KR20090009189A - 신경계를 표적으로 하는 약제학적 제제의 특성 향상 방법및 특성 향상용 조성물 - Google Patents

신경계를 표적으로 하는 약제학적 제제의 특성 향상 방법및 특성 향상용 조성물 Download PDF

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글제고르지 부라쥐
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유니버시티 오브 유타 리써치 파운데이션
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Abstract

본 발명은 신경계를 표적으로 하는 약제학적 제제의 특성 향상 방법 및 특성 향상용 조성물에 관한 것이다.

Description

신경계를 표적으로 하는 약제학적 제제의 특성 향상 방법 및 특성 향상용 조성물{Methods and Compositions Related to Improving Properties of Pharmacological Agents Targeting Nervous System}
본 출원과 관련된 상호참조 문헌
본 출원은 2006년 1월 5일에 출원된 미합중국 우선권 특허 제60/757,047호, 2006년 9월 11일에 출원된 미합중국 우선권 특허 제60/844,024호, 2006년 1월 5일에 출원된 미합중국 우선권 특허 제60/757,047호 및 2006년 9월 11일에 출원된 미합중국 우선권 특허 제60/844,024호를 우선권으로 청구하며, 이는 전체가 참조문헌으로서 본원에 삽입된다.
배경기술
혈액 뇌장벽(blood-brain barrier, BBB)은 체순환으로부터 포유동물의 뇌를 분리시키며, 중추신경계(CNS)의 항상성에 있어서 중요한 역할을 한다. 혈액-뇌장벽을 통해 펩타이드가 전달된다는 이해가 꾸준히 진행되었음에도 불구하고, 이 펩타이드가 CNS로 효율적으로 직접 전달되는 것은 잠재적 치료제로서 뉴로펩타이드를 개발하는데 주요한 도전으로 간주되었다.
예를 들어, 간질은 복합 신경성 질환이다. 난치성 간질은 환자 집단의 30%에 침범한 것으로 추측된다. 다양한 항간질 약물(AEDs)의 유용성에도 불구하고, 발작과 간질 증후군의 특정 타입은 오직 소수의 AEDs에 대해서만 성공률이 제한되게 반응한다. 따라서, 향상된 효능과 안전성을 갖는 신규한 항경련제 치료제를 발견하고 개발할 필요성이 계속되고 있다. 더불어, 간질 발작 이전에 유발되는 신경생리학적 변화에 대한 최근의 발견은 신규한 항발작 화합물의 발견에 대한 기회를 열어주었으며, 이러한 항발작제로는 뉴로펩타이드 및 뉴로트로핀을 포함할 수 있다. 간질 발작의 기작에 관계있는 뉴로펩타이드와 이의 수용체는 갈라닌, 뉴로펩타이드 Y, 소마토스타틴 및 아편유사제 펩타이드를 포함한다. 이들 뉴로펩타이드의 일부는 중추신경계(CNS)로 직접 전달될 때 항경련 활성을 가지지만, 이의 미약한 생물적합성 및 대사적 안정성의 한계는 뉴로펩타이드계 항간질 약물의 개발을 불가능하게 한다. 반면, 향상된 펩타이드 공학은 향상된 안정성과 생물적합성을 가진 펩타이드 유사체의 많은 성공적 예를 만들어 내었다. 그러나, 이용가능한 펩타이드 공학 기술의 어느 것도 항경련 활성을 가진 뉴로펩타이드에 적용하지는 못했다. 당업계에 필요한 것은 혈액 뇌장벽을 통한 투과성을 향상시키기 위한 방법과 조성물이다.
발명의 요약
본 발명의 목적에 따라, 본원에 포함되고 광범위하게 기재된 바와 같이, 본 발명의 일 양태는 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 3의 아미노산 서열과 최소 약 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 하나 이상의 아미노산이 보존적으로 치환된 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드에 관한 것이다.
또한 제공되는 것은 서열번호 2, 4-29, 37-39, 50, 64, 65, 66, 67, 80, 82 및 89로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 2, 4-29, 37-39, 50, 64, 65, 66, 67, 80, 82 및 89로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 최소 약 90%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 한개 이상의 아미노산이 보존적으로 치환된 서열번호 2, 4-29, 37-39, 50, 64, 65, 66, 67, 80, 82 및 89로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드이다.
또한 제공되는 것은 서열번호 31-36으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 31-36으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 최소 약 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 한개 이상의 아미노산이 보존적으로 치환된 서열번호 31-36으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드이다.
또한 제공되는 것은 서열번호 40의 아미노산 서열, 서열번호 40의 아미노산 서열과 최소 약 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 한개 이상의 아미노산이 보존적으로 치환된 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드이다.
또한 제공되는 것은 서열번호 105, 106, 107, 108, 109-112 및 113-118로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 105, 106, 107, 108, 109-112 및 113-118로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 최소 약 90%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 한개 이상의 아미노산이 보존적으로 치환된 서열번호 105, 106, 107, 108, 109-112 및 113-118로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드이다.
또한 제공되는 것은 서열번호 58 및 135-141로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 58 및 135-141로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 최소 약 90%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 한개 이상의 아미노산이 보존적으로 치환된 서열번호 58 및 135-141로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드이다.
추가로 제공되는 것은 비-변형된 펩타이드와 비교하여 증가된 지방 친화성을 갖고, 증가된 염기성을 갖는 펩타이드를 포함하는, 혈액뇌장벽의 투과성이 증진된 조성물이다.
제공되는 것은 비-변형된 형태의 펩타이드와 비교해 지방 친화성을 증가시키고, 펩타이드의 염기성을 증가시키는 것을 포함하는, 펩타이드의 혈액-뇌장벽 투과성 증가 방법이다.
또한 제공되는 것은 본원에 개시된 폴리펩타이드를 치료가 필요한 환자에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 간질 치료 방법이다. 추가로 제공되는 것은 본원에 개시된 조성물을 치료가 필요한 환자에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 간질 치료 방법이다.
제공되는 것은 본원에 개시된 폴리펩타이드를 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량 투여하는 단계를 포함하는 신경성 질환 치료, 예방 또는 완화 방법이다.
또한 제공되는 것은 환자의 치료에 사용되어야 하는 조성물을 동정하는 단계; 상기 조성물의 지방 친화성 및 염기성을 증가시킴으로써 상기 조성물을 변형시키는 단계; 및 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 변형된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 혈액-뇌장벽 투과 조성물을 이용한 치료 방법이다.
추가로 제공되는 것은 환자의 치료에 사용되어야 하는 조성물을 동정하는 단계; 상기 조성물의 지방 친화성, 글리코실화 및 염기성을 증가시킴으로써 상기 조성물을 변형시키는 단계; 및 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 변형된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 혈액-뇌장벽 투과 조성물을 이용한 치료 방법이다.
또한 제공되는 것은 환자의 치료에 사용되어야 하는 조성물을 동정하는 단계; 상기 조성물의 지방 친화성 및 염기성을 증가시킴으로써 상기 조성물을 변형시키는 단계; 상기 변형된 조성물을 벡터에 삽입하는 단계; 및 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 혈액-뇌장벽 투과 조성물을 이용한 치료 방법이다.
추가로 제공되는 것은 환자의 치료에 사용되어야 하는 조성물을 동정하는 단계; 상기 조성물의 지방 친화성 및 염기성을 증가시킴으로써 상기 조성물을 변형시키는 단계; 상기 변형된 조성물을 벡터에 삽입하는 단계; 및 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 벡터를 투입하는 단계를 포함하는, 혈액-뇌장벽 투과 조성물을 이용한 치료 방법이다.
상세한 설명
본 발명은 본 발명의 바람직한 구현예의 상세한 설명, 본원에 포함되는 실시예, 도면 및 이의 전후의 명세서를 참조로 하여 훨씬 용이하게 이해될 수 있다.
본 발명의 화합물, 조성물, 물품, 장치 및/또는 방법이 기술되고 제공되기 전에, 본 발명은 다르게 특정되지 않는 한 특정 합성 방법, 특정 재조합 생명공학 기술, 또는 다르게 특정되지 않는 한 특정 시약에만 제한되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 구현예만을 설명하기 위한 목적이며 이를 제한하려고 사용된 것은 아니다.
A. 정의
명세서 및 첨부되는 청구항에 사용된 단수 형태 '하나(a, an, the)'는 명백히 다르게 표시되지 않는 이상 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "약제학적 담체"는 둘 이상의 담체의 혼합물을 포함한다.
본원에서 범위는 "약(about)" 한가지 특정 값에서부터, 및/또는 "약" 다른 특정 값까지 표현될 수 있다. 이런 범위가 표현되었을때, 다른 구현예는 한가지 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값 까지를 포함한다. 유사하게는, 값이 예측의 형태로 사용되는 경우, 즉 선행사로 "약"을 사용하는 경우, 이는 다른 구현예를 형성하는 특정 값으로 이해되어야 한다. 추가로 각 범위의 종료점이 다른 종료점 모두 및 다른 종료점과는 독립적으로 유효한 것으로 이해되야 한다. 또한, 본원에 기술된 값의 수가 있으면, 각 값이 그 값 자체에 추가되는 특정 값인 "약"이라는 형태로 본원에 기술된다. 예를 들어, 값 "10"이 기술되는 경우, "약 10"도 기술된다. 또한, 값이 "이하 또는 동일한" 값, "이상 또는 동일한 값"으로 기술되고, 값 사이의 가능한 범위도 기술되는 것으로 이해되며, 이는 당업자에게 있어서 당연한 것이다. 예를 들어, 값 "10"은 "10 또는 그 이하" 뿐만 아니라 "10 또는 그 이상"으로도 기술된다.
이하 명세서 및 청구항에 있는 언급은 다음의 의미를 갖는 것으로 정의되어야 하는 용어에 대한 것이다:
"선택적" 또는 "선택적으로"는 그 후에 기재된 사건 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않아도 되는 것을 의미하며, 명세서는 상기 사건 또는 상황이 일어난 예 및 그렇지 않은 예를 포함한다.
B. 조성물 및 방법
1. 혈액- 뇌장벽
혈액-뇌장벽(BBB)은 혈관에 있는 나쁜 물질로부터 뇌를 보호하지만, 적절한 기능을 위해 요구되는 영양물질을 뇌에 공급하는 모세관 내피세포의 특정화된 시스템이다. 세포 사이에/통과하는 물질이 상대적으로 자유롭게 교환되게 하는 말초 모세관과는 달리, BBB는 물리적(강한 결합) 및 대사적(효소) 장벽 모두를 통해 혈관으로의 전달에만 극히 제한된다. 따라서, BBB는 치료학적 약물이 뇌로 투과되는 것을 결정하는데 있어서 속도-제한 인자가 된다.
최근 장애물들이 중추신경계(CNS) 약물로서 사용하기 위한 많은 화합물의 용도를 제한하고 있다. 첫째, 뇌는 장벽 시스템으로 이루어져 있다. 뇌 장벽 시스템은 2개의 주요한 성분을 갖는다: 맥락막층(choroid plexus) 및 혈액-뇌장벽(BBB). 맥락막층은 혈액으로부터 뇌척수액(CSF)을 분리하고, BBB는 혈액으로부터 뇌 ISF를 분리한다.
또한 BBB는 맥락막에 비해 약 100배 더 큰 표면적을 가지며, CNS에 치료학적 화합물을 전달하는 일차 장애물이다. BBB는 CNS와 말초 순환 사이에서 선별적 분리막으로서 작용하고, 펩타이드를 포함하는 물질의 교환을 조절한다. BBB의 일차 구조는 뇌의 모세관 내피세포 막이다. 뇌의 모세관 내피세포의 강력한 연결은 순환하는 화합물이 세포주위 경로를 통해 뇌 ISF에 도달하는 것을 억제한다. 또한, 최근의 연구에서는 강력한 연결에 의해 제공되는 장벽에 추가로, 기저판 수준에서의 생리학적 장벽의 존재를 제시하였다(Kroll et al., Neurosurgery, Vol.42, No.5, p.1083(May 1998)). BBB의 다른 독특한 특징은 세포간 천공과 피노사이틱(pinocytic) 소낭이 부족하며, 내피세포의 관 표면이 순수한 음전하를 띈다는 것이다.
물질이 BBB를 통과하는 기작은 능동 및 수동 전달 기작으로 나뉠 수 있다. 지방 친화성 분자는 내피세포 혈장막을 통해 수동 전달 또는 확산에 의해 BBB를 손쉽게 통과한다. 펩타이드와 같은 소수성 분자는 일반적으로 BBB르통과하기 위해서는 능동 전달 시스템을 필요로 한다. 인슐린과 같은 거대 펩타이드는 능동 전달세포(transcytosis) 시스템으로서 작용하는 뇌 모세관의 판 표면상에 수용체를 갖고 있다.
혈액-뇌장벽을 통과하는 전달 펩타이드에는 2가지 주요한 기작이 있다:(1) 분자 크기 및 지방 친화성에 의해 일차적으로 결정되는, 막을 통한 단순 확산, 및 (2) 혈액 뇌장벽에 있는 내피세포의 표면상에 위치한 특정 수용체 및 담체, 또는 비-특이적 흡수 전달세포에 의해 유발되는 능동 확산 (Tamai and Tsuj, 2000; Pan and Kastin, 2004a; Smith et al., 20040.
2. 투과성 향상
혈액 뇌장벽을 통한 펩타이드와 단백질의 투과성을 향상시키기 위해 많은 방법이 테스트되었다. 이는 여러가지 카테고리로 나뉠 수 있다: (1) 벡터에 연결 또는 CNS로의 펩타이드의 수득을 향상시키는 영양분-능동 전달, (2) 증가된 지방 친화성으로 인해 단순 확산을 향상시키는 지질화/할로겐화; (3) 흡수 전달세포를 통해 전달을 향상시키는 양이온화(증가된 염기성); 및 (4) 능동/수동 전달을 향상시키는 글리코실화 또는 전구약물 및 펩타이드의 약동학 프로파일((Witt et al., 2001) 및 (Pan and Kastin, 2004a0).
이러한 연구와 주요한 발견의 예는 표 1에 표시되어 있다. 혈액-뇌장벽의 투과에 관련된 내용에 관한 각각의 참조문헌은 전체로써 포함되어 있다.
혈액-뇌장벽을 통한 펩타이드 투과성 향상 예
방법 펩타이드 주요한 발견 참조문헌
방향족 잔기의 할로겐화 엔케팔린 Chloro-Phe 포함 펩타이드는 정맥내 주사후에 훨씬 큰 진통 효과를 보여줌 (Weber et al., 1991; Abbruscato et al., 1996)
지방아미노산과 결합 α-코노톡신 MII 혈액-뇌장벽 투과성이 4배 증가 (Blanchfield et al., 2003)
폴리아민 유도체와 결합 β-아밀로이드 -유래 펩타이드 혈액-뇌장벽 투과성이 7배 증가 (Poduslo et al., 1999)
DOPA/DTPA 유도체와 결합 옥트레오타이드/ 소마토스타틴 표피 성장인자 뇌가 MRI용 방사성 의약품 및 뇌 뇌종양의 치료를 훨씬 효과적으로 받아들임 (Luyken et al., 1994; Kurihara and Pardridge, 1999)
글리코실화 엔케팔린 글리코실 모이어티의 첨가는 전신의 생적합성을 20배 증가시킴 (Elmagbari et al., 2004)
선별적 아미노산 곁사슬 교환 뉴로텐신 Neo-Trp에 의한 Trp의 치환 및 Tert-Leu에 의한 Ile의 치환은 유사체가 혈액-뇌장벽을 통과하도록 함 (Hertel et al., 2001)
선별적 아미노산 곁사슬 교환 타이로트로핀 -방출 호르몬 (TRH) 피리미딘 모이어티에 의해 치환되 His은 TRH의 주요 활성을 2-, 3-배 증가시킴 (Prokai et al., 2004)
전구약물 방법 TRH-유사 펩타이드 Glu 잔기의 에스테르화는 흥분제 활성을 향상시킴 (Prokai-Tatrai et al., 2003)
전구약물 방법 엔케팔린 Phe으로 연장된 C-말단은 반감기 및 투과성이 증가함 (Greene et al., 1996)
전구약물 방법 엔케팔린 아다만틴 모이어티로 결합시키면 피하투여에서 향상된 활성을 보임 (Kitagawa et al., 1997)
벡터-유도된 전달 엔케팔린 달라그린 SynB3 펩타이드계 벡터는 뇌 흡수 및 진통 활성이 증가됨 (Roussele et al., 2003)
첫번째 아이템인 결합(conjugation)과 관련해, 결합된 펩타이드의 증가된 분자 크기는 투과성을 방해하지 않는 것으로 보인다. 아편 유사체(opiod) 펩타이드인 달라진(dalargin, MW=726)에 펩타이드계 벡터 SynB1(MW=2,099)을 첨가하면 약 배로 크기가 커지지만, 뇌 수득률은 18배 증가한다(Roussele et al., 2003).
유사하게는, 엔케팔린 유사체에 디사카라이드 모이어티를 첨가한 뒤 정맥내 투여하면, 통각 억제 활성이 21배까지 증가한다(Elmagbari et al., 2004).
지방 친화성 및 염기성이라고 불리는 2가지 중요한 인자는 특정 전달자 또는 담체의 도움 없이도 혈액-뇌장벽을 통을 통한 펩타이드의 투과성을 증진시키는데 도움을 준다. 펩타이드의 지방 친화성은 소수성 모이어티(즉, 폴리지방족 사슬)로의 결합, 또는 방향족 잔기의 할로겐화(즉, Phe과 비교하여 클로로-Phe)에 의해 변화될 수 있다. 폴리아민-변형된 단백질과 펩타이드가 비-변형된 것에 비교해 혈액-뇌장벽을 훨씬 효과적으로 통과함이 밝혀졌다(Poduslo and Curran, 1996a; b; Poduslo et al., 1999). 또한, 작은 펩타이드의 증가된 염기성이 흡수성-유도된 세포내이입(AME)을 통해 혈액-뇌장벽을 전달하는 중요한 결정인자임이 밝혀졌다(Tamai et al., 1997).
펩타이드의 직접 모방에 추가로, CNS로의 약물 수득이 향상된 다른 약물 전달 방법이 있다. 이는 혈액-뇌장벽을 통한 리포좀-, 마이셀- 또는 나노입자-유도된 펩타이드 전달을 포함한다(Kreuter et al., 2003; Pan and Kastin, 2004b). 이러한 신규한 약물 전달 기술은 본원에 기술되고 당업계에 알려진 뉴로펩타이드계 조성물에 적용될 수 있다.
혈액-뇌장벽을 통해 뉴로펩타이드의 투과성을 향상시키기 위한 몇가지 펩타이드-공학 방법이 있다. 이는 도 6에 요약되어 있다. 그러나, 상기에 언급된 연구의 어느 것도 혈액-뇌장벽을 통해 펩타이드의 투과성을 추가로 촉진하기 위해 이러한 방법들을 혼합하는 시스템적 시도를 보여주지는 않았다. 본원에 개시된 것은 펩타이드-공학 방법을 소마토스타틴 또는 갈라닌과 같은 공지된 항경련 뉴로펩타이드와 결합시킴으로서, 정맥내(iv) 또는 피하(sc) 경로의 투여를 통해 항경련성 펩타이드를 만드는 것이다.
본원에 기술된 것은 혈액-뇌장벽을 통한 투과성을 증가시키기 위한 조성물과 방법이다. "증가시키는" 것은 조성물이 야생형, 비-변형 또는 원래 펩타이드 또는 대조군 조성물과 비교하여 혈액-뇌장벽을 통과할 수 있는 비율이 높아지는 것을 의미한다. 예를 들어 증가율은 대조군, 원래, 또는 야생형 펩타이드 또는 조성물과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 200, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500 또는 4000 퍼센트가 될 수 있다.
특히 본원에 기술되는 것은 혈액-뇌장벽의 투과성이 증가한 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 비-변형된 형태의 펩타이드와 비교하여 증가된 지방 친화성 및 증가된 염기성을 가지는 펩타이드를 포함한다(도 7). 또한 기술되는 것은 혈액-뇌장벽의 투과성이 증가된 조성물이며, 여기서 상기 조성물은 비-변형된 형태의 펩타이드와 비교하여 증가된 지방 친화성, 증가된 염기성 및 증가된 글리코실화를 갖는 펩타이드를 포함한다.
또한 본원에 기술되는 것은 비-변형된 펩타이드와 비교해 펩타이드의 지방 친화성을 증가시키고 염기성을 증가시키는 단계를 포함하는, 혈액-뇌장벽에 대한 펩타이드의 투과성을 증가시키는 방법이다. 혈액-뇌장벽에 대한 펩타이드의 투과성을 증가시키는 다른 방법은 비-변형된 펩타이드와 비교해 펩타이드의 지방 친화성, 염기성 및 글리코실화를 증가시키는 단계를 포함한다.
a) 지방 친화성
조성물의 지방 친화성은 예를 들어 펩타이드를 소수성 모이어티에 결합시킴으로써 증가될 수 있다. 소수성 모이어티의 예는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 폴리지방족 사슬 또는 방향족 잔기를 포함한다. 지방 친화성은 방향족 잔기 또는 퍼플루오로헥사노익산과 같은 폴리지방족 시약의 할로겐화를 증가시킴으로써 증가될 수 있다.
b) 염기성
조성물의 염기성은 라이신, 아르기닌, 호모-라이신, 호모-아르기닌, L- 또는 D-이성질체 형태의 오르니틴; 2,3-디아미노프로피오닉산; 2,4-디아미노부티르산을 포함하는 양전하 아미노산 잔기의 호모- 및 헤테로올리고머를 도입함으로써 증가될 수 있다.
또한, 염기성은 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아미도아민 덴드리머 또는 폴리아민 톡신 및 이의 유도체와 같은 폴리아민계 모이어티에 결합시킴으로써 증가될 수 있다.
c) 글리코실화
글리코실화는 자일로스, 글루코스, 갈락토스, 말토스, 말토트리오스, 만노스, 락토스, 멜리바이오스 또는 유사한 사카라이드에 결합시킴으로써 도입될 수 있다.
d) 벡터
또한 기술되는 것은 본원에 기술된 조성물을 포함하는 벡터이다. BBB를 통과할 수 있는 벡터의 예는 토요부쿠(Toyobuku) 등의 문헌(J Pharmacol Exp Ther. 2003 Apr; 305(1):40-7)에서 확인할 수 있다.
C. 치료 방법
본원에 개시된 것은 중추신경계와 관련된 특정 질병 및 질환의 치료방법 또는 혈액-뇌장벽을 통과하는 화합물이 필요한 것과 관련된 모든 적용이다. 중풍 및 이와 관련된 허혈성 질환, 만성 등 통증, 척수 손상, 말초 신경 손상, 외사엉 뇌 손상, 망막 변성, 신경변성, 백내장, 항생제-유발 내이독성, 알츠하이머병, 근육위축 가쪽 경화증(ALS, LouGhrig's disease), 발작(전신성, 부분성 또는 불응성 발작과 같음), 헌팅톤 병, 파킨스씨 병, 다발성 경화증, 만성 등 통증, 섬유근육통, 대상포진후신경통, 당뇨병성 신경병증, 외상성 단발신경병증, 복합 국부 통증 증후군, 아쥬번트 진통, 신경근절제술/신경 절제, 선행 진통/절단, 간질유발/외상, 화학적 노출, 경련 중첩증, 화학치료-유도된 신경병증, 암, 아편 유사제 금단 및 만성 신경병증 통증을 포함하는 다양한 질병 및 질환은 본원에 개시된 방법 및 조성물을 이용해 치료될 수 있다. 투여방법 및 경로, 용량, 및 약제학적 조성물은 하기에 좀더 상세하게 설명되어 있다.
척수 손상 및 다발성 경화증을 치료하기 위해 본원에 기술된 조성물의 이용에 관해, 이들 질병들을 치료하는데 관련된 내용들에 관한 다음의 참조문헌들은 전체로써 본원에 삽입된다:Hawes JJ, Narasimhaiah R, Picciotto MR, Galanin and galanin-like peptide modulate neurite outgrowth via protein kinase C-mediated activation of extracellular signal-related kinase. Eur J Neurosci. 2006 Jun;23(11)2937-46. Suarez V, et al., The axotomy-induced neuropeptides galanin and pituitary adenylate cyclase-activating peptide promoteaxonal sprounting of primary afferent and cranial motor neurons. Eur J Neurosci. 2006 Sep;24(6):1555-64.
또한, 본원에 기술된 조성물과 방법은 무산소 손상을 억제하고, 인간의 성장 호르몬 분비를 증가시키며, 뇌하수체샘종으로부터 프로락틴 분비를 조절하며, 항우울제로서 몰폰(morphon) 진통을 연장시키며 , 그 질환에 투여하는데 유용할 수 있다.
또한 기술되는 것은 치료를 필요로 하는 환자에게 본원에 개시된 폴리펩타이드를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 통증 및 다른 신경성 질환 치료 방법이다.
또한 본원에 기술되는 방법과 조성물은 상기에 기재되고 당업계에 알려진 바와 같은 신경성 질환을 예방, 완화 또는 치료하는데 유용할 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 다른 조성물 또는 치료 방법과 결합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 다음의 약물과 약물 종은 간질, 신경억제 및 우울증, 양극(bipolar), 다른 정신과 질환 뿐만 아니라 본원에 기술된 조성물에 의해 치료될 수 있는 모든 질병 또는 질환을 치료하기 위해 본원에 기술된 조성물과 혼합 사용될 수 있다: 아편유사체 및 아편유사체 펩타이드, 몰핀, 하이드록시몰핀, 펜타닐, 옥시코돈, 코데인; 캡사이신; 뿐만 아니라 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 카바마제핀(carbamazepine), 프리미돈(primidone), 가바펜틴(gabapentin), 프레가발린(pregabalin), 디아제팜(diazepam), 펠바메이트(felbamate), 플루오로펠바메이트, 라모트리진(lamotrigine), 라코사마이드(lacosamide), 레베티라세탐(levetiracetam), 페노바비탈(phenobabital), 페니토인(phenytoin), 포스-페니토인, 토피라메이트(topiramate), 발프로에이트(valproate), 비가바트린(bigabatrin), 조니사마이드(zonisamide), 옥스카바제핀(oxcarbazepine), 비스테로이드성항-염증 약물(NSAIDs), 국소 마취제(이도카인과 같은), 글루타메이트 수용체 대항제, NMDA 대항제, 알파-아드레노셉터 작용제 및 대항제, 아데노신, 카나비노이드(canabinoid), NK-1 대항제(CI-1021), 항우울제(예, 아미트립틸린(amitriptyline), 데시프라민(desipramine), 이미프라민(imipramine)), 갈라닌 유사물질 및 유도체, 소마토스타틴, 델타-수면 유도 펩타이드, 엔케팔린(enkephalin), 옥시토신 콜레시스티키닌(cholecystikinin), 칼시토닌(calcitonin), 코르티스타틴(cortistatin), 노시셉틴(nociceptin) 및 기타 뉴로펩타이드계 치료제, 퓨로닉 P85 차단 코폴리머.
다음의 약물과 약물 종은 알츠하이머병을 치료하기 위해 본원에 기술딘 조성물과 혼합하여 사용될수 있다: 플루리잔(Flurizan)과 같은 아밀로이드 저하제; 갈란타민(galantamine)(Razadyne); 리바스티그민(rivastigmine)(Exelon); 도네페질(donepezil)(Aricept); 타크린(tacrine)(Cognex); 메만틴(memantine)(Namenda); 및 알츠하이머병용 백신. 또한 기술되는 것은 환자의 치료에 사용되어야 하는 조성물을 동정하는 단계; 상기 조성물의 지방친화성과 염기성을 증가시킴으로써 조성물을 변형시키는 단계; 및 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 변형된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 혈액-뇌장벽 투과 조성물을 이용한 환자의 치료 방법이다.
용어 "혼합(combination)"은 환자에게 투여될 수 있는 하나 이상의 추가적 조성물이 본원에 기술된 조성물에 추가되는 것을 의미한다.
또한 기술되는 것은 환자의 치료에 사용되어야 하는 조성물을 동정하는 단계; 상기 조성물의 지방 친화성, 글리코실화 및 염기성을 증가시킴으로써 상기 조성물을 변형시키는 단계; 및 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 변형된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 혈액-뇌장벽 투과 조성물을 이용한 환자의 치료 방법이다.
또한 기술되는 것은 환자의 치료에 사용되어야 하는 조성물을 동정하는 단계; 상기 조성물의 지방 친화성 및 염기성을 증가시킴으로써 상기 조성물을 변형시키는 단계; 상기 변형된 조성물을 벡터에 삽입하는 단계; 및 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 혈액-뇌장벽 투과 조성물을 이용한 환자의 치료 방법이다.
또한 기술되는 것은 환자의 치료에 사용되어야 하는 조성물을 동정하는 단계; 상기 조성물의 지방 친화성 및 염기성을 증가시킴으로써 상기 조성물을 변형시키는 단계; 상기 변형된 조성물을 벡터에 삽입하는 단계; 및 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 벡터를 투입하는 단계를 포함하는, 혈액-뇌장벽 투과 조성물을 이용한 환자의 치료 방법이다.
1. 연구 도구로서 조성물을 이용하는 방법
기술된 조성물은 연구 도구로서 다양한 방법으로 사용될 수 있다. 예를 들어 서열번호 1-55와 같은 언급된 조성물은 간질을 연구하기 위한 시약으로서 사용될 수 있다.
상기 조성물은 예를 들어 갈라닌 작용제 또는 대항제 또는 부분 작용제와 같이, 요구되는 작용적 특징을 갖는 분자를 분리하기 위한 혼합 화학 프로토콜 또는 다른 스크리닝 프로토콜에서 표적으로서 사용될 수 있다.
조성물은 신경계에 있는 다른 뉴로펩타이드, 다른 신경전달물질, 수용체 및 이온 채널 사이에서의 개별 및 네트워크 상호작용을 검증하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 기술된 조성물은 갈라닌 수용체 대항제와 동일한 신경에서 발현되는 분자 표적에서 기능을 하는 약물 사이의 상승적 관계를 검증하는데 이용될 수 있다. 이러한 양성 약물-약물 상호관계는 이점이 있는데, 그 이유는 2개의 약물이 혼합 적용될 때 치료의 효과 및/또는 안정성을 향상시킬 수 있기 때문이다.
기술된 조성물은 마이크로 어레이(micro array)에 있는 시약 또는 마이크 어레이를 확인하고 분석하기 위한 시약으로서 사용될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 단일 뉴클레오타이드 다형성을 분리하거나 확인하기 위한 모든 공지된 방법에 사용될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 칩/마이크로 어레이와 관련된 모든 공지된 스크리닝 분석 방법에 사용될 수 있다. 또한, 조성물은 본원에 기술된 조성물과 관련된 분자 모델링 분석을 수행하거나 관련성을 연구하기 위해, 기술된 조성물의 컴퓨터 판독가능한 양태를 사용하는 모든 공지된 방법에 사용될 수 있다.
2. 유전자 변형 및 유전자 파괴 방법
본원에 기술된 조성물과 방법은 다양한 일이 일어날 수 있는 모든 동물에서 표적 유전자 파괴 및 변형을 하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 갈라닌을 생산하는 유잔자는 혈액-뇌장벽의 증가된 투과성을 갖는 갈라닌 유사체를 발현하도록 변형될 수 있다. 유전자 변형 및 유전자 파괴는 포유동물의 생식세포 라인을 통한 변형을 증식시키는 방법으로, 포유동물과 같은 동물에 있는 유전자의 선별적 제거 또는 변형, 또는 염색체의 연장을 아우르는 방법, 기술 및 조성물을 일컫는다. 일반적으로, 세포는 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 세포내에 포함되어 있는 특정 염색체의 부위로 상동성 재조합하도록 디자인된 벡터로 형질전환된다. 상동성 재조합은 둘러싸는 DNA를 이용해, 예를 들어 프레임내에 도입되는 외래 DNA를 갖는 염색체를 생산할 수 있다. 이러한 형태의 프로토콜은 세포 내에 포함된 게놈으로 도입되는, 점 돌연변이와 같은 매우 특정한 돌연변이도 가능하게 한다. 이러한 형태의 상동성 재조합을 수행하는 방법이 본원에 개시되어 있다.
포유동물 세포에서의 상동성 재조합 수행의 바람직한 특징 중의 하나는 세포가 배양될 수 있어야 하는 것인데, 그 이유는 바람직한 재조합이 낮은 빈도에서 일어나기 때문이다.
일단, 세포가 본원에 기술된 방법을 통해 생산되면, 동물은 줄기세포 기술 또는 클로닝 기술 중 어느 것을 통해서도 세포로부터 생산될 수 있다. 예를 들어, 핵산이 형질전환된 세포가 줄기세포라면, 이 세포는 형질전환되고 배양되고 난 뒤에, 생식선 세포에 유전자 변형 또는 파괴를 포함하는 생물체를 생산하는데 사용될 수 있으며, 이는 세포의 모든 부위에 유전자 변형 또는 파괴를 포함하는 다른 동물을 생산하는데도 사용될 수 있다. 이러한 세포의 모든 부위에서 유전자 변형 또는 파괴를 포함하는 동물을 생산하기 위한 다른 방법에는, 클로닝 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술은 일반적으로 혈질전환된 세포의 핵을 선택하며, 심지어는 동물을 생산하기 위해 조작될 수 있는 난모세포를 이용해 형질전환된 핵을 융합 또는 교환 융합을 함으로써 수행된다. ES 기술 대신에 클로닝을 사용하는 방법의 이점은, ES 세포 이외의 세포가 형질전환될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 매우 손쉽게 배양할 수 있는 섬유아세포는 형질전환되어야 하고 유전자 변형 또는 파괴 현상이 일어나는 세포로서 사용될 수 있고, 이 세포로부터 유래된 세포들은 모든 동물을 클로닝하는데 사용될 수 있다.
D. 조성물
개시되는 것은 본원에 개시된 조성물을 제조하기 위해 사용되는 성분 뿐만 아니라 본원에 기술된 방법에서 사용되는 조성물 자체이다. 이 물질 및 다른 물질들이 본원에 기술되며, 이들 물질들의 조합, 집합, 연결, 그룹 등이 기술되는 경우, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별 및 집합적 조합 및 순열에 관련된 특정 참고문헌이 명백하게 기술되지 않을 수도 있으며, 각각은 특별하게 고안되며 본원에 기술되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 특정 갈라닌 유사체가 기술되고 언급되며 변이체를 포함하는 수많은 분자를 제조할 수 있는 수많은 변형이 언급되는 경우, 특별히 고안되는 것은 갈라닌 유사체의 각각 및 모든 조합과 순열, 그리고 특별히 다르게 표시되지 않는 한 가능한 변형이다. 따라서, 분자 A, B 및 C 클래스 뿐만 아니라 분자 D, E 및 F와 이 분자의 조합의 예로서 A-D가 언급되는 경우, 이들 각각이 개별적으로 언급되지 않는 한 각각은 개별적 및 집합적으로 고려되는 조합을 의미하며, A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E 및 C-F가 언급된다. 이처럼 이들의 모든 집합 또는 조합이 언급될 수 있다. 따라서, 예를 들어 A-E, B-F 및 C-E 서브-그룹이 언급되는 것으로 간주되어야 한다. 이러한 개념은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 본원에 개시된 조성물을 제조하고 이용하는 방법에 있는 단계를 포함하는 이러한 적용의 모든 양태에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가적 단계가 있다면, 이러한 추가적 단계 각각은 본원에 기술된 방법의 모든 양태 또는 양태의 조합으로 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
1. 혈액- 뇌장벽의 투과성과 관련된 조성물
연속적 간질 발작은 해마에 일차적으로 위치한 과다흥분성 신경의 과다 방전으로부터 유발된다. 뇌는 γ-아미노부티르산(GABA)을 포함하는 균형 억제 기작 및 글루타메이트에 의해 유발되는 흥분 기작에 의해 발작을 조절한다(Wasterlain et al., 2002). 신경전달은 뉴로펩타이드 Y, 갈라닌, 노시셉틴/오르파닌 FQ 및 엔도몰핀-1을 포함하는 수많은 내인성 뉴로펩타이드에 의해 조절된다. 도 1은 자가-유지된 경련중첩증(status epilepticus)의 해마의 뇌순환에서 글루타메이트, GABA 및 뉴로펩타이드 사이의 가능한 관계를 예시한다.
