定した。
【００５４】
乳酸生産のためにＳＳＦ またはＳＦ方法で行ない、グルコース消費及び乳酸生産を比較した。ＳＳＦ は４０℃、ｐＨ６ で実施をし、ｐＨ調節はしなかった。またＳＦ工程は、酵素反応は５０℃で実施し、酵素反応終了５ 時間後に発酵工程を実施した。対照群は、グルコースを基質に利用した。
【００５５】
その結果、グルコース消費と乳酸生産が同じように現れた。ＳＦ工程の利点は、酵素反応と発酵を分離して実施することによって、各工程をそれぞれの最適条件で実施できることにある。しかし、実験の結果、ＳＳＦ 工程と比較して乳酸生産と生産収率が大きな差が無いことが分かった（ 図１９） 。それで、装置的利点を持っているＳＳＦ 工程を選択して最適化実験を行なった。
【００５６】
＜７−２＞ 製紙スラッジ濃度による乳酸生産
ＳＳＦ工程のためには、製紙スラッジを加水分解した後、生成されたグルコースをすぐに乳酸に転換しなければならない。ＳＳＦ 工程での製紙スラッジの濃度は、物質移動のために適正濃度で実施しなければならない。インペラーと電力（ｐｏｗｅｒ） 問題等の問題点による撹拌の困難さを回避するため、撹拌と物質移動が容易な範囲内で加水分解を実施しなければならない。したがって、スラッジ濃度の適正値を探す実験が必要である。そのためにスラッジ５ 〜１０％ でＳＳＦ 工程を実施してその適正値を求める実験をフラスコ内で実施した。
【００５７】
その結果を図２０及び図２１に示した。酵素添加量は、図２ ０では天然セルラーゼ１０Ｕ／ｍｌとβ−グルコシダーゼ２Ｕ／ｍｌ にした。図２１では天然セルラーゼ５Ｕ／ｍｌ 、β−グルコシダーゼ２Ｕ／ｍｌ にした。酵素濃度による乳酸生産は、大きな差がなかった。スラッジ５ 〜１０％ により加水分解され生成されるグルコースの濃度及びＬ．ラムノーサスによってグルコースが消耗されることを示している。製紙スラッジの濃度が１０％ の場合に加水分解速度が減少した。これは、製紙スラッジ濃度が増加するにしたがって粘度が増加して物質移動に影響を与え、加水分解が容易ではなかったことを示している。乳酸生産は、濃度が増加するにしたがって一定に増加した。つまり、セルロースの加水分解のためには製紙スラッジが低い濃度でなければならないが、発酵条件では製紙スラッジ１０％ 濃度でもＳＳＦ 方法で乳酸を生産することが可能である。しかし、これは、フラスコで実験を実施したものであり、発酵器を利用したＳＳＦ 工程時には製紙スラッジ濃度を効率的に調節する必要がある。
【００５８】
＜７−３＞ 製紙スラッジの加水分解
製紙スラッジの加水分解のためには、酵素が必要である。そして、製紙スラッジの加水分解において適正酵素の添加が必要であり、また最適ｐＨ、最適温度がある。ＳＳＦ を、適正ｐＨのｐＨ ５．５と適正温度の４２℃、スラッジ濃度は５％で実施した。ＳＳＦ では、酵素反応よりは微生物生長がさらに重要な因子に見える。その理由は、つまり、工程初期にはグルコースが生成される速度より（酵素反応）、グルコースが消費され乳酸に転換される速度（微生物生長）が遅いためである。反応初期には酵素反応が速いためにグルコースが増加して、１０時間以後には微生物が指数期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ） から静止期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ）に移る段階にあるためにグルコース消耗速度が増加してグルコースが生産される速度より速くなる。一定スラッジ濃度でセルラーゼとβ−グルコシダーゼを多様な量で添加してＳＳＦ を実施した。
【００５９】
β−グルコシダーゼに変化を与え実験した結果は、図２２に示した。セルラーゼを変化した結果は、図２３に示した。酵素反応は、酵素量が増加するにしたがってグルコース濃度が増加するが、その増加量に比べて乳酸生産は、差がほとんど無い。これは、少ない量の酵素でもセルロースを充分に加水分解でき、乳酸に転換できることを示している。したがって以後の実験は、天然セルラーゼ５Ｕ／ｍｌ とβ−グルコシダーゼ２Ｕ／ｍｌ でＳＳＦ 工程を行なった。また、微生物生長が酵素反応に比べて遅く始まるため、これによりＳＳＦ に影響与える因子は、発酵工程であると見ることができ、発酵工程を先行させることによってより高い収率を得ることができる。
【００６０】
また、酵素反応工程と発酵工程を組み合わせて工程を実施する場合に、温度とｐＨに対する考慮が必要である。それで反応温度４２℃ないし４６℃でグルコース及び乳酸生産量を比較してみると、グルコース生産量及び乳酸生産量がほぼ同じで、これは、製紙スラッジを利用した乳酸生産工程での最適温度は、４２℃ないし４６℃であることが分かる（ 図２４） 。
【００６１】
＜７−４＞ 流加培養方法による乳酸生産 １
効率的な乳酸生産のためには流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ） または連続式発酵（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ） が必要である。乳酸生産において多くの量の製紙スラッジ濃度に比べ、生産される乳酸は低い濃度であり、これを解決するために発酵途中にスラッジを添加する流加培養方法を利用できる。
【００６２】
流加培養方法は、初期の物質移動を考慮できる。すなわち、スラッジによって培養液の混合が困難となる現象を、初期に添加するスラッジを少量にすることによって克服できる。初期の低濃度のスラッジにより、酵素によってセルロースが加水分解されつつ、培養液が円滑に撹拌できる。そして、低い濃度のスラッジを途中で添加する場合にも、その量を撹拌に支障を及ぼさない範囲にして、ＳＳＦ を実施できる。微生物が静止期に到達した時、基質である製紙スラッジを添加することによって乳酸生産を極大化した。
【００６３】
その結果を図２５に示した。対照群は、培地にグルコース添加して測定した。対照群の場合はグルコース消耗と乳酸生産が低かった。これは、フラスコでの実験のためｐＨ調節が難しく、ｐＨ調節がされず、発酵培養液がｐＨ３．５ まで下がり細胞生長に阻害を与えたためである。製紙スラッジを添加した場合には、製紙スラッジ内に含まれているアッシュ中にバッファリング（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ） 効果を示す色々なイオン物質が存在するためにｐＨを維持させることができ、最終ｐＨは４．５ であった。つまり、製紙スラッジのバッファリング効果により、発酵器を利用した発酵時のｐＨ調節が容易である。
【００６４】
＜７−５＞ 流加培養方法による乳酸生産 ２
本発明者達は、流加培養においてスラッジを添加する濃度を運転体積を基準に７％スラッジで乳酸生産を行なった。スラッジの初期濃度を８％で作動して、培養途中に酵素を添加して製紙スラッジ内のセルロース加水分解をより速くできるようにした。
【００６５】
その結果を図２６に示した。初期には酵素反応が速いためにグルコースが生成されるのを見ることができた。反応１２時間以後には、グルコース生成速度は落ち、その反対にグルコースが消費される速度が速くなる。すなわち、微生物が指数期から静止期に変化しながら多くの量のグルコースが乳酸に変化されたことが分かった。この時期にはむしろ、グルコースが不足するために乳酸生産速度が落ちるのが分かる（ 図２６のＡ）。反応５０時間以後には、微生物が静止期を維持した後、死滅期（ｄｅａｔｈ ｐｈａｓｅ） に近づく時期であることが分かった。この時期には乳酸生産は、変らずに継続し、また、グルコースが全部枯渇しないで５ｇ／Ｌ前後で残っていた。その理由は、この時期には微生物の活性が高くないためグルコースを乳酸に転換できないか、すでに発酵培養液に乳酸濃度が高いための乳酸による阻害影響のためであると推測できる。上記結果から、微生物の指数期と静止期に充分な量の基質を添加した場合には、速い速度で乳酸が生産された。
【００６６】
＜７−６＞ 発酵器を使用した乳酸生産
上記の＜７−１＞ 〜＜７−５＞ の実験では小規模（フラスコ）でＳＳＦ 工程を実行して発酵条件及び反応条件を求めた。微生物の生長時間を考慮してスラッジを添加した。Ｌ．ラムノーサス培養において２０ｇ／Ｌ グルコースの場合、８ 時間後に静止期に到達する。ゆえに、本実験ではスラッジのフィーディング（ｆｅｅｄｉｎｇ） を８ 時間後から始めた。初期作動体積は、１Ｌから実施し、流加培養後の最終体積は、１．９Ｌだった。ｐＨは、５Ｎ ＮＨ４ＯＨを利用して５．０ を維持した。
上記培養後に生産された乳酸の量を測定して、下記の数式２によりセルロース当たり乳酸の生産率を計算した。
【００６７】
流加培養の結果を、図２７に示した。乳酸生産は、６２ｇ／Ｌ とフラスコに比べて低かった。これは、スラッジの添加による体積増加によりそれ以上作動できなかったためである。しかし、総スラッジの添加量は、総体積の２２％ で、本実験で測定したスラッジ内に含まれたセルロースは３５％ で、この場合７７ｇ／Ｌ セルロースが添加されたことが分かる。この結果は、最終培養終了後のセルロース当たり乳酸生産率が８０％ であることを示す。スラッジ内でセルロースをグルコースに９０％ 転換した場合に、加水分解されたグルコースが乳酸に約９０％ 転換したことを示している。また、生産性は、培養３２時間を基準にして１．６４ｇ／Ｌ ・ｈ で、フラスコで培養した結果の０．９８ｇ／Ｌ ・ｈ より高い結果を示した。これは、スラッジ添加時間を先行させることによって、静止期に到達した微生物によるグルコースから乳酸への転換を容易になったものと思われる。また、初期運転体積を下げて実験を行なえば、より高い乳酸生産性が得られるだろう。
【００６８】
先の実験では酵素反応と発酵の最適条件を各々求めた。ＳＳＦ 方法遂行時には、大量生産に符合するｐＨ及び温度最適化が必要である。そこで、ＳＳＦ での乳酸生産のためにｐＨによる乳酸生産結果を測定した。既存実験では、スラッジの添加量を運転体積に対しスラッジを７％添加して実験した。この結果、運転初期には不溶性部分が多くなく物質移動に大きな影響を及ぼさなかったが、運転末期には不溶性部分が多くなり物質移動に影響を及ぼしスラッジを添加した直後に酵素がスラッジ内セルロースを加水分解するのが容易ではなかった。この解決のために運転体積に対してスラッジを５％に減らして添加した。
