Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowej 6'-N-podstawionej 3-N-formylokanaTnycyny uzytecznej przy wytwarzaniu 1-N-alkrlowanych po¬ chodnych kamaimycyny o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza grupe aminowa albo hydroksy¬ lowa, a R1 oznacza nizszy rodnik alkilowy, w któ¬ rym dowolny atom wegla, za wyjatkiem atomu wegla zwiazanego z atomem azoitu, moze byc ewen¬ tualnie podstawiony grupa hydroksylowa lub ami¬ nowa, czyli sposób wytwarzania nowych pochod¬ nych kanamycyny selektywnie zabezpieczonych przy atomach azotu, stosowanych w procesie wy¬ twarzania zwiazków o wzorze 1.Przyklady 1-N-alkilowanych pochodnych kana¬ mycyny sa znane z brytyjskiego opisu patentowe¬ go nr 1 464 401 i z belgijskiego opisu patentowego nr 855 709, Przy wytwarzaniu tych zwiazków z latwo dostepnej kanamycyny wytwarzanej droga fermentacji, pozadane jest zabezpieczenie wszyst¬ kich grup aminowych za wyjatkiem grupy ami¬ nowej w pozycji 1, gdyz to umozliwia nastepnie alkilowanie przede wszystkim w pozycji 1^ dzieki czemu upraszcza sie znacznie ostateczne wyosob¬ nianie produktu podstawionego przy atomie azo¬ tu w pozycji 1.Zwiazki o ogólnym wzorze 1, w którym R i R1 maja wyzej podane znaczenie, wytwairza sie w ten sposób, ze alkiluje sie zwiazek o ogólnym wzo¬ rze 2, w którym R8 oznacza grupe alkanokarbony- lowa o 2—4 atomach wegla lub grupe benzoilowa, 10 15 20 25 3ft a R4 oznacza grupe hydroksylowa lub grupe o wzorze -NHR8, w którym R* ma wyzej podane znaczenie, po czym w otrzymanym zwiazku o ogól¬ nym wzorze 3, w którym R1, R2, R8 i R4 maja wyzej podane znaczenie, odszczepia sie grupy za¬ bezpieczajace RM R1 i wyosobnia zwiazek o wzo¬ rze 1.Stosowane tu okreslenie „nizszy rodnik alkilo¬ wy" oznacza rodnik alkilowy o 1—6 atomach wegla i o ladunku prostym albo rozgalezionym. Szcze¬ gólnymi przykladami podstawionych nizszych rod¬ ników alkilowych sa grupy takie jak grupa /S/-4- -aimino-2-hydroksybutylowa i 1,3-dwuhydroksypro- pylcwa-2. Grupa zabezpieczajaca R8 korzystnie oznacza grupe acetylowa.Sposób wytwarzania nowej 6'-N-podstawionej 3-N-icrmylokanamycyny o wzorze 2 wedlug wy¬ nalazku polega na formylawaniu zwiazku o wzo¬ rze 4, w którym R8 i R4 maja wyzej podane zna¬ czenie, a nastepnie na selektywnej hydrolizie otrzymanego zwiazku w celu usuniecia grupy for- myl owej przy grupie aminowej w pozycji 1, bez naruszenia grupy formylowej w pozycji 3.Wytwarzanie odpowiednich pochodnych acylo- wych kanamycyny majacych w grupach amino¬ wych w pozycjach 3" i 6' w kanamycynie \ i oprócz tego w grupie aminowej w pozycji 2' w kanamycynie B podstawniki w postaci grup alka- nokarbonylewych o 2—4 atomach wegla lub w postaci grupy benzoilowej, jest znane z belgij- 114 720114 720 skiego opisu patentowego nr 853 564. W opisie tym podano np. wytwarzanie 3", 6'-dwu-N-acetylokana- mycyny A droga selektywnej mUgracji grupy ace- tylowej od atomu tlenu do atomu azotu. Inne po¬ chodne mozna wytwarzac w podobny sposób.Reakcje