JP2006514602A - 細胞侵入ペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
ZΣX=(Zxres1+Zxres2・・・+Zxresn)/n
Zxresyは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基yのそれぞれの記述子値であり、その際各残基の記述子値は記述子値スケールのZ1、Z2、Z3、Z4およびZ5記述子値に対応し、細胞侵入フラグメントは、実質的に個々の平均区間値、すなわちZΣ1<0.2;ZΣ2<1.1;ZΣ3<−0.49;ZΣ4<0.33;およびZΣ5<1.1およびZΣ5>0.12からなるZΣバルク特性値を有することによって特徴づけられる。
大部分のペプチドの定量的構造活性関係(QSAR)の研究においては、一組の無次元値を用いてアミノ酸の物理的特徴の合成物をあらわす。典型的文献において、3数値、Z1、Z2およびZ3がこの目的のために用いられる。最近、World and colleaguesはこの記述子セットに次の2つをさらに加えた:Z4およびZ5;そして87の天然および非天然アミノ酸を網羅する記述子スケールを作成した(サンドバーグ(Sandberg,M.)、エリクソン(Eriksson,L.)、ジョンソン,J(Jonsson,J.)ショーストロム(Sj str m,M.)、およびワールド(World,S.);生物学的活性ペプチドの設計のために有効な新しい化学的記述子。87アミノ酸の多変数特徴づけ(New chemical descriptors relevant for the design of biologically active peptides.A multivariate characterization of 87 amino acids)、J.Med.Chem.41巻、2481(1998))。
ZΣX=(Zxres1+Zxres2・・・+Zxresn)/n
前記アミノ酸配列中の残基類のそれぞれの記述子値の平均値ZΣ1;ZΣ2;ZΣ3;ZΣ4およびZΣ5を表1Bに列挙する。
ZΣX=(Zxres1+Zxres2・・・+Zxresn)/n
で計算される、前記アミノ酸配列における残基類のそれぞれの記述子の数値の平均値であり、Zxresyは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基yのそれぞれの記述子の数値であり、各残基の記述子の数値は表1Aに列挙したような記述子値スケールにおける記述子値Z1、Z2、Z3、Z4およびZ5に対応し、ZΣバルク特性値に基づいて前記少なくとも1つの候補フラグメント(類)から細胞侵入フラグメントを確認することを含む前記方法を開示する。細胞侵入フラグメントは本発明においては実質的に個々の平均区間値からなるZΣバルク特性値を有することによって特徴づけられ、その際ZΣ1<0.2;ZΣ2<1.1;ZΣ3<−0.49;ZΣ4<0.33;およびZΣ5<1.1およびZΣ5>0.12である。任意に前記確認されたペプチドまたは蛋白質および/または前記フラグメントの前記細胞侵入能力はインビトロおよび/またはインビボ法によってさらに証明される。
Bulkhaはアミノ酸の側鎖の原子数として計算されるが、水素は数えない。例えばCH2CH2OH(セリン)ではBulkha=2*C+1*O=3である。前記アミノ酸配列中の残基類において、ZΣBulkhaはアミノ酸側鎖の、水素以外の原子数の平均値であり、式
ZΣBulkha=(ZBulkhares1+ZBulkhares2・・・+ZBulkharesn)/n
で計算される。ZBulkharesyは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基yのそれぞれのBulkha値である。
ZΣhdb=(Zhdb res1+Zhdb res2・・・+Zhdb resn)/n
Zhdb resyは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基yのそれぞれのhdb値である。
選択クリテリアの第一組について既述したように、ペプチドの数値は平均値である(ペプチド中のアミノ酸残基の数で割ったもの)。ZΣ1、ZΣ2、ZΣ3、ZΣBulkha、ZΣhdb
3:好ましい:ZΣBulkha>3.1およびZΣBulkha<8.13、ZΣ1>−1.25およびZΣ1<3.52、ZΣ2>−3.9およびZΣ2<3.1、ZΣ3<−0.5およびZΣ3>−3.51、ZΣhdb>−0.115およびZΣhdb<5.1、およびhdb>0およびhdb<84。
2:より好ましい:ZΣBulkha>3.2およびZΣBulkha<5.9、ZΣ1>−1.25およびZΣ1<1.92、ZΣ2>−1.22およびZΣ2<1.29、ZΣ3<−0.5およびZΣ3>−1.94、ZΣhdb>0.28およびZΣhdb<2、およびhdb>5およびhdb<30。
1:最も好ましい:ZΣBulkha>3.2およびZΣBulkha<4.8、ZΣ1>−1.1およびZΣ1<1.92、ZΣ2>−1.1およびZΣ2<0、ZΣ3<−0.55およびZΣ3>−1.94、およびZΣhdb>−0.28およびZΣhdb<1.57、およびhdb>7およびhdb<25。
ZΣX=(Zxres1+Zxres2・・・+Zxresn)/n
Zxresyは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基yのそれぞれの記述子値であり、その際各残基の記述子値は表1Aに列挙される記述子値スケールのZ1、Z2、Z3、Z4およびZ5記述子値に対応する前記段階、および前記ペプチドの細胞侵入特性をそのZΣバルク特性値に基づいてチェックする段階であって、その際細胞侵入フラグメントは実質的に個々の平均区間値からなるZΣバルク特性値によって特徴づけられ、ZΣ1<0.2;ZΣ2<1.1;ZΣ3<−0.49;ZΣ4<0.33;およびZΣ5<1.1およびZΣ5>0.12である段階、前記確認された細胞侵入ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを合成または分離する段階、および任意に、合成または分離されたペプチドの蛋白質模擬機能性および/または細胞侵入能力をインビトロおよび/またはインビボ法によって証明する段階を含んでなる方法に向けられる。ここで再び任意に、上記の選択クリテリアを記述子の区間を逐次狭くするための三段階システムによって補強することができ、その際上記のように2つの追加的記述子が導入される:Bulkhaはアミノ酸の側鎖の非水素原子(C、N、S、およびO)の数であり、hdbはアミノ酸の側鎖の受容水素結合の数を示す。
ZΣX=(Zxres1+Zxres2・・・+Zxresn)/n
Zxresyは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基yのそれぞれの記述子の値であり、その際各残基の記述子の値は表1Aに列挙される記述子値スケールのZ1、Z2、Z3、Z4およびZ5記述子値に対応し、および前記少なくとも1つの候補フラグメント(類)からの細胞侵入フラグメントをそのZΣバルク特性値に基づいて確認し、その際細胞侵入フラグメントは、実質的に、ZΣ1<0.2;ZΣ2<1.1;ZΣ3<−0.49;ZΣ4<0.33;およびZΣ5<1.1およびZΣ5>0.12である個々の平均区間値からなるZΣバルク特性値を有することによって特徴づけられる。最後に、前記確認された細胞侵入ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを合成または分離し、任意に、前記合成または分離されたペプチドの蛋白質模擬機能性および/または細胞侵入能力をインビトロおよび/またはインビボの方法によって証明する。また任意に、記述子の区間を逐次狭くするための三段階システムによって上記の選択クリテリアを補強することができ、上記のように次の2つの追加的記述子が導入される:Bulkhaはアミノ酸の側鎖の非水素原子(C、N、S、およびO)の数であり、hdbはアミノ酸の側鎖の受容水素結合の数を示す。
ZΣX=(Zxres1+Zxres2・・・+Zxresn)/n
Zxresyは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基yのそれぞれの記述子の値であり、各残基の前記記述子値は表1Aに列挙される記述子値スケールのZ1、Z2、Z3、Z4およびZ5記述子値に対応するものであり、前記ペプチドの細胞侵入特性をそのZΣバルク特性値に基づいてチェックし、その際細胞侵入フラグメントは実質的に、ZΣ1<0.2;ZΣ2<1.1;ZΣ3<−0.49;ZΣ4<0.33;およびZΣ5<1.1およびZΣ5>0.12である個々の平均区間値からなるZΣバルク特性値を有することによって特徴づけられ、さらに前記確認された細胞侵入ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを合成または分離し、および任意に、合成または分離されたペプチドの蛋白質模擬機能性および/または細胞侵入能力をインビトロおよび/またはインビボの方法によって証明する諸工程を含む。また、任意に、記述子の区間を逐次狭くするための三段階システムによって上記の選択クリテリアを補強することができ、その際上記のように次の2つの追加的記述子が導入される:Bulkhaはアミノ酸の側鎖の非水素原子(C、N、S、およびO)の数であり、hdbはアミノ酸の側鎖のための受容水素結合の数を示す。
ZΣX=(Zxres1+Zxres2・・・+Zxresn)/n
Zxresyは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基yのそれぞれの記述子の値であり、各残基の前記記述子の値は表1Aに列挙される記述子値スケールのZ1、Z2、Z3、Z4およびZ5記述子値に対応するものであり、前記人工的ペプチドおよび/またはペプチドフラグメントの細胞侵入特性をそのZΣバルク特性値に基づいてチェックし、その際細胞侵入フラグメントは、実質的に、ZΣ1<0.2;ZΣ2<1.1;ZΣ3<−0.49;ZΣ4<0.33;およびZΣ5<1.1およびZΣ5>0.12である個々の平均区間値からなるZΣバルク特性値によって特徴づけられる諸工程を含む製法に関係する。この製法はさらに、細胞侵入性であることが確認されたアミノ酸配列を含む前記ペプチドおよび/またはペプチドフラグメントを合成し、任意に、その合成されたペプチドおよび/またはペプチドフラグメントの蛋白質模擬機能性および/または細胞侵入能力をインビトロおよび/またはインビボの方法によって証明することも含む。また任意に、記述子の区間を逐次狭くするための三段階システムで上記の選択クリテリアを補強することができ、その際上記のように次の2つの追加的記述子が導入される:Bulkhaはアミノ酸の側鎖の非水素原子(C、N、S、およびO)の数であり、hdbはアミノ酸の側鎖の受容水素結合の数を示す。
ZΣ2<1.2、例えばZΣ2<1.11、ZΣ2<1.12、ZΣ2<1.13、ZΣ2<1.14、ZΣ2<1.15、ZΣ2<1.16、ZΣ2<1.17、ZΣ2<1.18、またはZΣ2<1.19;
ZΣ3<−0.39、例えばZΣ3<−0.4、ZΣ3<−0.41、ZΣ3<−0.42、ZΣ3<−0.43、ZΣ3<−0.45、ZΣ3<−0.46、ZΣ3<−0.47、ZΣ3<−0.48;
ZΣ4<0.43、例えばZΣ4<0.34、ZΣ4<0.35、ZΣ4<0.36、ZΣ4<0.37、ZΣ4<0.38、ZΣ4<0.39、ZΣ4<0.4、ZΣ4<0.41、またはZΣ4<0.42;
ZΣ5<1.05およびZΣ5>0.22、例えばZΣ5<1.04およびZΣ5>0.21、ZΣ5<1.03およびZΣ5>0.20、ZΣ5<1.02およびZΣ5>0.19、ZΣ5<1.01およびZΣ5>0.18、ZΣ5<1.00およびZΣ5>0.17、ZΣ5<0.99およびZΣ5>0.16、ZΣ5<0.98およびZΣ5>0.15、ZΣ5<0.97およびZΣ5>0.14、またはZΣ5<0.96およびZΣ5>0.13;
を含むことができる。
最も好ましくは;ZΣBulkha>3.2およびZΣBulkha<4.8、およびZΣ1>−1.1およびZΣ1<1.92、およびZΣ2>−1.22およびZΣ2<0、およびZΣ3<−0.55およびZΣ3>−1.94、およびZΣhdb>−0.28およびZΣhdb<1.57、およびhdb>7およびhdb<25である。
a.機能的蛋白質模擬CPPs
b.カーゴ運搬CPPs
本発明の好ましい一実施形態は、グルカゴン様ペプチド1受容体、GLP−1受容体、から誘導される新規の合成ペプチド:GOPを含む(実施例5に詳細に記載される)。新規のCPPはGLP−1受容体の作用の強力な模擬体として作用する、すなわちそれはラットおよびヒト膵島と共にインキュベートした際にインスリン放出を高める。さらに、このペプチドおよびその細胞膜侵入類似体は、細胞と共にインキュベートした際細胞内に局在し、GLP−1受容体蛋白質作用のアゴニストの模擬体として作用することができる。したがってそれらは非インスリン依存性真性糖尿病、NIDDMの治療、および概してI型およびII型糖尿病の両方の治療に有効な強力な潜在的候補となる。
別の、同様に好ましい実施形態において、本発明に関連するCPPはその他の任意の膜貫通ペプチドに由来することができ、受容体からの誘導に限られるものではない。例えば実施例6に開示されるように、本発明の一実施形態はマウスPrpC(1−28):MANLG YWLLA LFVTM WTDVG Lckkr PKP、ヒトPrpC(1−28:MANLG CWMLV LFVAT WSDLG LCKKR PKP)、またはウシPrpC(1−30):MVKSK IGSWI LVLFV AMWSD VGLCK KRPKPから誘導されるCPPに関係する。配列番号:31896−31899を参照されたい。
本発明に関連して、細胞侵入ペプチド類はランダムペプチド配列および天然発生蛋白質の両方から誘導されるか、または新たに設計される。新たに設計されたCPPの典型的例は下の表18に与えられ、配列番号:31923−31940として示される。