이들 뉴로펩타이드의 역할은 약리학 및 유전학적(넉아웃 또는 과발현) 시도 모두를 이용해 설명되었다. 예를 들어 오베르토(Oberto)와 그의 동업자(Oberto et al., 2001)는 GABA성 시스템, 편도에 있는 뉴로펩타이드 Y와 뉴로펩타이드 Y(1) 사이의 상호작용을 밝히기 위해 형질전환 생쥐를 사용하였다(이는 Eva et al., 2004에도 언급되어 있음). 유사하게는, 레레쉐와 그의 동업자(Leresche et al., 2000)도 소마토스타틴이 시냅스전 기작을 통해 GABA-관련 신경전달을 억제함을 보여주었다. 해마에서의 갈라닌에 의한 글루타민 분비 조절은 2개의 형질전환 생쥐 모델에서 밝혀졌다: 갈라닌 넉아웃(GalKO) 및 갈라닌 과발현(GaOE) 생쥐(Mazarati et al., 2000). GalKO 및 GalOE 생쥐에서, 탈분극-유도된 글루타메이트 분비는 중심적으로 투여된 갈라닌에 의해 증가 및 감소되었는데, 이는 해마의 갈라닌이 글루타메이트성 시스템을 통해 항발작제로서 역할을 할 수 있음을 보여준다(Mazarati, 2004).
최소한 3개의 뉴로펩타이드와 이의 수용체가 간질유발의 역할을 함이 밝혀졌다: 갈라닌, 소마토스타틴 및 뉴로펩타이드 Y. 해마에서의 갈라닌 면역반응성은 변연 경련중첩증 이후에 감소된다. 해마 치아 허파문동맥으로 갈라닌을 주입하면 변연 경련중첩증의 시작을 억제시키며 경련중첩증을 중단시킨다. 이는 갈라닌이 경련중첩증을 억제하는 내인성 항경련제로서 작용할 수 있는 것으로 보인다(Mazarati et al., 1998). 이의 증거는 갈라닌이 과발현된 형질전환 생쥐의 표현형을 관찰함으로써 확인되었다(Kokaia et al., 2001). 이 연구에서, 갈라닌은 간질발생 점화현상(kindling)을 억제하였다.
신경전달물질 분비를 조절하고 발작을 조절하는데 있어서의 뉴로펩타이드의 역할은 새로운 치료적 처치를 위한 기회로 인식되었다. 하기에 기술된 바와 같이, 수많은 공개된 연구에서는 동물 모델에서의 뉴로펩타이드의 잠재적 항발작성 활성을 보여주었다.
a) 뉴로펩타이드 Y 및 다이노르핀
뉴로펩타이드 Y는 시험관 내에서 쥐 해마에 있는 간질모양 활성을 억제시켰다(Klapstein and Colmers, 1997). 다른 연구에서(Baraban et al., 1997), 뉴로펩타이드 Y가 결핍된 생쥐는 카이닉산에 반응하여 조절되지 않는 발작을 나타낸다. 넉아웃 생쥐의 93%는 사망으로 진행되었으나, 야생형 동물에서는 이런 사망이 드물었다. 뇌심실 내 뉴로펩타이드 Y는 카이닉산 투여에 의해 유발된 사망을 억제시켰다. 최종적으로, 뉴로펩타이드 Y의 항발작 기능은 Y5 수용체를 통해 매개되는 것으로 설명된다(Sperk and Herzog, 1997).
다이노르핀을 포함하는 해마 아편 유사체 펩타이드는 간질형성과 간질 발작과 관련이 있었다(Hong, 1992 및 Solbrig and Koob, 2004에 의해 설명됨). 전기경련 쇼크 또는 편도 점화현상에 의해 유도된 발작은 엔케팔린 및 다이노르핀 모두의 초기 분비를 유발하지만, 다이노르핀을 장시간 감소시키기도 한다(Gall, 1988). 다이노르핀의 항발작 활성은 자가-유지된 경련중첩증 생쥐 모델에서 보여지며(Mazarati and Wasterlain, 2002), 도 5에 예시되어 있다.
다이노르핀과 함께, 뉴로펩타이드 Y의 i.h 주입은 자가-유지 경련중첩증 모델에서 발작의 분포를 감소시켰다(Mazarati and Wasterlain, 2002). 가쪽뇌실(lateral ventricle)로의 NPY의 주입은 카이네이트-유도된 발작의 효과적인 억제제인 것으로 간주된다(Woldbye et al., 1997). 항간질 효과가 뉴로펩타이드 Y5 수용체에 의해 유발되는 것으로 제시되었으며, 이러한 결과는 Y5R-결핍 생쥐를 이용한 연구에서 확인되었다(Marsh et al., 1999).
b) 갈라닌 및 이의 유사체
마자라티와 그의 동업자(Mazarati et al., 1992)의 연구에서 갈라닌은 효과있는 항경련제로서 인식되었다. 뇌의 가쪽뇌실로 직접 주입된 경우, 갈라닌은 생쥐에 있는 피크로톡신-유도된 점화된 경련의 위험성을 감소시켰다. 경련중첩증동물 모델에서, 갈라닌을 천공(perforant) 경로 자극(PPS) 전 또는 후에 말초허파문동맥(perihilar)에 주입하면, 발작의 주기를 감소시키다(Mazarati et al. 1998). 이러한 효과는 갈라닌 대항제의 동시-적용에 의해 역전된다. 도 2에서 보는 바와 같이, 50 내지 500 피코몰과 같이 낮은 투여량도 정립된 자가-조절 경련중첩증(SSSE)을 중단시키는데 효과적이다.
간질을 치료하기 위한 한가지 방법은 뉴로펩타이드계 치료제를 사용하는 것이다. 이 개념에 대한 증명으로서, 2개의 비-펩타이드 갈라닌 수용체 작용제인 갈논 및 갈믹은 항경련 활성 및 항간질 활성을 가지는 것으로 최근 밝혀졌다(각각 Saar et al., 2002 및 Bartfai et al., 2004). 이 두가지 화합물은 GalR1 또는 GalR2 수용체에 대해 중간수준의 마이크로몰 농도 친화성을 가지며, 전신에 투여되는 경우 간질 동물 모델에서 항경련 활성을 보이는 것으로 확인되었다. 도 3에서 보는 바와 같이, 갈논(2mg/kg, i.p.) 또는 갈라닌(0.5 nmole, i.c.v)은 생쥐에서의 펜틸렌테트라졸(pentylenetetrazole, PTZ)-유도된 테스트에서 잠복기 및 발작 지수 모두에 대해 유사한 효과를 나타내었다(Saar et al., 2002; Ceide et al., 2004).
다음은 갈라닌 수용체에 대한 NAX 5055(GAL-BBB2)의 친화도를 보여주는 표이다:
리간드 GalR1 GalR2
Gal(1-16) 8.5 nM 8.3 nM
NAX 5055 ~ 9 nM ~ 6 nM
갈믹 34,000 nM >100,000 nM
갈논 12,000 nM 24,000 nM
복강내(i.p.)로 투여될때, 갈라닌은 생쥐에서의 펜틸렌테트라졸-유도된 발작의 심각성과 증가된 잠복기를 감소시키는 것으로 확인되었다. 갈논의 해마내 주입은 자가-유지된 경련중첩증의 주기를 짧게하는 것으로 밝혀졌다. 유사하게는, 갈믹은 i.h. 또는 i.p.로 주입되었을때 경련중첩증을 차단하였다. 따라서, 이들 두가지 갈라닌 작용제는 항경련제로서 유용하며, 간질에 대한 치료학적 표적으로서 갈라닌 수용체를 입증해준다.
갈라닌은 30개의 아미노산으로 이루어진 뉴로펩타이드이지만, SAR 연구에서는 N-말단 부분이 전장 펩타이드와 비교해 여전히 높은 잠재성의 작용제임이 확인되었다(Langel and Bartfai, 1998). 갈라닌(1-16) 유사체는 본원에 기술된 방법으로 사용될 수 있는데, 여기서 Gly1 잔기는 하기에 보이는 바와 같이 N-메틸-Gly(사코신, SAR)으로 치환되어 있다.:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro His Ala Val
Gly1의 N-메틸화는 N-말단으로부터 가속화된 단백질 분해로부터 펩타이드를 보호하지만, 이는 갈라닌 수용체에 대한 친화성에는 유의적으로 변화를 주지 않는다(Rivera Baeza et al., 1994). SAR 연구에서는 다음의 잔기에 대한 생물학적 활성을 검증하였다:Gly1, Trp2, Asn5, Tyr9 및 Gly12(Land et al., 1991). 유사한 연구에서는 N-말단 연장이 생물학적 활성의 소실을 유발함을 확인하였다. 반면에, 갈라닌(1-16)의 C-말단 부분은 더 큰 구조에 부착할 때 매우 튼튼해지는 것으로 보인다(Pooga et al., 1998). 따라서, [Sar1] 갈라닌 유사체를 디자인하기 위한 방법은 아미노산 치환과 관련된 소마토스타틴에만 사용된 것과 유사하지만, N-말단 보다는 C-말단에 연장을 도입하는 것과는 다르다.
갈라닌 유사체인 GAL-BBB2(서열번호 3)는 복강내로 투여될 때 효과적인 항경련 활성(ED50~3 mg/kg)을 나타내었다(실시예 2). 가장 효과적이고 장시간 동안 항경련 활성을 나타내는 가장 작은 갈라닌 유사체는 GAL-BBB2로부터 얻을 수 있다. 이들 서열의 예는 서열번호 4-29에서 확인된다(실시예 2에 기재됨). 이들 펩타이드는 예를 들어 갈라닌과 비교해 증가된 안정성을 가질 수 있다. 또한 언급되는 것은 갈라닌 유사체인 GAL-BBB3, GAL-BBB4, GAL-BBB5, GAL-BBB6, GAL-BB7 및 GAL-BBB8이다(서열번호 49-54). 이들 각각은 항경련 활성을 가질 수 있다.
제한된 구조-작용 관계 연구는, 전신으로 투여될 때 항경련 활성을 유지하는 GAL-BBB2 유사체의 가장 작은 단편을 확인하기 위해 수행되었다. C-말단 및 중심부위 절단을 포함하는 갈라닌 유사체가 합성되고 테스트되었다. 추가로, C-말단 모티프의 제한된 구조-작용 관계 연구는 혈액-뇌장벽을 통한 유사체의 투과성을 최적화하기 위해 수행되었다. 도 14는 구조-작용 연구에서의 GAL-BBB2의 구조를 나타낸다.
하기에 기술된 것은 다양한 갈라닌 유사체 및 이를 디자인하고 합성하기 위한 방법이다(참고, 실시예 1 및 2).
c) 소마토스타틴
뇌 소마토스타틴이 발작 및 간질발생의 억제제로서 중요한 역할을 함을 보여주는 많은 증거가 있다(Vezzani and Hoyer, 1999). 소마토스타틴은 해마의 GABA성 내부뉴런에서 발현되는 주요한 뉴로펩타이드이다. 더불어, 쥐 해마 뉴런으로부터의 소마토스타틴 분비는 글루타메이트에 의해 자극되었다(Fontana et al., 1996). 소마토스타틴과 이의 수용체의 발현은 간질 발작 이후에 유의적으로 변하였고, 이 뉴로펩타이드는 간질발생 동안 신경성 흥분을 조절할 필요가 있다(Schwarer et al., 1996 및 Vezzani and Hoyer, 1999에 정리됨). 수용체-서브타입-넉아웃 및 약리학 연구에서는 해마의 글루타메이트-유도된 신경전달에서의 최소한 4개의 소마토스타틴 수용체 서브타입(sst1, sst2, sst3 및 sst4)의 관계를 제안하였다(Pikwo et al., 1996). 사바와 그의 동업자의 최근 연구(Csaba et al., 2004)에서는 소마토스타틴 sst2A 수용체가 간질발생 및 항경련 활성에 있어서 중요한 역할을 할 수 있는 추가 증거를 제안하였다.
소마토스타틴의 항경련 활성의 가장 직접적 증거는 동물 간질 모델에서의 발작과 간질발생에 대한 약리학적 효과 연구로부터 얻을수 있다(Vezzani et al., 1991; Perez et al., 1995; Mazarati and Wasterlain, 2002).(Mazarati and Wasterlain, 2002). 소마토스타틴 또는 이의 서브타입-선별성 유사체의 주입은 발작 횟수를 감소시키고, 카이닉산 또는 퀴놀로닉산에 의해 유도되는 발작에 대한 잠복기를 늘려주었다(Vezzani et al., 1991). 유사하게는, 소마토스타틴 sst2-선별성 작용제인 RC-160의 주입은 펜틸렌테트라졸-유도된 긴장간대발작(tonic-clonic seizure)을 갖는 동물의 수를 감소시켰다(Perez et al., 1995). 도 4에 예시된 바와 같이, 소마토스타틴의 해마내(i.h.) 주입은 자가-유지 경련중첩증 쥐 모델에서 발작의 빈도를 상당히 감소시켰다(Mazarati and Wasterlain, 2002).
소마토스타틴은 단일 디설파이드 브릿지를 갖는 14-아미노산 시상하부 펩타이드이며, 1973년에 맨먼저 발견되었다(Brazeau et al., 1973). 소마토스타틴의 서열은 아래와 같다:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys
광범위한 SAR 연구에서는 5개의 중심 잔기를 검증하였다: Phe6, Phe7, Trp8, Lys9 및 Phe11, 그러나 Gly2, Lys4, Asn5, Thr10, Thr12 또는 Ser13의 알라닌 치환은 생물학적 활성에 유의적으로 영향을 주지 않았다(Vale et al., 1975). 또한, D-Trp8-포함 유사체는 단백질분해에 대한 더 큰 저항성 및/또는 활성 형태의 더 좋은 안정성으로 인해 훨씬 더 효과가 있는 것으로 확인되었다.
[D-Trp8] 또는 [L-Trp8] 소마토스타틴은 본원에 기술된 방법을 이용하여 대사적으로 안정한 유사체로서 사용될 수 있다. 염기성을 증가시키기 위해, Thr, Ser 또는 Asn 잔기는 등전자적으로 유사한 것과 전체적으로 치환될 수 있으나, 양전하의 DAB(디아미노부티르산) 또는 DAP(디아미노프로피오닉산)로는 그렇지 않다. 지방친화성을 증가시키기 위해, Lys-팔미토일 모이어티는 Lys4 또는 Asn5 위치에 도입될 수 있으며, 또는 Phe 잔기는 할로겐화된 등가물인 클로로-Phe 잔기로 치환될 수 있다. 표 5에 요약된 바와 같이, 9개의 유사체가 합성되고 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성이 분석되었다. 높은 결합 친화성에 부정적 영향을 주지않는 모방이 서로간에 결합된다. 이러한 2번째 세대 유사체는 2-4개의 결합된 모방을 포함한다. 이러한 서열들은 서열번호 31-36에서 확인할 수 있다.
다음으로 N-말단 연장물이 [D-Trp8] 또는 [L-Trp8] 소마토스타틴에 도입되었다. 이러한 연장물(BBB/PK 조절제, 도 8에 표시)은 두가지 목적을 제공한다: (1) 수동 및 능동 기작 모두에 의해 혈액-뇌장벽을 통한 투과성을 증진시키는 것, 및 (2) 제거율을 줄이고 단백질분해에 대한 저항을 향상시키는 거대 분자를 첨가함으로써 뉴로펩타이드 약물의 약리학 특성을 향상시키는 것. 이러한 "BBB/PK 조절제"는 새로운 개념이며, 몇가지 구조적 모듈을 여러가지 조합하는 것은 연장물을 구성하는데 사용된다. 표 6에서는 제안된 모듈의 구조와 기능에 대한 정보를 제공한다.
본원에 기술된 조성물과 방법으로 사용하기 위해 기술된 것은 옥트레오타이드(octreotide)이다. 예를 들어, 서열번호 40은 옥트레오타이드 분자를 표시한다. 도 21에서는 옥트레오사이드의 화학 구조 및 이를 제조하기 위한 모식도를 보여준다. 옥트레오타이드는 소마토스타틴 수용체의 sst2 서브타입(5개의 공지된 서브타입이 있음)에 대해 훨씬 더 선택적인 소마토스타틴 유사체이다. 소마토스타틴은 간질 및 간질발생과 관련이 있는 것으로 확인되었다. 다음의 참고문헌은 옥트레오타이드, 소마토스타틴 및 간질과 관련된 이론이며 전체로서 본원에 삽입된다: Vezzani A and Hoyer D, Eur J Neurosci, 1999, vol 11, p3767-3776. 유사하게는 노시셉틴에서의 소마토스타틴의 역할은 다음의 문헌에서 보여지며, 이는 소마토스타틴, 옥트레오타이드 및 노시셉틴과 관련된 이론에 대한 것으로서 전체가 본원에 삽입된다: Chapman V and Dicjkenson AH, Neuropeptides 1992, vol 23, 147-152. 알츠하이머 병의 발생에 있어서의 소마토스타틴의 역할이 최근에 기술되었으며, 이는 옥트레오타이드, 소마토스타틴 및 알츠하이머 병과 관련된 이론에 대한 것으로서 전체가 본원에 삽입된다: Saito T et al., Nature Medicine, 2005, vol 11, p. 434-439. 하기에 기술된 것은 소마토스타틴 유사체를 디자인하고 합성하기 위한 방법이다(실시예 1 참고).
d) 델타 수면 유도 펩타이드
델타 수면 유도 펩타이드(DSIP)는 항경련성 뉴로펩타이드이다(Schoenenberger 1984; Kovalzon and Strekalova 2006). DSIP는 μ 아편유사제 작용제인 더몰핀(dermorphin)과 구조적 동일성을 일부 공유한다. DSIP는 메타피트(metaphit)-유도된 간질 모델에서 발작을 억제하는데 효과적이었다. 또한, DSP는 유사한 간질 모델에서 발프로에이트(valproate)의 항경련 활성을 증가시키는 것으로 확인되었다(Hrncic, Stanojlovic et al., 2006). 더불어, 이 펩타이드는 아편 유사제 수용체와 엔케팔린 사이의 상호작용을 조절하며, DSIP의 진통 효과를 나타냄을 보여주었다(Nakamura, Nakashima et al., 1986). DSIP의 신경보호 활성은 독성 뇌 부종 모델에서 확인되었다. DSIP 및 일부 유사체는 BBB를 통과하는 것으로 보고되었다(Kastin, Nissen et al., 1981; Kastin, Banks et al., 1982).
2. 혈액- 뇌장벽의 투과성이 증진된 조성물
본원에 개시된 조성물은 혈액-뇌장벽 투과성이 증가된 것으로 밝혀졌다. 본원에 기술된 바와 같이, 언급된 것은 그와 상응하는 수용체에 대해 높은 친화성을 갖고 결합하는 능력을 테스트하기 위해 디자인되고 합성되는 뉴로펩타이드 유사체 세트이다. 이 세트는 뉴로펩타이드 당 약 10개의 유사체를 포함한다. 높은 친화성의 유사체는 혈액-뇌장벽을 투과하는 능력에 대해 추가로 테스트된다. 합성하고 난 뒤 첫번째 세대 유사체로부터 결과를 도출하고, 그 다음으로 2번째를 평가하며, 세번째 세대 유사체를 평가한다. 기능적 분석에서의 작용제 활성을 확인하기 위해 가장 유망한 유사체가 선별된다(혈액-뇌장벽을 통한 투과성이 향상된 높은 친화도의 리간드). 그리고 난 뒤, 이들 유사체 중의 일부(혈액-뇌장벽을 통한 투과성이 향상된 효과있는 작용제)는 생체내에서 약리학적으로 테스트된다.
약물이 되기 위해서는, 뉴로펩타이드 유사체는 다음의 몇가지 중요한 특징을 가져야 한다: (1) 높은 효능 및 선별성, (2) 대사적 안정성, (3) 체순환으로부터 상대적으로 긴 반감기 및 감소된 제거율, 및 (4) 혈액-뇌장벽을 통한 증가된 투과성. 가장 우수한 뉴로펩타이드는 높은 효능 및 선별성을 나타낸다. 대사적 안정성은 종종 펩타이드 골격 변형 및/또는 단백질분해 효소에 의해 인식되지 않는 잔기를 이용한 민감성 잔기의 치환에 의해 유도된다. 반감기의 증가 및 제거율의 감소는 폴리머계 모이어티를 펩타이드에 연결시킴으로써 효과적으로 수행될 수 있다(예, PEGylation). 혈액-뇌장벽을 통한 더 큰 투과성은 지방친화성 또는 양이온화의 증가 뿐만 아니라 전구 약물, 영양성분 전달 변형체 또는 글리코실화의 추가에 의해 도입될 수 있다. 이상적인 약물 뉴로펩타이드의 구조는 도 8에 개략적으로 표시되어 있다.
도 8에 예시된 바와 같이, 뉴로펩타이드 공학의 새로운 개념은 "BBB/PK 조절제"이다. BBB/PK 조절제는 지방친화성, 양이온성 및 전달 변형 모듈을 가진 폴리머계 거대 모이어티를 포함하며; 이 조절제는 혈액-뇌장벽을 통한 투과성을 향상시키는 것과 약동학적 특성을 향상시키는 두가지 목적을 제공한다. 양이온성 및 지방친화성 모듈은 각각 음전하의 막 표면과의 상호작용을 촉진하며, 막을 통한 확산을 향상시킨다. 능동 전달 변형 구조의 기능은 뇌 내피세포의 표면에 위치해 있는 특정 영양성분 전달자와의 상호관계를 향상시킴으로써, 뇌로의 뉴로펩타이드 특이적 섭취율을 증가시키는 것이다. 또한, 이러한 모듈 모두를 포함하는 구조적 틀은 펩타이드의 약동학적 특징을 향상시키고, 통상적으로 사용되는 PEG 모이어티의 역할을 변형/치환할 수 있다. 이러한 거대한 모이어티들은 모델 뉴로펩타이드의 N- 또는 C-말단 연장물로서 테스트되며, 뉴로펩타이드 구조 내에 있는 훨씬 더 다용도의 부착 위치도 본원에 기술되어 있다.
다음의 방법은 혈액-뇌장벽 투과성이 향상된 뉴로펩타이드 유사체를 디자인하기 위해 사용되었다: 이용가능하다면 대사적으로-안정한 유사체로 시작. 곁사슬을 치환하기 위한, 수정가능한 유사체에 있는 추가의 AA 위치를 확인하는 방법. 거대한 모이어티를 도입하기 위한, N- 및 C-말단에 있는 위치를 확인하는 방법. 곁-사슬 치환에 의해 유사체의 지방친화성 및 염기성을 증가시키는 방법. 지방친화성 및 염기성을 추가로 증가시키며 약동학적 특성을 향상시킬(BBB/PK 조절제) 펩타이드 유사체에 연장물을 도입하는 방법. 혈액-뇌장벽 투과의 특이성을 향상시키기 위해 연장물에 영양성분 변형 구조를 포함시키는 방법. 연장된 모이어티(BBB/PK 조절제)를 이용해 유사체를 곁사슬 변형물로 결합하는 방법.
이러한 유사체를 성공적으로 디자인하기 위한 핵심은 상기에 언급된 변형을 정확하게 결합하는 것이다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 변형의 개별적 세트를 디자인하고 평가하는 전체적인 시도 및 이의 최적의 조합이 사용될 수 있다. 일반적인 방법은 도 10에 모식화되어 있다. 본원에 기술된 바와 같은 아미노산의 변형은 자동 펩타이드 합성기를 이용해 고체상 펩타이드 합성 동안 도입될 수 있다. 모든 비-자연적 아미노산 또는 연결된 구조는 상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 유도체이다.
변이체가 언급되는 경우, 이 변이체는 표시된 특정 치환에 의존하는 특정의 치환을 나타내지만, 구체적으로 표시된 위치가 아닌 위치에서의 다른 치환, 결실, 및/또는 삽입, 예를 들어 보존적 치환, 삽입, 및/또는 결실은 기술된 활성을 유지하는 변이체로 제공되는 것으로 간주된다.
본원에 언급되는 것은 혈액-뇌장벽의 증가된 투과성과 같은, 바람직한 특징을 갖는 갈라닌 유도체이다. 또한, 언급되는 것은 혈액-뇌장벽의 증가된 투과성을 갖는 소마토스타틴 유도체이다. 상기에서 설명한 바와 같이, "증가시키" 또는 "증가된"은 조성물이 야생형, 비-변형 또는 원래 펩타이드 또는 대조군 조성물과 비교하여 혈액-뇌장벽을 통과할 수 있는 비율이 높아지는 것을 의미한다. 예를 들어 증가율은 대조군, 원래, 또는 야생형 펩타이드 또는 조성물과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1250, 1500, 1750, 200, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500 또는 4000 퍼센트가 될 수 있다.
또한, 실시예에 있는 표에서 언급된 각각의 개별적 유사체는 조성물의 언급된 활성으로부터 결정될 수 있는 기본적 투과성을 갖는 것으로 이해된다. 이러한 증가된 활성률은 다르게 표시되지 않는 한, 분석법의 분석 범위에 있는 데이터를 제공하는 모든 시점에서 얻어진 야생형, 자연의, 또는 대조군 펩타이드의 기본 투과성으로부터 계산될 수 있는 것으로 이해된다.
언급되는 것은 실시예 1 및 2에서 언급된 바와 같이, 공지된 치환, 결실, 변형, 추가 및 연장 또는 야생형, 펩타이드이다. 예를 들어, 표 7에는 소마토스타틴의 N-말단 연장이 언급되어 있다. 본원에 기술된 연장은 원래의, 야생형 또는 공지된 펩타이드로 사용될 수 있으며, 또는 공지된 펩타이드의 유사체와 혼합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 곁사슬 변형은 공지된 펩타이드를 만들 수 있으며, 본원에 기술된 바와 같은 연장과 혼합된다.
또한 언급되는 것은 아미노산 치환 및 추가이며, 여기서 치환 또는 추가는 비-자연적으로 발행하는 상황이다. 실시예는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 사코신, 디아미노부티르산(DAB), 디아미노프로피오닉산(DAP), Lys-팔미토일, 클로로-Phe, 아미노헥사노익산(AHX), 퍼플루오로헥사노익산(PerFHX), 8-아미노-3,6-디옥사옥타노익산, 및 올리고-Lys, tert-류신을 포함한다.
추가로 언급되는 것은 비-펩타이드 스페이서(spacer)와 같은 "골격 추가"를 이용한 아미노산 잔기의 치환이다. 실시예는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 아미노밸러릭산 또는 아미노헥사노익산을 포함한다. 이는 중심 잔기 사이의 간격을 유의적으로 변형시키지 않으면서 전체적인 분자 크기를 최소화할 수 있다. 스페이서는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 또는 50개의 잔기를 치환할 수 있다.
또한, 본원에 언급되는 것은 형태가 변형된 다양한 아미노산이다. 예를 들어 본원에 언급되는 것은 D-Lys, D-Trp 및 L-Trp이다.
언급되는 것은 원래 서열(갈라닌 또는 소마토스타틴과 같은 것)에 대해 최소 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 동일성을 갖는(예를 들어), 갈라닌 및 소마토스타틴과 같은 공지된 화합물의 유사체이며, 여기서 상기 유사체는 최소한 한개, 최소한 두개, 최소한 세개, 최소한 4, 최소한 5, 또는 최소한 6개의 본원에 기술된 치환, 결실, 추가, 또는 연장을 포함한다.
3. 서열 유사성
본원에 기술된 바와 같이, 용어 상동성 및 동일성의 사용은 유사성과 같은 유사한 것을 의미한다. 따라서, 단어 상동성이 2개의 비-자연의 서열 사이에 사용되는 경우, 이는 이들 2개의 서열 사이의 진화 관계를 나타낼 필요는 없지만, 이들의 핵산 서열 사이의 유사성 또는 연관성의 관점으로 보아야 하는 것으로 이해된다. 2개의 진화적으로 연관된 분자 사이의 상동성을 결정하기 위한 많은 방법은, 진화적으로 연관되거나 그렇지 않은 것과 상관없이 서열 유사성을 측정하기 위한 목적으로 2 이상의 핵산 또는 단백질 모두에 통상적으로 적용된다.
일반적으로, 본원에 기술된 유전자 및 단백질로부터 발생할 수 있는 모든 공지된 변이체 및 유도체를 확인하기 위한 한가지 방법은, 특정한 공지된 서열에 대한 상동성에 의해 변이체와 유도체를 확인하는 것으로 이해된다. 본원에 기술된 특정 서열의 확인은 본원 어느 곳에도 언급되어 있다. 일반적으로 본원에 기술된 유전자 및 단백질 변이체들은 일반적으로 정해진 서열 또는 원래 서열에 대해 최소, 약 40, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99퍼센트 상동성을 갖는다. 당업자라면 2개의 단백질 또는 유전자와 같은 핵산의 상동성을 결정하는 방법을 손쉽게 이해할 수 있다. 예를 들어, 상동성은 2개의 서열을 정렬하고 난 뒤에 계산될 수 있는데, 그로 인해 상동성은 가장 높은 레벨에 있게 된다.
상동성을 계산하는 다른 방법은 공개된 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 비교하기 위한 목적의 최적의 서열 정렬은 스미스와 워터맨의 로컬 상동성 알고리즘(Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2:482(1981)), 니들맨과 운크의 서열 정렬 알고리즘(Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48:443(1970)), 피어슨과 립맨의 유사성 조사 방법(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444(1998)), 이들 알고리즘의 자동 실행(GAP, BESTFIT, FASTA, TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) 또는 정밀조사에 의해 수행될 수 있다.
유사한 형태의 상동성은 예를 들어 다음의 문헌에 개시된 알고리즘에 의해 핵산에 대해 얻어질 수 있다: Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al., Method Enzymol. 183:281-306, 1989 이 문헌들은 핵산 정렬과 관련된 최소한의 물질에 대한 참조문헌으로서 본원에 삽입된다. 일반적으로 모든 방법이 사용될 수 있고, 어떠한 상황에서는 이러한 다양한 방법에 의한 결과가 달라질 수 있는 것으로 이해되지만, 당업자라면 상동성이 이러한 방법들 중 최소한 한가지에 의해 확인이 된다면, 서열은 그 상태의 상동성을 갖는 것으로 이해하며, 이는 본원에 언급되어 있다.
예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, 다른 서열에 대해 특정 퍼센트의 상동성을 갖는 것으로 기재된 서열은 본원에 기술된 하나 이상의 계산 방법에 의해 계산된 것과 같은 상동성을 갖는 서열을 의미한다. 예를 들어, 다른 모든 계산 방법에 의해 계산되었을때 첫번째 서열이 두번째 서열에 대해 80 퍼센트의 상동성을 갖지 않는다고 하더라도, 쥬커(Zuker) 계산 방법을 이용해 첫번째 서열이 두번째 서열에 대해 80 퍼센트 상동성을 갖는 것으로 계산되면, 본원에 설명된 바와 같이 첫번째 서열은 두번째 서열에 대해 80 퍼센트 상동성을 가진다. 다른 실시예에서 보는 바와 같이 스미스와 워터맨(Smith and Waterman)의 계산 방법, 니들맨과 운크(Needleman and Wonsch)의 계산 방법, 재거(Jaeger)의 계산 방법, 또는 다른 모든 계산 방법에 의해 계산되었을때 첫번째 서열이 두번째 서열에 대해 80 퍼센트의 상동성을 갖지 않는다고 하더라도, 쥬커(Zuker) 계산 방법과 피어슨과 립맨(Pearson and Lipman)의 계산 방법을 모두 이용해 첫번째 서열이 두번째 서열에 대해 80 퍼센트 상동성을 갖는 것으로 계산되면, 본원에 설명된 바와 같이 첫번째 서열은 두번째 서열에 대해 80 퍼센트 상동성을 가진다. 또한 다른 실시예에서 보는 바와 같이, 계산 방법 각각을 사용해 첫번째 서열이 두번째 서열에 대해 80 퍼센트의 상동성을 갖지 않는다고 하더라도, 첫번째 서열은 두번째 서열에 대해 80 퍼센트 상동성을 가진다(비록, 다른 계산 방법이라도 다르게 계산된 상동성 퍼센트의 결과를 나타낼 것이다).
4. 핵산
본원에는 다양한 갈라닌 및 소마토스타틴 유사체와 같은 펩타이드로 기술된 다양한 분자가 있다. 이들 펩타이드계 분자는 예를 들어 서열번호 1-55를 인코딩하는 핵산을 포함하는 다양한 핵산에 의해 인코딩될 수 있으며, 예를 들어 벡터가 세포에서 발현이 되는 경우, 발현된 mRNA는 A, C, G 및 U로 구성되는 것으로 이해된다.
a) 서열
예를 들어 갈라닌과 관련된 다양한 서열이 있으며, 이는 예를 들어 www.pubmed.gov. 에 접속하는 유전자은행 데이터베이스에서 확인될 수 있다. 이들 서열과 다른 것들은 전체로서 뿐만 아니라 본원에 포함된 각 서열에 대한 참조문헌으로서 본원에 삽입된다.
실시예로서, 서열번호 3으로 기재된 한가지 특정 서열은 본원에 기술된 조성물과 방법에 대한 예로서 본원에 삽입된다. 이 서열과 관련된 설명은 특별히 다르게 표시되지 않는 한 갈라닌 유사체와 관계있는 모든 서열에 적용가능한 것으로 이해된다. 당업자라면, 서열 불일치 및 차이를 해결하는 방법 및 특정 서열과 관련된 조성물 및 방법을 다른 관련 서열(즉 갈라닌 유사체 서열)에 맞추는 방법을 잘 알것이다. 프라이머 및/또는 프로브는 모든 갈라닌-관련된 핵산 서열을 디자인할 수 있으며, 예를 들면 본원에 기술되고 당업계에 알려진 정보를 이용하여 가능하다.
5. 조성물의 세포(벡터)로의 전달
시험관내 또는 생체내에서 핵산 또는 펩타이드를 세포로 전달하는 데 사용될 수 있는 수많은 조성물과 방법이 있다. 본원에 기술된 벡터는 다양한 방법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 벡터는 본원에 기술된 펩타이드를 인코딩하는 핵산을 세포 및 환자에게 전달하는데 사용될 수 있다. 벡터는 상기에서 언급한 바와 같이, 혈액-뇌장벽의 통과를 촉진시키기 위해 펩타이드와 함께 사용될 수 있다.
벡터와 관련된 방법과 조성물은 다음의 2가지 군으로 크게 나뉠 수 있다: 바이러스계 전달 시스템 및 비-바이러스계 전달 시스템. 예를 들어, 핵산 및 펩타이드는 다음과 같은 직접 전달 시스템을 통해 전달될 수 있다: 전기충격, 리포펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 플라스미드, 바이러스 벡터, 바이러스 핵산, 파지 핵산, 파지, 코스미드, 또는 세포내에 있는 유전물질 또는 양이온성 리포좀과 같은 전달체의 전달. 바이러스 벡터, 화학적 형질감염, 또는 전기충격 및 DNA의 직접 확산과 같은 물리-기계적 방법을 포함하는 형질 감염을 위한 적절한 수단이 예를 들어 다음의 문헌에 기재되어 있다: Wolff, J. A., et al., Science, 247, 1465-1468, (1990); and Wolff, J. A. Nature, 352, 815-818, (1991). 이러한 방법들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원에 기재된 조성물과 방법을 이용하여 사용하기가 매우 적절하다. 어떤 경우, 이 방법은 큰 DNA 분자와 특별한 기능을 하기 위해 변형될 것이다. 더불어, 이러한 방법들은 담체의 표적화 특성을 이용함으로써 특정 질병 및 세포 군락을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 혈액-뇌장벽을 통한 조성물의 전달능력을 추가로 향상시키기 위한 목적으로, TAT 단백질 형질도입 도메인이 사용될 수 있다(Dietz GP and Bahr M, Mol Cell Neurosci, 2004, vol 27, p. 85-131).
본원에 사용된 바와 같이, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 갈라닌 및 소마토스타틴 유사체와 관련이 있는 언급된 핵산 또는 펩타이드를 분해없이 세포로 전달하는 제제이다. 일 구현예에서, 전달 시스템은 바이러스 또는 레트로바이러스로부터 유래된다. 예를 들어 바이러스 벡터는 HIV 골격을 갖는 바이러스를 포함하는, 아데노바이러스, 아데노바이러스 -의존 바이러스, 허피스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폴리오 바이러스, AIDS 바이러스, 신경영양(neuronal trophic) 바이러스, 신비(Sindbis) 바이러스 및 다른 RNA 바이러스이다. 또한 바람직한 것은 벡터로서 사용하기에 적합하게 하는 바이러스 특성을 갖는 모든 바이러스 패밀리이다. 생쥐 말로니(Maloney) 백혈병 바이러스인 MMLV를 포함하는 레트로바이러스 및 레트로바이러스는 벡터로서 MLV의 바람직한 특성을 발현한다. 레트로바이러스 벡터는 다른 바이러스 벡터보다 더 큰 유전자 페이로드(payload)인 형질전환 유전자 또는 마커 유전자를 전달할 수 있으며, 이러한 이유로 벡터로서 통상적으로 사용된다. 그러나, 이는 비-증식 세포로는 유용하지 않다. 아데노바이러스 벡터는 높은 역가로도 상대적으로 안정하고 작업하기가 용이하며, 에어로졸 제형으로 전달될 수 있고, 비-분열 세포를 형질감염시킬 수도 있다. 폭스 바이러스 벡터는 크며, 유전자를 삽입하기 위한 위치를 여러개 갖고 있으며, 열안정성이며, 실온에서도 보관될 수 있다. 바람직한 구현예는 숙주 생물체의 면역 반응을 억제시키기 위해 조작된 바이러스 벡터이며, 이는 바이러스 항체에 의해 유발된다. 이러한 바람직한 형태의 벡터는 인터루킨 8 또는 10에 대한 코딩 부위를 가질 것이다.