【００６９】
＜７−７＞ ｐＨ調節による乳酸生産
既存実験でスラッジは、ｐＨバッファーリング効果があったために今回の実験は、ｐＨを調節しない条件と最適な発酵条件ｐＨ６ に近いｐＨ５．８ で発酵を比較した。初期運転体積は０．６５Ｌ で、最終運転体積は１．５Ｌとした。
【００７０】
その結果、ｐＨを調節しない場合（図２８のＡ）には、培養約６７時間後の乳酸生産が８１．２ｇ／Ｌ であった。ｐＨを５．８ に調節した場合（図２８のＢ）には、培養約８７時間後に６８．８ｇ／Ｌ まで生産した（ 図２８） 。ｐＨを調節しない場合、培養２４時間から４０時間までは、ｐＨの下がりがみられ、この時期には発酵条件に悪影響を及ぼし、乳酸生産が減らされ、またグルコース消費が減らされたことが分かる。これは、ｐＨ５ 以上の条件で発酵を実施してこそ乳酸生産及びグルコース加水分解が容易であることがわかる。ｐＨを５．８ に調節した場合、発酵条件には特に異常はなく、セルロース加水分解がｐＨを調節しない場合ほど効果的には起こらず、結果的に乳酸生産が少なかったことが分かる。ゆえに、ｐＨ５．０ 〜５．５ 間でＳＳＦ 工程を実施しなければならないことが分かる。ｐＨを調節しない場合、スラッジ内セルロース比率が３５％ であることを考慮すると、総１０５ｇ／Ｌセルロースが添加されたことが分かる。これによるセルロース当り乳酸転換率は、７７．５％ であり、セルロースがグルコースに転換される比率が９０％ の場合、グルコース当り乳酸転換率は、約８６％ であることが分かる。培養５０時間を基準とした乳酸生産性は、１．４８ｇ／Ｌ ・ｈ だった。最終的に添加された酵素量は、天然セルロース１７．１Ｕ／ｍｌ、β−グルコシダーゼは３．８Ｕ／ｍｌ だった。
【００７１】
ＳＳＦ 流加培養時に添加するスラッジは６５％ の水を含み、残りが固形分で存在するために連続的に添加することが難しく、機械的装置を利用して連続的にスラッジを添加する場合には、より効率的に工程を遂行できる。
【００７２】
また、ＳＳＦ 工程で流加培養でｐＨを調節して工程を実施した結果、最適ｐＨはｐＨ ５．０だった（ 図２９） 。上記のような結果は乳酸生産には多少不利であるが、酵素反応工程に有利でＳＳＦ 工程には有利な条件であることが分かる。
【００７３】
【発明の効果】
上記で詳しく見たように、本発明によれば、手頃な製紙スラッジを利用して乳酸の基質であるグルコースを生産することによって経済的に乳酸を生産でき、かつ大量生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラクトバシラスラムノーサスを３７℃で培養した時、時間に対する細胞生長を示したグラフである。
【図２】ラクトバシラスラムノーサスをグルコースを含んだ培地で培養した時、時間に対するグルコース消耗及び乳酸生産を示したグラフである。
【図３】ラクトバシラスラムノーサスをグルコースを含んだ培地で色々な温度（３２ 、３７、４２、４６または５０） ℃で培養した時、時間に対する細胞の生長を示したグラフである。
【図４】ラクトバシラスラムノーサスをグルコースを含んだ培地で色々な温度（３２ 、３７、４２、４６または５０） ℃で培養した時、時間に対するグルコース消耗を示したグラフである。
【図５】ラクトバシラスラムノーサスをグルコースを含んだ培地で色々な温度（３２ 、３７、４２、４６または５０） ℃で培養した時、時間に対する乳酸生産を示したグラフである。
【図６】ラクトバシラスラムノーサスをグルコースを含んだ培地で色々なｐＨ（４．８、５．０ 、５．５ または６．０）で培養した時、時間に対する細胞の生長を示したグラフである。
【図７】ラクトバシラスラムノーサスをグルコースを含んだ培地で色々なｐＨ（４．８、５．０ 、５．５ または６．０）で培養した時、時間に対するグルコース消耗を示したグラフである。
【図８】ラクトバシラスラムノーサスをグルコースを含んだ培地で色々なｐＨ（４．８、５．０ 、５．５ または６．０）で培養した時、時間に対する乳酸生産を示したグラフである。
【図９】ラクトバシラスラムノーサスをＭＲＳ 培地またはＭＲＳ 培地に比べ窒素源が低い培地で３７℃または４２℃で培養した時、時間に対する細胞の生長を示したグラフである。
【図１０】ラクトバシラスラムノーサスをＭＲＳ 培地またはＭＲＳ 培地に比べ窒素源が低い培地で３７℃または４２℃で培養した時、時間に対するβ−グルコシダーゼの活性を測定したグラフである。
【図１１】ラクトバシラスラムノーサスをＭＲＳ 培地またはＭＲＳ 培地に比べ窒素源が低い培地で３７℃または４２℃で培養した時、時間に対するＦＰａｓｅ 活性を測定したグラフである。
【図１２】製紙スラッジにセルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを添加して３７℃または４２℃で酵素反応を行った時のグルコースの濃度を測定したグラフである。
【図１３】製紙スラッジにセルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを添加してｐＨ４．８ またはｐＨ５．６ で酵素反応を行った時のグルコースの濃度を測定したグラフである。
【図１４】製紙スラッジにセルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを添加して４５℃でｐＨ４．８ またはｐＨ５．６ の条件で酵素反応を行った時のグルコースの濃度を測定したグラフである。
【図１５】製紙スラッジにセルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを添加して５０℃でｐＨ４．９ 、ｐＨ５．４ またはｐＨ５．９ の条件で酵素反応を行った時のグルコースの濃度を測定したグラフである。
【図１６】スラッジ含量によるグルコース生産速度を示したグラフである（ 〇、●： ２ 回実験） 。
【図１７】色々なスラッジ含量（１、３ 、５ または７）％ によるグルコース生産速度を示したグラフである。
【図１８】ラクトバシラスラムノーサス発酵培養物の有機酸成分を分析したグラフである。
【図１９】廃紙スラッジを利用して４０℃、ｐＨ６ で遂行した同時糖化発酵（ 「ＳＳＦ 」） 及び５０℃で酵素反応遂行、５ 時間後に発酵工程を遂行した順次発酵（ 「ＳＦ」） をグルコースを基質に使用した対照群と比較して時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を比較したグラフである。
【図２０】セルラーゼ１０Ｕ／ｍｌ及びβ−グルコシダーゼ２Ｕ／ｍｌ を添加して色々なスラッジ含量（５、６．７ 、８．３ または１０）％でＳＳＦ を行った時、時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を測定したグラフである。
【図２１】セルラーゼ５Ｕ／ｍｌ 及びβ−グルコシダーゼ２Ｕ／ｍｌ を添加して色々なスラッジ含量（５、６．７ 、８．３ または１０）％でＳＳＦ を行った時、時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を測定したグラフである。
【図２２】セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを各々異なる濃度（ セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを各々５Ｕ／ｍｌ 及び２Ｕ／ｍｌ 、５Ｕ／ｍｌ 及び４Ｕ／ｍｌ 、５Ｕ／ｍｌ 及び６Ｕ／ｍｌ 、５Ｕ／ｍｌ 及び８Ｕ／ｍｌ）で添加してＳＳＦ を行った時、時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を測定したグラフである。
【図２３】セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを各々異なる濃度（ セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを各々１５Ｕ／ｍｌ及び２Ｕ／ｍｌ 、１０Ｕ／ｍｌ及び２Ｕ／ｍｌ 、５Ｕ／ｍｌ 及び２Ｕ／ｍｌ 、２．５Ｕ／ｍｌ 及び２Ｕ／ｍｌ）で添加してＳＳＦ を行った時、時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を測定したグラフである。
【図２４】４０℃、４２℃、４４℃または４６℃でＳＳＦ を行った時、時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を測定したグラフである。
【図２５】ＳＳＦ 遂行途中にスラッジを添加した時（ ↓） の、時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を測定したグラフである。
【図２６】ＳＳＦ 遂行途中にスラッジを添加したり（ ↓） 、セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを添加（ ↑） した時の、時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を測定したグラフである。
【図２７】ＳＳＦ 遂行途中に発酵器にスラッジを添加したり（ ↓） 、セルラーゼ（５Ｕ／ｍｌ） 及びβ−グルコシダーゼ（１Ｕ／ｍｌ） を添加（ ↑） した時の、時間に対するグルコース濃度及び乳酸濃度を測定したグラフである。
【図２８】ＳＳＦ 遂行途中に発酵器にスラッジを添加したり（ ↓） 、セルラーゼ（５Ｕ／ｍｌ） 及びβ−グルコシダーゼ（１Ｕ／ｍｌ） を添加（ ↑） して、ｐＨを調節しない時（Ａ） と、ｐＨを５．８ に調節した時（Ｂ） の、時間に対するグルコース濃度及び乳酸濃度を測定したグラフである。
