HU207338B

HU207338B - Process for producing izepamycin

Info

Publication number: HU207338B
Application number: HU906641A
Authority: HU
Inventors: Chou-Hong Tann; Tiruvettipuram Thiruvengadam; John Sze-Hung Chiu; Cesar Colon; Michael Green
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1989-06-21
Filing date: 1990-06-19
Publication date: 1993-03-29
Also published as: JPH04502474A; ES2100380T3; EP0405820B1; ES2063274T3; DE69030590T2; NO915071L; DE69008052D1; EP0547031A1; DK0405820T3; FI96955B; KR920701226A; ATE152094T1; AU5946390A; JP2500059B2; FI915953A0; RU2120444C1; WO1990015810A2; DE69008052T2; CA2062788A1; KR940003496B1

Description

A találmány tárgya új eljárás gentamicin B átalakítására izepamicinné - az (I) képletű vegyületté; 1-N-[(S)3-amino-2-hidroxi-propionil]-gentamicin B-vé - egy új formilezőszer, a 2-(formil-tio)-benzo-tiazol - az angol elnevezésből származó rövidítéssel: FMBTA - alkalmazásával.

Közelebbről meghatározva a találmány tárgya eljárás izepamicin előállítására, ami abból áll, hogy a gentamicin B-t 2-(formil-tio)-benzo-tiazollal 3,6’-di(Nformilj-vegyületté alakítjuk, majd az így kapott 3,6’di(N-formil)-gentamicin Β 1-helyzetű aminocsoportját valamilyen (S)-izoszerin-származékkal acilezzük, végül eltávolítjuk a védőcsoportokat olyan reakciókörülményeket alkalmazva, amely magas hozammal adja a kívánt tennéket.

Az (I) képletű izepamicin ismert, úgynevezett aminoglikozid antibiotikum, amelynek előállítását gentamicin B-ből a 4230847 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölték. Eszerint úgy járnak el, hogy a gentamicin B réz-nikkel/H/-só komplexet először N-[(benzil-oxi)-karbonil]-ftálimiddel reagáltatják, majd ezt követi az így kapott köztitermék reagáltatása N-{[(S)-3-{[(benzil-oxi)-karbonil]amino }-2-hidroxi-propionil]-oxi }-szukcinimiddel. A védő benzil-oxi-karbonil-csoportokat csontszenes palládiumkatalizátor jelenlétében, katalitikus hidrogénezéssel távolítják el a molekulából, aminek eredményeképpen a köztitermékre számítva 60%-os kitermeléssel kapják az izepamicint.

Tsuchiya és munkatársai [Tetrahedron Letters 51, 4951-4954 (1979)] leírtak egy soklépéses komplex eljárást a kanamycin A 3,3”6’-aminocsoportjainak a megvédésére, amelynek során először cink-acetáttal kelátot képeznek, majd 3- és 6’-helyzetben az aminocsoportokat benzil-oxi-karbonilezik, azután eltávolítják a cinket, karbonátot képeznek, végül trifluoracetilezik a 3’’-helyzetű aminocsoportot. Az így előállított 3,3”,6’-helyzetben védett kanamycin A-t ezt követően a szabad C-l aminocsoportján (S)-4-{[(benzil-oxi)-karbonil]-amino }-2-hidroxi-vajsav valamilyen aktív észterével acilezik, majd a szintézis a védőcsoportok két lépésben történő eltávolításával zárul, és az amikacin nevű antibiotikumot kapják. Leírják továbbá, hogy hasonló reakciók láncolatán keresztül alakítják át a dibekacint a megfelelő l-N-[(S)-4-amino-2-hidroxibutiril]-származékká. Semmiféle utalás nem történik azonban arra nézve, hogy ezt a szelektív acilezési eljárást más aminoglikozidok esetében alkalmazták volna.

A Tsuchiya és munkatársai által közölt eljárás meglehetősen nehézkesnek tűnik, hiszen magában foglalja a trifluor-acetil-, valamint a benzil-oxi-karbonil-csoportok védőcsoportként való bevitelét a molekulába, és ugyanezen védőcsoportok eltávolítása végett szükséges a terméket mind aminolízisnek, mind hidrogenolízisnek alávetni. Ezek a lépések üzleti szempontból az eljárást egyáltalán nem teszik vonzóvá, mivel a kivitelezés költségei, beleértve a szükséges beruházás tőkeigényét is, jelentősek.