바이러스 벡터는 유전자를 세포내로 도입하기 위한 상호작용 능력이 화학적 또는 물리적 방법보다 더 높다. 일반적으로, 바이러스 벡터는 비구조적 초기 유전자, 구조적 후기 유전자, RNA 폴리머라아제 III 전사체, 복제 및 캡슐화에 필요한 역전 말단 반복체(repeat), 및 바이러스 게놈의 전사 및 복제를 조절하기 위한 프로모터를 포함한다. 벡터로서 조작될 때, 바이러스는 일반적으로 제거된 초기 유전자를 하나 이상 가지며, 유전자 또는 유전자/프로모터 카세트는 제거된 바이러스 DNA 대신에 바이러스 게놈으로 삽입된다. 이런 형태의 컨스트럭트는 약 8 kb의 외래 유전 물질을 가질 수 있다. 제거된 초기 유전자의 필수 기능은 형질전환체에 있는 초기 유전자의 유전자 산물을 발현하기 위해 조작된 세포주에 의해 제공된다.
(1) 레트로바이러스 벡터
레트로바이러스는 모든 형태, 아과(subfamily), 속(genus) 또는 향성(tropism)을 포함하는 레트로비리대(Retroviridae) 바이러스 과에 속하는 동물 바이러스이다. 일반적으로 레트로바이러스 벡터는 유전자 전달을 위한 레트로바이러스 벡터에 대한 문헌인 Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer에 기재되어 있다. 문헌 Microbiology-1985, Americal Society for Microbiology, pp. 229-232, Washington, (1985)는 참조문헌으로서 본원에 삽입된다. 유전자 치료를 위해 레트로바이러스 벡터를 사용하는 방법의 예는 다음 문헌에 기재되어 있으며, 이들은 참조문헌으로서 본원에 삽입된다: 미합중국 특허 제4,868,116호 및 4,980,286호; PCT 특허공보 WO 90/02806 및 WO 89/07136; 및 Mulligan, (Science 260:926-932(1993)).
레트로바이러스는 실질적으로 핵산 카고(gargo)로 패킹되는 패키지(package)이다. 핵산 카고(cargo)는 복제된 자손 분자가 패키지 코트 내로 효과적으로 패키지되게 하는 패키지 신호를 갖고 전달한다. 패키지 신호에 추가로, 복제 및 복제된 바이러스의 패키징을 위해 cis에서 필요로 하는 많은 수의 분자가 있다. 일반적으로 레트로바이러스 게놈은 단백질 코트를 만드는데 관련이 있는 gag, pol 및 env 유전자를 포함한다. gag, pol 및 env 유전자는 일반적으로 표적 세포로 형질전환되어야 하는 외래 DNA에 의해 치환된다. 일반적으로 레트로바이러스 벡터는 패키지 코트로 삽입하기 위한 패키징 신호, gag 전사 단위를 시작하는 신호 서열, 역전사의 tRNA 프라이머에 결합하는 프라이머 결합 위치를 포함하는 역전사에 필요한 성분, DNA 합성 동안 RNA 가닥의 교대를 가이드하는 말단 반복 서열, DNA 합성의 이차 가닥을 합성하기 위한 프라이밍 위치로서 제공하는 5' 에서 3' LTR의 퓨린 풍부 서열, 및 레트로바이러스를 DNA 상태로 숙주 게놈으로 삽입할 수 있게 하는 LTR의 말단 근처의 특정 서열을 포함한다. gag, pol 및 env 유전자의 제거는 약 8 kb의 외래 서열을 바이러스 게놈으로 삽입 가능하게 하며, 역전사되어 동시에 복제물이 새로운 레트로바이러스 입자로 패키지되게 한다. 한개 유전자를 많은 유전자로 전달하기에 충분한 핵산의 양은 각 전사체의 크기에 의존한다. 삽입물에 들어 있는 다른 유전자와 함께 양성 또는 음성 선별성 마커를 포함하는 것이 바람직하다.
대부분의 레트로바이러스 벡터에서의 복제 장치 및 패키징 단백질이 제거되었기 때문에(gag, pol, 및 env), 벡터는 이를 패키징된 세포주에 위치시킴으로써 생성된다. 패키징 세포주는 복제 및 패키징 장치를 포함하지만, 모든 패키징 신호가 결실된 레트로바이러스로 형질전환 또는 형질감염된 세포주이다. 선택된 DNA를 포함하는 벡터가 이들 세포주에 형질감염되면, 관심 유전자를 포함하는 벡터는 헬퍼 세포에 의해 cis에서 제공되는 장치에 의해 복제되고 새로운 레트로바이러스 입자로 패키지된다. 장치에 사용된 게놈은 필요한 신호가 부족하기 때문에 패키지되지 않는다.
(2) 아데노바이러스 벡터
복제-결핍 아데노바이러스의 컨스트럭트는 다음의 문헌에 기술되었다: Berkner et al., J. Virology 61:1213-1220(1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virology 57:267-274(1986); Davidson et al., J. Virology 61:1226-1239(1987); Zhang "Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis" BioTechniques 15:868-872(1993). 이들 바이러스들을 벡터로 사용하는 이점은 이들이 다른 형태 세포로 퍼져나가는 것과 같은 확산되는데 있어서 제한이 있다는 것인데, 그 이유는 이들이 최초로 감염된 세포 내에서 복제를 할 수 있으며 새로운 감염성 바이러스 입자를 형성할 수 없기 때문이다. 재조합 아데노바이러스는 기도 상피세포, 간세포, 혈관 내피세포, CNS 실질 및 다른 수많은 조직 위치로 생체내로 직접 전달되고 난 뒤, 높은 효율의 유전자 전달이 달성되는 것으로 밝혀졌다(Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586(1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387(1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092(1993); Moullier, Nature Genetics 4:154-159(1993); La Salle, Science 259:988-990(1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267:25129-25134(1992); Rich, Human Gene Therapy 4:461-476(1993); Zabner, Nature Genetics :75-83(1994); Guzman, Circulation Research 73:1201-1207(1993); Bout, Human Gene Therapy 5:3-10(1994); Zabner, Cell 75:207-216(1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291(1993); and Ragot, J. Gen. Virology 74:501-507(1993)). 재조합 아데노바이러스는 특정 세포 표면 수용체에 결합함으로써 유전자 형질도입을 실현하며, 그리고 난 뒤 바이러스는 야생형 또는 복제-결핍 아데노바이러스와 동일한 방법인 수용체-매개 세포내이입에 의해 세포내 이동한다(Chardonnet and Dales, Virology 40:462-477(1970); Brown and Burlingham, J. Virology 12:386-396(1973); Svensson and Persson, J. Virology 55:442-449(1985); Seth, et al., J. Virol. 51:650-655(1984); Seth et al., Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533(1984); Varga et al., J. Virology 65:6061-6070(1991); Wickham et al., Cell 73:309-319(1993)).
바이러스 벡터는 E1 유전자가 제거된 아데노바이러스를 기초로 하는 것이 될 수 있으며, 이러한 비리온은 인간 293 세포주와 같은 세포주에서 생성된다. 다른 바람직한 구현예에서 E1 및 E3 유전자 모두는 아데노바이러스 게놈으로부터 제거된다.
(3) 아데노바이러스 -의존 바이러스 벡터
다른 형태의 바이러스 벡터는 아데노바이러스-의존 바이러스(AAV)를 기초로 한다. 이 결핍성 파보바이러스는 바람직한 벡터인데, 그 이유는 많은 형태의 세포에 감염될 수 있고 인간에 대해 비병원성이기 때문이다. AAV 타입 벡터는 약 4 내지 5 kb를 전달할 수 있고, 야생형 AAV는 염색체 19로 안정하게 삽입되는 것으로 알려져 있다. 이러한 위치 특이적 삽입 특성을 갖는 벡터가 바람직하다. 이러한 바이러스 타입의 특히 바람직한 예는 Avigen, San Francisco, CA에 의해 생산된 P4.1C 벡터이며, 이는 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제 유전자인 HSV-tk, 및/또는 녹색 형광 단백질인 GFP를 인코딩하는 유전자와 같은 마커 유전자를 포함할 수 있다.
다른 타입의 AAV 바이러스에서, AAV는 이종 유전자에 작동가능한 연결되어 세포-특이적 발현을 지시하는 프로모터를 포함하는 최소한 한개의 카세트를 플랭크하는 한쌍의 역전 말단 반복(inverted terminal repeats, ITRs)을 포함한다. 본 발명의 문맥에서 이종(heterologous)은 AAV 또는 B19 파보바이러스가 기원이 아닌 모든 뉴클레오타이드 서열 또는 유전자를 일컫는다.
일반적으로 AAV 및 B19 코딩 부위가 결실되며, 이로 인해 안전하고 비독성인 벡터가 제조된다. AAV ITRs 또는 이의 변형은 감염성 및 위치-특이적 삽입을 제공하지만, 세포독성은 제공하지 않으며, 프로모터는 세포-특이적 발현을 지시한다.
미합중국 특허 제6,261,834호는 AAV 벡터에 관련된 물질에 대한 참조문헌으로써 본원에 삽입된다.
따라서, 본 발명의 벡터는 상당한 독성이 없이 포유동물 염색체 내로 삽입될 수 있는 DNA 분자를 제공한다.
바이러스 및 레트로바이러스 내에 있는 삽입된 유전자는 요구되는 유전자 산물의 발현을 조절하는 것을 돕기 위해 프로모터, 및/또는 인핸서를 포함한다. 프로모터는 일반적으로 전사 시작 위치와 관련된 상대적으로 고정된 위치에서 기능을 하는 서열 또는 DNA 서열이다. 코어 물질을 포함하는 프로모터는 RNA 폴리머라아제 및 전사 인자의 기본적 상호작용을 필요로 하며 상류 요소(upstream element) 및 반응 요소를 포함할 수 있다.
(4) 크기가 큰 페이로드 바이러스 벡터
크기가 큰 인간 허피스바이러스를 이용한 분자 유전 실험은 허피스바이러스와 함께 감염을 허용하는 세포로 클로닝되고, 증식하며 확립될 수 있는 크기가 큰 이종 DNA 단편을 의미하는 것으로 제공된다(Sun et al., Nature genetics 8:33-41, 1994; Cotter and Robertson, Curr Opin Mol Ther 5:633-644, 1999). 이들 크기가 큰 DNA 바이러스(허피스 심플렉스 바이러스(HSV) 및 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV))는 >150 kb의 인간 이종 DNA 단편을 특정 세포로 전달하는 잠재성을 가지고 있다. EBV 재조합체는 에피좀 DNA로서 감염된 B-세포에서 큰 크기의 DNA 조각을 유지할 수 있다. 330 kb 이하의 인간 게놈을 가지는 각 클론은 유전적으로 안정한 것으로 보인다. 이들 에피좀의 유지는 EBV를 이용해 감염하는 동안 보존적으로 발현되는 특정 EBV 핵단백질인 EBNA1을 필요로 한다. 또한, 이들 벡터들은 형질감염을 위해 사용될 수 있는데, 이때 대량의 단백질이 시험관 내에서 일시적으로 생성될 수 있다. 또한, 허피스바이러스 앰플리콘(amplicon) 시스템은 >220kb의 DNA 조각을 패키지하고, 에피좀으로써 DNA를 안정하게 유지할 수 있는 세포를 감염시키는데 사용된다.
다른 유용한 시스템은 예를 들면 복제 및 숙주-제한된 비-복제 백시니아 바이러스 벡터를 포함한다.
b) 비-핵산 기초 시스템
갈라닌 유사체를 인코딩하는 핵산과 같은 본원에 기술된 조성물은 다양한 방법으로 표적 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 전기충격, 또는 리포펙션, 또는 칼슘 포스페이트 침전을 통해 전달될 수 있다. 전달 기작은 표적이 되는 세포의 형태 및 전달이 생체내 또는 시험관내에서 일어나는지에 따라 선택될 것이다.
따라서, 조성물은 예를 들어 본원에 기재된 변이체 또는 벡터에, 양이온성 리포좀(예, DOTMA, DOPE, DC-콜레스테롤) 또는 음이온성 리포좀과 같은 리포좀과 같은 지질을 추가로 포함할 수 있다. 리포좀은 바람직하게는 특정 세포를 표적으로 하는 것을 촉진하는 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 화합물 및 양이온성 리포좀을 포함하는 조성물의 투여는 표적 기관에 대한 구심 혈관(blood afferent)에 투여될 수 있으며, 호흡기관의 세포를 표적으로 하는 호흡 기관으로 흡입될 수 있다. 리포좀과 관련해서는 다음의 문헌을 참고하라: Brigham et al., Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1:95-100(1989); Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413-7417(1987); 미합중국 특허 제4,897,355호. 더불어, 화합물은 대식세포와 같은 특정한 형태 세포에 표적이 될 수 있는 마이크로캡슐의 성분으로서 투여될 수 있으며, 여기서, 마이크로캡슐로부터 화합물의 확산 또는 전달은 특정 속도 또는 용량으로 디자인된다.
환자의 세포 내로 외래 DNA를 투여하고 섭취하는 것을 포함하는 상기에 기재된 방법에서(즉, 유전자 형질도입 또는 형질감염), 세포로의 조성물의 전달은 다양한 기작에 의해 수행될 수 있다. 일 실시예로서, 리포펙틴, 리포펙타민(GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), 슈퍼펙트(Qiagen, Inc. Hilden, Germany) 및 트랜스펙탐(Promega Biotec, Inc., Madison, WI)와 같은 상업적으로 이용가능한 리포좀 제제를 이용하는 리포좀 뿐만 아니라 당업계의 일반적인 방법에 따라 개발된 다른 리포좀을 통해 전달이 수행될 수 있다. 추가로, 본 발명의 핵산 또는 벡터는 전기충격에 의해 생체 내로 전달될 수 있으며, 이 기술은 Genetronics, inc(San Die해, CA)로부터 이용가능할 뿐만 아니라 소노포레이션(SONOPORATION) 기계(ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ)를 이용해 가능하다.
상기 물질은 용액, 현탁액의 형태(예를 들면 미세입자, 리포좀 또는 세포 내로 결합될 수 있음)일 수 있다. 이들은 항체, 수용체 또는 수용체 리간드를 통해 특정 세포 형태로 표적화될 수 있다. 하기 문헌들은 종양 조직에 대해 특정 단백질을 표적화하기 위한 기술을 이용하는 예이다: Senter, et al., Bioconjugate Chem ., 2:447-451(1991); Bagshawe, K.D., Br . J. Cancer , 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br . J. Cancer , 58:700-703, 91988); Senter, et al., Bioconjugate Chem ., 4:3-9, (1993); Bettelli, et al., Cancer Immunol . Immunother ., 35;421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews , 129:57-80, (1992); 및 Roffler, et al., Biochem . Pharmacol, 42:2062-2065, (1991). 이러한 기술들은 다양한 다른 특정 타입 세포에 대해 사용될 수 있다. "스텔스(stealth)" 및 다른 항체 결합된 리포좀(대장 암종을 표적으로 하는 지질 매개된 약물을 포함)과 같은 운반체, 세포 특이적 리간드를 통한 DNA의 수용체 매개 표적화, 림프구 유도 종양 표적화 및 생체 내에서의 생쥐 신경아교종 세포의 높은 특이성의 치료학적 레트로바이러스 표적화. 다음의 참고문헌은 종양 세포로 특정 단백질을 표적화하기 위한 이러한 기술의 사용에 대한 예이다: Hughes et al., Cancer Research , 49:6214-6220, (1989); 및 Litznger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992). 일반적을, 수용체는 세포내 이입의 과정에 관련이 있으며, 구조적이거나 리간드에 의해 유도된다. 이러한 수용체들은 클래트린(clathrin)-코팅된 피트에 클러스터되고, 클래트린-코팅된 소포를 통해 세포로 들어가며, 산성화된 엔도좀을 통해 통과하여 여기서 수용체가 분류되고 세포 표면으로 다시 되돌아 가며, 세포내에 저장되거나 라이소좀에서 분해된다. 세포내 이동은 영양성분 취득, 활성화된 단백질의 제거, 거대분자의 청소, 바이러스 및 톡신의 기회적 투입, 리간드의 해리 및 분해, 및 수용체-레벨 조절과 같은 다양한 기능을 제공한다. 많은 수용체들은 세포 형태, 수용체 농도, 리간드 형태, 리간드 원자가, 및 리간드 농도에 의존하여, 하나 이상의 세포간 기작을 따른다. 수용체-매개 세포내이입의 분자 및 세포 기작이 검토되었다(Brown and Greene, DNA and Cell Biology, 10:6, 399-409(1991)).
숙주 세포 게놈으로 삽입되어야 하는, 세포로 전달되는 핵산은 일반적으로 통합(integration) 서열을 포함한다. 특히 바이러스 관련 시스템이 사용될 경우, 이들 서열들은 종종 바이러스 관련된 서열이다. 또한, 이들 바이러스 통합 시스템은 리포좀과 같은 비-핵산계 전달 시스템을 이용해 전달되어야 하는 핵산에 결합될 수 있으며, 이로 인해 이 전달 시스템에 포함된 핵산은 숙주 게놈 내로 삽입될 수 있다.
숙주 게놈으로 통합되기 위한 다른 일반적인 기술은, 예를 들어 숙주 게놈과 상동성 재조합을 촉진하기 위해 디자인된 시스템을 포함한다. 일반적으로 이들 시스템은 발현되어야 하는 핵산-숙주 세포 게놈 내에서 표적 서열과 충분한 상동성을 가짐-을 플랭킹하는 서열에 의존하며, 벡터 핵산 및 표적 핵산 사이의 재조합이 일어나고, 이로 인해 전달된 핵산이 숙주 게놈 내로 통합되게 한다. 상동성 재조합을 촉진하기 위해 필요한 이러한 시스템과 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있다.
c) 생체내 ( in vivo )/생체외( ex vivo )
상기에 기술된 바와 같이, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체로 투여될 수 있으며 당업자에게 알려진 다양한 기작(예, 네이키드 DNA의 흡수, 리포좀 융합, 유전자 총을 통한 DNA의 근육내 주입, 세포내이입 등)에 의해 생체내 및/또는 생체외에서 목적 세포로 전달될 수 있다.
만약 생체외 방법이 사용되면, 세포 또는 조직은 당업계에 잘 알려진 표준 프로토콜에 따라 제거되어 체외에서 유지된다. 조성물은 예를 들어 칼슘 포스페이트 매개 유전자 전달, 전기충격, 미세 주입 또는 프로테오리포좀(proteoliposome)과 같은 모든 유전자 전달 기작에 의해 세포내로 도입될 수 있다. 그리고 난 뒤, 형질도입된 세포는 주입되거나(예를 들어 약제학적 허용 담체 내에서), 또는 세포 또는 조직 형태에 대한 표준 방법에 따라 목적물 내로 동위적으로 이식될 수 있다. 표준 방법은 목적물 내로의 다양한 세포의 이식 또는 주입에 대해 알려져 있다.
6. 발현 시스템
일반적으로 세포로 전달되는 핵산은 발현 조절 시스템을 포함한다. 예를 들어, 바이러스 및 레트로바이러스 시스템 내에 있는 삽입된 유전자는 바람직한 유전자 산물의 발현을 조절하는 것을 도와주기 위해 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 프로모터는 전사 시작 위치에 대해 상대적으로 고정된 위치에 있을때 기능을 하는 서열 또는 DNA 서열이다. 프로모터는 RNA 폴리머라아제와 전사 인자의 기본적인 관계에 필요한 핵심 성분을 포함하며, 상류 요소 및 반응 요소를 포함할 수 있다.
a) 바이러스 프로모터 및 인핸서
포유동물 숙주 세포에 있는 벡터로부터 전사를 조절하는 바람직한 프로모터는 다양한 기원으로부터 얻을 수 있는데, 예를 들면 폴리오마, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤파티티스-B 바이러스 및 가장 바람직하게는 사이토메갈로바이러스와 같은 바이러스의 게놈으로부터, 또는 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 베타 액틴 프로모터로부터 얻을 수 있다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기원도 포함하는 SV40 제한효소 단편으로서 간편하게 얻어진다(Fiers et al., Nature , 273: 113(1978)). 인간 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 통상적으로 HindIII E 제한효소 단편으로서 얻어진다(Greenway, P.J. et al., Gene, 18:355-360(1982)). 물론, 숙주 세포 또는 관련종으로부터의 프로모터도 본원에 유용하다.
일반적으로 인핸서는 전사 시작 위치로부터 고정되지 않은 거리에서 기능을 하는 DNA 서열을 일컫으며, 이는 전사 단위에 대해 5'(Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:993(1981)) 또는 3'(Lusky, M.L., et al., Mol . Cell. Bio. 3:1108(1983))에 있을 수 있다. 더불어, 인핸서는 인트론 내(Banerji, J. L. et al., Cell 33: 729(1983) 뿐만 아니라 코딩 서열 그자체 내(Osborne, T F., et al., Mol . Cell . Bio. 4:1293(1984))에 있을 수 있다. 이는 길이가 10 내지 300 bp이며, cis에서 기능을 한다. 인핸서는 근처에 있는 프로모터로부터 전사를 증가시키는 기능을 한다. 또한, 인핸서는 종종 전사 조절을 매개하는 반응 요소를 포함한다. 프로모터는 전사 조절을 매개하는 반응 요소도 포함할 수 있다. 인핸서는 유전자의 발현의 조절을 결정한다. 많은 인핸서 서열이 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타아제, 알부민, -페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있지만, 일반적인 발현을 위해서는 진핵세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 바람직한 실시예는 복제 기원의 뒷 부분에 있는 SV40 인핸서(bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 뒷 부분에 있는 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서이다.
프로모터 및/또는 인핸서는 빛 또는 이들의 기능을 유도하는 특정한 화학적 이벤트에 의해 특이적으로 활성화 될 수 있다. 시스템은 테트라사이클린 및 덱사메타손과 같은 시약에 의해 조절될 수 있다. 감마선 조사와 같은 조사에 노출되거나 화학치료 약물을 알킬화함으로써 바이러스 벡터 유전자 발현을 향상시키는 방법이 있다.
특정 구현예에서, 프로모터 및/또는 인핸서 부위는 번역되어야 하는 번역 단위의 부위의 발현을 최대화하기 위해 보존적 프로모터 및/또는 인핸서로서 작용할 수 있다. 특정 컨스트럭트에서, 프로모터 및/또는 인핸서 부위는 모든 형태의 진핵세포에서 활성을 띄며, 심지어는 특정 시간에 특정한 형태의 세포에서만 발현된다. 이러한 형태의 바람직한 프로모터는 CMV 프로모터(650 베이스)이다. 다른 바람직한 프로모터는 SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(전체 길이 프로모터), 및 레트로바이러스 벡터 LTF이다.
모든 특정 조절 요소가 클로닝될 수 있으며, 흑색종 세포와 같은 특정한 타입의 세포에서 선별적으로 발현될 수 있는 발현 벡터를 컨스트럭트하는데 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 아교 섬유 아세틱 단백질(glial fibrillary acetic protein, GFAP) 프로모터는 아교 기원 세포에서 유전자를 선별적으로 발현하는데 사용되었다.
진핵 숙주 세포(효모, 곰팡이, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 유핵 세포)에 사용된 발현 벡터는 mRNA 발현에 영향을 줄 수 있는 전사 종결에 필수적인 서열을 포함할 수도 있다. 이 부위는 조직 인자 단백질을 인코딩하는 mRNA의 비번역 부위에 있는 폴리아데닐화된 단편으로 번역된다. 3' 비번역 부위는 전사 종결 위치도 포함한다. 전사 단위가 폴리아데닐화 부위도 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 부위의 이점은 mRNA와 같이 처리되고 전달되는 번역된 단위를 증가시킨다는 것이다. 발현 컨스트럭트 내의 폴리아데닐화 신호의 확인과 사용이 잘 정립되어 있다. 상동성 폴리아데닐화 신호가 형질전환 유전자 컨스트럭트에 사용되는 것이 바람직하다. 어떠한 전사 단위에서, 폴리아데닐화 부위가 SV40 초기 폴리아데닐화 신호로부터 유래되며 약 400개 염기로 구성된다. 또한, 상기 번역된 단위는 다른 표준 서열을 단독으로 포함하거나, 컨스트럭트로부터의 발현을 향상시키거나, 컨스트럭트의 안정성을 향상시키는 상기 서열과 혼합하여 포함하는 것이 바람직하다.
b) 마커
바이러스 벡터는 마커 산물을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 이 마커 산물은 유전자가 세포 내로 전달되고, 일단 전달된 것이 발현되는지 여부를 확인하는데 사용된다. 바람직한 마커 유전자는 β-갈락토시다아제 및 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 대장균 lacZ 유전자이다.
일 구현예에서, 마커는 선별 마커가 될 수 있다. 포유동물 세포용으로 적합한 선별 마커의 예는 디하이드로폴레이트 리덕타아제(DHFR), 티미딘 키나아제, 네오마이신 유사체 G418, 하이드로마이신 및 퓨로마이신이다. 이러한 선별 마커가 포유동물 숙주 세포로 성공적으로 전달되면, 형질전환된 포유동물 숙주 세포는 선별적 압력에 놓여 있을 경우 생존할 수 있다. 일반적으로 사용되는 2개의 선별적 방법 카테고리가 있다. 첫번째 카테고리는 세포의 대사 및 보충된 배지와는 독립적으로 자라는 능력이 부족한 돌연변이 세포주의 사용을 기본으로 한다. 두가지 예로는 CHO DHFR- 세포 및 생쥐 LTK-세포가 있다. 이들 세포들은 티미딘 또는 하이폭산틴과 같은 영양분의 추가 없이 자랄 수 있는 능력이 결핍되어 있다. 왜냐하면, 이들 세포들은 완전한 뉴클레오타이드 합성 과정에 필요한 유전자가 결핍되어 있으며, 부족한 뉴클레오타이드가 보충된 배지에 제공되지 않는 이상 생존하지 못하기 때문이다. 배지를 보충하기 위한 대안은 각각의 유전자가 결핍된 세포 내로 DHFR 또는 TK 유전자를 도입함으로써, 이들의 성장 조건을 바꾸는 것이다. DHFR 또는 TK 유전자로 형질전환되지 않은 각 세포들은 비-보충된 배지에서 성장할 수 없을 것이다.
두번째 카테고리는 모든 세포 형태에서 사용되는 선별 방법이라고 일컫어지며 돌연변이 세포주의 사용을 필요로 하지 않는 우성 선별이다. 이 방법은 숙주세포의 성장을 정지시키기 위해 약물을 사용한다. 신규 유전자를 갖는 세포들은 약물 저항성을 전달하는 단백질을 발현하며, 선별 과정에서 생존할 것이다. 이러한 우성 선별의 예는 약물로서 네오마이신(Southern P. and Berg, P. J. Molec . Appl . Genet. 1:327(1982)), 마이코페놀릭산(Mulligan, R.C and Berg, P. Science 209: 1422 (1980)) 또는 하이그로마이신(Sugden, B. et al., Mol . Cell . Biol . 5: 410-413(1985))을 이용한다. 이 세가지 예는 적절한 약물 G418 또는 네오마이신(제네티신), xgpt(마이코페놀릭산) 또는 하이그로마이신 각각에 대해 저항성을 갖기 위해, 진핵세포 조절하에서 박테리아 유전자를 포함한다. 다른 것들은 네오마이신 유사체 G418 및 퓨로마이신을 포함한다.
7. 펩타이드
a) 단백질 변이체
본원에 언급된 바와 같이, 공지되고 본원에서 고려된 수많은 펩타이드 변이체가 있다. 추가로, 본원에 언급된 위치와 관련이 있는 언급된 기능적 변이체 및 유도체의 경우, 본원에 기술된 것 이외의 위치에 기능적인 자연적으로 발생하는 공지된 변이체가 있으며, 이는 요구되는 대로 기능을 한다. 단백질 변이체 및 유도체는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 아미노산 서열 변형체 또는 기능적 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 변형은 일반적으로 세가지 군으로 나뉜다: 치환, 삽입 또는 결실 변이. 삽입은 아미노 및/또는 카르복실 말달 융합 뿐만 아니라 단일 또는 복합 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 삽입은 아미노 또는 카르복실 말단 융합의 것보다 더 작은 삽입이며, 예를 들면 1 내지 4개의 잔기이다. 실시예에 기술된 바와 같은 면역원성 융합 단백질 유도체는, 시험관내 교차-결합 또는 융합을 인코딩하는 DNA로 형질전환된 재조합 세포 배양에 의해, 표적 서열에 면역원성을 제공하기에 충분히 큰 폴리펩타이드를 융합함으로써 제조된다. 결실은 단백질 서열로부터 한개 이상의 아미노산 잔기가 제거된 것을 말한다. 일반적으로, 약 2 내지 6개의 잔기가 단백질 분자내에 있는 모든 한개 부위에서 결실된다. 이러한 변이체들은 단백질을 인코딩하는 DNA에 있는 뉴클레오타이드의 위치 특이적 돌연변이발생에 의해 제조되며, 이로 인해 이 변이체를 인코딩하는 DNA를 생산하고, 재조합 세포 배양을 통해 DNA를 발현한다. 당업계에 알려져 있는 공지된 서열을 갖는 DNA 내의 예정된 위치에서 치환 돌연변이를 제조하기 위한 기술은 예를 들면 M13 프라이머 돌연변이유발 및 PCR 돌연변이유발이다. 아미노산 치환은 일반적으로는 단일 잔기에서의 치환이지만, 한번에 다른 부위에서 일어날 수 있으며; 삽입은 약 1 내지 10개 아미노산 잔기이며; 결실은 약 1 내지 30개의 잔기에서 일어날 것이다. 결실 또는 삽입은 바람직하게는 인접 쌍에서 이루어지는데, 즉 2개 잔기의 결실 또는 2개 잔기의 삽입이다. 치환, 결실, 삽입 또는 이의 모든 조합은 최종 컨스트럭트에 도달하기 위해 결합될 수 있다. 돌연변이는 리딩 프레임 바깥에 있는 서열에서 일어나서는 안되며, 바람직하게는 이차 mRNA 구조를 만들어 낼 수 있는 상보적 부위를 만들지 않아야 한다. 치환적 변이체에서는, 최소한 한개의 잔기가 제거되며 다른 잔기가 이 위치에 삽입된다. 이러한 치환은 다음의 표 3 과 표 4에 따라 이루어지며, 이는 보존적 치환으로 일컫어진다.
Figure 112008055988995-PCT00001
Figure 112008055988995-PCT00002
기능 또는 면역학적 동일성에 있어서의 상당한 변화는 표 3에 있는 것보다 덜 보존적인 치환을 선별함으로써 만들어지는데, 즉 (a) 예를 들어 쉬트(sheet) 또는 헬릭스(helix)의 형태인, 치환 부위에 있는 폴리펩타이드 골격의 구조, (b) 표적 위치에서의 분자의 전하 또는 소수성 또는 (c) 곁사슬의 부피를 유지하는데 미치는 효과와는 훨씬 더 유의적으로 다른 잔기를 선별함으로써 만들어진다. 일반적으로 단백질 특징에 있어서 가장 큰 변화를 만들어 내는 것으로 예측되는 치환은 다음과 같다: (a) 예를 들어 세릴(seryl) 또는 트레오닐(threonyl)과 같은 친수성 잔기는 류실(leucyl), 이소류실, 페닐알라닐(phenylalanyl), 발릴(valyl) 또는 알라닐(analyl)과 같은 소수성 잔기에 대해(또는 의해) 치환되고; (b) 시스테인 또는 프롤린은 모든 다른 잔기에 대해(또는 의해) 치환되며; (c) 예를 들어 라이실, 아르기닐(arginyl), 또는 히스티딜과 같은 양전성 곁사슬을 가지는 잔기는 글루타밀 또는 아스파틸(aspartyl)과 같은 음전성 잔기에 대해(또는 의해) 치환되거나; 또는 (d) 페닐알라닌과 같은 거대한 곁사슬을 갖는 잔기는 이 경우 글라이신과 같은 곁사슬을 갖지 않는 한가지에 대해(또는 의해) 치환되며; (e) 설파화(sulfation) 및/또는 글리코실화에 대한 위치의 갯수를 증가시킨다.
예를 들어, 한개의 아미노산 잔기를 생물학적 및/또는 화학적으로 유사한 다른 것으로 치환하는 것은, 당업자들에게 보존적 치환이라고 알려져 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 한개의 소수성 잔기를 다른 것으로, 또는 한개의 극성 잔기를 다른 것으로 치환할 수 있다. 치환은 예를 들어 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Tyr과 같은 조합을 포함한다. 명백하게 기술된 각 서열의 보존적으로 치환된 변이는 본원에 제공된 모자이크 폴리펩타이드 내에 포함된다.
치환적 또는 결실 돌연변이유발은 N-글리코실화(Asn-X-Thr/Ser) 또는 O-글리코실화(Ser 또는 Thr)에 대한 삽입 또는 불능 위치로 적용될 수 있다. 시스테이 또는 메티오닌(예를 들어 호중성백혈구에 의한 산화물의 생성으로 인해 "호중성백혈구-저항성" 단백질 내에 있음) 또는 다른 불안정 잔기의 결실 또는 치환이 요구될 수 있다. 예를 들어 Arg과 같은 잠재적 단백질 분해 위치의 결실 또는 치환은 예를 들어 염기성 잔기 중의 하나를 결실시키거나, 글루타미닐 또는 히스티딜 잔기 중의 하나를 치환함으로써 달성될 수 있다.
후-번역 유도화는 발현된 폴리펩타이드 상의 재조합 숙주 세포의 활동의 결과이다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 종종 이에 상응하는 글루타밀 및 아스파릴 잔기에 대해 후-번역적으로 탈아미드화된다. 선택적으로, 이 잔기들은 중간정도의 산 조건하에서 탈아미드화된다. 다른 후-번역적 변형은 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 그룹의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 곁사슬의 엡실론-아미노 그룹에서의 아민의 메틸화(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-8691983]), N-말단 아민의 아세틸화, 어떤 경우에는 C-말단 카르복실의 아미드화를 포함한다.
디설파이드 결합은 2개의 시스테인 분자의 티올(thiol) 그룹 사이에서의 공유 결합이다. 산화 반응을 통해, 수소 원자는 디설파이드 브릿지의 형성을 가능하게 하는 티올 그룹으로부터 제거되며; 이렇게 결합된 시스테인은 시스틴(cystine)으로 불린다. 디설파이드 결합은 카테고리 그룹 I 및 그룹 II로 나뉜다. 사슬 내에서 시스테인을 연결시킴으로써 단백질의 3차원 구조를 안정화하는 것을 제공하는 것이 그룹 II 결합이다. 그룹 I 디설파이드 결합은 이 결합이 분리된 사슬 사이에서 일어날 때 발생한다. 그룹 I 디설파이드 결합의 형성은 적당한 수용체-리간드 결합을 제공하기 위해 수용체에 필요한 중요한 특징인, 이합체 단백질의 형성에 도움을 줄 수 있다. 아미노산 치환은 시스테인 잔기가 발생하는 위치에서 이루어질 것이며; 일반적으로 보존적 치환은 디설파이드 결합과 관련된 시스테인 잔기를 변화시키지 않는다. 이러한 치환은 치환된 잔기가 디설파이드 결합과 관련이 있는 경우, 단백질 폴딩을 변화시키거나 멀티머 관계를 변화시키는 영향을 할 수 있을 것이다. 시스테인이 디설파이드 결합과 관련이 있는 것으로 결정될 수 있다.
특정 서열에 대해 최소 70%의 상동성을 가지며, 변이체가 보존적 돌연변이인 구현예와 같이, 보존적 돌연변이 및 상동성에 관한 기재는 모든 조합으로 결합될 수 있다.
