KR20150036951A - 탄산무수화 효소가 포함된 숙신산 고생산성 악티노바실러스 숙시노게네스 배양용 배지 - Google Patents

탄산무수화 효소가 포함된 숙신산 고생산성 악티노바실러스 숙시노게네스 배양용 배지 Download PDF

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Abstract

본 발명은 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)를 이용하여 숙신산을 고농도로 생산하는 프로세스 및 배지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래의 배양형태에 비해 액체 배양에서 생산성 수율이 1.2 배 높고 생산단가는 큰 폭으로 줄어든, 매우 우수한 탄산무수화 효소를 배지성분으로 이용한 숙신산의 생산 방법을 제공한다.

Description

탄산무수화 효소가 포함된 숙신산 고생산성 악티노바실러스 숙시노게네스 배양용 배지{MEDIUM FOR CULTURE OF ACTINOBACILLUS SUCCINOGEN FOR PRODUCTION OF SUCCINIC ACID, USING CARBONIC ANHYDRASE}
본 발명은 숙신산을 고효율로 생산할 수 있는 배지에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 숙신산 고생산성 배지는 탄산무수화 효소를 이용한 생산성의 증대와 기존의 개발된 배지의 고가 성분인 탄산마그네슘을 대체하거나 그 양을 획기적으로 감소시키는 프로세스에 관한 연구 개발 내용으로써, 탄산마그네슘을 사용하지 않아도 그에 대등한 숙신산을 생산할 수 있는 새로운 프로세스로써 발효를 통한 숙신산의 생산에서 산업화에 강력한 경쟁력을 부여할 수 있다.
미국 에너지자원부가 발표한 미래 10대 중요 에너지 자원에 숙신산이 포함되어 발표된 이후 C4 계열의 카르복실산류의 물질들은 발효를 통한 생물공학 연구 분야의 중요 주제로 발돋움 되었다. 과거 사용되었던 석유화학 공정을 통한 소위 building block material의 생산은 환경오염과 온실가스의 배출 등 이미 많은 문제점을 지적 받은지 오래되었으며 여러 노력에도 불구하고 지구환경오염 문제는 크게 개선되지 않았다. 최근 발효를 통한 상기 기술한 물질들의 발효시스템이 생물공학의 발달로 인해 경제적 경쟁성도 강해졌고 또한 발효시스템의 일부 프로세스가 이산화탄소를 이용한 프로세스라는 점에서 친환경적 공정으로 인식되어 더욱 그 가치를 높이게 하였다.
최근 숙신산의 중요성이 커짐에 따라서, 이를 경제적으로 생산할 수 있는 제조방법이 연구되고 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허 2002-0005200호에는 정제된 포도당 대신에 값싼 재생자원인 목질계 당화액을 탄소원으로 사용하는 기술이 기재되어 있다. 본 발명에서는 종래의 배양 형태에 비해 액체 배양에서 생산성 수율이 1.2배 높고 생산 단가는 큰 폭으로 낮춘 탄산무수화 효소를 사용하여 숙신산의 우수한 생산성을 얻고자 한다.
대한민국 공개특허 2002-0005200호
본 발명의 목적은 종래에 사용되던 배지보다 저렴한 비용으로 숙신산을 산업적으로 대량 생산할 수 있는 배지를 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 탄산무수화 효소를 이용하여 기존의 산업용 저가 배지의 가장 고가를 담당하는 탄산마그네슘을 대체하거나 양을 줄여서 배양하며 기존과 비슷한 생산성을 갖는 숙신산 고생산성 배지를 사용하여 고효율로 숙신산을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은
탄산무수화 효소가 포함된 숙신산 고생산성 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogen) 배양용 배지를 제공한다.
바람직하게는, 상기 배양은 포도당, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 및 탄산마그네슘(MgCO3)을 포함하는 액체 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 배지는 포도당 100 내지 110 g/ℓ, 효모 추출물 10 내지 25 g/ℓ, 옥수수 침지액 15 내지 35 g/L, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 7 내지 12 g/ℓ 및 탄산마그네슘(MgCO3) 0 내지 10 g/ℓ를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 배지는 탄산무수화 효소 10 내지 50 mg/L를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 탄산무수화 효소는 바람직하게는, 소와 인간에서 유래된 알파 (α) 그룹 또는 남조류에서 유래된 베타 (β) 그룹의 탄산무수화 효소인 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 남조류에서 유래된 베타 (β) 그룹의 탄산무수화 효소인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은
i) 탄산무수화 효소 10 내지 50 mg/L를 포함하는 배지에서 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogen)를 배양하는 단계;
ii) 상기 배양액으로부터 숙신산을 수득하는 단계를 포함하는 숙신산의 생산 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 배양은 포도당, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 및 탄산마그네슘(MgCO3)을 포함하는 액체 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 배지는 포도당 100 내지 110 g/ℓ, 효모 추출물 10 내지 25 g/ℓ, 옥수수 침지액 15 내지 35 g/L, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 7 내지 12 g/ℓ 및 탄산마그네슘(MgCO3) 0 내지 10 g/ℓ를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 탄산무수화 효소는 소와 인간에서 유래된 알파 (α) 그룹 또는 남조류에서 유래된 베타 (β) 그룹의 탄산무수화 효소인 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 남조류에서 유래된 베타 (β) 그룹의 탄산무수화 효소인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 숙신산 고생산성 배지는 종래에 사용되던 배지인 탄산마그네슘을 사용한 배지와 비등한 생산량을 가지며, 탄산마그네슘을 아예 사용하지 않거나 또는 부피 비로 10%만 첨가하여도 기존의 생산성과 대등한 생산량을 갖는 조업이 가능하게 된다. 그러므로 기존의 생산단가에 비해 저렴하게 생산 공정이 진행 될 수 있고, 본 발명에 따른 숙신산 생산 균주 액상배양용 배지를 이용한 산업적 규모의 액상 배양을 통하여 석유화학 유도체 및 의약, 식품산업 등에 다양하게 이용되는 숙신산을 저렴한 원가를 통하여 경쟁력 있는 대량 공급이 가능한 장점이 있다.
도 1은 질소가스로 폭기시켜 발효조 내의 다른 가스를 모두 제거한 후 이산화탄소를 다시 폭기시키는 실험을 수행한 그래프로써 그래프에 나타난 실선은 용존 이산화탄소의 농도를 나타낸다.
도 2는 가스 형태의 이산화탄소가 물에 녹았을 때 녹은 형태의 이산화탄소로 전환 되었다가 탄산, 중탄산염, 탄산이온의 형태로 전환되어지는 일련의 과정을 나타낸 그림이고 또한 이때의 각 반응에서의 평형상수를 나타내며 평형상수는 산 해리도를 통하여 구하여졌다.
도 3은 탄산무수화 효소를 넣거나 넣지 않았을 때의 각각 발효된 숙신산의 생산량을 비교하는 그래프이다.
도 4는 탄산무수화 효소를 농도별로 증가시키며 발효조 안에 넣었을 때 용존 이산화탄소의 녹는 속도가 증가하는 것을 나타낸 그래프이다.
도 5는 탄산무수화 효소를 농도별로 증가시키며 발효조 안에 넣었을 때 이산화탄소의 물질전달계수가 증가하는 것을 나타낸 그래프이다.
도 6은 교반기의 교반속도를 증가 시켰을 때와 각각 해당하는 교반속도에서 탄산무수화 효소를 공급하였을 때의 물질전달 계수를 비교한 그래프이다.
도 7은 다양한 형태의 전체 탄산을 공급하였을 때 숙신산이 생산되는 배양 형태를 나타낸 그래프로써, P medium에 탄산무수화 효소 30 ppm, 탄산마그네슘 10 g/L 그리고 이산화탄소 가스를 공급하였을 때 최고 96.49 g/L의 숙신산을 생산하는 것이 관찰 되었고 이는 탄산무수화 효소를 공급하지 않은 같은 조건의 발효조에서 나타난 숙신산 생산량보다 두 배 높은 농도를 생산하는 결과를 나타낸다.
도 8은 시아노박테리엄 시네초시스티스(cyanobacterium Synechocystis) sp. PCC 6803의 염색체 DNA를 추출한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 미국 국립생물정보센터(NCBI)의 데이터베이스에 게재된 시아노박테리엄 시네초시스티스 sp. PCC 6803 염색체 내에 존재한 탄산무수화 효소의 염기서열을 나열한 것을 나타낸다.
도 10은 제작된 forward primer와 reverse primer를 이용해 탄산무수화 효소의 유전자를 증폭시키기 위한 중합 효소 연쇄 반응을 수행 한 뒤 겔에 로딩한 결과이다.
도 11은 유전자 클로닝 및 형질 전환 후 선별된 단일 콜로니의 염기서열 분석을 통해 올바르게 클로닝이 되었음을 확인한 결과이다.