Mindezeken felül, a magunk részéről - szemben a Tsuchiya és munkatársai által közölt eljárás alapján megengedhető következtetésekkel - azt tapasztaltuk, hogy a cink-acetáttal létrehozott kelátszerkezet nem vezet a kanamycintől és a dibekacintól eltérő aminoglikozidok esetében kizárólagosan a 3- és 6’helyzet szelektív blokkolásához. Teljesen váratlanul és meglepő módon ugyanis, a gentamicin B-ből cink-acetáttal kelátot képezve, majd ezt követően a köztiterméket formil-imidazollal acilezve, elsődleges termékként l,6’-N-diformilezett vegyületet, és nem 3,6’-diformilszármazékot kaptunk. Megismételve a cink-acetáttal képzett, kelátszerkezetű köztitermék acilezését különféle formilezőszerekkel, így hangyasav-ecetsav vegyes anhidriddel, a számunkra kívánatos 3,6’-di(N-formil)gentamicin B mellett jelentős mennyiségű acetilezett gentamicin B is keletkezett. Hogy a reakció kimenetelének kiszámíthatatlanságát aláhúzzuk, megemlítjük, hogy a (hangyasav-p-nitro-benzoesav)anhidrid nem bizonyult eléggé reaktívnak a gentamicin B cink-acetáttal képzett kelátjának formilezéséhez, ugyanakkor viszont a hangyasav-p-ánizssav vegyes anhidriddel a kívánt 3,6’-diformil-gentamicin B kiváló termeléssel volt előállítható, és szennyezésként csak egészen csekély mennyiségű anizoil-származékot tudtunk a termékben kimutatni.

Egyébként a fémacetátok, például a cink-acetát és hasonlók alkalmazása minden esetben kis mennyiségű nehezen eltávolítható, nemkívánatos szennyezések, például N-acetil-származékok keletkezéséhez vezet, és ez a kitermelés csökkenését eredményezi.

Az aminoglikozidok formilezését Thomas és munkatársai [Tetrahedron Letters 27,4981-4984 (1980)] az 1-N-alkilezett kanamycin előállításával kapcsolatban korábban már közölték. Thomas és munkatársai azonban nem szólnak arról, hogy a formilezést az 1-N-acilezett származékok előállításánál alkalmazták volna aminocsoport megvédésére, és ezen lehetőség felismerésének nyoma sincs az aminoglikozidokkal foglalkozó szakirodalomban máshol sem. Ehelyett az irodalomban például a trifluor-acetil-, a triklór-acetil- és a ftaloilcsoportot adják meg amino védőcsoportként, és azt állítják, hogy aminolízissel vagy hidrazinolízissel ezek a csoportok lehasíthatók anélkül, hogy a molekulában esetleg jelen lévő, bizonyos más N-acil-csoportokra a reakciónak lényeges kihatása lenne. Röviden összefoglalva, sehol nem találtunk példát arra vonatkozóan, hogy valaha is megkísérelték volna a 3- és 6’-helyzetben N-foimilezett 1-N-acil-aminoglikozidok formilcsoportját bázis jelenlétében vizes hidrolízissel szelektíven lehasítani.

Legújabban felfedeztünk egy új formilezőszert, a (II) képletű 2-(formil-tio)-benzo-tiazolt, amellyel a gentamicin B cinkkelátját reagáltatva szelektíven a 3és 6’-aminocsoportok formileződnek. Ezen túlmenően, a találmány szerinti eljárás nagyon jó kitermelést eredményez, ha valamely más cinksót, például cink-pivalátot alkalmazva elkerüljük a nemkívánatos melléktermékek keletkezését. Még továbbá azt találtuk, hogy a kapott 3,6’-di(N-formil)-gentamicin B, miután a cinket eltávolítottuk, N-formil-(S)-izoszerin valamely aktív észterével szelektíven acilezhető a C-l aminocsopor1

HU 207 338 B tón anélkül, hogy a C-3” helyzetű metil-amino-csoportot külön védenünk kellene, amint azt Tsuchiya és munkatársai teszik a saját eljárásuknál. Végül azt is felismertük, hogy jó kitermelést eredményező módon, bázis jelenlétében, vizes hidrolízissel az összes formilcsoportot eltávolíthatjuk a 3,6’-di(N-formil)-l-N-[Nformil-(S)-izoszeril]-gentamicin B molekulából anélkül, hogy az izoszerint magában foglaló oldalláncot károsodás érné.

A fentiek alapján tehát a találmány tárgya javított, magas hozamú eljárás a gentamicin B izepamicinné való átalakítására. Ez az eljárás a következő lépésekből áll:

i) a gentamicin B-ből előbb kelátot képezünk, majd azt a formilcsoport szelektív bevitelére alkalmas 2(formil-tio)-benzo-tiazollal reagáltatjuk, aminek eredményeképpen 3,6’-di(N-formil)-gentamicin B keletkezik;

ii) a 3,6’-di(N-formil)-gentamicin B 1-helyzetű aminocsoportját N-acil-védett (S)-izoszerin valamely aktivált származékával acilezzük;

iii) eltávolítjuk az összes védőcsoportot; és iv) elkülönítjük az izepamicint.

