JP4503435B2 - 細胞選択的送達系 - Google Patents
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Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は標的細胞に送達される細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性物質のようなカーゴのための細胞選択的送達系に関する。本発明はまた医薬の製造における使用のための細胞選択的送達系にも関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の細胞エフェクタを細胞内に送達する多数の技術が開発されている。これらの技術の大部分はエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションのように侵襲的である。リポソーム被包化や受容体依存性エンドサイトーシス（細胞内取り込み）が比較的おだやかな方法であるが、それらは残念ながら重大な欠点、特に低い送達収率を示す。
【０００３】
細胞生物学における確立された視点から、親水性生体高分子の細胞インターナリゼーションは典型的エンドサイトーシス経路によってのみ実現し得ることが示されている。しかし過去１０年間に数種のペプチドが見かけ上エネルギー非依存性経路によって真核細胞の細胞膜を通過して移動することが証明された。これらのペプチドは細胞侵入ペプチド（ＣＰＰｓ）と定義され、それらの分子量の数倍大きい分子量を有する生体高分子の細胞内送達のために上首尾に使用されている。（リンドグレン（Ｍ．Ｌｉｎｄｇｒｅｎ）ら、２０００、細胞侵入ペプチド（Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）；ＴＩＰＳ、２１巻、ｐ．９９−１０３）
【０００４】
これらの細胞侵入ペプチドを使用する細胞送達は従来の方法にまさる幾つかの利点を有する。それは非侵襲的、エネルギー非依存性であり、広範囲の細胞型において有効であり、全ての細胞に適用できる。さらに、幾つかの種類のＣＰＰｓでは細胞インターナリゼーションが３７℃でも４℃でも同様に起こり、飽和することがないことが判明した。また大部分の場合に、そのインターナリゼーションはキラル受容体蛋白質を必要としないようにみえる。なぜならば光学異性的差別が認められないからである。
【０００５】
最近まで、細胞膜を破壊せずに親水性生体高分子を生体細胞の細胞質−および核コンパートメントに運搬することは遥かに遠くの目標であるように見えた。ポリペプチド類およびオリゴペプチド類は、生体膜透過性が低く、比較的速やかに分解するために、治療的価値は制限されると一般的に考えられていた。これは生医学的研究並びに製薬工業の両方において一つの障害である。
【０００６】
非常に重要な仕事であるとはいえ、さらにより困難なことは、親水性生体高分子を血液脳障壁を通過して送達することである。この関門を越えるために幾つかの方法が推奨された。にもかかわらずそれら全てに、その効果がある分子サブセットに限定されるとか、それらの収率が低すぎるなどの制限がある。しかし最近の報告は、ＣＰＰｓが生体高分子を血液−脳障壁を通って運搬し得ることを示唆している。
【０００７】
エフェクタ類の所望の送達のためのもう一つの重要な領域は、核内輸入である。その際シグナル配列がある正電荷を担った（塩基性）残基を含まなければならないことは一般に知られている（モロイアヌ（Ｍｏｒｏｉａｎｕ Ｊ．）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９９）。このような帯電アミノ酸は細胞膜転位のためにも必要であるようにみえる。
【０００８】
今日では、細胞侵入ペプチド、ＣＰＰｓの送達は知られている。数種のペプチドが見かけ上エネルギー非依存性経路によって真核細胞の細胞膜を経て転位することが証明された。こうして細胞侵入ペプチドは、ペプチド、蛋白質、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子など薬物学的に興味深い物質類の送達ベクターとして、並びに研究ツールとして使用できるかも知れない。
【０００９】
ＣＰＰｓの中で特に興味深いのは、低い溶解（ｌｙｔｉｃ）活性を有するペプチド類である。トロジャン・ペプチドとしても知られているこれら転位ペプチド（デロッシ（Ｄ．Ｄｅｒｏｓｓｉ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８（１９９８）ｐ．８４−８７）は、インビボおよびインビトロの両方において、親水性生体分子および薬剤を細胞の細胞質−および核コンパートメントに送達するためのベクターとして利用された（リンドグレン（Ｍ．Ｌｉｎｄｇｒｅｎ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ．２１巻（２０００）ｐ．９９−１０３）。それ自体の分子量の何倍も大きい分子量を有するポリペプチドおよびオリゴペプチドなどのカーゴと共有結合した場合でもこれらペプチドは転位することができる。
【００１０】
有用な運搬ペプチドの例は、ある種の転写因子のホメオドメインから誘導される配列、並びにシグナル配列をベースとしたいわゆるＴａｔ−誘導ペプチド類である。ホメオドメインから誘導された転位ペプチドの最初のものはｐＡｎｔｐと記載されるペネトラチン（配列番号１）であった。これはドロソフィラのアンテナペディナ・ホメオドメイン蛋白質からの第三α−ヘリックス（残基４３−５８）の１６残基に対応する配列を有する（デロッシら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻（１９９４）ｐ．１０４４４−１０４５０；プロキアンツ（Ａ．Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ）、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８６巻（１９９９）ｐ．１７２−１７９を参照されたい）。ｐＡｎｔｐペプチドはその膜転位特性を保有し、そのため普遍的細胞内送達ベクターであると提唱されてきた（デロッシら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８巻（１９９８）ｐ．８４−８７）。
【００１１】
純粋に合成されたペプチド、またはキメラ−ペプチドも文献に参照されるように（デロッシら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８巻（１９９８）ｐ．８４−８７；リンドグレンら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１巻（２０００）ｐ．９９−１０３）設計された。
【００１２】
非天然ペプチドなどのトランスポータン（配列番号２）は、それ自体は３ｋＤペプチドに過ぎないのに、約１５０ｋＤａの分子量を有する抗体分子を細胞膜を経て送達することができる。トランスポータンおよびペネトラチンは非天然ＤＮＡ類似体、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を培養細胞の細胞質および核内に送達することが証明された（プーガ（Ｐｏｏｇａ）ら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）。
【００１３】
驚いたことに、疎水性部分に結合した際に細胞膜を通過して運搬できることが証明されたまた別の群のペプチドは、ペプドゥシンと呼ばれる修飾受容体、特にＧ蛋白質結合受容体である（ＷＯ０１８１４０８、クリオプロス（Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ）ら、を参照されたい）。７ＴＭ受容体の第三細胞内ループから誘導されるペプチドに疎水性部分を結合させると、前記キメラペプチド類の細胞内転位および受容体Ｇ−蛋白質シグナリングの完全アゴニストおよび／またはアンタゴニストの細胞内転位が起きることが発見された。これらペプドゥシンは膜侵入性、膜結合性キメラペプチドであり、活性をあらわすためにはそれらの同種受容体の存在を必要とし、受容体型に対して非常に選択的である。
【００１４】
驚くほどの運搬能力のために、ＣＰＰｓは近年、科学的関心の的になったとはいえ、種々のＣＰＰｓの転位の最も基礎的なメカニズムはいまだに知られていない。例えば、転位を許す（エネルギー的に）ためには何らかの特別の二次構造、例えば同時に起きる一過性の膜不安定化などが誘導されなければならないのか否かはこの分野ではいまだに知られていない。しかしペプチド−膜相互作用の分子レベルでの詳細が転位プロセスのための基礎的重要事項であることは明らかである。
【００１５】
インターナリゼーションのメカニズムおよび必要事項が両親媒性α−ヘリカルペプチドと脂質（二）層との相互作用に関して研究された。これらの研究結果のなかには、トリプトファンがペプチドのインターナリゼーションを起こすことを示唆するものが多い。しかし芳香族アミノ酸がＣＰＰ配列に優勢であるとはいえ、それらは細胞侵入に絶対に必要というわけではない。
【００１６】
細胞侵入能力とは別に、ＣＰＰｓ間に構造または挙動の相関関係はほとんど認められていない。したがって現在までＣＰＰｓは合理的方法では設計されず、偶然に発見されていた。しかしこれまでに公表されたＣＰＰｓの配列は唯一の共通的特徴として正の正味電荷を有し、これが所定のペプチド配列におけるＣＰＰ機能性を予測するための出発点となった。しかし正の正味電荷を有する配列が全て細胞侵入性ではあり得ないことは明らかであり、確実にＣＰＰｓを選択するためにはさらなる制限が必要であることが示唆される。
【００１７】
ＷＯ００３４３０８は伝達ドメインと細胞傷害性ドメインを含む一つ以上の融合タンパク質を含んでなるタンパク質伝達系を開示している。そのタンパク質伝達系は、高レベルの重金属、ＤＮＡ損傷または制御されない細胞分裂のような独特の特性を示す異なった病原体または細胞の一つまたは組み合わせに感染した細胞を効果的に死滅させもしくは傷害を与える。
【特許文献】
ＷＯ００３４３０８
【発明の開示】
【００１８】
本発明は添付の請求項１及び従属請求項に記載の細胞選択的送達系並びに請求項８に記載の医薬の製造における使用のための細胞選択的送達系を提供する。
【００１９】
本発明に関連して、アミノ酸はアミノ（−ＮＨ２）およびカルボキシル（−ＣＯＯＨ）基を含む任意の有機化合物である。アミノ酸はＬ−型でもＤ−型でもよい。現在、ｍＲＮＡのリボソーム翻訳中に蛋白質を合成する公知のコーデドα−アミノ酸が２２種類ある。それに加えて、非常に多数の非コーデドアミノ酸が定常的にあらわれており、そのうちの５６例が表１Ａに示される。コーデドおよび非コーデドアミノ酸は、本発明に含まれるアミノ酸配列、ペプチドフラグメント類、ペプチド類、蛋白質類および／またはポリペプチド類の一部であることは当然である。
【００２０】
本発明に関連して、アミノ酸配列とはペプチドフラグメント、ペプチド、蛋白質またはポリペプチド中に精確に決められた順序で線状に配列するアミノ酸（コーデドおよび／または非コーデドアミノ酸を両方含む）である。
【００２１】
用語“非ペプチド類似体"は、本発明に関連して、少なくとも１つの非コーデドアミノ酸を含み、および／または主鎖修飾を有し、その結果ペプチド結合（すなわち１つのアミノ酸のカルボキシル基と他のアミノ酸のアミノ基との間に形成されるＣＯ−ＮＨ結合）のないアミノ酸配列を生成する、任意のアミノ酸配列である。
【００２２】
さらに、本発明のアミノ酸配列はアミド化されていてもよく、遊離酸として生成してもよい。
【００２３】
異なる特性のリポータ基、例えばビオチンおよび種々のフルオロフォア類、例えばフルオレセイン、アミノ安息香酸およびローダミン類など、を予測ＣＰＰに結合させて、その細胞転位および効率を推定することができる。
【００２４】
用語、ペプチドの“細胞侵入能力"とは、以後、細胞膜を経て真核細胞および／または原核細胞の細胞質および／または核コンパートメント、例えば細胞形質、核、リソソーム、小胞体、ゴルジ装置、ミトコンドリアおよび／または葉緑素、などに見かけ上エネルギー非依存的に転位する能力、と同意義に用いられる。追加的に、用語、ペプチドの“細胞侵入能力"は本発明のある局面においては、細胞貫通または膜貫通輸送と同意義にも用いられ、したがって、腸／頬系の上皮などの上皮膜、口腔、肺、直腸または鼻の粘膜、または哺乳動物の血液−脳障壁を通過する転位能力も表す。
【００２５】
本発明により細胞侵入能力をあらわす検出された、または新たに設計され、証明されたペプチドは、本発明に関連して“細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）"と定義され、例えば、それ自体の分子量より数倍大きい分子量をもつポリペプチドおよび／またはオリゴヌクレオチドなどの生体高分子を細胞内に送達するために使用できる。
【００２６】
概して細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体を使用する細胞内送達は非侵襲的、エネルギー非依存的であり、広範囲の細胞型および／または非常に種々様々のカーゴにとって効率的であり、全ての細胞に適用でき、飽和せず、受容体非依存性である。
【００２７】
本出願に開示される方法によって見いだされるかまたは新たに設計され、および／または証明されたＣＰＰｓは親水性生体高分子を生体細胞および／または微生物の細胞質および核コンパートメントに、細胞膜を恒久的に破壊することなく輸送するのに有用であり、血液−脳障壁を介して親水性生体高分子を送達し、共役オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドおよび薬剤類の細胞内輸送を可能にするために有用である。
【００２８】
こうして本発明に関連して、細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体が任意の薬物学的に興味深い物質、例えばペプチド、ポリペプチド、蛋白質、低分子物質、薬剤、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、二本鎖並びに一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／または任意の人工的または部分的人工的核酸、例えばＰＮＡ、の送達ベクターとして、並びに、タグやマーカーなど送達のための研究ツールとしておよび／または膜ポテンシャルおよび／または特性を変化させるための研究ツールとして使用できる。
【００２９】
したがって本発明によって見いだされまたは設計および／または生産されるＣＰＰは親水性生体分子および／または薬剤を細胞および／または組織の細胞質および核コンパートメントに送達するためのベクターとしてインビボおよびインビトロの両方に用いられる。
【００３０】
ＣＰＰ自体の分子量より何倍も大きい分子量を有する任意のペプチド、ポリペプチド、蛋白質、低分子物質、薬剤、ポリペプチドおよびオリゴペプチドを含むカーゴ（ｃａｒｇｏ）と共有結合した場合でも、ＣＰＰは転位することができる。
【００３１】
その上、ＣＰＰはそれ自体細胞内および／または細胞外エフェクタ活性を示し、細胞侵入機能的蛋白質模擬ペプチドとして働くことができ、または新たに設計され、新しい予想もできない機能をあらわすことがある。
【００３２】
細胞エフェクタは本明細書では細胞内および／または細胞外エフェクタであり、本発明に関連して、収縮、分泌、電気インパルス、または細胞内および／または細胞外シグナリング・カスケードの活性化または不活性化などの細胞効果を生み出す構造、または前記エフェクタによる刺激に応えてｍＲＮＡおよび／または蛋白質の細胞レベルのアップレギュレーションを誘発する構造と定義される。典型的エフェクタは本発明に関連して、代謝産物、アンタゴニスト、アゴニスト、受容体・リガンド、受容体結合蛋白質、活性化受容体、酵素インヒビタ、アクチベータ／インアクチベータおよび／またはスティミュレータ、キナーゼ、ホスファターゼ、エンハンサ、またはサイレンサ、転写因子、トランスポータおよび／またはトランスミッタ、ホルモン、チャンネル、イオン、プリオン、およびウィルス蛋白質からなる群から選択される。
【００３３】
カーゴ
既述のように、ＣＰＰはカーゴに結合し、前記カーゴを細胞、種々の細胞コンパートメント、組織または器官へ運ぶ担体として機能する。カーゴは薬物学的に興味深い物質、例えばペプチド、ポリペプチド、蛋白質、小分子物質、薬剤、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、二本鎖並びに一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／または任意の人工的または一部人工的核酸、例えばＰＮＡ、低分子量分子、糖類、プラスミド、抗生物質、細胞傷害剤および／または抗ウィルス剤などからなる群から選択される。さらに、カーゴの運搬は例えばタグ類およびマーカー類を送達するための研究ツール並びに膜電位および／膜特性を変えるための研究ツールとして有用であり、カーゴは例えばビオチンのようなマーカー分子でもよい。
【００３４】
カーゴを意図的に血液脳障壁を通過して運搬することに関連して、細胞内および細胞外物質類は同様に好ましいカーゴである。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態において、細胞侵入ペプチドは前記カーゴにＳ−Ｓ架橋によって結合する。当然、カーゴをＣＰＰに結合するための非常に種々様々の結合法があり、ＣＰＰ、カーゴおよび目的とする用途の性質に応じて個々に選択される。結合モードは共有および非共有結合（ビオチン−アビジン結合など）、エステル結合、およびアミド結合、抗体結合などからなる群から選択できる。
【００３６】
ある実施形態においては、不安定な結合が好ましく、ある実施形態においては安定な結合が重要である；例えば本発明によるＣＰＰを医学的物質の運搬のために使用する際には、使用前に前記医薬組成物を保存しておく必要があるため、安定な結合が重要である。
【００３７】
上記の実施形態のための例証的例は実施例２、５および６に記載される。
【００３８】
実施例５において、メトトレキセート（ＭＴＸ）とＣＰＰ担体との結合体が記載されている。ＭＴＸは細胞傷害性薬剤であり、それは悪性腫瘍の治療のために開発されたが、いまは乾癬のような自己免疫病の治療に使用されている。ＭＴＸは負に帯電した分子として体液中に存在するのが普通である。そのためそれが細胞膜を通過するには困難を伴う。
【００３９】
本発明によるカーゴの運搬のためにＣＰＰを使用する一つの例証的例は、実質的に配列番号３−７に含まれるようなＭＴＸ−ＣＰＰ結合体を含む。それらは例えば実施例５に記載されるような固相ペプチド合成法を用いて合成される。その特定の例は下の表１に示される：