【図２９】ｐＨ５．８（Ａ）、ｐＨ５．４（Ｂ）またはｐＨ５．０（Ｃ）でＳＳＦ 工程を遂行し、上記ＳＳＦ 遂行途中に発酵器にスラッジを添加したり（ ↓） 、セルラーゼ（５Ｕ／ｍｌ） 及びβ−グルコシダーゼ（１Ｕ／ｍｌ） を添加（ ↑） した時の、時間に対するグルコース濃度及び乳酸濃度を測定したグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、製紙スラッジを利用して乳酸を生産する方法に関するものである。より詳細には、製紙スラッジを加水分解する酵素反応工程と酵素反応工程で生成されたグルコースを基質に使用して乳酸に変換させる発酵工程とを行ない、乳酸を生産する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
環境保存とエネルギー資源の需要を減少しようという世界的な努力の一環として、有機廃棄物の再使用が国内外的に活発になされている。有機廃棄物には、製紙類の再使用工程で廃棄される製紙スラッジ、穀物を収穫後に廃棄される澱粉及び繊維素がある。この中で韓国国内で廃棄される有機物中、廃紙は年間８３０ 万トンが発生し、この中で再活用される廃紙は、５００ 万トンと６０％ の再活用率を示している（ 環境統計年鑑 ２００１ 、１４号、環境部） 。そして、有機廃棄物の一つである飲食廃棄物は、年間４２０ 万トンが発生し、有機性スラッジ類は、５５０ 万トンが発生している（ 環境統計年鑑 ２００１ 、１４号、環境部） 。また、山林資源から得られる木質系及びその廃棄物を使用できる。上記有機廃資源は、生物工学的方法によって加水分解され、乳酸生産微生物の炭素源等、有用な生物資源に使用できる。一方、製紙類の再使用工程では、重さにして５ 〜４０％ の紙類が使用されないスラッジとして廃棄されている。このスラッジの３０〜４０％ は、短い繊維素が主流を成している。韓国の製紙産業から発生したスラッジの総量は、１９９２年基準で年間約 ９０２千トンにのぼる。このような莫大な量のスラッジは、主に焼却によって処理されているが、スラッジに相当量の水（６０％以上） が含まれているため、燃料を加えて焼却処理しなければならない。２００１年基準で廃棄物処理業者の委託製紙スラッジ処理費用は、平均的に１トン当たり約４０，０００ウォンであり、スラッジ処理費用に約４００ 億ウォン以上の費用がかかっている。
【０００３】
産業的に有用な有機酸として代表的な乳酸（Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ） は、３ 炭素からなる有機酸（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ、ＣＯＯＨ−ＨＣＯＨ−ＣＨ３）で、ブドウ糖の嫌気性発酵によって生産される。乳酸の産業的用途は、工業用５５％ 、食品用４０％ 、医薬用５％で、食品用は主に酸味剤に使用され、工業用は、皮革産業と化粧品用湿潤剤に使用されている。医薬分野で最近注目されている用途開発は、生分解性高分子のポリ乳酸である。現在は、ポリ乳酸の価格が高く汎用使用されずにいるが、大量生産によって価格が下がれば、その膨大な需要が予測される。韓国の場合、生分解性高分子市場が近い将来に約５００ 億ウォンに達する展望であり、ポリ乳酸はこの市場の相当な部分を占めることができると予測されている。
【０００４】
しかし、今まで乳酸を手頃な価格で生産する方法が開発されておらず、現在はポリ乳酸の生産のための乳酸を全量輸入に依存している実情である。家畜飼料の機能性添加剤としての乳酸の産業的需要も増加している現実であり、これに対する手頃で大量的な乳酸生産方法の開発が急がれている。
【０００５】
そこで、本発明者達は、製紙スラッジ内のセルロースを加水分解してグルコースを生産し、該グルコースを基質に使用して経済的に乳酸を生産する方法を開発することによって、本発明を完成した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、経済的でありながらも、大量生産が可能に乳酸を生産するための方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は、製紙スラッジから乳酸の基質であるグルコースを生産する酵素反応と、該グルコースを乳酸に変換させる発酵工程とを含む乳酸生産方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、製紙スラッジを加水分解する酵素反応工程と、該酵素反応工程で生成されたグルコースを乳酸に変換させる発酵工程とを含む乳酸生産方法を提供する。
【０００９】
本発明では、乳酸を生産するための基質を大量生産するために、手頃に大量に得られる製紙スラッジを使用して乳酸の基質であるグルコースを生産する。製紙スラッジを再活用することによって、乳酸生産の費用を大幅に減らして、廃棄物の処理にかかる費用を節減できる。
【００１０】
本発明の乳酸生産方法は、製紙スラッジ内のセルロースからグルコースを生産する工程と、該グルコースを基質に使用して乳酸に変換させる発酵工程とに分けられる。
【００１１】
本発明の製紙スラッジ内のセルロースからグルコースを生産する方法は、セルロースを分解する酵素を添加して反応させることによって行なうことができる。上記セルロースを分解してグルコースを生産する酵素としては、エンド− グルカナーゼ（ｅｎｄｏ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）、エキソ− グルカナーゼ（ｅｘｏ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ） 及びβ−グルコシダーゼ（ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）で構成される群から選択した一つ以上の酵素を使用できるが、これに限定されるものではなく、セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ） 及びβ−グルコシダーゼ（ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を使用することが好ましい。セルラーゼは、エンド− グルカナーゼ（ｅｎｄｏ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ）とエキソ− グルカナーゼ（ｅｘｏ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ） から構成される。セルラーゼは、これらのグルカナーゼの複合的機能によりスラッジ内のセルロースを分解してセロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）という二糖類を生成する。また、β−グルコシダーゼ（ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）は、前段階で生成されたセロビオースを分解してグルコースをつくるのに関与する。
【００１２】
上記酵素反応工程は、上記で使用した酵素が活性を示す温度及びｐＨの範囲内で行なうことができ、３２℃ないし５０℃で行なうことが好ましく、４２℃ないし４６℃で行なうことがさらに好ましい。ｐＨは、ｐＨ４．８ ないしｐＨ６．０ で行なうことが好ましく、ｐＨ５．０ で行なうことがさらに好ましい。酵素反応工程は、５０℃で行なうことが好ましいが、微生物が成長する温度は、３７℃が好ましいので二条件の中間点の４２℃ないし４６℃で反応を行なうことが、乳酸生産に最も好ましい温度である。また、酵素反応ｐＨは、ｐＨ５ で行なうことが好ましく、微生物の成長するｐＨは、ｐＨ６ が好ましいため、二条件の最適条件は、ｐＨ５ である。
【００１３】
本発明の方法では、上記酵素反応工程を通じて生成されたグルコースを基質に使用して、乳酸に変換させる発酵工程を行なう。本発明の発酵工程では、グルコースを基質に使用して乳酸を生産できる微生物を添加して培養することによって乳酸を生産できる。発酵工程に添加される微生物は、特別に限定されるものではないが、ラクトバシラス属またはリゾプス属微生物であることが好ましく、ラクトバシラスラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） 、リゾプスオリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ） 及びラクトバシラスデルブリュッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｌｂｒｅｕｋｉｌｌ）で構成された群から選んだ一つまたは二つ以上を添加して培養することがさらに好ましく、ラクトバシラスラムノーサスを使用することが最も好ましい。ラクトバシラスラムノーサスによって乳酸を生産する工程は、３７℃で行なうことが好ましい。また、ｐＨは、ｐＨ６．０ で行なうことが好ましい。また、培養速度は、スラッジの濃度によって１００ｒｐｍないし５００ｒｐｍで行なうことが好ましい。
【００１４】
具体的に、Ｌ．ラムノーサスを利用してグルコースから乳酸を生産する発酵工程を行なった後、発酵工程を通じて生成された培養液（ｂｒｏｔｈ） の成分を分析した。その結果、ＨＰＬＣカラムを通過した有機酸は、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ） 、コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ） 、乳酸、蟻酸（ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ） 、酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ） 、プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）の順に各々１０、１４、１５、１６、２１．５ｍｉｎ で検出された。色々な有用有機酸が生産されたが、９７％ 以上の主要生産物は乳酸だった（ 図１８参照） 。
【００１５】
