DD148220A5 - Verfahren fuer die herstellung einer neuartigen 6'-n-substituierten-3-n-formylkanamycin-zwischenverbindung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer neuartigen 6'-N-substituierten-3-N-formylkanamycin-Zwischenverbindung fuer die Herstellung von Aminoglycosid-Antibiotika, vor allem 1-N-Alkyl-substituierten-Kanamycinderivaten. Beispielsweise werden zur Herstellung von 3'',6'-Di-N-acetyl-3-N-formyl-kanamycin-A 4-Nitrophenylfoemiat, 3'',6'-Di-N-acetyl-kanamycin A, Tetrahydrofuran und Triathylamin miteinander umgesetzt, wobei sich 3'',6'-Di-N-acetyl-1,3-di-N-formyl-kanamycin A bildet. Diese Verbindung wird in Wasser geloest, der pH-Wert mit NaOH auf 12,0 bis 12,5 eingestellt und nach siebentaegigem Ruehren bei Raumtemperatur durch Ionenaustauscherharz neutralisiert, wobei diegewuenschte Verbindung entstand.

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Dies ist ein ausgeschiedener Teil der Patentanmeldung Nr. 207.638. eingereicht 18. August 1978.

Die Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Herstellung von selektiv N-geschützten Kanamycinderivaten, bei denen es sich um nützliche Zwischenverbindungen für die Herstellung von Aminoglycosid-Antibiotika handelt, vor allem 1-N-Alkyl-substituierte-Kanamycinderivate.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Beispiele für derartige 1-N-Alkyl-substituierte-Kanamycinderivate werden in der GB-PS Nr. 1.464.401 beschrieben, weitere in dem belgischen Patent Nr. 855.709.

Ziel der Erfindung

Bei der Herstellung solcher Verbindungen aus dem reichlich zur Verfugung stehenden Fermentationsprodukt Kanamycin ist es zu empfehlen, alle Aminogruppen außer der 1-Aminogruppe zu schützen. Die Alkylierung kann dann vorzugsweise bei der Aminogruppe in der 1-Stellung erfolgen, und die Isolierung des endgültigen 1-N-substituierten Produktes wird dadurch vereinfacht.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Anmeldung Nr. 207.638 beschreibt und beansprucht ein Verfahren zur Herstellung eines 1-N-Alkyl-substituierten Kanamycinderivates der Formel:

_mm ο _w

HO—

NHR

worin R eine Amino- oder Hydroxylgruppe ist und R eine nie dere Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, wovon jedes Kohlenstoffatom, außer dem an das Stickstoffatom gebundenen Kohlenstoffatom, wahlweise durch eine Hydroxyl- oder Aminogruppe substituiert werden kann, gekennzeichnet 'dadurch, daß eine Zwischenverbindung der Formel:

CH₂NHR³

NHOCH

R³NH

HO

(II)

worin R eine C₀-C .-Alkano/Lgruppe oder eine Benzoylgruppe ist und R eine Hydroxygruppe oder eine Gruppe NHR ist, zur Herstellung einer Verbindung der Formel

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CH₂NHR"

NHR^-

HO

(III)

HO

worin R , R und R die oben erläuterte Bedeutung haben, alkyliert wird, die Formylgruppe und die Gruppe R entfernt werden und die vorgesehene Verbindung der Formel I isoliert wird.

In der hier gebrauchten Bedeutung besagt der Ausdruck niederes Alkyl, daß eine derartige Gruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält und eine gerade oder verzweigte Kette haben kann. Bestimmte Beispiele für substituierte niedere Alkyl-

1 ——

gruppen R sind die ^sy—'i-Amino^-h.ydröxybutyl- und 1,3-Dihydroxyprop-2-yl-Gruppen. Bei der Blockierungsgruppe R handelt es sich vorzugsweise um eine Acetylgruppe.. Das obige Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I) wird vor allem in der Anmeldung Nr. 207.638 beschrieben und vorgestellt.

