DE69008052T2

DE69008052T2 - Verfahren zur Herstellung von Isepamicin.

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Publication number: DE69008052T2
Application number: DE69008052T
Authority: DE
Inventors: John Sze-Hung Parsippany New Jersey 07054 Chiu; Cesar Rahway New Jersey 07065 Colon; Michael D. Paterson New Jersey 07513 Green; Chou-Hong Berkeley Heights New Jersey 07922 Tann; Tiruvettipuram Kannappan Edison New Jersey 08820 Thiruvengadam
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1989-06-21
Filing date: 1990-06-19
Publication date: 1994-07-28
Anticipated expiration: 2010-06-20
Also published as: HK185096A; CA2062788C; EP0478707A1; NO915071D0; DK0405820T3; FI96955B; DE69030590D1; ES2063274T3; FI915953A0; NO177349B; DE69030590T2; RU2120444C1; KR940003496B1; JPH04502474A; JPH0692433B2; AU629960B2; JP2500059B2; NO177349C; EP0405820A2; ATE152094T1

Description

Diese Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum Umwandeln von Gentamicin B in Isepamicin, 1-N-[ (S) 3-Amino-2-hydroxypropionyl] gentamicin 3 und ein neues Formylierungsmittel, 2-Formylmercaptobenzothiazol, das in diesem Verfahren nützlich ist.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Umwandeln von Gentamicin B in 3,6'-Di-N-formylgentamicin B unter Verwendung von 2-Formylmercaptobenzothiazol, Acylierung der 1- Aminogruppe mit einem (S)-Isoserinderivat, gefolgt von Entfernung der Schutzgruppen unter Bedingungen, die hohe Ausbeuten des erwünschten Produktes ergeben.
Isepamicin, welches die Formel
aufweist, ist ein bekanntes Aminoglycosid-Antibiotika. Die Herstellung dieser Verbindung aus Gentamicin B ist im U.S Patent Nr. 4,230,847 beschrieben. Das in dem Patent beschriebene Verfahren umfaßt Bilden von 3,6'-Di-N-benzyloxycarbonylgentamicin B durch Umsetzen eines Kupfer-(II)-Nickel-(II)- Salzkomplexes von Gentamicin B mit N-Benzyloxycarbonyloxyphthalimid und dann Umsetzen der Zwischenverbindung mit N-(S-3-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxypropionyloxy) succinimid. Die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppen wurden von dem entstandenen Stoff durch katalytische Hydrierung über Palladium-auf-Kohle entfernt, um Isepamicin in 60 %iger Ausbeute, bezogen auf die Zwischen-Startverbindung, herzustellen.
Tsuchiya et al., Tetrahedron Letters No. 51, S. 4951-4954 (1979) beschreiben ein komplexes mehrstufiges Verfahren für das Schützen von der 3,3,"-6'-Aminogruppen in Kanamycin A umfassend Zinkacetatchelatierung, 3,6'-N-Bisbenzyloxycarbonylierung, Zinkentfernung, Carbonatbildung und schließlich Trifluoracetylierung der 3"-Aminogruppe. Das so hergestellte 3,3"1,6'-N- dreifach geschützte Kanamycin A wird dann an der freien C-1 Aminogruppe unter Verwendung eines aktiven Esters von 1-N-[(S)- 4-Benzyloxycarbonylamino]-2-hydroxybuttersäure acyliert. Schließlich wird das erhaltene Produkt einem zweistufigen Enschützungsschema unterworfen, um Amikacin zu ergeben. Eine ähnliche Sequenz ist ebenso für die Umwandlung von Dibekacin in sein 1-N-[ (S)-4-Amino-2-hydroxybutyrylderivat beschrieben. Es war kein Hinweis auf die Verwendung dieses Verfahrens für die selektive Acylierung von anderen Aminoglycosiden offenbart. Die Verfahrensequenz von Tsuchiya et al. ist beschwerlich, da sie beides, Trifluoracetylierung und Benzyloxycarbonylierung in den Schutzschritten umfaßt und beides, Aminolyse und Hydrogenolyse in den Entschützungsschritten benötigt. Diese Schritte machen das Verfahren wirtschaftlich unattraktiv, sowohl im Hinblick auf Betriebskosten als auch auf Kapitalanforderungen für die Ausführung. Außerdem führte bei uns im Gegensatz zu den Folgerungen in der Tsuchiya et al. Verfahrensbeschreibung Zinkacetatchelatierung nicht beständig zu selektiver 