本発明では、酵素反応工程と発酵工程を別々に分離して行なったが、酵素反応工程と発酵工程を同時に行なうこともできる。上記のように酵素反応工程及び発酵工程を行なうための方法として、酵素反応工程及び発酵工程を別々に分離して行なう順次発酵（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； 以下「ＳＦ」と略称する） または二工程を同時に行なう同時糖化発酵（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；以下「ＳＳＦ 」と略称する） 方法が利用できる。本発明の乳酸生産方法は、ＳＳＦ 方法で行なうことが好ましく、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ） または連続式発酵（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ） で行なうことがさらに好ましい。流加培養というのは、初期に入れた基質が消費され、微生物がそれ以上成長できなくなった時に、基質を発酵器に入れて微生物がさらに成長できるようにする方法である。本実験では、製紙スラッジを入れて製紙スラッジが酵素によってブドウ糖に転換されると、基質として利用できるようにした。
【００１６】
ＳＦは、酵素反応と発酵を分離して実施する方法である。ＳＦ法では、酵素反応工程で生成された反応液だけを別に分離して発酵工程に適用して、スラッジ内に最も多く含まれているアッシュ（ａｓｈ） 部分を除去できる。また、酵素反応工程と発酵工程を分離して実施すると最適条件で各工程が行なわれるため、各工程での生産性が増加する。しかし、酵素反応工程で過剰量のスラッジを加水分解しても撹拌の困難さによってスラッジの１５％ 以上を加水分解できず、条件を満たすために装置にかかる経済的負担と生産時間遅延等の問題点がある。
【００１７】
それに比べて、スラッジを利用したＳＳＦ 法は、スラッジ内のセルロースを加水分解してグルコースを生成し、同時に発酵を通して乳酸を生産する。ＳＳＦ 方法は、装置の単純化と工程時間節約の長所があり、酵素を利用した加水分解から生じる基質阻害反応を減らすことによって、乳酸生産効率を向上せられる長所を持っている。したがって、ＳＳＦ 方法は、ＳＦ方法に比べて工程時間の短縮と酵素反応での産物阻害（ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を抑制できる。また、高濃度培養が容易で、工程を単純化でき、流加培養（ ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ） 時のスラッジ添加による物質移動（ｍａｓｓｔｒａｎｓｆｅｒ） の問題も大きくない。始めから高い濃度のスラッジを添加すれば、発酵液の粘度が上昇するため撹拌が困難となる。この問題を解決するために、初期に低い濃度スラッジを添加するようにすると、酵素がすぐに繊維素を分解するため、撹拌に大きな問題が起きず、物質移動に効果的である。また、スラッジ内の不溶性部分であるアッシュ部分は、乳酸生産後に微生物と一緒に除去することが有利である。
【００１８】
本発明で、酵素反応工程及び発酵工程を同時に行なうＳＳＦ の工程条件は、４２℃ないし４６℃で行なうことが最も好ましい。また、反応ｐＨは、ｐＨ４．８ ないしｐＨ６．０ で行なうことが好ましく、ｐＨ５．０ ないしｐＨ５．５ で行なうことがさらに好ましく、ｐＨ５．０ で行なうことが最も好ましい。これは、微生物生長と酵素反応条件の組み合わせが適切であるためである。また、培養速度は、スラッジの濃度によって変えられ、１００ｒｐｍないし５００ｒｐｍで行なうことが好ましい。また、ＳＳＦ 工程に使用される製紙スラッジの濃度は、１０％ 以下であることが好ましく、５％ないし１０％ であることがさらに好ましく、５％ないし８％であることが最も好ましい。製紙スラッジの濃度が高くなると、反応器での撹拌がたやすくなく、上記のような製紙スラッジ濃度で反応を行なうことが好ましい。
【００１９】
基質であるスラッジ量が多いほどグルコースの初期生成速度は、増加する（ 表１ 参照） 。しかし、一定量以上の基質が添加された場合には、スラッジと酵素間の円滑なコンプレックス（ｃｏｍｐｌｅｘ） 形成が難しい。ＳＳＦ 工程でスラッジの濃度は、物質移動のために適正濃度でなければならず、高濃度ではインペラーと電力（ｐｏｗｅｒ） 等の問題点によって撹拌がうまく行かないため、撹拌と物質移動が容易な濃度範囲内で加水分解を行なわなければならない。インペラーは、発酵器内の物質を撹拌する装置である。
【００２０】
酵素反応工程で酵素量が増加するにつれて、グルコース濃度が増加するが、その増加量に比べて乳酸生産量の差はほとんど無い。これは、少ない量の酵素でもセルロースを充分に加水分解できることを示している。また、微生物生長が酵素反応に比べて遅くに始まるため、発酵工程を先行させることによってより高い乳酸生産収率が得られる。
【００２１】
ＳＳＦ 工程で効率的な乳酸生産は、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ） 及び連続式発酵（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ） によって行なえる。乳酸生産において、スラッジ濃度が高い濃度であるのに比べ、生産される乳酸は、低い濃度であり、これを解決するために、発酵途中にスラッジを添加する流加培養方法を利用できる。バッチ方法は、回分式培養方法とも言うが、これは、初期に基質と微生物、酵素を一度に入れて、乳酸を生産する方法である。また、流加培養は、初期に基質、微生物酵素を入れて、発酵途中に基質が枯渇するにしたがって基質及び酵素を入れることである。連続式発酵は連続培養とも言い、基質及び酵素を連続的に入れる方法である。流加培養では、基質が一定の濃度を維持するように基質を連続的に入れることが重要であり、微生物生長速度に基づいて基質を添加する。本発明では、酵素反応速度によって製紙スラッジ内の繊維素が７０〜８０％ 分解された時点で基質を添加した。
【００２２】
流加方法は、初期の物質移動を考慮できる。つまり、スラッジによって培養液の混合が困難となる現象を、初期に添加するスラッジを少量にすることによって克服できる。初期の低濃度のスラッジにより、酵素によってセルロースが加水分解されつつ、培養液が円滑に撹拌できる。そして、途中で添加する量も、低濃度のスラッジを添加する場合、その量を撹拌に支障をきたさない範囲にして、ＳＳＦ 方法を実施できる。また、微生物が静止期に到達した時、スラッジを添加することによって乳酸生産を極大化する。
【００２３】
本発明の好ましい実施例では、流加培養方式でＳＳＦ を行なった。スラッジの初期濃度を８％にし、培養途中に酵素を添加して製紙スラッジ内のセルロース加水分解をより速くした。その結果、初期には酵素反応が速いためグルコース生成が大きく増加したが、反応１２時間以後にはグルコース生成速度は減少し、それに反してグルコースが消費される速度が増加した（ 図２６Ａ 参照） 。これは、微生物が指数期から静止期に変化しながら多くの量のグルコースが乳酸に変化されたことを示している。この時期には、グルコースが不足するため、かえって乳酸生産速度が落ちた（ 図２６Ｂ 参照） 。反応５０時間以後には、微生物が静止期を維持したあと死滅期（ｄｅａｔｈ ｐｈａｓｅ） に近づく時期であり、この時期は、乳酸生産は一貫している。またグルコースは全部枯渇しないで５ｇ／Ｌ前後で残っていた。その理由は、この時期には、微生物の活性が高くなくグルコースを乳酸に転換できないか、すでに発酵培養液の乳酸濃度が高いための乳酸による阻害影響のためである。上記結果から、微生物の指数期と静止期に充分な量の基質を添加した場合に、速い速度で乳酸を生産できることが分かった。ＳＳＦ 方法では、乳酸生産時に製紙スラッジを添加する時間を先行させることによって、静止期に到達した微生物がグルコースを得て乳酸へ容易に転換できる。
【００２４】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
但し、下記実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】
＜ 実施例 １＞ ラクトバシラスラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） からの乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ） 生産
本発明者達は、乳酸生産のための菌株にラクトバシラスラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） を使用し、上記ラクトバシラスラムノーサスが乳酸を生産するための最適条件を調べた。Ｌ．ラムノーサスは、Ｌ−（＋）−乳酸を生産する菌株で光学純度（ｏｐｔｉｃａｌ ｐｕｒｉｔｙ）が約９５％ 、およびグルコース対比約９５％ の生産収率を持っている。Ｌ．ラムノーサスを培養するためにＭＲＳ 培地（Ｄ−（＋）−ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．） 、ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ．） 、（ＮＨ４）２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．） 、ＫＨ２ＰＯ４（Ｓｈｉｎｙｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．） 、ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２Ｏ（Ｓｈｉｎｙｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．） 、Ｋ２ＨＰＯ４（Ｓｈｉｎｙｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．） 、ＦｅＳＯ４ ・７Ｈ２Ｏ（Ｄｕｋｓａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．））を使用した。種菌培養は、フラスコを利用してシェーキング培養器（ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ） で培養した。乳酸生産収率を高めるための本培養は、発酵器（ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ） を利用して培養した。培養条件は、種菌培養の場合３７℃、１００ｒｐｍで培養し、本培養でも同じ条件で培養した。ｐＨの調節は、ＮａＯＨを利用して、ｐ Ｈ４．８ 〜６．０ の範囲とした。