【００４０】
ＣＰＰと共に細胞膜を通過して運ばれる分子のその他の例は実施例６に記載されており、そこではｓｉＲＮＡの取り込みが実質的に改善される。
【００４１】
近年、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、哺乳動物細胞における遺伝子発現を調節するそれらの高い感受性能力のために、注目を集めている。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性化によって相補的ｍＲＮＡの特異的切断を引き起こす二本鎖ＲＮＡの短鎖（約２１〜２３ｂｐ）である。ＲＮＡ誘導性サイレンシングが内因性メカニズムであるとはいえ、合成的に合成されたｓｉＲＮＡ類はインビトロでもインビボでも同じ効果を有することが証明された。
【００４２】
ｓｉＲＮＡを使用する際の公知の問題は、細胞内取り込みの低収率である。細胞侵入ペプチド類（ＣＰＰ）を合成的に合成したｓｉＲＮＡに結合することによって、細胞内取り込みは有意に改善する。
【００４３】
本発明に含まれるカーゴ運搬のためにＣＰＰを使用するもう一つの特定の実施形態はトランスポータン１０（Ｔｐ１０）のようなＣＰＰにジスルフィド・リンカーによって結合した、ＧＡＬＲ−１ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに関するものである。例えば、図１８に示され、配列番号２に記載されている。
【００４４】
細胞選択ＣＰＰｓ
本発明のさらに別の実施形態において、ある細胞型／組織／器官に選択的に侵入し、またはある細胞型、組織型または器官型においてのみ活性化されるカーゴを運搬する細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体が提供される。
【００４５】
発明者は、種々の異なるＣＰＰｓが特異的細胞系、例えばヒトメラノーマ細胞系Ｂｏｗｓなどによって、有意に異なる効率、および有意に異なる取り込み速度、時には２倍も異なる速度でインターナライズされることを示す。これは、異なる効率で異なる細胞系および組織にインターナライズされるＣＰＰｓを定義する予備的条件である。そこで本発明の重要な実施形態は、選択的輸送が要求される細胞系、細胞類、組織類および／または器官類における細胞内取り込みのための天然のまたは新たに設計される全てのＣＰＰｓを試験することによって特徴づけられる選択性ＣＰＰｓ（ｓｅｌＣＰＰｓ）の開発法である。他方では、ある標的細胞または標的細胞集団のために選択されたＣＰＰｓの細胞選択性を人工的に高める幾つかの特殊な方法が使用される。これは以下に詳細に記載される。
【００４６】
一例として、癌細胞は多くの細胞表面抗原および／または蛋白質を露出し、並びにある蛋白質類を分泌する。通常、腫瘍細胞は特異的な細胞表面マーカーを発現せず、むしろ一般的受容体／マーカーを過剰発現する。これらの過剰に発現されるマーカー類および／または細胞内および／または細胞外シグナルの過剰増幅によるシグナリングは細胞周期を通じた細胞機構の制御を喪失するメカニズムの一つであると考えられる。こうして本発明の特殊な実施形態において、過剰発現する細胞表面蛋白質および／または分泌蛋白質は、ＣＰＰアドレッシングのための標的として使用される。
【００４７】
本発明の一実施形態において、細胞選択ＣＰＰ（ｓｅｌＣＰＰ）は、チャンネル受容体類、チロシンキナーゼ受容体類（例えばＥＧＥ、ＩＧＦ）、グアニレートシクラーゼ受容体類、セリン／スレオニン・キナーゼ・受容体類、サイトカイン受容体類、グアノシン三燐酸（ＧＴＰ）−結合蛋白質に結合した受容体（Ｇ−蛋白質結合受容体：ＧＰＣＲｓ）、スフィンゴ糖脂質類、ＣＤ４４、神経ペプチド受容体、例えばニューロテンシン受容体類、ガラニン、およびサブスタンスＰ受容体類からなる群から選択される細胞マーカーに対して生成した抗原／蛋白を含むことが予測される。
【００４８】
概して、細胞選択ＣＰＰ（ｓｅｌＣＰＰ）は任意の種類の薬剤または医薬物質の、種々の特異的真核および／または原核細胞標的への標的化輸送に極めて重要であることは当然である。このようなカーゴの細胞選択輸送は、例えばウィルス、細菌または寄生虫感染症によって起きる疾患のような感染症の治療または予防のための使用が想定される。
【００４９】
標的細胞をインビボで見いだす前にＣＰＰｓの非特異的イターナリゼーションを避けるために、別の局面において本発明は酵素−プロドラッグ戦略の新しい変形体に関係する。その際ｓｅｌＣＰＰ結合物は、ＣＰＰ類の細胞侵入−活性構造が、前記ｓｅｌＣＰＰのペプチド部分の細胞／組織または器官特異的受容体／マーカーへの結合事象または標的細胞／組織または器官によって分泌されるプロテアーゼによる前記ｓｅｌＣＰＰ結合体の切断によって構造識別体からＣＰＰを放出するまでは破壊されないように、設計される。
【００５０】
用語"酵素−プロドラッグ戦略／療法"は、アミノ酸または核酸プロドラッグ（それらは送達前または後に多かれ少なかれ組織、器官および／または細胞選択酵素類による活性化を要求する）の開発に焦点をおいたプロドラッグ送達の特異的アプローチを定義するために使用される。選択性の大きい差が先行技術に見いだされる。幾つかのプロドラッグでは標的組織／器官／細胞からの放出薬剤の速やかな除去が低選択性を説明し、またあるプロドラッグでは、非標的組織における切断、および細胞を経由する酵素部位への不十分な輸送が（低選択性の）主な原因であると考えられる。
【００５１】
特に、多くの抗癌剤は非常に有毒であり、そのためより効果的およびより毒性の少ないプロドラッグおよび／またはソフトドラッグが必要である。そのため典型的プロドラッグ／ソフトドラッグは活性化酵素のための効率的および選択的基質でなければならないし、好ましくは細胞周期の全段階において細胞を殺す強力な細胞傷害物質および／または細胞増殖抑制物質に代謝されなければならない。初期の抗代謝産物ベースのプロドラッグの多くは、細胞膜を経由する拡散能力が限られ、客観的効果を得るには細胞間の細隙結合に依存しなければならない極性の高い活性化型を提供した。しかし本発明に記載されるプロドラッグ類は良好な分布特性を有し、それらの活性種は翻訳細胞侵入性であり、それによって得られる客観的効果はその療法の効果を最大にすることができる。
【００５２】
本発明に関連して、用語“酵素−プロドラッグ戦略／療法"とは、その他に薬剤を送達する上記の方法であって、前記薬剤それ自体またはその運搬体ＣＣＰを非細胞侵入性にして、インビボ標的細胞を見つける前にＣＰＰｓの非特異的インターナリゼーションが起こるのを回避するようにし、その際前記ｓｅｌＣＰＰのペプチド部分の細胞／組織または器官特異的受容体／マーカーへの結合事象、または前記ｓｅｌＣＰＰ−結合体の、標的細胞／組織又は器官によって分泌されるプロテアーゼによる前記ｓｅｌＣＰＰ結合体の切断によってのみ、構造的識別体からＣＰＰが放出され、それが標的細胞に侵入できるという方法を説明するための用語である。
【００５３】
したがって本発明の特に好ましい実施形態は、ａ）標的細胞において特異的に過剰発現されるプロテアーゼのためのプロテアーゼ・コンセンサス部位、ｂ）細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体、およびｃ）細胞増殖抑制物質および／または細胞傷害物質を含む、細胞増殖抑制物質および／または細胞傷害物質の細胞選択的送達系に関するものであり、前記細胞選択的送達系はその他に前記細胞侵入ペプチドの細胞侵入能力を抑制する不活性配列も含み、その配列は前記細胞選択的送達系によって前記標的細胞の近くに導入されると、前記標的細胞に特異的に過剰発現される前記プロテアーゼによって切断される。実施例４などを参照されたい。
【００５４】
上記の概念の典型的例は基質金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）であり、それらはＺｎ２＋金属エンドペプチダーゼである。このファミリは結合したメンバーも分泌されたメンバーも両方共含み、それらは両方共細胞膜上または細胞外基質（ＥＣＭ）に存在する蛋白質の分解を触媒する（スターンリヒト（Ｍ．Ｄ．Ｓｔｅｒｎｌｉｃｈｔ）およびワーブ（Ｚ．Ｗｅｒｂ）「基質金属プロテアーゼが細胞挙動を調節する仕方（Ｈｏｗ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｃｅｌｌ ｂｅｈａｖｉｏｒ）」Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７巻：ｐ．４６３−５１６、２００１）。ＭＭＰｓは多種多様の悪性腫瘍の侵襲性および転移性挙動に関連があり、これら酵素は一般的に種々の腫瘍に過剰発現される（スターンリヒトおよびワーブ「基質金属プロテアーゼが細胞挙動を調節する仕方」Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７巻：ｐ．４６３−５１６；ロザノフ（Ｄ．Ｖ．Ｒｏｚａｎｏｖ）ら、“膜１型金属プロテアーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ、別名ＭＭＰ−１４）"Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＪＢＣ）２７６巻：ｐ．２５７０５−１４、２００１年７月１３日）。ＭＭＰ−ＭＴ１のような膜型ＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）は発癌に強く関係している。これらの酵素は侵襲性先端に局在する。可溶性ＭＭＰｓ１−３および９も腫瘍発生のアゴニストとして関係している（スミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｅ．，パークス（Ｐａｒｋｓ，Ｋ．Ｋ．），ハセガワ（Ｋ．Ｋ．Ｈａｓｅｇａｗａ，），イーストモンド（Ｅａｓｔｍｏｎｄ Ｄ．Ａ．）＆グロソヴスキ（Ｇｒｏｓｏｖｓｋｙ，Ａ．Ｊ．）パラセントメトリック・ヘテロクロマチンの標的化破壊は染色体を不安定にする（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｒｅａｋａｇｅ ｏｆ ｐａｒａｃｅｎｔｍｅｔｒｉｃ ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｈｒｏｍａｓｏｍａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）；Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ １３巻、ｐ．４３５−４３（１９９８））。
【００５５】
これに付随して、そして実施例４および１２に明確に証明されたように、本発明は次の３つの基礎的機能に基づいてｓｅｌＣＰＰを設計する方法に関係する：１）ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−ＭＴ１による選択的切断（およびそれによる活性化）、２）ペプチド（ＣＰＰｓ）による細胞侵入、および３）それによって腫瘍細胞または腫瘍の血管新生に関係する内皮を既知の細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤によって死滅させること（図２、３、８および９を参照されたい）。
【００５６】
本発明はこうして表２または表３に含まれるアミノ酸配列から選択されるｓｅｌＣＰＰ、および、表２または表３に列挙されるアミノ酸配列および細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤を含む、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤の複合的細胞選択的送達系に関係する。配列番号３−１０を参照されたい。
ＬＲＳＷ−１ｐｓ、ＬＲＳＷ−２ｐｓおよびＬＲＳＷ−３ｐｓはそれぞれ配列番号８、９および１０を有する。
【００５７】
したがって、本発明はａ）標的細胞において特異的に過剰発現されるプロテアーゼのためのプロテアーゼ・コンセンサス部位を含む細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体およびｃ）細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤を含む、細胞増殖抑制および／または細胞傷害性薬剤の細胞選択的送達系にも関係し、前記細胞選択的送達系はその他に前記細胞侵入ペプチドの活性を抑制する不活性化配列を含み、この配列は前記細胞選択的送達系が前記標的細胞近くに導入されると標的細胞において特異的に過剰発現されるプロテアーゼによって切断される。
【００５８】
上記のような前記細胞選択的送達系の好ましい実施形態において、前記細胞選択的送達系に含まれる前記細胞侵入ペプチドは前記細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤の細胞内取り込みの平均速度を、ａおよびｃ）の成分のみを含む細胞選択的送達系または前記細胞の成分ｃ）だけの平均細胞内取り込み率に比較して、１細胞あたり少なくとも１．５のファクターだけ高める。
【００５９】
前記細胞選択的送達系の、また別の同様に好ましい実施形態において、前記細胞選択的送達系に含まれる前記細胞侵入ペプチドは、前記細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤の前記選択的細胞の１細胞あたりの平均取り込み率を、ａ）およびｃ）の線分だけを含む細胞選択的送達系の前記細胞への平均取り込み率、または前記細胞のｃ）成分だけの平均取り込み率に比較して少なくともファクター１．５、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００または１００００だけ高める。
【００６０】
上記のような細胞選択的送達系のまた別の同様に好ましい実施形態において、前記過剰発現するプロテアーゼは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−ＭＴ１からなる群から選択されるＺｎ２＋金属エンドペプチダーゼである。
【００６１】
もう一つの実施形態において、前記過剰発現するプロテアーゼは細菌表面プロテアーゼおよびウィルス酵素からなる群から選択される。
【００６２】
ここに記載される細胞選択的送達系は哺乳動物における特殊な細胞集団の細胞増殖を停止させ、細胞増殖をコントロールできないという特徴を有する医学的障害、例えば腫瘍性異常または腫瘍疾患、または免疫学的および／または代謝機能亢進などに罹患した患者を治療するための医薬組成物の製造にも使用できることは勿論である。
【００６３】
本発明のさらにまた別の局面は、本発明による細胞選択的送達系を使用して薬剤を製造することに関係する。
【００６４】
本発明の種々の局面および実施形態を以下の実施例によって説明する。本発明は特別に記載された詳細によって制限されるものではない。
【００６５】
略語
Ａβ ベータ−アミロイド
ＡＤ アルツハイマー病
ＡＰＰ アミロイド前駆体蛋白質
ＡＴ１ アンジオテンシン・受容体ＡＴ１型
ＡＴ１Ａ アンジオテンシン・受容体・サブタイプＡＴ１Ａ
ＡＴ１Ｂ アンジオテンシン・受容体・サブタイプＡＴ１Ｂ
ＡＴ２ アンジオテンシン・受容体ＡＴ２型
ＢＡＣＥ β−部位ＡＰＰ−切断酵素
Ｂｉｏ ビオチン、ビオチニル化
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ＣＰＰ 細胞侵入ペプチド
ＣＴＦ Ｃ−末端フラグメント
ＤＣＣ Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＩＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＤＮＰ ジニトロフェニル
ＥＯＦＡＤ 早発性アルツハイマー病
ＦＩＴＣ ５−フルオレセイン・イソチオシアネート
Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＧＯＰ ＩＶＩＡＫＬＫＡ−アミド
ＧＰＣＲ Ｇ−蛋白質結合受容体
ＧＴＰ グアノシン ５’−三燐酸
ＧＴＰａｓｅ グアノシントリホスファターゼ
ＧＴＰγＳ グアノシンγ−Ｓ−５’−三燐酸
ＨＫＲ ヘペス−クレプス−リンゲル
ＨＯＢｔ Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ 高性能液体クロマトグラフィー
ＩＤＥ インスリン分解酵素
ＬＯＡＤ 遅発性アルツハイマー病
ＭＢＨＡ ４−メチルベンズヒドリルアミン
ＮＦＴ 神経原線維糸球
ＮＩＣＤ ノッチ細胞内ドメイン
ＮＭＰ Ｎ−メチルピロリドン
ＮＴＦ Ｎ−末端フラグメント
ＰＡＦ パラホルムアルデヒド
ＰＢＳ 燐酸緩衝食塩液
ＰＮＡ ペプチド核酸
ＰＳ プレセニリン
ＲＮＡ リボ核酸
ＳＡＰＰ 分泌ＡＰＰ
ＴＡＣＥ 腫瘍壊死因子アルファ変換酵素
ｔ−Ｂｏｃ ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＴＢＴＵ ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾールー１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロ硼酸
ＴＦＡ 三フッ化酢酸
ＴＦＡ 三フッ化酢酸
ＴＦＭＳＡ トリフルオロメタンスルホン酸
【実施例】
【００６６】
実施例１
ペプチド合成（特に他の記載がなければ、以下の諸実験の既定の方法が記載される）
ペプチドは固相ペプチド合成のｔ−Ｂｏｃ戦略を使用してペプチド合成器（アプライド・ビオシステムス４３１Ａ型、ＵＳＡ）で０．１ｍｍｏｌスケールで段階的方法によって合成される。ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニルアミノ酸（バチェム、ブデンドルフ、スイス）をヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ）エステルとしてｐ−メチルベンジルヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂（バチェム、ブデンドルフ、スイス）に結合させ、Ｃ−末端アミデート化ペプチドを得た。ビオチンを手動でＮ−末端に結合した；そのためには３倍過剰のＨｏＢｔおよびｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム テトラフルオロ硼酸（ＴＢＴＵ）活性化ビオチン（ケミコン、ストックホルム、スイス）をＤＭＦ中でペプチジル樹脂に加えた。上記ペプチドを、最後にｐ−クレゾールの存在下でＯ℃、３０分間、液体ＨＦで樹脂から切り離した。このペプチドの純度は、分析ヌクレオシル１２０−３ Ｃ−１８ ＰＲ−ＨＰＬＣカラム（０．４×１０ｃｍ）上のＨＰＬＣによって測定したところ、＞９８％であることが証明され、正確な分子量はプラズマ脱着質量分析（ビオイン２０、アプライド・ビオシステムス、ＵＳＡ）またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｖａａｇｅｒ ＳＴＲ−Ｅ、アプライド・ビオシステムス、ＵＳＡ）を使用して、記載されるようにして得た（ランゲル（Ｌａｎｇｅｌ，Ｕ．，）、ランド（Ｌａｍｄ，Ｔ．）＆バルトファイ（Ｂａｒｔｆａｉ，Ｔ．）、ガラニン受容体およびサブスタンスＰ受容体に対するキメラペプチドリガンドの設計（Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｇａｌａｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅＰ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）。Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ ３９巻、ｐ．５１６−２２（１９９２））。