3,6'- Diblockierung in anderen Aminoglycosiden als Kanamycin und Dibekacin. Unerwarteterweise führt die Zinkacetatchelatierung von Gentamicin B, gefolgt von Acylierung mit Formylimidazol primär zu 1,6'-N- Diformylierung und nicht zu 3,6'-Diformylierung. Gleichfalls gibt die Acylierung des gleichen Gentamicin B Zinkacetatchelates mit einem unterschiedlichen Formylierungsagens, gemischtem Ameisensäure-Essigsäureanhydrid ein Ansteigen von unerwünschten Mengen von acetylierten Gentamicin B Produkten, zusätzlich zu dem erwünschten 3,6'-N-Diformyl-gentamicin B. Um die Schwierigkeit der Voraussage zu unterstreichen, zeigte sich das Ameisensäure p-nitrobenzoesäuregemischtes Anhydrid als unzureichend reaktiv, um in der Formylierung von Gentamicin B Zinkacetatchelat nützlich zu sein, wohingegen die Verwendung von gemischtem Ameisensäure-p-Anissäureanhydrid ausgezeichnete Ausbeuten des erwünschten 3,6'-Diformyl-gentamicin B lieferte, das mit kleineren Mengen von Anisoyl- Verunreinigungen kontaminiert war.
Die Verwendung von Metallacetaten, z. B. Zinkacetat und dergl., ruft kleine Mengen von unerwünschten Nebenprodukten, z. B. N- Acetylderivaten, hervor, welche schwierig zu entfernen sind und die Ausbeute an erwünschtem Produkt verringern.
FR-A-2 441 631 beschreibt Verfahren für die Herstellung von selektiv acylierten N-geschützten Derivaten von Aminoglycosid- Antibiotika umfassend die Synthese von Isepamycin mit Hilfe der Acylierung von 3,6'-geschütztem Gentamicin B Zwischenprodukten und ein Verfahren für die Herstellung von 3,6'-Di-N-fomyl- Kanamycin A.
Die Formylierung von Aminoglycosiden ist vorher von Thomas et al, Tetrahedron Letters, Vol. 21 S 4981-4984 (1980) im Zusammenhang mit der Herstellung von 1-N-alkvlierten Kanamycinantibiotika beschrieben worden. Thomas et al lehren jedoch nicht den Wert der Formylierung als eine Aminschutzgruppe bei der Herstellung von 1-N-acylierten Aminoglycosiden. Dieser Punkt wird auch nicht in irgendeiner anderen Aminoglycosid-Literatur erkannt. Stattdessen beschreibt die Literatur die Verwendung von Gruppen wie z. B. Trifluoracetyl, Trichloracetyl und Phthaloyl für den Schutz von Aminogruppen und lehrt, daß die Aminolyse oder Hydrazinolyse solcher Gruppen ohne wesentliches Beeinträchtigen bestimmter anderer N-Acylgruppen, die in dem Molekül vorhanden sein können, durchgeführt werden kann. Kurz gesagt, die selektive wäßrige basische Hydrolyse von Formylgruppen aus 3,6'N-formylierten-1-N-acylierten Aminoglycosiden ist noch nie da gewesen.
Wir haben nun gefunden, daß ein neues Formylierungsmittel 2- Formylmercaptobenzothiazol der Formel II
die 3,6'-Aminogruppen des Gentamicin B Zinkchelats selektiv formylieren kann. Darüberhinaus gibt das Verfahren dieser Erfindung eine hohe Ausbeute, falls man ein anderes Zinksalz, wie z. B. Zinkpivaloat, verwendet, um die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten zu vermeiden. Darüberhinaus haben wir gefunden, daß ein durch Entfernen des Zinks aus dem Chelat erhaltenes 3,6'-N-Diformyl-gentamicin B mit aktiven Estern von N-Formyl-(S)-isoserin selektiv nur an der C-1 Aminogruppe, ohne getrenntes Schützen der C-3" Methylaminogruppe wie in dem Tsuchiya et al. Verfahren acyliert werden kann. Schließlich haben wir gefunden, daß alle Formylgruppen aus dem erhaltenen 3,6'-N-Diformyl-1-N-[N-formyl-(S)-isoserinoyl]-gentamicin B durch wäßrige basische Hydrolyse in hoher Ausbeute ohne Entfernen der erwünschten Isoserinseitenkette entfernt werden kann.
Diese Erfindung betrifft ein verbessertes Mehrstufenverfahren zur Umwandlung von Gentamicin B in Isepamicin in hohen Ausbeuten.
Das Verfahren dieser Erfindung umfaßt