formylowania mozna prowadzic rózny¬ mi, znanymi sposobami, np. stosujac mieszanine bezwodnika kwasu mrówkowego z bezwodnikiem kwasu octowego, ale zgodnie z wynalazkiem ko¬ rzystnie jest stosowac mrówczan 4-nitrofenylu. Od¬ powiednimi rozpuszczalnikami w tej reakcji sa wodne roztwory dioksanu lub czterowodorofuranu albo dwumetyloforamid. Reakcje prowadzi sie do¬ dajac nadmiar, np. trzykrotny, mrówczanu 4-nitro¬ fenylu porcjami do pochodnej kanamycyny. Re- ,aikcji tej sprzyja dodatek zasady i mozna do tego celu stosowac zasade organiczna, np. trójetyloami- ne, dodajac korzystnie co najmniej jeden równo¬ waznik zasady na kazda zdalna do reakcji grupe aminowa. Jleaftcja formylowania zwykle dobiega "konca w ciagu 24 godzin w temperaturze pokojo¬ wej, po. czym mozna wyosobniac produkt znany¬ mi sposobami, np. przez odparowanie rozpuszczal¬ nika lub stracenie i w razie potrzeby1 mozna pro¬ dukt oczyszczac dalej.Etap selektywnej hydrolizy prowadzi sie roz¬ puszczajac produkt 1,3-dwu-N-farniylowy w wo¬ dzie lub w uwodnionym rozpuszczalniku organicz¬ nym, np. takim jak dioksan lub czterowodorofuran i doprowadzajac starannie wartosc pH roztworu do 12,0—12,5 za pomoca alkalii, np. rozcienczone¬ go wodorotlenku sodowego albo potasowego. Roz¬ twór miesza sie w pokojowej temperaturze w cia¬ gu kilku dni sledzac przebieg reakcji za pomo¬ ca chromatografii cienkowarstwowej az do chwili zakonczenia sie przemiany w zadana pochodna 3-N-formylowa o wzorze 2. Nastepnie roztwór zo¬ bojetnia sie kwasem lub korzystnie za pomoca zywicznego wymieniacza jonowego z jonem wodo¬ rowym. Ma to te zalete, ze nie powoduje nagro¬ madzania sie substancji nieorganicznych w roz¬ tworze oraz te, ze ewentualnie wystepujacy pro¬ dukt uboczny, w którym obie grupy formylowe w pozycjach 1 i 3 zostaly odszczepione, ulega wchlonieciu przez zywice* Produkt wyosobnia sie ostatecznie znanymi sposobami, np. przez odparo¬ wanie do malej objetosci i wytracenie organicz¬ nym rozpuszczalnikiem, np. izopropanolem. Dalsze oczyszczanie moze byc prowadzone na drodze chro¬ matograficznej, ale zazwyczaj produkt jest dosta¬ tecznie czysty i moze byc bezposrednio stosowany do wytwarzania zwiazków o wzorze 1.Stosujac jako produkt wyjsciowy 3", 6'-dwu-N- -acetylokanamycyne w opisany wyzej sposób otrzymuje sie zwiazki o wzorze 2, w którym Ra oznacza grupe acetylowa i R4 oznacza grupe hy¬ droksylowa, a podobnie z 2', 3", 6'-trój-N-acetylo- kanamycyny B mozna wytwarzac zwiazki o wzo¬ rze 2, w którym R4 oznacza grupe o wzorze -NHR1, w którym R1 oznacza grupe acytylowa.Wynalazek zilustrowano w nastepujacych przy¬ kladach.Wspomniana w przykladach analize metoda chromatografii cienkowarstwowej przy uzyciu plytek krzemionkowych i okreslonego kazdorazowo ukladu rozpuszczalników. Plamy uwodornia sie pa wysuszeniu plytek \ zroszeniu ich 5% roztworem podchlorynu III-rzed. butylu w cykloheksanie, a nastepnie wysuszeniu w przewietrzanej suszarce 5 w temperaturze 1ÓÓ°C w ciagu 10 minut, ochlo¬ dzeniu i zroszeniu roztworem skrobia-jodek pota¬ sowy.Próby metoda cienkowarstwowej elektroforozy prowadzi sie na plytkach krzemionkowych o wy- ia miarach 20 cm, przy róznicy potencjalu 900 wolt stosowanej w ciagu 45 minut. Jako elektrolit sto¬ suje sie mieszanine kwasoi mrówkowego z kwa¬ sem octowym, która daje wartosc pH 2, a wy¬ krywanie prowadzi sie jak opisano Wyzej. 