【００６７】
細胞培養（特に他の記載がなければ、下の実験の既定の方法を述べる）
ネズミ線維芽細胞Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞およびＣＯＳ−７細胞を１０ｃｍペトリ皿中で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃で５％ＣＯ２気流中で増殖させた。細胞を播種し、５日目ごとに再培養した。播種した際ＣＯＳ−７および１０Ｔ１／２細胞をトリプシン化し、その一方、Ｎ２Ａ細胞は培地をその細胞に加えて、機械的力で懸濁した。実験開始前に細胞を融合するまで増殖させ、その後播種し、培地で２倍に希釈し、その後２４ウェルプレートに加えた（約６００００細胞／ウェル）。
【００６８】
カーゴ送達効率の高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）
ＣＰＰ−Ｓ−Ｓ−カーゴ構成物（カーゴは２−アミノ安息香酸フルオロフォアで標識化され、ＣＰＰは２−ニトロトリプシン消光剤で標識化されている）を使用することによって、還元性細胞内メジウムに起因するジスルフィド結合の細胞内分解、および目に見える蛍光の増加による前記構成物の細胞内取り込みを実時間でモニターすることができる。
【００６９】
懸濁細胞または付着細胞内のペプチド取り込みおよび流出の研究
細胞をトリプシン（インビトロゲン、スイス）で分離し、培養培地に溶解し、遠心分離した（１０００×ｇ、室温で１０分間）。細胞を再懸濁し、計数し、その一部を３０００００細胞／チューブの割合で氷上のＨＫＲ中に取った。Ａｂｚ−標識化ペプチドを懸濁細胞と共に、３７℃の水浴中で振とうしながら１５および３０分間インキュベートした。取り込みまたは流出を停止するために、トリプシン溶液を３分間加えた。細胞を４℃で、１００×ｇ、１０分間回転した。ペレットをＨＫＲ中に再懸濁して蛍光を検出し、または流出サンプルでは再び無ペプチドＨＫＲと共にインキュベートした。蛍光をスペクトラマックス・ジェミニＸＳ（モレキュラーデバイセス、カリフォルニア）上で３２０／４２０ｎｍで読んだ。細胞内濃度をＡｂｚ標識化ペプチドの標準曲線から計算した。Ｃａｃｏ−２細胞の平均細胞量を、クールター２５６チャンネライザー（クールター・エレクトロニックス社、カリフォルニア）を使用して測定した。その他に、同じアッセイの変法を使用した：細胞を２４ウェルプレートに１０００００細胞／ウェルの密度で前日に播種した。細胞を５μＭペプチド濃度で３７℃で３０分間インキュベートした。トリプシン処理し、洗浄し、塩酸中で溶解した。蛍光を懸濁アッセイについて記載したように測定した。
【００７０】
材料および方法
細胞
ヒトメラノーマ細胞Ｂｏｗｅｓを標準細胞培養法を使用してＭＥＭに培養し、実験を行う前の日に２４ウェルプレートに１０００００細胞／ウェルの密度で播種した。
【００７１】
結果および検討
表４はペプチドが実際に細胞侵入ペプチドであることを証明するための好ましい方法から得たデータを示す：懸濁細胞または付着細胞におけるペプチド取り込みおよび流出研究（以下を参照されたい）。これまでに約５０のペプチドをスクリーニングした。陰性対照では膜非侵入性糖ポリマーであるフルオレセイニル・デキストランを同じやり方で細胞に加える。デキストランの細胞溶解物に認められたパーセンテージは常に０．５％未満である。ＹＴＡ−２ｐｓ、ＬＲＳＷ−１およびＬＲＳＷ−３は新たに設計された人工ペプチドの例である。
【００７２】
実施例２
基質金属プロテイナーゼー２（ＭＭＰ−２）のＹＴＡ−２ｐｓの特異的切断の測定法；
上に、そして図１０に示したように、発明者らは選択的ＣＰＰ（ＹＴＡ−２）のＣＰＰ部分が３７℃でも４℃でも細胞に効率よく入ることができることを示した（データは示されず）。それに加えて“インアクチベータ"は細胞膜を介する転位に関してペプチドをより不活性にした。この方法の開発における次の工程は活性ＭＭＰ−２によるＹＴＡ−２ｐｓの特異的切断をチェックすることである。それは蛍光／消光剤アッセイによって行われる。ここではＭＭＰ−２基質ＹＴＡ−２ｐｓは切断で蛍光強度を高める。正しい切断は質量分析によってさらにチェックされる。
【００７３】
実施例３
材料および方法
ＴＰ１０およびＹＴＡ−２の合成および精製
上記ペプチド類をパーキン・エルマー／アプライド・ビオシステム社、４３１Ａ型ペプチド合成器で、既述のプロトコルによるｔ−Ｂｏｃ戦略を用いて段階的に合成した（ランゲル、ランドら、１９９２）。システインまたはグルタミン酸を手動で結合させた。ＴＰ１０配列はプーガ、１９９８、ＦＡＳＥＢ．Ｊ．に与えられている（配列番号２）。ＹＴＡ−２配列は表２に与えられ、配列番号３として記載されている。あらかじめペプチド類をＰＥＩに結合させ、それらを逆相ＨＰＬＣ（ギンコテク（Ｇｙｎｋｏｔｅｋ））Ｃ１８カラム上で、ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ勾配で精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（アプライド・ビオシステム社、ＶｏｙａｇｅｒＳＴＲ型）を用いて分析した。得られた質量値は計算値と一致した。
【００７４】
細胞培養
ネズミ線維芽細胞Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞およびＣＯＳ−７細胞を１０ｃｍペトリ皿中で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）に増殖させた。細胞を播種し、５日目ごとに培養しなおした。播種したときにＣＯＳ−７および１０Ｔ１／２細胞をトリプシン化し、その一方でＮ２Ａ細胞を、それら細胞に培地を加えることによって機械的に懸濁した。実験開始前に、細胞を融合するまで増殖させ、その後播種し、培地で２倍に薄め、その後２４ウェルプレートに加えた（約６００００細胞／ウェル）。
【００７５】
実施例４
ｓｅｌＣＰＰ
序文
基質金属プロテアーゼ類（ＭＭＰｓ）はＺｎ２＋金属エンドペプチダーゼ類である。このファミリは膜結合メンバーおよび分泌メンバーの両方を含む。その両方共細胞質膜上または細胞外基質（ＥＣＭ）内のどちらかに局在する蛋白質類の分解を触媒する（スターンリヒト−０１）。
【００７６】
ＭＭＰｓはＥＣＭを分解できるので、ＭＭＰｓは細胞の移動、再形成および炎症性反応に影響を与える。しかしこれらの酵素は侵襲性および炎症性疾患、例えば癌、リウマチ性関節炎、多発性硬化症および細菌性髄膜炎などの基礎的原因にも関係する（レッパート−０１）。
【００７７】
転移や血管新生などの侵襲性プロセスの一つの特徴は、通常は細胞移動に対する物理的障壁であるＥＣＭおよび基底膜の分解である。ＭＭＰｓは種々様々の悪性腫瘍の侵襲性および転移性挙動に関連しており、これらの酵素は種々の腫瘍に過剰発現するのが普通である（スターンリヒト−０１、ロザノフ−０１）。異なるＭＭＰｓの数が腫瘍の進行につれて増加し（ヘキストラ−０１）、ある種の腫瘍の侵襲力と相関関係にある（ホーンベック−０１）ことが見いだされている。さらに、ＭＭＰｓの発現はトランスジェニックマウスの転移腫瘍数と相関関係にある（ストレンリヒト−０１）。
【００７８】
ＭＭＰ−ＭＴ１のような膜型ＭＭＰｓ（ＭＴ−ＭＭＰ）は発癌に密接に関係している。これらの酵素は侵襲先端に局在する。可溶性ＭＭＰｓ１−３および９も腫瘍発生のアゴニストとして関係している（ロザノフー０１およびナベシマ−０２）。ＭＭＰ−ＭＴ１は血管形成中の内皮細胞の誘導および移動中にもアップレギュレートする（ガルヴェズ−０１）。その上、ＭＭＰ−ＭＴ１（またはＭＭＰ１４とも呼ばれる）はその“シェダーゼ（ｓｈｅｄａｓｅ）"活性によるｐｒｏＭＭＰ−２の活性化に関係し、それによって侵襲先端にＭＭＰ−２を放出する（ソンニ−０２）。ＭＭＰ−２は腫瘍血管新生に重要な役割を有するようにみえる（チェン−０１）。
【００７９】
ｓｅｌＣＰＰｓ
選択的ＣＰＰｓの概念はＭＭＰｓ酵素活性の組織特異性に基づく。
一アプローチはＣＰＰをガラニンのような任意の受容体リガンドに結合することによって、エンドサイトーシス取り込みを用いてそのＣＰＰの特異性および活性化を調べることである。
【００８０】
【００８１】
ＭＭＰ活性化ｓｅｌＣＰＰ
典型的ｓｅｌＣＰＰ（図８）は３つの部分、すなわちトランスポータ（ＣＰＰ）、特異的プロテアーゼ部位およびインアクチベータから作られる。インアクチベータはＣＰＰを不活性化するために付加され、インアクチベータが切り離される前にはそれが細胞に入ることができないようにする。ＣＰＰはトキシン、例えば公知の非侵入性細胞増殖停止物質および／または細胞傷害物質を担う。諸配列の好ましい実施形態およびペプチド類の標識化については表５を参照されたい。
【００８２】
上記の概念は次の３つの基礎的機能に基づく：ａ）ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−ＭＴ１による選択的切断（およびそれによる活性化）、ｂ）トキシンを担うペプチド（ＣＰＰ）による細胞侵入およびそれによるｃ）近くの、好ましくは腫瘍細胞または、腫瘍血管新生に含まれる内皮の死滅（略図が図８に示される）。
【００８３】
上記の概念を証明する例証的例として、発明者らは選択的ＣＰＰ（ＹＴＡ−２）のＣＰＰ部分が３７℃（図１０及び１１）および４℃（データは示されず）の両方において細胞に効率的に侵入できることを証明することに成功した。その上“インアクチベータ"（図９参照）は細胞膜を転位する際のペプチドをより不活性にする。ＭＭＰ２によるＹＴＡ−２の正しい切断も質量分析によって確認されている（データは示されず）。細胞増殖停止物質および／または細胞傷害物質（ＭＴＸ）のＣＰＰ−部分への付着および効率は実施例５を参照されたい。
【００８４】
ＭＭＰ１４（またはＭＭＰ−ＭＴ１）の切断のための新しい配列が４種類ある：ＬＲＳＷ１−３およびｐｅｎＭＭＰ１４。後者はＭＭＰ１４を発現する細胞（ＢｏｗｅｓおよびＣａｃｏ−２）に取り込まれることが証明されている。図７を参照されたい。
【００８５】
それに加えて、６７ｋＤａ蛋白質蛍光標識化ストレプトアビジンは、ビオチニル化ＹＴＡ−２に結合したとき、陥入した（図２１および２２を参照）。これは、ＹＴＡ−２が大きいカーゴ分子を細胞内に運搬できることを示す。
【００８６】
これまでに取り込みを試験した全てのｓｅｌＣＰＰを質量分析で確認する。さらに細胞培養培地および細胞溶解物中の安定性を測定する。さらに、これらのペプチドの選択性をインビトロ細胞アッセイで、例えばＣＰＰ部分の活性化のためのプロテアーゼを発現しない細胞と混合した選択的にプロテアーゼを発現する細胞で試験する（表６）。
【００８７】
実施例５
細胞内薬剤送達の実施例：
メトトレキセートおよび細胞侵入ペプチド（ＭＴＸ−ＣＰＰ）の結合物
序文
メトトレキセート（ＭＴＸ）は細胞傷害性薬剤であり、悪性腫瘍の治療のために開発されたものであるが、現在は乾癬のような自己免疫病の治療に使用されている。ＭＴＸは葉酸拮抗物質（式１）であり、葉酸トランスポータによって細胞に入る。ＭＴＸの標的は葉酸要求酵素である。
乾癬治療におけるＭＴＸの使用は、全身投与時のその副作用によって抑制される。最も重大な副作用は肝毒性である。そこで、ＭＴＸの局所的投与組成物が非常に好ましい。
【００８８】
式１．ＭＴＸの構造
【００８９】
生物学的液において、ＭＴＸは負電荷を有する分子として存在する。そのため、それは、葉酸トランスポータによってのみ細胞膜を通過することができる。本発明は先ず第一に、 １）容易に、かつ受容体／担体−非依存的に細胞内および皮膚内に侵入する
２）乾癬の顕著な特徴であるケラチノサイト過剰増殖を抑制する
３）不都合な副作用（ヒスタミン放出など）がない
ＭＴＸ−ＣＰＰ結合体を生成する手段を明らかにする。
【００９０】
ＭＴＸ−ＣＰＰ結合体は全て、固相ペプチド合成戦略を用いて合成される。これには次の２つの理由が考えられる：
１）ＭＴＸ（ＣＡＳ番号５９−０５−２）は２つの構造単位：４−デオキシ−４−アミノ−Ｎ１０−メチルプテロイン酸（Ａｐａ、ＣＡＳ番号１９７４１−１４−１）およびγ−グルタメートに分けることができる
２）ＭＴＸはそのγ−カルボキシル基上の置換に対して比較的非感受性である。
【００９１】
表１に示すように、数種のＭＴＸ−ＣＰＰ結合体が設計される。上記結合体のＣＰＰ部分は細胞内で分解すると予想される。
【００９２】
ＭＴＸ−ＣＰＰ結合物の固相合成
ＭＴＸはＢｏｃ化学作用の標準的切断条件のもとでは不安定であるため、Ｆｍｏｓ−化学作用を使用した（フッ化水素、０℃、３０分）。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕとＡｐａとの結合は標準カップリング法（ＨＯＢｔ／ＴＢＴＵ）を使用して行われた。結合物を試薬Ｋ（８２．５％ＴＦＡ：５％フェノール：５％チオアニソール：２．５％１，２−エタンジチオール）を用いて樹脂から切り離した。
【００９３】
細胞培養物
全ての細胞は３７℃で５％ＣＯ２中で培養された。プラスチック実験器具はコーニング社（アクトン、ＭＡ）から入手した。ヒト新生児表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）、全ての増殖培地の成分および、その増殖のために必要なトリプシン化試薬はカスケード・バイオロジックス（商標）（ポートランド、オレゴン）から入手した。ＨＥＫｎ細胞を、ヒトケラチノサイト増殖補充キット（ＨＫＧＳ）およびペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンフォテリシンＢを補充したエピライフ（Ｅｐｉｌｉｆｅ）（商標）培地に培養した。ＨＥＫｎ細胞を１週間に一度分割し、Ｔ７５あたり３０００００細胞を播種した。増殖培地を１〜２日ごとに交換した。
【００９４】
Ｂｏｗｅｓヒトメラノーマ細胞をアメリカ培養コレクション（マナッサス、ＶＡ）から得た。Ｂｏｗｅｓ細胞を、グルタマックス−Ｉ、非必須アミノ酸、ピルビン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン（図には“ＭＥＭ"として示される）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したイーグル最小必須培地に培養した。Ｂｏｗｅｓ細胞のための全ての培地成分はインビトロゲン・コーポレーション（ペイスリー、英国）からのものであった。トリプシン／ＥＤＴＡはＰＡＡラボラトリーズ社（リンツ、オーストリア）からのものであった。細胞を１週間に１回継代培養し、Ｔ７５あたり２０００００細胞を播種した。生育性のアッセイでは、実験前日に、２４ウェルプレートに１ウェルにつき５００００細胞（３００μｌ中）を播種した。
【００９５】
Ｋ５６２ヒト赤白血病細胞をアメリカ培養コレクション（マナッサス、ＶＡ）から入手した。Ｋ５６２細胞をグルタマックス−Ｉ、ペニシリン、ストレプトマイシン（図１４〜図１７には“ＲＰＭＩ"として示される）およびウシ胎児血清（７．５％）を補充したＰＲＭＩ−１６４０培地に培養した。Ｋ５６２のための全ての培地成分はインビトロゲン・コーポレーション（ペイスリー、英国）から入手した。トリプシン／ＥＤＴＡはＰＡＡラボラトリーズ社（リンツ、オーストリア）からのものであった。細胞を２日目または３日目（そのとき細胞密度は１００００００細胞／ｍｌに達した）ごとに継代培養し、１０００００細胞／ｍｌを播種した。生育性を試験するためには２４ウェル−プレートに１ウェルにつき３００００細胞／３００μｌを播種した。
【００９６】
細胞の生育性の測定
結合物のストック溶液（１ｍＭ）を滅菌水で調製し、ＭＴＸのストック溶液を１０％ＤＭＳＯ水溶液で調製した。曝露のために、薬剤を曝露培地（無血清ＯＰＴＩＭＥＭまたはＭＥＭ中１％ＦＢＳまたはＭＥＭ中１０％ＦＢＳまたはＲＰＭＩ中７．５％ＦＢＳ）で希釈し、所望濃度（Ｂｏｗｅｓ細胞の場合）または１０×最終濃度（Ｋ５６２細胞の場合）にした。１ウェルにつき、それぞれの曝露混合物３００μｌ（Ｂｏｗｅｓの場合）または３０μｌ（Ｋ５６２の場合）を使用した。Ｂｏｗｅｓ細胞を使用するいくつかの実験で、曝露混合物を２時間後に除去し、あらかじめ温めた薬剤不含有曝露培地に代えた。１〜２日後、細胞の生育性をセルタイタ−グロ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ）（商標）ルミネセント細胞生育性アッセイ（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン）を使用して試験した。プレートを室温で平衡化した（約３０分間）。セルタイタ−グロ（商標）試薬３００μｌを各ウェルに付加し、１０分間インキュベートした。３００μｌを白色ポリスチレン製フルオロヌンク（ＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ）（商標）プレート（ヌンクＡ／Ｓ、ロスカイルド、デンマーク）に移し、ルミネセンスを二重走査ミクロプレート・スペクトロフルオロメータ（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（商標）ＧＥＭＩＮＩ ＸＳ、モレキュラー・デバイセス、サニーベイル、カリホルニア）で記録した。
【００９７】
結果