既述のように、CPPはカーゴに結合し、前記カーゴを細胞、種々の細胞コンパートメント、組織または器官へ運ぶ担体として機能する。カーゴは薬物学的に興味深い物質、例えばペプチド、ポリペプチド、蛋白質、小分子物質、薬剤、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、二本鎖並びに一本鎖DNA、RNAおよび/または任意の人工的または一部人工的核酸、例えばPNA、低分子量分子、糖類、プラスミド、抗生物質、細胞傷害剤および/または抗ウィルス剤などからなる群から選択される。さらに、カーゴの運搬は例えばタグ類およびマーカー類を送達するための研究ツール並びに膜電位および/膜特性を変えるための研究ツールとして有用であり、カーゴは例えばビオチンのようなマーカー分子でもよい。
追加的に、本発明による方法によって発見されたCPPは公知の細胞侵入法、例えばトランスフェクション、マイクロインジェクション、形質導入またはエレクトロポレーションを含むインビボ遺伝子送達を改善するためにも使用できる。
今日使用できる非ウィルス性トランスフェクション試薬は主として次の3つの仕方で作用する:細胞膜を介するプラスミドの取り込みを増加する;エンドソーム膜を不安定にする;そして核内取り込みを高める。主なトランスフェクション・プロトコルおよび試薬類には:1)燐酸カルシウム沈殿;2)DEAEデキストラン、ポリリシンおよびポリエチレンイミン(PEI)としてのカチオン性ポリマー(ガーネット(Garnett,M.C.)、カチオン性ポリマーを使用する遺伝子送達システム(Gene−delivery systems using cationic polymers)Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 16巻、p.147−207(1999));3)マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーション、DNAガンなどの物理的方法(ソミアリ(Somiari,S.)ら、エレクトロポレーションによる遺伝子送達の理論およびインビボ適用(Theory and in vivo application of electroporative gene delivery)。Mol Ther 2巻、p.178−87(2000));および4)カチオンおよびアニオン性リポソームのようなリポソームベクター類(リー(Lee,R.J.)&フアング(Huang,L.)遺伝子伝達のための脂質ベクター系(Lipidic vector systems for gene transfer)。Crit.Rev Ther Carrier Syst 14巻、p.173−206(1997))がある。これらの方法およびトランスフェクション試薬の多くはインビトロおよびエキソビボトランスフェクションではうまく使用されるが、インビボ遺伝子伝達には十分には適さない(マ(Ma,H.)&ダイアモンド(Diamond,S.L.)、非ウィルス性遺伝子治療およびその送達系(Nonviral gene therapy and its delivery systems)。Curr Pharm Biotechnol 2巻、p.1−17(2001)。概して高い送達効率を有する方法は細胞にとって有毒でもある。一つの例外はマイクロインジェクションである。これは有効に送達し、無毒性でもあるが、残念ながらまとめて使用することはできない(ルオ(Luo,D.)&ザルツマン(Saltzman,W.M.)、細胞表面におけるDNAの物理的濃度によるトランスフェクションの増加(Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface)。Nat Biotechnol 18巻、p.893−5)。DEAE−デキストランおよび燐酸カルシウム沈殿のような古い化学的試薬および方法は簡単で、有効であり、いまだに広く使用されているが、細胞傷害性があり、インビボ適用は難しい。リポフェクションは細胞特異的ターゲティングが不十分であり、DEAE−脂質複合体の構造はよく理解されていない。
近年非常に目立つもう一つのアプローチは、ポリカチオンを有するDNAを濃縮するという原理に基づくトランスフェクション系の使用である。新しい命名法によると、この技術はポリプレックスと呼ばれる(フェルグナー(Felgner,P.L.)ら、合成遺伝子送達系のための命名法(Nomenclature for synthetic gene delivery systems)。Hum Gene Ther 8巻、p.511−2。(1997))。ポリプレックスは脂質ベースのベクター類より効果的で、大部分の場合毒性がより小さい(ゲブハルト(Gebhart,C.L.)&カバノフ(Kabanov,A.V.)遺伝子伝達物質としてのポリプレックスの評価(Evaluation of polyplexes as gene transfer agents)。J.Control.Release 73巻、p.401−16(2001))。最も安価で非常に有効で、最も広く使われるポリカチオンの一つはポリエチレンイミン(PEI)である(ブッシフ(Boussif,O.)ら、遺伝子およびオリゴヌクレオチドの培養細胞およびインビボ細胞への伝達のための有用なベクター:ポリエチレンイミン(A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo:polyethylenimine)。Proc Natl Acad Sci USA、92巻、p.7297−301(1995)。アブダラ(Abdallah,B.)ら、成哺乳動物脳へのインビボ遺伝子伝達のための強力な非ウィルス性ベクター:ポリエチレンイミン(A powerful nonviral for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain:polyethylenimine)。Hum Gene Ther 7巻、p.1947−54(1996)、シャツレイン(Schatzlein,A.G.)癌遺伝子治療における非ウィルス性ベクター:原理および進歩。Anticancer Drugs 12巻、p.275−304(2001))。それは高い正味の正電荷を有するためdsDNAの負電荷を中和し、DNAを濃縮する。緻密なPEI/DNA小粒体は大抵はエンドサイトーシスによって細胞内に陥入する(レミ−クリステンセン(Remy−Kristensen,A.)クランメ(Clamme,J.P.)、ブロイミア(Vuilleumier,C.)、クーリ(Kuhry,J.G.)&メリー(Mely,Y.)ポリエチレンイミン/DNA複合体によるL929線維芽細胞のトランスフェクションにおけるエンドサイトーシスの役割(Role of endocitosis in the transfection of L929 fibroblasts by polyethylenimne/DNA complexes)。Biochem Biophys Acta 1514巻、p.21−32(2001))。これらの複合体はリソソーマル酵素によるDNA分解の阻止およびエンドサイト小胞からのDNA放出の増加によってもトランスフェクションを促進する(ゲブハルトおよカバノフ、2001)。しかし残念ながら、インビトロで上首尾に使用できる濃度では、これらのポリカチオンはまが毒性が強く、全身的インビボ使用することはできない。
本発明のさらに別の実施形態において、ある細胞型/組織/器官に選択的に侵入し、またはある細胞型、組織型または器官型においてのみ活性化されるカーゴを運搬する細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体が提供される。
ZΣ2<1.2、例えばZΣ2<1.11、ZΣ2<1.12、ZΣ2<1.13、ZΣ2<1.14、ZΣ2<1.15、ZΣ2<1.16、ZΣ2<1.17、ZΣ2<1.18、またはZΣ2<1.19;
ZΣ3<−0.39、例えばZΣ3<−0.4、ZΣ3<−0.42、ZΣ3<−0.43、ZΣ3<−0.45、またはZΣ3<−0.46、ZΣ3<−0.47、またはZΣ3<−0.48;
ZΣ4<0.43、例えばZΣ4<0.34、ZΣ4<0.35、ZΣ4<0.36、ZΣ4<0.37、ZΣ4<0.38、ZΣ4<0.39、ZΣ4<0.4、ZΣ4<0.41、またはZΣ4<0.42;
ZΣ5<1.05およびZΣ5>0.22、例えばZΣ5<1.04およびZΣ5>0.21、ZΣ5<1.03およびZΣ5>0.20、ZΣ5<1.02およびZΣ5>0.19、ZΣ5<1.01およびZΣ5>0.18、ZΣ5<1.00およびZΣ5>0.17、ZΣ5<0.99およびZΣ5>0.16、ZΣ5<0.98およびZΣ5>0.15、ZΣ5<0.97およびZΣ5>0.14、またはZΣ5<0.96およびZΣ5>0.13;
を含む個々の平均値を有することはできない。
Aβ ベータ−アミロイド
AD アルツハイマー病
APP アミロイド前駆体蛋白質
AT1 アンジオテンシン・受容体AT1型
AT1A アンジオテンシン・受容体・サブタイプAT1A
AT1B アンジオテンシン・受容体・サブタイプAT1B
AT2 アンジオテンシン・受容体AT2型
BACE β−部位APP−切断酵素
Bio ビオチン、ビオチニル化
BSA ウシ血清アルブミン
CPP 細胞侵入ペプチド
CTF C−末端フラグメント
DCC N,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド
DCM ジクロロメタン
DIEA ジイソプロピルエチルアミン
DMF ジメチルホルムアミド
DNP ジニトロフェニル
EOFAD 早発性アルツハイマー病
FITC 5−フルオレセイン・イソチオシアネート
Fmoc 9−フルオレニルメトキシカルボニル
GOP IVIAKLKA−アミド
GPCR G−蛋白質結合受容体
GTP グアノシン 5’−三燐酸
GTPase グアノシントリホスファターゼ
GTPγS グアノシンγ−S−5’−三燐酸
HKR ヘペス−クレプス−リンゲル
HOBt N−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC 高性能液体クロマトグラフィー
IDE インスリン分解酵素
LOAD 遅発性アルツハイマー病
MBHA 4−メチルベンズヒドリルアミン
NFT 神経原線維糸球
NICD ノッチ細胞内ドメイン
NMP N−メチルピロリドン
NTF N−末端フラグメント
PAF パラホルムアルデヒド
PBS 燐酸緩衝食塩液
PNA ペプチド核酸
PS プレセニリン
RNA リボ核酸
SAPP 分泌APP
TACE 腫瘍壊死因子アルファ変換酵素
t−Boc tert−ブトキシカルボニル
TBTU 2−(1H−ベンゾトリアゾールー1−イル)−1,1,3,3,−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロ硼酸
TFA 三フッ化酢酸
TFA 三フッ化酢酸
TFMSA トリフルオロメタンスルホン酸
序文
大部分のペプチドの定量的構造活性関係(QSAR)の研究において、一組の無次元値を使用してアミノ酸の物理的特徴の組み合わせを説明する。典型的文献において、Z1、Z2およびZ3の3数値がこの目的のために使用される。最近の研究はこの記述子セットをさらに、Z4およびZ5の2つ広げ、87の天然および非天然アミノ酸を網羅する記述子スケールを生成した。
拡大された記述子スケール、バルク特性値ZΣ、を使用する。これは4種類の細胞侵入ペプチド(CPPs):トランスポータン、ペネトラチン、pVECおよびMAPで組み立てられ(トレーニングセット)、配列中のアミノ酸の総数で平均化したものである。ここでZ3値は主として極性をあらわし、最高の予測力を有する。多数の蛋白質およびランダム配列から、トレーニングセットから得られるバルク特性値ZΣ区間内に入る配列を探す。
ランダム−または天然蛋白質配列を検索すると、CPPsに相当する配列が集まってブロックとなってあらわれる。この挙動は“運搬モータ"、すなわちCPP特性を有する比較的短い配列が検索ウィンドウ内に存在することによる。GLP−1およびアンジオテンシン受容体類では、CPPに対応する配列は上に概略記載した方法によって正しく予測された。10,000アミノ酸長のランダム配列を検索すると、18アミノ酸のスライディングウィンドウの長さで平均32ブロックがヒットする。しかしヒット数はウィンドウの長さに依存する。その他のCPPsが対照として用いられる。上に概略記したクリテリアはCPPのTat/poly Argファミリを除いて、それら全てで真実であると考えられる。
ペプチドは固相ペプチド合成のt−Boc戦略を使用してペプチド合成器(アプライド・ビオシステムス431A型、USA)で0.1mmolスケールで段階的方法によって合成される。tert−ブチロキシカルボニルアミノ酸(バチェム、ブデンドルフ、スイス)をヒドロキシベンゾトリアゾール(HoBt)エステルとしてp−メチルベンジルヒドリルアミン(MBHA)樹脂(バチェム、ブデンドルフ、スイス)に結合させ、C−末端アミデート化ペプチドを得た。ビオチンを手動でN−末端に結合した;そのためには3倍過剰のHoBtおよびo−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウム テトラフルオロ硼酸(TBTU)活性化ビオチン(ケミコン、ストックホルム、スイス)をDMF中でペプチジル樹脂に加えた。上記ペプチドを、最後にp−クレゾールの存在下でO℃、30分間、液体HFで樹脂から切り離した。このペプチドの純度は、分析ヌクレオシル120−3 C−18 PR−HPLCカラム(0.4×10cm)上のHPLCによって測定したところ、>98%であることが証明され、正確な分子量はプラズマ脱着質量分析(ビオイン20、アプライド・ビオシステムス、USA)またはMALDI−TOF(Vaager STR−E、アプライド・ビオシステムス、USA)を使用して、記載されるようにして得た(ランゲル(Langel,U.,)、ランド(Lamd,T.)&バルトファイ(Bartfai,T.)、ガラニン受容体およびサブスタンスP受容体に対するキメラペプチドリガンドの設計(Design of chimeric peptide ligands to galanin receptors and substanceP receptors)。Int J Pept Protein Res 39巻、p.516−22(1992))。
