DE60315296T2

DE60315296T2 - Zell-selektives Abgabe System

Info

Publication number: DE60315296T2
Application number: DE60315296T
Authority: DE
Inventors: Mattias HÄLLBRINK; Margus Pooga; Madis Tallin Unive METSIS; Priit Kogerman; Andreas Valkna; Anne Meikas; Maria Lindgren; Astrid Gräslund; Göran ERIKSSON; Claes Göran ÖSTENSSON; Metka Budihna; Matjaz Zorko; Anna Elmquist; Ursel Soomets; Pontus Lundberg; Peter JÄRVER; Külliki SAAR; Samir El-Andaloussi; Kalle Kilk; Ülo Langel
Original assignee: CEPEP II AB
Current assignee: CEPEP II AB
Priority date: 2002-06-18
Filing date: 2003-06-18
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2023-06-19
Also published as: WO2003106491A2; ATE368853T1; AU2003253125A8; JP4503435B2; WO2003106491A3; EP1516184B1; US20080234183A1; JP2006514602A; AU2003253125A1; DE60315296D1; HK1078130A1; SE0201863D0; EP1516184A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein zellselektives Zufuhrsystem für eine Beladung, wie eine cytostatisches und/oder cytotoxisches Mittel, um an eine Zielzelle abgegeben zu werden. Die Erfindung betrifft auch das zellselektive Zufuhrsystem zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments.
Hintergrund der Erfindung
Eine Anzahl von Techniken wurden entwickelt um verschiedene zelluläre Effektoren den Zellen zuzuführen. Die Hauptzahl dieser Techniken sind invasisv wie Elektroporation oder Mikroinjektion. Eine Liposomen-Verkapselung und eine Rezeptor-vermittelte Endozytose sind milderer Verfahren, sie leiden jedoch leider an schwerwiegenden Nachteilen, insbesondere einem niedrigen Zufuhrertrag.
Die etablierte Ansicht in der zellulären Biologie diktiert, daß die zelluläre Internalisierung hydrophiler Makromoleküle nur auf dem klassischen Endozytoseweg erreicht werden kann. In der letzten Dekade wurde jedoch für etliche Peptide demonstriert, daß sie über die Plasmamembran von eukaryontischen Zellen auf einem anscheinend Energieunabhängigen Weg translozieren. Diese Peptide werden als zellpenetrierende Peptide (CPPs) definiert und wurden erfolgreich für die intrazelluläre Zufuhr von Makromolekülen mit Molekulargewichten, die ein Vielfaches größer sind als ihr eigenes, verwendet (M. Lindgren et al., 2000, Cellpenetrating peptides, TIPS, Bd. 21, S. 99–103).
Eine zelluläre Zufuhr unter Verwendung dieser zellpenetrierenden Peptide bietet etliche Vorteile gegenüber konventionellen Verfahren. Sie ist nicht invasiv, Energieunabhängig, ist für einen breiten Bereich von Zelltypen effizient und kann auf Zellen en masse angewandt werden. Weiterhin wird es festgestellt, daß bei etlichen Arten CPPs eine zelluläre Internalisierung bei 37°C sowie auch bei 4°C auftritt und daß sie nicht gesättigt sein kann. In vielen Fällen scheint die Internalisierung auch kein chirales Rezeptorprotein zu benötigen, da keine enantiomere Diskriminierung beobachtet wurde.
Bis vor kurzem schien ein Transport hydrophiler Makromoleküle in die cytoplasmatischen und nukleären Kompartimente lebender Zellen ohne den Aufbruch der Plasmamembran ein weit entferntes Ziel. Aufgrund ihrer niedrigen Biomembran-Permeabilität und ihres relativ schnellen Abbaus wurden Polypeptide und Oligonukleotide allgemein als von begrenztem therapeutischen Wert betrachtet. Dies ist ein Hindernis sowohl bei der biomedizinischen Forschung als auch für die pharmazeutische Industrie.
Eine tatsächlich noch schwierigere wenn auch sehr wichtige Aufgabe ist der Transport hydrophiler Makromoleküle über die Blut-Hirn-Schranke. Etliche Verfahren wurden angedacht, um diese Hürde zu überwinden. Nichtsdestotrotz leiden sie alle an Begrenzungen, da ihre Wirksamkeit auf eine Untergruppe von Molekülen begrenzt ist oder weil sie einen zu niedrigen Ertrag liefern. Kürzliche Berichte legen jedoch nahe, daß CPPs dazu in der Lage sein könnten, Makromoleküle über die Blut-Hirn-Schranke zu transportieren.
Ein anderer essentieller Bereich für die gewünschte Zufuhr von Effektoren ist der nukleäre Import, wobei im allgemeinen festgestellt wurde, daß die Signalsequenz einige positiv geladene (basische) Reste enthalten muß (J.J. Moroianu, J. Cell. Biochem. 1999). Es scheint, daß solche geladenen Aminosäuren auch für eine Plasmamembran-Translozierung nötig sein könnten.
Heute ist eine Vielzahl zellpenetrierender Peptide, CPPs, bekannt. Es wurde für etliche Peptide demonstriert, daß sie über die Plasmamembran eukaryontischer Zellen durch einen anscheinend Energie-unabhängigen Weg translozieren. So könnten zellpenetrierende Peptide als Zufuhrvektoren für pharmakologisch interessante Substanzen wie Peptide, Proteine, Oligonukleotide, Antisense-Molekül wie auch Research-Tools verwendet werden.
Von besonderem Interesse unter den CPPs sind diejenigen Peptide, die eine niedrige lytische Aktivität aufweisen. Diese translozierenden Peptide, die auch als Trojanische Peptide (D. Derossi et al., Trends Cell Biol. 8 (1998) 84–87) bekannt sind, wurden als Vektoren für die Zufuhr hydrophiler Biomoleküle und Arzneimittel in cytoplasmatische und nukleäre Kompartimente von Zellen sowohl in vivo als auch in vitro (für eine Übersicht siehe M. Lindgren et al., Trends Pharmacol. Sci. 21 (2000) 99–103) verwendet. Wenn sie kovalent an eine Beladung gebunden sind, einschließlich Polypeptiden und Oligonukleotiden, die ein Vielfaches ihrer eigenen molekularen Masse aufweisen, können diese Peptide immer noch translozieren.
Beispiele für nützliche Transportpeptide sind Sequenzen, die von Homeodomänen bestimmter Transkriptionsfaktoren abstammen wie auch sogenannte Tat-abstammende Peptide und Peptide, die auf Signalsequenzen basieren. Das erste der Homeodomäne abstammenden translozierenden Peptide war das Penetratin (SEQ ID NO: 1), das als pAntp bezeichnet wird, mit einer Sequenz, die zu den 16 Resten der dritten α-Helix (Reste 43–58) von dem Antennapedia-Homeodomänen Protein von Drosophila korrespondiert (D. Derossi et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), 10444–10450; A. Prochiantz, Ann. NY Acad. Sci. 886 (1999), 172–179). Das pAntp-Peptid erhält sich seine Membrantranslokationseigenschaften und wurde daher als universeller interzellulärer Zufuhrvektor vorgeschlagen (C. Derossi et al., Trends Cell Biol. 8 (1998) 84–87).
Reine synthetische oder chimäre Peptide wurden ebenfalls entworfen, wie übersichtlich dargestellt in D. Derossi et al., Trends Cell Biol. 8 (1998) 84–87 und M. Lindgren et al., Trends Pharmacol. Sci. 21 (2000) 99–103.
Transportan (SEQ ID NO: 2) beispielsweise, ein nicht-natürliches Peptid, ist dazu in der Lage ein Antikörpermolekül mit einer molekularen Masse von 150 kDa über die Plasmamembran zu führen, obwohl Transportan selbst nur ein 3 kDa-Peptid ist. Für Transportan und Penetratin wurde gezeigt, daß sie ein nicht-natürliches DNA-Analog, PNA (Peptid-Nukleinsäure) in das Cytoplasma und die Kerne von Zellen in Kultur führen (Pooga et al., 1998, Nature Biotech.).
Eine andere Gruppe von Peptiden, die überraschenderweise dazu in der Lage sind, über die zelluläre Membran einen Transport durchzuführen, wenn sie an einen hydrophoben Bestandteil gekoppelt sind, sind modifiziert Rezeptoren, insbesondere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, die Pepducine genannt werden (siehe z.B. WO 0181408 , Kuliopulos et al.). Es wurde entdeckt, daß die Anhaftung eines hydrophoben Bestandteils an Peptide, die von dem dritten intrazellulären Loop eines 7TM-Rezeptors abstammen, eine zelluläre Translokation der chimären Peptide und vollen Agonisten und/oder Antagonisten der Rezeptor-G-Protein-Signalbildung ergeben. Diese Pepducine sind Membran-inserierende, Membran-gebundene chimäre Peptide und benötigen die Gegenwart ihres verwandten Rezeptors für die Aktivität und sind hochselektiv für den Rezeptortyp.
Obwohl ihre erstaunliche Transportfähigkeit die CPPs für die letzten Jahre in den Blickpunkt des wissenschaftlichen Interesses gerückt hat, sind die grundlegenden Mechanismen der Translokation für die unterschiedlichen CPPs immer noch unbekannt. Beispielsweise ist es auch heutzutage auf dem Gebiet noch nicht bekannt, ob irgendeine bestimmte sekundäre Struktur induziert wurde, um eine Translokation zu ermöglichen (energetisch), was eine begleitende transiente Membrandestabilisierung involviert. Es ist jedoch klar, daß die molekularen Details der Peptid-Membraninteraktionen von fundamentaler Wichtigkeit für den Translokationsprozeß sein müssen.
Der Mechanismus und die Anforderungen an die Internalisierung wurden an Wechselwirkungen zwischen amphipathischen α-Helixpeptiden und Lipid(bi)-Lagers untersucht. Die Ergebnisse dieser Studien legen oft nahe, daß Tryptophan für die Internalisierung eines Peptids verantwortlich ist, jedoch obwohl aromatische Aminosäuren an CPP-Sequenzen bevorzugt sein können, sind sie für die Zellpenetration nicht absolut notwendig.
Abgesehen von der Zellpenetrationsfähigkeit wurde wenig Korrelation von Struktur oder Verhalten zwischen CPPs gefunden. Bis jetzt wurden die CPPs so nicht auf rationale Weise entworfen, sondern sie wurden durch glücklichen Zufall gefunden. Die bis jetzt veröffentlichten CPP-Sequenzen haben jedoch eine positive Nettoladung als einziges gemeinsames Merkmal, was einen Startpunkt für die Vorhersage einer CPP-Funktionalität in einer gegebenen Peptidsequenz ergibt. Alle Sequenzen, die eine positive Nettoladung aufweisen, können jedoch ganz eindeutig nicht automatisch zellpenetrierend sein, was anzeigt, daß weitere Restriktionen benötigt werden, um CPPs mit irgendeiner Sicherheit zu selektieren.
Die WO 0034308 beschreibt ein Protein-Transduktionssystem, umfassend ein oder mehr Fusionsproteine, die eine Transduktionsdomäne und eine cytotoxische Domäne beinhalten. Das Protein-Transduktionssystem tötet oder verletzt Zellen effektiv, die von einem oder einer Kombination unterschiedlicher Pathogene oder Zellen infiziert sind, die einzigartige Eigenschaften wie hohe Niveaus schwerer Metalle, DNA-Schäden oder nicht-kontrollierte Zellteilungen aufweisen.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein zellselektives Zufuhrsystem wie im beigefügten Anspruch 1 und den Unteransprüchen definiert bereit, wie auch ein zellselektives Zufuhrsystem zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments, wie definiert in Anspruch 8.
Im gegenwärtigen Kontext ist eine Aminosäure irgendeine organische Verbindung, enthaltend eine Amino(-NH₂)- und eine Carboxy(-COOH)-Gruppe. Aminosäuren können sich entweder in L- oder D-Form befinden. Gegenwärtig gibt es 22 bekannte codierte α-Aminosäuren, von denen Proteine während der ribosomalen Translation der mRNA synthetisiert werden. Zusätzlich werden konstant eine große Zahl nicht-codierter Aminosäuren aufgefunden. Sowohl codierte als auch nicht-codierte Aminosäuren können natürlich Teil der Aminosäuresequenzen, Peptid-Fragmente, Peptide, Proteine und/oder Polypeptide sein, die in der gegenwärtigen Erfindung beinhaltet sind.
Aminosäuresequenz ist im gegenwärtigen Kontext die präzis definierte lineare Reihenfolge von Aminosäuren (einschließlich sowohl codierter als auch nicht-codierter Aminosäuren) in einem Peptid-Fragment, Peptid, Protein oder Polypeptid.
Die Bezeichnung Nicht-Peptidanalog wird im gegenwärtigen Kontext verwendet um irgendeine Aminosäuresequenz zu beschreiben, die mindestens eine nicht-codierte Aminosäure umfaßt und/oder ein Grundgerüstmodifikation aufweist, die zu einer Aminosäuresequenz ohne Peptidbindung führt, d.h. einer CO-NH-Bindung, gebildet zwischen der Carboxyl-Gruppe einer Aminosäure und der Amino-Gruppe einer anderen Aminosäure.
Weiterhin können die gegenwärtigen Aminosäuresequenzen entweder amidiert sein oder als freie Säuren auftreten.
Reportergruppen unterschiedlichen Charakters können an ein putatives CPP gekoppelt werden, um seine zelluläre Translokation und Effizienz einzuschätzen, wie beispielsweise Biotin und unterschiedliche Fluorophore, beispielsweise Fluorescein, Aminbenzoesäure und Rhodamine.
Die Bezeichnung "zellpenetrierende Kapazität" eines Peptids wird im weiteren synonym zu seiner Fähigkeit zur Translokation über die Plasmamembran in entweder die cytoplasmatischen und/oder nukleären Kompartimente eukaryontischer und/oder prokaryontischer Zellen verwendet, wie beispielsweise in das Cytoplasma, den Kern, Lysosomen, das endoplasmatische Retikulum, den Golgi-Apparat, Mitochondrien und/oder Chloroplasten, anscheinend Energieunabhängig. Zusätzlich kann die Bezeichnung "zellpenetrierende Kapazität" eines Peptids in einigen Aspekten der Erfindung auch synonym zur Anzeige eines transzellulären oder transmembranen Transports verwendet werden und steht auch für zum Beispiel die Fähigkeit über eine Epithelmembran zu translozieren, wie beispielsweise über das Epithel im Intestinal/Bukkalsystem, die Mukosa im Mund, die Lunge, Rektum oder Nase oder die Blut-Hirn-Schranke eines Säugers.
Ein nachgewiesenes oder de novo entworfenes und verifiziertes Peptid, das zelluläre Penetrationsfähigkeiten gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, ist im gegenwärtigen Kontext als "zellpenetrierendes Peptid (CPP)" definiert und kann beispielsweise für die intrazelluläre Zufuhr von Makromolekülen verwendet werden, wie beispielsweise Polypeptiden und/oder Oligonukleotiden mit Molekulargewichten, die um ein vielfaches größer sind als sein eigenes.
Im allgemeinen ist die zelluläre Zufuhr unter Verwendung eines zellpenetrierenden Peptids und/oder eines Nicht-Peptidanalogs davon nicht invasiv, Energie-unabhängig, für einen breiten Bereich von Zelltypen und/oder eine breite Vielzahl von Beladungen effizient, auf Zellen en masse anwendbar, nicht-sättigbar und/oder Rezeptor-unabhängig.
Durch ein in der vorliegenden Anmeldung offenbartes Verfahren nachgewiesene, oder de novo entworfene und/oder verifizierte CPPs werden für den Transport hydrophiler Makromoleküle in die cytoplasmatischen und nukleären Kompartimente einer lebenden Zelle und/oder eines Mikroorganismus nützlich sein ohne die Plasmamembran permanent aufzubrechen wie auch für eine Zufuhr hydrophiler Makromoleküle über die Blut-Hirnschranke und ermöglichen zum Beispiel den intrazellulären Transport konjugierter Oligopeptide und Oligonukleotide und Arzneimittel.
So könnte ein zellpenetrierendes Peptid und/oder ein Nicht-Peptidanalog davon in dem gegenwärtigen Kontext als Zufuhrvektor für irgendeine pharmakologisch interessante Substanz wie ein Peptid, Polypeptid, Protein, kleine molekulare Substanz, Arzneimittel, Mononukleotid, Oligonukleotid, Polynukleotid, Antisense-Molekül, doppelsträngige wie auch einzelsträngige DNA, RNA und/oder irgendeine künstliche oder teilweise künstliche Nukleinsäure, z.B. PNA wie auch als Research-Tool für die Zufuhr von zum Beispiel Tags und Markern und/oder für die Veränderung von Membranpotentialen und/oder Eigenschaften verwendet werden.
Ein gemäß der vorliegenden Erfindung gefundenes, entworfenes und/oder erzeugtes CPP kann daher als Vektor für die Zufuhr eines hydrophilen Biomoleküls und/oder Arzneimittels in die cytoplasmatischen und nukleären Kompartimente einer Zelle und/oder eines Gewebes sowohl in vivo als auch in vitro Verwendung finden.
Wenn ein CPP kovalent an eine Beladung gebunden ist, einschließlich ein Peptid, Polypeptid, Protein, eine kleine molekulare Substanz, ein Arzneimittel, Polypeptid und Oligonukleotid, die das Vielfache der eigenen molekularen Masse aufweist, kann das CPP immer noch translozieren.
Außerdem kann ein CPP selbst intra- und/oder extrazelluläre Effektoraktivität zeigen und so als zellpenetrierendes funktionales Protein nachahmendes Peptid wirken oder sogar eine neue nicht-vorhersehbare Funktion zeigen, wenn es de novo entworfen wird.
Ein zellulärer Effektor kann hier entweder ein intrazellulärer und/oder extrazellulärer Effektor sein und ist im gegenwärtigen Kontext als Struktur definiert, die eine zelluläre Wirkung erzeugt, wie eine Kontraktion, Sekretion, einen elektrischen Impuls oder ein Aktivierung oder Inaktivierung einer intrazellulären und/oder extrazellulären Signalkaskade oder die die Hochregulierung eines zellulären Niveaus einer mRNA und/oder eines Proteins als Reaktion auf eine Stimulation durch den Effektor induziert. Ein typischer Effektor im gegenwärtigen Kontext wird aus der Gruppe gewählt, bestehend aus einem Metaboliten, einem Antagonisten, einem Agonisten, einem Rezeptorliganden, einem Rezeptorgekoppelten Protein, einem aktivierten Rezeptor, einem Enzyminhibitor, Aktivator/Inaktivator und/oder Stimulator einer Kinase, einer Phosphatase, einem Enhancer oder einem Silencer, einem Transkriptionsfaktor, einem Transporter und/oder einem Transmitter, einem Hormon, einem Kanal, einem Ion, einem Prion und einem viralen Protein.
Beladung
Wie vorher beschrieben, kann ein CPP an eine Beladung gekoppelt werden um als Träger der Beladung in die Zellen, verschiedene zelluläre Kompartimente, Gewebe oder Organe zu wirken. Die Beladung kann aus der Gruppe gewählt werden, bestehend aus jeder pharmakologisch interessanten Substanz wie einem Peptid, Polypeptid, Protein, kleinen molekularen Substanz, Arzneimittel, Mononukleotid, Oligonukleotid, Polynukleotid, Antisense-Molekül, doppelsträngiger wie auch einzelsträngiger DNA, RNA und/oder künstlicher oder teilweise künstlicher Nukleinsäure, wie zum Beispiel PNA, einem niedermolekularen Molekül, Saccharid, Plasmid, antibiotischen Substanz, cytotoxischen und/oder antiviralen Mittel. Weiterhin kann der Transport der Beladung als Research-Tool für die Zufuhr von z.B. Tags und Markern nützlich sein wie auch für die Veränderung von Membranpotentialen und/oder Eigenschaften, wobei die Beladung beispielsweise ein Markermolekül wie Biotin sein kann.
Im Hinblick auf den beabsichtigten Transport einer Beladung über die Blut-Hirn-Schranke sind sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Substanzen gleich bevorzugte Beladungen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das zellpenetrierende Peptid durch eine S-S-Brücke an die Beladung gekoppelt. Natürlich gibt es eine breite Varietät von Verfahren um eine Beladung an ein CPP zu koppeln, die individuell abhängig von der Natur von CPP, Beladung und beabsichtigter Verwendung gewählt werden. Ein Kopplungsmodus kann aus der Gruppe gewählt werden, bestehend aus kovalenter und nicht-kovalenter Bindung, wie eine Biotin-Avidin-Bindung, Esterbindung, Amidbindung, Antikörperbindungen usw.
In einigen Ausführungsformen wird eine labile Bindung bevorzugt, in anderen ist eine stabile Bindung elementar, wie beispielsweise bei der Verwendung eines CPPs gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung beim Transport medizinischer Substanzen aufgrund der notwendigen Lagerung der pharmazeutischen Zusammensetzungen vor der Verwendung.
Illustrative Beispiele für die oben beschriebenen Ausführungsformen werden in den Beispielen 2, 5 und 6 angegeben.
In Beispiel 5 wird eine Methotrexat (MTX)-Konjugat mit einem CPP-Träger beschrieben. MTX ist ein cytotoxisches Arzneimittel, das für die Behandlung maligner Zustände entwickelt wurde, das jedoch nun auch zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie Psoriasis verwendet wird. Normalerweise liegt MTX in Körperflüssigkeiten als negativ geladenes Molekül vor. Daher kann es die Zellmembran nur mit Schwierigkeiten überqueren.
So umfaßt ein illustratives Beispiel der Verwendung eines CPPs für den Transport einer Beladung gemäß der vorliegenden Erfindung MTX-CPP-Konjugate, im wesentlichen wie umfaßt in den SEQ ID NO: 3–7, die beispielsweise unter Verwendung einer Festphasen-Peptidsynthesestrategie wie in Beispiel 5 beschrieben, synthetisiert wurden, wovon spezifische Beispiele in Tabelle 1 unten aufgeführt sind: Tabelle 1. MTX-CPP-Konjugate