これまでに得られた結果は、ＣＰＰへのＭＴＸの結合はＣＰＰの細胞侵入性を破壊しないことを明らかに示した（図１３にはＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｅｖｏ１６５がヒト上皮ケラチノサイトに侵入することが示される）。（Ｅｖｏ１６５のアミノ酸配列は配列番号１４（３１９２５）から明らかで、変異体Ｅｖｏ１６５ｂ〜Ｅｖｏ１６５ｆは配列番号１５〜１９（３１９２５〜３１９３０）から明らかである）。また発明者らは、ＣＰＰへのＭＴＸの結合がＭＴＸの毒性作用を破壊しないことも見いだした。ＭＴＸのγ−カルボキシル基はＭＴＸのα−カルボキシル基よりもＣＰＰへの結合に適していることに注目されたい（図１４に見られるように、Ａｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−ｐＶＥＣはＡｐａ−Ｇｌｕ−ＧｌｙｐＶＥＣより毒性が大きいことが証明されている）。さらに言えることは、これまでに試験された全ての結合物によって例示されるように、種々の異なるＣＰＰｓがＭＴＸ−ＣＰＰ結合物において有用であることである：図１４のＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−ｐＶＥＣ、図１６のＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｅｖｏ１６５および図１６および図１７のＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−ＹＴＡ２。
【００９８】
実施例６
ＣＰＰを使用するｓｉＲＮＡ取り込みの改善
近年、小さい干渉ＲＲＮＡが、哺乳動物細胞における遺伝子発現を調節する高い選択能力のために多くの注目を集めている。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性化によってそれらの相補的ｍＲＮＡの特異的切断を誘起する二本鎖ＲＮＡの短い鎖（約２０ｂｐ）である。ＲＮＡ誘導性サイレンシングは内性メカニズムであるが、合成によって合成されたｓｉＲＮＡはインビトロでもインビボでも同じ効果を有することが示された。
【００９９】
残念ながらｓｉＲＮＡを使用する際の典型的問題は、細胞への取り込み収率が低いことである。本発明による細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）を合成的に合成したｓｉＲＮＡに結合することによって、発明者らはインビトロおよびインビボの両方で細胞内取り込みを改善することができた。
【０１００】
ＣＰＰトランスポータン１０（Ｔｐ１０）がジスルフィド−リンカーを介して結合しているガラニン受容体−１（ＧＡＬＲ−１）ｍＲＮＡに対して、ｓｉＲＮＡが設計された。そのＣＰＰの特性は、ｓｉＲＮＡの細胞内取り込みを高め、それによってｓｉＲＮＡを薬物学的使用により適したものにすることが判明した。図２１に、その作用メカニズムの略図が与えられる。
【０１０１】
材料および方法：
Ｂｏｗｅｓｅ細胞を２４ウェルプレートで一晩増殖させた（１０００００細胞／ウェル）。それら細胞を２００μｌの１μＭ蛍光標識ペプチド（ｐＶＥＣ）、または蛍光標識したｓｉＲＮＡ−ペプチド（図１９による）で３７℃で３０分間処理した。細胞を３倍希釈の標準トリプシン／ＥＤＴＡにさらし、外側細胞膜にくっついた全てのペプチドを除去した。細胞をその後０．１％トリトン−Ｘで溶解し、スペクトロマックス・ゲメニＸＳ（Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ Ｇｅｍｅｎｉ ＸＳ）蛍光リーダを使用してペプチド／ｓｉＲＮＡの取り込みを測定した。
【０１０２】
結果：
図１９からわかるように、結合していないｓｉＲＮＡに比較して、ＣＰＰ−結合ＤＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の取り込みには明らかな差が認められた。取り込みは細胞侵入ペプチドによる膜の破壊によるものではなかった。さらに、非結合のｐＶＥＣおよびｓｉＲＮＡの混合物は細胞内に陥入しなかった。
当業者には公知のように、ｓｉＲＮＡは細胞内で低濃度（ｐＭレベル以下）でも良い効率を有したから、この取り込みは標的ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ媒介性分解を十分活性化する可能性があると考えられる。
【０１０３】
実施例７
生体活性細胞侵入ペプチドを特徴づける一般的方法
トランスウェル（商標）実験
ヒト結腸癌細胞系Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ ｖｉａ ＬＧＣ、スエーデン）を１０％ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、非必須アミノ酸１×１００、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した、グルタマックス（インビトロゲン、スエーデン）を含むダルベッコ改良必須培地に、５％ＣＯ２を富化した空気中で３７℃で増殖させた。
【０１０４】
トランスウェル（商標）透明カップ（０．４μｍ孔、コーニング・コスタ、オランダ）にウシ血漿フィブロネクチン０．５μｇ／ｍｌ（インビトロゲン、スエーデン）を塗布した。１０００００ Ｃａｃｏ−２細胞を１２ウェル トランスウェル（商標）（１．１３ｃｍ２フィルタ面積）の各カップに播種し、少なくとも１０日間培養した。下方（１．５ｍｌ）および上方（０．５ｍｌ）チェンバ両方の培地を２〜３日ごとに交換した。細胞融合を位相差顕微鏡で検査し、ミリセル−ＥＲＳ（ミリポア、スエーデン）で、交流を使用してＴＥＥＲを測定した。細胞層侵入性の対照として、ＦＩＴＣ標識デキストラン４，４ｋＤａ（シグマーアルドリッヒ、スエーデン）の通過を、１０ｍＭ ＥＧＴＡ処理を行って、または行わずに測定した。ペプチド類の添加前、下方ウェルの培地をＨＥＰＥＳ干渉クレプス−リンゲル溶液（ＨＫＲ）に取り替えた。実験を開始する前に抵抗は６００Ω／ｃｍ２に達したので、５００Ωを超える数値は高抵抗と考えられる。
【０１０５】
燐酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）に溶解した１０μＭ濃度のホルオロフォア標識ペプチドを上方トランスウェル（商標）チェンバに加えた。各時点に、１５０μｌサンプルを下方チェンバから集め、蛍光をスペクトロマックス・ゲミニＸＳ（モレキュラーデバイス、カリホルニア）を用いて３２０／４２０ｎｍ（Ａｂｚ）および４９２／５２０ｎｍ（フルオレセイン）で測定した。
【０１０６】
細胞侵入研究および蛍光顕微鏡
細胞を２４−ウェルプレート中の丸いガラスカバースリップ（１２ｍｍ、ＧＴＦ、スエーデン）上に約５０％融合するまで増殖させた。培地を無血清培地に代え、ビオチニル化ペプチド溶液を加えた。細胞を３７℃または４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗い、４％パラホルムアルデヒド溶液で室温で（暗所）１５分間固定し、その後０．５％ｗ／ｖトリトンＸ−１００を含む３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中で氷上で３分間、浸透性にした。非特異的結合部位を３％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中で４℃で一晩ブロックした。ペプチド類をアビジン−ＦＩＴＣまたはストレプトアビジン−ＴＲＩＴＣ（モレキュラー・プローブス、オランダ）で染めることによって可視化した。細胞核をヘキスト３３２５８（０．５μｇ／ｍｌ）で５分間染色し、その後カバースリップをＰＢＳで３回洗い、ＰＢＳ中２５％グリセロール中に固定する。画像をライカ（Ｌｅｉｃａ）ＤＭ ＩＲＥ２蛍光顕微鏡（ライカ・マイクロシステム、スエーデン）でとり、フォトショップ（ＰｈｏｔｏＳｈｏｐ）６．０ソフトウエア（アドーブシステムズ社（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｎｓ）、カリホルニア）で処理した（図２０〜図２２などを参照されたい）。
【０１０７】
懸濁細胞におけるペプチドの取り込みおよび流出の研究
細胞をトリプシン（インビトロゲン、スエーデン）で脱着し、培養培地に溶解し、遠心分離した（１０００×ｇ、１０分間、室温）。細胞を再懸濁し、数え、氷上のＨＫＲ中に３０００００細胞／チューブづつ取り分けた。Ａｂｚ標識化ペプチドを懸濁液中の細胞と一緒に３７℃で１５分間および３０分間振とうしながらインキュベートした。取り込みまたは流出を停止するために、トリプシン溶液を３分間加えた。細胞を１０００×ｇで４℃で１０分間スピンダウンした。蛍光検出のためにペレットをＨＫＲに再懸濁し、または流出サンプルで、無ペプチドＨＫＲと共に再びインキュベートした。蛍光をスペクトロマックス・ゲミニＸＳ（モレキュラーデバイス、カリホルニア）で３２０／４２０ｎｍで読んだ。細胞内濃度をＡｂｚ−標識ペプチドの標準曲線から計算した。Ｃａｃｏ−２細胞の平均細胞容量をクールター２５６チャネライザー（クールタ・エレクトロニックス社、カリホルニア）を使用して測定した。
【０１０８】
質量分析により検出されるペプチドの分解／細胞内取り込み
３５ｍｍ細胞培養皿における８％融合細胞を、種々の時点において、無血清培地に溶解した１０μＭペプチドで処理した。細胞をＰＢＳで３回洗い、細胞を氷上で０．１％ＨＣｌで１５分間処理することによって細胞溶解物を調製した。溶解物を１３０００ｇで５分間遠心分離し、凍結した。充填する前に、それらのサンプルをＣ１８ Ｚｉｐ Ｔｉｐカラム（ミリポア、スエーデン）を用いて精製し、その後Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＲ ＳＴＲ装置で分析した（アプライド・ビオシステムズ、フラミンガム）。
【０１０９】
膜侵害アッセイ
２−デオキシグルコース・アッセイ
細胞を１２−ウェルプレートに播種し、播種の５日後に実験に使用した。先ず最初に、２−デオキシ−Ｄ−[１−３Ｈ]−グルコースの０．５μＣｉを無糖緩衝液中で各ウェル（アマーシャム・ファルマシア・ビオテク、英国）に加えた。３７℃で２０分間インキュベーション後、ペプチドを無血清培地に加え、最終濃度５、１０および２０μＭにした。陽性対照として、細胞をＰＢＳ中１％トリトンＸ−１００で処理した（漏出の上限を確認するため）。１、５、１５および３０分に、１５０μｌ培地サンプルを集め、エマルジファイアセーフ・シンチレーション・カクテル（パッカード、オランダ）を加え、放射能をパッカード３２５５液体シンチレーションカウンタで測定した。各ウェルからの相対的放射性流出を未処理細胞のパーセンテージとして計算した。
【０１１０】
ラクテート・デヒドロゲナーゼ・アッセイ
ラクテート・デヒドロゲナーゼ漏出を、プロメガ社（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン）のＣｙｃｌｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）ホメオゲナス・メンブラン・インテグリティ・（Ｈｏｍｅｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）アッセイを用いて試験し、メーカーの説明書によってラクテート・デヒドロゲナーゼ活性を計算した。
【０１１１】
ヒスタミン放出アッセイ
細胞培養
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞をアメリカ培養コレクション（マナッサス、ヴァージニア）から入手した。細胞を、グルタマックス−Ｉ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび加熱不活性化ウシ胎児血清（１０％）を補充したイーグル最小必須培地に培養した。全培地成分はインビトロゲン・コーポレーション（ペイスリー、英国）から得た。トリプシン／ＥＤＴＡはＰＡＡラボラトリーズ社（リンツ、オーストリア）から得た。細胞を１週間に２回分割し、Ｔ７５あたり約１．２百万個の細胞を播種した。ヒスタミン放出アッセイでは、実験の前日に、２４ウェル−プレートに１ウェルごとに１２５０００〜２５００００個の細胞（１ｍｌ中）を播種した。
【０１１２】
ヒスタミン放出
次の溶液を使用した：アッセイ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、 １ｍＭ ＣａＣｌ２、５．５ｍＭ グルコース、ｐＨ７．４）、１Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍｇ／ｍｌ ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＴ）−メタノール溶液、３Ｍ ＨＣｌおよび０．１％トリトンＸ−１００。全ての化学物質はシグマ−アルドリッヒ（セントルイス、マサチューセッツ）からのものである。１ｍＭペプチド保存溶液を水で調製し、アッセイ緩衝液を使用してさらに希釈した。細胞をアッセイ緩衝液で２回洗い、その後ペプチドをアッセイ緩衝液３００μｌに所望濃度で加えた。総細胞ヒスタミンを測定するために、幾つかのウェルを０．１％トリトンＸ−１００にさらした。３７℃で２０分間インキュベートした後、曝露培地を１．５ｍｌポリプロピレンチューブに移し、短時間遠心分分離した（２分間、３０００ｒｐｍ）。
【０１１３】
ＯＰＴを使用するヒスタミン測定
ＯＰＴはシグマ−アルドリッヒ社、セントルイス、ミズーリ州、から入手した。上澄液２００μｌを黒色未処理マイクロウエル−プレート（ＮＵＮＣ）に移し、４０μｌの１Ｍ ＮａＯＨおよび１０μｌのＯＰＴ溶液を加え、４分間振とうすることによってヒスタミンを測定した。反応を停止するために、２０μｌの３Ｍ ＨＣｌを加えた。３０秒後、蛍光強度を３５５ｎｍ励起フィルタおよび４５５ｎｍ発光フィルタを使用して測定した（ＳＰＥＫＴＲＡＭＡＸ（商標）ＧＥＭＩＮＩ ＸＳ、モレキュラデバイス、サニーベイル、カリホルニア）。放出されたヒスタミンを総細胞ヒスタミンのパーセンテージとしてあらわした。
【０１１４】
ＥＬＩＳＡを使用するヒスタミン測定
ヒスタミン用のＥＬＩＳＡキットはＩＢＬ社（ハンブルグ、ドイツ）から入手した。アッセイはメーカーの説明書にしたがって実施した。吸光度測定はＡＳＹＳ Ｈｉｔｈ社（ユーゲンドルフ、オーストリア）からのディジスキャン（Ｄｉｇｉｓｃａｎ）・マイクロプレート・リーダーを使用して行った。
【０１１５】
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【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】細胞内に拘束されているｓｅｌＣＰＰが、特異的受容体による認識事象によってその拘束をゆるめられ、インターナリゼーションが起きる。
【図２】キメラｓｅｌＣＰＰの略図である。
【図３】非共有結合ｓｅｌＣＰＰ−ＡＢ複合体と、エピトープ配列を露出する選択された細胞とのインキュベーション。ペプチドＸはＡＢと細胞表面蛋白質のペプチドＸ配列との競合的相互作用に導く。
【図４】不活性化されたｓｅｌＣＰＰの例。ＬｏＶｏ細胞におけるＹＴＡ−２（Ａ）とＹＴＡ−２ｐｓ（Ｂ）とのインターナリゼーションの比較。両方とも３７℃でＴＲＩＴＣアビジンによって検出されるビオチニル化ペプチドである。
【図５】プロテアーゼ活性化ｓｅｌＣＰＰ、フルオロフォア／クェンチャー（消滅）システムによる検出の例。基質金属プロテイナーゼ−２のＹＴＡ−２ｐｓの特異的切断の確認法（ＭＭＰ−２）。
【図６】ＬｏＶｏ細胞（ヒト結腸癌）、３７℃、における１０μＭペプチドの転位。
【図７】不活性化されたｓｅｌＣＰＰの別の例。Ｂｏｗｅｓ（Ａ）および（Ｂ）およびＣａｃｏ−２（Ｃ）および（Ｄ）におけるＰｅｎＭＭＰ１４の取り込み。左側はフルオレセイン標識化ペプチド（Ａ）および（Ｃ）の取り込みで、左はクマリン標識（Ｂ）および（Ｄ）である。
【図８】組織−（腫瘍）選択的取り込み（ｂ）に導く、任意の組織／器官／細胞特異的プロテアーゼを代表する基質金属プロテアーゼ（ａ）によるｓｅｌＣＰＰ活性化の図式。
【図９】組織−（腫瘍）選択的取り込み（ｂ）に導く、基質金属プロテアーゼ（ａ）によるｓｅｌＣＰＰ活性化の図式。
【図１０】ヒト結腸腺癌、ＬｏＶｏ細胞におけるビオチニル化ＹＴＡ−２のインターナリゼーション．Ａ）ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで検出 Ｂ）ヘキストによる核染色を比較。
【図１１】ＬｏＶｏ細胞におけるＹＴＡ−２ｐｓ（Ｂ）と比較したＹＴＡ−２（Ａ）のインターナリゼーション。両方とも３７℃でＴＲＩＴＣ−アビジンによって検出された。Ｃ）およびＤ）はストレプトアビジンＴＲＩＴＣおよび核染色で検出されるＣａｃｏ−２細胞中のＹＴＡ−２。
【図１２】蛍光標識化ペプチド（Ｆ）の取り込み。図は加えたペプチドの取り込み％で示される。
【図１３】培養ヒト上皮ケラチノサイトへのＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｅｖｏ１６５の侵入。免疫蛍光的検出。
【図１４】Ｂｏｗｅｓ細胞の生育性に与える種々のＭＴＸ−ｐＶＥＣ結合体の影響。１０％ＦＢＳ−ＭＥＭ中で２４時間曝露。
【図１５】Ｂｏｗｅｓ細胞の生育性に与えるＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｅｖｏ１６５の影響（アッセイにはＣｅｌｌ−ＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）を使用）。
【図１６】Ｂｏｗｅｓ細胞の生育性に与えるＭＴＸ、Ａｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−ＹＴＡ２およびＹＴＡ２の影響（アッセイにはＣｅｌｌ−ＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）を使用）。
【図１７】Ｋ５６２細胞生育性に与えるＭＴＸ、Ａｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−ＹＴＡ２およびＹＴＡ２の影響。７．５％ＦＢＳ−ＲＰＭＩに２日間曝露。
【図１８】ジスルフィド結合でＴｐ１０−ＰＮＡに結合したｓｉＲＮＡ。構成物および細胞内の理論的作用メカニズムの略図。
【図１９】Ｂｏｗｅｓ細胞への１μＭペプチド−ＤＮＡ構成物の取り込み、３７℃、３０分間、２４ウェルプレート。
【図２０】十分に研究されたＣＰＰによる細胞侵入の例。生きているＣａｃｏ−２細胞内への１μＭフルオ−ペプチドのペプチドインターナリゼーション。
【図２１】３７℃およびＴ／Ｅにおけるフルオ−ストレプトアビジンのＹＴＡ−２による蛋白質インターナリゼーション。ｓｅｌＣＰＰの送達特性を示す。
【図２２】４℃およびＴ／Ｅによるフルオ−ストレプトアビジンのＹＴＡ−２による蛋白質インターナリゼーション。ｓｅｌＣＰＰの送達特性および温度依存性を示す。
【配列表】
【０００１】