본 명세서가 다양한 단백질과 단백질 서열을 언급하는 경우, 이는 이들 단백질 서열을 인코딩할 수 있는 핵산도 언급될 수 있는 것으로 이해된다. 이는 특정 단백질 서열과 관계된 모든 축퇴 서열을 포함하는데, 즉 한개의 특정 단백질 서열을 인코딩하는 서열을 갖는 모든 핵산 뿐만 아니라 단백질 서열의 언급된 변이체 및 유도체를 인코딩하는 축퇴 핵산을 포함하는 모든 핵산을 포함한다. 따라서, 각각의 특정핵산 서열이 본원에 기재되지 않는다고 하더라도, 각 서열 및 모든 서열은 기재된 단백질 서열을 통해 본원에 기재되고 기술되는 것으로 이해된다. 또한, 어떠한 아미노산 서열도 생물체 내에 있는 단백질을 인코딩하는 특정 DNA 서열을 표시하지 않더라도, 기재된 단백질의 특정 변이체는 본원에 기술되며, 단백질이 만들어지는 특정 생물체에 있는 단백질을 인코딩하는 공지된 핵산 서열이 공지된 것이며 본원에 언급되고 기재되는 것으로 이해된다.
또한 언급되는 것은 언급된 단백질과 변이체의 단편이다. 일반적으로 이 단편들은 혈액 뇌장벽의 증가된 투과성과 같이, 본원에 기술된 기능 중 최소한 한개를 가질 것이다. 그러나, 이러한 활성을 갖지 않는 단편들은 예를 들어 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 예를 들어 갈라닌에 의해 발생하는 다양한 다른 기능적 활성이 있는 것을 이해된다. 이 활성들은 관련이 있을 수 있지만 반드시 필요한 것은 아니다. 이러한 기술은 예를 들어 특정 기능을 부여하기 위해 부위를 변화시킴으로써, 본원에 언급된 유사체의 기능적 도메인을 조작하는 방법으로 이해된다. 특정 기능적 위치가 제거되거나 변화된 유사체는 실시예 1 및 2에 언급되어 있다.
8. 항체
본원에 개시된 항체는 요구되는 기능을 가진 유사체를 확인하는데 유용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 모든 그룹의 전체 면역글로불린(즉 완전한 항체)을 포함한다. 일반적으로 본래의 항체는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성되는 헤테로테트라머 당단백질이다. 일반적으로 각각의 경쇄는 한개의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 디설파이드 연결의 수는 다른 면역글로불린 동형간에 다르다. 또한, 각 경쇄 및 중쇄는 조절적으로 간격이 있는 사슬간 디설파이드 브릿지를 가진다. 중쇄 각각은 한쪽 끝에 많은 고정 도메인에 따른 가변 도메인(V(H))을 갖는다. 경쇄 각각은 한쪽 끝에 가변 도메인(V(L))을 갖고 다른쪽 끝에 고정 도메인을 가지며; 경쇄의 고정 도메인은 중쇄의 첫번째 고정 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 사이에 인터페이스를 형성하는 것으로 믿어진다. 모든 척추동물 종의 항체의 경쇄는 이들의 고정 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(k) 및 람다(l)라고 불리는 2개의 명백히 차이나는 형태 중의 하나로 지정될 수 있다. 이들의 경쇄의 고정 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역 글로불린은 다른 그룹으로 지정될 수 있다. 5개의 주요한 인간 면역글로불린 그룹이 있으며: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이들 중 몇가지는 아군(동형)으로 다시 나뉠 수 있다, 즉 IgG-1, IgG-2, IgG-3 및 IgG-4; IgA-1 및 IgA-2. 당업자라면 생쥐에 대한 비교가능한 그룹을 알 수 있을 것이다. 면역 글로불린의 다른 그룹에 대응되는 중쇄 고정 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다.
본원에서 용어 "가변"은 항체 중에서 서열이 다른 가변 도메인의 특정 부분을 기술하는데 사용되며, 이의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인을 통해 공평하게 분포되지는 않는다. 이는 일반적으로 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 모두에 있는 상보성 결정 부위(CDRs) 또는 과가변 부위라고 불리는 3개의 단편에 집중된다. 가변 도메인의 더 높은 보존된 부위은 프레임워크(FR)라고 불린다. 원래의 중쇄 및 경쇄에 있는 가변 도메인은 각각 4개의 FR 부위를 포함하며, b-쉬트 형태를 채택하며, 3개의 CDRs에 의해 연결되어 루프 연결을 형성하고, 일부 경우는 b-쉬트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬에 있는 CDRs은 FR 부위에 의해 매우 근접하여 함께 결합하고, 다른 사슬로부터의 CDRs와도 결합하며, 이로 인해 항체의 항원 결합 위치를 형성하게 한다(참고, Kabat E. A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1987)). 고정 도메인은 항체 의존 세포 독성에 있는 항체의 관여와 같이, 다양한 작용기 기능을 나타내는 항체에 항체가 결합하는데 직접 연관되어 있지 않다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 또는 이의 단편"은 이중 또는 복수개의 항체 또는 에피토프 특이성을 갖는 키메라 항체 및 하이브리드 항체 및 하이브리드 단편을 포함한 F(ab')2, Fab', Fab 등과 같은 단편을 포함한다. 따라서, 항체 특이적 항원에 결합하는 능력을 갖는 항체의 단편이 제공된다. 예를 들어, 증가된 투과성을 유지하는 항체의 단편은 용어 "항체 또는 이의 단편"의 의미 내에 포함된다. 이러한 항체 및 단편은 당업계에 공지된 기술에 의해 제조될 수 있으며, 일반적인 항체 제조 방법 및 특이성과 활성에 대한 항체 스크리닝 방법으로 설병되는 방법에 따라 특이성 및 활성에 대해 스크리닝될 수 있다(참고, Harlow and Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988)).
또한 "항체 또는 이의 단편"의 의미 내에 포함되는 것은, 예를 들어 미합중국 특허 제4,704,692호에 기술된 바와 같은 항체 단편 및 항원 결합 단백질(단쇄 항체)의 결합이며, 이 문헌의 내용은 참조문헌으로서 본원에 삽입된다.
9. 약제학적 산물의 약제학적 담체 /전달
상기에 기재된 바와 같이, 갈라닌 유사체와 같은 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 내에서 생체 내로 투여될 수 있다 "약제학적으로 허용가능한"이란 생물학적으로 또는 다른 바람직하지 않은 것이 아닌 물질을 의미하며, 즉, 이 물질은 모든 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않거나 이것이 포함되는 약제학적 조성물의 다른 모든 성분과 해로운 방법으로 작용하지 않는, 핵산 또는 벡터와 함께 환자에 투여될 수 있다. 담체는 당업자에게 알려진 바에 따라, 활성 성분의 분해를 최소화하고 환자에서 부작용을 최소화하기 위해 선별될 수 있다.
조성물은 경구, 비경구(즉, 정맥내), 근육내 주입, 복강내 주입, 경피 주입, 체외 주입, 국소 주입 등으로 투여될 수 있으며, 국소 비강내 투여 또는 흡입에 의해 투여될 수도 있다. 필요한 조성물의 정확한 양은 환자마다 다르며, 종류, 나이, 체중 및 환자의 평소 상태, 사용되는 핵산 또는 벡터, 투여 방법 등에 의존한다. 따라서, 모든 조성물에 대해서 정확한 양을 정하는 것은 불가능하다. 그러나, 적정량은 본원에 개시된 일반적인 실험방법만을 이용하면 당업자에 의해 결정될 수 있다.
만약 조성물이 비경구로 투여되는 경우 이는 주입에 의해 특정화된다. 주입가능한 것은 액상 용액 또는 현탁액과 같은 통상적인 형태, 주입하기 전에 액상 내에서 현탁 용액으로 적합한 고형, 또는 에멀젼의 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여하기 위해 훨씬 최근에 검토된 시도는 느린 분비 또는 지연된 분비 시스템의 이용을 포함하며, 이는 투여량이 꾸준하게 유지되는 것이다. 본원에 참고문헌으로 삽입되는 미합중국 특허 제3,610,795를 참고하라.
물질은 용액, 현탁액(예를 들어 미세입자, 리포좀 또는 세포내로 결합됨)의 형태일 수 있다. 이들은 항체, 수용체 또는 수용체 리간드를 통해 특정 세포 형태로 표적화될 수 있다. 다음의 참고문헌은 종양 조직으로 특정 단백질을 표적화하기 위한 기술의 이용에 관한 예이다(Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br . J. Cancer , 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br . J. Cancer , 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem ., 4:3-9. (1993); Bettelli, et al., Cancer Immunol . Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog . Reviews, 129:57-80, (1992); 및 Roffler, et al., Biochem . Pharmacol, 42:2062-2065, (1991). "스텔스"와 같은 매개물 및 다른 항체 결합된 리포좀(대장 암종을 표적으로 하는 지방 매개된 약물을 포함), 세포 특이적 리간드를 통한 수용체 매개된 DNA 표적, 림프구 유도된 종양 표적 및 생체내에서의 생쥐 신경아교종의 매우 특이적인 치료적 레트로바이러스 표적. 하기의 참고문헌은 종양 조직으로 특정 단백질을 표적화하기 위해 이러한 기술을 사용하는 예이다: Hughes et al., Cancer Research , 49:6214-6220, (1989); 및 Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta , 1104:179-187, (1992). 일반적으로, 수용체는 세포내이입 과정-보존적 또는 리간드 유도된-에 관련이 있다. 이 수용체들은 클래트린-코팅된 피트(pits)에 클러스터되어, 클래트린-코팅된 소낭을 통해 세포 내로 들어가며, 산성화된 엔도좀을 통해 통과하면서 수용체가 분리되고, 세포 표면으로 다시 되돌아가 세포내에 저장되거나 라이소좀에서 분리된다. 세포내 이동 과정은 영양성분 수득, 활성화된 단백질의 제거, 거대분자의 청소, 바이러스 및 톡신의 기회주의적 투입, 리간드의 해리 및 분해, 및 수용체-레벨 조절과 같은 다양한 기능을 제공한다. 많은 수용체들은 세포 형태, 수용체 농도, 리간드 타입, 리간드 원자가, 및 리간드 농도에 따라, 하나 이상의 세포간 과정을 따른다. 수용체-매개 세포내이입의 분자 및 세포적 기작이 검토되었다(Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).
a) 약제학적으로 허용가능한 담체
갈라닌 유사체를 포함하는 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 치료학적으로 사용될 수 있다.
약제학적 담체는 당업계에 잘 알려져 있다. 가장 일반적인 것은 멸균수, 식염수 및 생리적 pH에 맞춘 완충 용액과 같은 용액을 포함하는, 인간에게 약물을 투여하기 위한 표준 담체가 될 수 있다. 조성물은 근육내 또는 피하 투여될 수 있다. 다른 화합물은 당업자에 의해 사용되는 표준 방법에 따라 투여될 것이다.
약제학적 조성물은 선택된 분자에 추가로, 담체, 점증제, 희석제, 완충제, 보존제, 표면 활성 제제 등을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 항미생물제, 항염증제, 마취제 등과 같은 하나 이상의 활성 제제도 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지, 치료되어야 하는 위치 등에 따라 수많은 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국소적으로(눈, 질, 직장, 비강을 포함), 경구로, 흡입으로, 또는 비경구로, 예를 들면 정맥내 점적주입에 의해, 피하, 복강내 또는 근육내 주입이 될 수 있다. 갈라닌 유사체와 같은 언급된 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 체강내 또는 경피로 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균 액상 또는 비-액상 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비-액상 용액의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물 오일, 및 에닐 올리에이트와 같은 주입가능한 유기 에스테르가 있다. 액상 담체는 식염수 및 완충 매질을 포함하는, 물, 알코올성/액상 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 매질은 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락테이트화 링거, 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥내 매질은 유상 및 영양 보충물, 전해질 보충물(링거 덱스트로스를 기반으로 하는) 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제는 항미생물제, 항-산화제, 킬레이트제, 및 비활성 기체 등과 같이 존재할 수 있다.
국소 투여하기 위한 제형은 연고, 로션, 크림, 젤, 점적약제(drop), 좌제, 스프레이, 액체 및 파우더를 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 담체인 액상, 파우더 또는 오일계 베이스, 점증제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다.
경구 투여하기 위한 조성물은 파우더 또는 과립, 물 또는 비-액상 매질 내에 있는 현탁액 또는 용액, 캡슐, 1회용 봉지 또는 정제를 포함한다. 점증제, 향료, 희석제, 에멀션화제, 분산제 또는 결합제가 요구될 수도 있다.
조성물 중의 일부는 하이드로클로릭산, 하이드로브로믹산, 퍼클로릭산, 나이트릭산, 티오사이아닉산, 설퍼릭산 및 포스포릭산과 같은 무기산, 및 포믹산(formic acid), 아세틱산, 프로피오닉산, 글리콜릭산, 락틱산, 피루빅산, 옥살릭산, 말로닉산, 숙시닉산, 말레익산 및 푸마릭산과 같은 유기산과 반응하여 형성되거나 소듐 하이드록사이드, 암모늄 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드와 같은 무기염 및 모노-, 디-, 트리알킬 및 아릴 아민과 치환된 에탄올아민과 같은 유기염과 반응하여 형성된, 약제학적으로 허용가능한 산- 또는 염기- 부가염으로서 투여될 수 있다.
b) 치료학적 용도
조성물을 투여하기 위한 투여량 범위는 질환의 증상이 바람직한 효과를 받도록 충분히 큰 양을 말한다. 투여량은 원하지 않는 교차-반응, 초과민반응 등과 같은 부작용을 일으킬 만큼 크지 않아야 한다. 일반적으로, 투여량은 환자의 나이, 몸상태, 성별 및 질병의 정도에 따라 다양할 것이며, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 모든 반대지표에서 발생하는 각 의사에 의해 적정화될 수 있다. 투여량은 다양할 것이며, 하루 또는 수일 동안 하루에 1회 이상 투여될 수 있다.
10. 칩 및 마이크로 어레이
본원에 언급되는 것은 최소한 한개의 주소(address)가 본원에 개시된 모든 핵산 서열에 표시되어 있는 서열 또는 이 서열의 일부인, 칩이다. 또한 언급되는 것은 최소한 한개의 주소가 본원에 개시된 모든 펩타이드 서열에 표시되어 있는 서열 또는 이 서열의 일부인, 칩이다.
또한 언급되는 것은 최소한 한개의 주소가 본원에 개시된 모든 핵산 서열에 표시되어 있는 서열 또는 이 서열의 일부분의 변이체인, 칩이다. 또한 언급되는 것은 최소한 한개의 주소가 본원에 개시된 모든 펩타이드 서열에 표시되어 있는 서열 또는 이 서열의 일부분의 변이체인, 칩이다.
또한 언급되는 것은 최소한 한개의 주소가 본원에 개시된 모든 핵산 서열에 표시되어 있는 서열 또는 이 서열의 일부분의 변이체이며, 여기서 상기 서열은 본원에 개시된 변이 서열 중 최소한 한개를 포함하는 것을 특징으로 하는, 칩이다. 또한 언급되는 것은 최소한 한개의 주소가 본원에 개시된 모든 펩타이드 서열에 표시되어 있는 서열 또는 이 서열의 일부분의 변이체이며, 여기서 펩타이드 서열은 본원에 개시된 갈라닌 유사체 중 최소한 한개를 포함하는 것을 특징으로 하는, 칩이다.
또한 언급되는 것은 최소한 한개의 주소가 본원에 개시된 모든 핵산 서열에 표시되어 있는 서열 또는 이 서열의 일부분의 변이체이며, 여기서 상기 서열은 본원에 설명된 부위 내에 있는 변이 서열 중 최소한 한개를 포함하는 것을 특징으로 하는, 칩이다. 또한 언급되는 것은 최소한 한개의 주소가 본원에 개시된 모든 펩타이드 서열에 표시되어 있는 서열 또는 이 서열의 일부분의 변이체이며, 여기서 상기 펩타이드 서열은 본원에 언급된 치환, 부가, 돌연변이 또는 결실 중 최소한 한개를 포함하는 것을 특징으로 하는, 칩이다.
11. 컴퓨터 판독가능 매체
본원에 기술된 핵산 및 단백질이 아미노산의 뉴클레오타이드로 구성되는 서열로 표현될 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 서열을 표시하는 다양한 방법이 있으며, 예를 들면 뉴클레오타이드 구아노신은 G 또는 g로 표시될 수 있다. 이와 같이 아미노산 발린은 Val 또는 V로 표시될 수 있다. 당업자라면 모든 핵산 또는 단백질 서열을 모든 다양한 방법으로 표시하고 표현하는 방법을 알 수 있으며, 이러한 방법 중의 일부는 본원에 개시되어 있다. 특히 본원에서 고려되는 것은 상업적으로 이용가능한 플로피 디스크, 테입, 칩, 하드 드라이브, 콤팩트 디스크 및 비디오 디스크 또는 다른 컴퓨터 판독가능 매체와 같은 컴퓨터 판독가능 매체 상에 이들 서열을 표시하는 것이다. 또한 기술되는 것은 본원에 기술된 서열을 이진접 코드로 표시하는 것이다. 당업자라면 컴퓨터 판독가능 매체가 무엇인지 알 수 있다. 따라서, 컴퓨터 판독가능 매체 상에 핵산 또는 단백질 서열이 기록되고, 저장되거나 보관되는 것이 언급된다.
본원에 기술되는 것은 서열 및 본원에 언급된 서열과 관련된 정보를 포함하는 컴퓨터 판독가능한 매체이다.
12. 킷트
본원에 기술되는 것은 본원에 기술된 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 제제와 연결된 킷트이다. 상기 킷트는 본원에 개시된 모든 제제 또는 제제의 조합을 포함할 수 있으며 또는 본원에 개시된 방법을 수행하는데 필요하거나 이점을 줄수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 킷트는 특정 구현예의 방법에서 언급된 치환을 수행하기 위해 아미노산 뿐만 아니라 설명서도 포함할 수 있다.
13. 유사한 기능을 가진 조성물
본원에 개시된 조성물이 혈액-뇌장벽의 투과성을 증가시키는 것과 같은 특정한 기능을 갖는 것으로 이해된다. 본원에 개시된 것은 개시된 기능을 수행하기 위한 구조적으로 필요한 것이며, 이는 기재된 구조와 관련이 있는 유사한 기능을 수행할 수 있는 다양한 구조가 있으며, 이러한 구조들이 유사한 결과를 최적으로 실현할 수 있을 것으로 이해된다.
E. 조성물의 제조 방법
본원에 개시된 조성물 및 본원에 개시된 방법을 수행하기에 필수적인 조성물은, 특별히 다르게 표시되지 않는 한 특정 제제 또는 화합물과 관련된 당업자에게 알려진 모든 방법을 이용해 제조될 수 있다. 다르게 표시되지 않는 이상 삼브루크 등의 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 2nd Edition(Cold Spring Harbor Labortory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989))에 기재된 바와 같은 일반적인 분자 생물학 기술이 본원애 기재된 분자를 제조하고 본원에 기재된 방법을 실행하는데 이용된다.
본원에 구체적으로 기술된 것은 혈액 뇌장벽의 투과성이 증진된 조성물의 제조방법이며, 여기서 상기 조성물은 비-변형된 형태의 펩타이드와 비교해 증가된 지방친화성 특징 및 증가된 염기성을 갖는 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 한다. 일 실시예에서, 지방친화성 특징은 폴리지방족 사슬과 같은 소수성 모이어티에 펩타이드를 결합시킴으로써 증가될 수 있다. 지방친화성 특징은 또한 방향족 잔기의 할로겐화를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 염기성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 라이신, 아르기닌, 호모-라이신, 호모-아르기닌, L- 또는 D-이성질체 형태의 오르니틴; 2,3-디아미노프로피오닉산; 2,4-디아미노부티르산을 포함하는 양전하 아미노산 잔기의 호모- 및 헤테로올리고머를 도입함으로써 증가될 수 있다. 다른 실시예에서, 염기성은 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아미노아민 덴드리머 또는 폴리아민 톡신 및 이의 유도체와 같은 폴리아민계 모이어티에 결합함으로써 증가될 수 있다. 펩타이드는 비-변형된 펩타이드와 비교해 혈액-뇌장벽을 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 효과적으로 통과할 수 있다. 또한, 펩타이드는 비-변형된 형태의 펩타이드와 비교해 증가된 글리코실화를 갖는다. 펩타이드는 스페이서를 포함할 수 있다. 스페이서는 Gly, Ahx, Gly-Ahx, 또는 PEG-O2Oc로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
1. 핵산 합성
예를 들어 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오타이드와 같은 핵산이 표준 화학 합성 방법을 이용해 제조될 수 있거나, 효소적 방법 또는 다른 모든 공지된 방법을 이용해 생산될 수 있다. 이러한 방법은 표준 효소 분해를 하고 난 뒤 뉴클레오타이드 단편을 분리하는 방법(참고예, Sambrok et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Chapter 5,6)에서부터 예를 들어 밀리젠 또는 베크만 시스템(Milligen or Beckman System) 1Plus DNA 합성기(예, Milligen-Biosearch, Burlington, MA의 Model 8700 자동 합성기 또는 ABI Model 380B)를 이용한 시아노에틸 포스포아미디트(cyanoethyl phosphoramidite) 방법까지 다양하다. 올리고뉴클레오타이드를 제조하기에 유용한 합성 방법은 다음의 문헌에 기재되어 있다: Ikuta et al., Ann . Rev . Biochem. 53:323-356(1984), (포스포트리에스테르 및 포스파이드-트리에스테르 방법), 및 Narang et al., Methods Enzymol., 65:610-620 (1980), (포스포트리에스테르 방법). (펩타이드 핵산 분자)는 닐슨 등의 문헌(Nielsen et al., Bioconjug . Chem. 5:3-7(1994))에 의해 기술된 바와 같은 공지되 방법을 이용해 제조될 수 있다.
2. 펩타이드 합성
본원에 개시된 단백질을 생산하기 위한 한가지 방법은 단백질 화학 기술로 2개 이상의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 연결하는 것이다. 예를 들어, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 Fmoc(9-플루오레닐메틸옥시카보닐) 또는 Boc(tert-부틸옥시카보노일) 화학을 이용하는 최근에 이용가능한 실험적 장비를 이용해 화학적으로 합성될 수 있다(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). 당업자라면, 본원에 개시된 단백질에 대응되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 표준 화학 반응에 의해 합성될 수 있음을 쉽게 알 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 합성되고 합성 레진으로부터 절단되지 않지만, 펩타이드 또는 단백질의 다른 단편이 합성되고 레진으로부터 절단됨으로써, 말단 그룹이 노출되어 다른 단편에 대해 기능적으로 차단되게 된다. 펩타이드 농축 반응을 통해, 이 2개의 단편들이 이의 카르복실 및 아미노 말단에 펩타이드 결합으로 공유결합되어 단백질 또는 이의 단편을 형성할 수 있다(Grant GA (1992) Synthetic Petptides: A User Guide. W. H. Greeman and Co., N.Y. (1992); Bodansky M and Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY, 이는 펩타이드 합성과 관련된 물질에 대한 참고문헌으로서 본원에 삽입된다). 선택적으로, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 본원에 개시된 바와 같이 생체 내에서 독립적으로 합성된다. 한번 분리되면, 이 독립적인 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 유사한 펩타이드 농축 반응에 의해 펩타이드 또는 이의 단편을 형성하도록 연결될 수 있다.
예를 들어, 클로닝되거나 합성된 펩타이드 단편의 효소적 연결은 상대작으로 짧은 펩타이드 단편이 연결되어 더 큰 펩타이드 단편, 폴리펩타이드 또는 전체 단백질 도메인을 만들수 있게 한다(Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151(1991)). 선택적으로 합성 펩타이드의 자연적 화학 연결은 짧은 펩타이드 단편으로부터 더 긴 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 합성적으로 컨스트럭트하는데 이용될 수 있다. 이 방법은 2 단계의 화학 반응으로 구성된다(Dawson et al., Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779(1994)). 첫번째 단계는 비보호된 합성 펩타이드-초기 공유결합 산물로서 티오에스테르 연결된 중간체를 제공하기 위해 아미노-말단 Cys 잔기를 포함하는 다른 보호되지 않은 펩타이드 단편을 가진 티오에스테르-의 화학선별적(chemoselective) 반응이다. 반응 조건의 변화 없이, 이 중간체는 자발적이고, 빠른 분자내 반응을 수행함으로써 연결 위치에 자연적인 펩타이드 결합을 형성한다(Baggiolini M et al., (1992) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I et al., J. Biol. Chem., 269:16075(1994); Clark-Lewis I et al., Bichemistry, 30:3128(1991); Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30(1994)).
선택적으로, 비보호된 펩타이드 단편은 비자연적인 (비-펩타이드) 결합과 같은 화학적 연결의 결과로서 펩타이드 단편 사이에서 결합이 형성되는 곳에서 화학적으로 연결된다(Schnolzer, M et al, Science, 256:221(1992)). 이러한 기술은 단백질 도메인의 유사체 뿐만 아니라 완전한 생물학적 활성을 가진 상대적으로 순수한 단백질을 대량으로 합성하는데 사용되었다(deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Acdemic Press, New York, pp. 257-267(1992)).
3. 조성물 제조 방법
본원에 개시된 것은 조성물 제조 방법 뿐만 아니라 조성물로 유도하는 중간체의 제조 방법이다. 예를 들어, 개시된 것은 서열번호 1-55로 표시되는 단백질이다. 이들 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있는 다양한 방법이 있으며, 합성 화학 방법 및 표준 분자 생물학 방법이 있다. 이들 및 다른 개시된 조성물을 제조하는 방법은 구체적으로 기술되는 것으로 이해된다.
개시되는 것은 서열번호 3으로 표시되는 서열을 포함하는 갈라닌 유사체를 인코딩하는 핵산 및 이 핵산의 발현을 조절하는 서열을 작동적 방법으로 연결시키는 것을 포함하는 단계에 의해 제조되는 단백질이다.
또한 개시되는 것은 서열번호 3으로 표시되는 서열과 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 갈라닌 유사체를 인코딩하는 핵산 및 이 핵산의 발현을 조절하는 서열을 작동적 방법으로 연결시키는 것을 포함하는 단계에 의해 제조되는 단백질이다.
개시되는 것은 세포를 본원에 개시된 모든 핵산으로 형질전환하는 과정에 의해 제조되는 세포이다. 개시되는 것은비-자연적으로 발생하는 본원에 개시된 모든 핵산을 발현시키는 단계에 의해 제조되는 개시된 모든 펩타이드이다. 개시되는 것은 언급된 모든 핵산을 발현하는 과정에 의해 제조된 비-자연적으로 발생하는 모든 펩타이드이다. 개시되는 것은 언급된 모든 비자연적인 핵산을 발현하는 과정에 의해 제조된 모든 개시된 펩타이드이다.
개시되는 것은 본원에 개시된 모든 핵산 분자로 동물 세포를 형질감염시키는 과정에 의해 제조된 동물이다. 개시되는 것은 본원에 개시된 모든 핵산 분자로 동물 세포를 형질감염시키는 과정에 의해 제조된 동물이며, 이 동물은 포유동물이다. 또한 개시되는 것은 본원에 개시된 모든 핵산 분자로 동물 세포를 형질감염시키는 과정에 의해 제조된 동물이며, 여기서 포유동물은 생쥐, 쥐, ㅌ토끼, 소, 양, 돼지 또는 영장류이다.
또한 개시되는 것은 본원에 개시된 모든 세포를 동물에 추가하는 과정에 의해 제조된 동물이다.
단백질을 생산하는 다른 방법은 생물단백질(Bioprotein) 기술에 의해 제조된 시스템과 같은 토끼 발현 시스템을 이용하는 것으로 이해된다. 개시된 분자는 여러 형태의 벡터 및 제조 시스템을 이용해 제조될 수 있다. 예를 들어, 이러한 타입의 시스템은 유럽 특허 출원 제 92 401 635.5호, 미합중국 특허 제5,965,788호 및 유전자 인슐레이터(유럽특허 제00 403 658.8호)에 개시되어 있으며, 정보는 www.bioprotein.com.에서 확인할 수 있다.
본 명세서를 통틀어, 다양한 공개문헌이 참조된다. 이들 공개문헌의 명세서는 본 발명에 속한 기술분야를 더 자세하게 설명하기 위해 본 명세서 내에 참조문헌으로써 전체가 삽입된다. 본원에 개시된 참고문헌은 이에 포함된 물질을 설명하기 위해 개별적 및 특징적으로 참고문헌으로써 포함되며, 이는 참고문헌이 속하는 문장 내에 언급된다.
당업자에게 있어서, 다양한 변형 및 모방이 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명에 속할 수 있다는 사실은 명백하다. 본 발명의 다른 구현예가 본원에 기술된 발명의 실시 및 상세한 설명으로부터 도출될 수 있다는 사실은, 당업자에게 있어서는 명백하다. 상세한 설명 및 실시예는 단지 예시일뿐, 본 발명의 진정한 범위 및 요지는 하기 특허청구범위에 의해 파악될 수 있는 것으로 간주된다.
첨부되는 도면은 본 명세서에 포함되며 일부로 구성되어, 본 발명의 여러가지 구현예를 설명하고, 명세서와 함께 본 발명의 원리를 설명한다.
도 1은 SSSE 해마신경세포 순환에 있어서의 GABA- 및 GLU-유도된 신경전달에 대한 뉴로펩타이드의 역할을 보여준다. 약자: CA, 피라미드 뉴런; DYN, 다이노르핀(dynorphin); GABA, γ-아미노 부티르산; GAL, 갈라닌(galanin); GLU, 글루타메이트; NE, 노르에피네프린; NPY, 뉴로펩타이드 Y; SOM, 소마토스타틴; SubsP, 물질 P(Wasterlain et al. 2002).
도 2는 자극하기 전 또는 이후에 갈라닌을 허파문동맥(hilus)에 주입하여, 생쥐의 발작 주기가 짧아진 것을 보여준다. 상부 그래프. 갈라닌(50 및 500 피코몰)을 퍼포란트-패스(perforant-path) 자극(PPS)하기 30분 전에 주입하였다. 하부 그래프. 오직 500 피코몰의 갈라닌만이 PPS 30분 후에 주입하였을때 발작 주기를 감소시키는데 효과있었다(Mazarati et al. 1998).
도 3은 비펩타이드성 갈라닌 수용체 작용제와 갈라닌 모두의 마우스에서 PTZ-유도된 발작에 대한 증가된 잠복기와 감소된 발작 지수를 보여준다. 삽입된 것은 최대 발작 지수를 요약한 것이다(검은색, 대조군; 투명, 갈논(galnon); 회색, 갈라닌). (Saar et al. 2002).
도 4는 생쥐의 자가-조절 상태 간질 모델(self-sustaining status epilepticus model)에 있어서의 해마내 주입 이후의 항발작 활성을 보여준다.(Mazarati and Wasterlain, 2002).
도 5는 생쥐의 자가-조절 상태 간질 모델에 있어서의 해마내 주입 이후의 다이노르핀 및 뉴로펩타이드 Y의 항발작 활성을 보여준다. 도 4에 대한 대조군 실험이다(Mazarti and Wasterlain, 2002).
도 6은 혈액-뇌장벽을 통해 펩타이드의 투과성에 영향을 주는 주요 인자를 보여준다. 염기성과 지방친화성은 확산과 흡수성-관련 세포내이입을 통해 수동 전달을 향상시키지만, 글리코실화 또는 벡터는 혈액-뇌장벽을 통해 능동 전달을 향상시킬 수 있다.
도 7은 항발작 활성을 가진 뉴로펩타이드 유사체를 개발하기 위한 일반적인 방법을 보여준다. 2가지 모델 뉴로펩타이드는 혈액-뇌장벽을 통해 투과성을 향상시키기 위한 기술을 평가하기 위해 선택하였다.
도 8은 이상적인 뉴로펩타이드 약물의 원형의 구조적 조직을 보여준다. 회색 박스는 펩타이드 모이어티의 대사적 안정성, 염기성 및 지방 친화성이 증가한 골격과 곁사슬 변형을 보여준다. BBB/PK-변형체는 거대한, 지방친하성, 양이온성 모듈과 내인성 영양 모방물을 포함하는 폴리머-기초의 구조이다. 양이온성 모듈은 막과의 정전기적 작용을 통해 흡수-유래 세포내이입을 증가시킨다. 지방 친화성 모듈은 혈액 뇌장벽을 통해 수동 전달을 증가시킨다. 능동 전달 모방물 구조(예, 헥소스 또는 페닐알라닌)는 혈액 뇌장벽에 위치한 영양 전달체의 내부에 직접 연결하는 물질로 제공한다.
도 9는 BBB를 투과하는 펩타이드 유사체의 디자인에 사용된 방법을 보여준다. 2개 이상의 다른 화학적 변형의 조합이 BBB를 통한 유사체의 투과성을 증가시 킴이 보여진다.
도 10은 혈액 뇌장벽을 통해 투과성을 향상시키는 뉴로펩타이드르 제작하기 위한 계획을 보여준다. 단어: DAB, 디아미노부티르산; DAP, 디아미노프로피오닉산; PEG, 폴리에틸렌 글리콜; Mmt, 4-메틸트리틸.
도 11은 소마토스타틴 유사체에서의 N-말단 연장 모듈 구조를 보여준다. 모듈들은 고체상 펩타이드 합성 동안 결합된다. 모듈의 수와 순서는 임의적이며, BBB/PK 모듈레이터의 구조적 조성물은 최적화될 수 있다.
도 12는 Gal BBB-2가 프링즈 생쥐에서 소리에 기인한 발작에 대해 시간(삽입) 및 용량-의존적 억제 나타냄을 보여준다. 시간 간격에 따라 생쥐에 4 mg/kg의 Gal BB-2를 복강내 투여하였으며, 투여후 다양한 시간에 테스트하였다. 용량-의존적 연구에서 프링즈 생쥐 그룹에 Gal BBB-2를 증가하는 투여량으로 처리하였으며 복강내 투여후 1시간에 테스트하였다.
도 13은 GAL-BB2를 최적화하기 위한 일반적인 실험 방법을 보여준다. 첫번째 3개의 박스는 실험예 1에 설명되는 활성을 요약한다. 약 40개의 유사체를 합성학 경쟁적 결합 분석에서 스크리닝하였다. 가장 효과있는 갈라닌 리간드는 이의 효과와 장시간 지속되는 항경련 활성에 대해 추가로 스크리닝한뒤, 더욱 자세한 약리학적 특성을 밝혔다
도 14는 GLA-BBB2의 구조적 조직과 제안된 SAR 연구를 보여준다. 검은색 박스는 중요한 약물작용발생단 잔기를 나타낸다.
도 15는 비-펩타이드 스페이서(5-아미노밸러릭산)를 이용한 비-약물작용발생 단 잔기(R2 및 R3)의 치환인 "골격 인공삽입물"을 보여준다, 다른 골격 스페이서는 아미노헥사노익산 또는 아미노-3,6-디옥사옥타노익산(PEG-스페이서)을 포함한다.
도 16은 초기 급성 단계 뿐만 아니라 지연된 염증 단계 모두 동안, GAL-BBB2(도면에는 NAX-5055라고 표시됨)(0.52-5 mg/kg)는 발바닥을 핥는데 있어서 용량-의존적 감소를 나타냄을 보여준다. 반대로, 비-변형된 원래 단편인 Gal 1-16은 GAL-BBB2에서 테스트된 가장 높은 용량(즉 20 mg/kg)보다 훨씬 높은 용량으로 4회로 복강내 투여하고 난 뒤에 비활성으로 확인되었다.
도 17은 5 mg/kg의 GAL-BBB2는 10 mg/kg 용량의 가바펜틴과 등가의 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
도 18은 만성 통증의 좌골 연결 모델에서 GAL-BBB2(도면에는 NAX-5055로 표시되어 있음)가 물리적 이질통증에 대한 역치가 시간-의존적으로 증가함을 보여준다. 더불어, GAL-BBB2는 모르핀에 대해 동일역가를 나타내고, 가바펜틴에 비해 몇배 더 효과가 있다.
도 19는 NAX 5055로도 불리는 GAL-BBB2의 구조를 보여준다.
도 20은 NAX 5055(GAL-BBB2)가 프링즈 생쥐에서 활성을 띄지만 원래의 펩타이드 단편은 그렇지 않음을 보여준다. 항경련 효과는 용량-반응 연구에서 시간에 따른 최대 효과(즉, 1h)로 정량화하였다. 이 연구의 결과는 GAL-BBB2가 소리-유도된 발작에 대해 용량 의존적 효과를 나타냄을 설명해준다. 용량-의존 데이터의 프로빗(Probit) 분석으로부터 얻은 계산된 유효량 중간값(즉, ED 50)과 95% 신뢰구간 은 3.2(2.-6.1) mg/kg 이었다. 원래 펩타이드 단편인 GAL(1-16)은 20 mg/kg 용량으로 복강내 주사했을때 비활성이었다(GAL-BBB2의 ED50 보다 6배).