【００２６】
分析方法は、試料を採取して細胞濃度、グルコース濃度、乳酸濃度を分析した。細胞濃度は、分光測定器（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ； ＧＥＮＥＳＹＳ ５ 、Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．） で、６００ｎｍ で測定した。グルコースと乳酸濃度はグルコース分析器（ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎａｌｙｚｅｒ； ＹＳＩ ２７００ ＳＥＬＥＣＴ、Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）で測定した。
【００２７】
乳酸生産のためのＬ．ラムノーサスの種菌培養は、２５０ｍｌ フラスコに１００ｍｌ のＭＲＳ 培地を入れ、そこに１％のＬ．ラムノーサスを接種して、シェーキング培養器で２４時間培養した（ 種菌培養は、本培養の１０％）。その後、本培養は、２．５Ｌ発酵器に１ＬのＭＲＳ 培地を入れ、そこに種菌培養したＬ．ラムノーサス培養液を接種した。
【００２８】
図１ は、Ｌ．ラムノーサスを細胞生長のＯＤ値を測定して分析したものである。図２ は、発酵中グルコース消耗量と乳酸生成量を示したものである。Ｌ．ラムノーサスは、接種後約１３時間後に静止期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ）に到達した。グルコースは、培養を始めてから２０時間後、全部消耗され、乳酸が生じた。乳酸生産収率は、約７３％ だった。 Ｌ． ラムノーサスによる乳酸生産の最適条件は、３７℃、１００ｒｐｍだった。
【００２９】
＜ 実施例 ２＞ ラクトバシラスラムノーサスの乳酸生産に温度がおよぼす影響
Ｌ． ラムノーサスによる乳酸生産において色々な温度による細胞生長、グルコース消耗量、乳酸生産量を測定することによって、その後の乳酸生産の為の発酵条件を最適化する実験を実施して、複合生物工程技術開発における基礎資料に利用しようとした。
【００３０】
具体的に、乳酸生産のためのＬ．ラムノーサスの培養方法及び培地組成は、実施例１と同一にし、温度だけを変えて２．５Ｌ発酵器で培養した。温度は３２、３７、４２、４６または５０℃にした。これは、Ｌ．ラムノーサスの培養最適温度が３７℃で、酵素反応の最適温度は５０℃だからである。ＳＳＦ 工程の最適化の為に適する温度を求めるために３７〜５０℃間の温度条件で実験を行なった。本実験で各々の温度による細胞生長、グルコースの濃度、乳酸の濃度を測定してその数値を比較した。
【００３１】
その結果、細胞生長においては、３７℃で最も早く静止期に到達し、残りの３２、４２、４６℃も培養を開始後約２０時間後に静止期に到達した。しかし、５０℃の場合細胞生長が他の温度に比べて非常に低かった（ 図 ３） 。グルコース濃度もやはり３７℃で培養後２０時間経過後すべて消耗され、３２、４２℃の場合は類似の速度で約４０時間以後に全部消耗された（ 図 ４） 。細胞生長中４６、５０℃の場合は、グルコースの消耗速度が遅いだけではなく、培養が完全に終了した５０時間以後にも２０〜２３ｇ／Ｌ のグルコースが消費されなかった。培養中に乳酸は、最も早い細胞の生長及びグルコース消耗量を見せた３７℃で最も多く生産され、３２℃と４２℃では３７℃より遅いけれど類似の量の乳酸生産が見られた。しかし、４６℃と５０℃ではグルコース消耗量が少ないためさらに少ない乳酸生産が見られた（ 図 ３〜 ５） 。
【００３２】
Ｌ．ラムノーサスの温度による生長及び乳酸生産を見てみると、細胞生長の場合３７℃で最大を示したが、乳酸生産の場合は４２℃で３７℃より若干高い生産量が見られたが、乳酸生産速度は３７℃の方が速いため、乳酸生産のためのＬ．ラムノーサスの最適温度は３７℃だった（ 図 ５） 。
【００３３】
＜ 実施例 ３＞ ｐＨによる発酵の影響
Ｌ． ラムノーサスによる乳酸生産で温度とともに重要な影響を及ぼす因子は、ｐＨである。一般的にＬ．ラムノーサスの最適ｐＨは６．０ で、酵素加水分解の最適ｐＨは４．８ である。したがって、本実験では、ｐＨ４．８ とｐＨ６．０ 間で最も最適な条件を探し出そうとした。本実験は、このような研究の基礎資料として色々なｐＨ条件での実験を行なった。
【００３４】
具体的に、Ｌ．ラムノーサスの培養条件及び培養培地の組成は、実施例１と同一にし、温度は３７℃に固定した。各々の培養でｐＨを変えて調節して実験した。ｐＨの調節の為に１０Ｎ ＮａＯＨを使用した。ｐＨは４．８ 、５．０ 、５．５ 、６．０ で実施し、試料採取後、細胞の濃度、グルコース消耗量及び乳酸生産量を測定して比較した。
【００３５】
その結果、実際、乳酸生産でのｐＨの影響が多くの実験を通して分かった。各ｐＨに対する対する細胞生長は、ｐＨ６．０ の場合に最も高く、ｐＨ４．８ と５．５ の場合に類似の結果を得た。ｐＨ５．０ の時に多少低い細胞生長を示した。グルコース消耗量もまたｐＨ６．０ の場合は全部消耗されたが、ｐＨ５．５ の時には約８ｇ／Ｌ程度が消費されなかった。ｐＨ４．８ と５．０ の時は、３０〜４０ｇ／Ｌ 程度のグルコースが消費されなかった。乳酸生産はｐＨ６．０ の場合に約８２ｇ／Ｌ 生産された。ｐＨ５．５ の場合に７２ｇ／Ｌ 程度生産された。ｐＨ４．８ と５．０ の場合は５０〜６０ｇ／Ｌ 程度の類似の生産を示した（ 図 ６、図 ７及び図 ８） 。
【００３６】
＜ 実施例 ４＞ 発酵による酵素分解
ＳＳＦ法では、発酵時に酵素を一緒に添加するため、本実験では、発酵条件による酵素不活性化（ｅｎｚｙｍｅ ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ） がどの程度であるか調べた。
【００３７】
具体的に、温度を変えた二つの恒温槽（３７ ℃、４２℃） に二種類の培地（ＭＲＳ、ＭＲＳ 培地に比べて窒素源の濃度を５ｇ／Ｌに低めた培地） を利用して、酵素が分解される程度と細胞濃度を測定した。細胞濃度はＯＤ値（６００ｎｍ） を測定して分析した。酵素活性は、ＤＮＳ（ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）方法を使用した。
一般的に、糖は非還元糖と還元糖に別れ、ＤＮＳ 方法は還元糖の分析方法であり、還元糖であるぶどう糖がＤＮＳ で発色反応を起こすことを吸光度測定機で分析した。（Ｇｈｏｓｅ， Ｔ．Ｋ． Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ． Ｃｈｅｍ． １９８７ 年、第５９巻、Ｐ．５７−２６８、Ｗｏｏｄ， Ｔ．Ｍ． ａｎｄ Ｋ．Ｍ． Ｂｈａｔ． 、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， １９８８ 年、Ｍａｎｄｅｌｓ， Ｍ． ａｎｄ Ｒ．Ｅ． Ａｎｄｒｅｏｔｔｉ．， Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９７８年、第１２巻、Ｐ．６−１３）。
【００３８】
ＭＲＳ 培地は、酵母抽出物とペプトンが添加され窒素源の比率が高い。産業的に乳酸を生産するためには窒素源の量を減らす必要がある。そこで窒素源の濃度を５ｇ／Ｌに下げた産業培地とＭＲＳ 培地を使用して、乳酸生産比較実験を実施した。また、少ない量の窒素源を添加することによって、微生物が酵素を窒素源に転換して使用するかどうかついて調査した。
【００３９】
その結果、全般的にＭＲＳ 培地に比べて窒素源が低い培地がＭＲＳ 培地よりも、各々の温度で高い細胞濃度を示した。上記二種類の培地は両方が４２℃でよりも３７℃で高い細胞濃度を示した。
【００４０】
酵素分解程度は、ＦＰａｓｅ 活性測定に基づいて評価する。ＦＰａｓｅ 活性測定は、フィルターペーパーが加水分解される程度を示して酵素の活性を測定するフィルターペーパー（ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ）活性測定方法で行なう。ＦＰａｓｅ 活性は温度４２℃で減少するように見えるが（図１１）、酵素分解はＬ．ラムノーサスの生長によっては大きく影響を受けないことを示している。また、微生物が酵素を窒素源に使用する比率が少ないことを間接的に確認した。むしろ、セルロース及びアッシュ（ａｓｈ） によるセルロースの不活性化が大きいことを示している（ 図 １０ 及び図 １１）。
【００４１】
＜ 実施例 ５＞ 酵素（ β−グルコシダーゼ、セルラーゼ） を利用したスラッジの糖化
本発明者達は、以前の実験を通じて明らかにした酵素の最適条件（ｐＨ４．８、温度５０℃） をパターンとして使用し、ＳＳＦ（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ） によってＬ．ラムノーサスの生存まで考慮した酵素の最適条件を調べ、またこのような酵素による初期加水分解速度（ｉｎｉｔｉａｌ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｒａｔｅ） と酵素の活性がどの程度まで維持されるのか調べるための半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ） を測定した。
【００４２】