Az átalakítás kulcsfontosságú köztiterméke tehát a 3,6’-di(N-formil)-gentamicin B, amelyet úgy állítunk elő, hogy a gentamicin B valamely fémsóval képzett komplexét 2-(formil-tio)-benzo-tiazollal reagáltatjuk, ily módon védőcsoportként formilcsoportokat építve a molekula 3- és 6’-helyzetű aminocsoportjaira. A fémsó komplex előállítását illetően a 4136254 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban, valamint a Thomas és munkatársai [Tetrahedron Lettére 21, 4981-4984 (1980)] által megadottak szerint járunk el. A (III) képletű 3,6’-di(N-formil)-gentamicin B előállításának menetét az [A] reakcióvázlat mutatja.

A találmány szerinti eljárás kivitelezése során komplexképző reagensként átmeneti fémek kétértékű sóit, így réz/H/-, nikkel/H/-, kobalt/II/-, kadmium/II/és cink/II/-sókat, valamint ezek keverékeit alkalmazhatjuk. Kétértékű fémsók alatt itt szerves savakkal, előnyösen hangyasavval, ecetsavval, propionsavval, pivalinsavval és benzoesavval képzett sókat értünk. Előnyben részesítjük a pivalinsav cink/II/- és és kobalt/n/-sóit, ezek közül is különösen előnyös a cink/II/pivalát.

A gentamicin B kétértékű fémsó komplexét általában valamilyen inért szerves oldószerben képezzük. Előnyös szerves oldószerek például a dimetil-szulfoxid, az Ν,Ν-dimetil-formamid és N,N-dimetil-acetamid, a metilén-diklorid, a toluol, az etil-acetát és ezek elegyei.

Azt találtuk előnyösnek, ha a gentamicin B fémsó komplex előállítása során 1 mól gentamicin B-re mintegy 1,5-4,5 mól kétértékű fémsót, például cink/n/-sót veszünk. Kiváltképpen előnyös a reagensek mólarányát úgy megválasztani, hogy a gentamicin B minden móljára 2,7-3,5 mól kétértékű fémsó essék.

A gentamicin B fenti módon előállított sókomplexét ezt követően 2-(formil-tio)-benzo-tiazollal reagáltatjuk, aminek eredményeképpen a formilcsoport védőcsoportként ráépül mind a 3-, mind a 6’-helyzetű aminocsoportra. A 2-(formil-tio)-benzo-tiazol moláris mennyisége a gentamicin B sókomplexre számítva általában két-háromszoros, előnyösen a mólarány 2,5:1.

A gentamicin B sókomplex formilezését 0 és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 20-30 °C-on végezzük. Célszerű a formilezést valamilyen szerves oldószerben vagy szerves oldószerek elegyében végezni. Megfelelő szerves oldószerek a dipoláris aprotikus oldószerek, például a dimetil-szulfoxid, az Ν,Ν-dimetilformamid, az Ν,Ν-dimetil-acetamid és hasonlók. Ugyancsak előnyösnek találtuk egy dipoláris aprotikus szerves oldószer és valamilyen inért szerves oldószer, például toluol, etil-acetát, etilénglikol-dimetil-éter, tetrahidrofurán, acetonitril, metilén-diklorid és hasonlók elegyeit. Kedvelt oldószerelegy például a dimetilszulfoxid akár metilén-dikloriddal, akár etil-acetáttal kombinálva.

Míg az összes korábban ismert eljárásnál a kétértékű fémkationtól kicsapással - többnyire megfelelő reagenst alkalmazva - szabadítják meg a terméket, a találmány szerinti eljárás, azaz 2-(formil-tio)-benzo-tiazol és cink esetében extrakciós úton távolíthatjuk el a 2merkapto-benzo-tiazol cinksóját, amely a szerves fázisban marad.

A vizes rész tartalmazza a 3,6’-di(N-formil)-gentamicin B-t, a kitermelés hozzávetőlegesen 90-95%. A termék kinyerése és tisztítása a szokásos módon, például ioncserés kromatográfiával történhet.

Az (S)-izoszeril-csoport oldalláncként való ráépítését a 3,6’-di(N-formil)-gentamicin B 1-helyzetű aminocsoportjára a [B] reakcióvázlatnak megfelelően végezzük, azaz az aminocsoportján védett (S)-izoszerint valamilyen aktiváló reagens, például diciklohexilkarbodiimid jelenlétében „in situ” aktív észterré alakítjuk.