Bei der Zwischenverbindung 6'-N-substituierte-3-N-Formylkanamycinderivate der Formel (II) handelt es sich um neuartige Verbindungen, und gemäß der Erfindung werden diese neuartigen Zwischenverbindungen der Formel (II) mit Hilfe eines Verfahrens hergestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Verbindung der Formel:

CH₂NHR

(HA)

worin R und R die oben erläuterte Bedeutung haben, formyliert und die entstandene Verbindung selektiv zur Entfernung der Formylgruppe aus der 1-Amino-Stellung hydrolisiert wird, während die Formylgruppe an der 3-Stellung unberührt bleibt. Die Herstellung von geeigneten Acyl-Kanamycinderivaten, die an der 3"- und 6'-Aminogruppe bei Kanamycin A und zusätzlich an der 2"-Aminogruppe bei Kanamycin B durch eine Cp-C.-Alkanoylgruppe oder eine Benzoylgruppe substituiert sind, wird in der belgischen PS Nr. 853.564 beschrieben. Beispielsweise wird die Herstellung von 3"_#6'-Di-N-acetyl-kanamycin A über

+ eine selektive O bis N-Acetylvvanderungsreaktion beschrieben.

Die Formylierungsreaktion kann auf den unterschiedlichsten Wegen ablaufen, die den Fachleuten allgemein bekannt sind

Beispielsweise kann die Formylierung unter Verwendung eines Gemischs von Ameisen- und Essigsäureanhydriden erzielt werden, es wurde aber gefunden, daß die Reaktion am besten unter Verwendung von 4-Nitrophenylformiat durchgeführt wird. Geeignete Lösungsmittel für die Reaktion sind wäßriges Dioxan, wäßriges Tetrahydrofuran oder Dimethylformamid, und die Reaktion wird durch den portionsweisen Zusatz eines Überschusses, (z. B. eines dreifachen Überschusses) von 4-Nitrophenylformiat zu dem Kanamycinderivat ausgeführt. Zur Unterstützung der Reaktion wird vorzugsweise eine Base zugegeben, und eine organische Base, z. B. Triethylamin kann für diesen Zweck

verwendet werden. Mindestens ein Äquivalent Base wird vorzugs-Andere Derivate können auf ähnliche Weise hergestellt werden

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weise für jede reaktionsfähige Aminogruppe zugesetzt. Die Formylierungsreaktion ist normalerweise innerhalb von 24 Stunden bei Raumtemperatur beendet, und das Produkt kann anschließend mit Hilfe herkömmlicher Techniken, z. B. durch Verdampfen des Lösungsmittels oder durch Ausfällung isoliert werden und kann bei Bedarf weiter gereinigt werden. Die !selektive Hydrolysestufe wird mit dem in Wasser oder einem wäßrigen organischen Lösungsmittel, z. B. wäßrigem Dioxan oder wäßrigem Tetrahydrofuran gelösten 1,3-Di-N-formylprodukt durchgeführt werden, wobei der pH-Wert der Lösung mit einem Alkali, z. B. durch die Zugabe von verdünntem Natrium- oder Kaliumhydroxid, sorgfältig auf den Bereich von 12,0 bis 12,5 eingestellt wird. Die Lösung wird bei Raumtemperatur mehrere Tage lang gerührt, wobei der Ablauf der Reaktion mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie verfolgt wird, bis die Umwandlung zu dem vorgesehenen 3-N-Formylderivat der Formel (II) beendet ist. Die Lösung wird dann durch die Zugabe von Saure neutralisiert, oder noch besser durch die Zugabe eines Ionenaustauscherharzes in Wasserstoff-Ionen-Form. Das hat den Vorteil, daß die Ansammlung eines anorganischen Stoffes in Lösung vermieden wird, und es hat den zusätzlichen Vorteil, daß jegliches Nebenprodukt, in das sowohl die 1- als auch die 3-Formylgruppe gespalten wurde, auf dem Harz absorbiert wird. Das Produkt wird schließlich mit Hilfe herkömmlicher Techniken isoliert, z. B. durch Eindampfen zu einem geringen Volumen und Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel wie Isopropanol. Wenn gewünscht, kann eine weitere Reinigung durch Chromatographie erfolgen, aber im allgemeinen ist das Produkt für die direkte Verwendung bei der Herstellung von Verbindungen der Formel (I ) rein genug.