ネズミ線維芽細胞C3H 10T1/2、マウス神経芽細胞腫N2A細胞およびCOS−7細胞を10cmペトリ皿中で、10%ウシ胎児血清(FCS)、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシンを補充したダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)中で37℃で5%CO2気流中で増殖させた。細胞を播種し、5日目ごとに再培養した。播種した際COS−7および10T1/2細胞をトリプシン化し、その一方、N2A細胞は培地をその細胞に加えて、機械的力で懸濁した。実験開始前に細胞を融合するまで増殖させ、その後播種し、培地で2倍に希釈し、その後24ウェルプレートに加えた(約60000細胞/ウェル)。
CPP−S−S−カーゴ構成物(カーゴは2−アミノ安息香酸フルオロフォアで標識化され、CPPは2−ニトロトリプシン消光剤で標識化されている)を使用することによって、還元性細胞内メジウムに起因するジスルフィド結合の細胞内分解、および目に見える蛍光の増加による前記構成物の細胞内取り込みを実時間でモニターすることができる。
細胞をトリプシン(インビトロゲン、スイス)で分離し、培養培地に溶解し、遠心分離した(1000×g、室温で10分間)。細胞を再懸濁し、計数し、その一部を300000細胞/チューブの割合で氷上のHKR中に取った。Abz−標識化ペプチドを懸濁細胞と共に、37℃の水浴中で振とうしながら15および30分間インキュベートした。取り込みまたは流出を停止するために、トリプシン溶液を3分間加えた。細胞を4℃で、100×g、10分間回転した。ペレットをHKR中に再懸濁して蛍光を検出し、または流出サンプルでは再び無ペプチドHKRと共にインキュベートした。蛍光をスペクトラマックス・ジェミニXS(モレキュラーデバイセス、カリフォルニア)上で320/420nmで読んだ。細胞内濃度をAbz標識化ペプチドの標準曲線から計算した。Caco−2細胞の平均細胞量を、クールター256チャンネライザー(クールター・エレクトロニックス社、カリフォルニア)を使用して測定した。その他に、同じアッセイの変法を使用した:細胞を24ウェルプレートに100000細胞/ウェルの密度で前日に播種した。細胞を5μMペプチド濃度で37℃で30分間インキュベートした。トリプシン処理し、洗浄し、塩酸中で溶解した。蛍光を懸濁アッセイについて記載したように測定した。
細胞
ヒトメラノーマ細胞Bowesを標準細胞培養法を使用してMEMに培養し、実験を行う前の日に24ウェルプレートに100000細胞/ウェルの密度で播種した。
10000アミノ酸長のランダムに作られた数種の配列を検索した。ヒット量はウィンドウの長さによって変動したが、総配列の約3%を保った。受容体配列に結合した約500のG蛋白質を検索し、可能性のある配列の約0.015%がCPPクリテリアに合うことが判明した。これはCPPsが自然に逆らって選択されることを示唆すると考えられる。 概略示したクリテリアは公表されたCPP配列の約95%を上首尾に予測した。
CPPsの組織特異性:
CPPsの細胞内取り込みは標的細胞の膜特性および膜電位に依存すると考えられるので、細胞特異的CPPsを得ることができる。上に概略示したクリテリアを使用して、ペプチドの、片寄りのあるライブラリーが作られる。このライブラリーについてその後、例えば上記の方法を用いて取り込み/カーゴ送達効率を試験した。つまり、CPP−S−S−カーゴ構成物(カーゴは2−アミノ安息香酸フルオロフォアで標識化され、CPPは3−ニトロチロシン消光剤で標識化されている)を使用することによって、ジスルフィド結合の細胞内分解を(実時間で)モニターできる。したがって構成物の細胞内取り込みおよびCPPのカーゴ送達効率を目に見える蛍光の増加によって測定することができる(図27)。この方法により陥入したペプチドと膜の外側に結合したペプチドとを識別する実験的に難しい工程を回避することができる。
上に、そして図27に示したように、発明者らは選択的CPP(YTA−2)のCPP部分が37℃でも4℃でも細胞に効率よく入ることができることを示した(データは示されず)。それに加えて“インアクチベータ"は細胞膜を介する転位に関してペプチドをより不活性にした。この方法の開発における次の工程は活性MMP−2によるYTA−2psの特異的切断をチェックすることである。それは蛍光/消光剤アッセイによって行われる。ここではMMP−2基質YTA−2psは切断で蛍光強度を高める。正しい切断は質量分析によってさらにチェックされる。
背景
GPCR−リガンド相互作用および諸疾患におけるそれらの模擬
7TMスパン・受容体とそれらそれぞれのG−蛋白質との相互作用は十分明らかにされており、特異的である。実際、これらの相互作用は特異的な十分明らかにされた蛋白質間のDNA/DNA相互作用に類似するものである。7TM受容体はG−蛋白質結合受容体(GPCR)であり、例えばそれらは、G−蛋白質結合を起こすと考えられている両親媒性α−ヘリカル・モチーフを露出する。GPCRの第三の細胞内ループ部分(ただし場合によっては他のループの部分も)がシグナリングに関係している。添付の略図である図7に、このような7TM受容体−G−蛋白質複合体が示される。GPCRの細胞内部分からの合成ペプチドはGPCRとG−蛋白質との相互作用を模することができる。すなわち細胞フラグメント系において証明されたように活性受容体シグナルを運搬する。
非インスリン依存性真性糖尿病、NIDDM、は2型真性糖尿病、T2DMとしても知られ、複雑なホルモン異常およびインスリン抵抗が特徴である。NIDDMの治療はその疾患の複雑さ並びにその背後にあるメカニズムの理解不足のために難しい。NIDDMの幾つかの重要な細胞性および分子レベルのメカニズムはまだ明らかになっていないと考えられる。NIDDMのメカニズムの包括的知識の不足にもかかわらず、糖尿病研究の最近の成果は研究および治療のための幾つかの有望な標的を明らかにした。
GLP−1受容体の第三細胞内ループ、iC3、から誘導される合成ペプチドはGTPaseおよびアデニレートシクラーゼ(AC)をEC50=100nMで活性化する。iC3ペプチドは強力な酵素活性剤で、AC活性を6−ないし13倍に高めることがよくある。それに加えて、これらのペプチドはG−蛋白質へのシグナル変換におけるGLP−1受容体の複雑さを研究するためのツールとして役立つかも知れない。
発明者らは、配列IVIAKLKA−アミド(GOP)を有するグルカゴン様ペプチド−1受容体、GLP−1Rから誘導される新規のオクタペプチドを設計し、合成し、インスリン放出を試験した。このペプチドは親蛋白質であるGLP−1Rの作用を模する。GLP−1Rは膵島においてインスリン放出を開始し、その後GLP−1ペプチドホルモンを認識することが知られている7回膜貫通蛋白質である。このペプチドの類似体が、被験細胞の細胞膜を転位させ得る新規の細胞侵入ペプチド、CPPsである。これらのデータは所望蛋白質のアゴニスト類(それら自体が細胞侵入性である)を設計する新しい可能性を示すものである。
ビオチン標識ペプチドの細胞侵入
血清を含む培地を無血清培地に交換し、ペプチド水溶液を直接その培地に加えて10μMの濃度にした。陰性対照を常に使用した。なぜならば生きている細胞は常に若干のビオチンを内部に有するからである。対照細胞にはペプチド溶液の代わりに純粋な水を加え、その他は他の全てと同様に処理した。細胞を5%CO2を加えた空気中で37℃または4℃で1時間インキュベートした。細胞をPBSで3回洗い、固定し、メタノールで−20℃で10分間浸透性にし、再びPBSで洗い、PBS中5%(w/v)無脂肪ミルク溶液中で1時間インキュベートして非特異的結合を減らした。ペプチド類を同じ溶液中で室温で1時間、0.1μMストレプトアビジン−FITCで染色することによって可視化した。細胞核をヘキスト33258(0.5μg/ml)で5分間DNA染色することによって可視化し、その後カバースリップをPBSで3回洗い、PBS中20%グリセロールに載せた。画像をツァイス・アクシオプラン(Zeiss Axioplan)2顕微鏡(カール・ツァイス社、ドイツ)によって得た。
インスリン分泌に与えるペプチド類の影響を体重200〜250gの雄ウィスターラットの膵島で評価した。島をコラゲナーゼ消化によって無菌的に分離し、その後一晩37℃で、10%加熱不活性化ウシ胎児血清を補充したRPMI 1640培養培地で培養した。培養後、3つの島を1回分として、10mM Hepesおよび2mg/molウシ血清アルブミンを含むクレプス−リンゲル重炭酸塩緩衝液(pH7.4)各300μl中で、37℃で1時間インキュベートすることによってインスリン分泌を測定した。インキュベーションメジウムはペプチドを含むかまたは含まず、3.3または16.7mMグルコースを含んでいた。一実験シリーズにおいて、5×105Rin m5F細胞のバッチを、メジウムからグルコースを除いたこと以外は同様な条件下でインキュベートした。インキュベーションメジウムの部分をとり、インスリンのラジオイムノアッセイを行った。インスリン分泌はμUインスリン/島/hおよびμUインスリン/5×105細胞/hでそれぞれあらわされる。統計的有意性をスチュデントt−検定で評価し、p<0.05を有意とみなした。
GLP−1R配列から誘導される短いペプチドは、分離ラット膵島からのインスリン分泌を用量依存的、グルコース依存的に増加させ得る。さらにこのペプチドはラットに静脈注射した際、インスリン分泌を高め、血糖値を低下させる。
図8において、GOP類似体M569の細胞侵入が説明される。発明者らは上記のGLP−1R誘導ペプチド類をその他に開発することができた。配列IVIAKLKAを含むこれら新世代のペプチドは、ラット膵島と共にインキュベートした際細胞侵入特性を有し、G−蛋白質を活性化し、インスリン放出を高めるという特徴を有する。GLP−1R誘導ペプチドM569は温度には無関係にヒトBowesメラノーマ細胞に侵入し、そのペプチドの同じ細胞内局在が4℃でも同様に記録される(図示されていない)。
ペプチドGOPが存在しない場合、16.7mMグルコースは、3.3mMグルコースにおける基礎的放出に比較してインスリン放出をほぼ3倍刺激した(図1および図11)。GOP(10μM)は3.3mMグルコースにおけるインスリン放出を5倍(p<0.001)刺激し、16.7mMグルコースでは1および10μMGOPによる刺激は4倍である。
体重約250gの健康な雄ウィスターラットを一晩空腹状態にした。最初の血液サンプルを遠位尾静脈の切開によって得た後(0min)、GOP(M528、100nmol/kg;n=4)を腹腔内に注射し、その後さらにグルコース(1g/kg)を腹腔内注射した。対照ラット(n=4)には食塩液およびグルコースを注射した。10および30分後に尾静脈から別の血液サンプルを採取した。血糖値をグルコースオキシダーゼ法によって測定し、血漿インスリン値はラジオイムノアッセイによって測定した。
IVV−X−KLKA、IVI−X−KLKA、IV−X1−X−KLKA
上記においてX1はアミノ酸であり、Xはリンカーである。
背景
プリオン蛋白質(PrPC)のN−末端配列は細胞侵入ペプチド(CPPs)として機能することが判明している、構成されたシグナルペプチド−NLSキメラに非常に似ている(ヴィダル(Vidal,P)ら、主要両親媒性ベクターペプチド類と膜との相互作用。コンフォメーション的因果関係および細胞局所化に与える影響(Interactions of primary amphipathic vector peptides with membranes.Conformational consequences and influence on cellular localization.)。J Membr Biol 162巻、p.259−64(1998))。これら配列類似性に基づいて、発明者らは、非切断シグナル配列を有するマウスからのPrPC誘導配列もCPPとして活性であるという仮説を試験した。発明者らは、マウスPrPC(1−28)が実際にCPPであり、カーゴ−アビジンを細胞内に運ぶ能力を有することを標準蛍光アッセイ法を用いて見いだした。蒸留水中で、PrPC(1−28)ペプチドは1mMより高い濃度で強く凝集し、特徴的β構造を有する。これらの知見は、完全N末端を有するプリオン蛋白質が細胞に侵入する仕方およびその蛋白質のスクレイピー型への変換と関係するβ構造への二次的構造変換を理解するために重要な意味を有する。
キメラCPP、すなわちHIV(1−17)のgp41からの疎水性配列+SV40大抗原T(18−24)からのNLS:MGLGL HLLVL AAALQ GAKKK RKVC(1)
マウスPrpC(1−28):MANLG YWLLA LFVTM WTDVG LCKKR PKP(2)
ヒトPrpC(1−28):MANLG CWMLV LFVAT WSDLG LCKKR PKP(3)
ウシPrPC(1−30):MVKSK IGSWI LVLFV AMWSD VGLCK KRPKP(4)
背景
アルツハイマー病は老人の痴呆の最も一般的な型であり、この病気がほとんど一世紀も前に発見されたにもかかわらず、治療法も正確な作用メカニズムも発見されていない。この病気の最も典型的な特徴はいわゆる老人斑と呼ばれる蛋白質凝集体である。これらの老人斑は主としてβ−アミロイドと呼ばれる、アミロイド前駆体蛋白質から誘導されるペプチドからなる。このβ−アミロイドペプチドはアミロイド前駆体蛋白質のプロセッシング中に作り出され、これにはプレセニリン−1およびプレセニリン−2と呼ばれる2種類の蛋白質が関係していると思われる。
実施例はアミロイド前駆体蛋白質(APP)およびプレセニリン−1(PS−1)が細胞侵入配列と呼ばれる特殊なペプチド配列を有し、その配列が細胞膜を介して転位し、生体細胞によるインターナリゼーションを助けることを証明する。これは分泌されるAPPまたはその他の任意の神経保護ペプチドが細胞に陥入し、それによってその神経保護特性をあらわすメカニズムとして使用できる。
細胞アッセイ
細胞培養:
マウス神経芽細胞腫細胞、N2A、をグルタマックス−Iを含み、10%(v/v)ウシ胎児血清、ペニシリン(100U/ml)およびストレプトマイシン(100μg/ml)を補充したダルベッコ最小必須培地に培養した。
インターナリゼーションのために用いる細胞を24ウェルプレートの丸いカバースリップ上に植え付けた。播種後1日目に細胞は半融合した。培地を無血清培地に取り替えた。フルオレセイン標識化ペプチドを最終濃度10μMになるまで加えた。37℃で60分間インキュベーション後、細胞をヘペス−クレプス−リンゲル−(HKR)緩衝液1mlで3回洗い、燐酸緩衝食塩溶液(PBS)中で3%パラホルムアルデヒド溶液で10分間固定した。細胞をその後HKR緩衝液1mlで3回洗い、カバースリップを載せ、顕微鏡検査のために密封した。
下記のペプチド類を合成し、フルオレセインに結合し、HPLC上で精製し、質量分析で分析した(ランゲル(Langel,U.)、ランド(Land,T.)&バルトファイ(Bartfai,T.)ガラニン受容体およびサブスタンスP受容体へのキメラペプチド・リガンド類の設計(Design of chimeric peptide ligands to galanin receptors and substanceP receptors);Int J Pept Protein Res)39巻、p.516−22(1992)に記載されている)。
フルオレセイン標識ペプチドに関するインターナリゼーション・アッセイに使用する細胞型はN2Aマウス神経芽細胞腫細胞であった。この細胞系はアルツハイマー病の研究に関連して一般に用いられ、これらのインターナリゼーション・アッセイ(ここではアルツハイマー病に関係する蛋白質から誘導されるペプチドが研究された)のための良いモデル細胞系として役立つ。これらのインターナリゼーション・アッセイは37℃で行われた。したがってエンドサイトーシスによるインターナリゼーションは排除できる。
実施例8は新規の血管収縮剤、より精確に述べれば、アンジオテンシン−1A受容体の細胞内C−末端から誘導される合成ペプチドを開示する。このペプチドは細胞侵入ペプチドであり、心臓冠状血管の収縮を促進する。
アンジオテンシン受容体類は7回膜貫通G−蛋白質結合受容体ファミリのメンバーであり、哺乳動物における血圧および電解質バランス維持システムの重要な構成成分である。それらには2型が存在する:AT1(AT1AおよびAT1Bサブタイプからなる)およびAT2。それらのなかでAT1がアンジオテンシンIIの公知のほとんど全ての全身作用の媒介を引き受けているようにみえる。AT1受容体は種々の組織、例えば血管、子宮、膀胱、および幾つかの内分泌腺などの平滑筋の収縮に関係し、腎臓、肝臓および中枢神経系に広く分布している。AT1受容体のアンタゴニストは潜在的抗高血圧剤であり、幾つかの非ペプチド性アンタゴニスト、例えばロルサタンは臨床的使用に導入され、成功している。しかしAT1受容体の選択的アゴニストは現在は入手できない。アゴニスト類は、血管収縮を必要とする例えば慢性低血圧または片頭痛などの症状に有用な潜在的薬剤として興味深い。
細胞培養
Bowesメラノーマ細胞(アメリカ培養コレクション CRL−9607)を10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、1%非必須アミノ酸および1%ピルビン酸ナトリウムを補充したグルタマックス含有最小必須培地(MEM、ライフ・テクノロジーズ、ストックホルム、スエーデン)に培養した。
インターナリゼーション実験のために使用する細胞を10000細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートの丸いガラスカバースリップ上に播種した。1日後、それらが約50%の融合に達したとき、培地を無血清培地に取り替え、ビオチニル化ペプチドをその培地に直接加えた。37℃または4℃で60分間インキュベーション後、細胞をPBSで3回洗い、PBS中3%(w/v)パラホルムアルデヒド溶液で15分間固定した。ビオチン標識ペプチドを間接的に検出するために、固定した細胞をPBS中0.5%トリトンX−100で浸透性にし、非特異的結合部位をPBS中5%BSAでブロックした。処理細胞をストレプトアビジン−TRITC(モレキュラー・プローブス、オランダ、1:200)と共に室温で1時間インキュベートすることによってビオチン部分を可視化した。細胞核をヘキスト33258(0.5μg/ml、モレキュラー・プローブス、オランダ)で染色した。蛍光を、CCD(C4880、浜松フォトニックス、日本)を備え付けたツァイス・アキシオプラン(Zeiss Axioplan)2顕微鏡を使用して検査した。
切り取ったブタ心臓(260〜390g)を氷冷クレプス−ヘンスレット溶液(119mM NaCl、23.8mM NaHCO3、3mM KCl、1.14mM NaH2PO4、1.63mM CaCl2、および16.5mMグルコース)に入れて、地方の屠殺場から実験室に運んだ。左前下行冠状動脈および大心臓静脈を分離した。分離後直ちに各血管部分を収縮アッセイに使用し、その一方でその一部を膜調製のために液体窒素に冷凍保存した。幾つかの実験において、内皮を機械的に除去した血管を使用した。同じ方法をヒト臍血管の調製にも用いた;臍帯はオブステトリック・クリニク・オブ・リュブリャナ・クリニカル・センタ(Obstetric Clinic of Ljublijana Clinical Center)、スロベニヤ、から入手した。
既述のように測定を行った(20)。血管の環(5mm巾)を切り取り、クレプス−ヘンスレット溶液(37℃;pH=7.4)を満たした10ml組織チェンバに取り付けた。上記溶液は95%O2および5%CO2の混合物で酸素化された。最初に50mNの伸長を加え、平衡化した後30mM KClを加えて安定なアイソメトリック収縮を得た。内皮の存在はサブスタンスPで証明した。KClおよびサブスタンスPを洗い流した後、そしてシステムの平衡を回復した後、試験ペプチドを組織チェンバに加え、血管収縮を記録した。
Gsα、Giα1およびβ1γ2の遺伝子を宿すバキュロウィルス転移ベクターはハガ・タツヤ教授(東京大学、東京、日本)から寄贈された。pVL1392中のウシGsα(21)、pVL1392中のウシGiα1(22)およびpVL1393中のウシβ1γ2(23)のためのcDNAを、線状バキュロウィルスDNA(ファーミンゲン、サンジエゴ、カリフォルニア、USA)と共にトランスフェクトし、生成したウィルスストックを1ラウンドのプラーク精製にかけ、高力価ウィルスストックを生成した。発現操作において、懸濁培養液中の200万細胞/ml密度のSf9細胞に2:1比のα対βγを感染させた。感染後48時間目に細胞を採取し、PBS中で洗い、膜を調製するまで−70℃で保存した。
血管の冷凍片を機械によって粉末化した。その後、多少の改良を加えたマッケンジーのプロトコル(Mackenzie,F.R.、シグナル形質導入(Milligan,E.、編集)、オックスフォード大学出版、オックスフォード、ニューヨーク、東京(1992))によって膜を得た。それらは使用するまで、ロウリー法(ロウリー(Lowry,O.H.)、ローゼンブロー(Rosenbrough,n.Y.)、ファール(Farr,A.L.)&ランダル(Randall,R.J.)、J.Biol.Chem.193巻、p.265−275(1951))によって測定して1〜2mg/蛋白質/ml濃度で冷凍保存した。異なる型のG−蛋白質を過剰発現するSf9細胞から膜を調製する際にも同じ方法(組織の粉末化を除いて)を使用した;これらの膜標本の蛋白質濃度は0.2ないし0.4mg/mlであった。
血管膜からのG−蛋白質への結合をマッケンジーが記載したように行った(マッケンジー;シグナル形質導入(Milligan,E.編集)、オックスフォード大学出版、オックスフォード、ニューヨーク、東京(1992))。つまり、膜(アッセイ混合物中の最終的蛋白質濃度は0.05mg/mlであった)を異なる濃度のペプチドの不在および存在下で、0.5nM[35S]GTPγSと共にTE緩衝液(10mMトリス−HCl、0.1mM EDTA)、pH7.5中で、13℃で3分間インキュベートした。未結合[35S]GTPγSは、反応混合物を真空下でミリポア社のGF/Cガラス線維フィルタによって急速濾過することによって除去された。フィルタに含まれる残った放射能をLKB1214ラックベータ(Rackbeta)液体シンチレーション・カウンタで測定した。膜標本を緩衝液に置き換えることによってブランク値を測定した。
この測定はカッセルおよびセリンガーの方法による放射能測定によって行われた(Cassel,D.&Selinger,Z.(1976)452巻(2号)、p.538−51(1976、マッケンジーによる改良を伴う)(Mackenzie,F.R.シグナル形質導入(Milligan,E.編集)オックスフォード大学出版、オックスフォード、ニューヨーク、東京(1992))。異なる型のG−蛋白質を過剰発現するSf9細胞から得られる希釈膜(アッセイ混合物中の最終的蛋白質濃度0.01mg/ml)に、ATP(1mM)、5’−アデニリルイミド二燐酸(1mM)、ウアバイン(1mM)、ホスホクレアチン(10mM)、クレアチンホスホ−キナーゼ(2.5単位/ml)、ジチオスレイトール(4mM)、MgCl2(5mM)、NaCl(100mM)、および反応混合物の部分に50000〜100000cpmを与えるための痕跡量の[γ−32P]GTP(GTPの必要な総濃度0.5μMを得るための冷GTPの添加と共に)を含む氷冷反応混合物を加えた。インキュベーション・メジウムは標準TE緩衝液、pH7.5、であった。[γ−32P]GTPのバックグラウンド低親和性加水分解を100μM GTPの存在下で平行チューブ類をインキュベートすることによって測定した。膜溶液をアッセイ緩衝液に代えることによってブランク値を測定した。GTPase反応は反応混合物を30℃水浴に20分間移すことによって開始した。未反応GTPは20mM H3PO4中活性炭5%懸濁液によって除去した。得られた放射性燐酸化合物の放射能をパッカード3255液体シンチレーション・カウンタで測定した。
ペプチドの細胞インターナリゼーション
ビオチニル化M511は間接的免疫蛍光によって判断して、4℃でも37℃でも生体細胞内に陥入した。このペプチドは温度とは無関係にBowesメラノーマ細胞に移動するから、取り込みの主なメカニズムはエンドサイトーシスではあり得ない。このペプチドは核に優先的に局所化されるが(図15A)、細胞質にも局在する。M511のスクランブルド類似体(やはりビオチニル化されている)はBowes細胞に陥入し、M511と同様な細胞内局所化および温度依存性を与えることが判明したが(図15B)、効率は若干低かった。よく研究されている細胞侵入ペプチドであるペネトラチン(12−14)を陽性対照として用いた(図15D)。
M511およびビオチニル化M511が血管の強力な収縮剤として作用することが認められた。図16の上方のパネルに見られるように、M511は16μM濃度でブタ左前下行冠状動脈の強い持続的収縮を促進する。収縮の強さはカリウムイオンの最大効果の約50%である、30mM K+の効果に匹敵する。より高濃度では、最大効果は、一般に到達し得る最大収縮効果と考えられる90mM KClの効果に近い。カリウムの収縮効果に対して、M511の効果はアッセイ溶液から収縮剤を洗っても停止させることはできなかった。さらに、M511の添加後、収縮が起きる前に、濃度に依って5ないし15分の時間的遅れがあった。結果から(図16真ん中のパネル)、M511の効果のためには血管内皮は必要でないことも判明した。図16でM511について示される定性的には同じだが、定量的にはより顕著な血管収縮が、ビオチン結合M511でも認められた(図には示されず)。M511およびビオチン標識M511によってあらわされるブタ左前下行冠状動脈の最大収縮力の濃度依存性が図17に示される。スクランブルドM511はM511と同じ環境下で収縮を全く起こさなかった(図16、下方のパネル)。
図17に示されるように、ブタ左前下行冠状動脈から得られた膜へのGTPγSの結合率はM511の存在下では用量依存的に増加し、それはビオチニル化M511の存在下ではさらにより顕著であった。500μMより高濃度のペプチド類の存在下で実験をすることができなかったため、効果の上方プラトーは得られなかった。この効果はM511に(ビオチニル化M511でも)配列特異的である、なぜならばスクランブルドペプチドは不活性であったからである。ブタ大冠状静脈およびヒト臍動脈から調製した膜でも原則として同じ結果が得られた(図は示されず)。
M511によって影響されるG−蛋白質の種類に焦点を当てるために、発明者らは異なる型のG−蛋白質を過剰発現するSf9細胞からの膜を使用し、これらの膜のGTPase活性をM511(100μM)の不在下および存在下で測定した。図17にまとめた結果はG1およびG0の小さいが有意な活性化を示し、興味深いことにG11の軽度の阻害も示す;G−蛋白質のGS型は影響を受けないようにみえる。これらの研究結果は、AT1A受容体がアデニルシクラーゼの抑制(G1/G0の活性化)を介して、およびホスホイノシチド代謝の調節を介して、十中八、九、百日咳毒素不感受性G−蛋白質(GqおよびG11)によって機能するという提唱に一致する。だが実際には、G11のM511による調節はこの種類のG−蛋白質の活性化によってではなく、むしろ抑制によって行われることが証明された。
これに加えて、発明者らは、アンジオテンシンIIアンタゴニストSar1−Thr8−アンジオテンシンIIがブタ左前下行冠状動脈に与えるアンジオテンシンIIの収縮効果を逆転させることができるが、M511によって誘発した血管収縮に影響することはできないことも証明した。これは、アンジオテンシンIIおよびM511が同じ収縮メカニズムによって作用するものではないことを強く示唆するものであり、M511がアンジオテンシン受容体を活性化せず、直接G−蛋白質に結合し、ホスホリパーゼCの活性化を誘起すると考えられるという知見を確認するものである。
M511はラットAT1A受容体の位置304−327に対応するペプチドである(表7)。図15が示すように、ビオチニル化M511は、十分研究された細胞侵入ペプチド、ペネトラチンと同様に、ヒトメラノーマ細胞系Bowesに侵入する。その上、ブタ動脈および静脈血管収縮によって得られた結果は、M511のインターナリゼーションを確認し、陥入したペプチドが天然受容体と競合し、そのシグナリング経路に影響を与えることを示唆する。興味深いことに、スクランブルド・ビオチニル化M511もBowes細胞に陥入するが、動脈または静脈血管の収縮を起こさない。筋肉収縮研究で認められた遅れ時間は、ペプチドの十分な量が細胞に侵入するために必要な時間として理解され、ペプチド濃度の増加により遅れ時間が短縮すること、並びにM511をアッセイ溶液から洗い流すことによって収縮を停止できないことは、その作用が細胞内作用であるためと考えられる。ブタ動脈および大心臓静脈およびヒト臍動脈においてM511が実質的に同じ効果をあらわすことは、この効果が静脈に限定されず、種々の組織の血管に対する一般的な性質であることを説明するものである。
発明者らはアンジオテンシンおよびその受容体を介するシグナル形質導入を研究した。細胞侵入ペプチドの研究によって、彼らは細胞マクロファージに侵入し、アンジオテンシン受容体のAT1A型に類似のエキソビボ細胞内シグナリング・カスケードを誘発するペプチドを設計することに成功した。ラットAT1A受容体のフラグメント304−327に対応するペプチドM511は温度には無関係にBowes細胞内に陥入することが見いだされた。この観察は異なる起源の血管の収縮によって確認された。濃度依存性遅れ時間後の、ブタ冠状動脈血管およびその他の数種の起源からの血管の長期持続的収縮はこのペプチドの溶液に起因するとされた。この作用の原理を発見するために、そのペプチドの、GTPγS結合率およびGα−サブタイプ選択性に与える影響を測定した。その結果、M511ペプチドはアゴニスト活性化AT1A受容体と同じ選択性でG−蛋白質サブタイプと相互作用し、それらを活性化/抑制することが判明した。血管収縮のU73122によるダウンレギュレーションは、その他の経路がホスホイノシトール燐酸系を含み、ビオチン結合M511でも認められたようにM511によってホスホリパーゼCを刺激することを示唆する(図は示されず)。M511およびビオチン標識M511によってあらわれるブタ左前下行冠状動脈の最大収縮力の濃度依存性が図17に示される。M511と同じ環境下においてスクランブルドM511は収縮を全く起こさなかった(図16、下のパネル)。
本研究において、発明者らは既に存在するPEIプロトコルに基づく新しい遺伝子送達系を開発した。PEIおよびTP10またはYTA−2の効果を組み合わせることによって、PEIだけで行うよりも実質的により高いトランスフェクション率が得られた。そのアプローチはTP10をトランスフェクション試薬に架橋させることであった。その後一般的トランスフェクション・プロトコルのPEIをCPP修飾PEIに代え、それ以上はプロトコルを変更しなかった。最適条件のもとで、結果はその他の系に比較して遺伝子送達の著しい改善を予測させる。
TP10およびYTA−2の合成および精製
上記ペプチド類をパーキン・エルマー/アプライド・ビオシステム社、431A型ペプチド合成器で、既述のプロトコルによるt−Boc戦略を用いて段階的に合成した(ランゲル、ランドら、1992)。システインまたはグルタミン酸を手動で結合させた。TP10配列は与えられている(プーガ(Pooga)、1998、FASEB.J)。システインまたはグルタミン酸を手動で結合した。TP10配列はプーガ、1998、FASEB.J.に与えられている。YTA−2配列は表5に与えられ、配列番号:31913として記載されている。あらかじめペプチド類をPEIに結合させ、それらを逆相HPLC(ギンコテク(Gynkotek))C18カラム上で、AcN/H2O勾配で精製し、MALDI−TOF質量分析計(アプライド・ビオシステム社、VoyagerSTR型)を用いて分析した。得られた質量値は計算値と一致した。
TP10またはYTA−2のPEIとの結合は2つの方法で行われた。第一の場合にはシステインをTP10のLys7側鎖、またはYTA−2のN−末端に結合した。PEI(1mg/ml、MW:60kDa、アルドリッヒ)を、種々のTP10/PEIモル比の際に必要な濃度の二官能価架橋剤スクシンイミジル トランス−4−(マレイミジルメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(SMCC)で処理した。第二の場合には、グルタミン酸をTP10のN−末端に結合し、さらにBOP生成Hebtエステルを使用してPEI(MW:60:25kDa、シグマ)に共有結合させた。形成された複合体の理論的分子量はMALDI TOF質量分析によって確認された。
ネズミ線維芽細胞C3H 10T1/2、マウス神経芽細胞腫N2A細胞およびCOS−7細胞を10cmペトリ皿中で、10%ウシ胎児血清(FCS)、2mM L−グルタミン、100U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシンを補充したダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)に増殖させた。細胞を播種し、5日目ごとに培養しなおした。播種したときにCOS−7および10T1/2細胞をトリプシン化し、その一方でN2A細胞を、それら細胞に培地を加えることによって機械的に懸濁した。実験開始前に、細胞を融合するまで増殖させ、その後播種し、培地で2倍に薄め、その後24ウェルプレートに加えた(約60000細胞/ウェル)。
pEGFP−N1、pEGFP−C2(両方共クロンテク社)、pGL3−プロモータベクター(プロメガ社)およびpRL−CMVベクター(プロメガ社)プラスミド類をメーカーの指示するプロトコルにしたがって複製コンピテント大腸菌(E.coli)に増殖させた。増殖したプラスミドをキアゲン・ミディプレプ(midiprep)(キアゲン社)を使用して精製し、アガロースゲル上に置き、プラスミドの純度および濃度を推定した。最後に濃度を各プラスミドでOD−分光器によって測定した
COS−7およびN2A細胞およびネズミ線維芽細胞C3H 10T1/2のトランスフェクション。PEI溶液を透析膜(MW−カットオフ15kDa)によって透析し、細胞に対して毒性のあるより小さいPEIフラグメントを除去した。その後TP10を上記のようにPEIに架橋させた。PEIおよび/またはCPP−PEIストック溶液(1mg/ml)を希釈し、各N/P比の実験のために同容量の溶液が使えるようにした。10μlのプラスミド(0.05μg/μl)および10μlのトランスフェクション試薬を、各実験時点に個別に96ウェルプレート中で混合した。混合物を室温で15分間インキュベートした。その間、前以て24時間培養した細胞の培地を新鮮培地に取り替えた(24ウェルプレート中、250μl/ウェル)。プラスミドおよびPEIのインキュベーションが終了した後、結合物の20μlを細胞に加えた。トランスフェクションは37℃で3時間行われ、その後培地を交換した。トランスフェクション効率をトランスフェクション後24時間または72時間に測定した。
トランスフェクション後1〜3日目にGFP発現レベルを倒立蛍光顕微鏡(蛍光顕微鏡検査のために装備したツアイス・アキシオバート(Zeis Axiovert)200、またはRFL−1蛍光装置を備えたオリンパスIMT2倒立顕微鏡)によって検査した。
ネズミ線維芽細胞C3H 10T1/2中のGFPを定量するために、細胞を溶解し、溶解物を485nmで励起し、ラブシステムズ(Labsystems)のフルオロスキャン・アセント(Ascent)CFインスツルメント(ラブシステムズ、FI)を用いてUV放射を527nmで測定した。
ウミシイタケまたはホタルのルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトした細胞を、トランスフェクション後36時間目に、受動性溶解緩衝液(プロメガ)を使用して溶解した。サンプル類を一度、凍結−融解し、ルシフェラーゼ活性を同じ日または翌日に測定した。メーカーが推薦する二重ルシフェラーゼ・キットのプロトコルをビクター(ワラク、フィンランド)ルミノメータ上で行った。得られたルシフェラーゼ活性を総蛋白質濃度1mgあたりの活性に変換した。総蛋白質濃度の測定はブラドフォード法によって行われた。
発生中のヒナドリ胚(3日)を有する卵を開け、SMV−lacZリポータ遺伝子を胚の神経管近くに注入した。48時間後に胚を取り出し、2%パラホルムアルデヒド、0.25%グルタールアルデヒド中で1〜2時間固定し、PBSTで洗い、染色溶液(9mlのスペルミジン、DMF中2%Xgal 1ml、0.5mlの165mg/ml K−フェリシアナイド、0.45mlの210mg/ml K−フェロシアナイド)で、青色が発現するまで(2時間)染色した。
CPP−PEIおよびGFP
TP10−PEI並びにYTA−2−PEI構成物は非修飾PEIプロトコルに比較して、全ての被験濃度でかなり高レベルのGFPトランスフェクションを媒介した。最も有意な増加は、ウェルあたり1μg未満の濃度のTP10−PEIで得られた。より高濃度では修飾PEIおよび非修飾PEI間の差は有意であったとはいえ、さほど著しくはなかった。図21Aa、bおよびcは、それぞれウェルあたり0.25、0.5および1.0μg濃度の非修飾PEIの効果を示す。同じ図のd、eおよびfは同じ濃度のTP10修飾PEIに対応する。平行研究において、ネズミ線維芽細胞C3H 10T1/2をN2A細胞の代わりに用いた。GFP発現は所定実験条件下ではPEI単独の実験に比べて14倍以上まで測定された(PEI−TP0.4μg 対 DNA1.2μgの比)。蛍光顕微鏡検査ではeGFP発現細胞の数はPEI−TPをトランスフェクトしたサンプルにおいて有意に高かった。
最適条件下で、完全増殖培地において、TP10修飾PEI(TP10/PEIモル比5)はルシフェラーゼ・トランスフェクション効率の約100%の増加を媒介した(図21参照)。非最適条件下では有意な陽性効果は認められなかった。
ポリカチオン分子1個あたりTP10分子1ないし100の範囲で4種類のTP10/PEI比について試験した。結果は、送達収率がこの比に依存することを示した。PEI1分子あたり5分子のTP10が最良の比であることがわかった。これに比20が続く。最適比は5ないし20であると考えられる。比1および100は最低効果を示した。
SMV−lacZ単独、またはPEIと組み合わせたSMV−lacZを胚に適用した際、リポータ遺伝子の発現は認められなかった。SMV−lacZをPEI−TP10と複合体化すると、神経管領域にリポータ遺伝子が発現するのが特殊染色によって検出された。B−ガラクトシダーゼ染色は強く、神経管領域全域にわたって同じ強度で分布していた。
ヒト7TM受容体配列をswissprot/rrmblデータベースからダウンロードした。それら配列の指示された長さ(8、12および17aa長さ)のCPPsを検索した。この蛋白質におけるCPPの開始位置をその蛋白質の全長で割り、発生頻度に対してプロットした(CPPsの部分)。ここで17aaの大きさの検索ウィンドウが最大のヒットをもたらした。4つのピークが明らかに7TM受容体の4つの細胞内部分に対応し、最大のピークは第三の内部ループ(IC3)に対応する。CPPの機能は、7TM受容体の形態並びに提示されたG蛋白質活性部位の両方と十分相関するようにみえる。図23を参照されたい。
三段階(three graded)システム
三段階は記述子区間の逐次的狭化をあらわす。これら段階のパフォーマンスは表10から明らかになる。第一に、段階が高ければ高いほど、それだけ予測CPPが“偽"の陽性である機会が低くなる。しかしCPPを見失う機会も高くなる。
3:好ましい:ZΣBulkha>3.1およびZΣBulkha<8.13およびZΣ1>−1.25およびZΣ1<3.52およびZΣ2>−3.9およびZΣ2<3.1およびZΣ3<−0.5およびZΣ3>−3.51およびZΣhdb>−0.115およびZΣhdb<5.1およびhdb>0およびhdb<84
序文
基質金属プロテアーゼ類(MMPs)はZn2+金属エンドペプチダーゼ類である。このファミリは膜結合メンバーおよび分泌メンバーの両方を含む。その両方共細胞質膜上または細胞外基質(ECM)内のどちらかに局在する蛋白質類の分解を触媒する(スターンリヒト−01)。
選択的CPPsの概念はMMPs酵素活性の組織特異性に基づく。
一アプローチはCPPをガラニンのような任意の受容体リガンドに結合することによって、エンドサイトーシス取り込みを用いてそのCPPの特異性および活性化を調べることである。
典型的selCPP(図25)は3つの部分、すなわちトランスポータ(CPP)、特異的プロテアーゼ部位およびインアクチベータから作られる。インアクチベータはCPPを不活性化するために付加され、インアクチベータが切り離される前にはそれが細胞に入ることができないようにする。CPPはトキシン、例えば公知の非侵入性細胞増殖停止物質および/または細胞傷害物質を担う。諸配列の好ましい実施形態およびペプチド類の標識化については表13を参照されたい。
アミロイド前駆体蛋白質をセクレターゼと呼ばれるプロテアーゼによって少なくとも3カ所処理する。Aβ−フラグメントを生成する、アルツハイマー病における毒性の主因であると考えられるセクレターゼは、β−およびγ−セクレターゼである。これらのセクレターゼの調節は現在、アルツハイマー病の症状を軽減する目的の薬剤の開発のために最も興味深いアプローチである。
γ−セクレターゼ切断はルシフェラーゼ・リポータ・アッセイによってモニターされる(カールシュトレム(Karlstr m)ら、J Biol Chem 2002年5月1日;277巻(9号)p.6763−6)。ペプチドを曝露する時点は、これらのペプチドに関するこれまでのデータを調べることができなかったため、任意に選んだ。ペプチドを2回加え、その間に4時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をPBSで洗い、溶解した。溶解後、ルシフェラーゼ活性および蛋白質濃度を測定した。結果は、ペプチドを加えなかった対照の%として示された。
メトトレキセートおよび細胞侵入ペプチド(MTX−CPP)の結合物
序文
メトトレキセート(MTX)は細胞傷害性薬剤であり、悪性腫瘍の治療のために開発されたものであるが、現在は乾癬のような自己免疫病の治療に使用されている。MTXは葉酸拮抗物質(式1)であり、葉酸トランスポータによって細胞に入る。MTXの標的は葉酸要求酵素である。