(a) die Umsetzung von Gentamicin B mit einem chelatierenden Agens und dann mit 2-Formylmercaptobenzothiazol, das befähigt ist, Formyl-Schutzgruppen in Gentamicin B einzuführen, um Gruppen des 3,6'-Di-N-Formylgenamicin B zu bilden;
(b) die Acylierung der 1-Amino-Gruppe des 3,6'-Di-N- Formylgentamicins B mit einer aktivierten N-acyl geschützen
(S) -Isoserin-Verbindung;
(c) die Entfernung sämtlicher Schutzgruppen; und
(d) die Isolierung von Isepamicin.
Die Zwischenverbindung 3,6'-Di-N-formylgentamicin B wird durch Umsetzen eines bivalenten Metallsalzkomplexes von Gentamicin B mit 2-Formylmercaptobenzothiazol zum Einführen der Formylschutzgruppen an den 3,6'-Positionen hergestellt. Der Metallsalzkomplex wird unter Verwendung der im U.S. Patent Nr. 4 136 254 und Thomas, et al., Tetrahedron Letters, Vol. 21, S. 4981-4984 (1980) beschriebenen Verfahren hergestellt.
Das Reaktionsschema zum Herstellen von 3,6'Di-N-formylgentamicin B (III) ist nachfolgend dargestellt:
Übergangsmetallsalze, die als Komplexmittel in dem Verfahren dieser Erfindung nützlich sind, umfassen solche divalenten Salze wie Kupfer(II), Nickel(II), Kobalt(II), Cadmium(II) und Zink(II), als auch Mischungen derselben. Die divalenten Metallsalze sind Salze von organischen Säuren, vorzugsweise organischen Säuren wie Ameisen-, Essig-, Propion-, Pivalin- und Benzoesäure. Bevorzugte divalente Metallsalze umfassen Pivaloatsalze von zink(II) und Kobalt(II). Von besonderem Nutzen ist Zink(II)pivaloat.
Die Bildung des divalenten Salzkomplexes von Gentamicin B wird in einem inerten organischen Lösungsmittel durchgeführt. Bevorzugte organische Lösungsmittel sind z. B. Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Methylenchlorid, Toluol, Ethylacetat und Mischungen derselben.
Beim Herstellen des divalenten Salzkomplexes von Gentamicin B hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, ungefähr 1,5 bis 4,5 Mol des divalenten Salzes, z. B. Zink(II), pro Mol Gentamicin B einzusetzen. Das bevorzugte Molverhältnis der Reagenzien beträgt ungefähr 2,7-3,5 Mol des divalenten Salzes pro Mol Gentamicin B.
Der divalente Salzkomplex von Gentamicin B wird mit 2- Formylmercaptobenzothiazol, welches eine Formylschutzgruppe an beiden, der 3- und der 6'-Aminogruppe einführt, umgesetzt.
Die molare Menge des 2-Formylmercaptobenzothiazols beträgt gewöhnlich 2-3 zu 1 der molaren Menge des divalenten Salzkomplexes von Gentamicin B. Die bevorzugte molare Menge ist 2,5 zu 1.
Formylierung des divalenten Salzkomplexes von Gentamicin B wird bei einer Temperatur von 0 ºC bis 40 ºC, vorzugsweise von 20 ºC bis 30 ºC, ausgeführt.
Die Formylierungsreaktion des divalenten Salzkomplexes von Gentamicin B wird geeigneterweise in einem organischen Lösungsmittel oder einer Mischung von organischen Lösungsmitteln ausgeführt. Organische Lösungsmittel, die in dieser Reaktion verwendet werden können, umfassen dipolare aprotische organische Lösungsmittel, z. B. Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid und dergl. Es hat sich auch als vorteilhaft herausgestellt, Mischungen eines dipolaren aprotischen organischen Lösungsmittels mit einem inerten organischen Lösungsmittel, z. B. Toluol, Ethylacetat, 1,2-Dimethoxyethan, Tetrahydrofuran, Acetonitril, Methylenchlorid und dergl. einzusetzen. Eine bevorzugte Mischung von Lösungsmitteln ist Dimethylsufoxid mit entweder Nethylenchlorid oder Ethylacetat.
Während alle früheren Verfahren die Verwendung eines Präzipitierungsmittel oder ein Verfahren zum Entfernen des divalenten Metallsalzkations benötigen, erlaubt die Verwendung von 2-Formylmercaptobenzothiazol und Zink ein extraktives Entfernen des Zink-2-Mercaptobenzothiazolsalzes in der organischen Lösungsmittelschicht.