本発明は標的細胞に送達される細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性物質のようなカーゴのための細胞選択的送達系に関する。本発明はまた医薬の製造における使用のための細胞選択的送達系にも関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の細胞エフェクタを細胞内に送達する多数の技術が開発されている。これらの技術の大部分はエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションのように侵襲的である。リポソーム被包化や受容体依存性エンドサイトーシス（細胞内取り込み）が比較的おだやかな方法であるが、それらは残念ながら重大な欠点、特に低い送達収率を示す。
【０００３】
細胞生物学における確立された視点から、親水性生体高分子の細胞インターナリゼーションは典型的エンドサイトーシス経路によってのみ実現し得ることが示されている。しかし過去１０年間に数種のペプチドが見かけ上エネルギー非依存性経路によって真核細胞の細胞膜を通過して移動することが証明された。これらのペプチドは細胞侵入ペプチド（ＣＰＰｓ）と定義され、それらの分子量の数倍大きい分子量を有する生体高分子の細胞内送達のために上首尾に使用されている。（リンドグレン（Ｍ．Ｌｉｎｄｇｒｅｎ）ら、２０００、細胞侵入ペプチド（Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）；ＴＩＰＳ、２１巻、ｐ．９９−１０３）
【０００４】
これらの細胞侵入ペプチドを使用する細胞送達は従来の方法にまさる幾つかの利点を有する。それは非侵襲的、エネルギー非依存性であり、広範囲の細胞型において有効であり、全ての細胞に適用できる。さらに、幾つかの種類のＣＰＰｓでは細胞インターナリゼーションが３７℃でも４℃でも同様に起こり、飽和することがないことが判明した。また大部分の場合に、そのインターナリゼーションはキラル受容体蛋白質を必要としないようにみえる。なぜならば光学異性的差別が認められないからである。
【０００５】
最近まで、細胞膜を破壊せずに親水性生体高分子を生体細胞の細胞質−および核コンパートメントに運搬することは遥かに遠くの目標であるように見えた。ポリペプチド類およびオリゴペプチド類は、生体膜透過性が低く、比較的速やかに分解するために、治療的価値は制限されると一般的に考えられていた。これは生医学的研究並びに製薬工業の両方において一つの障害である。
【０００６】
非常に重要な仕事であるとはいえ、さらにより困難なことは、親水性生体高分子を血液脳障壁を通過して送達することである。この関門を越えるために幾つかの方法が推奨された。にもかかわらずそれら全てに、その効果がある分子サブセットに限定されるとか、それらの収率が低すぎるなどの制限がある。しかし最近の報告は、ＣＰＰｓが生体高分子を血液−脳障壁を通って運搬し得ることを示唆している。
【０００７】
エフェクタ類の所望の送達のためのもう一つの重要な領域は、核内輸入である。その際シグナル配列がある正電荷を担った（塩基性）残基を含まなければならないことは一般に知られている（モロイアヌ（Ｍｏｒｏｉａｎｕ Ｊ．）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９９）。このような帯電アミノ酸は細胞膜転位のためにも必要であるようにみえる。
【０００８】
今日では、細胞侵入ペプチド、ＣＰＰｓの送達は知られている。数種のペプチドが見かけ上エネルギー非依存性経路によって真核細胞の細胞膜を経て転位することが証明された。こうして細胞侵入ペプチドは、ペプチド、蛋白質、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子など薬物学的に興味深い物質類の送達ベクターとして、並びに研究ツールとして使用できるかも知れない。
【０００９】
ＣＰＰｓの中で特に興味深いのは、低い溶解（ｌｙｔｉｃ）活性を有するペプチド類である。トロジャン・ペプチドとしても知られているこれら転位ペプチド（デロッシ（Ｄ．Ｄｅｒｏｓｓｉ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８（１９９８）ｐ．８４−８７）は、インビボおよびインビトロの両方において、親水性生体分子および薬剤を細胞の細胞質−および核コンパートメントに送達するためのベクターとして利用された（リンドグレン（Ｍ．Ｌｉｎｄｇｒｅｎ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ．２１巻（２０００）ｐ．９９−１０３）。それ自体の分子量の何倍も大きい分子量を有するポリペプチドおよびオリゴペプチドなどのカーゴと共有結合した場合でもこれらペプチドは転位することができる。
【００１０】
有用な運搬ペプチドの例は、ある種の転写因子のホメオドメインから誘導される配列、並びにシグナル配列をベースとしたいわゆるＴａｔ−誘導ペプチド類である。ホメオドメインから誘導された転位ペプチドの最初のものはｐＡｎｔｐと記載されるペネトラチン（配列番号１）であった。これはドロソフィラのアンテナペディナ・ホメオドメイン蛋白質からの第三α−ヘリックス（残基４３−５８）の１６残基に対応する配列を有する（デロッシら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻（１９９４）ｐ．１０４４４−１０４５０；プロキアンツ（Ａ．Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ）、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８６巻（１９９９）ｐ．１７２−１７９を参照されたい）。ｐＡｎｔｐペプチドはその膜転位特性を保有し、そのため普遍的細胞内送達ベクターであると提唱されてきた（デロッシら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８巻（１９９８）ｐ．８４−８７）。
【００１１】
純粋に合成されたペプチド、またはキメラ−ペプチドも文献に参照されるように（デロッシら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８巻（１９９８）ｐ．８４−８７；リンドグレンら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１巻（２０００）ｐ．９９−１０３）設計された。
【００１２】
非天然ペプチドなどのトランスポータン（配列番号２）は、それ自体は３ｋＤペプチドに過ぎないのに、約１５０ｋＤａの分子量を有する抗体分子を細胞膜を経て送達することができる。トランスポータンおよびペネトラチンは非天然ＤＮＡ類似体、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を培養細胞の細胞質および核内に送達することが証明された（プーガ（Ｐｏｏｇａ）ら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）。
【００１３】
驚いたことに、疎水性部分に結合した際に細胞膜を通過して運搬できることが証明されたまた別の群のペプチドは、ペプドゥシンと呼ばれる修飾受容体、特にＧ蛋白質結合受容体である（ＷＯ０１８１４０８、クリオプロス（Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ）ら、を参照されたい）。７ＴＭ受容体の第三細胞内ループから誘導されるペプチドに疎水性部分を結合させると、前記キメラペプチド類の細胞内転位および受容体Ｇ−蛋白質シグナリングの完全アゴニストおよび／またはアンタゴニストの細胞内転位が起きることが発見された。これらペプドゥシンは膜侵入性、膜結合性キメラペプチドであり、活性をあらわすためにはそれらの同種受容体の存在を必要とし、受容体型に対して非常に選択的である。
【００１４】
驚くほどの運搬能力のために、ＣＰＰｓは近年、科学的関心の的になったとはいえ、種々のＣＰＰｓの転位の最も基礎的なメカニズムはいまだに知られていない。例えば、転位を許す（エネルギー的に）ためには何らかの特別の二次構造、例えば同時に起きる一過性の膜不安定化などが誘導されなければならないのか否かはこの分野ではいまだに知られていない。しかしペプチド−膜相互作用の分子レベルでの詳細が転位プロセスのための基礎的重要事項であることは明らかである。
【００１５】
インターナリゼーションのメカニズムおよび必要事項が両親媒性α−ヘリカルペプチドと脂質（二）層との相互作用に関して研究された。これらの研究結果のなかには、トリプトファンがペプチドのインターナリゼーションを起こすことを示唆するものが多い。しかし芳香族アミノ酸がＣＰＰ配列に優勢であるとはいえ、それらは細胞侵入に絶対に必要というわけではない。
【００１６】
細胞侵入能力とは別に、ＣＰＰｓ間に構造または挙動の相関関係はほとんど認められていない。したがって現在までＣＰＰｓは合理的方法では設計されず、偶然に発見されていた。しかしこれまでに公表されたＣＰＰｓの配列は唯一の共通的特徴として正の正味電荷を有し、これが所定のペプチド配列におけるＣＰＰ機能性を予測するための出発点となった。しかし正の正味電荷を有する配列が全て細胞侵入性ではあり得ないことは明らかであり、確実にＣＰＰｓを選択するためにはさらなる制限が必要であることが示唆される。
【００１７】
ＷＯ００３４３０８は伝達ドメインと細胞傷害性ドメインを含む一つ以上の融合タンパク質を含んでなるタンパク質伝達系を開示している。そのタンパク質伝達系は、高レベルの重金属、ＤＮＡ損傷または制御されない細胞分裂のような独特の特性を示す異なった病原体または細胞の一つまたは組み合わせに感染した細胞を効果的に死滅させもしくは傷害を与える。
【特許文献】
ＷＯ００３４３０８
【発明の開示】
【００１８】
本発明は添付の請求項１及び従属請求項に記載の細胞選択的送達系並びに請求項８に記載の医薬の製造における使用のための細胞選択的送達系を提供する。
【００１９】
本発明に関連して、アミノ酸はアミノ（−ＮＨ２）およびカルボキシル（−ＣＯＯＨ）基を含む任意の有機化合物である。アミノ酸はＬ−型でもＤ−型でもよい。現在、ｍＲＮＡのリボソーム翻訳中に蛋白質を合成する公知のコーデドα−アミノ酸が２２種類ある。それに加えて、非常に多数の非コーデドアミノ酸が定常的にあらわれており、そのうちの５６例が表１Ａに示される。コーデドおよび非コーデドアミノ酸は、本発明に含まれるアミノ酸配列、ペプチドフラグメント類、ペプチド類、蛋白質類および／またはポリペプチド類の一部であることは当然である。
【００２０】
本発明に関連して、アミノ酸配列とはペプチドフラグメント、ペプチド、蛋白質またはポリペプチド中に精確に決められた順序で線状に配列するアミノ酸（コーデドおよび／または非コーデドアミノ酸を両方含む）である。
【００２１】
用語“非ペプチド類似体"は、本発明に関連して、少なくとも１つの非コーデドアミノ酸を含み、および／または主鎖修飾を有し、その結果ペプチド結合（すなわち１つのアミノ酸のカルボキシル基と他のアミノ酸のアミノ基との間に形成されるＣＯ−ＮＨ結合）のないアミノ酸配列を生成する、任意のアミノ酸配列である。
【００２２】
さらに、本発明のアミノ酸配列はアミド化されていてもよく、遊離酸として生成してもよい。
【００２３】
異なる特性のリポータ基、例えばビオチンおよび種々のフルオロフォア類、例えばフルオレセイン、アミノ安息香酸およびローダミン類など、を予測ＣＰＰに結合させて、その細胞転位および効率を推定することができる。
【００２４】
用語、ペプチドの“細胞侵入能力"とは、以後、細胞膜を経て真核細胞および／または原核細胞の細胞質および／または核コンパートメント、例えば細胞形質、核、リソソーム、小胞体、ゴルジ装置、ミトコンドリアおよび／または葉緑素、などに見かけ上エネルギー非依存的に転位する能力、と同意義に用いられる。追加的に、用語、ペプチドの“細胞侵入能力"は本発明のある局面においては、細胞貫通または膜貫通輸送と同意義にも用いられ、したがって、腸／頬系の上皮などの上皮膜、口腔、肺、直腸または鼻の粘膜、または哺乳動物の血液−脳障壁を通過する転位能力も表す。
【００２５】
本発明により細胞侵入能力をあらわす検出された、または新たに設計され、証明されたペプチドは、本発明に関連して“細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）"と定義され、例えば、それ自体の分子量より数倍大きい分子量をもつポリペプチドおよび／またはオリゴヌクレオチドなどの生体高分子を細胞内に送達するために使用できる。
【００２６】
概して細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体を使用する細胞内送達は非侵襲的、エネルギー非依存的であり、広範囲の細胞型および／または非常に種々様々のカーゴにとって効率的であり、全ての細胞に適用でき、飽和せず、受容体非依存性である。
【００２７】
本出願に開示される方法によって見いだされるかまたは新たに設計され、および／または証明されたＣＰＰｓは親水性生体高分子を生体細胞および／または微生物の細胞質および核コンパートメントに、細胞膜を恒久的に破壊することなく輸送するのに有用であり、血液−脳障壁を介して親水性生体高分子を送達し、共役オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドおよび薬剤類の細胞内輸送を可能にするために有用である。
【００２８】
こうして本発明に関連して、細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体が任意の薬物学的に興味深い物質、例えばペプチド、ポリペプチド、蛋白質、低分子物質、薬剤、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、二本鎖並びに一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／または任意の人工的または部分的人工的核酸、例えばＰＮＡ、の送達ベクターとして、並びに、タグやマーカーなど送達のための研究ツールとしておよび／または膜ポテンシャルおよび／または特性を変化させるための研究ツールとして使用できる。
【００２９】
したがって本発明によって見いだされまたは設計および／または生産されるＣＰＰは親水性生体分子および／または薬剤を細胞および／または組織の細胞質および核コンパートメントに送達するためのベクターとしてインビボおよびインビトロの両方に用いられる。
【００３０】
ＣＰＰ自体の分子量より何倍も大きい分子量を有する任意のペプチド、ポリペプチド、蛋白質、低分子物質、薬剤、ポリペプチドおよびオリゴペプチドを含むカーゴ（ｃａｒｇｏ）と共有結合した場合でも、ＣＰＰは転位することができる。
【００３１】
その上、ＣＰＰはそれ自体細胞内および／または細胞外エフェクタ活性を示し、細胞侵入機能的蛋白質模擬ペプチドとして働くことができ、または新たに設計され、新しい予想もできない機能をあらわすことがある。
【００３２】
細胞エフェクタは本明細書では細胞内および／または細胞外エフェクタであり、本発明に関連して、収縮、分泌、電気インパルス、または細胞内および／または細胞外シグナリング・カスケードの活性化または不活性化などの細胞効果を生み出す構造、または前記エフェクタによる刺激に応えてｍＲＮＡおよび／または蛋白質の細胞レベルのアップレギュレーションを誘発する構造と定義される。典型的エフェクタは本発明に関連して、代謝産物、アンタゴニスト、アゴニスト、受容体・リガンド、受容体結合蛋白質、活性化受容体、酵素インヒビタ、アクチベータ／インアクチベータおよび／またはスティミュレータ、キナーゼ、ホスファターゼ、エンハンサ、またはサイレンサ、転写因子、トランスポータおよび／またはトランスミッタ、ホルモン、チャンネル、イオン、プリオン、およびウィルス蛋白質からなる群から選択される。
【００３３】
カーゴ
既述のように、ＣＰＰはカーゴに結合し、前記カーゴを細胞、種々の細胞コンパートメント、組織または器官へ運ぶ担体として機能する。カーゴは薬物学的に興味深い物質、例えばペプチド、ポリペプチド、蛋白質、小分子物質、薬剤、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、二本鎖並びに一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／または任意の人工的または一部人工的核酸、例えばＰＮＡ、低分子量分子、糖類、プラスミド、抗生物質、細胞傷害剤および／または抗ウィルス剤などからなる群から選択される。さらに、カーゴの運搬は例えばタグ類およびマーカー類を送達するための研究ツール並びに膜電位および／膜特性を変えるための研究ツールとして有用であり、カーゴは例えばビオチンのようなマーカー分子でもよい。
【００３４】
カーゴを意図的に血液脳障壁を通過して運搬することに関連して、細胞内および細胞外物質類は同様に好ましいカーゴである。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態において、細胞侵入ペプチドは前記カーゴにＳ−Ｓ架橋によって結合する。当然、カーゴをＣＰＰに結合するための非常に種々様々の結合法があり、ＣＰＰ、カーゴおよび目的とする用途の性質に応じて個々に選択される。結合モードは共有および非共有結合（ビオチン−アビジン結合など）、エステル結合、およびアミド結合、抗体結合などからなる群から選択できる。
【００３６】
ある実施形態においては、不安定な結合が好ましく、ある実施形態においては安定な結合が重要である；例えば本発明によるＣＰＰを医学的物質の運搬のために使用する際には、使用前に前記医薬組成物を保存しておく必要があるため、安定な結合が重要である。
【００３７】
上記の実施形態のための例証的例は実施例２、５および６に記載される。
【００３８】
実施例５において、メトトレキセート（ＭＴＸ）とＣＰＰ担体との結合体が記載されている。ＭＴＸは細胞傷害性薬剤であり、それは悪性腫瘍の治療のために開発されたが、いまは乾癬のような自己免疫病の治療に使用されている。ＭＴＸは負に帯電した分子として体液中に存在するのが普通である。そのためそれが細胞膜を通過するには困難を伴う。
【００３９】
本発明によるカーゴの運搬のためにＣＰＰを使用する一つの例証的例は、実質的に配列番号３−７に含まれるようなＭＴＸ−ＣＰＰ結合体を含む。それらは例えば実施例５に記載されるような固相ペプチド合成法を用いて合成される。その特定の例は下の表１に示される：
ＣＰＰと共に細胞膜を通過して運ばれる分子のその他の例は実施例６に記載されており、そこではｓｉＲＮＡの取り込みが実質的に改善される。
【００４１】
近年、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、哺乳動物細胞における遺伝子発現を調節するそれらの高い感受性能力のために、注目を集めている。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性化によって相補的ｍＲＮＡの特異的切断を引き起こす二本鎖ＲＮＡの短鎖（約２１〜２３ｂｐ）である。ＲＮＡ誘導性サイレンシングが内因性メカニズムであるとはいえ、合成的に合成されたｓｉＲＮＡ類はインビトロでもインビボでも同じ効果を有することが証明された。