15 Przyklad I. Wytwarzanie 3", 6'^dwu-N-ace- tylo-3-N-formylokamycyny A.(A). 6,88 g mrówczanu 4-nitrofenylu dodaje sie porcjami w ciagu 45 minut do zawiesiny 3,9 g 3", 6'-dwu-N-acetylokanamycyny A w 21 ml wody i ..jq r. .21 ml czterowodorofuranu z dodatkiem 6,91 g trój- etyloaminy, po czym miesza sie w pokojowej tem¬ peraturze w ciagu nocy i nastepnie odparowuje do malej objetosci, zastepujac ostatecznie slady wody izopropanolem przez azostropowa destylacje j5 (ostateczna objetosc 35 ml). Z roztworu odsacza sie wytracony osad, który suszy sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem w temperaturze 50°C, otrzymujac 2,41 g 3", 6'-dwu-N-acetylo-l,3-dwu-N-formyloka- namycyny A.^ Przy badaniu metoda cienkowarstwowej elektro¬ forozy (wartosc pH = 2) produkt daje wartosc 0,09 odpowiadajaca kanamycynie. Wartosc R7 ustalona metoda chromatografii cienkowarstwowej przy uzyciu jako rozpuszczalnika mieszaniny metanol — 35 octan etylu — amoniak — woda (40 : 40 :1 : 30 wynosi 0,42. Protonowe widmo magnetycznego rezo¬ nansu jadrowego wykazuje sygnaly przy = 7,96 ppm (proton formylowy), 8,02 ppm (proton formylowy) i 2,02 ppm (6 protonów acetylowych). 40 (B)i 2,4 g produktu otrzymanego w sposób opi¬ sany w ustepie (A) rozpuszcza sie w 72 ml wody, alkalizuje do wartosci ph 12,0—12,5 za pomoca 2.0 ml 2n roztworu wodorotlenku sodowego i mie¬ sza sie w pokojowej temperaturze w ciagu 7 dni. 45 utrzymujac wartosc ph 12,0—12,5. Nastepnie zo¬ bojetnia sie roztwór dodajac 10 ml zywicznego wy¬ mieniacza jonowego Amberlite I R 120 (postac H+), odsacza zywice i przesacz steza do malej objetos¬ ci, usuwajac slady wody przez wypieranie ich dro- M ga utrzymywania w stanie wrzenia z dodatkiem 5 ml dwumetyloforamidu. Do otrzymanego roz¬ tworu w dwumetyloforamidzie dodaje sie powoli 30 ml izopropanolu, odsacza osad i suszy go pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 40°C, w otrzymujac 1,75 g 3", 6'-dwu^N-acetylo-3-N-foTmy- lokanamycyny A.Otrzymany zwiazek stosuje sie bez oczyszczania do dalszego procesu, a próbke jego oczyszcza sie chromatograficznie na zywicy CN Sophadex C 25 so (postac NH+), stosujac jako eluent 0,1 m roztwór wodorotlenku amonowego. Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego C18 potwierdza w pelni budo¬ we zwiazku, który zawiera tylko jedna grupe for- mylowa przy grupie aminowej w pozycji 3. Elek- C5 troforaza cienkowarstwowa (wartosc pH 2) "daje114720 Wartosc 0,43 vdda kanamycyny A. Analiza metoda chroariotografii cienkowarstwowej przy uzyciu jako elementu mieszaniny metanol-octan etylu-amoniak- -woda (40 : 40 :1 : 30) daje wartosc Rf = 0,23.Przyklad II. Wytwarzanie 2', 3", 6'-trój-N- -acetylo-3-N-formylokanamycyny A.