도 12는 피키아 파스토리스 X-33 균주를 숙주로 이용한 최종 형질 전환체 중 11개의 단일 콜로니를 선별해 콜로니 중합 효소 연쇄 반응(colony-PCR)을 수행한 결과이다.
도 13은 선별된 11개의 콜로니 중 5개의 콜로니의 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행한 결과이며 이 중 PCA4 균주를 선별하였다.
도 14는 피키아 파스토리스를 형질 전환을 위한 숙주로 사용하여 배양한 후 배양 파라미터를 나타낸 그래프이며, 유전자가 조작되지 않은 야생균주의 배양 결과이다.
도 15는 도 14의 배양과 비교하기 위한 실험 결과로서, 피키아 파스토리스 야생 균주에 탄산무수화 효소를 형질전환한 유전자 재조합 균주를 이용해 메탄올로 인덕션 하여유전자를 발현시키기 위한 배양으로서, 배양 과정의 파라미터를 결과를 나타내었다.
도 16은 표 4에 제시된 숙신산 생산성 결과 값을 그래프화한 것으로, 유전자 재조합된 형질전환체의 효과를 증명한 비교 배양 그래프이다.
본 발명은
탄산무수화 효소가 포함된 숙신산 고생산성 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogen) 배양용 배지를 제공한다.
탄산무수화 효소를 이용하는 경우에는 기존의 산업용 저가 배지 중 고가인 탄산마그네슘을 대체하거나 양을 줄여서 배양하고, 탄산무수화 효소를 이용하는 경우 기존과 비슷한 생산성을 갖는다. 세포는 숙신산을 합성하여 에너지 대사를 할 때 다량의 이산화탄소를 필요로 하게 된다. 따라서, 세포가 이용하는 전체 탄산 이온의 양은 부족한 상태이며, 이는 탄산무수화 효소를 첨가하여 이산화탄소의 전환속도를 높여줄 수 있다. 이러한 역할로 인하여 이산화탄소의 공급을 원활하게 해주어 숙신산의 생산량을 증가시킬 수 있다. 또한, 탄산무수화 효소가 포함된 본 발명의 배지는 종래의 배양형태에 비해 액체 배양에서 생산성 수율이 1.2배 높기 때문에 경제적으로도 효율적이다.
구체적으로는, 본 발명은 탄산무수화 효소를 사용하여 종래의 배지보다 숙신산의 생산 효율이 높은 숙신산 생산용 배지를 제공한다.
또한, 본 발명은
i) 탄산무수화 효소 10 내지 50 mg/L를 포함하는 배지에서 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogen)를 배양하는 단계; 및
ii) 상기 배양액으로부터 숙신산을 수득하는 단계를 포함하는 숙신산의 생산 방법을 제공한다.
이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 숙신산을 저렴한 비용으로 효율적으로 생산할 수 있는, 글루코스 100 내지 110 g/ℓ, 효모 추출물 10 내지 15 g/ℓ, 옥수수 침지액 15 내지 25 g/ℓ, 탄산수소나트륨 8 내지 12 g/ℓ 및 탄산마그네슘 0 g/L 내지 10 g/L를 포함하는 숙신산 생산 균주 배양용 배지에 탄산무수화 효소 10내지 50mg/L를 포함하는 숙신산 생산 균주 액상배양용 배지가 제공된다.
본 발명에서 탄산무수화 효소의 역할과 효과를 규명하기 위해서 기체상, 액상 그리고 이온화되어 이용되는 이산화탄소의 각 단계에 대한 물질수지식에 대한 이해와 용존 이산화탄소의 물질 전달을 알아보기 위해 dynamic method를 이용하여 여러 가지 조건에서 이산화탄소가 용존 이산화탄소로 녹는 과정의 속도 분석을 수행하였고 최종적으로 생물반응기에서 배양을 수행하여 실제 생산되는 숙신산 양의 변화를 관찰한다.
본 발명에 따른 일 구체 예에서, 숙신산 생산 균주 액상배양용 배지는 바람직하게는 글루코스 100 내지 130 g/ℓ, 효모 추출물 10 내지 25 g/ℓ, 옥수수 침지액 15 내지 35 g/ℓ, 탄산수소나트륨 8 내지 15 g/ℓ 및 탄산마그네슘 0 내지 10 g/ℓℓ, 더 바람직하게는 글루코스 100 내지 110 g/ℓ, 효모 추출물 10 내지 15 g/ℓ, 옥수수 침지액 15 내지 25 g/ℓ, 탄산수소나트륨 8 내지 12 g/ℓ 및 탄산마그네슘 0 내지 10 g/ℓ를 포함한다.
상기 서술된 바와 같은 배지를 사용하여 숙신산을 생산할 경우, 고농도의 숙신산 회수량을 얻을 수 있으며, 또한 고가인 탄산마그네슘을 배양에 첨가하지 않을 경우 탄산무수화 효소를 대체하여 배양 할 수 있으며, 탄산마그네슘을 넣은 배양과 비교하여 비등한 수준의 생산량을 회수할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, i) 본 발명에 따른 배지에서 숙신산 생산 균주를 배양하는 단계; 및 ii) 상기 배양액으로부터 숙신산을 수득하는 단계를 포함하는 숙신산의 생산 방법을 제공한다.
본 발명에서 배양액으로부터 숙신산을 수득하는 것은 당 분야에 알려진 통상의 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 전기투석이나 강산의 첨가로 결정화한 후 다른 염들을 씻어내고 증발시켜 회수하는 방법 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
이하에서 본 발명을 실험예 및 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 다만 실험예 및 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시되는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.
< 실험예 1: 사용 균주 및 균주 보관>
숙신산 생산 균주로 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입한 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)(ATCC 55618)로부터 유래된 돌연변이주, UK13균주(KCTC 12233BP)를 사용하였다. 또한 사이아노박테리엄 시네초시스티스 PCC 6803 (Cyanobacterium synechocystis sp. PCC 6803)(ATCC 27184)의 염색체에 존재하는 탄산무수화 효소 유전자를 얻었으며, 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 분양 받은 피키아 파스토리스(Pichia pastoris ) X-33 균주를 숙주로 사용해 탄산무수화 효소 유전자 클로닝을 수행하였다. 균주보관은 액상배양을 통해 얻은 균체를 4℃에 보관하거나 20% 글리세롤 stock을 만들어 -80℃에 보관하였고, 필요시 마다 보관된 stock을 꺼내어 고체 계대배양 배지에 접종 후 배양하여 사용하였다. 또한 피키아 파스토리스 X-33 균주는 BG-11 배지가 5~7ml 포함된 사면 배지에서 2주씩 격주로 계대 배양하여 보관하였다.
< 실험예 2: 배지 및 배양 조건>
2.1. 악티노바실러스 숙시노게네스( Actinobacillus succinogenes )( ATCC 55618)로부터 유래된 돌연변이주 , UK13 균주( KCTC 12233 BP )의 배지 및 배양 조건
고체배양은 TSA(tryptic soy agar) 배지(pancreatic digest of casein 15 g, papaic digest of soybean 5 g, NaCl 5 g, 한천(agar) 15 g, 증류수 1ℓ)를 이용하였다. 생산배양에 앞서 균체를 늘리기 위한 성장배양은 TSB(tryptic soy broth) 배지(pancreatic digest of casein 17 g, papaic digest of soybean 3 g, 덱스트로오스 2.5 g, NaCl 5 g, K2HPO4(인산칼륨 dibasic) 2.5 g, 증류수 1ℓ)를 사용하여 활성이 높은 균체를 얻어내었다.
2.2. 사이아노박테리엄 시네초시스티스 PCC 6803 ( Cyanobacterium synechocystis sp . PCC 6803)( ATCC 27184) 균주의 배지 및 배양 조건
고체배양은 BG(bluegreen)-11 배지(NaNO3 17.6 mM, K2HPO4 0.22 mM, MgSO4·7H2O 0.3 mM, CaCl2·2H2O 0.2 mM, Citric acid·H2O 0.03 mM, Ferric ammonium citrate 0.02 mM, Na2EDTA·2H2O 0.002 mM, Na2CO3 0.18 mM, BG-11 Trace metals solution 1 ml, sodium Thiosulfate pentahydrate 1 mM, 한천(agar) 15 g, 증류수 1L)를 이용하였다. 또한 고체배양에 사용된 BG-11 Trace metals solution의 성분은 H3BO3 46μM, MnC12·4H2O 9μM, ZnSO4·7H2O 0.77μM, Na2MoO4·2H2O 1.6μM, CuSO4·5H2O 0.3μM, Co(NO3)2·6H2O 0.17μM 로 구성되어 있다. 성장배양을 위한 배지는 고체배지와 같이 한천(agar)을 제외한 BG-11 배지를 사용하였다.