【００４２】
ｓｉＲＮＡを使用する際の公知の問題は、細胞内取り込みの低収率である。細胞侵入ペプチド類（ＣＰＰ）を合成的に合成したｓｉＲＮＡに結合することによって、細胞内取り込みは有意に改善する。
【００４３】
本発明に含まれるカーゴ運搬のためにＣＰＰを使用するもう一つの特定の実施形態はトランスポータン１０（Ｔｐ１０）のようなＣＰＰにジスルフィド・リンカーによって結合した、ＧＡＬＲ−１ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに関するものである。例えば、図１８に示され、配列番号２に記載されている。
【００４４】
細胞選択ＣＰＰｓ
本発明のさらに別の実施形態において、ある細胞型／組織／器官に選択的に侵入し、またはある細胞型、組織型または器官型においてのみ活性化されるカーゴを運搬する細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体が提供される。
【００４５】
発明者は、種々の異なるＣＰＰｓが特異的細胞系、例えばヒトメラノーマ細胞系Ｂｏｗｓなどによって、有意に異なる効率、および有意に異なる取り込み速度、時には２倍も異なる速度でインターナライズされることを示す。これは、異なる効率で異なる細胞系および組織にインターナライズされるＣＰＰｓを定義する予備的条件である。そこで本発明の重要な実施形態は、選択的輸送が要求される細胞系、細胞類、組織類および／または器官類における細胞内取り込みのための天然のまたは新たに設計される全てのＣＰＰｓを試験することによって特徴づけられる選択性ＣＰＰｓ（ｓｅｌＣＰＰｓ）の開発法である。他方では、ある標的細胞または標的細胞集団のために選択されたＣＰＰｓの細胞選択性を人工的に高める幾つかの特殊な方法が使用される。これは以下に詳細に記載される。
【００４６】
一例として、癌細胞は多くの細胞表面抗原および／または蛋白質を露出し、並びにある蛋白質類を分泌する。通常、腫瘍細胞は特異的な細胞表面マーカーを発現せず、むしろ一般的受容体／マーカーを過剰発現する。これらの過剰に発現されるマーカー類および／または細胞内および／または細胞外シグナルの過剰増幅によるシグナリングは細胞周期を通じた細胞機構の制御を喪失するメカニズムの一つであると考えられる。こうして本発明の特殊な実施形態において、過剰発現する細胞表面蛋白質および／または分泌蛋白質は、ＣＰＰアドレッシングのための標的として使用される。
【００４７】
本発明の一実施形態において、細胞選択ＣＰＰ（ｓｅｌＣＰＰ）は、チャンネル受容体類、チロシンキナーゼ受容体類（例えばＥＧＥ、ＩＧＦ）、グアニレートシクラーゼ受容体類、セリン／スレオニン・キナーゼ・受容体類、サイトカイン受容体類、グアノシン三燐酸（ＧＴＰ）−結合蛋白質に結合した受容体（Ｇ−蛋白質結合受容体：ＧＰＣＲｓ）、スフィンゴ糖脂質類、ＣＤ４４、神経ペプチド受容体、例えばニューロテンシン受容体類、ガラニン、およびサブスタンスＰ受容体類からなる群から選択される細胞マーカーに対して生成した抗原／蛋白を含むことが予測される。
【００４８】
概して、細胞選択ＣＰＰ（ｓｅｌＣＰＰ）は任意の種類の薬剤または医薬物質の、種々の特異的真核および／または原核細胞標的への標的化輸送に極めて重要であることは当然である。このようなカーゴの細胞選択輸送は、例えばウィルス、細菌または寄生虫感染症によって起きる疾患のような感染症の治療または予防のための使用が想定される。
【００４９】
標的細胞をインビボで見いだす前にＣＰＰｓの非特異的イターナリゼーションを避けるために、別の局面において本発明は酵素−プロドラッグ戦略の新しい変形体に関係する。その際ｓｅｌＣＰＰ結合物は、ＣＰＰ類の細胞侵入−活性構造が、前記ｓｅｌＣＰＰのペプチド部分の細胞／組織または器官特異的受容体／マーカーへの結合事象または標的細胞／組織または器官によって分泌されるプロテアーゼによる前記ｓｅｌＣＰＰ結合体の切断によって構造識別体からＣＰＰを放出するまでは破壊されないように、設計される。
【００５０】
用語"酵素−プロドラッグ戦略／療法"は、アミノ酸または核酸プロドラッグ（それらは送達前または後に多かれ少なかれ組織、器官および／または細胞選択酵素類による活性化を要求する）の開発に焦点をおいたプロドラッグ送達の特異的アプローチを定義するために使用される。選択性の大きい差が先行技術に見いだされる。幾つかのプロドラッグでは標的組織／器官／細胞からの放出薬剤の速やかな除去が低選択性を説明し、またあるプロドラッグでは、非標的組織における切断、および細胞を経由する酵素部位への不十分な輸送が（低選択性の）主な原因であると考えられる。
【００５１】
特に、多くの抗癌剤は非常に有毒であり、そのためより効果的およびより毒性の少ないプロドラッグおよび／またはソフトドラッグが必要である。そのため典型的プロドラッグ／ソフトドラッグは活性化酵素のための効率的および選択的基質でなければならないし、好ましくは細胞周期の全段階において細胞を殺す強力な細胞傷害物質および／または細胞増殖抑制物質に代謝されなければならない。初期の抗代謝産物ベースのプロドラッグの多くは、細胞膜を経由する拡散能力が限られ、客観的効果を得るには細胞間の細隙結合に依存しなければならない極性の高い活性化型を提供した。しかし本発明に記載されるプロドラッグ類は良好な分布特性を有し、それらの活性種は翻訳細胞侵入性であり、それによって得られる客観的効果はその療法の効果を最大にすることができる。
【００５２】
本発明に関連して、用語“酵素−プロドラッグ戦略／療法"とは、その他に薬剤を送達する上記の方法であって、前記薬剤それ自体またはその運搬体ＣＣＰを非細胞侵入性にして、インビボ標的細胞を見つける前にＣＰＰｓの非特異的インターナリゼーションが起こるのを回避するようにし、その際前記ｓｅｌＣＰＰのペプチド部分の細胞／組織または器官特異的受容体／マーカーへの結合事象、または前記ｓｅｌＣＰＰ−結合体の、標的細胞／組織又は器官によって分泌されるプロテアーゼによる前記ｓｅｌＣＰＰ結合体の切断によってのみ、構造的識別体からＣＰＰが放出され、それが標的細胞に侵入できるという方法を説明するための用語である。
【００５３】
したがって本発明の特に好ましい実施形態は、ａ）標的細胞において特異的に過剰発現されるプロテアーゼのためのプロテアーゼ・コンセンサス部位、ｂ）細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体、およびｃ）細胞増殖抑制物質および／または細胞傷害物質を含む、細胞増殖抑制物質および／または細胞傷害物質の細胞選択的送達系に関するものであり、前記細胞選択的送達系はその他に前記細胞侵入ペプチドの細胞侵入能力を抑制する不活性配列も含み、その配列は前記細胞選択的送達系によって前記標的細胞の近くに導入されると、前記標的細胞に特異的に過剰発現される前記プロテアーゼによって切断される。実施例４などを参照されたい。
【００５４】
上記の概念の典型的例は基質金属プロテアーゼ（ＭＭＰｓ）であり、それらはＺｎ２＋金属エンドペプチダーゼである。このファミリは結合したメンバーも分泌されたメンバーも両方共含み、それらは両方共細胞膜上または細胞外基質（ＥＣＭ）に存在する蛋白質の分解を触媒する（スターンリヒト（Ｍ．Ｄ．Ｓｔｅｒｎｌｉｃｈｔ）およびワーブ（Ｚ．Ｗｅｒｂ）「基質金属プロテアーゼが細胞挙動を調節する仕方（Ｈｏｗ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｃｅｌｌ ｂｅｈａｖｉｏｒ）」Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７巻：ｐ．４６３−５１６、２００１）。ＭＭＰｓは多種多様の悪性腫瘍の侵襲性および転移性挙動に関連があり、これら酵素は一般的に種々の腫瘍に過剰発現される（スターンリヒトおよびワーブ「基質金属プロテアーゼが細胞挙動を調節する仕方」Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７巻：ｐ．４６３−５１６；ロザノフ（Ｄ．Ｖ．Ｒｏｚａｎｏｖ）ら、“膜１型金属プロテアーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ、別名ＭＭＰ−１４）"Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＪＢＣ）２７６巻：ｐ．２５７０５−１４、２００１年７月１３日）。ＭＭＰ−ＭＴ１のような膜型ＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）は発癌に強く関係している。これらの酵素は侵襲性先端に局在する。可溶性ＭＭＰｓ１−３および９も腫瘍発生のアゴニストとして関係している（スミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｅ．，パークス（Ｐａｒｋｓ，Ｋ．Ｋ．），ハセガワ（Ｋ．Ｋ．Ｈａｓｅｇａｗａ，），イーストモンド（Ｅａｓｔｍｏｎｄ Ｄ．Ａ．）＆グロソヴスキ（Ｇｒｏｓｏｖｓｋｙ，Ａ．Ｊ．）パラセントメトリック・ヘテロクロマチンの標的化破壊は染色体を不安定にする（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｒｅａｋａｇｅ ｏｆ ｐａｒａｃｅｎｔｍｅｔｒｉｃ ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｈｒｏｍａｓｏｍａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）；Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ １３巻、ｐ．４３５−４３（１９９８））。
【００５５】
これに付随して、そして実施例４および１２に明確に証明されたように、本発明は次の３つの基礎的機能に基づいてｓｅｌＣＰＰを設計する方法に関係する：１）ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−ＭＴ１による選択的切断（およびそれによる活性化）、２）ペプチド（ＣＰＰｓ）による細胞侵入、および３）それによって腫瘍細胞または腫瘍の血管新生に関係する内皮を既知の細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤によって死滅させること（図２、３、８および９を参照されたい）。
【００５６】
本発明はこうして表２または表３に含まれるアミノ酸配列から選択されるｓｅｌＣＰＰ、および、表２または表３に列挙されるアミノ酸配列および細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤を含む、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤の複合的細胞選択的送達系に関係する。配列番号３−１０を参照されたい。
【００５７】
したがって、本発明はａ）標的細胞において特異的に過剰発現されるプロテアーゼのためのプロテアーゼ・コンセンサス部位を含む細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体およびｃ）細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤を含む、細胞増殖抑制および／または細胞傷害性薬剤の細胞選択的送達系にも関係し、前記細胞選択的送達系はその他に前記細胞侵入ペプチドの活性を抑制する不活性化配列を含み、この配列は前記細胞選択的送達系が前記標的細胞近くに導入されると標的細胞において特異的に過剰発現されるプロテアーゼによって切断される。
【００５８】
上記のような前記細胞選択的送達系の好ましい実施形態において、前記細胞選択的送達系に含まれる前記細胞侵入ペプチドは前記細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤の細胞内取り込みの平均速度を、ａおよびｃ）の成分のみを含む細胞選択的送達系または前記細胞の成分ｃ）だけの平均細胞内取り込み率に比較して、１細胞あたり少なくとも１．５のファクターだけ高める。
【００５９】
前記細胞選択的送達系の、また別の同様に好ましい実施形態において、前記細胞選択的送達系に含まれる前記細胞侵入ペプチドは、前記細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性薬剤の前記選択的細胞の１細胞あたりの平均取り込み率を、ａ）およびｃ）の線分だけを含む細胞選択的送達系の前記細胞への平均取り込み率、または前記細胞のｃ）成分だけの平均取り込み率に比較して少なくともファクター１．５、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００または１００００だけ高める。
【００６０】
上記のような細胞選択的送達系のまた別の同様に好ましい実施形態において、前記過剰発現するプロテアーゼは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−ＭＴ１からなる群から選択されるＺｎ２＋金属エンドペプチダーゼである。
【００６１】
もう一つの実施形態において、前記過剰発現するプロテアーゼは細菌表面プロテアーゼおよびウィルス酵素からなる群から選択される。
【００６２】
ここに記載される細胞選択的送達系は哺乳動物における特殊な細胞集団の細胞増殖を停止させ、細胞増殖をコントロールできないという特徴を有する医学的障害、例えば腫瘍性異常または腫瘍疾患、または免疫学的および／または代謝機能亢進などに罹患した患者を治療するための医薬組成物の製造にも使用できることは勿論である。
【００６３】
本発明のさらにまた別の局面は、本発明による細胞選択的送達系を使用して薬剤を製造することに関係する。
【００６４】
本発明の種々の局面および実施形態を以下の実施例によって説明する。本発明は特別に記載された詳細によって制限されるものではない。
【００６５】
略語
Ａβ ベータ−アミロイド
ＡＤ アルツハイマー病
ＡＰＰ アミロイド前駆体蛋白質
ＡＴ１ アンジオテンシン・受容体ＡＴ１型
ＡＴ１Ａ アンジオテンシン・受容体・サブタイプＡＴ１Ａ
ＡＴ１Ｂ アンジオテンシン・受容体・サブタイプＡＴ１Ｂ
ＡＴ２ アンジオテンシン・受容体ＡＴ２型
ＢＡＣＥ β−部位ＡＰＰ−切断酵素
Ｂｉｏ ビオチン、ビオチニル化
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ＣＰＰ 細胞侵入ペプチド
ＣＴＦ Ｃ−末端フラグメント
ＤＣＣ Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＩＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＤＮＰ ジニトロフェニル
ＥＯＦＡＤ 早発性アルツハイマー病
ＦＩＴＣ ５−フルオレセイン・イソチオシアネート
Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＧＯＰ ＩＶＩＡＫＬＫＡ−アミド
ＧＰＣＲ Ｇ−蛋白質結合受容体
ＧＴＰ グアノシン ５’−三燐酸
ＧＴＰａｓｅ グアノシントリホスファターゼ
ＧＴＰγＳ グアノシンγ−Ｓ−５’−三燐酸
ＨＫＲ ヘペス−クレプス−リンゲル
ＨＯＢｔ Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ 高性能液体クロマトグラフィー
ＩＤＥ インスリン分解酵素
ＬＯＡＤ 遅発性アルツハイマー病
ＭＢＨＡ ４−メチルベンズヒドリルアミン
ＮＦＴ 神経原線維糸球
ＮＩＣＤ ノッチ細胞内ドメイン
ＮＭＰ Ｎ−メチルピロリドン
ＮＴＦ Ｎ−末端フラグメント
ＰＡＦ パラホルムアルデヒド
ＰＢＳ 燐酸緩衝食塩液
ＰＮＡ ペプチド核酸
ＰＳ プレセニリン
ＲＮＡ リボ核酸
ＳＡＰＰ 分泌ＡＰＰ
ＴＡＣＥ 腫瘍壊死因子アルファ変換酵素
ｔ−Ｂｏｃ ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＴＢＴＵ ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾールー１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウム・テトラフルオロ硼酸
ＴＦＡ 三フッ化酢酸
ＴＦＡ 三フッ化酢酸
ＴＦＭＳＡ トリフルオロメタンスルホン酸
【実施例】
【００６６】
実施例１
ペプチド合成（特に他の記載がなければ、以下の諸実験の既定の方法が記載される）
ペプチドは固相ペプチド合成のｔ−Ｂｏｃ戦略を使用してペプチド合成器（アプライド・ビオシステムス４３１Ａ型、ＵＳＡ）で０．１ｍｍｏｌスケールで段階的方法によって合成される。ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニルアミノ酸（バチェム、ブデンドルフ、スイス）をヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ）エステルとしてｐ−メチルベンジルヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂（バチェム、ブデンドルフ、スイス）に結合させ、Ｃ−末端アミデート化ペプチドを得た。ビオチンを手動でＮ−末端に結合した；そのためには３倍過剰のＨｏＢｔおよびｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム テトラフルオロ硼酸（ＴＢＴＵ）活性化ビオチン（ケミコン、ストックホルム、スイス）をＤＭＦ中でペプチジル樹脂に加えた。上記ペプチドを、最後にｐ−クレゾールの存在下でＯ℃、３０分間、液体ＨＦで樹脂から切り離した。このペプチドの純度は、分析ヌクレオシル１２０−３ Ｃ−１８ ＰＲ−ＨＰＬＣカラム（０．４×１０ｃｍ）上のＨＰＬＣによって測定したところ、＞９８％であることが証明され、正確な分子量はプラズマ脱着質量分析（ビオイン２０、アプライド・ビオシステムス、ＵＳＡ）またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｖａａｇｅｒ ＳＴＲ−Ｅ、アプライド・ビオシステムス、ＵＳＡ）を使用して、記載されるようにして得た（ランゲル（Ｌａｎｇｅｌ，Ｕ．，）、ランド（Ｌａｍｄ，Ｔ．）＆バルトファイ（Ｂａｒｔｆａｉ，Ｔ．）、ガラニン受容体およびサブスタンスＰ受容体に対するキメラペプチドリガンドの設計（Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ｇａｌａｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅＰ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）。Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ ３９巻、ｐ．５１６−２２（１９９２））。