(A). 128 g chloromrówczanu benzylu dodaje sie w ciagu 10 minut do roztworu 80,3 g siarczanu kanamycyny B i 76 g weglanu sodowego w 400 ml wody i miesza roztwór w temperaturze pokojowej w ciagu 1 godziny, po czym odsacza osad, prze¬ mywa go woda, rozcienczonym kwasem solnym i woda, a nastepnie" suszy, otrzymujac 165,7 g pie- cio-N-benzyloksykarbonylokamycyny B.(B). 230,1 g piecio-N-benzyloksykarbonylokana- mycyny B dodaje sie porajami, mieszajac, w cia¬ gu 15 minut do roztworu 189 ml bezwodnika oc¬ towego w 346 ml pirydyny i 346 ml dwuchloro- meitanu i miesza zawiesine w pokojowej tempe¬ raturze w ciagu 48 godzin. Otrzymany roztwór wlewa sie do mieszaniny 1,5 litra dwuoblórometa- nu z 2,3 litrami wody, oddziela warstwe orga¬ niczna, plucze ja rozcienczonym kwasem solnym (wartosc pH 4) i woda, po czym odparowuje roz¬ puszczalnik do objetosci 0,75 litra i wlewa roztwór do 4 litrów eteru dwuetylowego. Wytracony osad odsacza, sie i suszy pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 244,8 g (92,8% wydajnosci teoretycz¬ nej) cztero-0-acetyIo-pieGio-N4enizyloksykarbonylo- kanamycyny B.(C). Roztwór 33,0 g cztero-0-acetytó-piecio-N-ben- zyloksykarbonyloikanamycyny B w 132 ml cztero- wodoirofuranu, 66 ml wody i 3,3 ml uwodornia sie na 3,3 g 5% palladu na weglu drzewnym w ciagu 7 godzin w temperaturze 50°C i pod cisnieniem 3,5 atm, po czym odsacza sie katalizator i prze¬ sacz steza do objetosci 25 ml. Do pozostalosci do¬ daje sie 81,5 ml 7 n roztwraru wodorotlenku -amo¬ nowego i miesza w ciagu nocy w temperaturze po¬ kojowej, po czym odparowuje do sucha i chroma- tografuje na* kolumnie z 2 litrów zywicznego wy¬ mieniacza jonowego.Amiberliito CC-50 (postac NH4+) eluujac woda i nastepnie 0,01 ml roztworem wodnym amoniaku.Glówne frakcje laczy sie i odparowuje do sucha otrzymujac 9,37 g (61,6% wydajnoscr teoretycznej) 2', 3", 6'-trój-N-acetylokanamycyny B, topniejacej z objawami rozkladu w temperaturze 191—198°C; Vmax(Kbr) 1650, 1550 cm-1, Rf = 0,ll metanol — eter dwuetylowy — woda — 0,880 wodny amoniak (6:3:1:2) i R£ = 0,11 metanol — octan etylu — woda — 0,880 wodny amoniak (40 : 40 : 30 :1).(D). 153,1 g mrówczanu p-nitrofanylu dodaje sie porcjami w ciagu 40 minut do ochlodzonego roz¬ tworu 93 g 2', 3", 6'-tiró|j-N-acetylikanamycyny B w mieszaninie 465 ml wody z 558 ml czterowodo- rofuranu i 134 g trójetyloaminy, po czym miesza sie w temperaturze pokojowej w wciagu nocy i na¬ stepnie odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do malej objetosci. Stezony roztwór wodny roz¬ ciencza sie izopropanolem wytracajac produkt, po czym reszte wody usuwa sie przez azostropowa de¬ stylacje z izopropanolem i produkt odsacza, prze¬ mywa go izopropanolem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 89,2 g 2', 3", 6'-trój-N-ace- tylo-l,3-dwu-N-formylokanamycyny B, topniejacej z objawami rozkladu w temperaturze 310—318°C; Vmax (HBr) 1665, 1545 om-1, Rf = 0,49 metanol — eter dwuetylowy — woda — 0,880 wodny amo- 5 niak <6 : 3 :1 : 2) i Rf = 0,54 metanol — x)ctan ety¬ lu — woda — 0,880 wodny amoniak (40 : 40 : 30 :1).