Die wäßrige Lösung umfaßt 3,6'-Di-N-formylgentamicin B in einer Ausbeute von ungefähr 90-95 %. Das Produkt kann durch konventionelle Verfahren wie z. B. Ionenaustauschchromatographie isoliert und gereinigt werden.
Einführung der (S)-Isoserinseitenkette an der 1-Aminogruppe von 3,6'-Di-N-formylgentamicin B wird mittels in-situ aktiver Esterbildung des N-geschützten-(S)-isoserins mit einem Aktivierungsreagens in Anwesenheit von Dicyclohexylcarbodiimid gemäß dem nachfolgenden Reaktionsschema durchgeführt:
N-geschützte-(S)-Isoserinverbindungen, die für das Verfahren dieser Erfindung nützlich sind, sind solche, in denen die Aminogruppe des (S)-Isoserins mit einer Acylgruppe geschützt ist, die leicht unter Bedingungen, unter welchen Formylschutzgruppen entfernt werden, entfernt werden kann und die andere Teile des Moleküls nicht beeinflußt. Acylschutzgruppen, die leicht unter milden basischen Bedingungen oder mit Hydrazin entfernt werden können, werden in dem Verfahren verwendet Beispiele von N-Acylschutzgruppen, die leicht unter milden basischen Bedingungen entfernt werden können, umfassen Formyl, Trichloracetyl und Trifluoracetyl. Beispiele von N-Acylschutzgruppen, die leicht durch Hydrazin entfernt werden können, umfassen Phthaloyl und Succinoyl. Die bevorzugte N-Acylschutzgruppe für die Isoserinverbindung ist die Formylgruppe.
N-geschützte Isoserinverbindungen, die in dem Verfahren dieser Erfindung nützlich sind, umfassen N-Formyl-(S)-isoserin, N- Phthaloyl-(S)-isoserin, N-Trichloracetyl-(S)-isoserin und N- Trifluoroacetyl-(S)-isoserin. Die bevorzugte N-geschützte Isoserinverbindung ist N-Formyl-(S)-isoserin.
Aktive Ester von N-geschütztem (S)-Isoserin werden durch Umsetzen der Isoserinverbindungen mit einer Verbindung wie z. B. N-Hydroxybenzotriazol, N-Hydroxysuccinimid, Imidazol, N- Hydroxyphthalimid, N-Hydroxy-5-norbornen-2, 3-dicarboximid und dergl. in Gegenwart eines Kupplungsmittels wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt.
Die Reaktion von N-geschütztem (S)-Isoserin mit 3,6'-Di-N- formylgentamicin B wird bei Temperaturen zwischen 0 ºc und 40 ºC, vorzugsweise bei ungefähr Raumtemperatur, in einem Lösungsmittel durchgeführt. Beispiele von Lösungsmitteln, die in dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen protische organische Lösungsmittel z. B. Alkohole, wie z. B. Methanol, Ethanol, Propanol und dergl; Mischungen von Wasser und Alkohol, wie z. B. wäßriges Methanol, wäßriges Ethanol und dergl.; aprotische Lösungsmittel, wie z. B. Dimethylformamid, Dioxan, Methylenchlorid. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist wäßriges Methanol.
Die durch Umsetzen von N-Formylisoserin mit 3,6'-Di-N- formylgenatmicin B erhaltene Verbindunng ist Triformylisepamicin, Verbindung IV.
Die Schutzgruppen werden von der Verbindung IV durch Hydrolyse gemäß dem folgenden Reaktionsschema entfernt.
Vor dem Entschützen von Verbindung IV wird das Lösungsmittel aus der Reaktionsmischung entfernt. Obgleich Entschützen durch Hydrolyse ein konventionelles Verfahren ist, ist die Spezifität der Formylgruppenentfernung ohne Entfernung der Isoserinseitenkette im Gebiet der Aminoglycoside beispiellos. Es ist gefunden worden, daß wenn die Hydrolysereaktion durch Rühren über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt wird, eine ausgezeichnete Ausbeute (88-90 %) des erwünschten Produktes erhalten wird. Das sich ergebende Hydrolysat wird auf pH 6 mit Säure angesäuert und Isepamicin wird durch Isolierung erhalten.
Die folgenden Beispiele stellen einen bevorzugten Weg der Ausführung unserer Erfindung dar, sind aber nicht als Begrenzung des Umfangs derselben gedacht.
In den Beispielen bedeutet HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; Amberlite IRC-50 ist ein schwaches Kationenionenaustauscherharz, erhältlich von Rohm und Haas Company.