Das Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (II) kann unter Verwendung von 3",6'-Di-N-acetylkanamycin A zur Gewinnung der Verbindung der Formel (II), worin R Acetyl ist und R eine Wasserstoff gruppe ist, durchgeführt werden. Ähnlich kann 2',3^M,6'-Tri-N-acetyl-kanamycin B zur

Gewinnung der Verbindung aer Formel (II), worin R eine Gruppe NHR ist und R Acetyl ist, verwendet werden. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert. Die Dünnschichtchromatographie wurde auf Silicaplatten unter Anwendung des angegebenen Lösungsmittelsystems durchgeführt. Die Flecken wurden nach dem Trocknen der Platten durch Besprühen mit einer 5 %igen Lösung von t-Butylhypochlorit in Cyclohexan, Trocknen der Platten 10 Minuten lang bei 100 ⁰C in einem belüfteten Ofen, Kühlen und Besprühen mit einer Stärke-Kaliumjodidlösung beurteilt. Die Dünnschichtelektrophorese erfolgte auf 20-cm-Silicaplatten mit einer Potentialdifferenz von 45 Minuten lang angelegten 900 Volt. Als Elektrolyt diente ein Gemisch aus Ameisen- und Essigsäure, wodurch ein pH-Wert von 2 erzielt wurde, und der Nachweis wurde wie oben durchgeführt.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Herstellung von 3".6'-Di-N-acetyl-3-N-formyl-kanamycin A (A) 4-Nitrophenylformiat (6,88 gj wurde portionsweise im Laufe von 45 Minuten zu einer Suspension von 3",6'-Di-N-acetyl-kanamycin A (3,9 g) in Wasser (21 ml) und Tetrahydrofuran (21 ml), die Triäthylamin (6,91 g) enthielt, gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und danach zu einem geringen Volumen eingedampft, wobei die letzten Spuren von Wasser durch azeotrope Destillation mit Isopropanol ersetzt werden (Endvolumen 35 ml). 3",e'-Di-N-acetyl-l.S-di-N-formyl-kanamycin A (2,41 g) fällte aus der Lösung aus und wurde filtriert und unter Vakuum bei 50 C getrocknet.

Bei der Dünnschichtelektrophorese (pH-Wert = 2) ergab die Verbindung einen Wert von 0,09 in bezug auf Kanamycin A.

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Bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Methanol, Äthylacetat, Ammoniak, Wasser (40:40:1:30) als Eluierüngsmittel ergab sich Rf 0,42. Das Protonen-NMR-Spektrum zeigte Signale bei S = 7,96 ppm (Formylproton), 8,02 ppm (Formylproton) und 2,02 ppm (6 Acetylprotonen) . (B) Das Produkt von (A) (2,4 g) wurden in Wasser (72 ml) gelöst, und der pH-Wert der Lösung wurde mit 2 N Natriumhydroxidlösung (2,0 ml) auf 12,0 bis 12,5 eingestellt. Die Lo^ sung wurde bei Raumtemperatur 7 Tage lang gerührt, wobei der pH-Wert zwischen 12,0 und 12,5 gehalten wurde, und sie wurde anschließend durch die Zugabe von Ionenaustauscherharz Amberlite IR120 (H+ Form) (10 ml) neutralisiert. Das Harz wurde filtriert und das Filtrat zu einem geringen Volumen eingeengt, wobei die letzten Wasserspuren durch Ersetzen durch Dimethylformamid (5 ml) unter Rückfluß entfernt wurden. Der Dimethylformamidlösung wurde dann langsam Isopropanol (30 ml) zugesetzt, und das Präzipitat von 3',G'-Di-N-acetyl-S-N-formylkanamycin A (1,75 g) wurde filtriert und unter Vakuum bei 40 ⁰C getrocknet. Die Verbindung war so rein, daß sie in der nächsten Stufe des Verfahrens verwendet werden konnte. Eine Probe wurde weiter durch Chromatographie auf CM Sephadex C25 (NH. + + Form) unter Verwendung von O,IM Ammoniumhydroxidlösung als Eluierungsmittel gereinigt. Es wurde ein C-13-NMR-Spektrum erzielt, das vollkommen mit der geforderten Struktur übereinstimmte und das die MonowFormylierung der 3-Aminogruppe bestätigte. Die Dünnschichtelektrophorese (pH = 2) ergab einen Wert von 0,43 in bezug auf Kanamycin A. Bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Methanol, Äthylacetat, Ammoniak, Wasser (40:40:1:30) als Eluierungsmittel ergab die Verbindung einen Rf-Wert von 0,23.