(E). Roztwór 86,9 g 2', 3", 6'-trój-N-acetylo-l,3- -dwu-N-formyiokanamycyny B w 2,61 litra wody alkalizuje sie 10 n roztworem wodorotlenku sodo- 1D wego do wartosci ph 12—12,5 i utrzymuje w po¬ kojowej temperaturze w ciagu 4 dni, dodajac w razie potrzeby wodorotlenku sodowego tak, aby wartosc pH wynosila 12. Nastepnie zobojetnia sie roztwór dodajac zywicy Amlberlita I R 120 (po- 15 stac H+), po czym przesacza i przesacz chromato¬ grafuje na 5,5 litrach zywicznego wymieniacza ja¬ nowego Amberlito 200 (postac NH4+), eluujac woda i nastepnie 0,1 n rozfoworem wodorotlenku amonowe¬ go. Po od/parowaniu glównych frakcji otrzymuje 20 sie 55,4 g 2', 3", e^trój-N-acetylo-S-N-formyloka- namycyny B, topniejacej z objawami rozkladu w temperaturze 226-^268°C; Vma*(HiBr) 1665, 1555 cm—1, Rf = 0,49 metanol — octan etylu — woda — 0,880 wodny amoniak (40 : 40 : 30 :1). Bu- 25 dowe zwiazku potwierdza badanie widma magne¬ tycznego rezonansu jadrowego za pomoca spektro¬ fotometru C18. 30 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowej 6'-N-podstawionej 3-N-formylokanamycyny o ogólnym wzorze 2, w którym R8 oznacza grupe alkanokarbonylowa o 2—4 atomach -wegla lub grupe benzoilowa, a R4 35 oznacza grupe hydroksylowa lub grupe o wzorze -NHJR8, w którym R8 ma wyzej podane znacze¬ nie, znamienny tym, ze zwftazek o ogólnym wzo¬ rze 4, w którym R8 i R4 maja wyzej podane zna¬ czenie, formyluje sie a otrzymany produkt poddaje 40 selektywnej hydrolizie, usuwajac grupe formy- lowa z grupy aminowej w pozycji 1. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako zwiazek o wzorze 4 stosuje sie 3", 6'-dwu-N- -acetylokanamycyne A, otrzymujac jako zwiazek 45 o wzorze 2', 3", 6'-dwu-iN-acetylo-3-N-formylp*ana- mycyne A. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako zwiazek o wzorze 4, stosuje sie 2', 3", 6'-trój- -N-acetylokanamycyne B, otrzymujac jako zwia- 50 zek o wzorze 2", 3", ^-trój-N-acetylo-S-N-formy- lokanamycyne B. 4. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2 albo 3, zna¬ mienny tym, ze zwiazek o wzorze 4 formyluje sie mrówczanem 4-nitrofenylu. 55 5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze proces formylowania prowadzi sie w uwodnionym rozpuszczalniku organicznym i w obecnosci zasady. 6. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2 albo 3 zna¬ mienny tym, ze selektywna hydrolize prowadzi sie gQ rozcienczonym roztworem wodorotlenku sodowego lub potasowego. 7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze selektywna hydrolize prowadzi sie w srodowisku o wartosci pH 12,0—12,5.114 720 XHOU O^H^^-NHR1 lfoÓ CHWHFP Wzór 3 Mzórl OyNHR3 NHOCH Wzór 2 HO-W*** HO HO m PZGraf. Koszalin D-376 9U A-4 Cena 100 zl PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL