Vynález se týká nového způsobu výroby aminoglykosidových antibiotik, zvláště způsobu výroby 1-N-alkyl-substituovaných kanaimycinových derivátů.

Příklady takových 1-N-alkyl-substituovaných kanamycinových derivátů jsou popsány v britském patentovém spise č. 1 464 401; další jsou popisovány v belgickém patentovém spise č. 855 709.

Мар-И se připravit podobné sloučeniny z kanamycinu, který je snadno dostupným produktem fermentování, je třeba, aby všechny aminoskupiny mimo aminoskupiny v poloze 1, byly chráněny. Pak je možno provést selektivní alkylaci. aminoskupiny v poloze —1, čímž se zjednoduší izolace konečného 1-N-substituovaného produktu. Předmětem tohoto vynálezu je tedy nový způsob výroby 1-N-substituevaných derivátů kanamycinu přes takto selektivně N-chráněné meziprodukty. Předmětem tohoto vynálezu je tedy způsob výroby sloučenin obecného vzorce I

-kde

R značí aminoskupinu nebo hydroxyskupinu,

R¹ značí nižší alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, přičemž kterýkoli atom uhlí ku této 'skupiny s výjimkou toho, ' který je vázán na atom dusíku, může být popřípadě substituován ' 'hydroxyskupínou nebo aminoskupinou, vyznačující se tím, že se alkyluje sloučenina -obecného vzorce II

kde

R2 znamená alkanoylovou skupinu se 2 až atomy uhlíku nebo benzoylovou skupinu, a R³ znamená hydroxylovou skupinu nebo skupinu obecného vzorce -NHR2 za ' vzniku sloučeniny obecného vzorce III

kde Ř1 až R3 imají výše uvedené významy, načež - se odstraní.; , skupina R2 a . formylová skupina- -a- izoluje - - se - sloučenina ' obecného vzorce' I.

V popise znamená výraz nižší alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku skupinu jak přímou, tak i rozvětvenou. Jako zvláštní příklady substituovaných nižších alkylových skupin R1 je možno uvést: -skupinu (S)-4-amino-2-hydroxybutylovou a - 1,3-dihydr-oxyprop-2-ylovou. Chránící -skupinou - R2 je s výhodou acetylová -skupina.

Způsob výroby -sloučenin obecného vzorce I zahrnuje jako počáteční stupeň alkylaci sloučeniny obecného vzorce II za účelem zavedení substituent-u R1 na aminoskupinu v poloze —1. Tuto- reakci je možno provést celou řadou - způsobů známých o-dborníkům pracujícím- v oboru. Tak například se může alkylace provádět redukční alkylaci za použití vhodného odpovídajícího· -aldehydu nebo ketonu, nebo za použití sloučeniny, jak je popsáno v belgickém patentovém spise č. 851777.

Druhý -stupeň výroby -se týká odstranění chránící skupiny R2 z 2‘-aminoskupiny, pokud je tato chránící skupina v molekule přítomna, jakož i z aminoskupin v polohách 6‘ a - 3“, jakož i formylové skupiny z aminoskupiny v poloze 3. V některých případech, pokud - 1-N-substituent -obsahuje sám 'také aminoskupinu, může být žádoucí chránit i tuto skupinu během reakce s tím, že tuto chránící skupinu bude nutno odstranit v konečném stupni reakce. Je zde celá řada možností, jak odstranit chránící skupiny z aminoskupiny -a odborníkům jsou dobře -známé. P-oužitý postup bude pochopitelně záviset na povaze chránící skupiny, jakož i na okolí chráněné aminoskupiny. Použité prostředí může být bezvodé i vodné a ve zvláštních případech může být kyselé nebo alkalické o různé síle. Tak například je možno popřípadě přítomnou -benzylovou -skupinu odstra nit katalytickou - hydrogenolýzou běžným způsobem za přítomnosti -paládiového katalyzátoru. Alkanoylové a benzoylové chránící skupiny je možno. obvykle o-dsSranit hydrolýzou v mírně alkalickém . prostředí, například působením zředěného roztoku hydroxidu sodného. za teploty 65 °C - po dobu několika hodin. Za těchto· podmínek se rovněž odstraní formylová skupina. Je-li to třeba, může se produkt vzorce I dále čistit běžnými postupy, například .krystalizací nebo chromatografií·.