乾癬治療におけるMTXの使用は、全身投与時のその副作用によって抑制される。最も重大な副作用は肝毒性である。そこで、MTXの局所的投与組成物が非常に好ましい。
2)乾癬の顕著な特徴であるケラチノサイト過剰増殖を抑制する
3)不都合な副作用(ヒスタミン放出など)がない
MTX−CPP結合体を生成する手段を明らかにする。
1)MTX(CAS番号59−05−2)は2つの構造単位:4−デオキシ−4−アミノ−N10−メチルプテロイン酸(Apa、CAS番号19741−14−1)およびγ−グルタメートに分けることができる
2)MTXはそのγ−カルボキシル基上の置換に対して比較的非感受性である。
MTXはBoc化学作用の標準的切断条件のもとでは不安定であるため、Fmos−化学作用を使用した(フッ化水素、0℃、30分)。Fmos−Glu−OtBuとApaとの結合は標準カップリング法(HOBt/TBTU)を使用して行われた。結合物を試薬K(82.5%TFA:5%フェノール:5%チオアニソール:2.5%1,2−エタンジチオール)を用いて樹脂から切り離した。
全ての細胞は37℃で5%CO2中で培養された。プラスチック実験器具はコーニング社(アクトン、MA)から入手した。ヒト新生児表皮ケラチノサイト(HEKn)、全ての増殖培地の成分および、その増殖のために必要なトリプシン化試薬はカスケード・バイオロジックス(商標)(ポートランド、オレゴン)から入手した。HEKn細胞を、ヒトケラチノサイト増殖補充キット(HKGS)およびペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンフォテリシンBを補充したエピライフ(Epilife)(商標)培地に培養した。HEKn細胞を1週間に一度分割し、T75あたり300000細胞を播種した。増殖培地を1〜2日ごとに交換した。
結合物のストック溶液(1mM)を滅菌水で調製し、MTXのストック溶液を10%DMSO水溶液で調製した。曝露のために、薬剤を曝露培地(無血清OPTIMEMまたはMEM中1%FBSまたはMEM中10%FBSまたはRPMI中7.5%FBS)で希釈し、所望濃度(Bowes細胞の場合)または10×最終濃度(K562細胞の場合)にした。1ウェルにつき、それぞれの曝露混合物300μl(Bowesの場合)または30μl(K562の場合)を使用した。Bowes細胞を使用するいくつかの実験で、曝露混合物を2時間後に除去し、あらかじめ温めた薬剤不含有曝露培地に代えた。1〜2日後、細胞の生育性をセルタイタ−グロ(CellTiter−Glo)(商標)ルミネセント細胞生育性アッセイ(プロメガ、マディソン、ウィスコンシン)を使用して試験した。プレートを室温で平衡化した(約30分間)。セルタイタ−グロ(商標)試薬300μlを各ウェルに付加し、10分間インキュベートした。300μlを白色ポリスチレン製フルオロヌンク(FluoroNunc)(商標)プレート(ヌンクA/S、ロスカイルド、デンマーク)に移し、ルミネセンスを二重走査ミクロプレート・スペクトロフルオロメータ(SPECTRAmax(商標)GEMINI XS、モレキュラー・デバイセス、サニーベイル、カリホルニア)で記録した。
これまでに得られた結果は、CPPへのMTXの結合はCPPの細胞侵入性を破壊しないことを明らかに示した(図31にはApa−γGlu−Gly−Evo165がヒト上皮ケラチノサイトに侵入することが示される)。また発明者らは、CPPへのMTXの結合がMTXの毒性作用を破壊しないことも見いだした。MTXのγ−カルボキシル基はMTXのα−カルボキシル基よりもCPPへの結合に適していることに注目されたい(図32に見られるように、Apa−γGlu−Gly−pVECはApa−Glu−GlypVECより毒性が大きいことが証明されている)。さらに言えることは、これまでに試験された全ての結合物によって例示されるように、種々の異なるCPPsがMTX−CPP結合物において有用であることである:図32のApa−γGlu−Gly−pVEC、図34のApa−γGlu−Gly−Evo165および図34および図35のApa−γGlu−Gly−YTA2。
近年、小さい干渉RRNAが、哺乳動物細胞における遺伝子発現を調節する高い選択能力のために多くの注目を集めている。siRNAは、RNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)の活性化によってそれらの相補的mRNAの特異的切断を誘起する二本鎖RNAの短い鎖(約20bp)である。RNA誘導性サイレンシングは内性メカニズムであるが、合成によって合成されたsiRNAはインビトロでもインビボでも同じ効果を有することが示された。
Bowese細胞を24ウェルプレートで一晩増殖させた(100000細胞/ウェル)。それら細胞を200μlの1μM蛍光標識ペプチド(pVEC)、または蛍光標識したsiRNA−ペプチド(図37による)で37℃で30分間処理した。細胞を3倍希釈の標準トリプシン/EDTAにさらし、外側細胞膜にくっついた全てのペプチドを除去した。細胞をその後0.1%トリトン−Xで溶解し、スペクトロマックス・ゲメニXS(Spectromax Gemeni XS)蛍光リーダを使用してペプチド/siRNAの取り込みを測定した。
図37からわかるように、結合していないsiRNAに比較して、CPP−結合DNA(siRNA)の取り込みには明らかな差が認められた。取り込みは細胞侵入ペプチドによる膜の破壊によるものではなかった。さらに、非結合のpVECおよびsiRNAの混合物は細胞内に陥入しなかった。
当業者には公知のように、siRNAは細胞内で低濃度(pMレベル以下)でも良い効率を有したから、この取り込みは標的mRNAのsiRNA媒介性分解を十分活性化する可能性があると考えられる。
トランスウェル(商標)実験
ヒト結腸癌細胞系Caco−2(ATCC via LGC、スエーデン)を10%ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム1mM、非必須アミノ酸1×100、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを補充した、グルタマックス(インビトロゲン、スエーデン)を含むダルベッコ改良必須培地に、5%CO2を富化した空気中で37℃で増殖させた。
細胞を24−ウェルプレート中の丸いガラスカバースリップ(12mm、GTF、スエーデン)上に約50%融合するまで増殖させた。培地を無血清培地に代え、ビオチニル化ペプチド溶液を加えた。細胞を37℃または4℃で30分間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗い、4%パラホルムアルデヒド溶液で室温で(暗所)15分間固定し、その後0.5%w/vトリトンX−100を含む30mM HEPES緩衝液中で氷上で3分間、浸透性にした。非特異的結合部位を3%(w/v)ウシ血清アルブミンを含むPBS中で4℃で一晩ブロックした。ペプチド類をアビジン−FITCまたはストレプトアビジン−TRITC(モレキュラー・プローブス、オランダ)で染めることによって可視化した。細胞核をヘキスト33258(0.5μg/ml)で5分間染色し、その後カバースリップをPBSで3回洗い、PBS中25%グリセロール中に固定する。画像をライカ(Leica)DM IRE2蛍光顕微鏡(ライカ・マイクロシステム、スエーデン)でとり、フォトショップ(PhotoShop)6.0ソフトウエア(アドーブシステムズ社(Adobe Systens)、カリホルニア)で処理した(図38〜図40などを参照されたい)。
細胞をトリプシン(インビトロゲン、スエーデン)で脱着し、培養培地に溶解し、遠心分離した(1000×g、10分間、室温)。細胞を再懸濁し、数え、氷上のHKR中に300000細胞/チューブづつ取り分けた。Abz標識化ペプチドを懸濁液中の細胞と一緒に37℃で15分間および30分間振とうしながらインキュベートした。取り込みまたは流出を停止するために、トリプシン溶液を3分間加えた。細胞を1000×gで4℃で10分間スピンダウンした。蛍光検出のためにペレットをHKRに再懸濁し、または流出サンプルで、無ペプチドHKRと共に再びインキュベートした。蛍光をスペクトロマックス・ゲミニXS(モレキュラーデバイス、カリホルニア)で320/420nmで読んだ。細胞内濃度をAbz−標識ペプチドの標準曲線から計算した。Caco−2細胞の平均細胞容量をクールター256チャネライザー(クールタ・エレクトロニックス社、カリホルニア)を使用して測定した。
35mm細胞培養皿における8%融合細胞を、種々の時点において、無血清培地に溶解した10μMペプチドで処理した。細胞をPBSで3回洗い、細胞を氷上で0.1%HClで15分間処理することによって細胞溶解物を調製した。溶解物を13000gで5分間遠心分離し、凍結した。充填する前に、それらのサンプルをC18 Zip Tipカラム(ミリポア、スエーデン)を用いて精製し、その後Voyager−DR STR装置で分析した(アプライド・ビオシステムズ、フラミンガム)。
2−デオキシグルコース・アッセイ
細胞を12−ウェルプレートに播種し、播種の5日後に実験に使用した。先ず最初に、2−デオキシ−D−[1−3H]−グルコースの0.5μCiを無糖緩衝液中で各ウェル(アマーシャム・ファルマシア・ビオテク、英国)に加えた。37℃で20分間インキュベーション後、ペプチドを無血清培地に加え、最終濃度5、10および20μMにした。陽性対照として、細胞をPBS中1%トリトンX−100で処理した(漏出の上限を確認するため)。1、5、15および30分に、150μl培地サンプルを集め、エマルジファイアセーフ・シンチレーション・カクテル(パッカード、オランダ)を加え、放射能をパッカード3255液体シンチレーションカウンタで測定した。各ウェルからの相対的放射性流出を未処理細胞のパーセンテージとして計算した。
ラクテート・デヒドロゲナーゼ漏出を、プロメガ社(プロメガ、マジソン、ウィスコンシン)のCycloTox−ONE(商標)ホメオゲナス・メンブラン・インテグリティ・(Homeogeneous Membrane Integrity)アッセイを用いて試験し、メーカーの説明書によってラクテート・デヒドロゲナーゼ活性を計算した。
細胞培養
RBL−2H3細胞をアメリカ培養コレクション(マナッサス、ヴァージニア)から入手した。細胞を、グルタマックス−I、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび加熱不活性化ウシ胎児血清(10%)を補充したイーグル最小必須培地に培養した。全培地成分はインビトロゲン・コーポレーション(ペイスリー、英国)から得た。トリプシン/EDTAはPAAラボラトリーズ社(リンツ、オーストリア)から得た。細胞を1週間に2回分割し、T75あたり約1.2百万個の細胞を播種した。ヒスタミン放出アッセイでは、実験の前日に、24ウェル−プレートに1ウェルごとに125000〜250000個の細胞(1ml中)を播種した。
OPTはシグマ−アルドリッヒ社、セントルイス、ミズーリ州、から入手した。上澄液200μlを黒色未処理マイクロウエル−プレート(NUNC)に移し、40μlの1M NaOHおよび10μlのOPT溶液を加え、4分間振とうすることによってヒスタミンを測定した。反応を停止するために、20μlの3M HClを加えた。30秒後、蛍光強度を355nm励起フィルタおよび455nm発光フィルタを使用して測定した(SPEKTRAMAX(商標)GEMINI XS、モレキュラデバイス、サニーベイル、カリホルニア)。放出されたヒスタミンを総細胞ヒスタミンのパーセンテージとしてあらわした。
ヒスタミン用のELISAキットはIBL社(ハンブルグ、ドイツ)から入手した。アッセイはメーカーの説明書にしたがって実施した。吸光度測定はASYS Hith社(ユーゲンドルフ、オーストリア)からのディジスキャン(Digiscan)・マイクロプレート・リーダーを使用して行った。
[35S]−GTPγS結合の初速度に与えるペプチドの影響を若干改良を加えたマッケンジーによるプロトコルにしたがって測定した。つまり、膜を50000〜70000cpmの[35S]−GTPγS(アマーシャム・ビオサイエンシス)と共にアッセイ緩衝液(10mMトリス−HCl、0.1mM EDTA、5mM MgCl2、150mM NaCl、1mM DTT、10μM GDP、pH7.5)中でインキュベートした。アッセイ混合物中における最終的蛋白質濃度、インキュベーション時間および温度を調節し、結合曲線の直線部分にウィンドウを与えるようにした。一般的には、それぞれの数値は1−2.5mg/ml、2〜5分、15または25℃であった。未結合[35S]−GTPγSを除去するために、0.9mlの氷冷TE緩衝液(10mMトリスーHCl、0.1mM EDTA、pH7.5)を加え、反応混合物を、少なくとも1時間TE緩衝液に予備浸漬した、結合樹脂のないガラス繊維フィルタ(ミリポア、APFA02500)を通して急速濾過した。それらのフィルタを3×5mlの氷冷TE−緩衝液で洗い、カウンティング・バイアルに移した。10mlのシンチレーション・カクテル(エマルジファイアーセイフパッカード)を各バイアルに加え、翌日放射能を計数した。
CGRP受容体ループiC4、配列391−405(VQAILRRNWNQYKIQ)を合成し、At1ARループについて既述したように、血管で試験した。
1.細胞培養
Rin m5F細胞を10%ウシ胎児血清、2mM L−グルタミン、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを補充したRPMI−1640培地に単層培養として37℃で5%CO2空気中で増殖させた。
Sf9細胞は、10%加熱活性化ウシ胎児血清、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを補充したグレース(Grace)のインセクト培地に単層培養として28℃で5%CO2空気中で維持した。