Apa-γGlu-Gly-CPP

Apa-(γGlu) 2-5-Gly-CPP

Apa-Cys-S-S-Cys-CPP
Ein anderes Beispiel eines Moleküls, das über eine zelluläre Membran mit einem CPP getragen wird, wird in Beispiel 6 angegeben, wodurch die siRNA-Aufnahme wesentlich verbessert wird.
In den letzten Jahren haben kleine interferierende RNAs (siRNAs) aufgrund ihrer hochempfindlichen Fähigkeit die Genexpression in Sängerzellen zu regulieren die Aufmerksamkeit auf sich gezogen. siRNAs sind kurze Stränge (ungefähr 21–23 bp) doppelsträngiger RNAs, die eine spezifische Spaltung ihrer komplementären mRNA durch Aktivierung des RNA-induzierten Silencing-Komplexes (RISC) induzieren. Obwohl das RNA-induzierte Silencing ein endogener Mechanismus ist, konnte gezeigt werden, daß synthetisch synthetisierte siRNAs dieselbe Wirkung sowohl in vitro als auch in vivo aufweisen.
Ein wohl bekanntes Problem bei der Verwendung von siRNA ist der niedrige Ertrag der Aufnahme in die Zelle. Durch die Kopplung zellpenetrierende Peptide (CPP) an synthetisch synthetisierte siRNA, wird die zelluläre Aufnahme jedoch signifikant verbessert.
Eine andere spezifische Ausführungsform der Verwendung eines CPPs für einen Beladungstransport, wie in der vorliegenden Erfindung beinhaltet, betrifft so eine siRNA gegen die GALR-1 mRNA, gekoppelt an ein CPP, wie Transportan10 (Tp10) über einen Disulfid-Linker, z.B. wie in 18 dargestellt und als SEQ ID NO: 2 aufgeführt.
Zellselektive CPPs
In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein zellpenetrierendes Peptid und/oder Nicht-Peptid-Analog davon bereitgestellt, das selektiv in einen bestimmten Zelltyp/Gewebe/Organ eintreten wird oder das eine Beladung transportiert, die nur in einem bestimmten Zelltyp, Gewebe oder Organtyp aktiviert wird.
Die Erfinder zeigen, daß unterschiedliche CPPs durch spezifische Zelllinien wie die menschliche Melanom-Zelllinie Bowes und andere internalisiert werden, mit signifikant unterschiedlicher Effizienz und Aufnahmerate, manchmal mehr als 2-fach. Dies ist eine Voraussetzung um CPPs zu definieren, die mit unterschiedlicher Effizienz in unterschiedliche Zelllinien und Gewebe internalisiert werden. Ein wichtiges Verfahren, das im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist daher die Entwicklung selektiver CPPs (selCPPs), dadurch gekennzeichnet, daß alle zur Verfügung stehenden natürlichen oder de novo entworfenen CPPs im Hinblick auf die zelluläre Aufnahme in Zelllinien, Zellen, Gewebe und/oder Organe getestet werden, in die ein selektiver Transport benötigt wird. Andererseits können bestimmte selektive Verfahren verwendet werden, um die Zellselektivität eines gewählten CPPs für eine bestimmte Zielzelle oder Zielzellpopulation zu erhöhen, was im Detail unten beschrieben werden wird.
Als Beispiel exponieren Krebszellen viele Zelloberflächenantigene und/oder Proteine und sezernieren bestimmte Proteine. Üblicherweise exprimieren Tumorzellen keine Zelloberflächenmarker, die einzigartig sind sondern überexprimieren statt dessen übliche Rezeptoren/Marker. Die Signalbildung über diese überexprimierten Marker und/oder Überamplifikationen von intrazellulären und/oder extrazellulären Signalen ist vermutlich einer der Mechanismen für den Verlust der Kontrolle der zellulären Maschinerie über den Zellzyklus. So wird gemäß einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein überexprimiertes Zelloberflächenprotein und/oder sezerniertes Protein als Ziel für die CPP-Adressierung verwendet.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein zellselektives CPP (selCPP) betrachtet, das ein Antigen/Protein umfaßt, gezüchtet gegen einen zellulären Marker, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kanalrezeptoren, Tyrosinkinase-Rezeptoren (z.B. EGF, IGF), Guanylatcyclase-Rezeptoren, Serin/Threoninkinase-Rezeptoren, Cytokin-Rezeptoren, Rezeptoren an Guanosintriphosphat (GTP)-Bindungsproteine (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren: GPCRs), Glycosphingolipide, CD44, Neuropeptid-Rezeptoren, z.B. Neurotensin-Rezeptoren, Galanin und Substanz P-Rezeptoren.
Allgemein wird natürlich ein zellselektives CPP (selCPP) bei einem Zieltransport von jeder Art von Arzneimittel oder pharmazeutischen Substanz zu einer Vielzahl spezifischer eukaryontischer und/oder prokaryontischer zellulärer Targets nützlich sein. Ein zellselektiver Transport einer solchen Beladung wird beispielsweise für eine verbesserte Behandlung oder Prävention infektiöser Erkrankungen wie Erkrankung, die durch eine virale, bakterielle oder parasitäre Infektion ausgelöst werden, betrachtet.
Um eine nicht-spezifische Internalisierung von CPPs vor dem Auffinden einer Zielzelle in vivo zu vermeiden, betrifft die Erfindung in einem weiteren Aspekt eine neue Variation der Enzym-Prodrug-Strategie, worin ein selCPP-Konjugat so entworfen wird, daß die Zellpenetrations-aktive Struktur des CPPs unterbrochen ist, bis zu einem Bindungsereignis eines Peptidteils des selCPPs an eine Zell/Gewebe oder einen organspezifischen Rezeptor/Marker oder die Spaltung des selCPP-Konjugats durch eine Protease, sezerniert durch die Zielzelle/Gewebe oder das Organ, was CPP aus der Konformationsdiskriminierung freisetzt.
Die Bezeichnung "Enzym-Prodrug-Startegie/Therapie" wird auf dem Gebiet verwendet, um einen spezifischen Ansatz für die Zufuhr eines Arzneimittels zu definieren, fokussiert auf die Entwicklung von Aminosäure- oder Nukleinsäure-Prodrugs, die vor oder nach der Zufuhr eine Aktivierung durch mehr oder weniger Gewebe, Organ und/oder zellselektive Enzyme benötigen. Große Unterschiede im Hinblick auf die Selektivität werden im Stand der Technik gefunden. Für einige Prodrugs erklärt eine schnelle Entfernung des freigesetzten Arzneimittels aus dem Zielgewebe/Organ/Zelle die niedrige Selektivität während bei anderen eine Spaltung in Nicht-Zielgeweben und ein unzureichender Transport über die Zelle zu der Enzymstelle im wesentlichen verantwortlich zu sein scheint.
Insbesondere viele Antikrebsmittel sind schwer toxisch, was die Notwendigkeit von effektiveren und weniger toxischen Prodrugs und/oder Softdrugs erklärt. Ein typisches Prodrug/Softdrug muß daher ein effizientes und selektives Substrat für die aktivierenden Enzyme sein und zu einem potenten Cytotoxin und/oder Cytostatikum verstoffwechselt werden, was vorzugsweise dazu in der Lage ist, Zellen auf allen Stufen des Zellzyklusses zu töten. Viele der frühen auf Antimetaboliten-basierenden Prodrugs stellten sehr polare aktivierte Formen bereit, die limitierte Fähigkeiten zur Diffusion über Zellmembranen aufwiesen und sich auf gap junctions zwischen den Zellen für ihre Bystander-Wirkungen verließen. Prodrugs wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben haben jedoch gute Verteilungseigenschaften und ihre aktivierten Spezies sind natürlich zellpenetrierend, so daß die resultierenden Bystander-Wirkungen die Wirksamkeit der Therapie maximieren können.
Im gegenwärtigen Kontext wird die Bezeichnung "Enzym-Prodrug-Strategie/Therapie" zusätzlich verwendet um das oben erklärte Verfahren für die Zufuhr eines Arzneimittels zu beschreiben, wobei das Arzneimittel selbst oder das Transporter-CPP nicht zellpenetrierend gemacht wird, um eine nicht-spezifische Internalisierung von CPPs zu vermeiden, bevor eine Targetzelle in vivo angetroffen wird und wobei nur das Bindungsereignis eines Peptidteils des selCPPs an eine Zelle/Gewebe oder einen organspezifischen Rezeptor/Marker oder die Spaltung des selCPP-Konjugats durch eine Protease, sezerniert von der Zielzelle/dem Gewebe oder dem Organ, das CPP aus der Konformationsdiskriminierung freisetzt, woraufhin es in die Zielzelle eindringen kann.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft so ein zellselektives Zufuhrsystem für ein cytostatisches und/oder cytotoxisches Mittel, umfassend a) eine Protease-Konsensusstelle für eine Protease, die in einer Zielzelle spezifisch überexprimiert wird, b) ein zellpenetrierendes Peptid und/oder Nicht-Peptid-Analoga davon und c) ein cytostatisches und/oder cytotoxisches Mittel, wobei das zellselektive Zufuhrsystem zusätzlich eine Inaktivierungssequenz umfaßt, die die zelluläre Penetrationsfähigkeit des zellpenetrierenden Peptids unterdrückt und die durch die Protease gespalten wird, die spezifisch in der Zielzelle überexprimiert wird, und zwar bei Einführung des zellselektiven Zufuhrsystems in die nahe Nachbarschaft zu der Zielzelle. Siehe beispielsweise Beispiel 4.
Ein typisches Beispiel für das obige Konzept sind Matrix-Metalloproteasen (MMPs), die Zn² ⁺-Metalloendopeptidasen sind. Die Familie enthält sowohl Membran-gebundene als sezernierte Mitglieder, wobei beide den Zusammenbruch von Proteinen katalysieren, die entweder auf der Plasmamembran der Zelle oder innerhalb der extrazellulären Matrix lokalisiert sind (ECM) (M.D. Sternlicht und Z. Werb, "How matrix metallo proteinases regulate cell behavior", Annual Review of Cell and Developmental Biology, 17:463–516, 2001). MMPs wurden mit dem invasiven und metastatischen Verhalten einer breiten Vielzahl von malignen Vorkommnissen verbunden und diese Enzyme werden allgemein in einer Vielzahl von Tumoren überexprimiert (M.D. Sternlicht und Z. Werb "How matrix metallo proteinases regulate cell behavior", Annual Review of Cell and Developmental Biology, 17:463–516; D.V. Rozanov et al., "Mutation analysis of membrane typ-1 metalloproteinase (Mt1-MMP, Alternativname MMP-14)", Journal of Biological Chemistry (JBC), 276:2570514, 13. Juli 2001). Membran-Typ-MMPs (MT-MMP) wie MMP-MT1 wurden mit der Onkogenese impliziert. Diese Enzyme lokalisieren sich an den invasiven Fronten. Die löslichen MMPs 1–3 und 9 wurde auch als Agonisten der Tumorigenese impliziert (L.E. Smith, K.K. Parks, L.S. Hasegawa, D.A. Eastmond & A.J. Grosovsky, Targeted breakage of paracentromeric heterochromatin induces chromosomal instability. Mutagenesis 13, 435–43 (1998)).
Gleichzeitig und elegant in den Beispielen 4 und 12 gezeigt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Entwurf eines selCPPs, basierend auf drei grundlegenden Funktionen: 1) selektive Spaltung (und dadurch Aktivierung) durch MMP-2 oder MMP-MT1, 2), zelluläre Penetration durch Peptide (CPPs) und 3) Tötung von nahegelegenen vorzugsweise Tumorzellen oder Endothelien, die an der Tumor-Neovaskularisierung beteiligt sind, durch ein bekanntes cytostatisches und/oder cytotoxisches Mittel (siehe 2, 3, 8 und 9).