【００６７】
細胞培養（特に他の記載がなければ、下の実験の既定の方法を述べる）
ネズミ線維芽細胞Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞およびＣＯＳ−７細胞を１０ｃｍペトリ皿中で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃で５％ＣＯ２気流中で増殖させた。細胞を播種し、５日目ごとに再培養した。播種した際ＣＯＳ−７および１０Ｔ１／２細胞をトリプシン化し、その一方、Ｎ２Ａ細胞は培地をその細胞に加えて、機械的力で懸濁した。実験開始前に細胞を融合するまで増殖させ、その後播種し、培地で２倍に希釈し、その後２４ウェルプレートに加えた（約６００００細胞／ウェル）。
【００６８】
カーゴ送達効率の高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）
ＣＰＰ−Ｓ−Ｓ−カーゴ構成物（カーゴは２−アミノ安息香酸フルオロフォアで標識化され、ＣＰＰは２−ニトロトリプシン消光剤で標識化されている）を使用することによって、還元性細胞内メジウムに起因するジスルフィド結合の細胞内分解、および目に見える蛍光の増加による前記構成物の細胞内取り込みを実時間でモニターすることができる。
【００６９】
懸濁細胞または付着細胞内のペプチド取り込みおよび流出の研究
細胞をトリプシン（インビトロゲン、スイス）で分離し、培養培地に溶解し、遠心分離した（１０００×ｇ、室温で１０分間）。細胞を再懸濁し、計数し、その一部を３０００００細胞／チューブの割合で氷上のＨＫＲ中に取った。Ａｂｚ−標識化ペプチドを懸濁細胞と共に、３７℃の水浴中で振とうしながら１５および３０分間インキュベートした。取り込みまたは流出を停止するために、トリプシン溶液を３分間加えた。細胞を４℃で、１００×ｇ、１０分間回転した。ペレットをＨＫＲ中に再懸濁して蛍光を検出し、または流出サンプルでは再び無ペプチドＨＫＲと共にインキュベートした。蛍光をスペクトラマックス・ジェミニＸＳ（モレキュラーデバイセス、カリフォルニア）上で３２０／４２０ｎｍで読んだ。細胞内濃度をＡｂｚ標識化ペプチドの標準曲線から計算した。Ｃａｃｏ−２細胞の平均細胞量を、クールター２５６チャンネライザー（クールター・エレクトロニックス社、カリフォルニア）を使用して測定した。その他に、同じアッセイの変法を使用した：細胞を２４ウェルプレートに１０００００細胞／ウェルの密度で前日に播種した。細胞を５μＭペプチド濃度で３７℃で３０分間インキュベートした。トリプシン処理し、洗浄し、塩酸中で溶解した。蛍光を懸濁アッセイについて記載したように測定した。
【００７０】
材料および方法
細胞
ヒトメラノーマ細胞Ｂｏｗｅｓを標準細胞培養法を使用してＭＥＭに培養し、実験を行う前の日に２４ウェルプレートに１０００００細胞／ウェルの密度で播種した。
【００７１】
結果および検討
【００７２】
実施例２
基質金属プロテイナーゼー２（ＭＭＰ−２）のＹＴＡ−２ｐｓの特異的切断の測定法；
上に、そして図１０に示したように、発明者らは選択的ＣＰＰ（ＹＴＡ−２）のＣＰＰ部分が３７℃でも４℃でも細胞に効率よく入ることができることを示した（データは示されず）。それに加えて“インアクチベータ"は細胞膜を介する転位に関してペプチドをより不活性にした。この方法の開発における次の工程は活性ＭＭＰ−２によるＹＴＡ−２ｐｓの特異的切断をチェックすることである。それは蛍光／消光剤アッセイによって行われる。ここではＭＭＰ−２基質ＹＴＡ−２ｐｓは切断で蛍光強度を高める。正しい切断は質量分析によってさらにチェックされる。
【００７３】
実施例３
材料および方法
ＴＰ１０およびＹＴＡ−２の合成および精製
上記ペプチド類をパーキン・エルマー／アプライド・ビオシステム社、４３１Ａ型ペプチド合成器で、既述のプロトコルによるｔ−Ｂｏｃ戦略を用いて段階的に合成した（ランゲル、ランドら、１９９２）。システインまたはグルタミン酸を手動で結合させた。ＴＰ１０配列はプーガ、１９９８、ＦＡＳＥＢ．Ｊ．に与えられている（配列番号２）。ＹＴＡ−２配列は表２に与えられ、配列番号３として記載されている。あらかじめペプチド類をＰＥＩに結合させ、それらを逆相ＨＰＬＣ（ギンコテク（Ｇｙｎｋｏｔｅｋ））Ｃ１８カラム上で、ＡｃＮ／Ｈ２Ｏ勾配で精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（アプライド・ビオシステム社、ＶｏｙａｇｅｒＳＴＲ型）を用いて分析した。得られた質量値は計算値と一致した。
【００７４】
細胞培養
ネズミ線維芽細胞Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞およびＣＯＳ−７細胞を１０ｃｍペトリ皿中で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）に増殖させた。細胞を播種し、５日目ごとに培養しなおした。播種したときにＣＯＳ−７および１０Ｔ１／２細胞をトリプシン化し、その一方でＮ２Ａ細胞を、それら細胞に培地を加えることによって機械的に懸濁した。実験開始前に、細胞を融合するまで増殖させ、その後播種し、培地で２倍に薄め、その後２４ウェルプレートに加えた（約６００００細胞／ウェル）。
【００７５】
実施例４
ｓｅｌＣＰＰ
序文
基質金属プロテアーゼ類（ＭＭＰｓ）はＺｎ２＋金属エンドペプチダーゼ類である。このファミリは膜結合メンバーおよび分泌メンバーの両方を含む。その両方共細胞質膜上または細胞外基質（ＥＣＭ）内のどちらかに局在する蛋白質類の分解を触媒する（スターンリヒト−０１）。
【００７６】
ＭＭＰｓはＥＣＭを分解できるので、ＭＭＰｓは細胞の移動、再形成および炎症性反応に影響を与える。しかしこれらの酵素は侵襲性および炎症性疾患、例えば癌、リウマチ性関節炎、多発性硬化症および細菌性髄膜炎などの基礎的原因にも関係する（レッパート−０１）。
【００７７】
転移や血管新生などの侵襲性プロセスの一つの特徴は、通常は細胞移動に対する物理的障壁であるＥＣＭおよび基底膜の分解である。ＭＭＰｓは種々様々の悪性腫瘍の侵襲性および転移性挙動に関連しており、これらの酵素は種々の腫瘍に過剰発現するのが普通である（スターンリヒト−０１、ロザノフ−０１）。異なるＭＭＰｓの数が腫瘍の進行につれて増加し（ヘキストラ−０１）、ある種の腫瘍の侵襲力と相関関係にある（ホーンベック−０１）ことが見いだされている。さらに、ＭＭＰｓの発現はトランスジェニックマウスの転移腫瘍数と相関関係にある（ストレンリヒト−０１）。
【００７８】
ＭＭＰ−ＭＴ１のような膜型ＭＭＰｓ（ＭＴ−ＭＭＰ）は発癌に密接に関係している。これらの酵素は侵襲先端に局在する。可溶性ＭＭＰｓ１−３および９も腫瘍発生のアゴニストとして関係している（ロザノフー０１およびナベシマ−０２）。ＭＭＰ−ＭＴ１は血管形成中の内皮細胞の誘導および移動中にもアップレギュレートする（ガルヴェズ−０１）。その上、ＭＭＰ−ＭＴ１（またはＭＭＰ１４とも呼ばれる）はその“シェダーゼ（ｓｈｅｄａｓｅ）"活性によるｐｒｏＭＭＰ−２の活性化に関係し、それによって侵襲先端にＭＭＰ−２を放出する（ソンニ−０２）。ＭＭＰ−２は腫瘍血管新生に重要な役割を有するようにみえる（チェン−０１）。
【００７９】
ｓｅｌＣＰＰｓ
選択的ＣＰＰｓの概念はＭＭＰｓ酵素活性の組織特異性に基づく。
一アプローチはＣＰＰをガラニンのような任意の受容体リガンドに結合することによって、エンドサイトーシス取り込みを用いてそのＣＰＰの特異性および活性化を調べることである。
【００８０】
ＭＭＰ活性化ｓｅｌＣＰＰ
典型的ｓｅｌＣＰＰ（図８）は３つの部分、すなわちトランスポータ（ＣＰＰ）、特異的プロテアーゼ部位およびインアクチベータから作られる。インアクチベータはＣＰＰを不活性化するために付加され、インアクチベータが切り離される前にはそれが細胞に入ることができないようにする。ＣＰＰはトキシン、例えば公知の非侵入性細胞増殖停止物質および／または細胞傷害物質を担う。諸配列の好ましい実施形態およびペプチド類の標識化については表５を参照されたい。
【００８２】
上記の概念は次の３つの基礎的機能に基づく：ａ）ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−ＭＴ１による選択的切断（およびそれによる活性化）、ｂ）トキシンを担うペプチド（ＣＰＰ）による細胞侵入およびそれによるｃ）近くの、好ましくは腫瘍細胞または、腫瘍血管新生に含まれる内皮の死滅（略図が図８に示される）。
【００８３】
上記の概念を証明する例証的例として、発明者らは選択的ＣＰＰ（ＹＴＡ−２）のＣＰＰ部分が３７℃（図１０及び１１）および４℃（データは示されず）の両方において細胞に効率的に侵入できることを証明することに成功した。その上“インアクチベータ"（図９参照）は細胞膜を転位する際のペプチドをより不活性にする。ＭＭＰ２によるＹＴＡ−２の正しい切断も質量分析によって確認されている（データは示されず）。細胞増殖停止物質および／または細胞傷害物質（ＭＴＸ）のＣＰＰ−部分への付着および効率は実施例５を参照されたい。
【００８４】
ＭＭＰ１４（またはＭＭＰ−ＭＴ１）の切断のための新しい配列が４種類ある：ＬＲＳＷ１−３およびｐｅｎＭＭＰ１４。後者はＭＭＰ１４を発現する細胞（ＢｏｗｅｓおよびＣａｃｏ−２）に取り込まれることが証明されている。図７を参照されたい。
【００８５】
それに加えて、６７ｋＤａ蛋白質蛍光標識化ストレプトアビジンは、ビオチニル化ＹＴＡ−２に結合したとき、陥入した（図２１および２２を参照）。これは、ＹＴＡ−２が大きいカーゴ分子を細胞内に運搬できることを示す。
【００８６】
【００８７】
実施例５
細胞内薬剤送達の実施例：
メトトレキセートおよび細胞侵入ペプチド（ＭＴＸ−ＣＰＰ）の結合物
序文
メトトレキセート（ＭＴＸ）は細胞傷害性薬剤であり、悪性腫瘍の治療のために開発されたものであるが、現在は乾癬のような自己免疫病の治療に使用されている。ＭＴＸは葉酸拮抗物質（式１）であり、葉酸トランスポータによって細胞に入る。ＭＴＸの標的は葉酸要求酵素である。
乾癬治療におけるＭＴＸの使用は、全身投与時のその副作用によって抑制される。最も重大な副作用は肝毒性である。そこで、ＭＴＸの局所的投与組成物が非常に好ましい。
【００８８】
式１．ＭＴＸの構造
生物学的液において、ＭＴＸは負電荷を有する分子として存在する。そのため、それは、葉酸トランスポータによってのみ細胞膜を通過することができる。本発明は先ず第一に、 １）容易に、かつ受容体／担体−非依存的に細胞内および皮膚内に侵入する
２）乾癬の顕著な特徴であるケラチノサイト過剰増殖を抑制する
３）不都合な副作用（ヒスタミン放出など）がない
ＭＴＸ−ＣＰＰ結合体を生成する手段を明らかにする。
【００９０】
ＭＴＸ−ＣＰＰ結合体は全て、固相ペプチド合成戦略を用いて合成される。これには次の２つの理由が考えられる：
１）ＭＴＸ（ＣＡＳ番号５９−０５−２）は２つの構造単位：４−デオキシ−４−アミノ−Ｎ１０−メチルプテロイン酸（Ａｐａ、ＣＡＳ番号１９７４１−１４−１）およびγ−グルタメートに分けることができる
２）ＭＴＸはそのγ−カルボキシル基上の置換に対して比較的非感受性である。
【００９１】
【００９２】
ＭＴＸ−ＣＰＰ結合物の固相合成
ＭＴＸはＢｏｃ化学作用の標準的切断条件のもとでは不安定であるため、Ｆｍｏｓ−化学作用を使用した（フッ化水素、０℃、３０分）。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕとＡｐａとの結合は標準カップリング法（ＨＯＢｔ／ＴＢＴＵ）を使用して行われた。結合物を試薬Ｋ（８２．５％ＴＦＡ：５％フェノール：５％チオアニソール：２．５％１，２−エタンジチオール）を用いて樹脂から切り離した。
【００９３】
細胞培養物
全ての細胞は３７℃で５％ＣＯ２中で培養された。プラスチック実験器具はコーニング社（アクトン、ＭＡ）から入手した。ヒト新生児表皮ケラチノサイト（ＨＥＫｎ）、全ての増殖培地の成分および、その増殖のために必要なトリプシン化試薬はカスケード・バイオロジックス（商標）（ポートランド、オレゴン）から入手した。ＨＥＫｎ細胞を、ヒトケラチノサイト増殖補充キット（ＨＫＧＳ）およびペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンフォテリシンＢを補充したエピライフ（Ｅｐｉｌｉｆｅ）（商標）培地に培養した。ＨＥＫｎ細胞を１週間に一度分割し、Ｔ７５あたり３０００００細胞を播種した。増殖培地を１〜２日ごとに交換した。
【００９４】
Ｂｏｗｅｓヒトメラノーマ細胞をアメリカ培養コレクション（マナッサス、ＶＡ）から得た。Ｂｏｗｅｓ細胞を、グルタマックス−Ｉ、非必須アミノ酸、ピルビン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン（図には“ＭＥＭ"として示される）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したイーグル最小必須培地に培養した。Ｂｏｗｅｓ細胞のための全ての培地成分はインビトロゲン・コーポレーション（ペイスリー、英国）からのものであった。トリプシン／ＥＤＴＡはＰＡＡラボラトリーズ社（リンツ、オーストリア）からのものであった。細胞を１週間に１回継代培養し、Ｔ７５あたり２０００００細胞を播種した。生育性のアッセイでは、実験前日に、２４ウェルプレートに１ウェルにつき５００００細胞（３００μｌ中）を播種した。
【００９５】
Ｋ５６２ヒト赤白血病細胞をアメリカ培養コレクション（マナッサス、ＶＡ）から入手した。Ｋ５６２細胞をグルタマックス−Ｉ、ペニシリン、ストレプトマイシン（図１４〜図１７には“ＲＰＭＩ"として示される）およびウシ胎児血清（７．５％）を補充したＰＲＭＩ−１６４０培地に培養した。Ｋ５６２のための全ての培地成分はインビトロゲン・コーポレーション（ペイスリー、英国）から入手した。トリプシン／ＥＤＴＡはＰＡＡラボラトリーズ社（リンツ、オーストリア）からのものであった。細胞を２日目または３日目（そのとき細胞密度は１００００００細胞／ｍｌに達した）ごとに継代培養し、１０００００細胞／ｍｌを播種した。生育性を試験するためには２４ウェル−プレートに１ウェルにつき３００００細胞／３００μｌを播種した。
【００９６】
細胞の生育性の測定
結合物のストック溶液（１ｍＭ）を滅菌水で調製し、ＭＴＸのストック溶液を１０％ＤＭＳＯ水溶液で調製した。曝露のために、薬剤を曝露培地（無血清ＯＰＴＩＭＥＭまたはＭＥＭ中１％ＦＢＳまたはＭＥＭ中１０％ＦＢＳまたはＲＰＭＩ中７．５％ＦＢＳ）で希釈し、所望濃度（Ｂｏｗｅｓ細胞の場合）または１０×最終濃度（Ｋ５６２細胞の場合）にした。１ウェルにつき、それぞれの曝露混合物３００μｌ（Ｂｏｗｅｓの場合）または３０μｌ（Ｋ５６２の場合）を使用した。Ｂｏｗｅｓ細胞を使用するいくつかの実験で、曝露混合物を２時間後に除去し、あらかじめ温めた薬剤不含有曝露培地に代えた。１〜２日後、細胞の生育性をセルタイタ−グロ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ）（商標）ルミネセント細胞生育性アッセイ（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン）を使用して試験した。プレートを室温で平衡化した（約３０分間）。セルタイタ−グロ（商標）試薬３００μｌを各ウェルに付加し、１０分間インキュベートした。３００μｌを白色ポリスチレン製フルオロヌンク（ＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ）（商標）プレート（ヌンクＡ／Ｓ、ロスカイルド、デンマーク）に移し、ルミネセンスを二重走査ミクロプレート・スペクトロフルオロメータ（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（商標）ＧＥＭＩＮＩ ＸＳ、モレキュラー・デバイセス、サニーベイル、カリホルニア）で記録した。
【００９７】
結果
これまでに得られた結果は、ＣＰＰへのＭＴＸの結合はＣＰＰの細胞侵入性を破壊しないことを明らかに示した（図１３にはＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｅｖｏ１６５がヒト上皮ケラチノサイトに侵入することが示される）。（Ｅｖｏ１６５のアミノ酸配列は配列番号１４（３１９２５）から明らかで、変異体Ｅｖｏ１６５ｂ〜Ｅｖｏ１６５ｆは配列番号１５〜１９（３１９２５〜３１９３０）から明らかである）。また発明者らは、ＣＰＰへのＭＴＸの結合がＭＴＸの毒性作用を破壊しないことも見いだした。ＭＴＸのγ−カルボキシル基はＭＴＸのα−カルボキシル基よりもＣＰＰへの結合に適していることに注目されたい（図１４に見られるように、Ａｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−ｐＶＥＣはＡｐａ−Ｇｌｕ−ＧｌｙｐＶＥＣより毒性が大きいことが証明されている）。さらに言えることは、これまでに試験された全ての結合物によって例示されるように、種々の異なるＣＰＰｓがＭＴＸ−ＣＰＰ結合物において有用であることである：図１４のＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−ｐＶＥＣ、図１６のＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｅｖｏ１６５および図１６および図１７のＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−ＹＴＡ２。
【００９８】
実施例６
ＣＰＰを使用するｓｉＲＮＡ取り込みの改善
近年、小さい干渉ＲＲＮＡが、哺乳動物細胞における遺伝子発現を調節する高い選択能力のために多くの注目を集めている。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性化によってそれらの相補的ｍＲＮＡの特異的切断を誘起する二本鎖ＲＮＡの短い鎖（約２０ｂｐ）である。ＲＮＡ誘導性サイレンシングは内性メカニズムであるが、合成によって合成されたｓｉＲＮＡはインビトロでもインビボでも同じ効果を有することが示された。
【００９９】
残念ながらｓｉＲＮＡを使用する際の典型的問題は、細胞への取り込み収率が低いことである。本発明による細胞侵入ペプチド（ＣＰＰ）を合成的に合成したｓｉＲＮＡに結合することによって、発明者らはインビトロおよびインビボの両方で細胞内取り込みを改善することができた。
【０１００】