Beispiel 1

Herstellung von 2-Formylmercaptobenzothiazol

In einen 500 ml Dreihalsrundkolben wurden 80 ml Acetonitril, 5,0 ml (0,133 mol) Ameisensäure und 18,1 g (0,266 mol) Natriumformiat gegeben. Die erhaltene Suspension wurde auf 0-5 ºC gekühlt und 14,6 ml (0,2 mol) Acetylchlorid wurden unter Halten der Temperatur der Reaktionsmischung auf unter 8 ºC langsam zugegeben. Nach Vervollständigung der Zugabe von Acetylchlorid wurde die Reaktionsmischung auf 18-20 ºC aufwärmen gelassen. Die Vollständigkeit der Reaktion wurde durch ¹H-NMR beurteilt. Zu der heterogenen Essigsäure-Ameisensäureanhydrid enthaltenden Mischung wurden 60 ml Acetonitril, gefolgt von 20 g (0,103 mol) 2-Mercaptobenzothiazol hinzugefügt, und die Reaktionsmischung wurde auf 32 ºC aufwärmen gelassen und bei der Temperatur gehalten, wobei der Fortschritt der Reaktion durch HPLC in 10-minütigen Intervallen beobachtet wurde. Die Reaktion wurde als vollständig erachtet, wenn ungefähr 4 % des 2- Mercaptobenzothiazols (in Flächen-%) unumgesetzt verblieben oder wenn seine Flächen-% aufgrund Zersetzung des Produktes zu steigen begann.
Die Reaktionsmischung wurde dann durch 200 ml Eiswasser gequenscht und 2 min gerührt. Das ausgefallene Produkt wurde abfiltiriert, ausgiebig mit Wasser (4 x 150 ml) gewaschen und unter Vakuum getrocknet, bis der Wassergehalt des Feststoffes (0,08 % ist, um 21,4 g (98%ig rein gemäß HPLC, 89 % Ausbeute) des 2-Formylmercaptobenzothiazols, Schmelzpunkt 125 ºC-130 ºC (Zersetzung) zu erhalten.
¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 7,36-7,44 (m,3H), 8,45-8,52 (m,1H), 9,92 (s,1H).

Beispiel 2

Herstellung von Zinkpivaloat

Zu 250 ml auf 60-70 ºC angewärmtes Wasser wurden 56,1 g (0,55 mol) Pivalinsäure (Trimethylessigsäure) hinzugegeben. 31,25 g (0,25 mol) Zinkcarbonat wurden dann portionsweise über einen Zeitraum von 10 bis 15 min hinzugefügt, und die Temperatur dann auf 96 ºC-98 ºC erhöht. Nach einstündigem Rühren der Reaktionsmischung wurde die Mischung mit einem Eisbad 30 min auf 4 º C abgekühlt und die Suspension abfiltriert. Der Filterkuchen wurde einmal mit 75 ml kaltem Wasser und 3 mal mit 50 ml kaltem Aceton gewaschen. Das erhaltene Produkt wurde bei 60 ºC 16 h in einem Zugluftofen getrocknet, um 58 g (87 %) Zinkpivaloat zu ergeben.

Beispiel 3

3,6'-Di-N-formylgentamicin B

Zu 285 ml Dimethylsulfoxid und 285 ml Methylenchlorid wurden 34,0 g (127 mmol) Zinkpivaloat und 19 g Gentamicin B (Reinheit 93,1 %, 36,7 mmol) hinzugefügt. Die erhaltene Suspension wurde 10-15 min bei Raumtemperatur gerührt, um Lösung zu bewirken. Zu dieser Lösung wurden 16,0 g 2-Formylmercaptobenzothiazol (81,9 mmol) hinzugefügt, und nach 5 min wurde ein Aliquot zur flüssigkeitschromatographischen Analyse des Verhältnisses der Monoformyl/Diformylpeaks entnommen. Es wurden zwei weitere kleine Zugaben gemacht, so daß schließlich die Gesamtladung 16,95 g (86,8 mmol) betrug, um ein abschließendes Peakverhältnis von 0,02 zu ergeben, welches als vollständig angesehen wurde.
Die Reaktionsmischung wurde in einen 2 l Scheidetrichter überführt, und es wurden 800 ml Wasser hinzugefügt. Die Phasen wurden getrennt, und die wäßrige Schicht wurde mit einer 30 ml Portion Methylenchlorid reextrahiert. Die wäßrige Schicht wurde dann durch einen kleinen Bausch Celite gefiltert, um eine Trübung von Feststoffen zu entfernen.
Das Filtrat wurde mit Wasser auf ein abschließendes Volumen von 2 l verdünnt und sein pH lag ungefähr bei 6 an diesem Punkt. Diese wäßrige Lösung wurde auf eine Kolonne aufgebracht, die 800 ml Amberlite IRC-50 Harz enthielt, welches an einen teilweisen Ammoniumcyclus angepaßt worden war. Das Produkt wurde mit 0,75 N Ammoniumhydroxid eluiert, die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert, um eine Lösung zu erhalten, die durch flüssigkeitschromatographische Analyse analysiert und gefunden wurde, daß sie 17,9 g (90,5 %) 3,6'-Di- N-formylgentamicin B enthielt. Massenspektrum m/e (%) (FAB/GLYTHIO) 539 (100,M&spplus;+1), 511(9), 380(9), 350(4), 191(10), 190(5), 160(28).
¹H-NMR (400 MHz, D&sub2;O; pH=9) δ 1,25 (s, 3H, C-4"-CH&sub3;), 2,57 (s, 3H, N-CH&sub3;), 5,11 (d, J=4,02 Hz, 1H, anomerisch), 5,38 (d, J=4,02 Hz, IH, anomerisch), 8,15 (s, 1H, N-CHO), 8,16 (s, 1H, N-CHO).
¹³C-NMR (100 MHZ, D&sub2;O; pH=9) δ 51,36(C-1), 47,8(C-3), 38,96(C- 6'), 64,5(C-3"), 37,01(N-CH&sub3;), 22,22(C-4"-CH&sub3;), 165,47(N-CHO), 164,76(N-CHO).