Beispiel 2: Herstellung von 2'.3",e'-Tri-N-acetyl-S-N-formyl-kanamycin B

(A) Benzylchloroformiat (128 g) wurde über einen Zeitraum

von 10 Minuten zu einer Lösung von Kanamycin-B-Sulfat (80,5 g) und Natriumcarbonat (76 g) in Wasser (400 ml) gegeben, und die Lösung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Prazipitat wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser, mit verdünnter Salzsäure und mit Wasser gewaschen und getrocknet, so daß Penta-N-benzyloxycarbonylkanamycin B gewonnen wurde (Ausbeute 125,7 g).

(B) Penta-N-benzyloxycarbonyl-kanarnycin B (230,8 g) wurde im Laufe von 15 Minuten portionsweise zu einer gerührten Lösung von Essigsäureanhydrid (189 ml) in Pyridin (346 ml) und Dichlormethan (346 ml) gegeben, und die Suspension wurde 48 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde in ein Gemisch von Dichlormethan (1,5 Liter) und Wasser (2,3 Liter) gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt und mit verdünnter Salzsäure (pH-Wert 4) und mit Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde zu einem Volumen von 0,75 Liter eingedampft und die Lösung in Diethylether (4 Liter) gegossen. Das Prazipitat von Tetra-O-acetyl-penta-N-benzyloxycarbonyl-kanamycin B wurde durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet (Ausbeute 244,8 g, 92,6 %).

(C) Eine Lösung von Tetra-O-acetyl-penta-N-benzyloxycarbonyl-kanamycin B (33,0 g) in Tetrahydrofuran (132 ml), Wasser (66 ml) und Essigsäure (3,3 ml) wurde über 5 % Palladiumauf-Holzkohle-Katalysator (3,3 g) 7 Stunden lang bei 50 °C und 50 psi hydriert. Der Katalysator wurde mit Hilfe von Filtration entfernt und das Filtrat zu einem Volumen von 25 ml eingeengt. Der Rückstand wurde mit Ammoniumhydroxid (7N, 81,5 ml) behandelt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde auf einer Säule von Ionenaustauscherharz Amberlite CG-50 in Form von Ammoniumionen (2 Liter) unter Eluierung mit Wasser und anschließend mit 0,01 wäßrigem Ammoniak chromatographiert. Fraktionen, die das vorgesehene Produkt enthielten, wurden zusammengenommen und eingedampft, um 2' ,3" ,e'-Tri-N-acetyl-kanamycin B (9.37 g,

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61,6 %) zu gewinnen; Schmelzpunkt 191 bis 198 ⁰C (Zersetzung, -Q _max (KBr) 1650, 1550 cm"¹, Rf: 0,11 (6:3:1:2 Methanol, Diäthyläther, Wasser. 0,880 wäßriges Ammoniak) , Rf 0,11 (40:40:30:1 Methanol, Äthylacetat, Wasser, 0,880 wäßriges Ammoniak).