2.3. 피키아 파스토리스 X-33 균주의 배지 및 배양 조건
고체 배양은 YPDA 배지(효모추출물 10 g, 펩톤 20 g, 덱스트로오스 20 g, 한천(agar) 15 g, 증류수 1L)를 이용하였고, 균체 성장을 위한 성장배양을 위한 배지는 고체 배양을 위한 YPDA 배지에서 한천(agar)을 제외한 YPD 배지를 사용하였다.
< 실험예 3: 유전자 재조합을 통한 유전자 클로닝 >
3.1. 균체 Chromosomal DNA 분리
액상배양을 통해 얻은 균체로부터 염색체 DNA를 획득하였다. 액체 배지에 1% (v/v)로 접종 후 30℃, 200(RPM)으로 16~18 시간 진탕 배양하여 균체를 준비한 후, 배양액을 원심 분리하여 상등액을 제거하였으며, 상등액이 제거된 균체를 인비트로젠사에서 구입한 키트(i-genomic BYF, cat. No. 17361, invitrogen)를 사용하여 염색체 DNA를 준비하였다.
3.2. Competent cell 의 제조 및 E. coli 로의 형질 전환
재조합된 발현벡터를 E. coli DH5α에 균주 형질전환을 시도하였다. competent cell의 조제는 CaCl2 방법을 이용하였다. E. coli 형질전환은 competent cell을 -80℃로부터 꺼내어 ice에서 천천히 해동하였으며 준비된 DNA 10㎕를 competent cell 200㎕에 넣은 후 ice에서 30분간 방치하여 cell과 DNA가 접합하도록 하였다. 이후 미리 준비된 42℃ 항온수조에서 90초간 열 충격을 주었다. 이후 ice에서 2분간 방치하였고 LB 배지 800㎕를 첨가하여 37℃에서 2시간 배양하였다. 배양액을 50~200㎕ 범위로 다양하게 앰피실린(ampicillin)이 첨가된 고체 LB배지에 도말하여 12~16시간 이후 colony를 확인하였다.
3.3. 생산 균주인 피키아 파스토리스 X-33로의 형질 전환
생산 균주의 electrocompetent cell을 준비하기 위해, YPD 배지에 2시간동안 30℃에서 250(RPM)으로 배양하였고, 세포의 밀도가 5-7×107 cells/ml이 될 때까지 12~16시간 2차 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 세포의 pellet을 현탁시켜 1M DTT(dithiothreitol)을 첨가해 15분 동안 30℃에서 배양하였다. 다음으로 1M sorbitol를 첨가하여 섞은 뒤, 원심분리하여 상등액을 제거했으며 세번 더 반복하였다. 최종 세포의 농도가 ~1×109 cells/ml이 되도록 조심스럽게 다룬뒤 최종적으로 최대 1.3ml의 세포 부피가 되도록 해주었다. 이렇게 얻은 DNA 샘플 최대 10㎍과 pPICZα B 벡터를 취해서 멸균된 1.5ml microfuge tube에 넣어주고 이전에 준비된 electrocompetent cell 40㎕를 첨가했다. 이 혼합액을 0.2 cm cuvette에 넣어준 뒤, 2.0 kV 전압으로 전기영동 하였고, pPICZα B 벡터를 선별하기 위해 지오신이 포함된 YPDA 배지에 도말하여 colony를 확인하는 과정을 수행하였다.
3.4. RT - PCR 에 의한 유전자 발현 확인
형질 전환 후 선별된 형질전환체로부터 탄산무수화 효소 유전자의 발현 여부를 확인하고자 RT-PCR을 수행하였다. 각 배양액으로부터 균체를 회수 하였고, Rneasy mini kit(Qiagene)을 사용하여 total RNA를 분리하였다. cDNA를 합성하고자 먼저 PCR tube에 total RNA 3㎕, RT용 primer(20pmol) 1 ㎕, dNTP(10mM) 1 ㎕, DNase free water 7 ㎕를 첨가하여 반응액을 제조하고 반응액을 65℃로 5분간 반응시킨 후 즉시 ice에 놓았다. 이 반응액에 5X RTase buffer 4 ㎕와 0.1M DTT 2 ㎕, RNase inhibitor 1 ㎕를 첨가하고 다시 42℃에서 2분간 반응시켰다. SuperscriptTMII RTase 1 ㎕를 첨가하여 42℃에서 60분간 반응시킨 후 70℃에서 15분간 RTase를 불활성화하여 cDNA 합성을 종결하였다. 탄산무수화 효소의 cDNA가 합성된 RT-PCR 반응액 3 ㎕, 10X buffer 5 ㎕, 2.5ml dNTP 5 ㎕, 10pmol specific primer 각 2 ㎕, Taq polymerase 5 Unit 그리고 최종 부피가 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하여 PCR 반응액을 조제하였으며 DNA 증폭을 시도하였다. 또한 인트론사의 one step RT-PCR kit를 이용할 경우에는 total RNA로부터 15 oligo dT primer를 이용하여 전체 RNA를 cDNA로 합성한 후 특정한 탄산무수화 효소의 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다.
3.5. 니켈( nickel ) 컬럼을 이용한 단백질 분리 정제
탄산무수화 효소 유전자를 수반하는 pPICZα B 벡터의 제한효소자리(multiple cloning site, MCS) 말단 부분에는 히스티딘이 존재함으로 이를 인지하는 니켈 수지를 채운 일회용 플라스틱 컬럼을 이용하여 단백질을 분리 정제하였다. 피키아 파스토리스 X-33 균주에서 발현된 탄산무수화 효소를 포함한 배양액을 원심분리하여 상등액을 얻은 후, 상등액의 500ml을 UF membrane을 통해 농축하였다. 5배 농축 한 뒤 농축액을 인비트로젠사의 ProBondTM Purification system(cat. No. 1382974) kit를 이용하여 정제하였으며, 정제된 용액은 4℃에서 보관하며 필요시 꺼내어 실험에 사용하였다.
3.6. 탄산무수화 효소의 활성 측정을 통한 단백질 발현 확인
본 발명에서 탄산무수화 효소의 활성을 측정하기 위해 사용된 방법은 PNPA법이며, 이는 탄산무수화 효소에 의해 발색되는 정도를 흡광도로 측정하는 방법이다. 피키아 파스토리스 X-33 균주에 의해 발현된 crude 용액과 정제한 용액, 그리고 기준물질로 시그마알드리치코리아사에서 구매한, 소에서 유래한 알파 (α) 그룹의 탄산무수화 효소를 사용하였다. Blank로는 reagent A(15 mM Tris sulfate buffer, pH 7.6 at 0℃) 2 ml과 reagent B(3 mM p-Nitrophenyl acetate solution, PNPA) 1 ml을 섞은 뒤 측정해주었으며, 기준 물질과 나머지 두 용액에는 reagent A를 1.9 ml과 reagent B를 1 ml 섞어 주고 reagent C(탄산무수화 효소 용액)를 100 ㎕ 첨가해주어 섞은 뒤 흡광분석기를 통해 파장 348nm에서 5분 동안 발색되는 차를 구해 아래의 식에 대입해 효소의 활성을 알 수 있었다.
Figure pat00001
여기서 1000은 단위변환을 위해 곱해주는 수이며, 5.0은 pH 7.6, 0℃에서의 p-Nitrophenol의 밀리몰 흡광계수를 나타낸다.
< 실험예 4: 유전자 발현을 위한 배양 조건>
피키아 파스토리스 X-33을 숙주로 사용해 탄산무수화 효소 유전자를 세포외로 분비하기 위해 배양을 수행하였다. 5L bottom-driven 배양기를 이용하여 유전자 발현을 위한 발효기 배양을 수행하였다. pH(Mettler-Toledo), DO probe(Mettler-Toledo)를 컴퓨터에 연결하여 온라인 모니터링 하였으며, Lokas사의 Autolab을 이용하여 vent gas(산소 및 이산화탄소)를 측정하였다. DO level은 충분한 산소 공급을 통하여 100% saturation 시킨 후 배양하였으며, DO level에 따라서 교반속도를 180(RPM)에서 300(RPM)까지 조정해주었다. 종균 접종을 위해서 고지오신을 포함한 고체배지에서 30℃, 3일간 키운 뒤 단일 콜로니를 회수하고 이를 50ml 유리튜브(working volume : 5ml)에 1%(v/v) 접종하여 180(RPM)으로 30℃에서 파장 600nm에서 O.D 값이 0.3이 되도록 1차 성장 배양하였으며, 500ml flask(working volume : 50ml)에 동일한 조건으로 O.D 값이 약 5가 되도록 배양하였다. 이를 발효기를 위한 종균 배양으로 하였으며 발효기에 1%로 접종하였다. 배양을 위한 생산 배지로는 글리세롤 40 g/L, 효모추출물 10 g/L, 펩톤 20 g/L, 효모 니트로겐 베이스 13.4 g/L, 인산칼륨(KH2PO4) 100mM, 비오틴 4×10-5 %, 히스티딘 1 g/L, 거품억제제(antifoam) 204 500 ㎕으로 구성된다. 배양 조건으로는 pH를 10N NaOH를 이용해 6.0으로 일정하게 유지해주고 0.75 vvm으로 산소를 공급해주었으며, pH와 D.O 값이 올라가는 때에 50 %(w/v) 글리세롤을 공급 해주기 시작하고 인덕션 전에 히스티딘에 제한 받지 않도록 5 %의 히스티딘을 5 ml 공급해주었다. 글리세롤의 공급이 끝나면 탄산무수화 효소 생산을 메탄올로 인덕션 해주기 위해 공급을 시작한다. 메탄올 공급양은 아래의 식과 같이 계산하여 점진적으로 증가시켰다.