Die vorliegende Erfindung umfaßt so ein selCPP, selektiert von einer Aminosäuresequenz wie enthalten in Tabelle 2 oder 3 und ein kombiniertes zellselektives Zufuhrsystem für ein cytostatisches und/oder cytotoxisches Mittel, umfassend eine Aminosäuresequenz wie aufgeführt in Tabelle 2 und 3 und ein cytostatisches und/oder cytotoxisches Mittel. Siehe SEQ ID NO: 3–10. Tabelle 2. selCPPs, basierend auf MMP-2 (Gelatinase-A)-Spaltungsspezifität:

Name	Sequenz	MMP-Stelle	Penetration	Bemerkung:
YTA-2	YTAIAWVKAFIRKLRK (SEQ ID NO: 3)	SGESLAY-YTA (SEQ ID NO: 11)	+++	Färben auch die nukleäre Membran Fig. 2
YTA-2ps*	SGESLAY-YTAIAWVKAFIRKLRK (SEQ ID NO: 4)	SGESLAY-YTA (SEQ ID NO: 11)	+	Binden die Plasmamembran Fig. 3

* ps steht für Proteinase-Spaltungsstelle

Name	Sequenz	MMP-Stelle
LRSW-1	LRSWVISRSIRKAA (SEQ ID NO: 5)	GPLG-LRSW (SEQ ID NO: 12)
LRSW-2	LRSWIRRLIKAWKS (SEQ ID NO: 6)	GPLG-LRSW (SEQ ID NO: 12)
LRSW-3	LRSWRVIIRNGQR (SEQ ID NO: 7)	GPLG-LRSW (SEQ ID NO: 12)

Die LRSW-1 ps, LRSW-2 ps und LRSW-3 ps haben die SEQ ID NO: 8, 9 bzw. 10.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung auch ein zellselektives Zufuhrsystem für ein cytostatisches und/oder cytotoxisches Mittel, umfassend a) ein zellpenetrierendes Peptid und/oder ein Nicht-Peptid-Analogon davon, umfassend eine Protease-Konsensusstelle für eine Protease, die spezifisch in einer Zielzelle überexprimiert wird und c) ein cytostatisches und/oder cytotoxisches Mittel, wobei das zellselektive Zufuhrsystem zusätzlich eine Inaktivierungssequenz umfaßt, die die Aktivität des zellpenetrierenden Peptids unterdrückt und die durch die Protease gespalten wird, die in der Zielzelle spezifisch überexprimiert wird, bei Einführung des zellselektiven Zufallsystems in die nahe Nachbarschaft der Zielzelle.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des zellselektiven Zufuhrsystems wie oben beschrieben, erhöht das zellpenetrierende Peptid, umfaßt in dem zellselektiven Zufuhrsystem die durchschnittliche Rate der zellulären Aufnahme des cytostatischen und/oder cytotoxischen Mittels in die selektive Zelle pro Zelle um einen Faktor von mindestens 1,5 im Vergleich zu der durchschnittlichen zellulären Aufnahmerate in die Zelle eines zellselektiven Zufuhrsystems, umfassend nur die Komponenten a) und c) oder die durchschnittliche Rate der zellulären Aufnahme von Komponente c) allein der Zelle.
Gemäß einer anderen genauso bevorzugten Ausführungsform des zellselektiven Zufuhrsystems, wie oben beschrieben, erhöht das zellpenetrierende Peptid, umfaßt in dem zellselektiven Zufuhrsystem die durchschnittliche zelluläre Aufnahmerate des cytostatischen und/oder cytotoxische Mittels in die selektive Zelle pro Zelle, um einen Faktor von mindestens 1,5 wie mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000 oder 10 000, verglichen mit der durchschnittlichen Rate der zellulären Aufnahme in die Zelle eines zellselektiven Zufuhrsystems, umfassend nur die Komponenten a) und c) oder der durchschnittlichen zellulären Aufnahmerate von Komponente c) allein der Zelle.
Gemäß einer anderen genauso bevorzugten Ausführungsform des zellselektiven Zufuhrsystems wie oben beschrieben, ist die überexprimierte Protease eine Zn²⁺ Metallo-Endopeptidase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus MMP-1, MMP-2 und MMP-MT1.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die überexprimierte Protease gewählt aus der Gruppe, bestehend aus bakteriellen Oberflächenproteasen und viralen Enzymen.
Ein zellselektives Zufuhrsystem wie oben beschrieben kann natürlich für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Beendigung der zellulären Proliferation einer spezifischen zellulären Population in einem Säuger und zur Behandlung eines Patienten, der an einem medizinischen Zustand leidet, charakterisiert durch ein unkontrolliertes zelluläres Wachstum, wie einer onkologischen Störung oder Erkrankung oder einer immunologischen und/oder Stoffwechselhyperfunktion verwendet werden.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines zellselektiven Zufuhrsystems gemäß der Erfindung für die Herstellung eines Medikaments.
Die unterschiedlichen Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung werden nun durch die folgenden Beispiele illustriert. Es sollte verstanden werden, daß die Erfindung nicht auf irgendwelche spezifisch erwähnten Details begrenzt ist.
Abkürzungen

Aβ: beta-Amyloid
AD: Alzheimer-Erkrankung
APP: Amyloid-Vorläuferprotein
AT1: Angiotensin-Rezeptor-Typ AT1
AT1A: Angiotensin-Rezeptor-Subtyp AT1A
AT1B: Angiotensin-Rezeptor-Subtyp AT1B
AT2: Angiotensin-Rezeptor-Typ AT2
BACE: APP-Spaltungsenzym an der β-Stelle
Bio: Biotin, biotinyliert
BSA: Rinderserumalbumin
CPP: zellpenetrierendes Peptid
CTF: C-terminales Fragment
DCC: N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
DCM: Dichlormethan
DIEA: Diisopropylethylamin
DMF: Dimethylformamid
DNP: Dinitrophenyl
EOFAD: Alzheimer-Erkrankung mit frühem Ausbruch
FITC: 5-Fluoresceinisothiocyanat
Fmoc: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
GOP: IVIAKLKA-Amid
GPCR: G-Protein-gekoppelter Rezeptor
GTP: Guanosin-5'-triphosphat
GTPase: Guanosintriphosphatase
GTPγS: Guanosin-γ-S-5'-triphosphat
HKR: Hepes-Krebbs-Ringer
HOBt: N-Hydroxybenzotriazol
HPLC: Hochleistungsflüssigchromatographie
IDE: Insulin-Abbauenzym
LORD: Alzheimer-Erkrankung mit spätem Ausbruch
MBHA: 4-Methylbenzhydrylamin
NFT: neurofibrilläres Gewirr
NICD: intracelluläre Kerbdomain
NMP: N-Methylpyrrolidon
NTF: N-terminales Fragment
PAF: Paraformaldehyd
PBS: phosphatgepufferte Salzlösung
PNA: Peptid-Nukleinsäure
PS: Presenilin
RNA: Ribonukleinsäure
SAPP: sekretorisches APP
TACE: Tumornekrosefaktor-alpha umwandelndes Enzym
t-Boc: tert-Butyloxycarbonyl
TBTU: 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat
TFA: Trifluoressigsäure
TFMSA: Trifluormethansulfonsäure