具体的に、ナトリウムアセテート緩衝液（Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）１７ｍｌ（ｐＨ ４．８） に３．２８ｇ （６４％ウェットスラッジ）のスラッジを入れ、最終５ ％（ｗ／ｖ）含量になるようにして３７、４２、４５、５０℃の恒温槽に１０ユニットのセルラーゼ（０．０６１ｇ）と５ ユニット（０．２１ｍｌ）のβ−グルコシダーゼを入れ、反応させた後、生成されたグルコースの濃度を分析した。スラッジがアルカリ性を帯びているため、緩衝液のｐＨは４．８ であるが、混合後の実験時にはｐＨ５．６ まで上昇した。これを再びｐＨ４．８ に調整後、既存実験と比較した。スラッジ１ 、３ 、５ 、７％に若干の酢酸を添加してｐＨ４．８ に調整した後、１０ユニットのセルラーゼ（０．０６１ｇ）と５ ユニット（０．２１ｍｌ）のβ−グルコシダーゼを入れ、基質の量による初期加水分解速度を測定した。
【００４３】
スラッジを添加して培養し生成されたグルコース量を測定後、下記の数式１によりスラッジ内セルロース当たりのブドウ糖転換率を計算した。
本発明で使用したスラッジ（６４％ウェットスラッジ）に含まれているセルロースの量は、乾燥スラッジの重量の３５％である。
スラッジ内セルロース当たりブドウ糖転換率（％）＝
（グルコース生産量／添加したスラッジ内セルロース量）×１００ …（１）
５ ℃の温度差で酵素反応を行なって培養終了後最終時間のスラッジ内セルロース当たりブドウ糖転換率を計算した結果、３７℃では４４％ のセルロース当たりブドウ糖転換率を示し、４２℃では４５％ のセルロース当たりブドウ糖転換率を示した。初期にはある程度の速度差が見られたが、反応時間を長くすればこの差は微微たるものとなった（ 図 １２）。
【００４４】
また、培養終了後最終時間のｐＨ５．６ でのセルロース当たりブドウ糖転換率は、４５％ である反面、ｐＨ４．８ ではセルロース当たりブドウ糖転換率が６７％ 程度と高かった。４５℃と５０℃でのセルロース当たりブドウ糖転換率差は、大きくなく、４２℃で行なった実験とも大差が見られなかった。温度の影響よりもむしろｐＨの影響をさらに多く受けるようである。従って、同時糖化は、４０〜４２℃で行なうことがもう少し有利な方法であるように思われる（ 図 １３ 、図 １４ 及び図 １５）。
【００４５】
以下の表１ のように、基質であるスラッジ量が多いほど初期生成速度は増加する。しかし、一定量以上の基質が添加された場合には、スラッジと酵素間の円滑なコンプレックス（ｃｏｍｐｌｅｘ） 形成が難しい。そのため反応初期にグルコース生成が起きず初期加水分解速度測定に無理が伴う。一連の実験を通じて表２ の結果を得ることができた（ 図１６及び図１７） 。ＳＳＦ を行なうための適切な条件は、ｐＨ５ 〜５．２ 、温度４０〜４２℃である。上記実験は、二段階に分けて得た結果であるので実際ＳＳＦ 実験結果とは若干の誤差が見られる。
【００４６】
【表１】
【表２】
＜ 実施例 ６＞ ラクトバシラスラムノーサスを利用した発酵培養液の成分分析
本発明者達は、Ｌ．ラムノーサスを利用した発酵工程で生産される有用有機酸の正確な成分分析をした。
【００４９】
具体的に、有機酸生産のための菌株は、Ｌ．ラムノーサスを利用した。培養期間は、５０時間とした。培養条件は、温度３７℃、１００ｒｐｍで、１０Ｎ ＮａＯＨを使用してｐＨ調節しｐＨ６ とした。有機酸分析は、ＨＰＬＣを利用した。使用したカラムは、ＨＰＸ−８７Ｈ（Ｂｉｏｒａｄ Ｃｏ．） 、移動相（ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）は、０．０８Ｎ Ｈ２ＳＯ４ 、流速（ｆｌｏｗ ｒａｔｅ） は、０．５ｍｌ／ｍｉｎ である。ＵＶ検出器（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）はウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）４８６ モデルを使用し、波長は、２１０ｎｍ である。
【００５０】
発酵工程を通じて生成された培養液（ｂｒｏｔｈ） の成分分析をした結果、ＨＰＬＣカラムを通過した有機酸は、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ） 、コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ） 、乳酸、蟻酸（ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ） 、酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ） 、プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）の順に各々１０、１４、１５、１６、２１．５ｍｉｎ で検出された。このような結果は、フラスコを使った実験でも類似だった。色々な有用有機酸が生産されたが主要生産物は、乳酸だった（ 図 １８）。二実験ともグルコース対比９７％ 以上の乳酸が生産された。
【００５１】
＜ 実施例 ７＞ 製紙スラッジからの乳酸生産
＜７−１＞ ＳＳＦ 及びＳＦによる乳酸生産
乳酸生産のためには乳酸の基質であるグルコースが必要である。それで本発明者達は、製紙スラッジ内のセルロースを加水分解して手頃な価格でグルコースを大量生産した。セルロースを加水分解してグルコースを生産するために、セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを利用した製紙スラッジの加水分解程度が、製紙スラッジ濃度によって決定される。加水分解可能な製紙スラッジの濃度が１５％ の場合、グルコースは３７ｇ／Ｌ まで生産された。故に、回分式（ｂａｔｃｈ） 培養時、製紙スラッジ内セルロースを加水分解して得られるグルコースの濃度はスラッジ内に３５％ のセルロースがあることをふまえて、グルコースが乳酸に９０％ 転換されると、乳酸３３ｇ／Ｌ が生産される。ＳＦ工程を流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ） で実施した場合、酵素反応液内グルコース含量が少ないために酵素反応液を再び蒸留する工程が必要であり、これは、装置を追加しなければならない経済的負担を招来する。回分式（ｂａｔｃｈ） 培養は、一度に生産を実施するため、スラッジ濃度が高ければ乳酸生産が高い。しかし、製紙スラッジ濃度が高いために撹拌が難しく、低い濃度の乳酸しか生産できない。流加培養には、発酵途中に継続して基質を添加するので、一つの発酵器で最適の生産性と生産濃度を得られるという利点がある。連続式培養では、製紙スラッジの濃度を高くすることができないため乳酸生産濃度が低く、製紙スラッジが固体であるため運転上の難しさが多い。
【００５２】
結論として、ＳＳＦ 工程は、ＳＦ工程に比べて工程時間を短縮し、酵素反応での産物阻害（ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を抑制する。また、高濃度培養が容易で、工程を単純化でき、流加培養時のスラッジ添加による物質移動の問題も大きくない。また、製紙スラッジ内不溶性部分であるアッシュ部分を、乳酸生産後に微生物とともに除去することが有利である。
【００５３】
乳酸生産のためにＬ．ラムノーサスを培養するための培地組成を下記に示す。廃紙スラッジ、酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ．）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．） 、ＫＨ２ＰＯ４（Ｓｈｉｎｙｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．） 、ＭｇＳＯ４ ・７Ｈ２Ｏ（Ｓｈｉｎｙｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．） 、Ｋ２ＨＰＯ４（Ｓｈｉｎｙｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．） 。種菌培養は、シェーキング培養器で２０時間培養した。ＳＳＦ のための実験は、１００ｍｌ フラスコで運転体積（ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ）２０〜３０ｍｌで実施した。培養条件は、種菌培養の場合３７℃、１５０ｒｐｍで培養した。本培養では酵素作用を考慮して４２℃、１５０ｒｐｍで培養した。分析方法は、試料を採取してグルコース濃度、乳酸濃度を分析した。グルコース濃度と乳酸濃度は、グルコース分析機（ＹＳＩ ２７００ ＳＥＬＥＣＴ、Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）で測定した。
【００５４】
乳酸生産のためにＳＳＦ またはＳＦ方法で行ない、グルコース消費及び乳酸生産を比較した。ＳＳＦ は４０℃、ｐＨ６ で実施をし、ｐＨ調節はしなかった。またＳＦ工程は、酵素反応は５０℃で実施し、酵素反応終了５ 時間後に発酵工程を実施した。対照群は、グルコースを基質に利用した。
【００５５】
その結果、グルコース消費と乳酸生産が同じように現れた。ＳＦ工程の利点は、酵素反応と発酵を分離して実施することによって、各工程をそれぞれの最適条件で実施できることにある。しかし、実験の結果、ＳＳＦ 工程と比較して乳酸生産と生産収率が大きな差が無いことが分かった（ 図１９） 。それで、装置的利点を持っているＳＳＦ 工程を選択して最適化実験を行なった。
【００５６】
＜７−２＞ 製紙スラッジ濃度による乳酸生産
ＳＳＦ工程のためには、製紙スラッジを加水分解した後、生成されたグルコースをすぐに乳酸に転換しなければならない。ＳＳＦ 工程での製紙スラッジの濃度は、物質移動のために適正濃度で実施しなければならない。インペラーと電力（ｐｏｗｅｒ） 問題等の問題点による撹拌の困難さを回避するため、撹拌と物質移動が容易な範囲内で加水分解を実施しなければならない。したがって、スラッジ濃度の適正値を探す実験が必要である。そのためにスラッジ５ 〜１０％ でＳＳＦ 工程を実施してその適正値を求める実験をフラスコ内で実施した。