Figure pat00002
여기서 F는 공급 속도로 단위는 ml/h이며 Fo는 초기 공급 속도이다. T는 인덕션 후의 시간이며 시간(h) 단위로 계산하였고 μ는 세포의 비성장속도를 나타내고 단위는 h-1이다. 정해진 시간 마다 샘플링하고, O.D600 값을 측정하며 샘플은 12,000 (RPM), 10분 동안 원심분리한 후에 상등액을 취했다.
< 실험예 5: 숙신산 생산 배양 조건>
고체 배지에서 성장한 단일 콜로니를 무균적으로 수거한 후, 이를 액체배지에 1%(v/v)가 되도록 접종하였다. 배양은 5L stirred tank reactor에서 3 L의 배양부피로 진행되었다. 최초 균체의 성장 배양은 진탕 배양기에서 38℃, 200(RPM)으로 1 내지 2일간 배양하였고, 액상 성장 배양은 50 ml 유리튜브에 5 ml 조업부피로 수행 되었으며 원활한 배양을 위하여 기울여 배양하였다. 1차 성장 배양은 12 내지 15 시간 배양하였으며 그 후 2차 성장 배양은 250 ml 플라스크에서 조업부피 30 ml 로 6 내지 12 시간 배양한 후 발효조에 접종하였다. 성장과 생산배양 모두 1%의 접종량으로 접종하였으며 포도당 109 g/ℓ, 효모 추출물 13 g/ℓ, 옥수수 침지액 19 g/ℓ, 탄산수소나트륨 10 g/ℓ 및 탄산마그네슘 10 g/ℓ이 포함된 생산배지를 사용하였다.
< 실험예 6: 숙신산의 정량분석>
악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes) KCTC 12233BP의 배양액에서 숙신산의 정량분석을 위해 1.5 ㎖ 마이크로 튜브에 시료를 채취하고 연속 희석(serial dilution)을 통하여 희석한 다음 0.45 ㎛ 여과지를 이용하여 2번의 여과 과정을 수행한 후, HPLC를 이용하여 다음의 조건으로 분석하였다.
분석 온도: 25℃
유속: 0.8 ㎖/min
이동상: 0.01N H2SO4
분석시간: 20분
시료 주입양: 20 ㎕
칼럼: Organic acid column (Bio-Rad, Aminex HPX 87H, 125-0140 )
검출기: UV detector
<실험예 7: 당 분석>
배양액 중의 당분석은 배양액을 12,000(RPM)에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 12,000(RPM)에서 10분간 3회 원심분리를 반복 수행하여 상등액만을 취한 다음 0.45 ㎛ HPLC용 여과지를 이용하여 여과하였다. HPLC를 이용한 당분석 조건은 다음과 같았다:
분석 온도: 40℃
유속: 1.2 ㎖/min
이동상(mobile phase): 아세토니트릴 : 물 = 75 : 25 (v/v)
분석 시간 : 15분
시료 주입양 : 20 ㎕
칼럼 : Amine column (250 ㎜ × 46 ㎜, RS tech)
검출기: RI detector
< 실험예 8: 균체 농도 측정>
균체의 농도는 세포 건조 중량(Dry cell weight, DCW)을 이용하여 측정하였다. 배양액으로부터 균일하게 세포를 회수한 다음 20ml의 세포를 4000(RPM)에서 10분간 원심 분리 하였다. 상등액을 회수하여 1.5ml tube에 옮겨 남아 있는 당의 측정에 사용하였고 나머지 상등액은 제거한 후 3번의 세척 과정을 통해서 남아 있는 당 및 불용성 물질이나 염류들을 제거하였다. 이 후 무게용 접시에 담아 90℃에서 12시간 건조하여 세포 건조 중량의 무게에 변화가 없는 것을 확인한 후 건조 중량을 측정하여 1L당 세포 농도로 환산하여 나타내었다. 경우에 따라서는 회수한 배양액을 paper filter로 세척한 후 이를 전자레인지를 이용하여 20분간 건조하여 세포 건조 중량을 측정하였다.
< 실험예 9: 이산화탄소 물질전달속도계수( k L a )를 측정하기 위한 실험방법 및 이론식 확립>
기체 이산화탄소와 액체 배양액사이의 경계면에서 이산화탄소의 농도차가 존재하고 이로 인해 상경계를 통한 이산화탄소의 전달현상이 발생하는데, 이를 수치화한 것이 물질전달계수(kLa)이다. 발효조에서의 kLa값을 측정하기 위해 용존 이산화탄소의 물질수지식에 근거한 dynamic method를 적용하였다. 즉 기체 이산화탄소의 용존 이산화탄소로의 전달률(CTR = carbon dioxide transfer rate)과 생산균주의 이산화탄소흡수율 (CUR=carbon dioxide uptake rate)을 측정하여 용존 이산화탄소에 근거한 물질수지식으로부터 이산화탄소 전달계수(carbon dioxide transfer rate coefficient, kLa)를 측정하였다. Dynamic method 적용을 위해 용존 이산화탄소에 대한 물질수지식을 다음과 같이 얻을 수 있었다.
Figure pat00003
①
여기서 CL은 발효배양액 내의 용존 이산화탄소 농도(mg CO2/L)이고, C* L는 포화 용존 이산화탄소 농도(mg CO2/L)이다. 는 세포 당 이산화탄소흡수율(specific carbon dioxide uptake rate, mg CO2/g cell/h)이며, X는 배양액 내의 세포농도(g cell/L)이다. 배양 도중 어느 한 시점에서 이산화탄소의 공급을 멈추면 상기식의 kLa는 0이므로 배양액의 용존 이산화탄소 농도는 다음 식을 만족하면서 감소하게 된다.
Figure pat00004
②
그러므로 t에 대한 CL선의 기울기를 측정함으로서 생산균주의 이산화탄소흡수율(CUR)인 를 측정할 수 있다. 일정 시점이 지난 후 기체이산화탄소를 다시 발효조로 공급하면, 배양액 내의 용존 이산화탄소는 식의 물질수지식을 만족하면서 증가한다(도 1). 이 때 식을 다시 정리하여 직선관계식으로 재배열하면 다음과 같다.
Figure pat00005
③
식으로부터
Figure pat00006
에 대한 CL의 플롯은 기울기가
Figure pat00007
이며 y축의 절편이 C* L인 직선이므로 이로부터 기울기를 계산함으로써 이산화탄소전달계수인 kLa를 측정할 수 있다. 여기서 CL=Co L (final steady dissolved-carbon dioxide concentration)일 때,
Figure pat00008
④
이 된다. 식을 t2와 t1 사이에서 적분하여 정리 하면
Figure pat00009
⑤
가 된다. 따라서 좌변을 Y 좌표로, 우변의 (t2-t1)을 X좌표로 교반속도나 가스유량, impeller나 sparger 등 다양한 배양 parameter에 따른 CL의 변화를 도식화하면, 그 기울기로부터 이산화탄소전달계수인 kLa를 구할 수 있게 된다.
세포가 없는 경우, gassing-out method를 사용하였는데 포화용존 CO2 농도에서 질소가스를 폭기 시켜 발효조 내의 용존 이산화탄소 농도를 인위적으로 가장 낮은 수준으로 낮춰준 후, 다시 이산화탄소를 폭기 시켜 이산화탄소의 농도가 상승하는 곡선에서 용존 이산화탄소에 대한 물질수지식을 적용하여 kLa를 구하였다. 이 때 사용된 물질수지식은 아래와 같다.