ＣＰＰトランスポータン１０（Ｔｐ１０）がジスルフィド−リンカーを介して結合しているガラニン受容体−１（ＧＡＬＲ−１）ｍＲＮＡに対して、ｓｉＲＮＡが設計された。そのＣＰＰの特性は、ｓｉＲＮＡの細胞内取り込みを高め、それによってｓｉＲＮＡを薬物学的使用により適したものにすることが判明した。図２１に、その作用メカニズムの略図が与えられる。
【０１０１】
材料および方法：
Ｂｏｗｅｓｅ細胞を２４ウェルプレートで一晩増殖させた（１０００００細胞／ウェル）。それら細胞を２００μｌの１μＭ蛍光標識ペプチド（ｐＶＥＣ）、または蛍光標識したｓｉＲＮＡ−ペプチド（図１９による）で３７℃で３０分間処理した。細胞を３倍希釈の標準トリプシン／ＥＤＴＡにさらし、外側細胞膜にくっついた全てのペプチドを除去した。細胞をその後０．１％トリトン−Ｘで溶解し、スペクトロマックス・ゲメニＸＳ（Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ Ｇｅｍｅｎｉ ＸＳ）蛍光リーダを使用してペプチド／ｓｉＲＮＡの取り込みを測定した。
【０１０２】
結果：
図１９からわかるように、結合していないｓｉＲＮＡに比較して、ＣＰＰ−結合ＤＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の取り込みには明らかな差が認められた。取り込みは細胞侵入ペプチドによる膜の破壊によるものではなかった。さらに、非結合のｐＶＥＣおよびｓｉＲＮＡの混合物は細胞内に陥入しなかった。
当業者には公知のように、ｓｉＲＮＡは細胞内で低濃度（ｐＭレベル以下）でも良い効率を有したから、この取り込みは標的ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ媒介性分解を十分活性化する可能性があると考えられる。
【０１０３】
実施例７
生体活性細胞侵入ペプチドを特徴づける一般的方法
トランスウェル（商標）実験
ヒト結腸癌細胞系Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ ｖｉａ ＬＧＣ、スエーデン）を１０％ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、非必須アミノ酸１×１００、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した、グルタマックス（インビトロゲン、スエーデン）を含むダルベッコ改良必須培地に、５％ＣＯ２を富化した空気中で３７℃で増殖させた。
【０１０４】
トランスウェル（商標）透明カップ（０．４μｍ孔、コーニング・コスタ、オランダ）にウシ血漿フィブロネクチン０．５μｇ／ｍｌ（インビトロゲン、スエーデン）を塗布した。１０００００ Ｃａｃｏ−２細胞を１２ウェル トランスウェル（商標）（１．１３ｃｍ２フィルタ面積）の各カップに播種し、少なくとも１０日間培養した。下方（１．５ｍｌ）および上方（０．５ｍｌ）チェンバ両方の培地を２〜３日ごとに交換した。細胞融合を位相差顕微鏡で検査し、ミリセル−ＥＲＳ（ミリポア、スエーデン）で、交流を使用してＴＥＥＲを測定した。細胞層侵入性の対照として、ＦＩＴＣ標識デキストラン４，４ｋＤａ（シグマーアルドリッヒ、スエーデン）の通過を、１０ｍＭ ＥＧＴＡ処理を行って、または行わずに測定した。ペプチド類の添加前、下方ウェルの培地をＨＥＰＥＳ干渉クレプス−リンゲル溶液（ＨＫＲ）に取り替えた。実験を開始する前に抵抗は６００Ω／ｃｍ２に達したので、５００Ωを超える数値は高抵抗と考えられる。
【０１０５】
燐酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）に溶解した１０μＭ濃度のホルオロフォア標識ペプチドを上方トランスウェル（商標）チェンバに加えた。各時点に、１５０μｌサンプルを下方チェンバから集め、蛍光をスペクトロマックス・ゲミニＸＳ（モレキュラーデバイス、カリホルニア）を用いて３２０／４２０ｎｍ（Ａｂｚ）および４９２／５２０ｎｍ（フルオレセイン）で測定した。
【０１０６】
細胞侵入研究および蛍光顕微鏡
細胞を２４−ウェルプレート中の丸いガラスカバースリップ（１２ｍｍ、ＧＴＦ、スエーデン）上に約５０％融合するまで増殖させた。培地を無血清培地に代え、ビオチニル化ペプチド溶液を加えた。細胞を３７℃または４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗い、４％パラホルムアルデヒド溶液で室温で（暗所）１５分間固定し、その後０．５％ｗ／ｖトリトンＸ−１００を含む３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中で氷上で３分間、浸透性にした。非特異的結合部位を３％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中で４℃で一晩ブロックした。ペプチド類をアビジン−ＦＩＴＣまたはストレプトアビジン−ＴＲＩＴＣ（モレキュラー・プローブス、オランダ）で染めることによって可視化した。細胞核をヘキスト３３２５８（０．５μｇ／ｍｌ）で５分間染色し、その後カバースリップをＰＢＳで３回洗い、ＰＢＳ中２５％グリセロール中に固定する。画像をライカ（Ｌｅｉｃａ）ＤＭ ＩＲＥ２蛍光顕微鏡（ライカ・マイクロシステム、スエーデン）でとり、フォトショップ（ＰｈｏｔｏＳｈｏｐ）６．０ソフトウエア（アドーブシステムズ社（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｎｓ）、カリホルニア）で処理した（図２０〜図２２などを参照されたい）。
【０１０７】
懸濁細胞におけるペプチドの取り込みおよび流出の研究
細胞をトリプシン（インビトロゲン、スエーデン）で脱着し、培養培地に溶解し、遠心分離した（１０００×ｇ、１０分間、室温）。細胞を再懸濁し、数え、氷上のＨＫＲ中に３０００００細胞／チューブづつ取り分けた。Ａｂｚ標識化ペプチドを懸濁液中の細胞と一緒に３７℃で１５分間および３０分間振とうしながらインキュベートした。取り込みまたは流出を停止するために、トリプシン溶液を３分間加えた。細胞を１０００×ｇで４℃で１０分間スピンダウンした。蛍光検出のためにペレットをＨＫＲに再懸濁し、または流出サンプルで、無ペプチドＨＫＲと共に再びインキュベートした。蛍光をスペクトロマックス・ゲミニＸＳ（モレキュラーデバイス、カリホルニア）で３２０／４２０ｎｍで読んだ。細胞内濃度をＡｂｚ−標識ペプチドの標準曲線から計算した。Ｃａｃｏ−２細胞の平均細胞容量をクールター２５６チャネライザー（クールタ・エレクトロニックス社、カリホルニア）を使用して測定した。
【０１０８】
質量分析により検出されるペプチドの分解／細胞内取り込み
３５ｍｍ細胞培養皿における８％融合細胞を、種々の時点において、無血清培地に溶解した１０μＭペプチドで処理した。細胞をＰＢＳで３回洗い、細胞を氷上で０．１％ＨＣｌで１５分間処理することによって細胞溶解物を調製した。溶解物を１３０００ｇで５分間遠心分離し、凍結した。充填する前に、それらのサンプルをＣ１８ Ｚｉｐ Ｔｉｐカラム（ミリポア、スエーデン）を用いて精製し、その後Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＲ ＳＴＲ装置で分析した（アプライド・ビオシステムズ、フラミンガム）。
【０１０９】
膜侵害アッセイ
２−デオキシグルコース・アッセイ
細胞を１２−ウェルプレートに播種し、播種の５日後に実験に使用した。先ず最初に、２−デオキシ−Ｄ−[１−３Ｈ]−グルコースの０．５μＣｉを無糖緩衝液中で各ウェル（アマーシャム・ファルマシア・ビオテク、英国）に加えた。３７℃で２０分間インキュベーション後、ペプチドを無血清培地に加え、最終濃度５、１０および２０μＭにした。陽性対照として、細胞をＰＢＳ中１％トリトンＸ−１００で処理した（漏出の上限を確認するため）。１、５、１５および３０分に、１５０μｌ培地サンプルを集め、エマルジファイアセーフ・シンチレーション・カクテル（パッカード、オランダ）を加え、放射能をパッカード３２５５液体シンチレーションカウンタで測定した。各ウェルからの相対的放射性流出を未処理細胞のパーセンテージとして計算した。
【０１１０】
ラクテート・デヒドロゲナーゼ・アッセイ
ラクテート・デヒドロゲナーゼ漏出を、プロメガ社（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン）のＣｙｃｌｏＴｏｘ−ＯＮＥ（商標）ホメオゲナス・メンブラン・インテグリティ・（Ｈｏｍｅｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）アッセイを用いて試験し、メーカーの説明書によってラクテート・デヒドロゲナーゼ活性を計算した。
【０１１１】
ヒスタミン放出アッセイ
細胞培養
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞をアメリカ培養コレクション（マナッサス、ヴァージニア）から入手した。細胞を、グルタマックス−Ｉ、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび加熱不活性化ウシ胎児血清（１０％）を補充したイーグル最小必須培地に培養した。全培地成分はインビトロゲン・コーポレーション（ペイスリー、英国）から得た。トリプシン／ＥＤＴＡはＰＡＡラボラトリーズ社（リンツ、オーストリア）から得た。細胞を１週間に２回分割し、Ｔ７５あたり約１．２百万個の細胞を播種した。ヒスタミン放出アッセイでは、実験の前日に、２４ウェル−プレートに１ウェルごとに１２５０００〜２５００００個の細胞（１ｍｌ中）を播種した。
【０１１２】
ヒスタミン放出
次の溶液を使用した：アッセイ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．６ｍＭ ＭｇＣｌ２、 １ｍＭ ＣａＣｌ２、５．５ｍＭ グルコース、ｐＨ７．４）、１Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍｇ／ｍｌ ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＴ）−メタノール溶液、３Ｍ ＨＣｌおよび０．１％トリトンＸ−１００。全ての化学物質はシグマ−アルドリッヒ（セントルイス、マサチューセッツ）からのものである。１ｍＭペプチド保存溶液を水で調製し、アッセイ緩衝液を使用してさらに希釈した。細胞をアッセイ緩衝液で２回洗い、その後ペプチドをアッセイ緩衝液３００μｌに所望濃度で加えた。総細胞ヒスタミンを測定するために、幾つかのウェルを０．１％トリトンＸ−１００にさらした。３７℃で２０分間インキュベートした後、曝露培地を１．５ｍｌポリプロピレンチューブに移し、短時間遠心分分離した（２分間、３０００ｒｐｍ）。
【０１１３】
ＯＰＴを使用するヒスタミン測定
ＯＰＴはシグマ−アルドリッヒ社、セントルイス、ミズーリ州、から入手した。上澄液２００μｌを黒色未処理マイクロウエル−プレート（ＮＵＮＣ）に移し、４０μｌの１Ｍ ＮａＯＨおよび１０μｌのＯＰＴ溶液を加え、４分間振とうすることによってヒスタミンを測定した。反応を停止するために、２０μｌの３Ｍ ＨＣｌを加えた。３０秒後、蛍光強度を３５５ｎｍ励起フィルタおよび４５５ｎｍ発光フィルタを使用して測定した（ＳＰＥＫＴＲＡＭＡＸ（商標）ＧＥＭＩＮＩ ＸＳ、モレキュラデバイス、サニーベイル、カリホルニア）。放出されたヒスタミンを総細胞ヒスタミンのパーセンテージとしてあらわした。
【０１１４】
ＥＬＩＳＡを使用するヒスタミン測定
ヒスタミン用のＥＬＩＳＡキットはＩＢＬ社（ハンブルグ、ドイツ）から入手した。アッセイはメーカーの説明書にしたがって実施した。吸光度測定はＡＳＹＳ Ｈｉｔｈ社（ユーゲンドルフ、オーストリア）からのディジスキャン（Ｄｉｇｉｓｃａｎ）・マイクロプレート・リーダーを使用して行った。
【０１１５】
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【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】細胞内に拘束されているｓｅｌＣＰＰが、特異的受容体による認識事象によってその拘束をゆるめられ、インターナリゼーションが起きる。
【図２】キメラｓｅｌＣＰＰの略図である。
【図３】非共有結合ｓｅｌＣＰＰ−ＡＢ複合体と、エピトープ配列を露出する選択された細胞とのインキュベーション。ペプチドＸはＡＢと細胞表面蛋白質のペプチドＸ配列との競合的相互作用に導く。
【図４】不活性化されたｓｅｌＣＰＰの例。ＬｏＶｏ細胞におけるＹＴＡ−２（Ａ）とＹＴＡ−２ｐｓ（Ｂ）とのインターナリゼーションの比較。両方とも３７℃でＴＲＩＴＣアビジンによって検出されるビオチニル化ペプチドである。
【図５】プロテアーゼ活性化ｓｅｌＣＰＰ、フルオロフォア／クェンチャー（消滅）システムによる検出の例。基質金属プロテイナーゼ−２のＹＴＡ−２ｐｓの特異的切断の確認法（ＭＭＰ−２）。
【図６】ＬｏＶｏ細胞（ヒト結腸癌）、３７℃、における１０μＭペプチドの転位。
【図７】不活性化されたｓｅｌＣＰＰの別の例。Ｂｏｗｅｓ（Ａ）および（Ｂ）およびＣａｃｏ−２（Ｃ）および（Ｄ）におけるＰｅｎＭＭＰ１４の取り込み。左側はフルオレセイン標識化ペプチド（Ａ）および（Ｃ）の取り込みで、左はクマリン標識（Ｂ）および（Ｄ）である。
【図８】組織−（腫瘍）選択的取り込み（ｂ）に導く、任意の組織／器官／細胞特異的プロテアーゼを代表する基質金属プロテアーゼ（ａ）によるｓｅｌＣＰＰ活性化の図式。
【図９】組織−（腫瘍）選択的取り込み（ｂ）に導く、基質金属プロテアーゼ（ａ）によるｓｅｌＣＰＰ活性化の図式。
【図１０】ヒト結腸腺癌、ＬｏＶｏ細胞におけるビオチニル化ＹＴＡ−２のインターナリゼーション．Ａ）ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで検出 Ｂ）ヘキストによる核染色を比較。
【図１１】ＬｏＶｏ細胞におけるＹＴＡ−２ｐｓ（Ｂ）と比較したＹＴＡ−２（Ａ）のインターナリゼーション。両方とも３７℃でＴＲＩＴＣ−アビジンによって検出された。Ｃ）およびＤ）はストレプトアビジンＴＲＩＴＣおよび核染色で検出されるＣａｃｏ−２細胞中のＹＴＡ−２。
【図１２】蛍光標識化ペプチド（Ｆ）の取り込み。図は加えたペプチドの取り込み％で示される。
【図１３】培養ヒト上皮ケラチノサイトへのＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｅｖｏ１６５の侵入。免疫蛍光的検出。
【図１４】Ｂｏｗｅｓ細胞の生育性に与える種々のＭＴＸ−ｐＶＥＣ結合体の影響。１０％ＦＢＳ−ＭＥＭ中で２４時間曝露。
【図１５】Ｂｏｗｅｓ細胞の生育性に与えるＡｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｅｖｏ１６５の影響（アッセイにはＣｅｌｌ−ＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）を使用）。
【図１６】Ｂｏｗｅｓ細胞の生育性に与えるＭＴＸ、Ａｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−ＹＴＡ２およびＹＴＡ２の影響（アッセイにはＣｅｌｌ−ＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）を使用）。
【図１７】Ｋ５６２細胞生育性に与えるＭＴＸ、Ａｐａ−γＧｌｕ−Ｇｌｙ−ＹＴＡ２およびＹＴＡ２の影響。７．５％ＦＢＳ−ＲＰＭＩに２日間曝露。
【図１８】ジスルフィド結合でＴｐ１０−ＰＮＡに結合したｓｉＲＮＡ。構成物および細胞内の理論的作用メカニズムの略図。
【図１９】Ｂｏｗｅｓ細胞への１μＭペプチド−ＤＮＡ構成物の取り込み、３７℃、３０分間、２４ウェルプレート。
【図２０】十分に研究されたＣＰＰによる細胞侵入の例。生きているＣａｃｏ−２細胞内への１μＭフルオ−ペプチドのペプチドインターナリゼーション。
【図２１】３７℃およびＴ／Ｅにおけるフルオ−ストレプトアビジンのＹＴＡ−２による蛋白質インターナリゼーション。ｓｅｌＣＰＰの送達特性を示す。
【図２２】４℃およびＴ／Ｅによるフルオ−ストレプトアビジンのＹＴＡ−２による蛋白質インターナリゼーション。ｓｅｌＣＰＰの送達特性および温度依存性を示す。
【配列表】
Claims (8)
- ａ）標的細胞中に特異的に過剰発現されるプロテアーゼのためのプロテアーゼ・コンセンサス部位、ｂ）細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体、およびｃ）カーゴを含む、カーゴのための細胞選択的送達剤であって、前記細胞侵入ペプチドの細胞侵入能を抑制し、前記プロテアーゼによって切断される不活性化配列をさらに含む細胞選択的送達剤。
- 細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体がプロテアーゼ・コンセンサス部位を含む請求項１記載の細胞選択的送達剤。
- カーゴが細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性物質である請求項１または２記載の細胞選択的送達剤。
- 細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体が、ＹＴＡＩＡＷＶＫＡＦＩＲＫＬＲＫ（配列番号３）、ＬＲＳＷＶＩＳＲＳＩＲＫＡＡ（配列番号５）、ＬＲＳＷＩＲＲＬＩＫＡＷＫＳ（配列番号６）、ＬＲＳＷＲＶＩＩＲＮＧＱＲ（配列番号７）およびＩＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２０）からなる群から選択される請求項１記載の細胞選択的送達剤。
- プロテアーゼ・コンセンサス部位を含む細胞侵入ペプチドおよび／またはその非ペプチド類似体が、ＳＧＥＳＬＡＹ−ＹＴＡＩＡＷＶＫＡＦＩＲＫＬＲＫ（配列番号４）、ＧＰＬＧ−ＬＲＳＷＶＩＳＲＳＩＲＫＡＡ（配列番号８）、ＧＰＬＧ−ＬＲＳＷＩＲＲＬＩＫＡＷＫＳ（配列番号９）、ＧＰＬＧ−ＬＲＳＷＲＶＩＩＲＮＧＱＲ（配列番号１０）、およびＤＥＥＱＥＲＳＥＮ−ＩＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１３）からなる群から選択される請求項２記載の細胞選択的送達剤。
- 前記過剰発現されるプロテアーゼが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−ＭＴ１からなる群から選択されるＺｎ２＋金属エンドペプチダーゼである請求項１から５のいずれかに記載の細胞選択的送達剤。
- 前記過剰発現するプロテアーゼが細菌表面プロテアーゼおよびウィルス酵素からなる群から選択される請求項１から５のいずれかに記載の細胞選択的送達剤。
- 医薬の製造における使用のための請求項１から７のいずれかに記載の細胞選択的送達剤。
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