Postup je podrobněji popsán na přípravě 1-N- [ (S) -4-amino-2-hydro<xxy bty 1] -kanamycinu A. V tomto případě se chráněný kanamycinový meziprodukt obecného vzorce II, kde R³ znamená hydroxylovou skupinu a R² znamená acetylovou skupinu, -alkyluje redukční alkylací za použití vhodného· aldehydu nebo sloučeniny, jak je popsána v belgickém patentovém spise č. 851 777. Tak se může použít 3-benzyl-6-(S)-dihydro'Xymethyltetrahydro-l,3-oxazi.n-2-on a redukční alkylace se provede působením natriumborohydridu, nebo- s výhodou působením natriumkyanborohydridu jako redukčního činidla. Je možno použít přebytku činidla i aldehydu nebo jiné sloučeniny, aby se zajistil dokonalý - průběh .reakce . na 1-ami.noskupině. Vhodnými rozpouštědly jsou vodný methanol - nebo dioxan, dále dimethylformamid nebo di-methylsulfoxid. S výhodou se může použít - kyselina, například kyselina octová. Reakce se -obvykle provádí za teploty místnosti a zpravidla. je ukončena - - za - 5 nebo- 6 hodin. Surový produkt je možno izolovat oddestilováním rozpouštědla a je-li to žádoucí, může -se dále čistit krystalizací nebo- chromatografií. Obvykle však je výhodnější použít surový produkt přímo v dalším stupni přípravy.

Surový reakční -produkt -se rozpustí ve zředěném roztoku hydroxidu -sodného a roztok se zahřívá po- dobu asi 5 hodin na 65 °C, čímž se odstraní acetylové -a formylové chránící skupiny. Po neutralizaci se produkt — s výhodou po oddělení anorganických podílů — zbaví chránící benzylové skupiny běžnou katalytickou hydrogenací. K úplnému odstranění chránící benzylové skupiny obvykle postačuje provádění - katalytické hydrogenace za teploty 60 °C po dobu 4 nebo 5 hodin a za tlaku 0,412 MPa. Produkt se nakonec zpracuje běžným způsobem - a je-li to- nutné, čistí - se iontoměničovou chromatografií za vzniku čistého konečného produktu. Protože výchozí sloučenina obecného vzorce II - obsahuje pouze jednu reaktivní aminoskupinu, je konečným -produktem v podstatě pouze požadovaný 1-N-substituovaný izoimer a tak je možno se vyhnout separaci blízce příbuzných izomerů.

Reakce je možno rovněž provést stejným způsobem za použití 2‘,3“,6‘-tri-N-acetyl-3-formylkanamycinu B za vzniku odpo^í^i^j^jiícího- 1-N-substituovaného derivátu kanamycinu B.

Alkylační reakci je možno rovněž provést za -použití aldehydu nebo- ketonu substituovaného hydroxylovou skupinou, za vzniku 1-N-hydroxyalkylovaného derivátu kanamycinu, jak jsou tyto- látky popsány v belgickém patentovém spise č. 855 70Θ. Tak například -při použití 1,3-dihydroxyacetonu se získá produkt obecného vzorce I, kde R¹ znamená l,3-dihydroxyprop-2-ylovou skupinu.

Sloučeniny obecného vzorce II jsou novými látkami. Mohou se připravit z 3“,6‘-di-N-acyl-kanamycinu A nebo z 2‘,3“,6‘-trí-N-acyl-kanamycinu B reakcí, - která zahrnuje nejprve formylaci zbývajících 1 a 3 -aminoskupin a potom selektivní hydrolýzu, při které bylo s překvapením shledáno, že se odstraní -formylová skupina s 1-aminoskupiny, zatímco formylová skupina v poloze 3 zůstává nedotčena.

Vynález je blíže popsán následujícími příklady.

Chromatografie na tenké vrstvě se provádí na destičkách silikagelu za použití dále uvedené soustavy rozpouštědel. Skvrny jsou lokalizovány po vysušení -destiček postřlkem 5% roztokem terc.butylesteru kyseliny chlorné v cyklohexanu s následujícím sušením destičky po -dobu 10 minut při 100 °C ve větrané sušárně a po -ochlazení possřikem roztokem jodidu sodného· obsahujícím škrob.

Elek-troforéza na tenké vrstvě - -se provádí na 20 cm destičkách silikagelu s rozdílem potenciálu 900 V -po 45 minut. Jako elektrolyt -se použije směs kyseliny mravenčí a octové o· pH 2, detekce se provádí tak, jak je uvedeno výše.

AmbeHit a Sephadex jsou chráněné obchodní známky.