【００５７】
その結果を図２０及び図２１に示した。酵素添加量は、図２ ０では天然セルラーゼ１０Ｕ／ｍｌとβ−グルコシダーゼ２Ｕ／ｍｌ にした。図２１では天然セルラーゼ５Ｕ／ｍｌ 、β−グルコシダーゼ２Ｕ／ｍｌ にした。酵素濃度による乳酸生産は、大きな差がなかった。スラッジ５ 〜１０％ により加水分解され生成されるグルコースの濃度及びＬ．ラムノーサスによってグルコースが消耗されることを示している。製紙スラッジの濃度が１０％ の場合に加水分解速度が減少した。これは、製紙スラッジ濃度が増加するにしたがって粘度が増加して物質移動に影響を与え、加水分解が容易ではなかったことを示している。乳酸生産は、濃度が増加するにしたがって一定に増加した。つまり、セルロースの加水分解のためには製紙スラッジが低い濃度でなければならないが、発酵条件では製紙スラッジ１０％ 濃度でもＳＳＦ 方法で乳酸を生産することが可能である。しかし、これは、フラスコで実験を実施したものであり、発酵器を利用したＳＳＦ 工程時には製紙スラッジ濃度を効率的に調節する必要がある。
【００５８】
＜７−３＞ 製紙スラッジの加水分解
製紙スラッジの加水分解のためには、酵素が必要である。そして、製紙スラッジの加水分解において適正酵素の添加が必要であり、また最適ｐＨ、最適温度がある。ＳＳＦ を、適正ｐＨのｐＨ ５．５と適正温度の４２℃、スラッジ濃度は５％で実施した。ＳＳＦ では、酵素反応よりは微生物生長がさらに重要な因子に見える。その理由は、つまり、工程初期にはグルコースが生成される速度より（酵素反応）、グルコースが消費され乳酸に転換される速度（微生物生長）が遅いためである。反応初期には酵素反応が速いためにグルコースが増加して、１０時間以後には微生物が指数期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ） から静止期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ）に移る段階にあるためにグルコース消耗速度が増加してグルコースが生産される速度より速くなる。一定スラッジ濃度でセルラーゼとβ−グルコシダーゼを多様な量で添加してＳＳＦ を実施した。
【００５９】
β−グルコシダーゼに変化を与え実験した結果は、図２２に示した。セルラーゼを変化した結果は、図２３に示した。酵素反応は、酵素量が増加するにしたがってグルコース濃度が増加するが、その増加量に比べて乳酸生産は、差がほとんど無い。これは、少ない量の酵素でもセルロースを充分に加水分解でき、乳酸に転換できることを示している。したがって以後の実験は、天然セルラーゼ５Ｕ／ｍｌ とβ−グルコシダーゼ２Ｕ／ｍｌ でＳＳＦ 工程を行なった。また、微生物生長が酵素反応に比べて遅く始まるため、これによりＳＳＦ に影響与える因子は、発酵工程であると見ることができ、発酵工程を先行させることによってより高い収率を得ることができる。
【００６０】
また、酵素反応工程と発酵工程を組み合わせて工程を実施する場合に、温度とｐＨに対する考慮が必要である。それで反応温度４２℃ないし４６℃でグルコース及び乳酸生産量を比較してみると、グルコース生産量及び乳酸生産量がほぼ同じで、これは、製紙スラッジを利用した乳酸生産工程での最適温度は、４２℃ないし４６℃であることが分かる（ 図２４） 。
【００６１】
＜７−４＞ 流加培養方法による乳酸生産 １
効率的な乳酸生産のためには流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ） または連続式発酵（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ） が必要である。乳酸生産において多くの量の製紙スラッジ濃度に比べ、生産される乳酸は低い濃度であり、これを解決するために発酵途中にスラッジを添加する流加培養方法を利用できる。
【００６２】
流加培養方法は、初期の物質移動を考慮できる。すなわち、スラッジによって培養液の混合が困難となる現象を、初期に添加するスラッジを少量にすることによって克服できる。初期の低濃度のスラッジにより、酵素によってセルロースが加水分解されつつ、培養液が円滑に撹拌できる。そして、低い濃度のスラッジを途中で添加する場合にも、その量を撹拌に支障を及ぼさない範囲にして、ＳＳＦ を実施できる。微生物が静止期に到達した時、基質である製紙スラッジを添加することによって乳酸生産を極大化した。
【００６３】
その結果を図２５に示した。対照群は、培地にグルコース添加して測定した。対照群の場合はグルコース消耗と乳酸生産が低かった。これは、フラスコでの実験のためｐＨ調節が難しく、ｐＨ調節がされず、発酵培養液がｐＨ３．５ まで下がり細胞生長に阻害を与えたためである。製紙スラッジを添加した場合には、製紙スラッジ内に含まれているアッシュ中にバッファリング（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ） 効果を示す色々なイオン物質が存在するためにｐＨを維持させることができ、最終ｐＨは４．５ であった。つまり、製紙スラッジのバッファリング効果により、発酵器を利用した発酵時のｐＨ調節が容易である。
【００６４】
＜７−５＞ 流加培養方法による乳酸生産 ２
本発明者達は、流加培養においてスラッジを添加する濃度を運転体積を基準に７％スラッジで乳酸生産を行なった。スラッジの初期濃度を８％で作動して、培養途中に酵素を添加して製紙スラッジ内のセルロース加水分解をより速くできるようにした。
【００６５】
その結果を図２６に示した。初期には酵素反応が速いためにグルコースが生成されるのを見ることができた。反応１２時間以後には、グルコース生成速度は落ち、その反対にグルコースが消費される速度が速くなる。すなわち、微生物が指数期から静止期に変化しながら多くの量のグルコースが乳酸に変化されたことが分かった。この時期にはむしろ、グルコースが不足するために乳酸生産速度が落ちるのが分かる（ 図２６のＡ）。反応５０時間以後には、微生物が静止期を維持した後、死滅期（ｄｅａｔｈ ｐｈａｓｅ） に近づく時期であることが分かった。この時期には乳酸生産は、変らずに継続し、また、グルコースが全部枯渇しないで５ｇ／Ｌ前後で残っていた。その理由は、この時期には微生物の活性が高くないためグルコースを乳酸に転換できないか、すでに発酵培養液に乳酸濃度が高いための乳酸による阻害影響のためであると推測できる。上記結果から、微生物の指数期と静止期に充分な量の基質を添加した場合には、速い速度で乳酸が生産された。
【００６６】
＜７−６＞ 発酵器を使用した乳酸生産
上記の＜７−１＞ 〜＜７−５＞ の実験では小規模（フラスコ）でＳＳＦ 工程を実行して発酵条件及び反応条件を求めた。微生物の生長時間を考慮してスラッジを添加した。Ｌ．ラムノーサス培養において２０ｇ／Ｌ グルコースの場合、８ 時間後に静止期に到達する。ゆえに、本実験ではスラッジのフィーディング（ｆｅｅｄｉｎｇ） を８ 時間後から始めた。初期作動体積は、１Ｌから実施し、流加培養後の最終体積は、１．９Ｌだった。ｐＨは、５Ｎ ＮＨ４ＯＨを利用して５．０ を維持した。
上記培養後に生産された乳酸の量を測定して、下記の数式２によりセルロース当たり乳酸の生産率を計算した。
流加培養の結果を、図２７に示した。乳酸生産は、６２ｇ／Ｌ とフラスコに比べて低かった。これは、スラッジの添加による体積増加によりそれ以上作動できなかったためである。しかし、総スラッジの添加量は、総体積の２２％ で、本実験で測定したスラッジ内に含まれたセルロースは３５％ で、この場合７７ｇ／Ｌ セルロースが添加されたことが分かる。この結果は、最終培養終了後のセルロース当たり乳酸生産率が８０％ であることを示す。スラッジ内でセルロースをグルコースに９０％ 転換した場合に、加水分解されたグルコースが乳酸に約９０％ 転換したことを示している。また、生産性は、培養３２時間を基準にして１．６４ｇ／Ｌ ・ｈ で、フラスコで培養した結果の０．９８ｇ／Ｌ ・ｈ より高い結果を示した。これは、スラッジ添加時間を先行させることによって、静止期に到達した微生物によるグルコースから乳酸への転換を容易になったものと思われる。また、初期運転体積を下げて実験を行なえば、より高い乳酸生産性が得られるだろう。
【００６８】
先の実験では酵素反応と発酵の最適条件を各々求めた。ＳＳＦ 方法遂行時には、大量生産に符合するｐＨ及び温度最適化が必要である。そこで、ＳＳＦ での乳酸生産のためにｐＨによる乳酸生産結果を測定した。既存実験では、スラッジの添加量を運転体積に対しスラッジを７％添加して実験した。この結果、運転初期には不溶性部分が多くなく物質移動に大きな影響を及ぼさなかったが、運転末期には不溶性部分が多くなり物質移動に影響を及ぼしスラッジを添加した直後に酵素がスラッジ内セルロースを加水分解するのが容易ではなかった。この解決のために運転体積に対してスラッジを５％に減らして添加した。
【００６９】
＜７−７＞ ｐＨ調節による乳酸生産
既存実験でスラッジは、ｐＨバッファーリング効果があったために今回の実験は、ｐＨを調節しない条件と最適な発酵条件ｐＨ６ に近いｐＨ５．８ で発酵を比較した。初期運転体積は０．６５Ｌ で、最終運転体積は１．５Ｌとした。
【００７０】
その結果、ｐＨを調節しない場合（図２８のＡ）には、培養約６７時間後の乳酸生産が８１．２ｇ／Ｌ であった。ｐＨを５．８ に調節した場合（図２８のＢ）には、培養約８７時間後に６８．８ｇ／Ｌ まで生産した（ 図２８） 。ｐＨを調節しない場合、培養２４時間から４０時間までは、ｐＨの下がりがみられ、この時期には発酵条件に悪影響を及ぼし、乳酸生産が減らされ、またグルコース消費が減らされたことが分かる。これは、ｐＨ５ 以上の条件で発酵を実施してこそ乳酸生産及びグルコース加水分解が容易であることがわかる。ｐＨを５．８ に調節した場合、発酵条件には特に異常はなく、セルロース加水分解がｐＨを調節しない場合ほど効果的には起こらず、結果的に乳酸生産が少なかったことが分かる。ゆえに、ｐＨ５．０ 〜５．５ 間でＳＳＦ 工程を実施しなければならないことが分かる。ｐＨを調節しない場合、スラッジ内セルロース比率が３５％ であることを考慮すると、総１０５ｇ／Ｌセルロースが添加されたことが分かる。これによるセルロース当り乳酸転換率は、７７．５％ であり、セルロースがグルコースに転換される比率が９０％ の場合、グルコース当り乳酸転換率は、約８６％ であることが分かる。培養５０時間を基準とした乳酸生産性は、１．４８ｇ／Ｌ ・ｈ だった。最終的に添加された酵素量は、天然セルロース１７．１Ｕ／ｍｌ、β−グルコシダーゼは３．８Ｕ／ｍｌ だった。