도 21은 옥트레오사이드(octreocide)의 화학적 구조 및 이를 제조하기 위한 도식도를 보여준다.
도 22는 NAX 5055(GAL-BBB2)가 6 Hz(32 mA) 테스트에서 원래 펩타이드보다 훨씬 효과가 있고 훨씬 효능이 좋음을 보여준다.
도 23은 NAX 5055(GAL-BBB2)(4 mg/kg, ip)가 프링즈 생쥐에서 시간-의존적 항경련 활성을 나타냄을 보여준다.
도 24는 NAX 5055(GAL-BBB2)가 프링즈 생쥐에서 소리에 이긴한 발작에 대해 용량-의존적 억제효과를 나타냄을 보여준다.
도 25는 NAX 5055(GAL-BBB2)(4 mg/kg)가 약물-저항성 발작 모델에서 활성임을 보여준다.
도 26은 NAX 5055(GAL-BBB2)가 6 Hz 발작 테스트에서 복강내(ip) 및 피하내(sc) 주입하고 난 뒤에 훌륭한 생물적합성을 나타냄을 보여준다. NAX 5055는 수컷 CF-1생쥐 그룹(n=6-8)에 복강내 또는 피하내로 주입된다. 60분 뒤에, 각 그룹에 있는 각 생쥐에게 각막 전극을 통해 자극시켰다(32 mA, 6Hz, 3초 간격). 변연계 발작을 보이지 않는 생쥐는 억제된 것으로 간주하였다. 이 결과에서는 피하내 주입 뒤에 NAX 5055의 항경련 활성이 유지됨을 설명해준다. 이러한 발견에서는 NAX 5055(GAL-BBB2) 및/또는 다른 신경활성 펩타이드가 피하내 전달을 받을 수 있는 저장(depot) 제형이 사용될 수 있음을 보여준다.
도 27은 NAX 5055(GAL-BBB2)가 6Hz (44 mA) 테스트에서 CMPD X의 효과와 효능을 증가시킴을 보여준다. 단독으로 투여될때, CMPD A(레베티라세탐, levetiracetam)는 매우 높은 용량에서 6 Hz 변연계 발작에 대해 최소의 유효한 효과를 나타낸다(즉, 1000 mg/kg에서 최대 50% 억제). 반대로, 최소 유효량의 NAX5055(1.5 mg/kg)가 CMPDA A(레베티라세탐)과 혼합으로 투여되면, 효능과 효과는 급격히 증가하였다. 이 결과에서는 NAX 5055에 의한 갈라닌 수용체의 조절이 레베티라세탐의 항경련 효과를 유의적으로 증가시키도록 유도함을 보여준다. 함께 사용될 경우, NAX 5055를 레베티라세탐과 혼합한 혼합 물질이 매우 높은 용량으로 레베티라세탐 단독으로 사용되는 것에 비해 치료학적 이점을 제공할 수 있음을 보여준다.
도 28은 NAX 5055(GAL-BBB2)가 해마 자극된 쥐에서 이상적이 억제를 나타냄을 보여준다. 해마 자극된 쥐 모델의 부분 발작에서, NAX 5055는 발작 지수를 5에서 3으로 감소시켰다. 이 결과에서는 NAX 5055에 의한 갈라닌 수용체의 조절이 이차적으로 일반화된 부분 발작을 억제하는데 유용하며, 자극된 쥐의 뇌에 갈라닌이 직접 투입되는 이전의 대뇌심실내 연구와 일관된 결과임을 보여준다. 복강내 투여된 NAX 5055가 활성이라는 확인은 전신 투여뒤에 뇌에서 얻어지는 결과를 뒷받침한다.
도 29는 포르말린-유도된 통각 과민에 미치는 NAX 5055(GAL BBB2)의 영향을 보여준다. NAX 5055는 포르말린을 발바닥에 투여하기 전 60분에 투여하였다. 시간은 최대 효과의 항경련 시간을 기본으로 한다.
도 30은 소마토스타틴과 델타수면-유도 펩타이드(DSIP)가 22 mM 6 Hz 발작 테스트에서 모두 항경련임을 보여준다. 이 도면의 결과에서는 소마토스타틴과 델타수면-유도 펩타이드(DSIP)가 CF-1 생쥐의 심실 공간에 직접 투여되었을때 6 Hz(22 mA) 발바닥 발작에 대해 효과가 있음을 설명해준다. 이 결과에서는 뇌에 있는 소마토스타틴과 DSIP 결합 위치의 조절이 실행가능한 시도라는 '개념의 증명'을 제공해준다. 이는 더불어 우리가 소유한 기술을 이용하는, 혈액 뇌장벽을 통과하는 전체적으로 활성의 소마토스타틴 및 DSIP 신경활성 펩타이드의 개발을 지지해준다.
도 31은 GAL(1-16) 유사체의 구조를 보여준다. 표시된 것은 BBB 투과성이 증가된 유사체를 디자인하는데 사용된 정보의 중심이 되는 부분이다.
도 32는 생쥐 각막 점화현상의 수득에 대한 NAX 5055의 2일 동안의 투입(4 mg/kg, ip)의 효과를 보여준다. CF#1 생쥐는 매개물(0.9% 식염수) 또는 NAX 5055를 무작위로 투여받았다. NAX-5055 그룹 생쥐는 첫번째 자극을 하기전 12시간 및 1시간에 2회 용량으로 투여받았다. 그 이후의 자극을 하기 1시간 전에, MAX-5055 처리된 그룹 생쥐는 다른 용량의 NAX-5055(4 mg/kg, ip)를 투여받았다. 생쥐들은 16일 동안 이틀에 한번씩 자극시켰다. 결과는 자극 당 평균 발작 점수로 표현하였다. 상기에 표시한 바와 같이, NAX-5055 처리한 생쥐에 대한 결과는 2 그룹으로 분리된다; 즉, 민감성(녹색 선) 및 비민감성(청색 선). 식염수 대(vs) NAX-5055 민감성은 p<0.0002의 유의적 차이점을 보이고; NAX-5055 민감성 대 NAX-5055 비민감성은 p<0.0001의 유의적 차이점을 보였다. 이 연구에서 얻어진 결과는 NAX-5055와 같은 갈린을 기초로 하는 펩타이드가 자극을 받아들이는 것을 억제하는 능력을 갖고 있으며, 간질 및 다른 신경학적 질환이 발생하는 위험에서 환자의 질병을 모방할 수 있다.
도 33은 NAX-5055(mg/kg, ip)를 이틀에 한번씩 투여하는 것이 각막 점화현상 속도에 미치는 영향을 보여준다. NAX-5055 처리한 생쥐(실험예 상세하게 설명된 도면 X를 참고)에 대한 결과는 2 그룹으로 분리된다; 즉, NAX-5055 민감성 및 NAX-5055 비민감성. 결과는 각각의 발작 점수 +/- S.E.M에 도달하는데 필요한 자극의 수로 표현하였다; 즉 1 내지 5. NAX-5055 민감성 그룹에 속하는 생쥐는 단계 1 발작에 도달하는데 2배의 자극을 필요로 하였으며, 단계 2 및 단계 3의 발작에 도달하기 위해서는 35-40% 더 많은 자극이 필요했다. 또한, NAX-5055 민감성 그룹에 속하는 생쥐 어느 것도 단계 5의 발작에는 도달하지 않았다. One way ANOVA, p<0.0209; 포스트 혹(post hoc) 분석: 식염수 대 NAX-5055 비민감성, p>0.05; NAX-5055 민감성 대 NAX-5055 비민감성, p<0.05. 이러한 결과들은 변형된 갈라닌계 뉴로펩타이드가 점화현상 수득물의 발생을 변형하는 능력을 가지며, 간질 및 다른 신경학적 질환으로 발전하기 쉬운 환자 그룹에서 네트워크 과잉민감성을 억제하는데 유용하다는 결론을 뒷받침해준다.
도 34는 엔케팔린 유사체에 도입된 글리코실 그룹의 구조를 보여준다(Elmagbari, Egeton et al. 2004).
도 35는 두개의 다른 화학적 변형의 조합이 각각의 변형보다 훨씬 월등함을 보여준다. 양이온화 또는 지질화 단독으로는 이들의 조합과 비교했을때 5055 유사 체의 투과성을 증가시키지 못했다.
도 36은 혈액 뇌장벽을 통해 펩타이드의 투과성을 향상시키는데 사용된 리포아미노산의 예를 보여준다. 이러한 리포아미노산은 표적 펩타이드의 염기성을 증가시키는 화학적 변형과 결합될 수 있다.
도 37은 뉴로펩타이드 유사체의 대사적 안정성을 향상시키는 화학 변형을 보여준다. 유사체 5055(서열번호 3) 또는 1205-2(서열번호 50) 또는 비변형된 유사체 Gal(1-1)는 37℃에서 쥐 혈청에 희석하여 배양하였다. 잔여량의 펩타이드는 HPLC로 확인하였다.
도 38은 BBB를 통과하는 뉴로펩타이드 유사체에 의해 치료, 예방 또는 역전될 수 있는 신경병증 통증의 여러가지 형태를 보여준다.
하기 실시예는 본 발명의 기재와 상세한 설명과 함께 본원에 청구된 화합물, 조성물, 물품, 장치 및/또는 방법이 어떻게 만들어지고 평가되는지에 대해 당업자에게 제공하기 위해 기술되며, 이는 단지 본 발명의 일 예시이며 이것이 본 발명의 범위를 제한하지는 않는 것으로 간주된다. 숫자(즉 양, 온도 등)와 관련해서 정확하게 표현되도록 노력하였지만, 에러 및 변화도 있을 수 있다. 다르게 표시되지 않는 한, 부(parts)는 중량부, 온도는 ℃ 또는 대기온도, 그리고 압력은 기압 또는 그와 근접한 것이다.
1. 실시예 1: 전신-활성 항경련 갈라닌 유사체
개념-증명의 결과를 얻기 위해, 항경련 뉴로펩타이드는 혈액-뇌장벽을 통한 투과성을 향상시키도록 조작할 수 있으며, 2가지 모델 뉴로펩타이드가 선별되었다: 소마토스타틴 및 갈라닌. 상기에 기재한 바와 같이 이 뉴로펩타이드 모두는 항경련 활성을 가진다.
일반적일 실험 방법은 도 7에 예시되어 있다. 뉴로펩타이드 유사체 세트(1차 세대)는, 이의 수용체에 대해 높은 친화성으로 결합하는지에 대한 능력을 테스트하기 위해 디자인하고 합성하였다. 이 세트는 뉴로펩타이드 당 약 10개의 유사체를 포함한다. 높은 친화성의 유사체는 혈액-뇌장벽을 투과하는지에 대한 능력을 추가로 테스트하였다. 1차 세대 유사체로부터의 결과는 합성 후에 평가하고, 뒤따라 2차 및 3차 세대 유사체를 평가하였다. 가장 유망한 유사체를 선별하여(혈액-뇌장벽을 통해 향상된 투과성을 가진 높은-친화성의 리간드) 기능적 분석에서 이의 작용제 활성을 확인하였다. 그리고 난 뒤 이들 유사체의 서브타입(혈액-뇌장벽을 통해 향상된 투과성을 가진 효과이는 작용제)이 생체 내에서 약제학적으로 테스트된다.
약물이 되기 위해, 뉴로펩타이드 유사체는 다음을 포함하는 몇가지 중요한 특징을 가져야 한다: (1) 높은 효율 및 선별성, (2) 대사적 안정성, (3) 상대적으로 긴 반감기 및 체순환으로부터의 감소된 제거율, 및 (4) 혈액-뇌장벽을 통한 증가된 투과성. 대부분의 뉴로펩타이드는 높은 효율과 선별성을 가진다. 대사적 안정성은 펩타이드 골격 변형 및/또는 단백질 분해 효소에 의해 인식되지 않는 잔기 를 이용한 민감성 잔기의 치환에 의해 도입될 수 있다. 반감기의 증가 및 제거율의 감소는 폴리머계 모이어티를 펩타이드에 결합시킴으로써 효과적으로 달성될 수 있다(즉, PEGylation). 혈액-뇌장벽을 통한 더 큰 투과성은 지방친화성 또는 양이온화의 증가 뿐만 아니라 전구약물, 영양성분 전달 모방체 또는 글리코실화의 추가에 의해 도입될 수 있다. 이상적인 약물 뉴로펩타이드의 구조는 도 8에 도식화되어 있다.
도 8에 예시된 바와 같이, 뉴로펩타이드 조작에 대한 새로운 개념이 도입되었다: "BBB/PK 조절제". BBB/PK 조절제는 지방친화성, 양이온성 및 전달 모방 모듈을 가진 폴리머계 거대 모이어티를 포함하며; 이 조절제는 혈액-뇌장벽을 통해 투과성을 증가시키고, 약동학적 특성을 향상시키는 두가지 목적을 제공한다. 양이온성 및 지방친화성 모듈은 각각 음전하 막 표면과의 상호작용을 촉진하고, 막을 통한 확산을 향상시킨다. 능동 전달 모방 구조의 기능은 뇌 내피세포의 표면에 위치한 특정 영양성분 전달자와의 상호작용을 향상시킴으로써 뇌로의 뉴로펩타이드 수득 특이성을 향상시키는 것이다. 이들 모듈을 모두 포함하는 구조적 골격은 펩타이드의 약동학적 특성을 향상시키고, 공통적으로 사용되는 PEG 모이어티의 기능을 변형/치환할 수 있다. 이 거대 분자들은 모델 뉴로펩타이드의 N- 또는 C-말단 연장에 대해 테스트되며, 뉴로펩타이드 구조 내에 있는 더 다용도의 부착 위치도 본원에 언급된다.
다음의 방법은 향상된 혈액-뇌장벽 투과성을 가진 뉴로펩타이드 유사체를 디자인하기 위해 사용되었다: 이용 가능하다면 대사적으로-안정한 유사체로 시작함. 곁사슬 치환에 대해 수정할 수 있는 유사체에 있는 추가적 AA 위치를 확인하는 단계. 거대 모이어티의 도입에 대해 수정할 수 있는 N- 및 C-말단에 있는 위치를 확인하는 단계. 곁사슬 치환에 의해 유사체의 지방친화성 및 염기성을 증가시키는 단계. 지방친화성 및 염기성을 추가로 증가시킬 수 있으며, 약동학적 특성(BBB/PK 조절제)을 향상시키도록 펩타이드 유사체에 연장을 도입하는 단계. 혈액-뇌장벽 투과성의 특이성을 향상시키기 위해 연장물에 영양성분 모방 구조를 포함시키는 단계. 곁사슬 변형된 유사체를 연장 모이어티(BBB/PK)와 결합하는 단계.
이러한 유사체를 성공적으로 디자인하기 위한 핵심은 상기-언급된 변형의 정확한 결합이다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 각각의 변형 세트 및 이의 최적의 조합을 디자인하고 평가하는 데 있어서 시스템적 시도가 채택될 수 있다. 일반적인 방법은 도 10에 도식화되어 있다. 본원에 개시된 바와 같은 아미노산의 변형은 자동 펩타이드 합성기를 이용하여 고체상 펩타이드 합성 동안 도입될 수 있다. 모든 비-천연의 아미노산 또는 결합된 구조는 상업적으로 이용가능한 Fmoc-보호된 유도체이다.
소마토스타틴은 단일 디설파이드 브릿지를 가진 14-아미노산 시상하부(hypothalamic) 펩타이드이며, 이는 1973년에 맨처음 발견되었다(Brazeau et al., 1973). 소마토스타틴의 서열은 다음과 같다:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys
광범위한 SAR 연구에서 5개의 중요한 잔기를 확인하였다: Phe6, Phe7, Trp8, Lys9 및 Phe11, 그렇지만 Gly2, Lys4, Asn5, Thr10, Thr12 또는 Ser13의 알라닌 치환은 생물학적 활성에 유의적인 영향을 주지는 않았다(Vale et al, 1975). 추가로, D-Trp8-포함 유사체는 단백질분해에 대한 저항성이 더 크고 활성 형태를 더 안정화하기 때문에, 더 효과있는 것으로 밝혀졌다.
[D-Trp8] 소마토스타틴은 본원에 개시된 방법을 이용해 대사적으로 안정한 유사체로서 사용될 수 있다. 염기성을 증가시키기 위해, Thr, Ser 또는 Asn 잔기는 등전자적으로 유사하지만, 양전하인 DAB(디아미노부티르산) 또는 DAP(디아미노프로피오닉산) 잔기를 이용해 전체적으로 치환될 수 있다. 지방친화성을 증가시키기 위해, Lys-팔미토일 모이어티는 Lys4 또는 Asn5 위치에 도입될 수 있고, 또는 Phe 잔기는 할로겐화된 등가물인 클로로-Phe 잔기로 치환될 수 있다. 표 5에 요약된 바와 같이, 9개의 유사체가 합성되었으며 소마토스타틴 수용체에 대한 친화성이 분석되었다. 높은 결합 친화성에 대해 반대 효과를 주지 않는 변형이 서로간에 결합되었다. 이러한 2차 세대 유사체는 2-4 결합된 변형을 포함한다.
다음으로, N-말단 연장이 [D-Trp8] 소마토스타틴에 도입된다. 이러한 연장(BBB/PK 조절제, 도 8에 표시)은 두가지 목적을 제공한다: (1) 능동 및 수동 기작 모두에 의해 혈액-뇌장벽을 통한 투과성 증가 및 (2) 제거율을 감소시키고 단백 질 분해에 대한 저항성을 향상시키는 거대 모이어티를 첨가시킴으로서 뉴로펩타이드 약물의 약동학적 특성을 향상. 이러한 "BBB/PK 조절제"는 새로운 개념이기 때문에, 몇가지 구조적 모듈의 몇가지 조합이 연장물을 구성하기 위해 사용되었다. 표 6은 제안된 모듈의 구조 및 기능에 대한 정보를 제공한다.
Figure 112008055988995-PCT00003
DAB, 디아미노부티르산; DAP, 디아미노프로피오닉산; Lys-palm, Lys-팔미토일; Cl-Phe, 클로로-Phe.
BBB/PK 조절제를 합성하는데 사용된 모듈의 구조적 및 기능적 특징의 요약
모듈 구조 기능/설명
AHX 아미노헥사노익산 연장물의 중간에서 지방 친화성을 증가시킴으로써 막을 통한 수동 투과를 향상시킴. 수소 결합 공여자/수용자가 추가로 도입되지 않음
PerFHX 퍼플루오로헥사노익산 극소수성 "꼬리"로 N-말단을 캡핑함으로써 지방 친화성 증가. 이는 분자 길이 연장에 있어서의 유의적 증가 없이 소수성을 증가시키는 매우 효과적인 방법이다.
PEG-스페이서 8-아미노-3,6-디옥사옥타노익산 PEG계 스페이서를 이용한 연장물의 길이/크기의 증가:이는 유사체의 약리학적 특징을 향상시키는 결과를 나타냄
Phe Phe-[D-Phe] 영양물질의 능동 전달을 위한 인식 물질로서 Phe의 모방; 선택적으로 글리코실 모이어티도 도입될 수 있음
Oligo-(Lys) Lys-(D-Lys)-Lys-(D-Lys)-Lys-(D-Lys)-Lys 연장물의 염기성 증가:이는 막과의 정전기적 관계를 향상시킴.
모듈은 [D-Trp8] 소마토스타틴의 Ala1 잔기에 대한 연장물로서 고체상 합성 동안 도입될 수 있다. 표 7 및 도 11은 연장물을 요약한다.
소마토스타틴 유사체에서의 N-말단 연장 요약(사용된 약어는 표 6 참고)
유사체 # 모듈 3 모듈 2 모듈 1 유사체
EXT1 AHX-AHX [D-Trp8]SOM
EXT2 PerFHX [D-Trp8]SOM
EXT3 PEG-스페이서 [D-Trp8]SOM
EXT4 AHX-AHX PEG-스페이서 [D-Trp8]SOM
EXT5 PerFHX PEG-스페이서 [D-Trp8]SOM
EXT6 Oligo-(Lys) PEG-스페이서 [D-Trp8]SOM
EXT7 Phe AHX-AHX [D-Trp8]SOM
EXT8 Phe AHX [D-Trp8]SOM
EXT9 AHX-AHX Oligo-(Lys) PEG-스페이서 [D-Trp8]SOM
EXT10 Phe Oligo-(Lys) PEG-스페이서 [D-Trp8]SOM
처음으로, 10개의 유사체를 합성하고 소마토스타틴 수용체에 대한 결합 특성을 평가하였다. 높은-친화성 유사체는 혈액-뇌장벽 투과성 분석 모델을 통해 투과 특성에 대해 추가로 평가되었다.
일단 최적의 연장물이 선별되면, 이는 최적화된 곁사슬 치환을 이미 포함하는 소마토스타틴 유사체에 부착될 수 있다(표 5 참고). "연장 유사체"를 "곁사슬 치환 유사체"와 가장 적합하게 조합하는 것을 예측하기 힘들기 때문에, 매트릭스 시도가 사용되는데, 여기서는 각 선별된 유사체가 각 선별된 연장물로 합성된다. 9-12 유사체가 이 라운드에서 실현될 수 있다. 이러한 3차 세대 유사체는 3개의 시험관내 분석에서 모두 테스트될 수 있다: (1) 소마토스타틴 수용체에 대한 결합 분석, (2) 작용제 활성 분석, 및 (3) 혈액-뇌장벽 모델을 통한 투과 분석. 가장 유망한 유사체 중에 제한된 수가 생체내 생쥐 간질 모델에서 약제학적 테스트되기 위해 선별될 수 있다.
Figure 112008055988995-PCT00004
상기 표에서, 3개의 선별된 연장 구조는 3개의 선별된 "곁사슬 치환" 유사체와 결합된다.
소마토스타틴에 대해 상기에 기술된 것과 유사한 시도가 갈라닌 및 이의 유사체에 채택될 수 있다. 갈라닌은 30개 아미노산 뉴로펩타이드이지만, SAR 연구에서는 N-말단 부분이 전체길이 펩타이드에 비해 여전히 효율이 높은 작용제인 것으로 확인되었다(Langel and Bartfai, 1998). 갈라닌(1-16) 유사체는 본원에 개시된 방법으로 사용될 수 있는데 여기서 Gly1 잔기는 N-메틸-Gly(사코신, SAR)에 의해 치환되며, 다음과 같다:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro His Ala Val
Gly1의 N-메틸화는 N-말단으로부터 가속화되는 단백질 분해로부터 펩타이드를 보호하지만, 갈라닌 수용체에 대한 친화성에는 유의적인 변화를 주지 않는다(Rivera Baeza et al., 1994). SAR 연구에서는 다음의 잔기들이 생물학적 활성에 대해 결정적임을 확인하였다: Gly1, Trp2, Asn5, Tyr9 및 Gly12(Land et al., 1991). 이와 유사한 연구에서는 N-말단 연장이 생물학적 활성의 소실을 유발함을 확인하였다. 반대로, 갈라닌(1-16)의 C-말단은 더 큰 구조에 부착할때 매우 강력해지는 것으로 나타났다(Pooga et al., 1998). 따라서, [Sar1] 갈라닌 유사체를 다자인하기 위한 방법은 아미노산 치환과 관련하여 소마토스타틴에서만 사용된 방법과 유사하지만, N-말단 보다는 C-말단에서의 연장을 도입하는 것과는 다르다. 표 9는 아미노산 치환된 갈라닌 유사체를 요약한다.
Figure 112008055988995-PCT00005
(표 제목: [Sar1] 갈라닌 (1-16)의 각 잔기의 치환. 아미노산 코드는 표 5 참고)
C-말단 연장은 표 7에 보여지는 것과 동일할 수 있지만, His14 위치에 도입된다. 그리고 난 뒤 Lys14(Mmt) 잔기(4-메톡시트리틸 그룹으로 보호된 곁사슬)를 갖는 (Sar1) 갈라닌이 합성된다. 사코신을 결합하고 난 뒤, 펩타이드 레진은 디클로로메탄에 1% TFA가 든 용액으로 30분 동안 처리될 수 있다. Lys14 잔기의 곁사슬 아미노 그룹은 탈보호되고, 연장 모듈이 커플링된다. 곁사슬 치환 및 C-말단 연장된 3차 세대 유사체의 디자인은 소마토스타틴 유사체에 대해 기재된 것과 동일하다.
뉴로펩타이드의 화학적 합성. 펩타이드는 Fmoc-기초의 고체상 펩타이드 합성 프로토콜 및 자동 펩타이드 합성기를 이용해 합성된다. 커플링 방법 및 고체 기판(support)으로부터의 펩타이드의 제거는 잔과 화이트의 문헌에 기재된 바에 따라 수행된다(Chan and White, 2000). 펩타이드는 제제 K로 처리함으로써 고체 기판으로부터 제거될 수 있다. 세척 및 침전하고 난 뒤, 유사체는 역상 HPLC 분리 방법을 이용해 정제된다. 소마토스타틴 유사체에 있는 디설파이드 브릿지는 참고문헌에 기재된 방법(Chen et al., 2000)에 따라 정제된 펩타이드를 2% DMSO, 30% 아세틱산 용액, pH 7.0으로 반응시킴으로써 형성될 수 있다. 이 방법에 따르면 각 펩타이드 유사체는 최소한 수 밀리그램으로 생산될 수 있다.
뉴로펩타이드 유사체의 혈액-뇌장벽을 통한 투과성을 평가하기 위해, pION's PAMPA 방법이 이용될 수 있다. 이 방법에서는, 고정된 인공막을 가진 필터가 2가지 구성물인 수용체 및 공여자 사이에 위치한다. 유사체는 공여자 구성물에 위치할 수 있다. 적합한 시간 간격 뒤에, 공여자 및 수용체 구성물은 UV 분광기를 이용해 정량화된다.
소마토스타틴 및 갈라닌 결합 분석(비-선별적)은 Novascreen Biosciences Corporation에 의해 수행된다. 쥐의 전뇌 막 및 동위원소 표지된 부모(parent) 뉴로펩타이드가 이 분석에 사용된다. 유사체는 높은 친화성 및 낮은 친화성 유사체 사이를 구분하기 위해 단일 농도(1 μM)로 테스트하였다. 선별된 소마토스타틴과 갈라닌 유사체의 작용제 활성은 MDS-Pharma 서비스에서 제공되는 기능적 분석법을 이용해 추가로 테스트될 수 있다. 유사체는 단일 농도(1 μM)로 테스트될 수 있다.
항경련 테스트. 항경련 활성은 프링즈(Frings) AGS-민감성 생쥐 모델의 반사 발작에서 수행될 수 있다. AGS-민감성 생쥐는 맨처음의 개념 증명 연구를 위한 가장 이상적인 급성 발작 모델인데, 그 이유는 비-특이적이고, 광범위한 CNS 활성 화합물을 효과적으로 검출할 수 있기 때문이다(White et al., 1992). 프링즈 생쥐에서 활성인 것으로 확인된 펩타이드들은 최대 전기쇼크(maximal electroshock, MES) 및 피하(s.c.) 투여된 펜틸렌테트라졸(PTZ)에 의해 유도된 발작을 차단하는 능력에 대해 검증될 수 있다. 이 두가지 테스트는 항간질 화합물이 발작의 확산을 억제하고, 발작의 역치를 상승시키는 것에 대한 능력을 각각 평가한다(White et al., 2002). 일단 변형된 펩타이드는 이 세가지 발작 테스트 중 하나 이상에서 활성을 띄는 것으로 검증되었으며, 완벽한 용량-의존적 연구는 i.v. 투여되고 난 뒤에 최대 효과를 나타내는 미리 결정하여 수행하였다. 이러한 개념을 증명하는 연구로부터의 결과는 대뇌심실내(intracerebroventricular, i.c.v.) 투여뒤에 수행된 연구의 효과와 비교하였다. i.p. 용량-의존적 커브에서의 왼쪽 방향으로의 이동은, 혈액-뇌장벽의 더 큰 투과성이 실현된 것으로 관찰될 수 있다. 총괄하면, 이 세가지 발작 테스트로부터 얻어진 결과는, 전신 투여하고 난 뒤에 뇌로 훨씬 더 접근 가능한 작은 펩타이드를 만들기 위한 시도를 뒷받침할 수 있는 실질적인 데이터를 제공한다. 개별 발작 테스트 각각에 대한 상세한 설명은 아래와 같다.
뉴로펩타이드 유사체의 투여. 변형된 신경활성 펩타이드 각각은 10 ㎕ 해밀턴 주사기를 이용해 5 ㎕ 인공 대뇌척수액을 대뇌심실내(i.c.v)로 투여하거나, 0.5% 메틸셀룰로즈를 0.01 ml/g 체중 용량으로 정맥내(i.v.) 투여한다.
소리에 기인한 발작. AGS-민감성 프링즈 생쥐 모델에서 소리에 의해 유발되는 발작을 억제하기 위한 변형된 펩타이드 각각의 능력은 최대 효과 시간에서 측정될 수 있다(White et al., 1992). 이 테스트를 수행하기 위해, 각 생쥐를 오디오 변환기(Model AS-ZC; FET Research and Development, Salt Lake City, UT)가 장착된 플렉시글래스 실린더(직경, 15 cm; 높이, 18 cm)에 넣고 20초 동안 전달되는 110 데시벨(11 KHz)의 소리 자극에 노출시켰다. 소리-유발된 발작은 정상적으로 걷다가 앞발 및 뒷발에 강직성 신장(tonic extension)을 보이면서 바로서기 반사(righting reflex)가 소실되는 증상을 보였다. 뒷발 강직성 신장을 보이지 않는 생쥐는 억제된 것으로 간주하였다.
MES 테스트. MES 테스트를 하기 위해, 각막 전극을 배치하기 전에 각 동물의 눈에 마취제/전해질 용액(0.9% 식염수에 들어있는 0.5% 테트라카인 하이드로클로라이드) 방울이 적용될 수 있다. 생쥐 MES 테스트에서의 전기적 자극은 우디버리와 데이븐포트에 의해 원래 기재된 것(Woodbury and Davenport, 1952)과 유사한 장치에 의해 50 mA를 0.2초 동안 전달하였다. 발작의 뒷발 강직성 신장의 종료는 종료점으로 사용하였다.
최소 독성 테스트. 최소 독성은 로타로드(rotarod) 방법에 의해 생쥐에서 확인될 수 있다(Dunham and Miya, 1957). 생쥐가 6 rpm의 속도로 회전하는 1인치 마디 로드에 놓여있으면, 동물은 장시간 동안 평형을 유지할 수 있다. 동물이 1분의 시간 동안 이 회전 로드에서 3회 떨어지는 경우 독성이 있는 것으로 간주될 수 있다.
평균 유효량( ED 50 ) 또는 평균 독성 용량( TD 50 )의 결정. 생체 내에서의 모든 정량적 항경련/독성 연구는 이전에 결정한 TPE에서 수행된다. 100% 저해 또는 최소 독성과 0% 저해 또는 최소 독성의 제한 범위 내에서 최소한 2 포인트가 결정될때까지, 최소한 8마리의 생쥐 그룹이 다양한 투여량의 펩타이드로 테스트된다. 각 테스트에서 동물의 50%에서 바람직한 종료점을 유발하는데 필요한 약물의 용량(ED50 또는 TD50), 95% 신뢰 구간, 회귀선의 슬로프, 및 슬로프의 S.E.M.은 핀니에 의해 기술된 방법(Finney, 1971)을 기초로하여 컴퓨터 프로그램으로 계산된다.
소마토스타틴의 유사체는 표 10에 나타나 있다(모든 유사체는 2개의 시스테인 잔기 사이에서 형성된 디설파이드 브릿지를 가진다).
Figure 112008055988995-PCT00006
상기 표에서, (AHX)는 아미노헥사노익산, (Dab)는 디아미노부티르산, (Dap)는 디아미노프로피오닉산, (Tle)는 tert-류신, (Cl-Phe)는 4-클로로페닐알라닌, (NN3APG)는 N,N-비스(3-아미노프로필)글리신, (AHX)는 아미노헥사노익산, (Lys-P)는 Lys-팔미토일, Thr(ol)은 트레오니놀(threoninol), DK, DF, DW는 D-이성질체, PFHA는 2H, 2H, 3H, 3H-퍼플루오로헵타노익산, 그리고 ACPA는 8-아미노카프릴릭산이다.
갈라닌 및 소마토스타틴 이외의 것에 사용될 수 있는 다른 유사체 예도 있다. 예를 들어 델타-수면 유도 펩타이드(DSIP)가 있다:
DSIP-BBB8: (AHX)GGWAGGDASGE(서열번호 55). 추가적 DSIP 펩타이드는 표 31에서 확인할 수 있다.
2. 실시예 2: 항경련 갈라닌 유사체
갈라닌은 전체 길이 펩타이드와 비교해 효과가 높은 작용기인 N-말단 부분을 갖는 30개의 아미노산 뉴로펩타이드이다(Langel and Bartfai, 1998). 절단된 갈라닌(1-16) 유사체(아래)는 변형을 도입하는데 사용되어 혈액-뇌장벽을 통한 투과성을 향상시킨다.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro His Ala Val
생물학적 활성이 명확한 다음의 잔기들이 확인되었다: Gly1, Trp2, Asn5, Tyr9 및 Gly12(Land et al., 1991). N-말단 연장 또는 절단은 생물학적 활성의 소실을 유발한다. 반대로, 갈라닌(1-16)의 C-말단 부분은 절단되거나 더 큰 구조가 부착되더라도 매우 강력하다(Pooga et al., 1998).
이용가능한 구조-활성 관계 데이타를 기초로 하여, 2개의 펩타이드-기초 갈라닌 유사체가 디자인되고, 화학적으로 합성되며, 테스트되었다. 유사체 (GAL-BBB1 및 GAL-BBB2) 모두의 구조는 아래와 같다:
GAL-BBB1: Sar-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-His-(Lys-palm)-Tle-NH2
GAL-BBB2: Sar-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2
여기서 Sar은 사코신, Tle는 tert-류신, Lys-palm은 라이신 잔기가 엡실론 아미노 그룹을 통해 팔미토일 모이어티가 결합된 것이며 -NH2는 C-말단의 아미드화를 나타낸다. 펩타이드는 표준 Fmoc 화학을 이용해 고체 기판 상에서 합성되고 HPLC에 의해 정제된다. 그리고 난 뒤 정제된 유사체는 프링스 소리유도성-발작 민감성 간질 생쥐 모델에서 테스트된다. 이 연구로부터의 결과는 원래의 갈라닌 펩타이드 단편(1-16)과 비교된다.
다른 유사체는 다음을 포함한다:
GAL-BBB3: WTLNSAGYLLGPKKXK-NH2(서열번호 49)
GAL-BBB4: Sar-WTLNSAGYLLGP(D-Lys)(D-Lys)X(D-Lys)-NH2(서열번호 50)
GAL-BBB5: Sar-WTLNSAGYLLGPRRXR-NH2(서열번호 51)
GAL-BBB6: Sar-WTLNSAGYLLGPHHXH-NH2(서열번호 52)
GAL-BBB7: Sar-WTLNSAGYLLKKKKXK-NH2(서열번호 53)
GAL-BBB8: Sar-WTLNSAGYLLKKXK-NH2(서열번호 54)
여기서 Sar은 사코신이고 X는 Lys-팔미토일 잔기이다.
2개의 변형된 갈라닌 유사체(GAL-BBB1 및 GAL-BBB2)는 프링즈 소리유발성 발작 민감성 생쥐 그룹에 4 mg/kg 투여량으로 i.p.로 투여하였다. 투여후 다양한 시간에(즉 15, 30, 60, 120 및 240분) 생쥐 각각을 오디오 변환기가 장착된 실린더 테스트 챔버에 넣고, 고강도의 소리 자극(110 dB, 11KHz, 20초 동안)을 주었다. 강직성 뒷발 신장을 보이지 않는 동물은 억제된 것으로 간주하였다. 도 12에 요약된 바와 같이, 이 연구로부터 얻어진 결과는 GAL-BBB2가 시간-의존적 항경련 효과를 나타내고, 이러한 효과가 빨리 시작되고(30분 이내) 지속시간(2 내지 4시간)도 적당함을 증명해준다. 반대로 다른 변형된 갈라닌 유사체 GAL-BBB1은 테스트된 어떤 시점에서도 활성을 띄지 않고, 심지어는 12 mg/kg의 높은 투여량에도 그렇지 않았다. 그 이후의 연구에서, 항경련 효과는 투여량-의존 연구에서 최대 효과를 나타내는 시간(즉 1시간)에서 정량화하였다. 이 연구의 결과는 GAL-BBB2가 소리-유도된 발작에 대해 용량-의존적인 효과를 나타냄을 증명해준다. 용량 의존 데이터의 프로빗 분석으로부터 얻은 계산된 평균 유효량(즉, ED50) 및 95% 신뢰 구간은 3.2(2.3-6.1) mg/kg이었다. 원래 펩타이드 단편 GAL(1-16)은 20 mg/kg 용량을 i.p 투여하였을때 불활성이었다(GAL-BBB2의 ED50의 6배)(도 20).
갈라닌 유사체인 GAL-BBB2는 i.p로 투여되었을때 효과적인 항경련 활성(ED50~3 mg/kg)을 나타내었다. 훨씬 더 "약물-유사한" 유사체 상에서 원형을 나타내는 개념을 증명할 유사체가 디자인되었다. 가장 효과가 있고 장시간 지속하는 항경련 활성을 가진 가장 작은 갈라닌 유사체가 얻어졌다. 이는 2 단계를 필요로 한다: (1)항경련 활성을 유지하는 GAL-BBB2 유사체의 가장 작은 단편을 확인하는 단계: 이는 말단 및 중심 절단을 포함할 것임, (2) 유사체의 BBB 투과성을 추가로 향상시킬 C-말단 구조 모티프를 최적화하는 단계. 이 합성딘 유사체는 갈라닌 경쟁 결합 분석에서 첫번째로 선별된다. 1 μM 이하 농도에서 갈라닌을 치환하는 유사체들은 소리유발-발작 생쥐 간질 모델을 이용해 하영련 활성에 대해 추가로 스크리닝된다. 단일 투여량(즉, 2 mg/kg, i.p. 투여)에서 장시간 지속하는 항경련 활성을 나타내는 유사체들은 약동학적 분석에서 추가로 검증된다. 일반적인 실험적 방법은 도 13에 요약되어 있다. 도 23 및 24는 GAL-BBB2에 대한, 프링즈 생쥐에서의 시간-의존적 항경련 활성 및 프링즈 생쥐에서의 소리유도성 발작에 대한 용량 의존적 억제를 각각 보여준다.
제한된 구조-기능 관계 연구는, 전신 투여되었을때 항경련 활성을 유지하는 GAL-BB2 유사체의 최소 단편을 확인하기 위해 수행되었다. C-말단 및 중심 절단을 포함하는 갈라닌 유사체를 합성하고 테스트하였다. 추가로, C-말단 모티프의 제한된 구조-기능 관계 연구는 혈액-뇌장벽을 통한 유사체의 투과성을 최적화하기 위해 수행하였다. 도 14는 구조-기능 연구의 맥락에서 GAL-BBB2의 구조를 보여준다.
GAL-BBB2의 절단된 유사체를 만들기 위해, Pro13에서부터 Leu10 잔기까지 4개의 연속적 결실을 수행하였다(표 11에 요약됨). Tyr9는 갈라닌 활성에 있어서 핵심이기 때문에, 추가적인 C-말단 절단은 생물학적 활성의 완전하 소실을 유발할 수 있다(참고문헌 Land et al., Int J Pept Prot 1991). 각 절단된 유사체에서, C-말단 "-Lys-Lys-LysP-Lys"은 BBB를 통한 투과성을 향상시키기 위해 유지되었다.
Figure 112008055988995-PCT00007
(GLA-BBB2의 구조 및 절단된 유사체)
GAL-BBB2 유사체를 최소화하기 위해, 핵심 잔기 사이에서 중심 절단이 도입되었다. 이는 주어진 펩타이드의 길이를 손상시키지 않으면서, 간단화된 구조로 활성 펩타이드 유사체를 디자인하기 위한 대안이다. 골격 치환(즉 "골격 인공삽입물")은 2 이상의 보존적 "비-핵심" 잔기를 아미노밸러릭산 또는 아미노헥사노익산("골격 스페이서)과 같은 비-펩타이드 스페이서로 치환함으로써 달성된다. 이러한 개념은 도 15에 더 자세히 나타나 있다.
GAL-BB2 유사체의 경우, 펩타이드의 3부분은 골격 스페이서를 가진 잔기의 구조적 치환에 의해 증명되었다(표 11): Trp2와 Asn5 사이, Asn5와 Tyr9 사이 및 Tyr9과 C-말단 모티프 사이. 이러한 유사체 중 약 14개가 합성되고 갈라닌 수용체에 대한 결합이 테스트되었다. 만약 특정 유사체가 항경련 활성을 유지는 경우, 다른 위치에 2 이상의 스페이서가 도입될 수 있다(참고, 표 12에 있는 예).
Figure 112008055988995-PCT00008
(표 제목:GAL-BBB2 유사체에서의 "골격 인공삽입물 워크")
상기 표에서 아미노밸러릭산 또는 아미노헥사노익산과 같은 비-펩타이드 골격 스페이서를 이용한 2개 잔기의 치환은, 핵심 약물작용발생단 사이에 이는 스페이싱의 유의적인 변화 없이 전체적인 분자 크기를 최소화하는 결과를 나타내었다.
다음으로, C-말단 구조 모티프인 "-Lys-Lys-LysP-Lys-NH2"는 BBB 투과성을 향상시키기 위해 최적화될 수 있다. 초기 화합물인 GAL-BB2는 표 13에 요약된 구조적 변화의 도입에 의해 최적화될 수 있다. 호모-Lys, D-Lys 또는 디아미노부티르산을 이용한 Lys 잔기의 치환은, 곁사슬이 다양한 지방 친화성을 갖는 양전하 잔기의 BBB 투과성의 효율을 증명한다. 위치 16에 있는 Lys-팔미토일 모이어티를 2-아미노-테트라데카노익산 또는 3,3-디페닐알라닌으로 치환하는 것은, 이 위치가 BBB 투과성을 증가시킬 수 있는 다른 소수성 잔기에 대해 얼마나 유연한지를 증명해준다.
Figure 112008055988995-PCT00009
(표제목: BBB를 통한 갈라닌의 투과성을 향상시키는 C-말단 모티프의 변형)
상기 표에서 TDA는 2-아미노-테트라데카노익산, DAB는 디아미노부티르산, D-Lys은 Lys의 D-이성질체, h-Lys은 호모-Lys, DPA는 3,3-디페닐알라닌이다.
Figure 112008055988995-PCT00010
상기 유사체 리스트에 추가로, 지방 친화적이고 C-말단에 비-펩타이드 연장된 2개의 유사체도 제조될 수 있으며, 아래에 표시한 바와 같다:
여기서 X는 12-아미노-도데카노익산 또는 2-아미노-테트라데카노익산을 나타낸다.
도 13에 표시된 바와 같이, 각 합성되고 정제된 유사체는 갈라닌 수용체에 대한 이의 결합 특성에 대해 테스트된다. 1 μM 이하의 농도에서 전체길이 갈라닌을 치환하는 유사체만이 추가로 연구되었다. 갈라닌 결합 분석은 예를 들어 Novascreen Biosciences Corporation에 의해 수행될 수 있다. 쥐 전뇌 막 및 방사능 표지된 부모 뉴로펩타이드가 이 분석에 사용될 수 있다. 유사체는 높은 친화성 및 낮은 친화성의 유사체 간을 구분하기 위해 단일 농도(1 μM)에서 테스트될 수 있다. 선별된 갈라닌 유사체의 작용제 활성은 MDS-Pharma Service에 의해 제공되는 기능적 분석법을 이용해 추가로 테스트될 수 있다. 예를 들어, 유사체는 단일 농도(1 μM )에서 테스트될 수 있다.
하기 표는 다양한 SAR 유사체 및 4 mg/kg의 투여량으로 i.p. 투여하였을때의 1, 2 및 4시간째의 억제율을 보여준다.
NAX 구조 4 mg/kg 용량 복강내 투입에 의해 얻어지는 1, 2 및 4시간째의 억제율
Gal(1-16) GWTLNSAGYLLGPHAV (서열번호 1) 비반응성
5055 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)K (서열번호 56) 100%, 100%, 0%(0.8 mg/kg)
서브타입 선별성
1205-1 WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)K (서열번호 57) 50%, 50%, 0%*(5.7 mg/kg)
"KKKpK" 모티프
1205-2 (Sar)WTLNSAGYLLGPDKDK(Lys-P)DK (서열번호 50) 100%, 50%, 75%(1.2 mg/kg)
1205-3 (Sar)WTLNSAGYLLGPRRR(Lys-P)R (서열번호 59) 100%, 75%, 0%
1205-4 (Sar)WTLNSAGYLLKKKK(Lys-P)K (서열번호 60) 75%, 100%, 66%, *
1105-2 (Sar)WTLNSAGYLLGPKKKK (서열번호 61) 30%, 0%, 0%(3.7 mg/kg)
절단
1205-5 (Sar)WTLNSAGYLLKK(Lys-P)K (서열번호 62) 100%, 25%, 0%(2.8 mg/kg)
306-3 (Sar)WTLNSAGYKK(Lys-P)K (서열번호 63) 75%, 25%, 0%(2.7 mg/kg)
골격 스페이서
306-2 (Sar)WTLNSAGYLLGP(Ahx)KK(Lys-P)K (서열번호 64) 100%, 75%, 0%, *
306-4 (Sar)WTLNSAGY(Ahx)KK(Lys-P)K (서열번호 65) 50%, 0%, 0%(2.95 mg/kg)
항경련 활성은 프링즈 AGS-민감성 생쥐 반사적 간질 모델에서 먼저 확인될 수 있다. AGS-민감성 생쥐는 비-특이적이며, 광범위한 CNS 활성 화합물을 효과적으로 검출할 수 있기 때문에 이상적인 급성 발작 모델이다(White et al., 1992). 프링즈 생쥐에서 활성인 것으로 확인된 펩타이드들은 최대 전기쇼크(MES) 및 피하(s.c.) 투여된 펜틸렌테트라졸(PTZ)에 의해 유도된 발작을 차단하는 능력에 대해 검증될 수 있다. 이 두가지 테스트는 항간질 화합물이 발작의 확산을 억제하고, 발작의 역치를 상승시키는 것에 대한 능력을 각각 평가한다(White et al., 2002). 일단 변형된 펩타이드는 이 세가지 발작 테스트 중 하나 이상에서 활성을 띄는 것으로 검증되었으며, 완벽한 용량-의존적 연구는 i.v. 투여되고 난 뒤에 최대 효과를 나타내는 시간을 미리 결정하여 수행하였다. 이러한 개념을 증명하는 연구로부터의 결과는 대뇌심실내(intracerebroventricular, i.c.v.) 투여뒤에 수행된 연구의 효과와 비교하였다. i.p. 용량-의존적 커브에서의 왼쪽 방향으로의 이동은, 혈액-뇌장벽의 더 큰 투과성이 실현된 것으로 관찰될 수 있다. 요약하면, 이 세가지 발작 테스트로부터 얻어진 결과는, 전신 투여하고 난 뒤에 뇌로 훨씬 더 접근 가능한 작은 펩타이드를 만들기 위한 시도를 뒷받침할 수 있는 실질적인 데이터를 제공한다. 개별 발작 테스트 각각에 대한 상세한 설명은 아래와 같다.
뉴로펩타이드 유사체의 투여. 변형된 갈라닌 유사체 각각은 10 ㎕ 해밀턴 주사기를 이용해 5 ㎕ 인공 대뇌척수액을 대뇌심실내(i.c.v)로 투여하거나, 0.5% 메틸셀룰로즈를 0.01 ml/g 체중 용량으로 정맥내(i.v.) 투여하였다.
소리에 기인한 발작. AGS-민감성 프링즈 생쥐 모델에서 소리에 의해 유발되는 발작을 억제하기 위한 변형된 유사체 각각의 능력은 최대 효과 시간에서 측정될 수 있다(White et al., 1992). 이 테스트를 수행하기 위해, 각 생쥐를 오디오 변환기(Model AS-ZC; FET Research and Development, Salt Lake City, UT)가 장착된 플렉시글래스 실린더(직경, 15 cm; 높이, 18 cm)에 넣고 20초 동안 전달되는 110 데시벨(11 KHz)의 소리 자극에 노출시켰다. 소리-유발된 발작은 정상적으로 걷다가 앞발 및 뒷발에 강직성 신장(tonic extension)이 소실되는 것을 특징으로 한다. 뒷발 강직성 신장을 보이지 않는 생쥐는 억제된 것으로 간주하였다.
MES 테스트. MES 테스트를 하기 위해, 각막 전극을 배치하기 전에 각 동물의 눈에 마취제/전해질 용액(0.9% 식염수에 들어있는 0.5% 테트라카인 하이드로클로라이드) 방울이 적용될 수 있다. 생쥐 MES 테스트에서의 전기적 자극은 우디버리와 데이븐포트에 의해 원래 기재된 것(Woodbury and Davenport, 1952)과 유사한 장치에 의해 50 mA를 0.2초 동안 전달하였다. 발작의 뒷발 강직성 신장의 종료는 종료점으로 사용하였다.
s.c. PTZ 테스트. s.c. PTZ 테스트를 하기 위해, 85 mg/kg 용량의 PTZ를 각 생쥐의 등 피부의 이완된 주름(loose fold)에 s.c.로 투여하였다. 생쥐를 각각의 플렉시글래스 관찰 상자에 넣어 최소 간헐 발작을 확인하기 위해 30분 동안 관찰하였다. 간헐 발작 활성을 나타내지 않는 생쥐는 억제된 것으로 간주하였다.
최소 독성 테스트. 최소 독성은 로타로드(rotarod) 방법에 의해 생쥐에서 확인될 수 있다(Dunham and Miya, 1957). 생쥐가 6 rpm의 속도로 회전하는 1인치 마디 로드에 놓여있으면, 이 동물은 장시간 동안 평형을 유지할 수 있다. 동물이 1분의 시간 동안 이 회전 로드로부터 3회 떨어지는 경우 독성이 있는 것으로 간주하였다.
평균 유효량( ED 50 ) 또는 평균 독성 용량( TD 50 )의 결정. 생체 내에서의 모든 정량적 항경련/독성 연구는 이전에 결정한 TPE에서 수행된다. 100% 저해 또는 최소 독성과 0% 저해 또는 최소 독성의 제한 범위 내에서 최소한 2 포인트가 결정될때까지, 최소한 8마리의 생쥐 그룹이 다양한 투여량의 펩타이드로 테스트된다. 각 테스트에서 동물의 50%에서 바람직한 종료점을 유발하는데 필요한 약물의 용량(ED50 또는 TD50), 95% 신뢰 구간, 회귀선의 슬로프, 및 슬로프의 S.E.M.은 핀니에 의해 기술된 방법(Finney, 1971)을 기초로 하여 컴퓨터 프로그램으로 계산된다.
3. 실시예 3: 효과적인 통증 완화 효과를 가지는 GAL - BBB2
a) 포르말린 테스트
0.5% 포르말린을 생쥐의 오른쪽 발바닥의 평편한 부위에 주입하였다. 이는 생쥐가 주입된 발바닥을 핥음으로써 특징화된 명백한 이상 행동 프로파일을 도출해낸다. 주입하고 난 바로 뒤에, 생쥐는 약 10분 동안 발바닥을 핥았다. 이는 단계 1(급성)이며, 그리고 난 뒤 매우 적은 행동 활성을 보이는 명백한 잠복기 기간이 있었다. 발바닥을 핥는 약 20 내지 30분의 더 지연된 기간의 결과 구성 단계 2(염증성)가 나타났다.
활성 펩타이드, 약물 또는 매개물을 투여하기 전에, 각 생쥐는 거울 앞에 놓여져 있는 몇개의 6" 플렉시글래스 관찰 튜브(4" 직경) 중의 하나에서 15분의 조절 기간을 가졌다. 조절 기간 뒤에, 생쥐에게 GAL-BBB2, 비활성의 원래 단편 GAL 1-16 또는 가바펜틴을 i.p.로 투여한 뒤 상기 튜브에 되돌려 주었다. 처리후 1시간 뒤에, 오른쪽 뒷발의 평편한 표면에 포르말린을 피하(20 ㎕; 27 게이지 주사바늘)로 주입하였다. 주사바늘의 경사면을 피부 표면쪽에 대해 아래로 향하게 하였다. 포르말린을 주입하고 난 두, 각 동물들을 전체 45분 동안 각 5분 마다 처음 2분씩 관찰하였다. 각 2분의 기간 동안 핥기의 누적 길이를 측정하였다. 필수량의 매개물을 투여받는 동물은 GAL-BBB2, Gal 1-16 또는 가바펜틴을 투여받은 각 생쥐와 교대로 하였다. 시험이 종료되고 난 뒤 동물을 마취하였다.
추가의 실험에서(하기 표), 독특한 구조적 모티프를 갖는 2개의 추가적인 갈라닌 유사체(즉, NAX 306-3 및 306-4) 뿐만 아니라 NAX 5055도 생쥐의 염증성 통증 포르말린 분석에서 효과가 있는 것으로 확인되었다. 이러한 확인은 활성 약물작용발생단이 구조적 변형에 따른다는 것을 보여준다.
NAX 활성 농도
5055 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)K (서열번호 56) 5 mg/kg("편평 단계 II")
306-3 (Sar)WTLNSAGYKK(Lys-P)K (서열번호 66) 2.7 mg/kg("편평 단계 II")
306-4 (Sar)WTLNSAGY(Ahx)KK(Lys-P)K (서열번호 67) 2.9 mg/kg("편평 단계 II")
커브 아래 부피(Area under the curve, AUC) 측정은 GraphPad Prism Version 3.03을 이용해 수행하였다. 전체 AUC는 급성 및 염증성 단계 모두에 대해 테스트 그룹과 대조군 그룹 모두에서 계산하였다. 각 단계의 각 동물에 대한 AUC도 계산하였으며 대조군에 대한 전체 AUC의 퍼센트로 전환하였다. 약물 처리군 및 대조군 모두에 대해 평균 퍼센트 및 SEM을 계산하고 유의적 차이를 테스트하였다.
b) 좌골 신경의 연결
수술하기 바로 전에, 장시간 작용하는 아편 유사체인 부프레노르핀(buprenorphine)을 0.1 내지 0.5 mg/kg 용량으로 쥐에게 피하 투여하였다. 그리고 난 뒤, 펜토바비탈로 쥐를 마취시키고, 꼬리 꼬집기에 대한 반응을 모니터하고 호흡의 깊이를 관찰함으로써 마취의 깊이를 테스트하였다.
각 쥐의 넓적다리 위를 면도한 뒤 에탄올과 베타인으로 닦아내었다. 좌골 신경이 노출될때까지 넓적다리 윗부분의 피부에서부터 근육까지를 작게 절단하였다. 그리고 난 뒤 둘러싸는 연결 조직으로부터 신경을 분리하여 미세하고, 굴국이 있는 집게 쌍으로 조심스럽게 들어올렸다. 나일론 실(7.0)이 연결된 바늘을 신경에 통과시킴으로써 신경의 약 1/3 내지 1/2을 묶었다. 그리고 난 뒤 절단된 근육 및 피부를 5.0 봉합사로 봉합하고. 이 동물들을 마취로부터 회복될때까지 자동온도조절되는 단열재에 놓아 따뜻하게 유지시켰다. 이러한 과정은 오른쪽 부분(ipsilateral)에서 수행되었는데 왼쪽 뒷발(contralateral)에도 동일한 수술을 수행하였다. 후자는 왼쪽 부분에 있는 좌골 신경이 노출만 되고 연결되지 않은 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하였다. 수술후 12시간 뒤에, 2번째로 부프레노르핀을 투여하여 수술 과정으로부터의 모든 불쾌함을 최소화하였다. 그리고 난 뒤 쥐는 주입에 의한 발생 또는 수술에 대한 부작용에 대해 매일마다 엄격하게 모니터하였다.
회복하기에 적당한 시간 뒤에(약 7-14일), 동물들은 물리적 이질통증(비-유해 자극에 대한 통증 반응)의 발생에 대해 테스트되었다. 이 연구를 위해, 와이어 메쉬(1/4") 플랫폼에 놓여져 있는 밑바닥이 없는 플렉시글래스 박스에 동물을 놓아두었다. 30-60분의 순응기간 뒤에, 기저 상태(baeline) 물리적 민감성을 측정하였다. 이 과정은 조정된 Von Frey 섬유를 뒷발 각각의 편평한 표면에 수직으로 놓고, 상기 섬유를 미세하게 구부리기에 충분한 힘으로 약 6초 동안 이를 잡고 있었다. 양성 반응(발을 뒤로 빼기) 후에 더 작은 직경의 섬유를 적용하였다. 이러한 과정은 발을 뒤로 빼는 것에 대한 역치가 50% 역치에 도달하는 것으로 측정될때 까지 반복하였다.
2 mg/kg의 GAL-BB2를 i.p. 주입하고 난 뒤(n=약물당 8마리 생쥐), 물리적 역치를 주입후 30분과 그 이후 다양한 시간(예, 1, 2, 4 및 6시간)에 측정하여 테스트 화합물의 작용 지속시간을 결정하였다. GAL-BBB2로 얻어진 결과는 2 mg/kg 몰핀 및 40 mg/kg 가바펜틴에서 얻어진 결과와 비교하였다.
c) 결과
많은 항경련제는 통증의 치료에 효과가 있는 것으로 증명되었다. 따라서, GAL-BBB2가 진통 효과를 가지는지 확인하기 위해 생쥐 포르말린 모델에서 실험하였다. 이 실험에서, GAL-BBB2는 동물이 같은쪽 발바닥을 핥는데 소요되는 시간을 정량화함으로써 예측된 것처럼, 포르말린을 s.c.로 편평한 부위에 주입했을때 통증을 유의적으로 감소시키는 것으로 확인되었다. 도 16에서 보는 바와 같이, GAL-BBB2(0.52-5 mg/kg)는 초기 급성 단계 뿐만 아니라 지연된 염증상 단계 모두에서 발바닥 핥기에 있어서 용량-의존적 감소를 유발하였다. 반대로, 비-변형된 원래 단편인 Gal 1-16은 GAL-BBB2에서 테스트된 가장 높은 용량(즉 20 mg/kg) 보다 4배 더 높은 용량으로 i.p. 투여한 뒤에도 불활성인 것으로 확인되었다. 또한, 5 mg/kg GAL-BBB2(도 16)는 10 mg/kg 용량의 가바펜틴(도 7)과 등가의 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
도 18에서 보는 바와 같이, GAL-BBB2는 만성 통증의 좌골 연결 모델에서 물리적 이질통증에 대한 역치가 시간-의존적으로 증가함으로 보여준다. 또한, 이 테스트에서 GAL-BBB2는 몰핀과는 등가의 효과를 나타내고 가바펜틴 보다는 몇배 더 효과가 있었다(도 18).
결론적으로, 통증에 대한 이 2가지 정립된 모델에서 얻어진 결과에서는 GAL-BBB2가 설치류의 만성 통증 모델에서 효과적으로 통증을 완화함을 보여준다.
실시예 4: 혈액- 뇌장벽을 투과하는 갈라닌 유사체
표 16은 갈라닌 유사체가 본원에 기술된 조성물과 방법에 사용될 수 있음을 보여준다.
(Sar)WTLNSAGY(D-Lys)(D-Lys)(Lys-P)(D-Lys) (서열번호 119) Gal-BBB25
(Sar)WTLNSAGY(Ahx)(D-Lys)(D-Lys)(Lys-P)(D-Lys) (서열번호 120) Gal-BBB26
(Sar)WTLNSAGY(7-Ahp)(D-Lys)(D-Lys)(Lys-P)(D-Lys) (서열번호 121) Gal-BBB27
(Sar)WTLNSAGY(3,5-dibromo-Tyr)LLGPKK(Lys-P)K (서열번호 122) Gal-BBB28
(Sar)WTLNSAGYLLGPHH(Lys-P)K (서열번호 123) Gal-BBB29
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Cys-Mmt)K (서열번호 124) Gal-BBB30
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-Biotin-aminocaproyl)K (서열번호 125) Gal-BBB31
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-sterol)K (서열번호 126) Gal-BBB32
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-decanoyl)K (서열번호 127) Gal-BBB33
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-octanol)K (서열번호 128) Gal-BBB34
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-linoyl)K (서열번호 129) Gal-BBB35
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Ser-melbiose)K (서열번호 130) Gal-BBB36
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-adamentoyl)K (서열번호 131) Gal-BBB37
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Glu(β-Lac-PEG3-amine))K (서열번호 132) Gal-BBB38
(Sar)WTLTSAGYLLGPKK(Lys-palmitoyl)K (서열번호 133) Gal-BBB39
(Sar)WTLLSAGYLLGPKK(Lys-palmitoyl)K (서열번호 134) Gal-BBB40
(Sar)WTLDSAGYLLGPKK(Lys-palmitoyl)K (서열번호 135) Gal-BBB41
지방친화성과 염기성은 특정 전달자 또는 담체 필요없이 BBB를 통과하는 펩타이드의 증가된 투과성을 제공한다. 펩타이드의 지방친화성 특징(logP 값에 의해 측정됨)은 소수성 모이어티(예, 리포아미노산)의 결합 또는 방향족 잔기의 할로겐화에 의해 변화될 수 있다. 염기성에 관해, 포듀슬로 그룹은 폴리아민-변형된 단백질과 펩타이드가 BBB를 더 효과적으로 통과함을 보여주었다(Poduslo and Curran 1996; Poduslo and Curran 1996; Poduslo, Curran et al., 1998; Poduslo, Curran et al., 1999). 타메이와 그의 동업자는(Tamai, Sai et al., 1997) 작은 펩타이드의 증가된 염기성은 흡착-매개 세포내이입(adsorptive-mediated endocytosis, AME)을 통한 BBB의 통과의 중요한 결정인자임을 증명하였다.
글리코실화는 전신-활성의 아편 유사체 펩타이드를 제조하기 위한 매우 효과적인 시도인 것으로 확인되었다(Elmagbari, Egleton et al. 2004; Polt, Dhanasekaran et al., 2005). SAR 연구에서는 사카라이드의 구조가 활성을 결정하는 중요한 인자이지만, 모노사카라이드는 일반적으로 디사카라이드에 비해 덜 효과적임을 보여주었다. 베타-멜리바이오스(beta-melibiois) 또는 베타-락토스를 갖는 O-글리코실화된 세린은 효과있는 진통 화합물을 만들어내는 가장 효과적인 변형에 속한다.
간질과 간질발생에 있어서 갈라닌과 이의 수용체의 역할. 뉴로펩타이드는 기본적 신경전달물질과 신경 흥분의 효과적 조절제이다(Hokfelt, Broberger et al., 2000). 기본 신경전달물질과 뉴로펩타이드의 공존-선택적으로는 신경 흥분능을 포함하는 신경 집단과 공존-은 펩타이드성 전달의 변형을 통해 조절될 수 있다(Baraban and Tallent 2004). 대기 조건하에서, 펩타이드는 "침묵"하며 정상 신경전달에 미약한 영향을 준다. 반대로, 과다하게 높은 신경 발사 조건하에서는(발작 부위에서 일어나는 것과 같음), 뉴로펩타이드가 분비되고 신경전달에 있어서 조절의 영향을 준다.
갈라닌은 뇌에 복합적인 영향을 준다(Hokfelt, Xu et al., 1998; Lundstrom, Elmquist et al., 2005). 3개의 갈라닌 수용체 아형은 G 단백질 결합된 수용체(GPCR)의 상과(superfamily)에 속하는 것으로 확인되었다(Branch다 Smith et al., 2000; Lundstrom, Elmquist et al., 2005). 갈라닌 수용체 타입 1(GalR1)은 많은 뇌 부위에 존재하지만, 해마에서 가장 높은 발현을 보인다(Burgevin, Loquet et al., 1995). 갈라닌 수용체 타입 2(GalR2)는 GalR1과 같이 광범위하게 분포한다. 뇌에서 이는 시상하부, 해마(치아이랑(dentate gyrus)>CA3>CA1), 편도, 조롱박 겉질(piriform cortex), 기저 전뇌(중간 중격/대각섬유줄), 소뇌 및 뇌줄기에서 발현한다. 갈라닌 수용체 타입 3(GalR3)은 뇌에서 아주 제한된 발현을 한다. 이는 시상하부, 안쪽 그물체(medial reticular formation) 및 대각섬유줄에 가장 풍부하며, 해마에는 존재하지 않는다.
마자라티와 그의 동업자의 선구적 연구(Mazarati, Halaszi et al., 1992)에서는, 갈라닌이 효과적인 항경련 펩타이드라는 증거가 많이 제시되었다. 해마에서의 갈라닌 수용체 작용제의 투여 또는 갈라닌의 바이러스-매개 과발현은 쥐와 생쥐에서 변연계 경련중첩증을 나타내고, 펜틸렌테트라졸 및 피크로톡신 발작을 나타내는 것으로 확인되었다(Mazarati, Halaszi et al., 1992; Mazarati, Liu et al., 1998; Saar, Mazarati et al., 2002; Haberman, Samulski et al., 2003; Lin, Richichi et al., 2003; Bartfai, Lu et al., 204). 더불어, 갈라닌 과발현 형질전환 동물에서의 발작 역치는 경련중첩증 및 점화현상 모델에서 증가하였다(Mazarati, Hohmann et al., 2000; Kokaia, Holmberg et al., 2001; Schlifke Kuteeva et al., 2006).
시험관 내에서, 갈라닌은 해마로부터 글루타메이트가 분비되는 것을 억제한다(Zini, Roisin et al., 1993; Mazarati, Hohmann et al., 2000). GalR1 넉아웃 생쥐 및 쥐를 GalR2 펩타이드 핵산 안티센스로 처리한 연구로부터 얻어진 결과에서는 갈라닌이 그의 항경련 효과를 GalR1 및 GalR2 모두의 작용에 영향을 줌을 제시해 준다(Mazarati, Lu et al., 2004; Mazarati, Lu et al., 2004). 더불어, GalR2는 해마 뉴런에 있는 갈라닌의 신경보호적 효과에 있어서 중요한 기능을 하는 것으로 간주되었다(Haberman et al, 2003; Mazarati et al., 2004a; Pirondi et al., 2005; Elliot-Hunt et al., 2004; Lee et al., 2005; Hwang et al., 2004).
갈라닌이 급성 발작의 발현을 억제하고, 다양한 손상후에 오는 간질의 발생을 조절시키는데 효과적임이 강조되어야 한다. 예를 들어, 많은 논문에서는 갈라닌이 변연계 발작과 연관된 손상을 조절할 수 있고 간질의 발생을 억제 또는 지연(즉, 항간질발생적)시킬 수 있음을 보여주었다. 코카이아 등의 문헌(Kokaia, Holmberg et al., 2001)에서는 갈라닌 펩타이드 과발현 생쥐에서 점화현상이 지연됨을 보고하였다. 빠른 점화현상 모델의 최근 연구로부터의 결과는 Gi /0 단백질에 결합한 해마 GalR2가 GIRK와는 상관없이 항간질발생적 효과를 나타내지만, GalR2는 GIRK 활성에 의한 점화현상의 수득을 지연시켰다(Mazarati, Lundstrom et al., 2006).
갈라닌 및 갈라닌 수용체 리간드에서의 구조-활성-관계(structure-activity-relationships, SAR).
갈라닌은 1983년에 처음 발견되었다(Tatemoto, Rokaeus et al. 1983). 이는 하기 서열을 가지는 29-30개의 긴 아미노산 펩타이드이다.
인간 GWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS-COOH (서열번호 93)
쥐/생쥐 GWTLNSAGYLLGPHAIDNHRSFSDKHGLT-NH2 (서열번호 94)
돼지 GWTLNSAGYLLGPHAIDNHRSFHDKYGLA-NH2 (서열번호 95)
첫번째 N-말단의 14개 잔기(음영표시)는 다른 동물 종의 갈라니 서열 중에 가장 보존적이었다(Langel and Bartfai 1998). 갈라닌의 구조-활성-관계가 광범위하게 연구되었기 때문에, 본 발명자는 이들 SAR 만을 연구할 것이며, 이 연구 결과가 이 등록된 출원에 관련된 것이다. 첫번째 15개 잔기(유사체 GAL(1-15)) 또는 16개 잔기(유사체 GAL(1-16))로 구성되는 GAL의 N-말단 단편은 갈라닌 수용체에 대해 매우 높은 친화성을 유지하는 것으로 밝혀졌다(Fisone, Berthold et al., 1989; Land, Langel et al., 1991). 하기 표에서 보는 바와 같이, GAL(1-16)의 계획적 절단은 이의 수용체에 대한 친화성을 점진적으로 감소시키는 결과를 보인다(Land, Langel et al., 1991).
GAL(1-16) 단편의 절단이 갈라닌 수용체에 대한 친화성에 미치는 영향
단편 서열 KD[μM]
1-16 GWTLNSAGYLLGPHAI (서열번호 96) 0.0007
1-14 GWTLNSAGYLLGPHA (서열번호 97) 0.15
1-12 GWTLNSAGYLLG (서열번호 98) 3
1-10 GWTLNSAGYL (서열번호 99) 25
1-9 GWTLNSAGY (서열번호 100) 100
이와 동일한 연구에서, 저자는 Gly1, Trp2, Asn5, Tyr9 및 Gly12 잔기가 갈라닌 수용체에 대한 GAL(1-16)의 높은 결합 친화성에 있어서 중요함을 증명하였다. GAL(1-16)의 알라닌-워크(alanine-walk) 유사체는, 이들 잔기의 치환이 GalR1 보다는 RalR2에 대한 친화성에 영향을 주는 것으로 확인되었다(Carpenter, Schmidt et al., 1999). 알라닌-쉐이빙(alanine-shaving) 시도에서는 Tyr9에서부터 His14까지의 서열이 갈라닌 수용체를 인식하는데 있어서 핵심임을 보여주었다(Jureus, Langel et al., 1997).
GAL(1-16) 유사체에 대한 매우 광범위한 SAR 연구가 수행되었다(Pooga, Jureus et al., 19980. Gly1 또는 Trp2의 변형은 갈라닌 수용체에 대한 친화력을 유의적으로 소실시켰다. 크기가 다양한 다른 그룹과 연결된 Lys14 엡실론-NH 그룹을 가지는 모든 GAL(1-13) 유사체는 높은 친화성을 유지하였다. 이 결과를 기초로 하면, GAL(1-1)의 C 말단은 결합 특성에 영향을 주지 않으면서 상대적으로 큰 그룹을 수용할 수 있다. 요약하자면, 갈라닌과 이의 절단된 유사체의 SAR은 Trp2, Asn5 및 Tyr9가 갈라닌과 GalR1 및 GalR2 수용체 간의 관계를 저해하기 위한 핵심 잔기임을 보여준다. 돌연변이 유발 및 모델링 연구에서는 Trp2가 hGalR1의 Phe282와 상호작용하지만, Tyr9는 His264와 상호작용하지 않음을 보여준다(Kask et al., 1996; Berthold et al., 1997; Church et al., 2002).
광범위한 구조-활성 관계 연구의 결과로서, 펩타이드-기초 갈라닌 유사체인 작용제와 대항제 모두가 합성되었으며 기능적으로 특징분석되었다. 선별된 갈라닌 수용체 리간드의 결합 특성은 표 18에 요약되어 있다.
선별된 갈라닌 수용체 리간드 및 다른 갈라닌 수용체 서브타입에 대한 겨합 특성
리간드 친화도a, KD[nM]
hGalR1 hGalR2 hGalR3
작용제
hGAL(1-29) 9.4 8.6 7.1
GAL(1-16) 8.5 8.3 6.5
GAL(2-11) 879 1.8 미검출
혈액 뇌장벽을 통과하는 작용제
갈논 12,000 24,000 미검출
갈믹 34,000 >100,000 미검출
유사체 5055b ~9 ~6 미검출
대항제
M35 0.1 2 15
M15(갈란티드) 0.3 1 40
상기 표에서 aKD 값은 다음의 문헌에 따른다(Branchek Smith et al., 2000; Lundsrom, Elmquist et al., 2005; Lundstrom, Sollenberg et al., 2005; Sollenberg, Lundstrom et al., 20060. 갈논 및 갈믹은 2개의 비-펩타이드 갈라닌 수용체 작용제로서, CNS에 있는 갈라닌 수용체의 효과를 연구하기 위해 매우 유용한 약동학적 수단이다(Saar, Mazarati et al., 2002; Bartfai, Lu et al., 2004; Badie-Mahdavi, Behrens et al., 2005; Lu, Barr et al., 2005; Schlifke, Kuteeva et al., 2006). 그러나, 최근에는 다음과 같이 설명된다:"갈논 및 갈믹의 약점은 낮은 친화성( 마이크로몰 농도의 친화성), 비-수용체 서브타입 선별성을 갖고 다른 약제학적으로 중요한 표적과 작용을 한다는 것이다"(Lu, Lundstrom et al., 2005).