A találmány szerinti eljárás megvalósításához az aminocsoportban védett (S)-izoszerin-származékok közül elsősorban az acilcsoporttal védett vegyületek megfelelőek, éspedig olyan N-acil-származékok amelyek acilcsoportját könnyen - ugyanolyan körülmények között, mint a formilcsoportokat - eltávolíthatjuk a molekulából, és amelyek eltávolításakor érintetlenül maradnak a molekula más részei. Az eljárás kivitelezhetőségének szempontjából tehát azok az acilcsoportok vehetők számításba, amelyek enyhe bázikus körülmények között vagy hidrazinnal könnyen lehasíthatók. Az ismert védőcsoportok közül enyhe bázikus körülmények között lehasítható N-acil-csoport a formil-, a trikiőr-acetil és a trifluor-acetil-csoport, míg hidrazinnal könnyen eltávolítható N-acil-csoport például a ftaloilés a szukcinilcsoport.

Mindazonáltal az izoszerin-vegyület aminocsoportjának megvédésére a formilcsoportot tartjuk a legjobbnak.

A találmány szerinti eljáráshoz az aminocsoportban védett izoszerin-származékok közül a fentiek értelmében az N-formil-(S)-izoszerin, az N-ftaloil-(S)-izoszerin, az N-(triklór-acetil)-(S)-izoszerin és az N-(trifluoracetil)-(S)-izoszerin a leginkább megfelelőek, és külö3

HU 207 338 Β nősen előnyösnek ítéljük az N-formil-(S)-izoszerint. Az aminocsoportban védett (S)-izoszerin aktív észterét úgy állítjuk elő, hogy valamilyen kondenzálószer, így diciklohexil-karbodiimid jelenlétében például N-hidroxi-benzo-triazollal, N-hidroxi-szukcinimiddel, imidazollal, N-hidroxi-ftálimiddel, N-hidroxi-5-norbomán2,3-d.ikarboximiddel vagy hasonlókkal reagáltatjuk a megfelelő izoszerin-származékot.

A 3,6’-di(N-formil)-gentamicin B reagáltatását a megfelelő N-acil-(S)-izoszerinnel 0 és 40 °C közötti, előnyösen szobahőmérsékleten vagy ahhoz közeli hőmérsékleten, valamilyen alkalmas oldószerben végezzük, Az oldószerre példaként említhetjük a protikus szerves oldószereket, ezek közül is az alkoholokat, így a metanolt, etanolt, propánok és hasonlókat; víz és valamilyen alkohol elegyét, így a vizes metanolt, a vizes etanolt és ezekhez hasonló elegyeket; megfelelő oldószerek lehetnek továbbá az aprotikus oldószerek, így az Ν,Ν-dimetil-formamid, a dioxán és a metilén-diklorid; legelőnyösebbnek mégis a metanolt tartjuk.

A fenti módon eljárva 3,6’-di(N-formil)-gentamicin B-ből és N-formil-izoszerinből a (IV) képletű triformilizepamicin keletkezik. A molekulából a védőcsoportokat 2 M nátrium-hidroxiddal szobahőmérsékleten kivitelezett hidrolízis révén távolítjuk el, ezt megelőzően azonban a reakcióelegyet megszabadítjuk az oldószertől. Bár a védőcsoportok lehasítása hidrolízis útján teljesen szokványos eljárás, az a specifikusság, amelynek következtében csak a formilcsoportok hasadnak le, és az oldalláncként beépült izoszerilcsoport sértetlen marad, példa nélkül áll az aminoglikozidok kémiájában. Azt találtuk ugyanis, hogy ha a hidrolízist szobahőmérsékleten, éjszakán át folytatott keverés mellett végezzük, egészen kiváló, mintegy 88-90%-os kitermeléssel kapjuk a kívánt terméket. A kapott hidrolizátum pH-ját ezután savval 6-osra állítjuk, és elkülönítjük az izepamicint.

Az alábbiakban a találmány szerinti eljárás előnyös kiviteli módjait példákon mutatjuk be, azonban fontos tudni, hogy ezek semmiképpen nem lehetnek korlátozó érvényűek az oltalmi körre nézve. Hasonló kiviteli módok a köteles tudással bíró szakemberek számára ezen leírás olvastán teljesen nyilvánvalók, és nyilvánvaló az is, hogy ezek a kiviteli megoldások részét képezik a találmánynak.

A példaként megadott előiratokban a nagynyomású folyadékkromatográfiát az angol névből származó, általánosan elterjedt rövidítéssel HPLC-ként említjük. Az Amberlit IRC-50 gyenge kationcserélő gyantát a Rohm and Haas Company szállította.

I. példa

2-(Formil-tio)-benzo-tiazol előállítása

Egy 500 ml-es, háromnyakú, száraz gömblombikba bemérünk 80 ml acetonitrilt, 5,0 ml (0,133 mól) hangyasavat és 18,1 g (0,266 mól) nátrium-formiátot. A kapott szuszpenziót lehűtjük 0-5 °C-ra, és lassú ütemben beadagolunk 14,6 ml (0,2 mól) acetil-kloridot, miközben a reakcióelegy hőmérsékletét 8 °C alatt tartjuk. Az acetil-klorid hozzáadását követően hagyjuk az elegyet 18-20 °C-ig felmelegedni, és 'H-NMR-spektrum alapján állapítjuk meg a reakció teljessé válását. Az (ecetsav-hangyasav)-anhidridet tartalmazó heterogén reakcióelegyhez 60 ml acetonitrilt és 20 g (0,103 mól) 2-merkapto-benzo-tiazolt adunk, ezután hagyjuk az elegyet 32 °C-ra melegedni, és ezen a hőmérsékleten tartjuk, miközben tízperces időközökben vett minta HPLC analízisével követjük a reakció előrehaladását. A reakciót akkor tekintjük teljesnek, amikor a görbe alatti területből számolva a 2-merkapto-benzo-tiazolnak hozzávetőlegesen 4%-a marad elreagálatlan, illetve ha a termék bomlása következtében a 2-merkapto-benzo-tiazolnak megfelelő csúcs alatti terület növekedni kezd.

A reakcióelegyet ekkor 200 ml jeges vízzel megbontjuk, 2 percig keverjük, majd a kicsapódott anyagot szűrjük, négyszer 150 ml vízzel alaposan kimossuk, végül vákuumban addig szárítjuk, amíg a víztartalma 0,08% alá csökken. Az így kapott 21,4 g 2-(formil-tio)benzo-tiazol 125-130 °C-on bomlás közben olvad, HPLC analízis alapján 98%-os tisztaságú, a kitermelés 89%.

A termék *H-NMR-spektruma (CDC1₃, δ): 7,36-7,44 (m, 3H); 8,45-8,52 (m, IH); 9,92 (s, IH).

2. példa

Cink-pivalát előállítása

250 ml vizet felmelegítünk 60-70 °C-ra, hozzáadunk 56,1 (0,55 mól) pivalinsavat, majd 10-15 perc alatt, részletekben beadagolunk 31,25 g (0,25 mól) cink-karbonátot, és az elegy hőmérsékletét 96-98 °Cra emeljük. Egyórányi keverés után lehűtjük a rekcióelegyet 4 °C-ra, jégfürdőben tartjuk 30 percig, majd a keletkezett szuszpenziót szűrjük, és a szűrőn maradt anyagot egyszer 75 ml jeges vízzel, azután háromszor 50 ml hideg acetonnal mossuk. 16 órán át, 60 °C-on, légáramlásos szárítószekrényben megszárítva a terméket, ilyen módon 58 g cink-pivalátot kapunk.

3. példa

3,6’-Di(N-formil)-gentamicin B előállítása

285 ml dimetil-szulfoxid és 285 ml metilén-diklorid elegyéhez 34,0 g (127 mmól) cink-pivalátot és 19 g gentamicin B-t (93,1%-os tisztaságú; 36,7 mmól) adunk. A szuszpenziót 10-15 percig szobahőmérsékleten keverjük, amíg oldattá alakul, majd 16,0 g (81,9 mmól) 2-(formil-tio)-benzo-tiazolt adunk hozzá. Öt perc múlva az elegyből mintát veszünk, és folyadékkromatográfiás analízissel megállapítjuk a monoformil-, illetve diformilvegyülethez tartozó csúcsok arányát. Még kétszer adunk kis mennyiségű reagenst az elegyhez, így a reakcióba bevitt 2-(formil-tio)benzo-tiazol teljes mennyisége 16,95 g (86,8 mmól), amikor is a csúcsok arányszámából (0,02) a reakciót befejezettnek tekinthetjük.