Sf9細胞に、ヘテロトリマーG−蛋白質(Gαs、Gαi1、Gαo、Gα11)の種々のαサブユニットを担う組換えバキュロウィルス・ベクターをβ1γ2と共に、若干改良したネスマン(Naessman)らの方法によって同時トランスフェクトした。つまり、約6×106細胞/75cm2フラスコ に高力価組換えバキュロウィルス・ストック溶液を感染させた。28℃で60分間インキュベーションした後、ウィルスストックを除去し、新鮮培地を加え、細胞を28℃で3日間増殖させた。G−蛋白質の発現を11%SDS−PAGEによって分析した。それは対照の非トランスフェクト細胞とは異なり、G−蛋白質のβ−サブユニットおよびαサブユニットにそれぞれ対応する分子量36および40〜45kDaの強い蛋白質バンドを示した。過剰発現したG−蛋白質の各型(Gs、Gi1、Go、G11)を、それぞれのモノクローナル抗体を使用してさらにチェックした。過剰発現の収率は、トランスフェクト細胞および非トランスフェクト細胞から得られた膜に対する[35S]−GTPγS結合率の比較によって評価した。
細胞膜を既述のように若干改良を加えたマッケンジーたらのプロトコル、1992、によって得た。単層細胞培養物を洗浄し、その後TE緩衝液(10mM トリス−HCl、0.1mM EDTA、pH7.5)に再懸濁した。脳膜の場合はウィスターラットを殺し、全脳を摘出し、スライスした。脳皮質を分離し、液体窒素中で速やかに凍結した。膜調製の直前に、組織を細かく切り刻んだ。材料(組織または細胞)をポリトロン型ホモジナイザー(ブラウン社(Braun AG)、ドイツ)でホモジナイズした。ホモジネートを500×gで15分間遠心分離し、上澄液をベックマン−L8 70M超遠心機(ベックマン・インスツルメント、USA)で40000×gで30分間遠心分離することによって膜を集めた。全操作は4℃未満の温度で行われた。膜調製物中の蛋白質濃度はローリーらの方法(1952)によって測定して1ないし2.5mg/mlであった。
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Claims (76)
- 細胞侵入ペプチドまたは蛋白質および/またはペプチドまたは蛋白質の細胞侵入フラグメントを確認する方法であって、
a)前記蛋白質またはペプチドのアミノ酸配列を得、
b)少なくとも1つの候補フラグメントのアミノ酸配列を選択し、
d)前記配列のバルク特性値ZΣを評価し、ZΣは少なくとも5つの個々の平均区間値ZΣ1;ZΣ2;ZΣ3;ZΣ4およびZΣ5を含み、
前記ZΣ1、ZΣ2、ZΣ3、ZΣ4およびZΣ5は前記アミノ酸配列における残基類のそれぞれの記述子値の平均値であり、下記の式で計算され
ZΣX=(Zxres1+Zrxes2・・・・+Zxresn)/n
Zxresyは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基yのそれぞれの記述子値であり、各残基の記述子値は表1Aに記載される記述子値スケールにおけるZ1;Z2;Z3;Z4およびZ5記述子値に対応し、
e)前記少なくとも1つの候補フラグメント(類)から、そのZΣバルク特性値に基づいて細胞侵入フラグメントを確認し、
細胞侵入フラグメントは実質的に個々の平均区間値からなるZΣバルク特性値を有することによって特徴づけられ、ZΣ1<0.2;ZΣ2<1.1;ZΣ3<−0.49;ZΣ4<0.33;およびZΣ5<1.1およびZΣ5>0.12であり、
f)任意にインビトロおよび/またはインビボ法によって前記確認されたペプチドまたは蛋白質および/または前記フラグメントの細胞侵入能力を証明する諸工程を含む方法。 - ペプチドの細胞侵入特性をチェックする方法であって、
a)ペプチドのアミノ酸配列を得、
d)前記配列のバルク特性値ZΣを評価し、ZΣは少なくとも5つの個々の平均区間値ZΣ1;ZΣ2;ZΣ3;ZΣ4およびZΣ5を含み、
ここでZΣ1、ZΣ2、ZΣ3、ZΣ4およびZΣ5は下記の式で計算される、前記アミノ酸配列中の残基類のそれぞれの記述子値の平均値であり
ZΣX=(Zxres1+Zxres2・・・・+Zxresn)/n
Zxresyは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基yのそれぞれの記述子値であり、各残基の記述子値は表1Aに記載される記述子値スケールにおけるZ1、Z2、Z3、Z4およびZ5記述子値に対応し、
e)前記ペプチドの細胞侵入特性を、そのZΣバルク特性値に基づいてチェックし、細胞侵入フラグメントは実質的に個々の平均区間値からなるZΣバルク特性値を有することによって特徴づけられ、ZΣ1<0.2;ZΣ2<1.1;ZΣ3<−0.49;ZΣ4<0.33;およびZΣ5<1.1およびZΣ5>0.12であり、
f)前記確認された細胞侵入ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを合成または分離し、
g)任意に、合成または分離されたペプチドの蛋白質模擬機能性および/または細胞侵入能力をインビトロおよび/またはインビボ法によって証明する
諸工程を含む方法。 - 細胞侵入ペプチドおよび機能的蛋白質模擬ペプチドの製法であって、
a)対象とする機能的蛋白質を選択し、
b)前記選択された蛋白質のアミノ酸配列を得、
c)前記蛋白質の細胞内部分に対応する少なくとも1つの候補フラグメントのアミノ酸配列を選択し、
d)前記配列のバルク特性値ZΣを評価し、ZΣは少なくとも5つの個々の平均区間値ZΣ1;ZΣ2;ZΣ3;ZΣ4およびZΣ5を含み、
ZΣ1、ZΣ2、ZΣ3、ZΣ4およびZΣ5は下記の式で計算される前記アミノ酸配列中の残基類のそれぞれの記述子値の平均値であり、
ZΣX=(Zxres1+Zxres2・・・・+Zxresn)/n
Zxresyは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基yのそれぞれの記述子値であり、各残基の記述子値は表1Aに記載される記述子値スケールにおけるZ1、Z2、Z3、Z4およびZ5記述子値に対応し、
e)前記少なくとも1つの候補フラグメント(類)からそのZΣバルク特性値に基づいて細胞侵入フラグメントを確認し、
細胞侵入フラグメントは実質的に個々の平均区間値からなるZΣバルク特性値を有することによって特徴づけられ、その際ZΣ1<0.2;ZΣ2<1.1;ZΣ3<−0.49;ZΣ4<0.33;およびZΣ5<1.1およびZΣ5>0.12であり、
f)前記確認された細胞侵入ペプチドのアミノ酸配列を含むペプチドを合成または分離し、
g)任意に、前記合成または分離されたペプチドの蛋白質模擬機能性および/または細胞侵入能力をインビトロおよび/またはインビボ法によって証明する
諸工程を含む方法。 - 人工的細胞侵入ペプチドおよび/または人工的細胞侵入性および機能的蛋白質模擬ペプチドを新たに設計し、生産する方法であって、
a)少なくとも1つの人工的ペプチドおよび/またはペプチドフラグメントを設計し、 d)前記人工的ペプチドまたはペプチドフラグメントのアミノ酸配列のバルク特性値ZΣを評価し、ZΣは少なくとも5つの個々の平均区間値ZΣ1;ZΣ2;ZΣ3;ZΣ4およびZΣ5を含み、
ここでZΣ1、ZΣ2、ZΣ3、ZΣ4およびZΣ5は下記の式で計算される前記アミノ酸配列中の残基類のそれぞれの記述子値の平均値であり
ZΣX=(Zxres1+Zxres2・・・・+Zxresn)/n
Zxresyは選択された候補フラグメントに含まれるアミノ酸残基yのそれぞれの記述子値であり、各残基の記述子値は表1Aに記載される記述子値スケールにおけるZ1、Z2、Z3、Z4およびZ5記述子値に対応し、
e)前記人工的ペプチドおよび/またはペプチドフラグメントの細胞侵入特性をそのZΣバルク特性値に基づいてチェックし、
細胞侵入フラグメントは実質的に個々の平均区間値からなるZΣバルク特性値を有することによって特徴づけられ、その際ZΣ1<0.2;ZΣ2<1.1;ZΣ3<−0.49;ZΣ4<0.33;およびZΣ5<1.1およびZΣ5>0.12であり、
f)細胞侵入性であることが確認されたアミノ酸配列を含む前記ペプチドおよび/またはペプチドフラグメントを合成し、および
g)任意に、合成ペプチドおよび/またはペプチドフラグメントの蛋白質模擬機能性および/または細胞侵入能力をインビトロおよび/またはインビボ法によって証明する
諸工程を含む方法。 - 工程e)後の前記アミノ酸配列が追加的に
h)実質的に個々の平均区間値、すなわちZΣBulkha>3.1およびZΣBulkha<8.13およびZΣ1>−1.25およびZΣ1<3.52およびZΣ2>−3.9およびZΣ2<3.1およびZΣ3<−0.5およびZΣ3>−3.51およびZΣhdb>−0.115およびZΣhdb<5.1およびhdb>0およびhdb<84からなる特性値を有することに関して評価され、選択される
請求項1ないし請求項4のいずれかの項に記載の方法。 - 工程e)後の前記アミノ酸配列が追加的に
h)実質的に個々の平均区間値、すなわちZΣBulkha>3.2およびZΣBulkha<5.9およびZΣ1>−1.25およびZΣ1<1.92およびZΣ2>−1.22およびZΣ2<1.29およびZΣ3<−0.5およびZΣ3>−1.94およびZΣhdb>0.28およびZΣhdb<2およびhdb>5およびhdb<30からなる特性値を有することに関して評価および選択される請求項1ないし請求項4のいずれかの項に記載の方法。 - 工程e)後の前記アミノ酸配列が追加的に
h)実質的に個々の平均区間値、すなわちZΣBulkha>3.2およびZΣBulkha<4.8およびZΣ1>−1.1およびZΣ1<1.92およびZΣ2>−1.1およびZΣ2<0およびZΣ3<−0.55およびZΣ3>−1.94およびZΣhdb>−0.28およびZΣhdb<1.57およびhdb>7およびhdb<25からなる特性値を有することに関して評価および選択される
請求項1ないし請求項4のいずれかの項に記載の方法。 - 工程d)およびe)に代わって、
h)実質的に個々の平均区間値、すなわちZΣBulkha>3.1およびZΣBulkha<8.13およびZΣ1>−1.25およびZΣ1<3.52およびZΣ2>−3.9およびZΣ2<3.1およびZΣ3<−0.5およびZΣ3>−3.51およびZΣhdb>−0.115およびZΣhdb<5.1およびhdb>0およびhdb<84からなる特性値を有することに関してアミノ酸配列を評価し、選択する
工程を含む請求項1ないし請求項4のいずれかの項に記載の方法。 - 工程d)およびe)に代わって
h)実質的に、個々の平均区間値、すなわちZΣBulkha>3.2およびZΣBulkha<5.9およびZΣ1>−1.25およびZΣ1<1.92およびZΣ2>−1.22およびZΣ2<1.29およびZΣ3<−0.5およびZΣ3>−1.94およびZΣhdb>−0.28およびZΣhdb<2およびhdb>5およびhdb<30からなる特性値を有することに関してアミノ酸配列を評価および選択する工程を含む
請求項1ないし請求項4のいずれかの項に記載の方法。 - 工程d)およびe)に代わって、
h)実質的に、個々の平均区間値、すなわちZΣBulkha>3.2およびZΣBulkha<4.8およびZΣ1>−1.1およびZΣ1<1.92およびZΣ2>−1.1およびZΣ2<0およびZΣ3<−0.55およびZΣ3>−1.94およびZΣhdb>−0.28およびZΣhdb<1.57およびhdb>7およびhdb<25からなる特性値を有することに関してアミノ酸配列を評価および選択する工程を含む
請求項1ないし請求項4のいずれかの項に記載の方法。 - 前記蛋白質が膜貫通蛋白質である請求項1ないし請求項10のいずれかの項に記載の方法。
- 前記蛋白質がヒトPrpC、アミロイド前駆体蛋白質(APP)およびプレセニリン−1(PS−1)からなる群から選択される蛋白質である請求項11記載の方法。
- 前記蛋白質が哺乳動物受容体、例えばチロシンキナーゼ受容体のスーパーファミリに属する受容体、7TM受容体および/またはG−蛋白質結合受容体などである請求項11記載の方法。
- 前記蛋白質がGLP−1受容体、AT1A受容体、およびドーパミン−2受容体からなる群から選択される蛋白質である請求項13記載の方法。
- 前記ペプチドおよび/またはペプチドフラグメントの細胞侵入能力を、前記ペプチドおよび/またはペプチドフラグメントに曝露した後の前記細胞への検出可能色素の取り込み率をモニターすることによって証明する先行請求項のいずれかの項に記載の方法。
- 前記色素がフルオレセインである請求項15記載の方法。
- 先行請求項のいずれかの項に記載の方法によって得られる細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体。
- 実質的に、先行請求項のいずれかの項に記載の方法によって得られるペプチドからなる細胞侵入ペプチド。
- 細胞侵入能力を有する8ないし50アミノ酸残基長のペプチドまたはそのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
- ペプチドが14ないし30アミノ酸残基長である請求項19記載の細胞侵入ペプチド。
- ペプチドが16ないし20アミノ酸残基長である請求項19記載の細胞侵入ペプチド。
- 配列番号:6234−7420に列挙されるアミノ酸配列の一つに対応する8アミノ酸残基長のペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
- 配列番号:1−150に記載されるアミノ酸配列の一つに対応する12ないし50アミノ酸残基長のペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
- 配列番号:151−2684に記載されるアミノ酸配列の一つに対応する12アミノ酸残基長のペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
- 配列番号:7421−11649に記載されるアミノ酸配列の一つに対応する12アミノ酸残基長のペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
- 配列番号:2685−6233に記載されるアミノ酸配列の一つに対応する16アミノ酸残基長のペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
- 配列番号:11650−18398に記載されるアミノ酸配列の一つに対応する16アミノ酸残基長のペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
- 転写因子から誘導され、または転写因子または転写因子の少なくとも機能的部分に酷似するように設計された細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチド。
- 配列番号:18399−31839に記載されるアミノ酸配列の一つに対応する8−16アミノ酸残基長のペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
- セクレターゼから誘導され、またはセクレターゼまたは少なくともセクレターゼの機能的部分に酷似するように設計された細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチド。
- 配列番号:31840−31864に記載されるアミノ酸配列の一つに対応するペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
- GLP−1受容体から誘導されるかまたはGLP−1受容体または少なくともGLP−1受容体の機能的フラグメントに酷似するように設計される細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチド。
- 配列番号:31865−31886に記載されるアミノ酸配列の一つに対応するペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
- CGRP受容体から誘導されるか、またはCGRP受容体または少なくともCGRP受容体の機能的フラグメントに酷似するように設計される細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチド。
- 配列番号:31895に示されるアミノ酸配列に対応するペプチドまたはペプチドフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
- AT2型受容体から誘導されるかまたはAT2型受容体または少なくともAT2型受容体の機能的フラグメントに酷似するように設計される細胞侵入機能的蛋白質模擬ペプチド。
- 配列番号:31887−31894に記載されるアミノ酸配列の一つに対応するペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
- PrpCから誘導されるか、またはPrpCまたは少なくともPrpCの機能的フラグメントに酷似するように設計される細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチド。
- 配列番号:31896−31899に示されるアミノ酸配列の一つに対応するペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
- アミロイド前駆体蛋白質(APP)またはプレセニリン−1(PS−1)から誘導されるか、またはアミロイド前駆体蛋白質(APP)またはプレセニリン−1(PS−1)または少なくともアミロイド前駆体蛋白質(APP)またはプレセニリン−1(PS−1)の機能的フラグメントに酷似するように設計される細胞侵入性機能的蛋白質模擬ペプチド。
- 配列番号:31900−31906に列挙されるアミノ酸配列の一つに対応するペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される細胞侵入ペプチド。
- 請求項19ないし請求項41のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドの機能的類似体。
- 請求項19ないし請求項41のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/または非ペプチド類似体に少なくとも75%は一致する細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体。
- 請求項19ないし請求項41のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/または非ペプチド類似体を含む細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体。
- アミノ酸配列IVIAKLKAおよび/またはその細胞膜侵入性機能的類似体を含むペプチド類からなる群から選択される、請求項19ないし請求項44のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体。
- アミノ酸配列IVIAKLKANLMCKTCRLAKを含む、請求項45記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体。
- ペプチドがカーゴに結合する、請求項19ないし請求項46のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体。
- ペプチドがS−S架橋によってカーゴに結合する、請求項47に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体。
- 前記カーゴが細胞エフェクタである請求項47または請求項48に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体。
- 前記カーゴが薬物学的活性成分である請求項47ないし請求項49のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体。
- 前記カーゴが小分子、ペプチド、蛋白質、砂糖、一本鎖および/または二本鎖オリゴヌクレオチド、プラスミド、抗生物質、細胞傷害性および/または抗ウィルス物質からなる群から選択される請求項47ないし請求項50のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体。
- 前記カーゴがマーカー分子である請求項47ないし請求項51のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体。
- 配列番号:31907−31922に記載されるアミノ酸配列の一つに対応するペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される、請求項47ないし請求項51のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体。
- a)標的細胞中に特異的に過剰発現しおよび/または標的細胞によって特異的に分泌されるプロテアーゼのためのプロテアーゼ・コンセンンサス部位を含む細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および
b)細胞増殖抑制性および/または細胞傷害性物質
を含む細胞増殖抑制および/または細胞傷害性物質の細胞選択的送達系であって、
前記細胞選択的送達系がその他に前記細胞侵入ペプチドの活性を抑制する不活性化配列を含み、それは前記細胞選択的送達系が前記標的細胞の近くに導入されると前記プロテアーゼによって切断される
前記細胞選択的送達系。 - 細胞にトランスフェクトするベクターであって、そのベクターは
a)核酸成分、
b)ポリカチオン結合体、および
c)細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体
を含み、同一条件における細胞あたりの平均トランスフェクション率が、成分a)およびb)だけ、または成分a)およびc)だけを含むベクターに比較して少なくともファクタ2だけ増加する
前記ベクター。 - 前記ベクターが細胞の一過性トランスフェクションおよび/または安定的トランスフェクションに使用される請求項55記載のベクター。
- 前記ベクターが細胞のインビボおよび/またはインビトロトランスフェクションに使用される請求項56記載のベクター。
- 前記ベクターが細胞の非ウィルス性トランスフェクションのために使用される請求項57記載のベクター。
- 前記ポリカチオン結合体がポリエチレンイミン(PEI)である請求項55ないし請求項58のいずれかの項に記載のベクター。
- 配列番号:31913に記載されるアミノ酸配列に対応するペプチドまたはペプチドのフラグメントから選択される請求項55ないし請求項59のいずれかの項に記載のベクター。
- 前記細胞侵入ペプチドが請求項22ないし請求項27、請求項29、請求項31、請求項33、請求項35、請求項37、請求項39、請求項41、請求項45、請求項46、請求項52、および請求項60のいずれかの項に記載のペプチドまたはペプチドのフラグメントである請求項55ないし請求項59のいずれかの項に記載のベクター。
- さらに細胞および/または細胞型および/または組織に特異的であるという特徴を有する請求項22ないし請求項27、請求項29、請求項31、請求項33、請求項35、請求項37、請求項39、請求項41、請求項45、請求項46、請求項52、請求項59および請求項55ないし請求項60のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および/またはベクター。
- 前記細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および/またはベクターが選択的に細胞表面蛋白質と相互作用し、前記細胞および/または細胞型および/または組織に特異的な細胞侵入を媒介する請求項62記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および/またはベクター。
- 前記細胞表面蛋白質が前記特異的な細胞および/または細胞型および/または組織に過剰発現する、請求項63記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および/またはベクター。
- 前記細胞表面蛋白質が受容体チロシンキナーゼ型受容体類、グリコスフィンゴリピド類、CD44、erbB2、erbB3、および神経ペプチド受容体類からなる群から選択される請求項63または請求項64記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および/またはベクター。
- 前記ペプチドおよび/またはベクターが、過剰発現した細胞内および/または細胞外蛋白質と選択的に相互作用し、それによって細胞および/または細胞型および/または組織に特異的な細胞侵入を媒介する、請求項62記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および/またはベクター。
- 前記過剰発現する蛋白質が細胞および/または細胞型および/または組織特異的受容体に対するアゴニストおよびアンタゴニストからなる群から選択される、請求項62記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および/またはベクター。
- 前記過剰発現する蛋白質がプロテアーゼ類、プロテアーゼインヒビタ類およびプロテアーゼアクチベータ類からなる群から選択される請求項62または請求項63記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および/またはベクター。
- 医薬組成物の製造のために請求項17ないし請求項68のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および/またはベクター、および/または請求項54記載の細胞選択的送達系の使用。
- 請求項69によって製造される医薬組成物。
- 遺伝子治療のために請求項17ないし請求項68のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および/またはベクターおよび/または細胞選択的送達系および/または医薬組成物の使用。
- 遺伝子治療のための医薬組成物を製造するために、請求項17ないし請求項68のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および/またはベクターおよび/または細胞選択的送達系の使用。
- 腸/頬系の上皮、口、肺、直腸または鼻の粘膜、または哺乳動物の血液脳障壁を介するなど、上皮膜を介する膜貫通輸送のための薬剤送達系を作るために請求項17ないし請求項68のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および/またはベクターおよび/または細胞選択的送達系の使用。
- 感染性疾患、I型糖尿病、II型糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌からなる群から選択される医学的障害を治療および/または予防するための医薬組成物の製造のために請求項17ないし請求項68のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および/またはベクターおよび/または医薬組成物および/またはドラッグ・デリバリー・システムの使用。
- 医学的障害にかかった患者の治療法であって、請求項17ないし請求項68のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および/またはベクター、医薬組成物および/またはドラッグ・デリバリー・システムを、それらを必要とする患者に適用することを含む方法。
- I型およびII型糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、心臓血管病、感染性疾患、シグナル形質導入の混乱に起因する諸疾患、または癌からなる群から選択される医学的障害にかかった患者を治療する方法であって、請求項17ないし請求項68のいずれかの項に記載の細胞侵入ペプチドおよび/またはその非ペプチド類似体および/またはベクター、医薬組成物および/または薬剤送達系を、それらを必要とする患者に適用することを含む方法。
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