Přikladl >

Příprava l-N-[ (S]-4-amino-2-h^droxybutyl jkanamycínu A

Do reakční směsi obsahující 2,0 g 3“,6‘-di-N-acetyl-3-N-formylkanamycinu A, 2,38 g 3-benzyl-6- (S) -dihydr oxymerhyl-trtrahydro-2H-l,3-oxazm-2-onu, -roztok 0,1 g síranu měďnatého· v 66 ml vody a 322 ml methanolu se přidává během 5 hodin roztok 0,21 g natriumkyanborohydridu ve 40 ml vody. -Potom se reakční směs zahustí za sníženého tlaku -do sucha a ke zbytku se -přidá 25 ml vody -a 25 ml methylenchloridu. Vodná fáze se zahustí do sucha -a zbytek -se zahřívá s 20 ml 3N hydroxidu sodného 4 hodiny na teplotu 65 až 70 °C.

Reakční směs se po ochlazení neutralizuje přidáváním koncentrované kyseliny chlorovodíkové pod dobrým odtahem (uniká kyanovodík), načež se .prolije kolonou 600 mililitrů iontoměničové pryskyřice Amberlit CG-50 v amoniové formě, anorganické podíly se eluují vodou a potom se aminoglykosi201512 dická sloučenina eluuje 0,2 N roztokem hydroxidu amonného.

Frakce obsahující aminoglykosid se spojí, zahustí do sucha, zbytek se rozpustí ve směsi 13 ml methanolu, 13 ml kyseliny octové a 13 ml vody a hydrogenuje se na 5% paládiu na aktivním uhlí (0,4 g) 4. hodiny při' 60 °C za tlaku 0,41 MPa. Po skončené hydrogenaci se katalyzátor odfiltruje a filtrát se zahustí do sucha. Zbytek se rozpustí ve 20 ml vody a roztok se chromatografuje na 200 ml Íontoměničové pryskyřice CG-50 v amoniové formě na koloně za použití hydroxidu amonného (0,25 až 1,0 M) jako elučního činidla. Zahuštěním odpovídajících frakcí se izoluje 0,75 g (37 %) l-N-[(S)-4-amino-2-hydroxybu'tyljkanamycinu A, který je při chromatografii na tenké vrstvě i při elektroforéze totožný s autentickým vzorkem.

Příklad 2

Příprava 1-N- (1,3-dihy droxypr op-2-y 1) kanamyícinu В

Roztok 8,8 g 2‘,3“,6‘-tri-N-acetyl-3-N-formylkanaimycinu В v 880 ml methanolu a 176 ml vody se po přidání 4,0 g 1,3-dihydroxyacetonu redukuje přidáváním 3,9 g natriumkyanborohydridu. pH výsledného roztoku se upraví na hodnotu 6,5 přidáním 5 N roztoku kyseliny chlorovodíkové. Roztok se zahřívá 18 hodin к varu pod zpětným chladičem, ochladí se, přidají se další 4,0 g 1,3B

-dihydroxyacetonu a 3,9 g natrlumkyanborohydridu. pH se upraví přidáním kyseliny chlorovodíkové na 5,5 a roztok se zahřívá dalších 6 hodin к varu pod zpětným chladičem. Methanol se vydestiluje za sníženého tlaku a vodný koncentrát se chromatografuje na koloně Íontoměničové pryskyřice Amberlit 200 v amoniové formě za použití vody jako elučního činidla.

Frakce obsahující požadovaný 2‘,3“,6‘-tri-N-acétyl-3-N-formyl-l-N- (1,3-dihydroxyprop-2-yl).kanaimycin В se spojí a roztok se zahustí za sníženého tlaku na objem 40 ml.

Ke koncentrátu se přidá 40 ml 10 N vodného roztoku hydroxidu sodného a reakční směs se zahřívá 16 hodin na parní lázni. Ochlazený roztok se neutralizuje koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou, objem roztoku se doplní vodou na 1 litr a směs se chromatografuje na koloně íontoměničové pryskyřice Amberlit 200 v amoniové formě (3 litry). Kolona se promyje vodou, za účelem odstranění anorganických látek, načež se 1 N vodným roztokem hydroxidu amonného eluuje aminoglykosidová sloučenina. Surový produkt se znovu chromatografuje na íontoměničové pryskyřici Amberlit CG-50 v amoniové formě (2 1) za eluování vodou, 0,05 N vodným roztokem hydroxidu amonného a nakonec 0,1 N vodným roztokem hydroxidu amonného·. Zahuštěním odpovídajících frakcí se izoluje 3,2 g l-N-(l,3-dlhydroxyprop-2-yl)kanamycinu B, který je při chromatografii na tenké vrstvě totožný s referenčním vzorkem.