A reakcióelegyet átvisszük egy kétliteres választótölcsérbe, 800 ml vízzel összerázzuk, majd elválasztjuk a fázisokat, és a vizes részt még 30 ml metilén-dikloriddal extraháljuk. A vizes oldatot a lebegő szilárd részek eltávolítása végett Celit-rétegen megszűrjük,

HU 207 338 Β majd vízzel 2 liter végső térfogatra hígítjuk a szűrletet, amelynek a pH-ja most 6 körül van. Ezt a vizes oldatot ezután felvisszük egy 800 ml-es előzőleg részlegesen ammónium-ciklusba hozott, Amberlit IRC-50 gyantával töltött oszlopra, és a terméket 0,75 M ammóniumhidroxid-oldattal eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és betöményítjük, majd az így kapott oldatnak folyadékkromatográfiás analízissel meghatározzuk a tartalmát Az oldat a mérés alapján 17,9 g (90,5%) 3,6’-di(N-formil)-gentamicin B-t tartalmaz. Tömegspektrum (FAB/GLY-THIO): m/e (%) 539 (100, M⁺ + 1); 511 (9); 380 (9); 350 (4); 191 (10); 190 (5); 160 (28).

'H-NMR-spektrum (400 MHz, D₂O, pH-9, δ): 1,25 (s, 3H, C-4”-CH₃); 2,57 (s, 3H, N-CH₃); 5,11 (d, J=4,02 Hz, IH, anomer); 5,38 (d, J-4,02 Hz, IH, anomer); 8,15 (s, IH, N-CHO); 8,16 (s, IH, NCHO).

¹³C-NMR-spektrum (100 MHz, D₂O, pH-9, δ): 51,36 (C-1); 47,8 (C-3); 38,96 (C-6’); 64,5 (C-3”); 37,01 (N-CH₃); 22,22 (C-4”-CH₃); 165,47 (NCHO); 164,76 (N-CHO).

4. példa

N,O-Diformil-(Sfizoszerin előállítása Egyliteres gömblombikba bemérünk 50 g (0,476 mól) (S)-izoszerint és 62,5 ml hangyasavat, majd 0-5 °C-on, mintegy 30 perc alatt beadagolunk 5 ekvivalens frissen készült (ecetsav-hangyasav)anhidrid-oldatot*. Miután 'H-NMR-spektrometirás vizsgálattal meggyőződtünk arról, hogy a reakció teljessé vált - ehhez mintegy 2 óra szükséges -, a reakcióelegyet vákuumban, 40 °C-on az eredeti térfogatának felére betöményítjük, és lassú ütemben, állandó hűtés mellett 250 ml izopropil-alkoholt adva a maradékhoz megindítjuk a kristályosodást. A keletkezett szuszpenziót 1 óra hosszáig 0 °C-on keverjük, majd a terméket szűrjük és izopropil-alkohollal mossuk. Az így kapott N,Odiformil-(S)-izoszerin tömege 64 g, az olvadáspontja 139,5-141,5 °C, a kitermelés 84%.

[a]§=-38° (1%; metanol).

Ή-NMR-spektrum (D₂O, δ): 3,8 (dd, IH, J-14,6;

4,4 Hz); 3,91 (dd, IH, J-14,6; 5,5 Hz); 5,38 (dd, IH, J=5,5; 4,4 Hz); 8,15 (s, IH); 8,27 (s, IH).

Az (ecetsav-hangyasav)anhidridet úgy állítjuk elő, hogy vízmentes mikronizált nátrium-formiát és vízmentes acetonitril elegyéhez (a nátrium-formiát aránya az 50%-ot is elérheti) 0-5 ’C-on 1,2 ekvivalens acetil-kloridot adunk. A reakció hozzávetőlegesen 2 óra alatt teljessé válik, ekkor a csapadékot kiszűrjük, és a szűrletet a fent leírtak szerint használjuk fel. A hőmérséklettől függően előfordulhat, hogy némi szén-monoxid távozik a reakcióelegyből. Megfigyelésünk szerint 0 ’C-on egy hónapig az oldat elfogadhatóan stabil.

5. példa

N-Ftaloil-(S)-izoszerin előállítása

Toluol és Ν,Ν-dimetil-formamid 3:1 arányú elegyéhez (600 ml) 15,75 g (150 mmól) (S)-izoszerint és 22,2 g (150 mmól) ftálsavanhidridet adunk. Az így kapott szuszpenziót keverjük, hozzáadunk 2,1 ml (15 mmól) trietil-amint, majd forrásig melegítjük, és a keletkező vizet egy Dean-Stark-féle vízleválasztó feltéttel eltávolítjuk a rendszerből.

Kétórányi reakcióidő után már nem válik el víz a feltétben. Ekkor az elegyet hozzávetőlegesen 100 mire bepároljuk, lehűtjük, jeges vízzel meghígítjuk és 2 M sósavval megsavanyítjuk, aminek következtében csapadék válik ki. A terméket szűrjük, jeges vízzel mossuk, és vákuumban megszárítjuk. Az így kapott N-ftaloil-(S)-izoszerin tömege 30,4 g (86%), az olvadáspontja 227-228 °C.

[a]g-+10° (c-1; Ν,Ν-dimetil-formamid). 'H-NMR-spektrum (DMSO-d_ő, δ): 3,76 (dd, IH,

J-13,46; 7,69 Hz); 3,84 (dd, IH, J= 13,46;

5,77 Hz); 4,3 (dd, IH, J-7,69; 5,77 Hz); 7,77-7,89 (m,4H).

6. példa

N-(Trifluor-acetil)-(S)-izoszerin előállítása ml (1 ekvivalens), 24,8 tömegszázalékos metanolos nátrium-metilát-oldathoz keverés közben 5 g (S)izoszerint adunk. Szobahőmérsékleten folytatjuk a keverést még 15 percig, amíg homogén oldatot kapunk, majd 7 ml (1,25 ekvivalens) etil-(trifluor-acetát)-ot adunk az elegyhez, azután újabb 30 percig keverjük. Ha az 'H-NMR-spektrum azt mutatja, hogy a reakció teljessé vált, az elegyet vákuumban a lehető legkisebb térfogatra bepároljuk, a maradékot felvesszük etil-acetátban, 0 és 5 °C közötti hőmérsékletre hűtjük, előbb 25 ml (1 ekvivalens) 2 M sósavat, majd 5 g szilárd nátrium-kloridot adunk hozzá, és a szerves fázist elválasztjuk. A vizes részt extraháljuk 50 ml etil-acetáttal, majd az egyesített szerves fázist 5 g vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, és vákuumban 20 ml-re betöményítjük. A maradékot jégfürdőbe helyezzük, és keverés közben, 30 perc alatt 50 ml heptánt adunk hozzá. A terméket szűrjük és szárítjuk, aminek eredményeképpen 8,86 g (93%) 142-143 °C olvadáspontú N-(trifluor-acetil)-(S)-izoszerint kapunk.

[a]g-+12,4° (c-1; víz).

'H-NMR-spektrum (D₂O, δ): 3,78 (d, 2H, J=5,48 Hz);

4,53 (t, IH, J=5,48 Hz).

7. példa

Izepamicin előállítása

Az alábbiakban különböző eljárásokat adunk meg az izepamicin előállítására:

A eljárás:

N-Formil-(S)-izoszerinből törzsoldatot készítünk oly módon, hogy 20 g (124,2 mmól) N,0-diformil(S)-izoszerint 85 ml metanol és 15 ml (1,5 ekvivalens) piridin elegyében szobahőmérsékleten hagyunk keveredni 14-16 óra hosszat. A reakció teljessé válását 'H-NMR-spektrum alapján állapítjuk meg. Egy másik lombikba bemérünk 20 g 4,424 g (8,2 mmól) hatóanyagot tartalmazó 3,6’-diformil-gentamicin B vizes sűrítményt és 1,26 g (8,26 mmól) 1-hidroxibenzo-triazol-monohidrátot, majd az egészet feloldjuk 40 ml metanolban.

HU 207 338 Β

Ezután keverés közben mintegy 40 perc alatt egyidejűleg beadagolunk 22,2 ml (24,4 mmól; 3 ekvivalens) fenti, metanolos N-formiI-(S)-izoszerin-oldatot és 5 g (24,3 mmól; 3 ekvivalens) diciklohexil-karbodiimidet 20 ml metanolban oldva. A beadagolást követően az elegyet 15 percig keverjük, miközben vagy HPLC analízissel, vagy vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel követjük a reakció előrehaladását, majd az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. A visszamaradó termék a triformil-izepamicin, amelyet 90 ml 2 M nátrium-hidroxid-oldatban szobahőmérsékleten 16 órán át kevertetve elhidrolizálunk. A reakcióelegy pH-ját ezután savval 6-ra állítjuk, szűr?¹;, és a szűrlet térfogatát pontosan 1000 mire beállítjuk,belső standarddal végzett HPLC analízis azt mutatja, hogy az oldat 4,17 g (7,3 mmól) izepamicint tartalmaz, azaz a kitermelés 89%.

B eljárás:

ml metanolban feloldunk 1,156 g (2,07 mmól) 96,6%-os tisztaságú 3,6’-di(N-formil)-gentamicin B-t, 800 mg (1,7 ekvivalens) N-ftaloil-(S)-izoszerint és 365 mg (1,2 ekvivalens) l-hidroxi-benzo-triazol-monohidrátot. Az oldathoz 700 mg (1,7 ekvivalens) diciklohexil-karbodiimidet adunk, 1 óra hosszáig szobahőmérsékleten keverjük, majd még 160 mg N-ftaloil-(S)izoszerint és 140 mg diciklohexil-karbodiimidet adunk az elegyhez, és folytatjuk a kevertetést szobahőmérsékleten mintegy 3 órán át. A reakció előrehaladását vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal követjük, és a megfelelő időpontban az elegyet bepároljuk, majd a maradékot felvesszük 50 ml etanol és 5 ml víz elegyében. A védőcsoportok eltávolítása végett ezután 6,0 ml 85%-os hidrazin-hidrátot adunk a reakcióelegyhez, és nitrogén-gáz alatt 85-90 °C-on tartjuk 14 óra hosszáig. Belső standard mellett HPLC módszerrel meghatározva a keletkezett izepamicin mennyiségét, azt 1,05 gnak (1,85 mmól) találtuk, a kitermelés 89%.

C eljárás:

45,9 g, 8,45 g (15,7 mmól) hatóanyagot tartalmazó 3,6’-di(N-formil)-gentamicin B vizes sűrítményhez

2,4 g (15,7 mmól) 1-hidroxi-benzol-triazol-monohidrátot és 80 ml metanolt adunk. Az elegyet keverjük, és mintegy 40 perc alatt egyidejűleg beadagolunk 5 g (47,3 mmól; 3 ekvivalens) N-(trifluor-acetil)-(S)-izoszerint, valamint 9,7 g (47,1 mmól; 3 ekvivalens) diciklohexil-karbodiimidet, mindkettőt 40-40 ml metanolban oldva. Az adagolás befejeztével az elegyet még 15 percig keverjük, és a reakció előrehaladását HPLC analízissel vagy vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal követjük. A reagáltatást követően az oldószert vákuumban elpárologtatjuk, és a terméket 170 ml 2 M nátrium-hidroxid-oldatban 16 órán át szobahőmérsékleten kevertetve elhidrolizáljuk. Az elegy pH-ját savval 6-ra állítjuk, majd megszűrjük az elegyet, és a szűrletet pontosan 1000 ml térfogatra hígítjuk. Belső standardot alkalmazva HPLC analízissel meghatározzuk az oldatban az izepamicin mennyiségét - 7,84 g (13,8 mmól) -, amelynek alapján a kitermelés 88%.

Claims

1. Eljárás izepamicin előállítására, azzal jellemezve, hogy

i) a gentamicin B valamilyen kétértékű fémsó komplexét 2-(formil-tio)-benzo-tiazollal reagáltatjuk, miáltal a 3- és 6’-helyzetű aminocsoportokon szelektíven védett 3,6’-di(N-fonnil)-gentamicin B keletkezik;

ii) a 3,6’-di(N-formil)-gentamicin Β 1-helyzetű aminocsoportját valamely az aminocsoportján védett (S)-izoszerin-származékkal acilezzük;

iii) eltávolítjuk az összes védőcsoportot a molekulából; és iv) ismert módon elkülönítjük az izepamicint.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gentamicin B kétértékű fémsó komplexeként kobalt/II) vagy cink/IP-vegyületet reagáltatunk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a komplexképző fémsó cink-pivalát.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy a kétértékű fémsó komplex képzésénél 1 mól gentamicin B-re számítva mintegy 1,5—

4,5 mól cink/IP-sót használunk.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2-(formil-tio)-benzo-tiazol moláris mennyisége a gentamicin B sókomplexre vonatkoztatva két-háromszoros, előnyösen a mólarány 2,5:1.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aminocsoportján védett (S)izoszerin-származékként a b) lépésben N-formil-(S)izoszerint, N-ftaloil-(S)-izoszerint vagy N-(trifluoracetil)-(S)-izoszerint reagáltatunk.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépés kivitelezése során az aminocsoportján védett (S)-izoszerint „in situ” aktív észterré alakítjuk.

8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépés kivitelezése során az aminocsoportján védett (S)-izoszerint diciklohexil-karbodiimid jelenlétében alakítjuk át reaktív származékká.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reaktív származékot reagensként N-hidroxibenzo-triazolból, imidazolból, N-hidroxi-szukcinimidből, N-hidroxi-ftálimidből vagy N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximidből állítjuk elő.

10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a védőcsoportokat lúgos hidrolízissel távolítjuk el a molekulából.

HU 207 338 Β Int. Cl.⁵: C 07 H 15/236 (I)

SCHO (IV a)

HU 207 338 Β Int.Cl.⁵: C 07 Η 15/236