BBB 를 통과하는 갈라닌 유사체로서, NAX 5055의 이론적 디자인 및 화학적 합성. 본원에 기재된 바와 같이, 갈라닌은 30개의 아미노산 뉴로펩타이드이며, N-말단 단편 GAL(1-16)은 해마 갈라닌 수용체에 대해 여전히 높은 효율의 작용제임이 증명되었다(Fisone, Berthold et al., 1989). 여기서 얻어진 결과는 대사적 안정성을 증가시키고 BBB를 통한 투과성을 향상시키기 위해 변형된, 절단된 GAL(1-16) 유사체(도 31)에 의해 얻어졌다.
이용가능한 구조-활성 관계 데이터를 기초로 하여, 대사적 안정성과 BBB를 통한 투과성을 향상시키기 위해 GAL(1-16)에 다음의 변형이 도입되었다: (1) Gly1 잔기는 사코신으로 치환되었다. Gly1의 N-메틸화는 갈라닌 수용체 친화성에 영향을 주지 않았다(Rivera Baeza, Kask et al., 1994). 더불어, 아미노펩티다아제 N은 뉴로펩타이드를 분해하며, N-말단 아미노 그룹의 캡핑이 사코신-포함 유사체의 대사적 분해를 감소시키는 것으로 알려져 있다; (2) His14 및 Ala15는 Lys 잔기에 의해 치환되었다. 아미드화된 Lys 잔기는 C-말단에 도입되었다. 이 부가적 양전하는 흡착-매개 세포내이입을 통해 유도된 BBB 투과성을 증가시킨다(Tamai, Sai et al., 1997); (3) Val16은 라이신-팔미토일(Lys-palm) 잔기에 의해 치환되었다. 이 긴 소수성은 수동 확산을 증가시키고, 대사적 분해에 대해 추가적인 저항성을 제공할 수 있다(Yuan, Wang et al., 2005). NAX 5055는 표준 Fmoc 프로토콜 및 자동 펩타이드 합성기를 이용해 고체 기판 상에서 화학적으로 합성되었다.
NAX 5055의 약제학적 특성. 현재까지, NAX 5055는 방사능리간드 결합 분석 및 생체내 급성 발작 테스트의 배터리에서 평가되었다. 이 연구로부터 얻어진 결과에서는 본원에 개시된 시도가 BBB를 투과하는 갈라닌 수용체 조절제가 효과가 있고, 높은 친화성을 가질수 있음을 보여준다.
GalR1 및 GalR2 에 대해 높은 친화성을 가지는 NAX 5055. 인간 hGalR1 및 hGalR2에 대한 NAX 5055의 친화성은 MDS-PS contract screening company에 의해 수행된 예비 방사능리간드 결합 연구(레포트 #:1077561, 참조: DMSPS 231510 및 23600)에서 확인되었다. 이 연구에서, hGalR1은 HEK-293 세포에서 발현되었지만, hGalR2는 CHO-K1 세포에서 발현되었고, 인간 [125I]갈라닌이 방사능리간드로서 사용되었다. NAX 5055는 서브타입 모두에 대해 높은 친화성을 유지하였다-예측된 Ki는 hGalR1에 대해 9 nM, hGalR2에 대해 6 nM.
전신투여후 효과적인 항경련 활성을 나타내는 NAX 5055. NAX 5055는 프링즈 소리유도성 발작(AGS)-민감성 반사적 간질 동물 모델에 4 mg/kg을 i.p. 투여함으로써 먼저 테스트되었다. 투여후 다양한 시간(즉, 15, 30, 60, 120 및 240분)에 각 생쥐를 오디오 변환기가 장착된 실린더 테스트 챔버에 놓아 높은 강도의 소리 자극(110 dB, 11 kHz, 20초 동안)을 주었다.
강직성 뒷발 신장을 나타내지 않는 동물은 억제된 것으로 간주하였다. 도 24에 표시한 바와 같이, 이 실험으로부터 얻어진 결과는 NAX 5055가시간-의존적 항경련 효과-시작할때 빨리(30분 이내) 그리고 지속 기간 동안 보통(2 내지 4시간)-를 나타냄을 증명하여 준다. 이후에 실시한 용량-의존 연구에서, 항경련 효과는 최대 효과가 나타난 시간(즉, 1시간)에 정량화되었다. 용량-의존 데이터의 프로빗 분석에 의해 얻어진 계산된 유효량 중간값(즉, ED50) 및 95% 신뢰 구간은 3.2(2.3-6.1)mg/kg 이었다. i.p.로 투여하고 난 뒤 1시간째 테스트하였을때, NAX 5055(4mg/kg)는 프링즈 생쥐에서의 소리-유도된 발작을 차단하는데 있어서 효과가 있었지만 원래 GAL(1-16) 단편(20 mg/kg)은 그렇지 않았다.
또한, NAX 5055는 2가지의 잘 정립된 발작 모델에서 테스트되었다; 즉 최대 전기충격 발작(일반적인 강직성-간헐 간질 모델) 및 s.c. 메트라졸-발작 테스트(일반적인 간대성 근경련 간질 모델). 이 연구를 수행하기 위해, 4 mg/kg의 NAX 5055를 i.p.로 투여하였고, 이로부터 1시간 뒤에 생쥐들은 강직성-신장(최대 전기쇼크) 및 간헐적(s.c. 메트라졸) 발작에 대한 저항에 대해 테스트하였다. NAX 5055는 s.c. 메트라졸 발작 테스트에서 최소 활성(25% 억제)을 보이고 최대 전기충격 발작 테스트에서는 완전히 불활성이었다(결과 미제시). 비록 이러한 결과들이 임상적 효과 관점으로부터는 음성적인 것으로 설명될 수 있지만, 언급된 NAX 5055의 프로파일은 신규한 항간질제인 레베티라세탐-이는 인간 부분 발작을 치료하기 위해 200년도에 도입됨-의 것과 거의 동일하다.
따라서, NAX 5055의 항경련 프로파일을 확장하기 위한 노력으로서, 본 발명자들은 다른 레베티라세탐-민감성 급성 발작 모델에서 이를 평가하였다; 즉, 6Hz 정신운동(psychomotor) 테스트. 6Hz 발작 테스트는 불응성 부분 간질을 치료하기 위해 유용할 수 있는 효과적인 항경련 화합물을 구분하기 위한 독특한 모델로서 발달한다(Barton, Klein et al., 2001; White 2003). NAX 5055는 약물-저항성 간질 모델에 i.p. 투여하고 난 뒤에 매우 효과가 있다(표 19). 레베티라세탐 및 발프로익산과는 달리, NAX 5055의 효과는 자극 강도가 22 mA로부터 44 mA까지 증가된 채로 유지되었다. 따라서, NAX 5055는 6 Hz 테스트에서 3개의 전류 강도 모두에서 매우 효과가 있게 유지된 테스트된 항경련 약물 중에서 상대적으로 독특하다. 반대로, 자극 강도가 22에서 44 mA로 증가함에 따라 다른 약물의 효과는 감소하였다. NAX 5055는 생쥐 6 Hz 변연계 발작 모델에 피하 투입하열 실질적으로 테스트되었다. 흥미롭게, 활성은 s.c. 투여 후에 유지되었다(도 26). NAX를 s.c.로 투여하고 난 뒤 ED50이 오른쪽으로 미약하게 이동한 것에 대한 발견은, NAX 5055가 우수한 생체 이용 능력을 가짐을 보여준다.
원래 펩타이드 단편이 활성-이것이 뇌로의 접근성을 가질때-이라는 것을 확인하기 위한 노력으로, 뒤따르는 연구가 수행되었는데, 여기서 NAX 5055 및 GAL(1-16) 모두가 심실 공간으로 직접 투여되었다. 이 대뇌심실내(i.c.v) 연구로부터 얻어진 결과는 도 22에 요약되어 있다. 도 22에서 보는 바와 같이, 두개 유사체 모두는 i.c.v. 투여하고 난 뒤에 매우 효과있었다(즉, NAX 5055 및 GAL (1-16)에 대해 각각 ED50's: 0.07 및 1.7 nmole). NAX 5055가 원래 펩타이드 단편 GAL(1-16)에 비해 훨씬 더 효과있다는 것은 흥미로왔다.
6 Hz 모델에서의 약리학
AED 22 mA 32 mA 44 mA
페니토인(Phenytoin) 9.4 (4.7-14.9) >60 >60
라모트리진(Lamotrigine) 4.4 (2.2-6.6) >60 >60
에토석씨마이드 (Ethosuximide) 86.9 (37.8-156) 167 (114-223) 600
레베티라세탐 4.6 (1.1-8.7) 19.4 (9.9-36.0) 1089 (787-2650)
발포릭산(Valporic acid) 41.5 (16.1-68.8) 126 (94.5-152) 310 (258-335)
NAX 5055 <4 2.9 (2.24.0) 5.5 (4.6-8.5)
NAX 5055 유사체의 구조-활성 관계. 전신 투여하고 난 뒤의 활성의 구조적 결정물을 좀 더 이해하기 위한 노력으로 SAR 연구가 수행되었다. 먼저, C-말단에 있는 화학적 변형 각각이 두 변형의 조합과 비교해 비교가능한 효과를 나타내는지 여부를 테스트하였다. 하기에 표시된 바와 같이, 어떠한 변형도 NAX 5055와 비교해 장시간 지속되고 효과적인 항경련 활성을 갖는 것은 없었다. 유사체 1105-2는 더 낮은 효과(5055가 0.5 mg/kg인 것에 비교해 ED50=3.8 mg/kg), 더 짧은 활성 지속시간 및 5055에서는 관찰되지 않은 독성(운동 장애)을 보였다. Lys-palm 잔기의 존재는 모든 관찰가능한 항경련 활성을 발생하기에는 충분하지 않았다. 이러한 결과는 두개의 변형의 조합이 5055 유사체의 약제학적 특성에 있어서 가장 중요함을 제시해준다.
유사체 구조 4 mg/kg 용량 복강내 투입에 의해 얻어지는 1, 2 및 4시간째의 억제율
Gal(1-16) GWTLNSAGYLLGPHAV (서열번호 1) 비 반응성
5055 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)K (서열번호 56) 100%, 100%, 0%
1105-2 (Sar)WTLNSAGYLLGPKKKK (서열번호 60) 30%, 0%, 0%, 독성
306-5 (Sar)WTLNSAGYLLGPHA(Lys-P) (서열번호 68) 비 반응성
참고: NAX 5055를 포함한 모든 유사체는 C-말단에 아미드화 되어있음.
두번째로, C-말단에서의 Lys 잔기의 역할은 Lys을 DLys, 또는 Arg으로 치환하거나, Lys 잔기의 수를 변화시킴으로써 검증되었다. Lys을 Arg으로 치환하는 것은 단지 유사체의 활성만을 미약하게 변화하였다. Lys을 이성질체 DLys으로 치환하면, 비교가능한 효과(ED50=1.2 mg/kg)를 가진 장시간 지속성의 유사체(1205-2)를 도출한다. Gly12-Pro13을 2개의 추가적 Lys 잔기로 치환하면 항경련 활성은 유지되지만, 독성이 유발되었다. 이 실험으로부터의 결과는 표 21에 요약되어 있다:
NAX 구조 4 mg/kg 용량 복강내 투입에 의해 얻어지는 1, 2 및 4시간째의 억제율
5055 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)K (서열번호 56) 100%, 100%, 0%
1205-2 (Sar)WTLNSAGYLLGPDKDK(Lys-P)DK (서열번호 69) 100%, 50%, 75%
1205-3 (Sar)WTLNSAGYLLGPRR(Lys-P)R (서열번호 70) 100%, 75%, 0%
1205-4 (Sar)WTLNSAGYLLKKKK(Lys-P)K (서열번호 71) 75%, 100%, 66%, 독성
다음으로, NAX 5055의 중심 절단의 기능적 중요성이 확인되었다. 표 22에 나타난 바와 같이, "G12, P13" 또는 "L10, L11, G12, P13"에 의한 Gal(1-16)의 절단은 갈라닌 수용체로의 친화성을 최소 2배 감소시켰다. 5055 유사체(유사체 1205-5 및 306-3)의 계획적 중심 절단은, 6 Hz 모델에서 매우 낮은 효과만을 나타내게 하고(5055 유사체에 대해 0.8 mg/kg인 것에 비교해, 유사체 모두의 ED50=2.7 mg/kg) 작용 지속 시간이 더 짧아지게 하였다.
NAX 구조 4 mg/kg 용량 복강내 투입에 의해 얻어지는 1, 2 및 4시간째의 억제율
5055 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)K (서열번호 56) 100%, 100%, 0%
1205-5 (Sar)WTLNSAGYLLKK(Lys-P)K (서열번호 72) 100%, 25%, 0%
306-3 (Sar)WTLNSAGYKK(Lys-P)K (서열번호 66) 75%, 25%, 0%
6-아미노헥사노익산과 같은 골격 스페이서의 도입은, 갈라닌 단편과 KKkpK 모티프-유사체의 항경련 활성에 영향을 줄 수 있는- 사이에서 조사하였다. 유사체 306-2 및 306-4는 그의 항경련 활성을 유지하였다(306-4의 경우 ED50=2.95 mg/kg). 흥미롭게도, 306-4 유사체는 2.95 mg/kg 용량(6 Hz 모델에서의 ED50)에서 생쥐 염증성 통증 분석의 두번째 반응 단계에서 매우 활성을 띄는 것으로 밝혀졌으며, 이의 항경련 및 항통각 활성의 효과가 직접 관련되어 있지 않음을 제시하였다.
NAX 구조 4 mg/kg 용량 복강내 투입에 의해 얻어지는 1, 2 및 4시간째의 억제율
5055 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)K (서열번호 56) 100%, 100%, 0%
306-2 (Sar)WTLNSAGYLLGP(Ahx)KK(Lys-P)K (서열번호 65) 100%, 75%, 0%
306-4 (Sar)WTLNSAGY(Ahx)KK(Lys-P)K (서열번호 67) 50%, 0%, 0%
마지막으로, N-말단 사코신 잔기가 사라진 5055 유사체의 활성을 측정하였다(유사체 1205-1: WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)K). 이 유사체는 갈라닌 작용제 유사체이며 AR-M1896이라고 알려져 있는 Gal(2-11)을 기준으로 하여 디자인하였다: 첫번째 잔기를 제거하면 GalR1 서브타입으로의 유사체의 친화도가 감소하지만, GalR2에 대해서는 높은 친화성을 유지하는 것으로 추측함(Gal(2-11) 유사체에 대한 결합 데이터는 표 21 참고). 1205-1 유사체는 6 Hz 변연계 발작 모델에서 감소된 효과를 보였다(ED50=5.7 mg/kg).
요약하면, SAR 결과에서는 양이온화와 지질화의 조합이 각각의 화학적 변형 보다 훨씬 우월함을 보여준다.
a) BBB 를 투과하는 갈라닌 유사체의 디자인 및 화학적 합성
최근의 SAR 결과를 기초로 하여, 화학적 합성의 조합을 포함하는 유사체의 합성 및 특징분석이 수행되었다. 양이온화를 하기 위한 새로운 방법이 사용되었다: 스퍼민과 같은 폴리아민계 화합물 또는 리포폴리아민 콘쥬게이트가 사용됨. 펩타이드의 글리코실화는 이의 BBB 투과를 향상시키기 위해 잘 정립된 방법이며, 글리코실화된 갈라닌 유사체가 사용되었다.
양이온화 . 양전하 Lys 잔기 및 Lys-palm과의 조합은 CNS로의 유사체의 전달을 향상시킬 수 있다. 이러한 상대적으로 보존적인 유사체의 예가 표 24에 표시되어 있다.
KKKpK 모티프 변형된 유사체. 모든 유사체는 C-말단이 아미드화되어 있다.
유사체 설명
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)K (서열번호 56) NAX 5055(참조로 표시)
(Sar)WTLNSAGYLLGP(Orn)(Orn)(Lys-P)(Orn) (서열번호 73) Lys을 오르니틴(Orn)으로 치환하면, 한개의 메틸렌 그룹에 의해 곁사슬이 더 짧아진다. 이는 NAX 5055의 BBB-투과에 있어서 상대적으로 소수성의 역할을 한다.
(Sar)WTLNSAGYLLGP(Dab)(Dab)(Lys-P)(Dab) (서열번호 74) Lys을 2,4-디아미노부티르산(Dab)로 치환하면 2개의 메틸렌 그룹에 의해 곁사슬이 더짧아진다. 상기 설명 참고.
(Sar)WTLNSAGYLLGPbKbK(Lys-P)bK (서열번호 75) beta-homo-Lys은 (1)대사적으로 안정하고, (2) 더 소수성이다.
(Sar)WTLNSAGYLLGPHH(Lys-P)H (서열번호 76) Lys을 His으로 치환하는 것은 유사체의 염기성을 감소시킨다.
(Sar)WTLNSAGYLLGP(Lys-P)KKK (서열번호 77) Lys 및 Lys-palm 잔기의 상대적 위치 변화
(Sar)WTLNSAGYLLGPK(Lys-P)KK (서열번호 78) 상기와 같음
(Sar)WTLNSAGYLLGPKKK(Lys-P) (서열번호 79) 상기와 같음
양이온화는 BBB를 통한 갈라닌 유사체의 통과에 있어서 핵심이기 때문에, 폴리아민을 포함하는 갈라닌 유사체가 조사되었다. 스퍼민을 포함하는 유사체를 조사하는 이론적 배후는 여러개의 아민 그룹을 갖지만, 펩타이드 결합이 없는(단백질 분해에 대해 민감성이 떨어지고 수소-결합 공여자/수용체가 없음) 단일 분자로 여러개의 Lys 잔기(NAX 5055에 존재함)를 치환하는 것이다. 몇가지 갈라닌 유사체가 합성되었으며, 여기서 스퍼민은 골격 또는 곁사슬의 일부이다. 표 25는 갈라닌-스퍼민 유사체의 구조 및 설명을 요약한다.
골격 스페이서 또는 곁사슬로서 스퍼민을 포함하는 NAX 5055 유사체. 스퍼민S는 1,5,10,14-테트라-아자쿼트로데칸-N4-숙시나믹산이다. 모든 유사체는 C-말단이 아미드화되어 있다.
유사체 설명
(Sar)WTLNSAGY(spermineS)(Lys-P) (서열번호 80) 스퍼민-N4숙시나믹산은 원래 6개의 AA에 치환된 18개의 골격 원자를 갖는다. 스퍼민S는 NAX 5055에 있는 "LLGPKK"를 치환하는 골격 스페이서로서 기능을 한다.
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)-(SpermineS) (서열번호 81) 스퍼민을 이용한 Lys17의 치환은 유사체의 염기성을 증가시킬 것이다.
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Glu-Spermine)K (서열번호 82) 스퍼민을 이용한 Lys-palm의 치환은 글루타믹산의 곁사슬에 결합된다.
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-Spermine-Palmitoyl)K (서열번호 83) 스퍼민-팔미토일을 이용한 Lys-palm 모이어티의 치환은 유사체의 염기성을 증가시킬 것이다.
지질화 . 다음 세트의 유사체에서(표 26), BBB를 통한 유사체의 투과에 있어서, 위치 16의 지질화 효과가 연구되었다.
위치 16이 변형된 유사체. 모든 유사체는 C-말단이 아미드화됨.
유사체 설명
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(TDA)K (서열번호 84) Lys-팔미토일 모이어티를 더 짧은 리포아미노산으로 치환한 테스트 효과: 테트라데카노익 모이어티
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(NorL)K (서열번호 85) Lys-팔미토일 모이어티를 노르류신으로 치환하는 것은 "절단된" 유사체 손실 팔미토일 잔기임(및 아미노 그룹)
글리코실화 . 알파-만노실 또는 베타-멜리바이오스 세린 잔기를 위치 16에 포함하는 2개의 글리코실화된 갈라닌 유사체가 먼저 합성되었다. 그리고, 이 유사체에는, 사카라이드 모이어티가 Lys-palm 잔기를 치환한다.
글리코실화된 갈라닌 유사체. 모든 유사체는 C-말단이 아미드화되어 있다.
유사체 설명
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)K (서열번호 56) NAX 5055 (참조로 표시)
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Man)K (서열번호 86) Lys-팔미토일 모이어티를 모노사카라이드 유도체로 치환한 테스트 효과:L-Ser-알파-만노스
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Mel)K (서열번호 87) Lys-팔미토일 모이어티를 디사카라이드 유도체로 치환한 테스트 효과:L-Ser-베타-멜바이오스. 상기와 같은 원리
골격 스페이서 . 골격 스페이서가 NAX-5055 기초의 유사체의 항경련 활성에 미치는 영향이 조사되었다. 펩타이드 골격 부분을 비펩타이드계 스페이서로 치환하는 주요한 이점은 다음과 같다: (1) 분자 크기를 감소시킴으로써 BBB-투과성을 향상, (2) 단백질 분해 민감성을 감소, 및 (3) 수소 결합 공여자/수용체의 부족. 이들 유사체의 예는 표 28에 표시되어 있다.
연장된 글라이신 골격 스페이서를 포함하는 NAX 5055 유사체. 모든 유사체는 C-말단이 아미드화되어 있다.
유사체 스페이서
(Sar)WTLNSAGYLL(1PEG)KK(Lys-P)K (서열번호 88) 5-아미노-3-옥사펨타노익산
(Sar)WTLNSAGYLL(5AVA)KK(Lys-P)K (서열번호 89) 5-아미노밸러릭산
(Sar)WTLNSAGYLL(2PEG)KK(Lys-P)K (서열번호 90) 8-아미노-3,6-디옥사오타노익산
(Sar)WTLNSAGYLL(8AOA)KK(Lys-P)K (서열번호 91) 8-아미노옥타노익산
(Sar)WTLNSAGYLL(1PEG)(5AVA)KK(Lys-P)K (서열번호 92) 5-아미노-3-옥사펨타노익산, 5-아미노밸러릭산
유사체의 화학적 합성. 모든 유사체는 Fmoc-기초의 고체상 펩타이드 합성 (SPPS) 프로토콜 및 자동 펩타이드 합성기를 이용해 합성하였다. SPPS를 위한 모든 빌딩 블록(building block)은 상업적으로 이용가능하며, Fmoc 보호된 골격 스페이서, 글리코아미노산, 스퍼민, 스퍼민-숙시니아믹산 또는 스퍼민-팔미토일을 포함한다(Sussex Research Laboratories, Iris Biotech, NeoMPS, Chem-Impex). 결합 방법은 이전에 기술된 방법(Fields and Noble 1990; Albericio 2000)에 따라 수행할 것이다. 스퍼민 또는 이의 유도체가 위치 16에 결합되어 있는 유사체의 경우, 상기 유사체는 감마-2-페니이소프로필 에스테르(0-2-PhiPr)로 보호된 글루타믹산을 포함한다. 곁사슬 카르복실은 디크로로메탄에 있는 1% TFA를 이용해 레진 상에 탈보호화된다. 스퍼민 또는 이의 팔미토일 유도체(다른 아미노 그룹에 보호된 Fmoc/Boc)의 결합은 1,3-디이소프로필카보디이미드(DIC)를 이용해 수행하였다. 그리고 난 뒤 펩타이드는 고체 기판으로부터 제거되고, 세척되며 MTBE를 이용해 침전되었다. 상기 유사체는 디페닐 예비 역상 HPLC를 이용해 정제되었다. 90% 아세토니트릴/10% 물/0.1% TFA의 아세토니트릴(0.1% TFA에 들어있음)을 20%에서부터 90%의 농도 경사로 사용하여 15분 동안 용출하는데 사용하였다. 유사체는 280 nm에서의 몰 흡수 계수 7,000(1 Tpr 5,600 및 1 Tyr 1,400)을 이용해 정량화하였다. 이러한 과정은 NAX 5055 및 10 내지 50 밀리그램 범위의 개별 배치를 갖는 유사 유사체를 제조하는데 있어서 효과가 있었다.
b) BBB 를 통과하는 갈라닌 유사체의 시험관내 특성 분석
합성된 갈라닌 유사체의 생물학적 활성을 확인하기 위해, GalR1 및 GalR2 수용체에 대한 결합 상수가 결정되었다. 3가지 주요한 목적은 다음과 같다: (1) GAL(1-16)에 도입된 화학적 합성이 갈라닌 수용체로의 친화성을 변화시키는데 영향을 주는지 확인하기 위해, (2) 갈라닌 유사체에 대한 선별적 프로파일을 확인하기 위해, 그리고 (3) BBB를 투과하는 높은 친화성의 갈라닌 유사체의 신뢰성 있는 스크리닝 분석법을 개발하기 위해. NAX 5055가 GalR1 및 GalR2 모두에 대해 낮은 나노몰 농도 친화도를 유지함이 밝혀졌다.
유로피움(europium)-표지된 갈라닌을 이용한 형광계 결합 분석법(Delfia assay from Perkin Elmer)이 사용될 수 있다. 참고문헌에 이미 기술된(Valenzano, Miller et al., 2000) 이 분석법은 입증된 방법이며, 이전에 합성한 모든 유사체의 결합 특성을 확인하는데 사용하였다. 전통적으로 널리 사용된 방사능리간드 결합 분석법에 비교한 형광계 결합 분석법의 주된 이점은 방사능에 의한 장애(건강, 처분, 얻어진 신호의 긴 지속시간)를 피할 수 있다는 것이며, 이 분석법은 중간- 및 높은-처리량의 스크리닝 훨씬 쉽게 할 수 있게 한다는 것이다. 란타나이드(lanthanide)를 갖는 표지 수용체 리간드는 이의 긴 형광 수명으로 인해 높은 민감성의 이점을 제공한다. 400 마이크로초가 지연된 시간-고려된 형광 검출을 이용하면, 1 펜토몰 이하의 유로피움이 단일 웰에서 검출될 수 있다.
2개의 갈라닌 수용체는 막 제제(membrane preparation) 형태로, Perkin Elmer 또는 Multispan, Inc로부터 얻을 수 있다. 유로피움-표지된 갈라닌(Eu-Galanin)은 Perkin Elmer로부터 구입하였다. 결합 반응은 60 마이크로리터 부피의 결합 완충제(EDTA, BSA, PEG가 저장 완충액에 들어 있음)에 10 마이크로그램의 막 단백질(농축액)을 넣어 수행한다. 포화 결합 커브는 0.01 내지 10 nM 농도의 리간들부터의 Eu-갈라닌의 범위로 형성된다. 결합 상수를 결정하기 위해, 0.2 nM의 Eu-갈라닌을 막과 함께 2시간 동안 반응하였다. 이 반응은 진공 박스를 이용해 AcroWell 필터 플레이트를 통해 빨리 여과하고, 300 ml의 저장(hypotonic) 완충액으로 3회 세척함으로써 종결지었다. 증강 용액을 각 웰에 첨가하고, TRF 신호는 TFR을 이용해 Victor3 분광형광계에 기록하였다.
c) BBB 를 통과하는 갈라닌 유사체의 생체내 특성
약물-저항성 간질 모델에서의 갈라닌계 뉴로펩타이드의 항경련 활성 및 이의 항간질발생 특성.
약물-저항성 부분 간질의 6 Hz 변연계 발작 모델에서 선별된 유사체를 특성분석하였다. 약물-저항성 간질 모델에서의 유사체의 효과는 i.p. 투여후 투여량-의존성 커브를 작성함으로써 결정하였다. 모든 화합물은 0.9% NaCl에 넣어 체중 g당 0.01 ml 부피로 i.p. 투여하였다. 6 Hz 발작 테스트에서의 급성 효과 연구에 추가로, 생쥐의 부분 간질 각막 점화 모델에서 NAX 5055 및 다른 갈라닌 유사체가 점화현상 획득을 억제할 수 있는 지에 대한 능력이 분석되었다(Matagne and Klitgaard 1998).
항경련 테스트. 6 Hz 각막 자극(3초 지속)에 의해 유도된 발작을 억제하는 각 유사체의 능력은 3개의 다른 자극 강도(즉, 22, 32 및 44 mA)에서 측정하였다. 6 Hz 발작은 최소 간헐 단계로 특징되며, 그 다음으로 상동(stereotyped) 행동, 자동 행동이 일어나고, 이 행동은 부분 발작을 가진 인간 환자의 조짐과 유사한 것으로 간주되는 것으로 원래 기술되었다(Toman, Everett et al., 1952; Barton, Klein et al., 2001). 이러한 행동을 보이지 않는 동물은 억제된 것으로 간주하였다. 상기에 언급한 바와 같이, 6 Hz 발작은 전류가 22 mA에서 44 mA로 증가함에 따라 항간질 약물에 의한 차단에 대해 훨씬 더 저항성이 있게 되었다. 6 Hz 발작 테스트에서의 각 유사체에 대한 활성은 참고문헌(Barton, Klein et al., 2001)에 기재된 방법에 따라, i.p 투여하고 한 뒤에 최대 효과에 도달하는 시간에서 정량화하였다. 이 테스트를 하기 위해, 각막 전극을 위치시키기 전에, 마취제/전해질 용액(0.9% 식염수에 0.5% 테트라카인 하이드로클로라이드가 녹아 있음)을 각 생쥐의 눈에 점적 투여하였다. 최대 효과 도달 시간 연구를 하기 위해, 전체 20마리의 CF-1 생쥐가 사용되었다. 4마리로 이루어진 그룹은 다양한 시간(즉, 0.25, 0.5, 1, 2 및 4시간)에 테스트되었다. 투여량-반응 연구를 하기 위해, 최소 8마리 생쥐로 이루어진 그룹은 최소한 2개 포인트가 100% 효율 내지 0% 효율 제한 사이에서 확립될때까지, 다양한 용량의 후보 펩타이드로 테스트하였다. 노출된 동물의 50%에서 유효용량 중간값(즉 ED50)을 얻는데 필요한 약물 용량, 95% 신뢰 구간, 감소선 슬로프, 및 슬로프의 S.E.M.은 핀니에 의해 기술된 방법(Finney 1971; Einney 1971)을 기초로 하여 컴퓨터 프로그램으로 계산하였다.
각막 점화현상의 수득. NAX 5055 및 선별된 다른 갈라닌 유사체는 참고문헌(Matagne and Klitgaard 1998)에 기재된 바에 따라 생쥐 각막 점화현상 모델에서 점화현상의 획득을 억제하는 능력을 평가하였다. 매일마다 각막을 통한 전기적 자극은 15-20일 이내에 안정하게 점화된 상태의 결과를 도출하였다. 이는 선별된 갈라닌 유사체의 점화현상 획득을 억제하기 위한 능력을 초기에 측정할 수 있는 이상적인 모델인데, 그 이유는 요구되는 펩타이드의 양이 쥐 점화현상 연구에 필요한 것보다 훨씬 낮기 때문이다. 점화현상의 획득을 억제하는데 효과적인 것으로 확인된 이 화합물은 그 다음으로 훨씬 더 전통적인 쥐 점화현상 모델에서 평가되었다: 즉 편도 점화된 쥐. 제안된 연구에서, 두 그룹의 생쥐(그룹당 n=8마리 생쥐)는 각 점화 자극이 주어지기 전에 매개체 또는 펩타이드를 무작위로 받았다. 각 펩타이드는 6 Hz(44 mA) 발작을 억제하기 위한 ED50 용량으로 i.p.로 투여하였다. 최대 효과에 도달하는 시간에서(6 Hz 연구에서 얻어짐), 불완전 발작 전류(50 Hz, 3 mA, 3초 동안)로 각막 전극을 통해 자극하고 발작 활성이 존재하는지 그렇지 않은지에 대해 관찰하였다. 발작 활성은 라신 등의 문헌(Racine et al., 1972)에 의해 정립된 방법에 따라 점수를 매겼다. 동물들은 첫번째 단계 5 행동학적 발작을 나타낼때까지 매일마다 2회의 자극을 받았으며, 그리고 난 뒤 안정한 두번째 발작(5 연속 단계 4-5 발작)을 보일때까지 하루에 한번 자극을 받았다. 펩타이드 처리는 대조군 생쥐가 완전히 점화될때까지 실험 군에서 계속하였다. 이 시점에서, 두 그룹에 있는 생쥐는 한주는 자극을 주고 다른 주는 처치를 하지 않게 하였다. 8번째 날에, 두 그룹의 생쥐는 펩타이드 또는 매개체 없이 자극하였으며 이의 발작 점수를 기록하였다.
매개체-처리된 그룹의 생쥐는 자극을 준 두번째 주의 마지막날에 완전히 점화 상태에 이를 수 있다(도 32 및 33). 또한, 갈라닌을 i.c.v. 투여받은 생쥐는 점화현상의 진행을 억제하는 것으로 이미 확인되었으며(Mazarati, Lundstrom et al., 2006), 실험 그룹의 생쥐는 매개체-처리된 생쥐보다는 더 낮은 속도로 점화되거나 점화되지 않았다. 따라서, 활성 점화현상 연구의 마지막날에 얻어진 발작 점수는 1 또는 그 이하일 수 있고 발작 점수는 약효세척(washout) 기간 후에도 여전히 낮게 유지되었다: 예 처치된(항간질발생적). 만약 약효세척 후 기간에 실험 그룹의 발작 점수가 매개체-처리된 그룹과 유의적으로 다르지 않다면, 이는 활성 처리 기간 동안의 펩타이드의 효과는 이의 항경련 효과 때문인 것으로 결론지을 수 있다; 예, 처치된(항경련). 항간질발생효과가 관찰되면, 이전에 처치된 생쥐가 펩타이드 없이 점화될 수 있는지를 확인하기 위해 매개체- 및 처치-그룹 모두의 생쥐를 약물의 부재하에서 점화된다.
5. 실시예 5: 유사체의 디자인 및 화학적 합성
a) BBB 를 투과하는 뉴로펩타이드 유사체
표 29는 몇가지 뉴로펩타이드 유사체의 구조를 요약한다. 각 유사체에 대해, "KKKPK" 모티프는 고체상 펩타이드 합성 동안 N- 또는 C-말단에 부착한다. 아래에 제공되는 것은 뉴로펩타이드의 유사체를 디자인하기 위한 상세한 설명이다.
선별된 뉴로펩타이드의 구조
뉴로펩타이드 구조
SOM Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (서열번호 30)
옥트레오타이드-NH2 DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2(서열번호 101)
DSIP Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Phe-Ser-Gly-Glu(서열번호 102)
다이노르핀 A(1-16) Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln (서열번호 103)
NPY(13-36) PAEDLARYYSALRAYINLITRQRY-NH2(서열번호 104)
소마토스타틴 및 이의 서브타입-선별성 유사체인 옥트레오타이드는 그의 생물학적활성을 손상시키지 않으면서 N-말단 연장을 "수용할수" 있다(Dasgupta and Mukherjee 2000; Dasgupta, Singh et al., 2002; Na, Murty et al. 2003). RC-160 유사체의 N-말단 아세틸화는 이 소마토스타틴 유사체의 CNS 농도를 증가시키는 결과를 유발한다(Banks, Schally et al., 1990). 또한 옥트레오타이드는 추가적 변형없이 연장되어 BBB를 투과할 수 있다(Fricder, Nobmann et al., 2002).
DSIP . N-말단 연장이 DSIP의 항간질 활성에 영향을 주지 않고, C-말단 연장이 비활성 유사체를 발생하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, DSIP 유사체는 N-말단에 부착한 벡터로 제조될 수 있다.