Beispiel 4

Herstellung von N,O-Diformvl-(S)-isoserin

Zu einem 1 l Rundkolben, der 50 g (S)-Isoserin (0,476 mol) und 62,5 ml Ameisensäure enthielt, wurden innerhalb von 30 min eine frisch hergestellte Essigsäure-Ameisenanhydridlösung * (5 Äquiv.) bei 0-5 ºC hinzugefügt. Nach Untersuchung der Vollständigkeit der Reaktion durch ¹H-NMR (annähernd 2 h) wurde die Mischung im Vakuum bei 40 ºC auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens eingeengt. Zum Bewirken der Kristallisation wurden 250 ml Isopropanol langsam unter gleichzeitigem Kühlen hinzugefügt. Die Auf schlämmung wurde 1 h bei 0 ºC gerührt. Das Produkt, N,O-Diformyl-(S)-isoserin, wurde abfiltriert und mit Isopropanol gewaschen. Dieses ergab 64 g N,O-Diformyl-(S)- isoserin; 84 % Ausbeute; Schmelzpunkt 139,5 ºC - 141,5 ºC; [α]D20 -38 ºC (1%, MeOH).
¹H-NMR (D&sub2;O) δ 3,8 (dd, 1H, J=14,6, 4,4 Hz), 3,91 (dd, 1H, J=14,6, 45,5 Hz), 5,38 (dd, 1H, J=5,5, 4,4 Hz), 8,15 (s, 1H), 8,27 (s, 1H).
* Essigsäure-Ameisensäureanhydrid wurde durch Zugabe von Acetylchlorid zu 1,2 Äquiv. Natriumformiat (trocken, micronisiert) in trockenem Acetonitril (die Konzentration von Natriumf ormiat/CH&sub3;CN kann so hoch wie 50 % sein) bei 0-5 ºC hergestellt. Zur Vervollständigung benötigt die Reaktion 2 h. Die Ausfällung wurde abfiltriert, das Filtrat wurde, wie es war, in der vorstehenden Reaktion verwendet. Etwas Kohlenmonoxid wird in Abhängigkeit von der Temperatur von dieser Mischung entwickelt. Eine vernünftige Stabilität, für einen Monat, wurde bei 0 ºC beobachtet.

Beispiel 5

Herstellung von N-Phthaloyl- (S) -Isoserin

Zu einer gerührten Suspension von 15,75 g (150 mmol) (S)- Isoserin und 22,2 g (150 mmol) Phthalsäureanhydrid in 600 ml Toluol:Dimethylformamid (3:1) wurden 2,1 ml (15 mol) Triethylamin hinzugefügt. Die Suspension wurde zum Rückfluß erhitzt, und das erzeugte Wasser wurde unter Verwendung eines Dean-Stark Kondensators entfernt. Kein zusätzliches Wasser schied sich nach zwei (2) Stunden Erhitzen unter Rückfluß mehr ab. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum auf ein Endvolumen von ungefähr 100 ml entfernt. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt, mit Eiswasser verdünnt und mit 2N Salzsäure angesäuert, um einen Niederschlag zu ergeben. Das Produkt wurde abfiltriert, mit Eiswasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet, um 30,4 g (86 %) N-Phthaloyl-(S)-isoserin Schmelzpunkt 227-228 ºC; [α]D²&sup0;: +10 (1%, DMF) zu erhalten.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ 3,76 (dd, 1H, J=13,46, 7,69 Hz), 3,84 (dd, 1H, J=13,46, 5,77 Hz), 4,3 (dd, 1H, J=7,69, 5,77 Hz), 7,77-7,89 (m, 4H).