Figure pat00010
⑥
< 실시예 1: 탄산무수화 효소의 특성 규명 및 이를 이용한 산업용 저가 배지의 개발>
생산배양에서 사용되는 이산화탄소 가스는 배양 중 배지 속으로 가스 형태가 액체에 녹아든 상태로 녹아들어가고 이는 다시 중탄산염 형태나 탄산이온의 형태로 녹아 들어가게 된다(도2). 이때의 평형상수를 조사해보면 탄산이온 상태가 4.8×10- 11정도로 거의 존재하지 않는 것을 알 수 있다. 중탄산염의 평형상수도 극히 낮은 편이며 대부분 액상에 녹아든 상태의 탄산이거나 가스 상태의 이산화탄소인 것을 알 수 있다. 숙신산을 생합성 하는 데에 있어 이산화탄소의 이용은 세포 내에 이산화탄소가 직접 유입되는 것과 세포막에 존재하는 펌프 단백질에 의해 탄산 이온 형태로도 유입이 되는 것으로 알려져 있어 보통 전체 탄산 이온의 효과적인 전달을 많이 연구한다. 현재 보유하고 있는 주요 생산배지의 이산화탄소 공급원은 탄산마그네슘이다. 그러나 탄산마그네슘의 가격이 비싸기 때문에 경제성에 적합하지 않다. 보유하고 있는 생산배지에서 탄산마그네슘이 차지하는 생산단가는 약 35~40% 수준이다.
따라서 탄산마그네슘을 공급하는 양을 감소시키거나 아예 공급하지 않게 되면 그만큼 경제적인 이점을 가져올 수 있다. 이에 탄산 형태의 이산화탄소를 중탄산염 형태로 전환시켜 주는 탄산무수화 효소에 주목하게 되었고 탄산무수화 효소를 이용한 배양 프로세스의 개발을 연구하였다. 도3과 같이 이미 수행된 실험에서 탄산마그네슘이 없는 생산배지에서 가스형태의 이산화탄소만 폭기 시켜 준 것과 탄산무수화 효소를 배지 내 공급해준 두 개의 발효를 수행하였고, 그 결과, 탄산무수화 효소를 배지성분과 같이 생산배지 내에 공급하여 주었을 때 생산성이 약 30% 이상 증가하는 것을 확인하였다(도 3).
탄산무수화 효소는 용액으로 녹아드는 이산화탄소의 반응속도를 더욱 높게 해준다. 발효 시, 지수성장기가 시작되면 세포는 숙신산을 합성하여 에너지대사를 하게 되므로 다량의 이산화탄소를 필요로 하게 된다. 따라서 배지 내 세포가 이용하는 전체 탄산 이온의 양은 부족한 상태라 할 수 있는데 탄산무수화 효소가 이산화탄소의 전환속도를 높여 주는 역할을 수행하기 때문에 이산화탄소의 공급을 원활하게 해주어 숙신산의 생산량이 증가하는 것으로 풀이할 수 있다.
상기 결과를 확인한 후, 탄산무수화 효소의 효과를 확인하기 위하여 gassing out method를 이용하여 이산화탄소 용존 수준을 확인하여 보았다. 발효조를 이용하여 3리터 생산배지에 질소가스를 폭기시켜 발효조내의 다른 가스들을 모두 제거 한 후에 이산화탄소를 폭기 시켜 배지 내에 증가되는 용존 이산화탄소의 수준을 확인하였다. 도 4에 나타난 바와 같이 탄산무수화 효소를 공급해 주었을 때 이산화탄소가 배지 내 녹아들어가는 속도가 좀 더 빨라지는 것을 확인 할 수 있다.
더 나아가 공급되는 탄산무수화 효소를 농도별로 공급하여 주었을 때의 이산화탄소의 물질전달 계수를 조사한 결과, 큰 차이로 증가되지는 않지만 조금씩 농도에 따라 증가되는 것을 확인하였다(도 5). 이산화탄소의 물질전달계수의 증가정도는 작지만 물질전달계수의 정의가 단위면적당 공급되는 속도인 것을 볼 때 실제 전달되는 이산화탄소의 변환정도는 크다고 생각할 수 있다. 또한 일정한 교반속도에서의 이산화탄소에 대한 물질전달계수와 탄산무수화 효소가 같이 있을 때의 이산화탄소의 물질전달계수를 비교해보면 탄산무수화 효소가 같이 있을 때의 이산화탄소의 물질전달계수가 좀 더 높은 것을 알 수 있다. 도 6에서 나타나는 결과를 관찰하면 교반속도에 의한 증가가 탄산무수화 효소의 첨가보다 용존 이산화탄소의 용해정도에 더 큰 영향을 미치는 것을 확인 할 수 있다. 그러나 교반속도의 증가로만 이산화탄소의 용해속도를 높이는데 한계가 있으며 교반속도를 300(RPM) 이상 올려주었을 때, 더 이상 이산화탄소의 물질전달계수가 증가하지 않는 결과를 1단계 과제수행에서 관찰한 바 있다. 하지만 탄산무수화 효소를 첨가하여 주었을 때 이산화탄소의 용해속도가 증가하는 것을 관찰할 수 있으며 이는 생산 균주에 공급되는 이산화탄소의 양이 늘어난다는 것을 의미한다.
< 실험예 10: MgCO3 의 부분 첨가와 탄산무수화 효소 첨가를 통한 상승 효과>
탄산무수화 효소의 전체 탄산이온 공급 효과를 확인하였으므로 좀 더 다양한 조건에서 탄산무수화 효소의 효과를 알아보기 위하여 실험을 수행하였다. 먼저 탄산무수화 효소가 공급되는 시간에 따른 실험을 수행하였는데 탄산무수화 효소는 단백질로 구성된 효소라서 효소에 가장 중요한 요소인 단백질의 활성유지가 사실 탄산무수화 효소를 중심으로 한 배양공정의 핵심이라 할 수 있다. 따라서 효소의 활성이 발효조 내에서 얼마나 유지되는지 계측할 수 없으므로 0시간인 초기에 공급되는 조건과 지수성장기가 시작되는 시간인 12시간, 그리고 지수성장기가 유지되는 시점인 24시간에 탄산무수화 효소를 공급하여 주어 실험을 수행하였다. 5리터 발효조에 48시간 배양을 수행한 결과 탄산무수화 효소의 활성은 초기부터 배양말기 까지 지속적으로 유지되는 것으로 풀이된다. 초기에 공급해준 탄산무수화 효소의 발효조가 생산성이 가장 높은 것으로 나타났고 배양 중반에 공급해준 실험은 시간의 단계에 따라 감소되어 나타나는 것이 확인 되었다. 지수성장기가 시작되는 12시간에 공급해준 배양은 초기에 공급해준 발효조와 5 g/L정도 숙신산이 조금 생산된 것을 확인 할 수 있었는데 세포내 이산화탄소를 이용하고 못하는 것은 초반의 이산화탄소 농도나 전체 탄산이온들의 영향이 있다고 판단 할 수 있다.
또한, 여실히 들어나는 것은 지수성장기 중반에서 감속기로 유도되는 시점인 24시간대에는 이미 이산화탄소의 요구도가 작고 탄산무수화 효소가 공급되지 않고 이산화탄소 가스만 폭기 시켜주면서 수행된 발효와 비슷한 생산량을 보인다는 점이다. 따라서 다시 강조하면 탄산무수화 효소 효소의 activity는 유지 되지만 숙신산을 생산하는 세포내의 이산화탄소 이용정도와 요구도 자체가 생산량을 좌우하는 것으로 풀이할 수 있다(표 1).
이를 통하여 탄산무수화 효소는 배양초기부터 공급해 주는 것이 좋을 것으로 판단되었으며 탄산무수화 효소의 공급 농도는 이미 gassing out method와 실제 생산균주 배양을 통하여 30 ppm이 가장 좋은 것으로 나타났기 때문에 탄산무수화 효소 효소를 공급해주는 배양형태에 탄산마그네슘을 추가적으로 공급해주는 실험을 수행하였다. 탄산마그네슘은 기존의 생산프로세스에서 가장 중요한 이산화탄소 공급원이었고 또한 생산균주의 관점에서 접근하여 보았을 때, 앞서 실험한 수행에서 나타난 바와 같이 초반의 이산화탄소 공급과 이산화탄소의 농도가 숙신산 생합성 대사과정에서 매우 중요한 요소로 판단되었기 때문이다. 배양은 역시 5리터 발효조로 실험을 수행하였고 탄산무수화 효소 공급 실험 자체가 탄산마그네슘을 줄이는 데에 그 목적이 있기 때문에 최대 30 g/L까지만 공급해 주었다. 배양결과, 10g/L의 탄산마그네슘을 공급해준 발효조에서 96.49 g/L로 숙신산 생산량이 가장 높은 것을 확인 할 수 있었다. 20, 30 g/L로 공급해준 조건의 발효조에서는 약 77g/L로 비슷한 수준의 숙신산을 생산하였다.