Legenden für die Figuren
1 Intramolekular eingeschränktes selCPP verliert seine Einschränkung durch das Erkennungsereignis durch einen spezifischen Rezeptor und die Internalisierung findet statt.
2 Schematische Struktur von chimärem selCPP.
3 Inkubation eines nicht-kovalenten selCPP-AB-Komplexes mit den selektierten Zellen, die die Epitopsequenz exponieren. Peptid X führt zu einer kompetitiven Wechselwirkung von AB mit der Peptid X-Sequenz in dem Zelloberflächenprotein.
4 Beispiel für inaktiviertes selCPP. Internalisierung von YTA-2(A) im Vergleich mit YTA-2ps (B) in LoVo-Zellen, beide biotinylierte Peptide nachgewiesen durch TRITC-Avidin bei 37°C.
5 Beispiel eines Protease-aktivierten selCPP, Nachweis durch ein Fluorophor/Quencher-System. Bestimmungsverfahren der spezifischen Spaltung von YTA-2ps der Matrixmetallproteinase-2 (MMP-2).
6 Translokation eines 10 μM Peptids bei 37°C in LoVo-Zellen (menschlicher Kolonkrebs).
7 Ein weiteres Beispiel eines inaktivierten selCPPs. PenMMP14-Aufnahme in Bowes (A) und (B) und Caco-2-(C) und (D). Die linke Spalte ist die Aufnahme des Fluoreszein-markierten Peptids (A) und (C) und die linke mit Coumarin-Markierung (B) und (D).
8 Schema der selCPP-Aktivierung durch Matrix-Metalloproteasen (a) repräsentativ für irgendeine gewebe/organ/zellspezifische Protease, was zu einer Gewebe(Tumor)-selektiven Aufnahme führt (b).
9 Schema der selCPP-Aktivierung durch Matrix-Metallproteasen (a) was zu einer Gewebe (Tumor)-selektiven Aufnahme (b) führt.
10 Internalisierung von biotinyliertem YTA-2 in menschliches Kolonadenokarzinom, LoVo-Zellen. A) Nachgewiesen mit Streptavidin-FITC, B) Vergleich nukleäre Färbung mit Hoechst. B)
11 Internalisierung von YTA-2 (A) im Vergleich mit YTA-2ps (B) in LoVo-Zellen, beide biotinylierten Peptide nachgewiesen durch TRITC-Avidin bei 37°C. C) und C) YTA-2 in Caco-2-Zellen, nachgewiesen mit Streptavidin TRITC und nukleärer Färbung.
12 Aufnahme von fluoreszent markiertem Peptid (F). Die Zahlen werden in prozentualer Aufnahme von zugefügtem Peptid gezeigt.
13 Penetration von Apa-γGlu-Gly-Evo165 in kultivierte menschliche Epidermis-Keratinozyten, Imunofluoreszenznachweis.
14 Wirkungen von unterschiedlichen MTX-pVEC-Konjugaten auf die Lebensfähigkeit von Bowes-Zellen (Assay unter Verwendung von Cell-TiterGlo^TM). Aussetzung für 24 h in 10 % FBS-MEM.
15 Wirkung von Apa-γGlu-Gly-Evo165 auf die Lebensfähigkeit von Bowes-Zellen (Assay unter Verwendung von Cell-TiterGlo^TM)
16 Wirkungen von MTX, Apa-γGlu-Gly-YTA2 und YTA2 auf die Lebensfähigkeit von Bowes-Zellen (Assay unter Verwendung von Cell-TiterGlo^TM).
17 Wirkungen von MTX, Apa-γGlu-Gly-YTA2 und YTA2 auf die Lebensfähigkeit von K562-Zellen (Assay unter Verwendung von Cell-TiterGlo^TM). Aussetzung für 2 Tage in 7,5 % FBS-RPMI.
18 siRNA, gebunden durch Disulfidbindungen an Tp10-PNA, schematische Ansicht des Konstrukts und theoretischer Wirkungsmechanismus in der Zelle.
19 Aufnahme eines 1 μM Peptid-DNA-Konstrukts, 30 min, 37°C in Bowes-Zellen, Platte mit 24 Vertiefungen.
20 Beispiel für eine zelluläre Penetration durch gut untersuchte CPPs. Peptid-Internalisierung in lebende Caco-2-Zellen eines 1 μM-Fluo-Peptids.
21 Proteininternalisierung durch YTA-2 von Fluo-Streptavidin, 37°C und T/E, zeigt die Zufuhreigenschaft eines selCPP.
22 Proteininternalisierung durch YTA-2 von Fluo-Streptavidin, 4°C und T/E, zeigt die Zufuhreigenschaften und Temperaturunabhängigkeit eines selCPPs.
Experimenteller Teil
Beispiel 1
Peptidsynthese (zeigt ein Default-Verfahren für die unten stehenden Experimente, wenn nicht anders angegeben)
Die Peptide wurden schrittweise in einem 0,1 mmol-Umfang auf einem Peptid-Synthetisierer (Applied Biosystems Modell 431A, USA) unter Verwendung der t-Boc-Strategie der Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert. tert-Butyloxycarbonylaminosäuren (Bachem, Bubendorf, Schweiz) wurden als Hydroxybenzotriazol (HOBt)-Ester an ein p-Methylbenzylhydrylamin (MBHA)-Harz (Bachem, Bubendorf, Schweiz) gekoppelt, um ein C-terminal amidiertes Peptid zu erhalten. Biotin wurde manuell an einen N-Terminus gekoppelt, indem ein dreifacher Überschuß HOBt und o-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorborat (TBTU) aktiviertes Biotin (Chemicon, Stockholm, Schweden) in DMF an Peptyl-Harz gekoppelt wurde. Das Peptid wurde schließlich von dem Harz mit flüssiger HF bei 0°C für 30 min in Gegenwart von p-Cresol gespalten. Die Reinheit des Peptids lag bei > 98 %, demonstriert durch HPLC auf einer analytischen Nucleosil 120-3 C-18 RP-HPLC-Säule (0,4 × 10 cm) und die korrekte molekulare Masse wurde durch Verwendung eines Plasma-Desorptionsmassenspektrometers (Bioion 20, Applied Biosystems, USA) oder MALDI-TOF (Vaager STR-E, Applied Biosystems, USA) wie beschrieben in U. Langel, T. Land & T. Bartfai, Design of chimeric Peptid ligands to galanin receptors and substance P receptors, Int. J. Pept. Proein Res. 39, 516–22 (1992) erhalten.
Zellkultur (beschreibt ein Default-Verfahren der unten stehenden Experimente, wenn nicht anders angegeben) Murine Fibroblasten C3H 10T1/2, Maus-Neuroblastoma-N2A-Zellen und COS-7-Zellen wurden in 10 cm Petrischalen in Dulbeccos modifiziertem Eagles-Medium (DMEM), supplementiert mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin bei 37°C in einer 5 % CO₂-Atmosphäre gezüchtet. Die Zellen wurden ausgesät und alle 5 Tage neu plattiert. COS-7 und 10T1/2-Zellen wurden mit Trypsin behandelt, wenn sie ausgesät wurden, während die N2A-Zellen durch mechanische Kraft durch Zugabe von Medien zu den Zellen suspendiert wurden. Bevor die Experimente begonnen wurden, wurden die Zellen zur Konfluenz gezüchtet und dann ausgesät und zweimal in Medien vor einer Zugabe zu Platten mit 24 Vertiefungen verdünnt (ungefähr 60 000 Zellen/Vertiefung).
Hochdurchsatz-Screening (HTS) der Beladungszufuhreffizienz
Unter Verwendung von CPP-S-S-Beladungskonstrukten, wobei die Beladung mit dem 2-Aminobenzoesäure-Fluorophor markiert ist und das CPP mit dem 2-Nitrotyrosin-Quencher ist es möglich, in Echtzeit den intrazellulären Abbau der Disulfidbindung zu überwachen, der sich aus dem reduzierenden intrazellulären Milieu umgibt und daher die zelluläre Aufnahme der Konstrukte durch Zunahme der anscheinenden Fluoreszenz.
Peptidaufnahme und Ausfluß (outflow) Studien in Zellen in Suspension oder angebunden
Die Zellen wurden mit Trypsin (Invitrogen, Schweden) abgelöst, in Kulturmedien gelöst und zentrifugiert (1000 x g für 10 min bei RT). Die Zellen wurden dann resuspendiert, gezählt und in HKR auf Eis, 300 000 Zellen/Röhrchen in Aliquots verteilt. Abz-markiertes Peptid wurde für 15 und 30 min zusammen mit den Zellen in Suspension unter Schütteln bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Um die Aufnahme oder den Ausfluß zu beenden wurde eine Trypsin-Lösung für 3 min zugeführt. Die Zellen wurden bei 1000 g für 10 min bei 4°C abzentrifugiert. Die Pellets wurden in HKR für den Fluoreszenznachweis resuspendiert oder für die Ausflußproben, wieder mit peptidfreiem HKR inkubiert. Die Fluoreszenz wurde bei 320/420 nm auf einem Spectramax Gemini XS (Molecular Devices, CA) abgelesen. Die intrazellulären Konzentrationen wurde aus einer Standardkurve von Abz-markierten Peptiden berechnet. Das durchschnittliche Zellvolumen von Caco-2-Zellen wurde unter Verwendung eines Coulter 256 channelizer (Coulter Electronics Ltd., CA) bestimmt. Zusätzlich wurde eine Variante desselben Assays verwendet: die Zellen wurden in eine Platte mit 24 Vertiefungen mit einer Dichte von 100 000 Zellen/Vertiefung ausgesät und zwar am Tag vorher. Die Zellen werden mit 5 μM Peptid-Konzentration 30 min bei 37°C inkubiert. Sie werden mit Trypsin behandelt, gewaschen und in Salzsäure lysiert. Die Fluoreszenz wurde wie für den Suspensions-Assay beschrieben gemessen.
Material und Methoden
Zellen
Menschliche Bowes-Melanomzellen wurden in MEM unter Verwendung von Standard-Zellkulturtechniken kultiviert, und mit einer Dichte von 100 000 Zellen/Vertiefung in Platten mit 24 Vertiefungen am Tag vor der Durchführung der Experimente ausgesät.
Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 4. Beispiele, die die quantitativen Messungen für die Fähigkeit verschiedener CPPs zum Eintritt in Bowes-Zellen demonstrieren, wenn 30 min bei 37°C mit einer Konzentration von 5 μM zugefügt wird