Beispiel 6

Herstellung von N-Trifluoracetyl-S-isoserin

Zu einer gerührten Lösung von Natriummethoxid in Methanol, 11 ml (1 Äquiv., 24,8 % w/w Lösung) wurden 5 g (S)-Isoserin hinzugefügt. Die Mischung wurde 15 min bei Raumtemperatur gerührt, bis eine homogene Lösung erhalten wurde. 7 ml (1,25 Äquiv.) Ethyltrifluoracetat wurden hinzugefügt. Die Mischung wurde 30 min nach der Zugabe gerührt. Die Vollständigkeit der Reaktion wurde durch ¹H-NMR beobachtet. Die Mischung wurde unter vermindertem Druck zu einem Volumen so klein wie möglich konzentriert. Zu dem Rückstand wurden 50 ml Ethylacetat hinzugefügt. Die Mischung wurde auf 0-5 ºC abgekühlt, 25 ml 2N HCl (1 Äquiv.) wurden hinzugefügt, gefolgt von 5 g festem Natriumchlorid. Die organische Schicht wurde abgetrennt. Die wäßrige Schicht wurde mit 50 ml Ethylacetat reextrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden (über 5 g wasserfreiem Magnesiumsulfat) getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck auf 20 ml eingeengt. Hierzu wurden 50 ml Heptan unter Rühren in einem Eisbad für 30 min hinzugefügt. Das Produkt wurde abfiltriert und getrocknet, um 8,86 g (93 %) N-Trifluoracetyl- (S)-isoserin Schmelzpunkt 142-143 ºC [α]D²&sup0;: +12,4 (1%, H&sub2;O; ¹H-NMR (D&sub2;O) δ 3,78 (d, 2H, J=5,48 Hz), 4,53 (t, 1H, J=5,48 Hz) zu erhalten.

Beispiel 7

Herstellung von Isepamicin

Die folgenden Verfahren zeigen die Herstellung von Isepamicin.

Verfahren A:

Eine Vorratslösung von N-Formyl-(S)-isoserin wurde durch 14-16 von 20 g (124,2 mmol) N,O-Diformyl-(S)-isoserin in einer Mischung von Methanol (85 ml) und Pyridin (15 ml, 1,5 Äquiv.) durch 14-16 h Rühren bei Raumtemperatur erhalten. Die Vollständigkeit der Reaktion wurde durch ¹H-NMR beurteilt.
In einem getrennten Reaktionsgefäß wurden 20 g eines wäßrigen Konzentrats (4,424 g aktiv, 8,2 mol) von 3,6'-Di-formylgentamicin B und 1,26 g (8,26 mol) von 1-N-Hydroxybenzotriazol- Monohydrat in 40 ml Methanol gelöst. Zu der gerührten Mischung wurde die vorstehende N-Formyl-(S)-isoserinlösung in Methanol (22,2 ml, 24,4 mmol, 3 Äquiv.) und eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (5 g, 24,3 mol, 3 Äquiv.) in 20 ml Methanol gleichzeitig über einen Zeitraum von 40 min hinzugefügt. Nach vollständiger Zugabe wurde die Mischung 15 min gerührt. Der Fortschritt der Reaktion wurde entweder durch HPLC oder durch DSC verfolgt. Die Lösungsmittel wurden dann unter vermindertem Druck entfernt, und das Produkt, Triformylisepamicin, wurde durch Rühren bei Raumtemperatur für 16 h mit 90 ml 2N NaOH hydrolisiert. Die Reaktionsmischung wurde mit Säure auf pH=6 neutralisiert, filtriert, und das Filtrat wurde auf ein genaues Volumen von 1000 ml verdünnt. Extern-Standard HPLC Analyse dieser Lösung zeigte eine 89 %ige Ausbeute von Isepamicin (4,17 g, 7,3 mol).

Verfahren B:

Eine Lösung wurde durch Lösen von 1,156 g (96,6 % rein, 2,07 mmol) 3,6'-Di-N-formylgentamicin B, 800 mg (1,7 Äquiv.) N- Phthaloylisoserin und 365 mg (1,2 Äquiv.) N-Hydroxybenzotriazol- Monohydrat in 40 ml Methanol hergestellt. Zu dieser Lösung wurden 700 mg (1,7 Äquiv.) Dicyclohexylcarbodiimid hinzugefügt. Die Reaktion wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt und 160 mg N- Phthaloyl-(S)-isoserin und 140 mg Dicyclohexylcarbodiimid wurden hinzugefügt, und die Reaktion bei Raumtemperatur für annähernd drei (3) h rühren gelassen. Der Fortschritt der Reaktion wurde durch DSC verfolgt. Das Lösungsmittel wurde durch Eindampf en entfernt, und der Rückstand wurde in 50 ml Ethanol und 5 ml Wasser aufgenommen. Die Schutzgruppen wurden durch Behandeln der erhaltenen Mischung mit 6,0 ml (85 %) Hydrazinhydrat entfernt. Die Reaktion wurde 14 h auf 85-90 ºC unter Stickstoff erhitzt. Extern-Standard HPLC Analyse der Reaktion zeigte eine Ausbeute von 89 % (1,05 g, 1,85mmol) Isepamicin.

Verfahren C:

Zu 48,9 g eines wäßrigen Konzentrats (8,45 g aktiv, 15,7 mmol) 3,6'-Diformylgentamicin B wurden 2,4 g (15,7 mmol) 1-N- Hydroxybenzotriazol-Monohydrat hinzugefügt, gefolgt von 80 ml Methanol. Zu der gerührten Mischung wurden 9,5 g (47,3 mmol, 3 Äquiv.) N-Trifluoroacetyl-(S)-isoserin in 40 ml Methanol und 9,7 g (47,1 mrnol, 3 Äquiv.) Dicyclohexylcarbodiimid in 40 ml Methanol gleichzeitig über einen Zeitraum von 40 min hinzugefügt. Nach vollständiger Zugabe wurde die Mischung 15 min gerührt. Der Fortschritt der Reaktion wurde entweder durch HPLC oder DSC verfolgt. Die Lösungsmittel wurden dann unter vermindertem Druck entfernt, und das Produkt wurde durch Rühren mit 170 ml 2N NaOH bei Raumtemperatur für 16 h hydrolisiert. Die Reaktionsmischung wurde mit Säure auf pH=6 neutralisiert, filtriert, und das Filtrat wurde zu einem genauen Volumen von 1000 ml verdünnt. Extern-Standard HPLC Analyse der Lösung zeigte eine 88 %ige Ausbeute von Isepamicin (7,84 g, 13,8 mmol).

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Isepamicin, umfassend

(a) die Umsetzung eines Komplexes eines zweiwertigen Salzes von Gentamicin B mit 2-Formylmercaptobenzothiazol, das befähigt ist, Formyl-Schutzgruppen selektiv an den 3,6'-Amino-Gruppen des Gentamicins B einzuführen, zur Herstellung von 3,6'-Di-N-Formylgentamicin B;

(b) die Acylierung der 1-Amino-Gruppe des 3,6'-Di-N- Formylgentamicins B mit einer N-geschützten (5)-Isoserin-Verbindung;

(c) die Entfernung sämtlicher Schutzgruppen;

(d) die Isolierung von Isepamicin.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Komplex eines zweiwertigen Salzes von Gentamicin E der Cobalt(II)- oder Zink(II) -Komplex ist.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, worin das Zink- Salz sich von Zinkpivaloat ableitet.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Komplex des zweiwertigen Salzes aus etwa 1,5 bis 4,5 mol Zink(II) auf 1 mol Gentamicin gebildet wird.

5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Stoffmengen-Verhältnis des 2-Formylmercaptobenzothiazols zu dem Komplex des zweiwertigen Salzes von Gentamicin E etwa 2 bis 3 1, vorzugsweise 2,5 : 1, beträgt.

6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin die N-geschützte (S)-Isoserin-Verbindung in Schritt (b) N-Formyl- (S) -isoserin, N-Phthaloyl- (S) -isoserin, N-Trifluoracetyl- (S) -isoserin oder N-Trichloracetyl- (S) -isoserin ist.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin der Schritt (b) mittels einer in-situ -Bildung eines aktiven Esters der N-geschützten (S)-Isoserin-Verbindung durchgeführt wird.

8. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, worin die N-geschützte (S)-Isoserin-Verbindung in Schritt (b) mit einem aktivierenden Reagens in Anwesenheit von Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt wird.

9. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, worin das aktivierende Reagens N-Hydroxybenzotriazol, Imidazol, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid oder N-Hydroxy-5- norbornen-2, 3-dicarboximid ist.

10. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Schutzgruppen durch basische Hydrolyse entfernt werden.

11. Verbindung 3,6'-Di-N-formylgentamicin B mit der Struktur

12. Verbindung der Struktur

in der

R H, CCl&sub3; oder CF&sub3; ist und

R' H ist oder

R und R' zusammen den Imid-Ring einer Phthaloyl-Struktureinheit bilden.

13. Verbindung nach Anspruch 12, worin

R H ist und

R' H ist.

14. Verbindung 2-Formylmercaptobenzothiazol.