" KKK P K " 모티프는 SOM, 옥트레오타이드 또는 DSIP의 N-말단에 도입된다. 3개의 다른 스페이서(Gly, 6-아미노헥사노익산(Ahx), Ahx-Gly)를 이용하여 "KKKPK" 모티프를 부착하면, 거대한 Lys-palm 잔기가 표적 수용체와의 상호작용에 영향을 줄 수 있는 가능성을 최소화한다. 하기의 유사체가 합성되었다:
KK(Kp)K-(뉴로펩타이드) (서열번호 105)
KK(Kp)KG-(뉴로펩타이드) (서열번호 106)
KK(Kp)K(Ahx)-(뉴로펩타이드) (서열번호 107)
KK(Kp)K(Ahx)G-(뉴로펩타이드) (서열번호 108)
다이노르핀 A(1-16)은 아편 유사체 수용체에 대한 친화성의 유의적인 감소 없이, C-말단이 절단 또는 변형될 수 있다(Lapalu, Moisand et al., 1997; Naqvi, Haq et al. 1998; Schlechtingen, Dehaven et al. 2003). 따라서, BBB를 투과하는 갈라닌 유사체와 같이, 다이노르핀 A(1-16) 유사체는 마지막 몇개의 잔기가 "KKKPK" 모티프에 의해 치환되도록 합성된다. 유사체는 다음과 같다:
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2 (서열번호 109)
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2 (서열번호 110)
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2 (서열번호 111)
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-(Ahx)-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2 (서열번호 112)
뉴로펩타이드 Y 유사체는 교수인 Annette G. Beck-Sickinger의 실험실에서 수행한 많은 SAR 연구의 결과를 기초로 하여 디자인하였다(Beck-Sickinger and Jung 1995; Cabrele and Beck-Sickinger 2000). 특히, 디자인은 종양 이미지화 제제로 합성되고 테스트된 99 mTc-표지된 NPY 유사체를 기초로 하였다(Langer, La Bella et al. 2001). 킬레이트화된 99 mTc를 갖는 거대한 2-피코릴아민(picolylamine)-N,N-디아세틱산을 포함하는 절단된 NPY 유사체 (Ac-[Ahx5-24,K4(99mTc(CO)3-PADA),,A26]-NPY는 Y2 수용체 서브타입에 대해 매우 효과 있었다(IC50=1 nM). 따라서, 2-피코릴아민-N,N-디아세틱산은 Lys-팔미토일 잔기로 치환될 수 있다. 2개의 NPY 유사체는 다음과 같다:
KKK(KP)(Ahx)RAYINLITRQRY-NH2 (서열번호 113)
KK(KP)K(Ahx)RAYINLITRQRY-NH2 (서열번호 114)
또한, 4개의 NPY(13-36) 유사체가 N-말단 연장으로 만들어졌다:
KK(KP)K-[NPY(13-36)] (서열번호 115)
KK(KP)KG-[NPY(13-36)] (서열번호 116)
KK(KP)K(Ahx)-[NPY(13-36)] (서열번호 117)
KK(KP)K(Ahx)G-[NPY(13-36)] (서열번호 118)
모든 유사체는 표준 Fmoc-기초의 고체상 펩타이드 합성(SPPS) 프로토콜 및 자동 펩타이드 합성기를 이용하여 합성하였다. 빌딩 블록(building block)은 상업적으로 이용가능하며, Fmoc 보호된 아미노헥사노익산, Lys-팔미토일, 및 글리코아미노산을 포함한다(Sussex Research Laboratories, Iris Biotech, NeoMPS, Chem-Impex). 결합 방법은 이전에 기술된 방법(Fields and Noble 1990; Albericio 2000)에 따라 수행할 것이다. 그리고 난 뒤 펩타이드는 고체 기판으로부터 제거되고, 세척되며 MTBE를 이용해 침전되었다. 상기 유사체는 디페닐 예비 역상 HPLC를 이용해 정제되었다. 용출하기 위해 선형의 농도 경사가 사용되었다. 90% 아세토니트릴/10% 물/0.1% TFA의 초기 및 최종 농도는 각 유사체에 대해 결정되었고, 이는 분석적 HPLC 분석법으로부터의 유지 시간을 기준으로 하였다. 유사체는 280 nm에서(Trp ε=5,600 및 Tyr ε=1,400) 각 유사체에 대해 계산된 분자 흡수 상수를 이용해 정량화하였다. 이러한 과정은 갈라닌 유사체를 10 내지 50 밀리그램 범위의 양으로 제조하는데 효과가 있었다. 소마토스타틴 또는 옥트레오타이드 유사체에 있는 디설파이드 브릿지를 산화시키기 위해 Clear-Ox 레진이 사용되었다(Darlak, Weigandt Long et al. 2004; Green and Bulaj 2006). 본원에 개시된 옥트레오타이드 유사체는 95% 이상의 수율로 산화되었다. 최종 산화 산물은 예비 HPLC로 정제하였다.
뉴로펩타이드 유사체의 항경련 활성.
약물-저항성 부분 간질의 6 Hz 변연계 발작 모델에서 선별된 유사체를 특성분석하였다. 유사체의 활성은 i.c.v. 및 i.p. 투여후에 결정될 수 있다. 이방법은 유사체를 i.c.v.(2 nmole)로 먼저 테스트하는 것이다: 활성 유사체는 i.p.로 환 주입(4 mg/kg)을 이용해 추가로 테스트된다. 또한, 다이노르핀 A(1-16), NPY 및 NPY(13-36)의 항경련 활성은 2 nmole로 i.c.v. 투여하여 테스트되었다. 이 결과들은 이들 변형된 유사체를 선별하기 위한 참조로서 제공된다.
항경련 테스트.
6 Hz 각막 자극(3초 지속)에 의해 유도된 발작을 억제하는 각 유사체의 능력은 32 mA의 자극 강도에서 측정하였다. 6 Hz 발작은 최소 간헐 단계로 특징되며, 그 다음으로 상동(stereotyped) 행동, 자동(automatic) 행동이 일어나고, 이 행동은 부분 발작을 가진 인간 환자의 조짐과 유사한 것으로 간주되는 것으로 원래 기술되었다(Toman, Everett et al., 1952; Barton, Klein et al., 2001). 이러한 행동을 보이지 않는 동물은 억제된 것으로 간주하였다. 6 Hz 발작 테스트에서의 각 유사체에 대한 활성은 참고문헌(Barton, Klein et al., 2001)에 기재된 방법에 따라, i.c.v 또는 i.p 투여하고 난 뒤에 최대 효과에 도달하는 시간에서 정량화하였다. 이 테스트를 하기 위해, 각막 전극을 위치시키기 전에, 마취제/전해질 용액(0.9% 식염수에 0.5% 테트라카인 하이드로클로라이드가 녹아 있음)을 각 생쥐의 눈에 점적 투여하였다. 최대 효과 도달 시간 연구를 하기 위해, 전체 20마리의 CF-1 생쥐가 사용되었다. 4마리로 이루어진 그룹은 다양한 시간(즉, 0.25, 0.5, 1, 2 및 4시간)에 테스트되었다. 모든 화합물은 0.01 ml/g 체중의 부피로 0.9% NaCl에 녹여 투여하였다.
글리코실화된 뉴로펩타이드 유사체의 디자인 및 화학적 합성. 글리코실화는 아편 유사체 펩타이드의 BBB 투과성을 향상시키는데 있어서 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다(Elmagbari, Egleton et al., 2004; Polt, Dhanasekaran et al. 2005). 도 34는 엔케팔린 유사체에 사용된 당 잔기의 구조를 보여준다. β-멜리바이오스의 펩타이드로의 전달은 i.v. 투여하고 난 뒤에 가장 우수한 진통 효과를 갖는 유사체를 만들어내었다.
β-멜리바이오스-Ser 잔기는 전장 "KKKPK" 모티프 또는 Lys-팔미토일 잔기의 위치에 선별된 뉴로펩타이드 유사체를 도입할 수 있다(상기에 기술한 바와 같음). 글리코실화된 유사체를 화학적 합성하기 위해, Sussex Research로부터 이용가능한 Fmoc-보호된 퍼아세틸(peracetyl)-β-멜리바이오스-Ser 유도체가 사용되었다. 표준 고체상 합성 프로토콜이 사용되었다. 멜리바이오스 잔기의 디아세틸화는 10 mM 소듐 메톡사이드가 들어있는 메탄올에서 유사체를 4-5시간 동안 pH 조절된(pH 10) 반응을 시킴으로서 수행된다. 유사체는 예비 HPLC에 의해 정제되고 항경련 활성을 테스트하기 전에 고속진공기(speedvac)에서 건조시켰다.
6. 실시예 6: 생쥐 각막 점화현상 수득에 미치는 NAX 5055의 영향
혈액-뇌장벽 투과성 갈라닌계 뉴로펩타이드 NAX 5055가 각막 점화현상의 발생을 억제하는 능력은 CF#1 생쥐에서 연구하였다. 생쥐 각막 점화현상 모델은 부분 간질의 비-방해성 동물 모델인데, 여기서 생쥐는 각막 전극을 통해 수일 동안 2일에 한번 불완전경련 전류(3 mA)를 받는다. 매개체 처리된 생쥐는 안정 단계 5 발작-즉 2차 병소 발작-에 도달하기 위해 12 내지 16일이 소요된다. 본 연구에서 16마리의 생쥐를, 2개 중의 하나를 실험 그룹으로 무작위로 나누었다; 식염수 또는 NAX-5055. NAX-5055 그룹의 생쥐는 첫번째 각막 자극하기 전 12시간 및 1시간에 그리고 그 이후의 각각의 자극 전 1시간에 NAX-5055를 복강내(i.p)로 주입(4 mg/kg, n=8) 받았다. 반대로, 매개체 그룹 생쥐는 각각의 각막 자극하기 1시간 전에 0.9% NaCl(n=8)을 투여받았다. 각 자극을 수행하기 전에 0.9% 식염수에 들어있는 0.5% 테트라카인을 각막에 점적 투여하였다. 그 다음의 자극 발작 활성은 라신(Racine, 1972)에 의해 정립된 대로 0-5 스케일로 점수를 매겼다. 대조군 동물이 단계 5 발작을 꾸준히 보일때까지 처치를 계속하였다.
도 32 및 33에서 보는 바와 같이, NAX-5055 그룹 생쥐는 2개의 개별 집단으로 나눌 수 있다; 즉 NAX-5055 처치에 대해 민감한 그룹(n=3) 및 무감각한 그룹(n=5). 민감성은 동물이 자극 기간 동안 단계 5 발작을 보이는데 실패한 것으로 정의를 내렸다. NAX-5055 민감성 동물은 대조군 및 NAX-5055 무감각성 동물 모두와 비교해 단계 1, 2 및 3에 도달하는데 있어서 유의적으로 더 많은 수의 자극을 필요로 하였다. 더불어, 한주의 자극 뒤에 재-시도하는 동안과 펩타이드가 존재하지 않는 기간 동안, NAX-5055 민감성 동물은 대조군 및 NAX-5055 무감각성 동물과 비교해 단계 4/5 발작에 도달하는데 있어서 유의적으로 더 많은 자극을 필요로 하였다. 이 결과는 NAX-5055가 점화현상 수득을 지연시킬 수 있고, 뇌 손상 후에 간질 발생의 위험에 있는 환자의 초기 치료를 위해 유용할 수 있음을 보여준다(Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 1972 Mar; 32(3)281-94).
전신 전달 후의 옥트레오타이드 또는 DSIP 유사체의 항경련 활성
유사체 30분째의 억제율(4 mg/kg, i.p.)
옥트레오타이드 유사체
DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2 50%
Lys-Lys-Lys(palm)-Lys-Ahx-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2 100%
DSIP 유사체
Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Phe-Ser-Gly-Glu 0%
Ahx-Gly-Gly-Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Phe-Ser-Gly-Glu 50%(2시간후에 100%)
추가의 델타 수면 유도 펩타이드
유사체 구조
DSIP-BBB8 (Ahx)GGWAGGDASGE (서열번호 136)
DSIP-BBB99 (Palm)GGWAGGDASGE (서열번호 137)
DSIP-BBB100 (Kp)GGWAGGDASGE (서열번호 138)
DSIP-BBB101 KKK(Kp)GGWAGGDASGE (서열번호 139)
DSIP-BBB102 KK(Kp)GGWAGGDASGE (서열번호 140)
DSIP-BBB103 KKKGGWAGGDASGE (서열번호 141)
DSIP-BBB104 (DK)(DK)(DK)(Kp)GGWAGGDASGE (서열번호 58)
서열목록
서열번호 1 (야생형 갈라닌 )
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro His Ala Val
서열번호 2 ( GAL - BBBl )
Sar-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-His-(Lys-palm)-Tle-NH2 (여기서 Sar은 사코신(sarcosine), Tle는 tert-류신(Leucine)이고 Lys-palm은 라이신이 엡실론 아미노산 그룹을 통해 팔미토일 모이어티와 결합한 것이고, -NH2는 C-말단이 아미드화된 것을 표시한다)
서열번호: 3 ( GAL - BBB2 )
Sar-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2
(여기서 Sar은 사코신(sarcosine), Tle는 tert-류신(Leucine)이고 Lys-palm은 라이신이 엡실론 아미노산 그룹을 통해 팔미토일 모이어티와 결합한 것이고, -NH2는 C-말단이 아미드화된 것을 표시한다)
서열번호 4 (표 11에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala GIy Tyr Leu Gly Pro Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 5 (표 11에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 6 (표 11에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 7 (표 11에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 8 (표 11에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 9 (표 12에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 10 (표 12에 있음)
Sar Trp Xaa Xaa Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 11 (표 12에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Xaa Xaa Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 12 (표 12에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Xaa Xaa Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 13 (표 12에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Xaa Xaa Gly Pro Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 14 (표 12에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Xaa Xaa Pro Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 15 (표 12에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Xaa Xaa Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 16 (표 12에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 17 (표 12에 있음)
Sar Trp Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys-P Lys
(표 12에 있는 서열(서열번호 9-17)에서 "Xaa"는 스페이서를 나타내며 어떤 길이든지 상관없다).
서열번호 18 (표 13에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 19 (표 13에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 20 (표 13에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Lys Lys Lys Lys Lys-P Lys
서열번호 21 (표 13에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys Lys
서열번호 22 (표 13에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys-P Lys Lys
서열번호 23 (표 13에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys-P Lys Lys Lys
서열번호 24 (표 13에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro D-Lys D-Lys Lys-P D-Lys
서열번호 25 (표 13에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro h-Lys h-Lys Lys-P h-Lys
서열번호 26 (표 13에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro DAB DAB Lys-P DAB
서열번호 27 (표 13에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys TDA Lys
서열번호 28 (표 13에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys DPA Lys
표 13에 있는 서열(서열번호 18-28)에서, TDA는 2-아미노-테트라데카노익산, DAB는 디아미노부티르산, D-Lys은 Lys의 D-이성질체이고 h-Lys는 homo-Lys이고, DPA는 3,3-디페틸알라닌이다.
서열번호 29 (표 13에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys-P Lys X
여기서 X는 12-아미노-도데카노익산 또는 2-아미노-테트라데카노익산을 나타낸다.
서열번호 30 ( 소마토스타닌 야생형)
Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys
서열번호 31 (표 5에 있음)
Ala Ala Cys Lys DAB Phe Phe D-Trp Lys DAP Phe DAP DAP Cys
서열번호 32 (표 5에 있음)
Ala Gly Cys Lys-P Lys-P Phe Phe D-Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys
서열번호 33 (표 5에 있음)
Ala Gly Cys Lys Asn Cl-Phe Cl-Phe D-Trp Lys Thr Cl-Phe Thr Ser Cys
서열번호 34 (표 5에 있음)
Ala Ala Cys Lys DAB Phe Phe L-Trp Lys DAP Phe DAP DAP Cys
서열번호 35 (표 5에 있음)
Ala Gly Cys Lys-P Lys-P Phe Phe L-Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys
서열번호 36 (표 5에 있음)
Ala Gly Cys Lys Asn Cl-Phe Cl-Phe L-Trp Lys Thr Cl-Phe Thr Ser Cys
표 5에 있는 서열에서, DAB는 디아미노부티르산; DAP는 디아미노프로피오닉산; Lys-palm은 Lys-팔미토일; 그리고 Cl-Phe는 클로로-Phe를 나타낸다.
서열번호 37 (표 9에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys-p Lys-p Lys-p Val
서열번호 38 (표 9에 있음)
Sar Trp DAP Leu Asn DAP DAP Gly Tyr Leu Leu Gly DAB His DAP DAB
서열번호 39 (표 9에 있음)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Cl-Tyr Leu Leu Gly Pro His Ala Val
서열번호 40 (변형된 옥트레오타이드 ( Octreotide ))
D-Phe Cys Phe D-Trp Lys Thr Cys Thr(ol)
서열번호 41 ( SOM - BBBl )
(NN3APG)(AHX)AGCKNFFWKTFTSC
서열번호 42 ( SOM - BBB2 )
(NN3APG)(AHX)AGCKNFF(DW)KT(Cl-Phe)T(Dap)C
서열번호 43 ( SOM - BBB3 )
W(AHX)KKCKNFFpW)KT(Cl-Phe)(Dab)(Dab)C
서열번호 44 ( SOM - BBB21 )
KK(Lys-P)K(AHX)(DF)CF(DW)KTC-Thr(ol)
서열번호 45 ( SOM - BBB22 )
KKK(LyS-P)K(AHX)(AHX)(DF)CF(DW)KTC-Thr(ol)
서열번호 46 ( SOM - BBB23 )
(Lys-P)KK(Lys-P)K(AHX)(DF)CF(DW)KTC-Thr(ol)
서열번호 47 ( SOM - BBB24 )
KK(Lys-P)K(AHX)KK(Lys-P)K(AHX)(DF)CF(DW)KTC-Thr(ol)
서열번호 48 ( SOM - BBB25 )
(PFHA)K(DK)K(ACPA)KK(Lys-P)K(AHX)(DF)CF(DW)KTC-Thr(ol)
서열번호 41-48에서, (AHX)는 아미노헥사노익산; (Dab) = 디아미노부티르산; (Dap) = 디아미노프로피오닉산; (Tie) = tert-류신; (Cl-Phe) = 4-클로로페닐알라닌;
(NN3 APG) = N,N-bis(3-아미노프로필)글리신; (AHX) = 아미노헥사노익산; (Lys-P) = Lys-팔미토일; Thr(ol) =트레오니놀; DK, DF, DW는 D-이성질체; PFHA는 2H, 2H, 3H, 3H-퍼플루오로헵타노익산; 그리고 ACPA는 8-아리오노카프릴릭산(aroinocaprylic acid)이다.
서열번호 49 ( GAL - BBB3 )
WTLNSAGYLLGPKKXK-NH2
서열번호 50 ( GAL - BBB4 )
Sar-WTLNSAGYLLGP(D-Lys)(D-Lys)X(D-Lys)-NH2
서열번호 51 ( GAL - BBB5 )
Sar-WTLNSAGYLLGPRRXR-NH2
서열번호 52 ( GAL - BBB6 )
Sar-WTLNSAGYLLGPHHXH-NH2
서열번호 53 ( GAL - BBB7 )
Sar-WTLNSAGYLLKKKKXK-NH2
서열번호 54 ( GAL - BBB8 )
Sar-WTLNSAGYLLKKXK-NH2
서열번호 49-54에서, Sar는 사코신이고 X는 Lys-팔미토일 잔기이다.
서열번호 55 ( DSIP - BBB8 )
(AHX)GGWAGGDASGE
서열번호 56
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)K
서열번호 57
WTLNSAGYLLGPKK(LyS-P)K
서열번호 58
(DK)(DK)(DK)(Kp)GGWAGGDASGE
서열번호 59
(Sar)WTLNSAGYLLGPRR(Lys-P)R
서열번호 60
(Sar)WTLNSAGYLLKKKK(Lys-P)K
서열번호 61
(Sar)WTLNSAGYLLGPKKKK
서열번호 62
(Sar)WTLNSAGYLLKK(Lys-P)K
서열번호 63
(Sar)WTLNSAGYKK(Lys-P)K
서열번호 64
(Sar)WTLNSAGYLLGP(Ahx)KK(Lys-P)K
서열번호 65
(Sar)WTLNSAGY(Ahx)KK(Lys-P)K
서열번호 66
(Sar)WTLNSAGYKK(Lys-P)K
서열번호 67
(Sar)WTLNSAGY(Ahx)KK(Lys-P)K
서열번호 68
(Sar)WTLNSAGYLLGPHA(Lys-P)
서열번호 69
(Sar)WTLNSAGYLLGPDKDK(Lys-P)DK
서열번호 70
(Sax)WTLNSAGYLLGPRR(Lys-P)R
서열번호 71
(Sar)WTLNSAGYLLKKKK(Lys-P)K
서열번호 72
(Sar)WTLNS AGYLLKK(LyS-P)K
서열번호 73
(Sar)WTLNSAGYLLGP(Om)(Orn)(Lys-P)(Orn)
서열번호 74
(Sar)WTLNSAGYLLGP(Dab)(Dab)(Lys-P)(Dab)
서열번호 75
(Sar)WTLNSAGYLLGPbKbK(Lys-P)bK
서열번호 76
(Sar)WTLNSAGYLLGPHH(Lys-P)H
서열번호 77
(Sar)WTLNSAGYLLGP(Lys-P)KKK
서열번호 78
(Sar)WTLNSAGYLLGPK(Lys-P)KK
서열번호 79
(Sar)WTLNSAGYLLGPKKK(Lys-P)
서열번호 80
(Sar)WTLNSAGY(SpermineS)(Lys-P)
서열번호 81
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)-(SpermineS)
서열번호 82
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Glu-Spermine)K
서열번호 83
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-Spermine-Palmitoyl)K
서열번호 84
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(TDA)K
서열번호 85
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(NorL)K
서열번호 86
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Man)K
서열번호 87
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Mel)K
서열번호 88
(Sar)WTLNSAGYLL(lPEG)KK(Lys-P)K
서열번호 89
(Sar)WTLNSAGYLL(5AVA)KK(LyS-P)K
서열번호 90
(Sar)WTLNSAGYL(2PEG)KK(Lys-P)K
서열번호 91
(Sar)WTLNSAGYL(8AOA)KK(Lys-P)K
서열번호 92
(Sar)WTLNSAGY(lPEG)(5AVA)KK(Lys-P)K
서열번호 93
GWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS-COOH
서열번호 94
GWTLNSAGYLLGPHAIDNHRSFSDKHGLT-NH2
서열번호 95
GWTLNSAGYLLGPHAIDlSIHRSFHDKYGLA-NH2
서열번호 96
GWTLNSAGYLLGPHAI
서열번호 97
GWTLNSAGYLLGPH
서열번호 98
GWTLNSAGYLLG
서열번호 99
GWTLNSAGYL
서열번호 100
GWTLNSAGY
상기 서열에서:
Ahx= 아미노헥사노익산
DK= 라이신의 D-이성질체
orn= 오르니틴
Dab= 2,4 디아미노부티르산
bK= 베타-호모-라이신
spermineS= 스퍼민-N4 숙시닉산
TDA= 테트라데카노익산
NorL= 노르류신
man=L-Ser-beta-멜리바이오스
1-PEG= 5-아미노-3-옥사펨타노익산
5AVA=5-아미노밸러릭산
2-PEG = 8-아미노-3,6-디옥사옥타노익산
8AOA= 8-아미노 옥타노익산.
서열번호 101
DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2
서열번호 102
Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Phe-Ser-Gly-Glu
서열번호 103
Tyr-GIy-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln
서열번호 104
PAEDLARYYSALRAYINLITRQRY-NH2
서열번호 105
KK(Kp)KX (여기서 X는 모든 길이 및 모든 아미노산이 될 수 있다)
서열번호 106
KK(Kp)KGX (여기서 X는 모든 길이 및 모든 아미노산이 될 수 있다)
서열번호 107
KK(Kp)K(Ahx)-(neuropeptide)
(여기서 X는 모든 길이 및 모든 아미노산이 될 수 있다)
서열번호 108
KK(Kp)K(Ahx)G-(neuropeptide)
(여기서 X는 모든 길이 및 모든 아미노산이 될 수 있다)
서열번호 109
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Axg-Pro-Lys-Leu-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2
서열번호 110
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Axg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys- NH2
서열번호 111
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2
서열번호 112
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ue-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-(Ahx)-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys- NH2
서열번호 113
KKK(Kp)(AhX)RAYINLITRQRY-NH2
서열번호 114
KK(Kp)K(AhX)RAYINLITRQRY-NH2
서열번호 115
KK(Kp)K-[X(13-36)]
(여기서 X(13-36)는 뉴로펩타이드 Y 유사체를 나타낸다)
서열번호 116
KK(Kp)KG-[X(13-36)]
(여기서 X(13-36)는 뉴로펩타이드 Y 유사체를 나타낸다)
서열번호 117
KK(Kp)K(Ahx)-[X(13-36)]
(여기서 X(13-36)는 뉴로펩타이드 Y 유사체를 나타낸다)
서열번호 118
KK(Kp)K(Ahx)G-[X(13-36)]
(여기서 X(13-36)는 뉴로펩타이드 Y 유사체를 나타낸다)
서열번호 119
(Sar)WTLNSAGY(D-Lys)(D-Lys)(Lys-P)(D-Lys)
서열번호 120
(Sar)WTLNSAGY(Ahx)(D-Lys)(D-Lys)(Lys-P)(D-Lys)
서열번호 121
(Sar)WTLNSAGY(7-Ahp)(D-Lys)(D-Lys)(Lys-P)(D-Lys)
서열번호 122
(Sar)WTLNSAGY(3,5-dibromo-Tyr)LLGPKK(Lys-P)K
서열번호 123
(Sar)WTLNSAGYLLGPHH(Lys-P)K
서열번호 124
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Cys-Mmt)K
서열번호 125
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-Biotin-aminocaproyl)K
서열번호 126
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-sterol)K
서열번호 127
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-decanoyl)K
서열번호 128
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-octanoyl)K
서열번호 129
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-linoyl)K
서열번호 130
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Ser-melbiose)K
서열번호 131
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-adamentoyl)K
서열번호 132
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Glu(β-Lac-PEG3-amine))K
서열번호 133
(Sar)WTLTSAGYLLGPKK(Lys-palmitoyl)K
서열번호 134
(Sar)WTLLSAGYLLGPKK(Lys-palmitoyl)K
서열번호 135
(Sar)WTLDSAGYLLGPK-K(Lys-Palmitoyl)K
서열번호 136
(Ahx)GGWAGGDASGE
서열번호 137
(Palm)GGWAGGDASGE
서열번호 138
(Kp)GGWAGGDASGE
서열번호 139
KKK(Kp)GGW AGGDASGE
서열번호 140
KK(Kp)KGGWAGGDASGE
서열번호 141
KKKGGWAGGDASGE
서열번호 58 및 135-141에서, (DK)는 D-Lys, (Kp)는 Lys-palmitoyl, Axh는 아미노헥사노익산, Palm은 팔미틱산이다.

Claims (56)

  1. 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 3의 아미노산 서열과 최소 약 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 한개 이상의 아미노산이 보존적으로 치환된 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  2. 서열번호 2, 4-29, 37-39, 50, 64, 65, 66, 67, 80, 82 및 89로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 2, 4-29, 37-39, 50, 64, 65, 66, 67, 80, 82 및 89로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 최소 약 90%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 한개 이상의 아미노산이 보존적으로 치환된 서열번호 2, 4-29, 37-39, 50, 64, 65, 66, 67, 80, 82 및 89로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  3. 서열번호 31-36으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 31-36으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 최소 약 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 한개 이상의 아미노산이 보존적으로 치환된 서열번호 31-36으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  4. 서열번호 40의 아미노산 서열, 서열번호 40의 아미노산 서열과 최소 약 90%의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 한개 이상의 아미노산이 보존적으로 치환된 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  5. 서열번호 105, 106, 107, 108, 109-112 및 113-118로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 105, 106, 107, 108, 109-112 및 113-118로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 최소 약 90%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 한개 이상의 아미노산이 보존적으로 치환된 서열번호 105, 106, 107, 108, 109-112 및 113-118로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  6. 서열번호 58 및 135-141로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 서열번호 58 및 135-141로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 최소 약 90%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 한개 이상의 아미노산이 보존적으로 치환된 서열번호 58 및 135-141로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 갈라닌(galanin)과 비교하여 증가된 안정성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  8. 제 3 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 소마토스타틴(somatostatin)과 비교하여 증가된 안정성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 델타 수면 유도 펩타이드(delta sleep inducing peptide, DSIP)와 비교하여 증가된 안정성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  10. 비-변형된 펩타이드와 비교하여 증가된 지방 친화성을 갖고, 증가된 염기성을 갖는 펩타이드를 포함하는, 혈액-뇌장벽 투과성이 증진된 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 조성물은 한개 이상의 추가의 조성물과 혼합 사용 되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 추가의 조성물은 하기에 기재된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물: 뉴로펩타이드 Y, 다이노르핀(dynorphin), 아편유사제(opioid) 및 아편유사제 펩타이드, 몰핀, 하이드록시몰핀, 펜타닐, 옥시코돈, 코데인; 캡사이신; 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 카바마제핀(carbamazepine), 프리미돈(primidone), 가바펜틴(gabapentin), 프레가발린(pregabalin), 디아제팜(diazepam), 펠바메이트(felbamate), 플루오로펠바메이트, 라모트리진(lamotrigine), 라코사마이드(lacosamide), 레베티라세탐(levetiracetam), 페노바비탈(phenobabital), 페니토인(phenytoin), 포스-페니토인, 토피라메이트(topiramate), 발프로에이트(valproate), 비가바트린(bigabatrin), 조니사마이드(zonisamide), 옥스카바제핀(oxcarbazepine), 비스테로이드성 항-염증 약물(NSAIDs), 국소 마취제(이도카인과 같은), 글루타메이트 수용체 대항제, NMDA 대항제, 알파-아드레노셉터 작용제 및 대항제, 아데노신, 카나비노이드(canabinoid), NK-1 대항제(CI-1021), 항우울제(예, 아미트립틸린(amitriptyline), 데시프라민(desipramine), 이미프라민(imipramine)), 갈라닌 유사물질 및 유도체, 소마토스타틴, 델타-수면 유도 펩타이드, 엔케팔린(enkephalin), 옥시토신 콜레시스티키닌(cholecystikinin), 칼시토닌(calcitonin), 코르티스타틴(cortistatin), 노시셉틴(nociceptin) 및 기타 뉴로펩타이드계 치료제, 퓨로닉 P85 차단 코폴리머, 플루 리잔(Flurizan)과 같은 아밀로이드 저하제를 포함하는 항간질 약물; 갈란타민(galantamine)(Razadyne); 리바스티그민(rivastigmine)(Exelon); 도네페질(donepezil)(Aricept); 타크린(tacrine)(Cognex); 메만틴(memantine)(Namenda); 및 알츠하이머병용 백신.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지방 친화성은 펩타이드를 소수성 모이어티에 결합시킴으로써 증가하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 소수성 모이어티는 폴리지방족 사슬인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지방 친화성은 방향족 잔기의 할로겐화를 증가시킴으로써 증가되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 라이신, 아르기닌, 호모-라이신, 호모-아르기닌, L- 또 는 D-이성질체 형태의 오르니틴; 2,3-디아미노프로피온산; 2,4-디아미노부티르산을 포함하는 양전하 아미노산 잔기의 호모- 및 헤테로올리고머를 도입함으로써 증가하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기성은 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아미도아민 덴드리머 또는 폴리아민 톡신과 그의 유도체와 같은 폴리아민계 모이어티에 결합됨으로써 증가하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 10 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 비-변형된 펩타이드와 비교해 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 큰 효율로 혈액-뇌장벽을 투과할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 10 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 비-변형된 형태의 펩타이드와 비교해 글리코실화가 증가된 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 10 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 벡터.
  21. 비-변형된 형태의 펩타이드와 비교해 지방 친화성을 증가시키고, 펩타이드의 염기성을 증가시키는 것을 포함하는, 펩타이드의 혈액-뇌장벽 투과성 증가 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 지방 친화성은 펩타이드를 소수성 모이어티에 결합시킴으로써 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 소수성 모이어티는 폴리지방족 체인인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 21 항에 이어서, 상기 지방 친화성은 방향족 잔기의 할로겐화를 증가시킴으로써 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 21 항에 있어서, 상기 염기성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 라이신, 아르기닌, 호모-라이신, 호모-아르기닌, L- 또는 D-이성질체 형태의 오르니 틴; 2,3-디아미노프로피온산; 2,4-디아미노부티르산을 포함하는 양전하 아미노산 잔기의 호모- 및 헤테로-올리고머를 도입함으로써 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 21 항에 있어서, 상기 염기성은 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아미도아민 덴드리머 또는 폴리아민 톡신과 그의 유도체와 같은 폴리아민계 모이어티에 결합됨으로써 증가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 21 항에 있어서, 상기 펩타이드는 비-변형된 펩타이드와 비교해 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 큰 효율로 혈액-뇌장벽을 투과할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 21 항에 있어서, 상기 방법은 비-변형된 펩타이드와 비교해 펩타이드의 글리코실화를 증가시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1 항의 폴리펩타이드를 치료가 필요한 환자에게 유효량으로 투여하는 단 계를 포함하는 간질 치료 방법.
  30. 제 10 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 치료가 필요한 환자에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 간질 치료 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 간질은 전신성, 부분 또는 불응성 간질인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
  32. 제 1 항의 폴리펩타이드를 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량 투여하는 단계를 포함하는 통증 또는 기타 신경성 질환의 치료, 예방 또는 완화 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 통증은 하나 이상의 하기 질환에 의해 유발되거나, 신경성 질환은 하나 이상의 하기 질환으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법: 만성 등 통증, 암, 섬유성근육통(fibromyalgia), 신경통, 다발성 경화증, 당뇨병 신경병증, 말초 신경 손상, 외상 단발신경병증, 복합 국부 통증 증후군 및 척수 손상.
  34. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 척수 손상 치료 방법.
  35. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 다발성 경화증 치료 방법.
  36. 제 2 항의 폴리펩타이드를 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량 투여하는 단계를 포함하는 신경성 질환의 치료, 예방 또는 완화 방법.
  37. 제 3 항의 폴리펩타이드를 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량 투여하는 단계를 포함하는 신경성 질환의 치료, 예방 또는 완화 방법.
  38. 제 32 항 또는 제 36 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경성 질환은 간질인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 32 항 또는 제 36 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경성 질환은 우울증인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 32 항 또는 제 36 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경성 질환은 통증인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 32 항 또는 제 36 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경성 질환은 알쯔하이머병인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 32 항 또는 제 36 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 한개 이상의 추가의 조성물로도 치료되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. i. 환자의 치료에 사용되어야 하는 조성물을 동정하는 단계;
    ii. 상기 조성물의 지방 친화성 및 염기성을 증가시킴으로써 상기 조성물을 변형시키는 단계;
    iii. 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 변형된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 혈액-뇌장벽 투과 조성물을 이용한 치료 방법.
  44. i. 환자의 치료에 사용되어야 하는 조성물을 동정하는 단계;
    ii. 상기 조성물의 지방 친화성, 글리코실화 및 염기성을 증가시킴으로써 상기 조성물을 변형시키는 단계;
    iii. 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 변형된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 혈액-뇌장벽 투과 조성물을 이용한 치료 방법.
  45. i. 환자의 치료에 사용되어야 하는 조성물을 동정하는 단계;
    ii. 상기 조성물의 지방 친화성 및 염기성을 증가시킴으로써 상기 조성물을 변형시키는 단계;
    iii. 상기 변형된 조성물을 벡터에 삽입하는 단계;
    iv. 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 혈액-뇌장벽 투과 조성물을 이용한 치료 방법.
  46. i. 환자의 치료에 사용되어야 하는 조성물을 동정하는 단계;
    ii. 상기 조성물의 지방 친화성 및 염기성을 증가시킴으로써 상기 조성물을 변형시키는 단계;
    iii. 상기 변형된 조성물을 벡터에 삽입하는 단계;
    iv. 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 벡터를 투입하는 단계를 포함하는, 혈액-뇌장벽 투과 조성물을 이용한 치료 방법.
  47. 혈액-뇌장벽의 투과성이 증가된 조성물의 제조방법으로서, 이 방법은 혈액-뇌장벽혈액-뇌장벽 증가된 조성물을 제조하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 비-변형된 형태의 펩타이드와 비교해 증가된 지방 친화성과 증가된 염기성을 갖는 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 지방 친화성은 펩타이드를 소수성 모이어티에 결합시킴으로써 증가되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  49. 제 47 항에 있어서, 상기 소수성 모이어티는 폴리지방족 체인인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  50. 제 47 항에 있어서, 상기 지방친화성은 방향족 잔기의 할로겐화를 증가시킴으로써 증가되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  51. 제 47 항에 있어서, 상기 염기성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 라이신, 아르기닌, 호모-라이신, 호모-아르기닌, L- 또는 D-이성질체 형태의 오르니틴; 2,3-디아미노프로피온산; 2,4-디아미노부티르산을 포함하는 양전하 아미노산 잔기의 호모- 및 헤테로-올리고머를 도입함으로서 증가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  52. 제 47 항에 있어서, 상기 염기성은 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아미도아민 덴드리머(polyamidoamine dendrimer) 또는 폴리아민 톡신 및 이의 유도체와 같은 폴리아민계 모이어티에 결합시킴으로써 증가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  53. 제 47 항에 있어서, 상기 펩타이드는 비-변형된 펩타이드와 비교해 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 증가된 효율로 혈액 혈관막을 통과할 수 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  54. 제 47 항에 있어서, 상기 펩타이드는 비-변형된 형태의 펩타이드와 비교해 글리코실화가 증가된 것을 특징으로 하는 제조방법.
  55. 제 47 항에 있어서, 상기 펩타이드는 스페이서를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 스페어서는 Gly, Ahx, Gly-Ahx 또는 GPE-O2Oc로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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