Fluoresceinyl-Peptid % der zugefügten Fluoreszenz im Zelllysat

Transportan 10,5

pVEC 4,6

YTA-2ps 3,5

LRSW-3 1,9

TP10 1,8

LRSW-1 1,4
Tabelle 4 zeigt Daten von dem bevorzugten Verfahren um zu verifizieren, daß das Peptid tatsächlich ein Zellpenetrierendes Peptid ist: Peptid-Aufnahme und Ausflußstudien in Zellen in Suspension oder angebunden (siehe unten). Ungefähr 50 Peptide wurden bis jetzt einem Screening unterzogen. Für die negative Kontrolle wird das Nicht-Membran-permeable Zuckerpolymer Fluoresceinyl-Dextran den Zellen auf dieselbe Weise zugefügt, der im Zelllysat von Dextran angetroffene Prozentsatz liegt immer < 0,5 %. Merke, daß YTA-2ps, LRSW-1 und LRSW-3 Beispiele für de novo entworfene künstliche Peptide sind.
Beispiel 2
Verfahren zur Bestimmung der spezifischen Spaltung von YTA-2ps der Matrix-Metallproteinase 2 (MMP-2):
Wie oben und in 10 illustriert, waren die Erfinder dazu in der Lage zu zeigen, daß der CPP-Teil eines selektiv CPPs (YTA-2) effizient Zellen sowohl bei 37° als auch bei 4°C betreten kann (Daten nicht gezeigt). Zusätzlich machte der "Inaktivator" das Peptid bei der Translokation über die Zellmembran weniger aktiv. Der nächste Schritt für die Entwicklung dieser Technik ist die Überprüfung der spezifischen Spaltung von YTA-2ps durch aktive MMP-2. Dies wird durch einen Fluoreszenz/Quencher-Assay durchgeführt, wobei das MMP-2-Substrat YTA-2ps bei Spaltung die Fluoreszenzintensität erhöht. Die korrekte Spaltung wird weiter durch Massenspektrometrie überprüft.
Beispiel 3
Material und Methoden
Synthese und Reinigung von TP-10 und YTA-2
Die Peptide wurden schrittweise auf einem Perkin Elmer/Applied Biosystem Modell 431A-Peptid-Synthesizer unter Verwendung der t-Boc-Strategie gemäß dem vorher beschriebenem Protokoll (Langel, Land et al. 1992) synthetisiert, Cystein oder Glutaminsäure wurden manuell gekoppelt. Die TP10-Sequenz wird in Pooga, 1998, FASER J. (SEQ ID NO: 2) angegeben. Die YTA-2-Sequenz ist in Tabelle 2 angegeben und als SEQ ID NO: 3 aufgeführt. Vor der Konjugation von Peptiden an PEI wurden sie auf einer Umkehrphasen-HPLC (Gynkotek) C18-Säule mit einem AcN/H₂O-Gradienten gereinigt und unter Verwendung eines MALDI-TOF-Massenspektrometers (Applied Biosystems, Modell Voyager STR) analysiert. Die erhaltenen Massewerte entsprachen den berechneten Werten.
Zellkultur
Murine Fibroblasten C3H 10T1/2, Maus-Neuroblastom N2A-Zellen und COS-7-Zellen wurden in 10 cm-Petrischalen in Dulbeccosmodifiziertem Eagles-Medium (DMEM), supplementiert mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin bei 37°C in einer 5 % CO₂-Atmosphäre gezüchtet. Die Zellen wurden ausgesät und alle 5 Tage neuerlich plattiert. Die COS-7- und 10T1/2-Zellen wurden mit Trypsin behandelt, während sie ausgesät wurden, während die N2A-Zellen durch mechanische Kraft durch Zugabe von Medien zu den Zellen suspendiert wurden. Vor Beginn der Experimente wurden die Zellen zur Konfluenz gezüchtet und dann ausgesät und zweimal in Medien verdünnt, bevor sie zu Platten mit 24 Vertiefungen zugefügt wurden (ungefähr 60 000 Zellen/Vertiefung).
Beispiel 4
selCPP
Einführung
Matrix-Metalloproteasen (MMPs) sind Zn² ⁺-Metallo-Endopeptidasen. Die Familie enthält sowohl Membran-gebundene als auch sezernierte Mitglieder, die beide den Zusammenbruch von Proteinen katalysieren, lokalisiert entweder auf der Plasmamembran der Zelle oder in der extrazellulären Matrix (ECM) (Sternlicht-01).
Da MMPs die ECM abbauen können, beeinflussen MMPs die Zellmigration, die Remodellierung und die entzündlichen Reaktionen. Diese Enzyme können jedoch auch an den zugrundeliegenden Auslösern für invasive und entzündliche Erkrankungen beteiligt sein, einschließlich Krebs, rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose und bakterieller Meningitis (Leppert-01).
Ein Charakteristikum für invasive Prozesse wie Metastasen und Angiogenese ist der Abbau der ECM und der Basalmembranen, die normalerweise physikalische Barrieren für die Zellmigration sind. MMPs wurden mit dem invasiven und metastatischen Verhalten einer breiten Vielzahl von malignen Vorkommen in Verbindung gebracht und diese Enzyme werden allgemein in einer Vielzahl von Tumoren überexprimiert (Sternlicht-01, Rozanov-01). Die Zahl unterschiedlicher MMPs scheint sich mit der Tumorprogression zu erhöhen (Hoekstra-01) und mit der invasiven Kapazität bestimmter Tumor zu korrelieren (Hornebeck 02). Weiterhin wurde die Expression von MMPs mit der Zahl des metastatischen Wachstums in transgenen Mäusen korreliert (Sternlicht-01).
Membran-Typ-MMPs (MT-MMP) wie MMP-MT1 wurden mit der Onkogenese in Verbindung gebracht. Diese Enzyme lokalisieren sich an invasiven Fronten. Die löslichen MMPs 1–3 und 9 wurden auch als Agonisten der Tumorigenese betrachtet (Rozanov-01 und Nabeshima-02). MMP-MT1 wird auch während der endothelen Zellinduktion und Migration während der Angiogenese hochreguliert (Galvez-01). Zusätzlich ist MMP-MT1 oder MMP14, wie es auch genannt wird, an der Aktivierung von proMMP-2 durch seine "Shedase"-Aktivität beteiligt, und setzt so aktives MMP-2 an der invasiven Front frei (Sounni-02). MMP-2 scheint eine wichtige Rolle in der Tumorangiogenese zu spielen (Chen-01).
selCPPs

Das Konzept selektiver CPPs basiert auf der Gewebespezifität der MMP-Enzymaktivität. Ein Ansatz ist die Verwendung der Endozytoseaufnahme für die Spezifität und Aktivierung des CPPs durch Konjugation an irgendeinen Rezeptorliganden wie Galanin. Tabelle 5. Sequenzen von selCPPs

Name	Sequenz	Aufnahme	In Zellen
YTA-2 SelCPP1	Biotin-YTAIAWVKAFIRKLRK-Amid (SEQ ID NO: 3)	+++	Lovo, bEnd, Caco
YTA2-ps	Biotin-SGESLAY-YTAIAWVKAFIRKLRK-Amid (SEQ ID NO: 4)	+	Lovo, bEnd, Caco
LRSW-1	LRSWVISRSIRKAA-Amid (SEQ ID NO: 5)	nd	Synthese
LRSW-2	LRSWIRRLIKAWKS-Amid (SEQ ID NO: 6)	nd	Synthese
LRSW-3	LRSWRVIIRNGQR-Amid (SEQ ID NO: 7)	nd	Synthese
SelCPP2 (Fig. 7)	coum-DEEQERSEN-IRQIKIWFQNRRMKVK*K-Amid (SEQ ID NO: 13)	++	bEnd, Caco, SHS5Y

* Fluorescein-markiert (IRQIKIWFQNRRMKWKK = SEQ ID NO: 20)

MMP-aktiviertes selCPP
Ein typisches SelCPP (8) besteht aus drei Teilen, dem Transporter (CPP), der spezifischen Proteasestelle und dem Inaktivator. Der Inaktivator wird zugefügt um das CPP zu inaktivieren, so daß es die Zellen nicht betreten kann bevor der Inaktivator abgespalten wird. Das CPP trägt ein Toxin, beispielsweise ein bekanntes nicht-permeables cytostatisches und/oder cytotoxisches Mittel. Für bevorzugte Ausführungsformen der Sequenzen und der Markierung der Peptide siehe Tabelle 5.
Die Idee basiert auf drei grundlegenden Funktionen: a) selektive Spaltung (und dadurch Aktivierung) durch MMP-2 und MMP-MT1, b) zelluläre Penetration durch das Peptid (CPP), das das Toxin trägt und dadurch c) Töten von nahegelegenen, vorzugsweise Tumorzellen oder Endothelien, die an der Tumorneovaskularisierung beteiligt sind (schematische Übersicht siehe 8).
Als illustratives Beispiel um das obige Konzept zu beweisen, haben die gegenwärtigen Erfinder erfolgreich gezeigt, daß der CPP-Teil von selektivem CPP (YTA-2) effizient Zellen sowohl bei 37°C (10 und 11) als auch 4°C (Daten nicht dargestellt) betreten kann. Zusätzlich macht der "Inaktivator", siehe 9, das Peptid bei der Translokation über die Zellmembran weniger aktiv. Die korrekte Spaltung von YTA-2 durch MMP2 wurde auch durch Massenspektrometrie (Daten nicht dargestellt) bestätigt. Die Anhaftung und Effizienz von cytostatischem und/oder cytotoxischem Mittel (MTX) an den CPP-Teil, siehe Beispiel 5.
Es gibt 4 neue Sequenzen für die Spaltung von MMP (oder MMP-MT1): LRSW1-3 und penMMP14. Das letztere wird nachweislich in Zellen aufgenommen, die MMP14 (Bowes und Caco-2) exprimieren, siehe 7.

Zusätzlich wurde das 67 kDa-Protein Fluorescein-markierte Streptavidin internalisiert, wenn es an biotinyliertes YTA-2 gebunden war (siehe 21 und 22). Dies zeigt, daß YTA-2 große Beladungsmoleküle in Zellen transportieren kann. Tabelle 6. Expression von MMP2 und MMP14 in Zelllinien im Labor

Zellen	MMP2-Expression (Experiment):	MMP14-Expression (Literatur)
Caco-2	–	–
Lovo	–	+
SHS5Y	+ (inaktiv freigesetzt)	nicht bestimmt
Bowes	+ (inaktiv freigesetzt)	+
PC12	+ (inaktiv freigesetzt)	nicht bestimmt
Rinm5F	–	nicht bestimmt

Alle für die Aufnahme bis jetzt getesteten selCPP werden durch Massenspektrometrie bestätigt. Weiterhin wird die Stabilität der Peptide in Zellkulturmedien und in Zelllysaten bestimmt. Zusätzlich wird die Selektivität der Peptide in Invitro-Zell-Assays getestet, beispielsweise mit Zellen, die die Selektivitätsprotease exprimieren, vermischt mit Zellen, die die Protease, für die Aktivierung des CPP-Teils (Tabelle 6) nicht exprimieren.
Beispiel 5
Beispiel für eine intrazelluläre Arzneimittelzufuhr: Konjugat von Methotrexat und zellpenetrierendem Peptid (MTX-CPP)
Einführung
Methotrexat (MTX) ist ein cytotoxisches Arzneimittel, das für die Behandlung maligner Vorkommnisse entwickelt wurde, das jedoch auch zur Heilung bei Autoimmunerkrankungen wie Psoriasis verwendet wird. MTX ist ein Folat-Antagonist (Formel 1) und betritt die Zelle über Folat-Transporter. Die Ziele von MTX sind Folat-benötigende Enzyme.
Die Verwendung von MTX bei der Behandlung von Psoriasis wird durch die Nebenwirkungen bei der systemischen Verabreichung, besonders schwerwiegend seine Hepatotoxizität beeinträchtigt. Daher ist eine topische Verabreichungsformulierung für MTX sehr wünschenswert.
Formel (1): Struktur von MTX
In biologischen Flüssigkeiten liegt MTX als negativ geladenes Molekül vor. Daher kann es die Zellmembran nur über Folat-Transporter überqueren. Die vorliegende Erfindung zeigt zum ersten Mal Mittel zur Erzeugung eines MTX-CPP-Konjugats, das:

1) schnell und Rezeptor/Träger-unabhängig in Zellen und die Haut eintritt
2) die Keratinozyten-Hyperproliferation, ein Hauptpunkt der Psoriasis, beeinträchtigt
3) keine unerwünschten Nebenwirkungen aufweist (wie eine Histamin-Freisetzung).