이와 같은 결과는 높아지는 마그네슘의 농도가 효소의 활성에 영향을 주었다고 판단되어진다. 탄산무수화 효소 자체가 아연이 결합되어 있는 금속효소이기 때문에 Zn2 +,Mn2 +, Ca2 +, Co2 +, Fe2 + 등의 2가 금속이온에 민감하다. 본래 금속이온이 효소에서 해리되었을 때 금속이온을 추가시켜 주면 그 활성이 회복되지만 반대로 과한 금속이온의 공급조건에서는 활성이 떨어진다고 판단되어지며 금속이온 자체가 효소의 기질특이성에 관계없이 촉매기능에만 역할을 나타내는 특성 때문에 활성에 영향을 주었다 볼 수 있다(표 1). 따라서 본 실험을 통하여 탄산마그네슘의 추가적인 공급은 활성에 영향을 주지 않는 10 g/L의 농도 수준이 적합하다고 판단되어 지며 최고 96.49 g/L의 숙신산을 생산할 수 있었다.
하기 표 1은 탄산무수화 효소의 첨가 시간과 첨가되는 농도에 따른 발효결과를 나타낸 표로써 최종 숙신산 농도와 소모된 글루코오스, 생산성 및 전체 수율을 나타낸다.
아래와 같은 조건으로 P 배지에 첨가 생산된 숙신산 양 (Pf, g/L) 소비된 기질의 양 (Sf, g/L) 비 생성 속도 (QP, g/L/hr) 전체 수율
(%, YO /T)
0시간에 탄산 무수화 효소 30ppm을 공급 70.04 76.64 1.46 49
12시간에 탄산 무수화 효소 30ppm을 공급 65.17 103.91 1.36 46
24시간에 탄산 무수화 효소 30ppm을 공급 35.35 103.5 0.73 25
탄산 무수화 효소 30ppm과 함께 탄산 마그네슘 10 g/L 첨가 96.49 80.95 2.3 68
탄산 무수화 효소 30ppm과 함께 탄산 마그네슘 20 g/L 첨가 77.22 87.47 1.84 54
탄산 무수화 효소 30ppm과 함께 탄산 마그네슘 30 g/L 첨가 77.18 83.31 1.84 54
위와 같은 사실을 확인하였으므로 최종적으로 발효조 배양을 통하여 비교실험을 수행하였다. 기존의 생산배지인 P medium에 이산화탄소 가스만 폭기 시킨 조건과 탄산무수화 효소를 공급했을 때, 10 g/L의 탄산마그네슘만 공급하였을 때, 탄산마그네슘과 탄산무수화 효소를 같이 공급해 주었을 때, Y medium(데이터 미제시)에 탄산무수화 효소와 탄산마그네슘을 같이 공급해주었을 때의 조건으로 확인 실험을 수행하였고 배양 결과, 10 g/L의 탄산마그네슘과 탄산무수화 효소를 같이 공급하여 주었을 때 약 97 g/L로 가장 높은 생산성을 보였으며 Y medium에 탄산마그네슘과 탄산무수화 효소를 공급하여 주었을 때는 75 g/L로 비교적 낮았다. 이는 Y medium에 높은 농도로 존재하는 효모추출물의 다양한 금속이온들 조효소 등이 탄산무수화 효소의 활성에 영향을 미치고 또한 고농도의 효모추출물이 균체의 성장저해 등으로 영향을 미친것들이 원인인 것으로 판단되며 실제로 숙신산 생산의 지연기가 상당히 긴 시간 유지되는 것을 확인 할 수 있다(도 7).
이번 확인 실험을 통하여, 탄산무수화 효소의 이산화탄소 공급 증가 효과를 확인 할 수 있었고 10g/L의 탄산마그네슘, 30 ppm의 탄산무수화 효소 공급 시 가장 최적의 상조상승효과를 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 최종 약 97 g/L의 생산량을 확인 할 수 있었으며 이론수율과 관찰수율을 비교해보면 전체수율이 68%로 상당히 높은 수준으로 유지되는 것을 확인 할 수 있다(표 2). 배지가격이 상당이 고가인 탄산마그네슘을 10분의 1로 줄이는 배양 프로세스의 개발로 생산단가를 큰 폭으로 절감시킬 수 있었다.
하기 표 2는 P medium에 가스형태의 이산화탄소만 폭기 시켜준 발효, P medium에 10 g/L의 탄산마그네슘과 이산화탄소 가스를 공급해준 발효, P medium에 30 pmm의 탄산무수화 효소와 가스를 공급해준 발효, P medium에 탄산마그네슘 10 g/L, 탄산무수화 효소 20 ppm과 이산화탄소 가스를 공급해준 발효, Y medium에 탄산마그네슘 10 g/L, 탄산무수화 효소 20 ppm과 이산화탄소 가스를 공급해준 발효 결과를 비교한 결과로써 최종 숙신산 농도와 소모된 글루코오스, 생산성 및 전체 수율을 나타낸다.
생산된 숙신산 양 (Pf, g/L) 소비된 기질의 양 (Sf, g/L) 비 생성 속도 (QP, g/L/hr) 전체 수율
(%, YO /T)
P 배지, 탄산 마그네슘 비공급 41.68 80.08 0.87 29
P 배지, 탄산 마그네슘 10 g/L 공급 45.68 75.29 0.95 32
P 배지, 탄산 무수화 효소 30 ppm 공급 76.3 77.95 1.59 53
P 배지, 탄산 마그네슘 10 g/L와 탄산 무수화 효소 30 ppm 동시 첨가 96.49 90 2.29 68
Y 배지, 탄산 마그네슘 10 g/L와 탄산 무수화 효소 30 ppm 동시 첨가 75.3 106.68 1.57 53
< 실험예 11: 유전자 재조합 발현 벡터 설계 및 개발>
11.1. 유전자 클로닝 (형질전환)
시아노박테리엄 시네초시스티스 sp. PCC 6803으로부터의 탄산무수화 효소 유전자를 운반하기 위한 숙주로 E. coli DH5α와 최종 형질전환을 위한 숙주로 피키아 파스토리스 X-33를 사용하여 유전자를 클로닝하였다. 남조류는 빛을 이용해 광합성하는 균주로 이산화탄소를 이용하는 균주로 알려져 있다. 그렇기 때문에 세포가 이용하지 못하는 이산화탄소를 중탄산이온(HCO3 -)으로 전환시키고 또한 세포 내에서 다시 세포가 이용하도록 이산화탄소로 전환시키는 가역적인 반응을 촉매하는 효소인 탄산무수화 효소 유전자를 염색체 내에 포함하고 있다. 따라서 본 발명에서는 남조류에서 유래된 베타(β) 그룹의 탄산무수화 효소를 얻으려 했으며, 형질전환 숙주로는 E. coli와 피키아 파스토리스를 선택한 이유로는 첫 번째로 E. coli는 배양이나 다루는 데 있어서 용이한 점이 있고 흔히 형질전환을 할 수 있도록 사용되는 균주다. 그리고 피키아 파스토리스 균주는 발현 균주로 사용했으며 세포외 분비를 하기 때문에 배양 후 상등액을 취해 다음 실험에 사용하면 되는 회수가 쉽다는 장점이 있으며, 염색체 내로 유전자가 삽입되기 때문에 불안정한 비삽입성 벡터(episomal vector)에 비해 훨씬 안정성이 높아 벡터가 사라질 수 있는 가능성을 배제 할 수 있다. 마지막으로 피키아 파스토리스 균주는 세포의 고밀도 배양이 가능하다고 알려져 있기 때문에, 표적 단백질의 생산에 많이 사용되어지고 있다. 우선 탄산무수화 효소 유전자를 얻기 위해 사이아노박테리엄의 염색체 DNA를 추출하는 실험을 수행하였다. 사이아노박테리엄의 염색체 DNA의 크기는 약 3,600 Kb로 알려져 있으며 실험 결과, 10kb 마커 보다 더 높은 위치에 band가 loading되는 것을 알 수 있었다(도 8). 따라서 염색체 DNA가 추출되었다고 판단하였고, 본 발명에서 얻고자하는 탄산무수화 효소 유전자만을 증폭시키기 위해 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 수행 전, 탄산무수화 효소 유전자의 서열(GenBank: U45962.1 ,도 9)에 상보적인 20~30 mer의 짧은 올리고뉴클레오타이드를 마크로젠사에 제작 의뢰하여 사용하였다. 프라이머(primer) 제작을 위해 shuttle 벡터인 pGEM T-벡터와 발현 벡터인 pPICZα B 벡터의 제한효소자리(multiple cloning site, MCS)를 확인하여 적합한 제한효소를 선택하였고, DNA 염기배열인 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)가 올바른 방향으로 정확하게 들어갔는지 확인할 수 있도록 forward primer와 reverse primer의 제한효소를 다르게 해주었다: forward primer - aagagaggctgaagctgcaggaatgcaaagactcatcgagggac(제한효소 : pstI); reverse primer - gagtttttgttctagaaaacgggagcctcgataaatgcgctc(제한효소 : XbaI).