【００７１】
ＳＳＦ 流加培養時に添加するスラッジは６５％ の水を含み、残りが固形分で存在するために連続的に添加することが難しく、機械的装置を利用して連続的にスラッジを添加する場合には、より効率的に工程を遂行できる。
【００７２】
また、ＳＳＦ 工程で流加培養でｐＨを調節して工程を実施した結果、最適ｐＨはｐＨ ５．０だった（ 図２９） 。上記のような結果は乳酸生産には多少不利であるが、酵素反応工程に有利でＳＳＦ 工程には有利な条件であることが分かる。
【００７３】
【発明の効果】
上記で詳しく見たように、本発明によれば、手頃な製紙スラッジを利用して乳酸の基質であるグルコースを生産することによって経済的に乳酸を生産でき、かつ大量生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラクトバシラスラムノーサスを３７℃で培養した時、時間に対する細胞生長を示したグラフである。
【図２】ラクトバシラスラムノーサスをグルコースを含んだ培地で培養した時、時間に対するグルコース消耗及び乳酸生産を示したグラフである。
【図３】ラクトバシラスラムノーサスをグルコースを含んだ培地で色々な温度（３２ 、３７、４２、４６または５０） ℃で培養した時、時間に対する細胞の生長を示したグラフである。
【図４】ラクトバシラスラムノーサスをグルコースを含んだ培地で色々な温度（３２ 、３７、４２、４６または５０） ℃で培養した時、時間に対するグルコース消耗を示したグラフである。
【図５】ラクトバシラスラムノーサスをグルコースを含んだ培地で色々な温度（３２ 、３７、４２、４６または５０） ℃で培養した時、時間に対する乳酸生産を示したグラフである。
【図６】ラクトバシラスラムノーサスをグルコースを含んだ培地で色々なｐＨ（４．８、５．０ 、５．５ または６．０）で培養した時、時間に対する細胞の生長を示したグラフである。
【図７】ラクトバシラスラムノーサスをグルコースを含んだ培地で色々なｐＨ（４．８、５．０ 、５．５ または６．０）で培養した時、時間に対するグルコース消耗を示したグラフである。
【図８】ラクトバシラスラムノーサスをグルコースを含んだ培地で色々なｐＨ（４．８、５．０ 、５．５ または６．０）で培養した時、時間に対する乳酸生産を示したグラフである。
【図９】ラクトバシラスラムノーサスをＭＲＳ 培地またはＭＲＳ 培地に比べ窒素源が低い培地で３７℃または４２℃で培養した時、時間に対する細胞の生長を示したグラフである。
【図１０】ラクトバシラスラムノーサスをＭＲＳ 培地またはＭＲＳ 培地に比べ窒素源が低い培地で３７℃または４２℃で培養した時、時間に対するβ−グルコシダーゼの活性を測定したグラフである。
【図１１】ラクトバシラスラムノーサスをＭＲＳ 培地またはＭＲＳ 培地に比べ窒素源が低い培地で３７℃または４２℃で培養した時、時間に対するＦＰａｓｅ 活性を測定したグラフである。
【図１２】製紙スラッジにセルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを添加して３７℃または４２℃で酵素反応を行った時のグルコースの濃度を測定したグラフである。
【図１３】製紙スラッジにセルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを添加してｐＨ４．８ またはｐＨ５．６ で酵素反応を行った時のグルコースの濃度を測定したグラフである。
【図１４】製紙スラッジにセルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを添加して４５℃でｐＨ４．８ またはｐＨ５．６ の条件で酵素反応を行った時のグルコースの濃度を測定したグラフである。
【図１５】製紙スラッジにセルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを添加して５０℃でｐＨ４．９ 、ｐＨ５．４ またはｐＨ５．９ の条件で酵素反応を行った時のグルコースの濃度を測定したグラフである。
【図１６】スラッジ含量によるグルコース生産速度を示したグラフである（ 〇、●： ２ 回実験） 。
【図１７】色々なスラッジ含量（１、３ 、５ または７）％ によるグルコース生産速度を示したグラフである。
【図１８】ラクトバシラスラムノーサス発酵培養物の有機酸成分を分析したグラフである。
【図１９】廃紙スラッジを利用して４０℃、ｐＨ６ で遂行した同時糖化発酵（ 「ＳＳＦ 」） 及び５０℃で酵素反応遂行、５ 時間後に発酵工程を遂行した順次発酵（ 「ＳＦ」） をグルコースを基質に使用した対照群と比較して時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を比較したグラフである。
【図２０】セルラーゼ１０Ｕ／ｍｌ及びβ−グルコシダーゼ２Ｕ／ｍｌ を添加して色々なスラッジ含量（５、６．７ 、８．３ または１０）％でＳＳＦ を行った時、時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を測定したグラフである。
【図２１】セルラーゼ５Ｕ／ｍｌ 及びβ−グルコシダーゼ２Ｕ／ｍｌ を添加して色々なスラッジ含量（５、６．７ 、８．３ または１０）％でＳＳＦ を行った時、時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を測定したグラフである。
【図２２】セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを各々異なる濃度（ セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを各々５Ｕ／ｍｌ 及び２Ｕ／ｍｌ 、５Ｕ／ｍｌ 及び４Ｕ／ｍｌ 、５Ｕ／ｍｌ 及び６Ｕ／ｍｌ 、５Ｕ／ｍｌ 及び８Ｕ／ｍｌ）で添加してＳＳＦ を行った時、時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を測定したグラフである。
【図２３】セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを各々異なる濃度（ セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを各々１５Ｕ／ｍｌ及び２Ｕ／ｍｌ 、１０Ｕ／ｍｌ及び２Ｕ／ｍｌ 、５Ｕ／ｍｌ 及び２Ｕ／ｍｌ 、２．５Ｕ／ｍｌ 及び２Ｕ／ｍｌ）で添加してＳＳＦ を行った時、時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を測定したグラフである。
【図２４】４０℃、４２℃、４４℃または４６℃でＳＳＦ を行った時、時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を測定したグラフである。
【図２５】ＳＳＦ 遂行途中にスラッジを添加した時（ ↓） の、時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を測定したグラフである。
【図２６】ＳＳＦ 遂行途中にスラッジを添加したり（ ↓） 、セルラーゼ及びβ−グルコシダーゼを添加（ ↑） した時の、時間に対するグルコース濃度（Ａ） 及び乳酸濃度（Ｂ） を測定したグラフである。
【図２７】ＳＳＦ 遂行途中に発酵器にスラッジを添加したり（ ↓） 、セルラーゼ（５Ｕ／ｍｌ） 及びβ−グルコシダーゼ（１Ｕ／ｍｌ） を添加（ ↑） した時の、時間に対するグルコース濃度及び乳酸濃度を測定したグラフである。
【図２８】ＳＳＦ 遂行途中に発酵器にスラッジを添加したり（ ↓） 、セルラーゼ（５Ｕ／ｍｌ） 及びβ−グルコシダーゼ（１Ｕ／ｍｌ） を添加（ ↑） して、ｐＨを調節しない時（Ａ） と、ｐＨを５．８ に調節した時（Ｂ） の、時間に対するグルコース濃度及び乳酸濃度を測定したグラフである。
【図２９】ｐＨ５．８（Ａ）、ｐＨ５．４（Ｂ）またはｐＨ５．０（Ｃ）でＳＳＦ 工程を遂行し、上記ＳＳＦ 遂行途中に発酵器にスラッジを添加したり（ ↓） 、セルラーゼ（５Ｕ／ｍｌ） 及びβ−グルコシダーゼ（１Ｕ／ｍｌ） を添加（ ↑） した時の、時間に対するグルコース濃度及び乳酸濃度を測定したグラフである。
Claims (7)
- 製紙スラッジを加水分解する酵素反応工程と、前記酵素反応工程で生成されたグルコースを乳酸に変換させる発酵工程とを含む乳酸生産方法。
- 前記酵素反応工程は、セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ） 及びβ−グルコシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ） を添加して製紙スラッジのセルロースを加水分解することを特徴とする請求項１に記載の乳酸生産方法。
- 前記発酵工程は、ラクトバシラス属またはリゾプス属微生物添加して培養することを特徴とする請求項１に記載の乳酸生産方法。
- 前記酵素反応工程及び発酵工程を同時に行なうことを特徴とする請求項１に記載の乳酸生産方法。
- 前記方法は、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ） で行なうことを特徴とする請求項４に記載の乳酸生産方法。
- 前記流加培養は４２℃ないし４６℃で行なうことを特徴とする請求項５に記載の方法。
- 前記流加培養はｐＨ５．０ ないしｐＨ５．５ で行なうことを特徴とする請求項５に記載の方法。
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