(D) p-Nitrophenylformiat (153,1 g) wurde portionsweise im Laufe von 40 Minuten zu einer gekühlten Lösung von 2',3",6^f-Tri-N-acetyl-kanamycin B (93 g) in einem Gemisch von Wasser (465ml), Tetrahydrofuran (558 ml) und Triäthylamin (154 g) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und anschließend zu einem geringen Volumen unter reduziertem Druck eingeengt. Das wäßrige Konzentrat wurde mit Isopropanol zur Ausfällung des Produktes verdünnt, wobei das restliche Wasser durch azeotrope Destillation mit Isopropanol entfernt wurde. Das Produkt wurde schließlich durch Filtration gesammelt, mit Isopropanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet, um 2",3",6'-Tri-N-acetyl-l,3-di-N-formylkanamycin B (89,2 g) zu gewinnen. Schmelzpunkt 310 bis 318 ⁰C (Zersetzung) . -|)._max (KBr) 1665, 1545 cm"¹, Rf 0,49 (6:3:1:2) Methanol, Diäthyläther, Wasser, 0,880 wäßriges Ammoniak), Rf 0,54 (40:40:30:1 Methanol, Äthylacetat, Wasser, 0,880 wäßriges Ammoniak).

(E) Eine Lösung von 2'3",6'-Tri-N-acetyl-1,3-dL-N-formylkanamycin B (86,9 g) in Wasser (2,61 Liter) wurde mit ION Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 12 bis 12,5 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Tage lang bei Raumtemperatur gehalten, wobei der pH-Wert der Lösung notfalls mit wäßrigem Natriumhydroxid wieder auf 12 eingestellt wurde, und die Lösung wurde anschließend durch die Zugabe von Amberlite-Harz IR 120 (H+ Form) neutralisiert. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat auf Ionenaustauscherharz Amberlite 200 (Ammonium-Ionen-Form,. 5,5 Liter) unter Eluierung mit Wasser und danach mit O,1N wäßrigem Ammoniumhydroxid chromatographiert. Eindampfen der jeweiligen Fraktionen ergab 2',3",6'-Tri-N-acetyl-3-N-formylkanamycin B

- ίο - 2

(55,4 g), Schmelzpunkt 266 bis 268 ⁰C (Zersetzung), "0 max (^KBr) ¹⁶⁶⁵· ¹⁵⁵⁵ cm*"¹, Rf 0,49 (40:40:30:1 Methanol, Äthylacetat, Wasser, 0,880 wäßriges Ammoniak). Die Struktur wurde mit Hilfe der magnetischen C-13-Kernresonanzspektroskopie bestätigt.

Claims (7)

""." 21690 Erfindunqsanspruch ;

1. Verfahren für die Herstellung einer neuartigen 6'-N-substituierten-3-N-fοrmylkanamyein-Zwischenverbindung der Formel:

HO O

worin R eine C₀ - C.-Alkanoylgruppe oder eine Benzoyl-

4

gruppe ist und R eine Hydroxygruppe oder eine Gruppe NHR ist, gekennzeichnet dadurch, daß eine Verbindung der Formel

CH NHR³
HO- '

(HA)

worin R und R die oben angeführte Bedeutung haben, formyliert wird, und die entstandene Verbindung selektiv zur Entfernung der Formylgruppe aus der 1-Aminostellung hydrolysiert wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß 3" ,6'-Di-N-acotylkanamycin A als Ausgangsverbindung ver· wendet wird.

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß 2',3",6'»Tri-N-acetylkanamycin B als Ausgangsverbindung verwendet wird.

4, Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Formylierung der Verbindung der Formel HA mit 4-Nitrophenylformiat erzielt wird.

5. Verfahren nach Punkt 4 ,gekennzeichnet dadurch, daß die Formylierung in einem wäßrigen organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer Base vorgenommen wird.

6.Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß die selektive Hydrolyse mit verdünnter Natriumoder Kaliumhydroxidlösung vorgenommen wird.

7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß die selektive Hydrolyse bei einem pH-Wert von 12,0 bis 12,5 vorgenommen wird.