따라서 준비된 샘플들로 중합 효소 연쇄 반응을 수행하였으며, 탄산무수화 효소 유전자의 크기인 825bp에 상응하는 밴드가 확인되는 것을 볼 수 있었다(도 10). 사이아노박테리엄에서 유래한 탄산무수화 효소를 1차적으로 E. coli를 숙주로 사용하여 pGEM T-벡터에 형질전환하였고, 앰피실린 저항성 유전자를 포함하고 있는 벡터의 특성에 따라 앰피실린을 통해 약 103개의 세포 중 10개의 세포를 선별하여 정상적으로 삽입된 콜로니를 확인하는 과정을 수행하였다. 확인 후, 콜로니의 서열 확인 과정을 마크로젠사에 의뢰하여 NCBI 웹 사이트의 Blast X를 통해 100 % 일치하는 것을 확인하였다(도 11). 따라서 형질전환체를 회수해 MCS 중 삽입된 탄산무수화 효소에 영향이 미치지 않는 MCS를 선정해 선형화(linearization)가 되도록 하였고, 염색체 통합 벡터인 pPICZα B 벡터에 삽입되도록 하였다. 최종적으로 피키아 파스토리스 염색체로 벡터 전체가 삽입되도록 전기영동을 통해 실험을 수행하고 지오신 저항성 유전자를 포함하고 있는 벡터의 특성에 따라 지오신이 포함된 선별 고체배지에서 약 103개의 세포 중 11개의 세포를 선별하였다(도 12).
이 중 서열 확인 과정 및 오픈 리딩 프레임 방향 등 올바르게 클로닝이 되었는지 확인하여 #4 균주가 선별되었다. #4 균주를 PCA4 균주라 명명하였고 플라스크 배양을 통해 메탄올로 인덕션한 후, 배양액 일부를 취해 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 중합 효소 연쇄 반응을 통해 원하는 유전자가 삽입 및 발현 여부를 확인하였다. 실험 결과, 탄산무수화 효소 유전자 825 bp를 포함한 피키아 파스토리스 염색체내로 삽입된 벡터의 MCS를 나타내는 1476 bp에 상응하는 밴드가 나타나는 것을 확인할 수 있었으며(도 13), 이에 연속적인 계대가 가능하고 지속적인 계대에도 불구하고 형질이 변하지 않는 세포주를 개발하였다.
11.2. 피키아 파스토리스에서 발현
유전적 확인 과정을 마친 PCA4 균주를 이용해 탄산무수화 효소를 메탄올로 인덕션시 발현이 되는지 확인하기 위해 야생 균주와의 비교 실험을 수행하였다. 배양 과정은 4단계로 나뉘어지며, 첫 번째로는 글리세롤을 탄소원으로 사용한 회분식 배양 단계가 되겠다. 이 단계는 인덕션을 위해 균체의 성장을 증대시키는 배양이며 바이오매스가 빠르게 생성되는 단계이다. 또한 글리세롤의 농도의 결정은 standard protocols에서 제시한 40 g/L를 사용했는데, 이는 고 농도의 글리세롤은 균주의 성장을 저해시키기 때문이다. 초기 글리세롤을 모두 소비하고 용존 산소의 농도가 100%로 감소했을 때, 추가적으로 글리세롤을 공급하는 두 번째 단계를 수행하였다. 초기 회분식 배양 중에는 세포가 알코올 옥시다아제(alcohol oxidase, AOX)를 생산하지 않기 때문에, 세포가 알코올 옥시다아제에 중독되는 것을 막기 위해 초기 메탄올의 공급 속도는 매우 낮아야 한다. 그러므로 짧게 글리세롤을 연속적으로 공급하거나 기하급수적인 유가식 공급 단계가 필요하며 이는 AOX1 프로모터가 활성되도록 해주며 초기 메탄올 공급 속도를 고농도로 할 수 있도록 해준다. 그러나 글리세롤을 짧은시간에 공급해주는 것은 잔여 글리세롤 농도가 낮음에 따라 비성장속도를 감소시키는 결과를 가져다주기 때문에 부적합하다. 반대로 기하급수적인 유가식 공급을 할 때에는, 비성장속도가 유지되고 고 농도의 바이오매스 생산성을 나타낸다고 보고되어져 있기 때문에 본 발명에서는 기하급수적인 유가식 배양을 수행해주었다. 세 번째 단계로 탄산무수화 효소를 발현시키기 위한 인덕션 단계로, AOX1 프로모터를 활성화시키기 위해 메탄올을 공급해주었다. 이 단계는 알코올 옥시다아제의 활성이 낮고 메탄올을 쉽게 축적시키기 때문에 메탄올에 의한 인덕션의 시작이 중요한 단계이며, 알코올 옥시다아제의 활성이 급격하게 증가함으로써 산소 소비 속도가 제한된다. 피키아 파스토리스 균주는 메탄올의 농도가 고농도로 축적되는 것에 민감하고 메탄올의 축적에 의해 알코올 옥시다아제의 활성이 감소하는 특성이 있다. 그러므로 메탄올의 농도를 인덕션시 매우 조심스럽게 조절해주어야 한다. 초반에는 1.4 ml/h/L의 속도로 3~4시간동안 균주를 메탄올에 적응시켰고 비성장속도 μ에 따라 점차적으로 증가시키며 메탄올을 공급하고 메탄올의 최대 속도가 8 ml/h/L가 넘지 않도록 조절해주었다. 본 발명에서는 약 7.2 ml/h/L를 최대 공급 속도로 해주었고, 이후로는 배양이 끝날 때까지 공급 속도를 유지해주었다. 이렇게 메탄올의 공급 속도를 변함없이 첨가해주는 단계가 마지막 단계가 되겠다. 본 발명에서는 배양 후 24시간이 지났을 때, 글리세롤을 공급하는 유가식 배양을 수행하였고 최대 교반 속도는 300(RPM)으로 증가시켜 주었다. 글리세롤의 공급을 마친 뒤, 메탄올로 인덕션 하기 전에 히스티딘의 제한을 받지 않도록 3.5 %의 히스티딘을 5ml씩 첨가해주었는데, 이는 피키아 파스토리스 균주가 히스티딘 영양요구주이기 때문이다. 그 후에는 인덕션을 위해 메탄올을 점진적으로 공급해주어 탄산무수화 효소의 발현을 유도하였고, 이 모든 과정은 야생균주와 PCA4 균주에게 동일하게 적용되었다. 결과적으로 세포의 균체량을 나타내는 건조중량을 비교해보면 약 40 g/L의 질량을 나타내는 야생균주에 비해 약 1.4배 높은 55 g/L의 농도를 보였고, 또한 세포 성장을 나타내는 광밀도값(optical density)에서도 1.04배 높은 값을 나타내는 것을 알 수 있었다(도 14, 15). 따라서 PCA4 균주가 탄산무수화 효소를 안정적으로 발현시키는 것 뿐만 아니라 고 농도의 세포 성장 속도를 보이는 것 또한 확인할 수 있었다. 본 발명에서는 탄산무수화 효소를 발현하는지 확인하기 위해서 UF membrane을 통해 5배 농축하고, 히스티딘 태그가 붙은 벡터의 특성상 히스티딘과 붙는 니켈 수지가 포함된 컬럼을 이용해 분리 정제를 수행하였다. 이로 인해 얻어진 샘플을 이용해 탄산무수화 효소의 활성 여부를 확인하고자 활성 측정 실험을 수행하였다. 파라-나이트로페닐아세테이트(p-nitrophenylacetate)가 탄산무수화 효소가 첨가됨에 따라 5분간 발색되는 정도를 파장 348nm에서 흡광분석기를 통해 측정하는 방법을 통해 수행하였고, 수행 결과, 기준 물질인 시그마 알드리치 코리아사에서 구매한 소에서 유래한 탄산무수화 효소는 224.56 units/mg의 활성을 나타냈고, 정제된 샘플에 존재하는 탄산무수화 효소는 276.54 units/mg의 활성으로 상업용 탄산무수화 효소보다도 1.23배 더 높은 활성을 보였다(표 3).
하기 표 3은 본 발명에서 유전자 조작을 통해 개발한 탄산무수화 효소와 상업적으로 판매하는 소의 적혈구에서 유래한 탄산무수화 효소의 활성을 PNPA 방법으로 측정하여 비교한 결과를 나타내었다.