Alle MTX-CPP-Konjugate werden unter Verwendung einer Festphasen-Peptidsynthese-Strategie synthetisiert. Dies ist aufgrund von zwei Dingen möglich:

1) MTX (CAS Nr. 59-05-2) kann in zwei Struktureinheiten eingeteilt werden: 4-Desoxy-4-amino-N10-methylpteroinsäure (Apa, CAS Nr. 19741-14-1) und γ-Glutamat
2) MTX ist relativ unempfindlich gegenüber Substitutionen an der γ-Carboxyl-Gruppe

Apa-γGlu-Gly-CPP

Apa-(γGlu) 2-5-Gly-CPP

Apa-Cys-S-S-Cys-CPP

Wie in Tabelle 1 dargestellt, wurden etliche MTX-CPP-Konjugate entworfen. Es wird erwartet, daß der CPP-Teil des Konjugats in der Zelle abgebaut wird.
Festphasensynthese von MTX-CPP-Konjugaten
Es wurde eine Fmoc-Chemie verwendet, aufgrund derer MTX unter Standardspaltungsbedingungen für die Boc-Chemie (Hydrogenfluorid bei 0°C für 30 min) nicht stabil ist. Die Kupplungen von Fmoc-Glu-OtBu und Apa wurden unter Verwendung des Standardkupplungsverfahrens (HOBt/TBTU) durchgeführt. Die Konjugate wurden von dem Harz unter Verwendung von Reagens K (82,5 %, TFA: 5 %, Phenol: 5 %, Thioanisol: 2,5 %, 1,2-Ethandithiol) abgespalten.
Zellkulturen
Alle Zellen wurden bei 37°C in 5 % CO₂ kultiviert. Die Kunststofflaborware stammte von Corning Inc. (Acton, MA). Neonatale menschliche Epidermis-Keratinozyten (HEKn), alle Wachstumsmedien-Bestandteile und Trypsinierungsreagentien, die für ihrer Propagation notwendig sind, wurden von Cascade Biologics^TM (Portland, OR) erhalten. HEKn-Zellen wurden in Epilife^®-Medium kultiviert, supplementiert mit einem menschlichen Keratinozyten-Wachstumssupplement-Kit (HKGS) sowie Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B. HEKn-Zellen wurden einmal in der Woche gesplitted, wobei 300 000 Zellen pro T75 ausgesät wurden. Das Wachstumsmedium wurde alle 1 bis 2 Tage geändert.
Menschliche Bowes-Melanomzellen wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA) erhalten. Die Bowes-Zellen wurden in minimalem Essentialmedium mit Earle-Salzen kultiviert, komplementiert mit Glutamax-1, nicht-essentiellen Aminosäuren, Natriumpyruvat, Penicillin, Streptomycin (bezeichnet in den Figur als "MEM") und 10 % fötalem Rinderserum (FBS). Alle Medienbestandteile für Bowes-Zellen stammten von der Invitrogen Corporation (Paisley UK). Trypsin/EDTA stammten von PAA-Laboratories GmbH (Linz, Österreich). Die Zellen wurden einmal pro Woche subkultiviert, wobei 200 000 Zellen pro T75 ausgesät wurden. Für die Lebensfähigkeits-Assays wurden 50 000 Zellen (in 300 μl) pro eine Vertiefung in eine Platte mit 24 Vertiefungen einen Tag vor dem Experiment ausgesät.
K562 menschliche Erythroleukämiezellen wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA) erhalten. K562-Zellen wurden in RPMI-1640-Medium kultiviert, komplementiert mit Glutamax-1, Penicillin, Streptomycin (bezeichnet in 14-17 als "RPMI") und fötalem Rinderserum (7,5 %). Alle Medienbestandteile für K562-Zellen stammten von der Invitrogen-Corporation (Paisley, UK). Trypsin/EDTA stammte von PAA-Laboratories GmbH (Linz, Österreich). Die Zellen wurden jeden 2. oder 3. Tag subkultiviert (wenn die Zelldichte 1 000 000 Zellen/ml erreicht hatte), wobei 100 000 Zellen pro ml ausgesät wurden. Für die Lebensfähigkeitsassays wurden 30 000 Zellen in 300 μl pro Vertiefung in eine Platte mit 24 Vertiefungen ausgesät.
Zelllebensfähigkeitsmessungen
Die Grundlösungen der Konjugate (1 mM) wurden in sterilem Wasser hergestellt und die Grundlösung von MTX in 10 % DMSO in Wasser. Für die Aussetzung wurden die Arzneimittel in dem Aussetzungsmedium (serumfreies OPTIMEM oder 1 % FBS in MEM oder 10 % FBS in MEM oder 7,5 % FBS in RPMI) auf die gewünschten Konzentrationen (im Fall von Bowes-Zellen) oder die 10x-Endkonzentration (im Fall von K562-Zellen) verdünnt. 300 μl (für Bowes) oder 30 μl (für K562) der jeweiligen Aussetzungsmischung wurde pro Vertiefung verwendet. Im Fall einiger Experimente mit Bowes-Zellen wurde die Aussetzungsmischung nach 2 h ersetzt und durch vorher erwärmtes Arzneimittel-freies Aussetzungsmedium ersetzt. Nach 1–2 Tagen wurde die Zelllebensfähigkeit unter Verwendung des CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assays (Promega, Madison, WI) einem Assay unterworfen. Die Platten wurden auf Raumtemperatur äquilibriert (ungefähr 30 min). 300 μl CellTiter-Glo^TM-Reagens wurde jeder Vertiefung zugefügt und es wurde 10 min inkubiert. Dann wurden 300 μl auf eine weiße Polystyrol FluoroNunc^TM-Platte (Nunc A/S, Roskilde, Dänemark) übertragen und die Lumineszenz wurde mit einem Dual-Scanning-Microplate-Spektrofluorometer (SPECTRAmax^® GEMINI XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) aufgezeichnet.
Ergebnisse
Die bis jetzt erhaltenen Ergebnisse zeigen deutlich, daß die Konjugation von MTX an ein CPP die Zell-penetrierende Natur eines CPP nicht unterdrückt (wie beispielhaft dargestellt in 13, worin es gezeigt wird, daß Apa-γGlu-Gly-Evo165 in die menschlichen Epidermis-Keratinozyten eindringt) (die Aminosäuresequenz von Evo165 erscheint aus SEQ ID NO: 14 (31925) und die Varianten Evo165b-Evo165f erscheinen aus SEQ ID NOs: 15–19 (31926–31930). Außerdem haben die Erfinder festgestellt, daß die Konjugation von CPP an MTX die toxische Wirkung von MTX nicht unterdrückt. Merke, daß die γ-Carboxyl-Gruppe von MTX für eine Konjugation an CPP geeigneter ist als die α-Carboxyl-Gruppe von MTX (wie zu sehen ist in 14, worin demonstriert wird, daß Apa-γGlu-Gly-pVEC toxischer ist als Apa-Glu-Gly-pVEC). Außerdem kann eine Vielzahl unterschiedlicher CPPs in dem MTX-CPP-Konjugat verwendet werden, wie als Beispiel gezeigt durch alle getesteten Konjugate: Apa-γGlu-Gly-pVEC in 14, Apa-γGlu-Gly-Evo165 in 16 und Apa-γGlu-Gly-YTA2 in 16 und 17).
Beispiel 6
Verbesserung der siRNA-Aufnahme unter Verwendung von CPP
In den letzten Jahren wurde den kleinen interferierenden RNAs (siRNAs) viel Aufmerksamkeit im Hinblick auf ihre hochempfindliche Fähigkeit zur Regulation der Genexpression in Sängerzellen gewidmet. siRNAs sind kurze Stränge (ungefähr 20 bp) doppelsträngiger RNA, die eine spezifische Spaltung ihrer komplementären mRNA durch die Aktivierung des RNA-induzierten Silencing-Komplexes (RISC) induzieren. Das RNA-induzierte Silencing ist ein endogener Mechanismus, jedoch wurde gezeigt, daß synthetisch synthetisierte siRNAs denselben Effekt aufweisen, sowohl in vitro als auch in vivo.
Unglücklicherweise ist ein typisches Problem bei der Verwendung von siRNA die niedrige Aufnahmerate in die Zelle. Durch die Kopplung von zellpenetrierenden Peptiden (CPP) gemäß der vorliegenden Erfindung an synthetisch synthetisierte siRNAs waren die Erfinder dazu in der Lage, die zelluläre Aufnahme sowohl in vitro als auch in vivo zu verbessern.
Eine siRNA wurde gegen die Galanin-Rezeptor-1 (GALR-1) mRNA entworfen, woran ein CPP-Transportan10 (Tp10) über einen Disulfidlinker gebunden wurde. Die Eigenschaften des CPPs konnten erwiesenermaßen die zelluläre Aufnahme der siRNA erhöhen und machten sie daher für pharmazeutische Verwendung geeigneter. Eine schematische Ansicht des Mechanismus dieser Wirkung ist in 21 angegeben.
Material und Methoden
Die Bowes-Zellen wurden über Nacht in einer Platte mit 24 Vertiefungen gezüchtet (100 000 Zellen/Vertiefung). Die Zellen wurden mit 200 μl, 1 μM fluoreszenz-markiertem Peptid (pVEC) oder fluoreszenz-markiertem siRNA-Peptid (gemäß 19) 30 min bei 37°C behandelt. Die Zellen wurden 3-mal verdünntem Standardtrypsin/EDTA ausgesetzt um jegliches Peptid zu entfernen, das an der äußeren Zellmembran anhaftete. Die Zellen wurden dann mit 0,1 % Triton-X lysiert und die Aufnahme von Peptid/siRNA wurde unter Verwendung eines Spectramax Gemeni XS-Fluoreszenz-Lesers gemessen.
Ergebnisse:
Wie aus 19 ablesbar ist, wurde ein deutlicher Unterschied in der Aufnahme von CPP-konjugierter DNA (siRNA) im Vergleich zu nackter siRNA bemerkt. Die Aufnahme war nicht auf einen Membranaufbruch durch das zellpenetrierende Peptid zurückzuführen. Weiterhin internalisierte die Mischung von nicht-konjugiertem pVEC und siRNA nicht in die Zelle.
Wie auf dem Gebiet wohl bekannt ist, hat siRNA eine gute Effizienz selbst bei niedrigen Konzentrationen (bis zu pM) innerhalb der Zelle, so daß die Aufnahme als ausreichend betrachtet wird, um den siRNA-vermittelten Abbau der Ziel-mRNA potentiell zu aktivieren.
Beispiel 7
Allgemeine Verfahren bei der Charakterisierung von bioaktiven zellpenetrierenden Peptiden
Transwell^TM-Experimente
Die menschliche Kolon-Krebszelllinie Caco-2 (ATCC via LGC, Schweden) wurde in Dulbeccos modifizierten essentiellen Medien mit Glutamax (Invitrogen, Schweden), supplementiert mit 10 % fötalem Rinderserum, Natriumpuruvat 1 mM, nicht-essentiellen Aminosäuren 1 × 100, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, Luft angereichert mit 5 % CO₂ bei 37°C propagiert.
Transwell^TM-klare Schalen (0,4 μm Poren, Corning Costar, Niederlande) wurden mit bovinem Plasma-Fibronectin 0,5 μg/ml (Invitrogen, Schweden) beschichtet. 100 000 Caco-2-Zellen wurden in jede Schale einer Transwell^TM mit 12 Vertiefungen (1,13 cm² Filterbereich) ausgesät und für mindestens 10 Tage kultiviert. Die Medien wurden sowohl in den unteren (1,5 ml) als auch den oberen (0,5 ml) Kammern alle 2 bis 3 Tage gewechselt. Die Zellkonfluenz wurde in einem Phasenkontrastmikroskop überprüft und durch Messung von TEER mit einer Millicell-ERS (Millipore, Schweden) mit einem alternierenden Strom. Als Kontrollen der Zellschichtpermeabilität wurde eine FITC-markiertes Dextran 4,4 kDa (Sigma-Aldrich, Schweden) Passage mit oder ohne 10 mM EGTA-Behandlung gemessen. Vor der Zugabe der Peptide wurden die Medien in der unteren Vertiefung auf HEPES-gepufferte Krebbs-Ringer-Lösung (HKR) geändert. Der Widerstand erreichte 600 Ω/cm², bevor die Experimente initiiert wurden, Werte von mehr als 500 Ω/cm² werden als hoher Widerstand betrachtet.
Ein mit Fluorophoren markiertes Peptid mit einer Konzentration von 10 μM, gelöst in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) wurde zu der oberen Transwell^TM-Kammer zugefügt. Zu jedem Zeitpunkt wurde eine 150 μl-Probe aus der unteren Kammer gesammelt und die Fluoreszenz bei 320/420 nm (Abz) und 492/520 nm (Fluorescein) auf einem Spectramax Gemini XS (Molecular Devices, CA) gemessen.
Zelluläre Penetrationsstudien und Fluoreszenzmikroskopie
Die Zellen wurden auf Rundglasabdeckstreifen (12 mm, GTF, Schweden) gezüchtet, in einer Platte mit 24 Vertiefungen auf eine ungefähr 50%ige Konfluenz. Die Medien wurden zu serumfrei geändert und die biotinylierten Peptidlösungen wurden zugefügt. Die Zellen wurden 30 min bei 37 oder 4°C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, mit 4 % Paraformaldehydlösung 15 min bei Raumtemperatur (im Dunkeln) fixiert und dann in 30 mM HEPES-Puffer, enthaltend 0,5 % G/V Triton X-100, 3 min auf Eis permeabilisiert. Stellen für eine unspezifische Bindung wurden in PBS, enthaltend 3 % (G/V) Rinderserumalbumin über Nacht bei 4°C blockiert. Die Peptide wurden durch Anfärbung mit Avidin-FITC oder Streptavidin-TRITC (Molecular Probes, Niederlande) sichtbar gemacht. Die Zellkerne wurde mit Hoechst 33258 (0,5 νg/ml) 5 min gefärbt, woraufhin die Abdeckstreifen 3-mal mit PBS gewaschen und in 25 % Glycerin in PBS eingebracht wurden. Die Bilder wurden mit einem Leica DM IRE2-Fluoreszenzmikroskop (Leica Microsystem, Schweden) erhalten und in einer PhotoShop 6.6 software (Adobe Systems Inc., CA) (siehe z.B. 20–22) verarbeitet.
Peptidaufnahme und Ausflußstudien in Zellen in Suspension
Die Zellen wurden mit Trypsin (Invitrogen, Schweden) abgelöst, in Kulturmedien gelöst und zentrifugiert (1000 xg für 10 min bei RT). Die Zellen wurden resuspendiert, gezählt und in HKR auf Eis in Aliquots verteilt, mit 300 000 Zellen/Röhrchen. Abz-markiertes Peptid wurde für 15 und 30 min zusammen mit den Zellen in Suspension unter Schütteln bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Um die Aufnahme oder den Ausfluß zu beenden, wurde eine Trypsin-Lösung 3 min zugefügt. Die Zellen wurden mit 1000 g 10 min bei 4°C abzentrifugiert. Die Pellets wurden in HKR für den Fluoreszenznachweis resuspendiert oder für die Ausfluβproben wiederum mit peptidfreiem HKR inkubiert. Die Fluoreszenz wurde bei 320/420 nm auf einem Spectramax Gemini XS (Molecular Devices, CA) abgelesen. Die intrazellulären Konzentrationen wurden aus einer Standardkurve für Abzmarkierte Peptide berechnet. Das durchschnittliche Zellvolumen von Caco-2-Zellen wurde unter Verwendung eines Coulter 256 Channelizer (Coulter Electronic Ltd., CA) bestimmt.
Abbau von Peptiden/Aufnahme in Zellen, nachgewiesen durch Massenspektrometrie
80 % konfluente Zellen in 35 mm-Zellkulturschalen wurden mit 10 μM Peptid behandelt, gelöst in serumfreien Medien für unterschiedliche Zeitpunkte. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und Zelllysate wurden durch Behandlung der Zellen mit 0,1 % HCl für 15 min auf Eis hergestellt. Die Lysate wurden bei 13 000 g für 5 min zentrifugiert und eingefroren. Vor dem Beladen wurden die Proben unter Verwendung von C 18 Zip Tip-Säulen (Millipore, Schweden) gereinigt und dann auf einem Voyager-DR STR-System (Applied Biosystems, Framingham) analysiert.
Membran-Störungsassays
2-Desoxygluco-Assays
Zellen wurden in Platten mit 12 Vertiefungen ausgesät und für das Experiment 5 Tage nach dem Aussäen verwendet. Zunächst wurde 0,5 μCi 2-Desoxy-D-[1-3H]-glucose jeder Vertiefung (Amersham Pharmacia Biotech, UK) in Glucose-freiem Puffer zugefügt. Nach 20-minütiger Inkubation bei 37°C wurden die Peptide in serumfreiem Medium zugefügt, um die Endkonzentration von 5, 10 und 20 μM zu erreichen. Als Positivkontrolle wurden Zellen mit 1 % Triton X-100 in PBS behandelt (um die obere Leckgrenze zu etablieren). Nach 1, 5, 15 und 30 Minuten wurden 150 μl Medienproben gesammelt und ein Emulsifier Safe-Szintillationscocktail (Packard, Niederlande) wurde zugefügt und die Radioaktivität in einem Packard 3255-Flüssigszintillationszähler gemessen. Der relative radioaktive Efflux aus jeder Vertiefung wurde als Prozentsatz unbehandelter Zellen berechnet.
Lactatdehydrogenase-Assay
Das Lecken von Lactatdehydrogenase wurde unter Verwendung eines Cyclo Tox-ONE^TM Homeogeneous Membrane Integrity Assay von Promega Corp. (Promega, Madison, WI) durchgeführt und die Lactatdehydrogenase-Aktivität gemäß den Anweisungen des Herstellers berechnet.
Histamin-Freisetzungsassays
Zellkultur
RBL-2H3-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, VA) erhalten. Die Zellen wurden in Minimal Essential Medium mit Earles-Salzen, komplementiert mit Glutamax-I, nicht-essentiellen Aminosäuren, Natriumpyruvat, Penicillin, Streptomycin und wärmeinaktiviertem fötalen Rinderserum (10 %) kultiviert. Alle Medienbestandteile stammten von der Invitrogen Corporation (Paisley, UK). Trypsin/EDTA stammte von PAA Laboratories GmbH (Linz, Österreich). Die Zellen wurden zweimal pro Woche gesplittet, wobei ca. 1,2 Millionen Zellen pro T75 ausgesät wurden. Für den Histamin-Freisetzungsassay wurden 125 000 bis 250 000 Zellen (in 1 ml) pro Vertiefung in eine Platte mit 24 Vertiefungen einen Tag vor dem Experiment ausgesät.
Histaminfreiseztung
Die folgenden Lösungen wurden verwendet: Assaypuffer (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,6 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 5,5 mM Glucose, pH 7,4), 1 M NaOH, 10 mg/ml o-Phthaldialdehyd (OPT) in Methanol, 3M HCl und 0,1 % Triton X-100. Alle Chemikalien stammten von Sigma-Aldrich (St. Louis, MA). 1 mM Peptid-Grundlösungen wurden in Wasser hergestellt und weiter unter Verwendung von Assaypuffer verdünnt.
Die Zellen wurden zweimal mit Assaypuffer gewaschen und dann wurde das Peptid mit der gewünschten Konzentration in 300 μl Assaypuffer zugefügt. Für die Bestimmung des gesamten zellulären Histamins wurden einige Vertiefungen gegenüber 0,1 % Triton X-100 ausgesetzt. Nach 20-minütiger Inkubation bei 37°C wurde das Aussetzungsmedium in ein 1,5 ml-Polypropylen-Röhrchen übertragen und kurz zentrifugiert (2 min bei 3000 Upm).
Histaminbestimmung unter Verwendung von OPT
Das OPT stammte von Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO. 200 μl des Überstands wurde in eine schwarze unbehandelte Mikrotiterplatte (NUNC) übertragen und im Hinblick auf Histamin durch Zugabe von 40 μl 1M NaOH und 10 μl OPT-Lösung und 4-minütiges Schütteln einem Assay unterzogen. Um die Reaktion zu beenden wurden 20 μl 3M HCl zugefügt. Nach 30 Sekunden wurde die Fluoreszenzintensität unter Verwendung eines 355 nm-Anregungsfilters und eines 455 nm-Emissionsfilters (SPECTRAmax^®GEMINI XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) gemessen. Das freigesetzte Histamin wurde als Prozentsatz von gesamtem zellulären Histamin ausgedrückt.
Histaminbestimmung unter Verwendung von ELISA
Der ELISA-Kit für Histamin stammte von IBL GmbH (Hamburg, Deutschland). Der Assay wurde folgend den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Absorptionsmessungen wurden unter Verwendung eines Digiscan Microplate Reader von ASYS Hiltech GmbH (Fugendorf, Österreich) durchgeführt.
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Sequenzprotokoll