탄산 무수화 효소의 종류 효소 활성 ( units / mg )
1 소 적혈구에서 유래한 상업성의 탄산 무수화 효소 (시그마 알드리치 코리아, C2624) 224.56
2 시아노박테리아에서 유래한 중합효소 사슬 반응을 통해 클로닝된 탄산 무수화 효소 276.54
4). 유전자 클로닝으로부터 얻어진 탄산무수화 효소가 숙신산 생산성 증대에 미치는 영향
활성 측정을 통해 탄산무수화 효소의 발현 여부를 확인하였기 때문에, 정제하여 얻어진 효소를 공급했을 때 탄산마그네슘을 10 g/L로 첨가했을 때와 첨가하지 않았을 때의 비교 배양과 상업용 효소를 공급하고 탄산마그네슘을 10 g/L로 첨가했을 때, 마지막으로 효소를 공급하지 않고 탄산마그네슘만을 10 g/L 첨가해준 배양까지 총 4가지 배양을 수행하여 탄산무수화 효소가 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)를 이용한 숙신산 생산성을 증대시키는 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 모든 배양 조건은 숙신산 생산 배양과 동일한 조건으로 수행하였다. 숙신산 생산성을 배양 별로 비교해보면, 첫 째로 유전자 클로닝 및 형질 전환을 통해 얻어진 탄산무수화 효소가 탄산마그네슘의 첨가 여부에 따른 synergistic effect를 확인하기 위한 비교 배양으로, 탄산마그네슘이 첨가 된 배양에서 첨가하지 않은 배양보다 1.6배 높은 숙신산 생산성을 보였다(도 16). 이는 가스 형태의 이산화탄소에서 녹아들어오는 용존 이산화탄소와 탄산마그네슘을 탄산무수화 효소가 촉매 역할을 하여 세포가 이용할 수 있는 중탄산 이온의 양을 증가시키기 때문이며 숙신산 생산성 뿐만 아니라 탄소원인 글루코오스의 소비량이나 수율 면에서도 확연하게 높은 것을 알 수 있었다. 두 번째 비교 배양으로는 상업용 효소와 유전자 재조합을 통해 얻어진 효소를 비교하는 실험으로, 본 발명에서 개발한 탄산무수화 효소가 상업적으로 판매되는 소에서 유래한 탄산무수화 효소와 동일한 활성과 역할 및 기능을 하는지 확인하고자 하였다. 따라서 효소를 첨가하지 않고 탄산마그네슘만 10 g/L 공급한 배양을 control 배양으로 두었고 탄산마그네슘을 공급하고 각 각의 효소를 첨가한 비교 배양을 수행하였다. 최종적으로 유전자 재조합을 통한 효소를 이용한 배양의 숙신산 생산성은 약 82.5 g/L이며 상업용 효소를 사용한 배양은 약 82.7 g/L로 숙신산의 생산성이 동일하게 나타나는 것을 볼 수 있었다(도 16, 표 4). 이를 토대로 상업용 탄산무수화 효소와 비교해 볼 때 본 발명에서 개발한 탄산무수화 효소가 동일한 기능을 하며 활성을 띤다고 판단할 수 있었다. 일반적인 탄산무수화 효소는 인간이나 동물에서 유래되고 경제적인 부분에 있어서 경쟁적이지 않기 때문에 탄산무수화 효소 유전자를 지니고 있는 남조류를 통해 유전자를 클로닝 및 형질전환을 하였고 최종적으로 발현을 통해 활성을 띠고 제 기능을 하는 것을 확인하였다. 따라서 생산 배양을 위한 배지 성분으로 고 농도로 공급되던 탄산마그네슘의 양을 줄이고 경제적인 탄산무수화 효소를 첨가하여 이산화탄소 공급 속도를 증가시킬 수 있게 되었다. 이는 배양 결과를 통해 증명되었음을 확인하였고, 숙신산을 생산하기 위한 생산 배지의 비용을 절감하고 탄산마그네슘의 양을 줄여 회수 과정을 더욱 용이하게 해줄 수 있는 이점을 갖게 되었다.
하기 표 4는 유전자 재조합에 의해 개발된 효소와 기존 효소의 비교 배양 한 후, 전반적인 배양 파라미터를 정리해놓은 도표로서, 첫 번째 배양은 P media에서 탄산 마그네슘을 10 g/L로 고정하고 탄산무수화 효소 30 ppm을 첨가하였고, 두 번째 배양은 탄산 마그네슘을 첨가하지 않고 동일한 농도의 효소를 첨가하였다. 세 번째는 효소를 첨가하지 않고 탄산 마그네슘만을 10 g/L 공급한 배양이며, 마지막으로 소에서 유래한 탄산무수화 효소와 탄산 마그네슘을 공급한 배양으로 네 종류의 배양에 공급한 효소 활성과 숙신산 생산성, 소비된 당 농도, 비생성 속도, 수율을 나타내었다.
배지 효소 활성 (units/mg) 생산된 숙신산 양 (Pf, g/L) 소비된 기질의 양 (Sf, g/L) 비 생성 속도 (QP, g/L/hr) 전체 수율
(%, YO /T)
형질전환체에 의해 생산된 탄산 무수화 효소 30 ppm과 탄산 마그네슘 10 g/L를 포함한 P 배지 276.54 82.53 90.65 1.72 58
형질전환체에 의해 생성된 탄산 무수화 효소 30 ppm만을 첨가된 P 배지 (탄산 마그네슘 무첨가) 276.54 50.97 72.29 1.06 36
탄산 마그네슘 10 g/L만 첨가된 P 배지 (탄산 무수화 효소 무첨가) - 23.68 32.53 0.48 17
소에서 유래된 탄산 무수화 효소 30ppm과 탄산 마그네슘 10 g/L를 첨가한 P 배지 224.56 82.73 91.25 1.72 58
상기 실험 결과를 통해서, 탄산무수화 효소는 이산화탄소 가스에서 중탄산염과 탄산이온으로의 반응을 촉매 하는 해당 반응의 전환속도를 높여주어 원활한 숙신산을 생산되게 하였으며, 다양한 탄산무수화 효소 공급의 농도 및 배양 조건을 연구한 결과 탄산마그네슘 10 g/L와 탄산무수화 효소 30 ppm 그리고 이산화탄소 가스를 복합 공급하여 주었을 때, 약 97 g/L로 높은 수준의 숙신산의 생산량을 얻을 수 있었다. 또한 탄산무수화 효소를 효모 종류인 피키아 파스토리스에 형질전환하여 발현시킨 후 미생물에서 직접 생산된 탄산무수화 효소를 첨가하여 같은 발효공정을 수행하였을 때, 82 g/L의 숙신산 생산량을 확인하였고 이는 기존의 생물공정에서 얻어낸 숙신산 값과 동일하거나 더 우수하다.

Claims (11)

  1. 탄산무수화 효소가 포함된 숙신산 고생산성 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogen) 배양용 배지.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 배양은 포도당, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 및 탄산마그네슘(MgCO3)을 포함하는 액체 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 숙신산 고생산성 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogen) 배양용 배지.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 배지는 포도당 100 내지 110 g/ℓ, 효모 추출물 10 내지 25 g/ℓ, 옥수수 침지액 15 내지 35 g/L, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 7 내지 12 g/ℓ 및 탄산마그네슘(MgCO3) 0 내지 10 g/ℓ를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙신산 고생산성 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogen) 배양용 배지.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 배지는 탄산무수화 효소 10 내지 50 mg/L를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙신산 고생산성 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogen) 배양용 배지.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 탄산무수화 효소는 소와 인간에서 유래된 알파 (α) 그룹 또는 남조류에서 유래된 베타 (β) 그룹의 탄산무수화 효소인 것을 특징으로 하는 숙신산 고생산성 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogen) 배양용 배지.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 탄산무수화 효소는 남조류에서 유래된 베타 (β) 그룹의 탄산무수화 효소인 것을 특징으로 하는 숙신산 고생산성 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogen) 배양용 배지.
  7. i) 탄산무수화 효소 10 내지 50 mg/L를 포함하는 배지에서 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogen)를 배양하는 단계;
    ii) 상기 배양액으로부터 숙신산을 수득하는 단계를 포함하는 숙신산의 생산 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 배양은 포도당, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 및 탄산마그네슘(MgCO3)을 포함하는 액체 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 숙신산의 생산 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 배지는 포도당 100 내지 110 g/ℓ, 효모 추출물 10 내지 25 g/ℓ, 옥수수 침지액 15 내지 35 g/L, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 7 내지 12 g/ℓ 및 탄산마그네슘(MgCO3) 0 내지 10 g/ℓ를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙신산의 생산 방법.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 탄산무수화 효소는 소와 인간에서 유래된 알파 (α) 그룹 또는 남조류에서 유래된 베타 (β) 그룹의 탄산무수화 효소인 것을 특징으로 하는 숙신산의 생산 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 탄산무수화 효소는 남조류에서 유래된 베타 (β) 그룹의 탄산무수화 효소인 것을 특징으로 하는 숙신산의 생산 방법.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020005200A (ko) 2000-06-23 2002-01-17 윤덕용 목질계 당화액을 이용한 숙신산의 생산방법
KR20120113146A (ko) * 2011-04-04 2012-10-12 한국생산기술연구원 숙신산 고생산성 변이 균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조 방법

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