Claims

Zellselektives Zufuhrsystem für eine Beladung, umfassend a) eine Proteasekonsensusstelle für eine Protease, die in einer Zielzelle spezifisch überexprimiert wird, b) ein zelleindringendes Peptid und/oder ein Nicht-Peptidanalog davon und c) eine Beladung, wobei das zellselektive Zufuhrsystem zusätzlich eine Inaktivierungssequenz umfaßt, die die zelluläre Penetrationsfähigkeit des zelleindringenden Peptids unterdrückt und die durch die Protease gespalten wird.
Zellselektives Zufuhrsystem gemäß Anspruch 1, wobei das zelleindringende Peptid und/oder ein Nicht-Peptidanalog davon die Proteasekonsensusstelle umfaßt.
Zellselektives Zufuhrsystem gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Beladung ein zytostatisches und/oder zytotoxisches Mittel ist.
Zellselektives Zufuhrsystem gemäß Anspruch 1, wobei das zelleindringende Peptid und/oder ein Nicht-Peptidanalog davon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus YTAIAWVKAFIRKLRK (SEQ ID NO: 3), LRSWVISRSIRKAA (SEQ ID NO: 5), LRSWIRRLIKAWKS (SEQ ID NO: 6), LRSWRVIIRNGQR (SEQ ID NO: 7) und IRQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 20).
Zellselektives Zufuhrsystem gemäß Anspruch 2, wobei das zelleindringende Peptid und/oder ein Nicht-Peptidanalog davon, umfassend die Proteasekonsensusstelle SGESLAY-YTAIAWVKAFIRKLRK (SEQ ID NO: 4), GPLG-LRSWVISRSIRKAA (SEQ ID NO: 8), GPLG-LRSWIRRLIKAWKS (SEQ ID NO: 9), GPLG-LRSWRVIIRNGQR (SEQ ID NO: 10) und DEEQERSEN-IRQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 13) ist.
Zellselektives Zufuhrsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die überexprimierte Protease eine Zn²⁺-Metalloendopeptidase ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MMP-1, MMP-2 und MMP-MT1.
Zellselektives Zufuhrsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die überexprimierte Protease ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus bakteriellen Oberflächenproteasen und viralen Enzymen.
Zellselektives Zufuhrsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments.