JP2014147394A - 神経系を標的する薬理学的物質の性質を改善することに関連する方法および組成物 - Google Patents
神経系を標的する薬理学的物質の性質を改善することに関連する方法および組成物 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】Sar−Trp−Thr−Leu−Asn−Ser−Ala−Gly−Tyr−Leu−Leu−Gly−Pro−Lys−Lys−(Lys−palm)−Lys−NH2のアミノ酸配列を有するガラニン類似のポリペプチド。該アミノ酸配列と少なくとも約90%同一のアミノ酸配列、あるいは1以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。さらに、血液脳関門の高い透過性を有する組成物は、変化していない形態のペプチドと比較したとき高い親油特性と高い塩基度を有するペプチドを含む。
【選択図】図1
Description
本出願は、2006年1月5日に出願された米国仮特許出願第60/757,047および2006年9月11日に出願された米国仮特許出願第60/844,024の利益を主張する。2006年1月5日に出願された米国仮特許出願第60/757,047および2006年9月11日に出願された米国仮特許出願第60/844,024は、本明細書中で参考として援用される。
血液脳関門(BBB)は、哺乳動物の脳を全身循環から切り離し、中枢神経系(CNS)のホメオスタシスにおいて極めて重要な役割を果たす。血液脳関門を通してのペプチドの輸送の理解は継続的に進展しているにもかかわらず、CNSへのそれらの直接の効率的な送達は、現在も神経ペプチドを潜在的治療薬として開発する上での主要な課題となっている。
本明細書で具体化され、広く説明される、本発明の目的に従って、本発明は、1つの態様では、配列番号3、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも約90%同一のアミノ酸配列、あるいは1以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号3のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドに関する。
ミノ酸配列と少なくとも約90%同一のアミノ酸配列、あるいは1以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号2、4−29、37−39、50、64、65、66、67、80、82および89から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドが開示される。
成物をその必要のある対象に投与することを含む、血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法が開示される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
配列番号3、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも約90%同一のアミノ酸配列、あるいは1以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号3のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
(項目2)
配列番号2、4−29、37−39、50、64、65、66、67、80、82および89から成る群より選択されるアミノ酸配列、配列番号2、4−29、37−39、50、64、65、66、67、80、82および89から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約90%同一のアミノ酸配列、あるいは1以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号2、4−29、37−39、50、64、65、66、67、80、82および89から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
(項目3)
配列番号31−36から成る群より選択されるアミノ酸セグメント、配列番号31−36から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約90%同一のアミノ酸配列、あるいは1以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号31−36から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
(項目4)
配列番号40、配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも約90%同一のアミノ酸配列、あるいは1以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号40のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
(項目5)
配列番号105、106、107、108、109−112および113−118から成る群より選択されるアミノ酸配列、配列番号105、106、107、108、109−112および113−118から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約90%同一のアミノ酸配列、あるいは1以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号105、106、107、108、109−112および113−118から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
(項目6)
配列番号58および135−141から成る群より選択されるアミノ酸配列、配列番号58および135−141から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約90%同一のアミノ酸配列、あるいは1以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号58および135−141から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
(項目7)
前記ポリペプチドが、ガラニンと比較したとき高い安定性を有する、項目1または2に記載のポリペプチド。
(項目8)
前記ポリペプチドが、ソマトスタチンと比較したとき高い安定性を有する、項目3に記載
のポリペプチド。
(項目9)
前記ポリペプチドが、デルタ睡眠誘発ペプチド(DSIP)と比較したとき高い安定性を有する、項目6に記載のポリペプチド。
(項目10)
血液脳関門の高い透過性を有する組成物であって、変化していない形態のペプチドと比較したとき高い親油特性と高い塩基度を有する該ペプチドを含む組成物。
(項目11)
1以上のさらなる組成物と組み合わせて使用される、項目10に記載の組成物。
(項目12)
前記さらなる組成物が、神経ペプチドY、ジノルフィン、オピオイドおよびオピオイドペプチド、モルヒネ、ヒドロキシモルヒネ、フェンタニル、オキシコドン、コデイン;カプサイシン;ならびにカルバマゼピン、プリミドン、ガバペンチン、プレガバリン、ジアゼパム、フェルバメート、フルオロフェルバメート、ラモトリギン、ラコサミド、レベチラセタム、フェノバルビタール、フェニトイン、フォスフェニトイン、トピラメート、バルプロエート、ビガバトリン、ゾニサミド、オキシカルバゼピン、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、局所麻酔薬(リドカインなど)、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、NMDAアンタゴニスト、αアドレナリン作用性受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、アデノシン、カンナビノイド、NK−1アンタゴニスト(CI−1021)、抗うつ薬(例えばアミトリプチリン、デシプラミン、イミプラミン)、ガラニン、ソマトスタチン、デルタ睡眠誘発ペプチド、エンケファリン、オキシトシン、コレシストキニン、カルシトニン、コルチスタチン、ノシセプチンおよび他の神経ペプチドに基づく治療薬の類似体および誘導体、プルロニックP85ブロックコポリマーを含むが、これらに限定されない、クラスとしての抗てんかん薬、Flurizanなどのアミロイド低下剤;ガランタミン(Razadyne);リバスチグミン(Exelon);ドネペジル(Aricept);タクリン(Cognex);メマンチン(Namenda);およびアルツハイマー病のためのワクチンから成る群より選択される、項目10に記載の方法。
(項目13)
前記親油特性が、前記ペプチドを疎水性部分に結合体化することによって高められる、項目10−12のいずれか1項に記載の組成物。
(項目14)
前記疎水性部分がポリ脂肪族鎖である、項目10に記載の組成物。
(項目15)
前記親油特性が、芳香族残基のハロゲン化を増大させることによって高められる、項目10−14のいずれか1項に記載の組成物。
(項目16)
前記塩基度が、リシン、アルギニン、ホモリシン、ホモアルギニン、LまたはD異性体立体配置のオルニチン;2,3−ジアミノプロピオン酸;2,4−ジアミノ酪酸を含むが、これらに限定されない、正に荷電したアミノ酸残基のホモおよびヘテロオリゴマーを導入することによって高められる、項目10−15のいずれか1項に記載の組成物。
(項目17)
前記塩基度が、スペルミン、スペルミジン、ポリアミドアミンデンドリマーまたはポリアミン毒素およびそれらの誘導体などの、ポリアミンベースの部分への結合体化によって高められる、項目10−15のいずれか1項に記載の組成物。
(項目18)
前記ペプチドが、変化していない該ペプチドと比較して1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%より効率的に血液脳関門を通過することができる、項目10−17のいずれか1項に記載の組成物。
(項目19)
前記ペプチドがまた、変化していない形態の該ペプチドと比較したとき高いグリコシル化
を有する、項目10−18のいずれか1項に記載の組成物。
(項目20)
項目10−18のいずれか1項に記載の組成物を含むベクター。
(項目21)
ペプチドについての血液脳関門の透過性を上昇させる方法であって、変化していない形態の該ペプチドと比較して該ペプチドの親油特性を上昇させることおよび塩基度を増大させることを含む、方法。
(項目22)
前記親油特性が、前記ペプチドを疎水性部分に結合体化することによって高められる、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記疎水性部分がポリ脂肪族鎖である、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記親油特性が、芳香族残基のハロゲン化を増大させることによって高められる、項目21に記載の方法。
(項目25)
前記塩基度が、リシン、アルギニン、ホモリシン、ホモアルギニン、LまたはD異性体立体配置のオルニチン;2,3−ジアミノプロピオン酸;2,4−ジアミノ酪酸を含むが、これらに限定されない、正に荷電したアミノ酸残基のホモおよびヘテロオリゴマーを導入することによって高められる、項目21に記載の方法。
(項目26)
前記塩基度が、スペルミン、スペルミジン、ポリアミドアミンデンドリマーまたはポリアミン毒素およびそれらの誘導体などの、ポリアミンベースの部分への結合体化によって高められる、項目21に記載の方法。
(項目27)
前記ペプチドが、変化していない該ペプチドと比較して1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%より効率的に血液脳関門を通過することができる、項目21に記載の方法。
(項目28)
変化していない形態の前記ペプチドと比較して該ペプチドのグリコシル化を増大させることをさらに含む、項目21に記載の方法。
(項目29)
項目1に記載のポリペプチドの有効量をその必要のある対象に投与することを含む、てんかんを治療する方法。
(項目30)
項目10−19のいずれか1項に記載の組成物の有効量をその必要のある対象に投与することを含む、てんかんを治療する方法。
(項目31)
前記てんかんが、全身、部分または難治性てんかんである、項目30に記載の方法。
(項目32)
項目1に記載のポリペプチドの有効量をその必要のある対象に投与することを含む、疼痛または他の神経障害を治療、予防または改善する方法。
(項目33)
項目32に記載の方法であって、前記疼痛が以下の1つ以上によって引き起こされる、または前記神経障害が以下の1つ以上から選択される:慢性背痛、癌、線維筋痛、ヘルペス後神経痛、多発性硬化症、糖尿病性ニューロパシー、末梢神経損傷、外傷性モノニューロパシー、複合性局所疼痛症候群および脊髄損傷。
(項目34)
項目10−12のいずれか1項に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象において脊髄損傷を治療する方法。
(項目35)
項目10−12のいずれか1項に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象において多発性硬化症を治療する方法。
(項目36)
項目2に記載のポリペプチドの有効量をその必要のある対象に投与することを含む、神経障害を治療、予防または改善する方法。
(項目37)
項目3に記載のポリペプチドの有効量をその必要のある対象に投与することを含む、神経障害を治療、予防または改善する方法。
(項目38)
前記神経障害がてんかんである、項目32または36−37のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
前記神経障害がうつ病である、項目32または36−37のいずれか1項に記載の方法。(項目40)
前記神経障害が疼痛である、項目32または36−37のいずれか1項に記載の方法。
(項目41)
前記神経障害がアルツハイマー病である、項目32または36−37のいずれか1項に記載の方法。
(項目42)
前記対象がまた、1以上の付加的な組成物でも治療される、項目32または36−37のいずれかに記載の方法。
(項目43)
血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法であって、
i.該対象の治療において使用する該組成物を同定すること;
ii.該組成物の親油性と塩基度を増大させることによって該組成物を修飾すること;
iii.該修飾した組成物をその必要のある該対象に投与すること;
を含む、方法。
(項目44)
血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法であって、
i.該対象の治療において使用する該組成物を同定すること;
ii.該組成物の親油性、グリコシル化および塩基度を増大させることによって該組成物を修飾すること;
iii.該修飾した組成物をその必要のある該対象に投与すること;
を含む、方法。
(項目45)
血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法であって、
i.該対象の治療において使用する該組成物を同定すること;
ii.該組成物の親油性、グリコシル化および塩基度を増大させることによって該組成物を修飾すること;
iii.該修飾した組成物をベクターに挿入すること;
iv.その必要のある該対象に該ベクターを投与すること
を含む、方法。
(項目46)
血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法であって、
i.該対象の治療において使用する該組成物を同定すること;
ii.該組成物の親油性と塩基度を増大させることによって該組成物を修飾すること;
iii.該修飾した組成物をベクターに挿入すること;
iv.その必要のある該対象に該ベクターを投与すること
を含む、方法。
(項目47)
血液脳関門の高い透過性を有する組成物を作製する方法であって、血液脳関門の高い透過性を有する組成物を作製することを含み、該組成物が、変化していない形態のペプチドと比較したとき高い親油特性と高い塩基度を有する該ペプチドを含有する、方法。
(項目48)
前記親油特性が、前記ペプチドを疎水性部分に結合体化することによって高められる、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記疎水性部分がポリ脂肪族鎖である、項目47に記載の方法。
(項目50)
前記親油特性が、芳香族残基のハロゲン化を増大させることによって高められる、項目47に記載の方法。
(項目51)
前記塩基度が、リシン、アルギニン、ホモリシン、ホモアルギニン、LまたはD異性体立体配置のオルニチン;2,3−ジアミノプロピオン酸;2,4−ジアミノ酪酸を含むが、これらに限定されない、正に荷電したアミノ酸残基のホモおよびヘテロオリゴマーを導入することによって高められる、項目47に記載の方法。
(項目52)
前記塩基度が、スペルミン、スペルミジン、ポリアミドアミンデンドリマーまたはポリアミン毒素およびそれらの誘導体などの、ポリアミンベースの部分への結合体化によって高められる、項目47に記載の方法。
(項目53)
前記ペプチドが、変化していない該ペプチドと比較して1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%より効率的に血液脳関門を通過することができる、項目47に記載の方法。
(項目54)
前記ペプチドがまた、変化していない形態の該ペプチドと比較したとき高いグリコシル化を有する、項目47に記載の方法。
(項目55)
前記ペプチドがスペーサーを含む、項目47に記載の方法。
(項目56)
前記スペーサーが、Gly、Ahx、Gly−AhxまたはPEG−O2Ocから成る群より選択される、項目55に記載の方法。
本発明は、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明およびその中に含まれる実施例、ならびに図面とそれらの上記および下記の説明を参照することによってより容易に理解され得る。
本明細書および付属の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかに異なる指示を与えない限り、複数の指示対象を包含する。それ故、例えば「医薬担体」への言及は、2以上のそのような担体の混合物を含む、等である。
「任意の(optional)」または「場合により(optionally)」は、その後に述べられる事象または状況が起こってもよくまたは起こらなくてもよいこと、およびその記述が、前記事象または状況が起こる場合と起こらない場合を包含することを意味する。
1.血液脳関門
血液脳関門(BBB)は、適切な機能のために必要な栄養素を脳に供給しながら、血流中の有害物質から脳を保護する毛細血管内皮細胞の特殊なシステムである。細胞を横切る/細胞間の物質の比較的自由な交換を許容する末梢毛細血管と異なり、BBBは、物理的(密着結合)および代謝(酵素)関門の両方を通して脳内への輸送を厳密に制限する。それ故BBBは、しばしば、治療薬の脳内への透過を決定する上での速度制限因子である。
血液脳関門を通るペプチドおよびタンパク質の透過性を改善するために多くの戦略が試験されてきた。これらはいくつかのカテゴリーに分けることができる:(1)CNSへのペプチドの取り込みを増強するベクターまたは栄養素能動輸送体への結合体化;(2)単純拡散を増強する高い親油性を生じさせる脂質付加/ハロゲン化;(3)吸収トランスサイトーシスを通しての輸送を増強するカチオン化(塩基度上昇);および(4)能動/受動輸送およびペプチドの薬物動態プロフィールを改善するグリコシル化またはプロドラッグ((Wittら、2001)および(PanとKastin,2004a))。そのような試験の例および主要所見を表1に示す。各々の参考文献は、血液脳関門の透過に関するその教示に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
n、2004b)。これらの新規薬剤送達技術は、本明細書で開示され、当技術分野で公知の神経ペプチドに基づく組成物にも適用できる。
組成物の親油特性は、例えばペプチドを疎水性部分に結合体化することによって上昇させ得る。疎水性部分の例は、ポリ脂肪族鎖または芳香族残基を含むが、これらに限定されない。親油特性はまた、ペルフルオロヘキサン酸などの、芳香族残基またはポリ脂肪族試薬のハロゲン化を増大させることによって高めることができる。
組成物の塩基度は、リシン、アルギニン、ホモリシン、ホモアルギニン、LまたはD異性体立体配置のオルニチン;2,3−ジアミノプロピオン酸;2,4−ジアミノ酪酸を含
むが、これらに限定されない、正に荷電したアミノ酸残基のホモおよびヘテロオリゴマーを導入することによって上昇させ得る。
グリコシル化は、キシロース、グルコース、ガラクトース、マルトース、マルトトリオース、マンノース、ラクトース、メリビオースまたは同様の糖への結合体化によって導入することができる。
また、本明細書で開示される組成物を含むベクターを開示する。BBBを通過することができるベクターの一例は、Toyobukuら(J Pharmacol Exp Ther.2003 Apr;305(1):40−7.)に見出される。
中枢神経系に関わる特定疾患および障害を治療する方法、または血液脳関門を通過する化合物を必要とする適用を本明細書で開示する。様々な疾患および障害が本明細書で開示する方法および組成物によって治療でき、発作および関連虚血疾患、慢性背痛、脊髄損傷、末梢神経損傷、外傷性脳損傷、網膜変性、神経変性疾患、白内障、抗生物質誘導性中毒性難聴、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS、ルー・ゲーリグ病)、てんかん(全身、部分または難治性てんかんなど)、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、慢性背痛、線維筋痛、ヘルペス後神経痛、糖尿病性ニューロパシー、外傷性モノニューロパシー、複合性局所疼痛症候群、アジュバント鎮痛(adjuvant analgesic)、神経根切断/神経切除、切断前痛覚脱失/切断、てんかん原性/外傷、化学物質曝露、てんかん重積持続状態、化学療法誘発性ニューロパシー、癌、オピオイド離脱症状、および慢性神経因性疼痛が含まれる。投与の方法と経路、用量、および医薬組成物を以下でより詳細に論じる。
primary afferent and cranial motor neurons Eur J Neurosci.2006 Sep;24(6):1555−64。
また、対象の治療において使用する組成物を同定すること;組成物の親油性、グリコシル化および塩基度を増大させることによって組成物を修飾すること;および修飾した組成物をその必要のある対象に投与することを含む、血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法を開示する。
開示される組成物は、研究ツールとして様々な方法で使用することができる。例えば配列番号1−55のような開示組成物は、例えばてんかんを検討するための試薬として使用できる。
開示される組成物および方法は、標的遺伝子破壊および修飾のために、これらの事象を受けることができる任意の動物において使用できる。例えばガラニンを生産する遺伝子を、血液脳関門の高い透過性を有するガラニン類似体を発現するように変化させることができる。遺伝子修飾および遺伝子破壊は、哺乳動物などの動物における、修飾が哺乳動物の生殖細胞系を通して伝播する方法での、遺伝子または一続きの染色体の選択的除去または変化を取り巻く方法、手法および組成物を指す。一般に、細胞は、例えば本明細書で述べるような、その細胞内に含まれる特定染色体の領域と相同的に組み変わるように設計されたベクターで形質転換される。この相同的組換え事象は、周囲のDNAと共に、例えばインフレームで導入された外来性DNAを有する染色体を生産することができる。この種のプロトコルは、点突然変異などの非常に特異的な突然変異が、細胞内に含まれるゲノムに導入されることを可能にする。この種の相同的組換えを実施するための方法は本明細書で開示される。
ランスフェクトした核を、その後動物を生産するように操作することができる卵母細胞と融合する。ESテクノロジーの代わりにクローニングを使用する手順の利点は、ES細胞以外の細胞をトランスフェクトできることである。例えば、培養が非常に容易である線維芽細胞を、トランスフェクトして、遺伝子修飾または破壊事象を生じさせる細胞として使用することができ、その後この細胞由来の細胞を、動物全体をクローニングするために使用できる。
開示化合物を調製するために使用される成分ならびに組成物自体および本明細書で開示する方法において使用される成分を開示する。これらや他の材料が本明細書で開示されるが、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群等が開示されるとき、これらの化合物のありとあらゆる個別および集合的組合せ、ならびに順列への具体的な言及は明白に開示されないことがあり得るが、各々は本明細書で明確に考慮され、記述されることが了解される。例えば特定ガラニン類似体が開示され、論じられ、変異体を含む多くの分子に対して行い得る多くの修飾が論じられる場合、明確に異なる指示がない限り、ガラニン類似体のありとあらゆる組合せと順列および可能な修飾が明確に考慮される。それ故、分子A、BおよびCのクラスならびに分子D、EおよびFのクラスおよび組合せ分子の一例であるA−Dが開示される場合、各々が個別に列挙されていない場合でも、各々が個別に及び集合的に考慮され、意図される組合せ、A−E、A−F、B−D、B−E、B−F、C−D、C−EおよびC−Fが開示されるとみなされる。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも開示される。それ故、例えばA−E、B−FおよびC−Eのサブグループが開示されるとみなされる。この概念は、開示組成物を作製し、使用する方法における工程を含むが、これらに限定されない、本出願の全ての態様に適用される。それ故、実施できる様々な付加的工程が存在する場合、これらの付加的工程の各々が、開示される方法の任意の特定実施形態または実施形態の組合せと共に実施され得ることが了解される。
自発てんかん発作は、主として海馬に位置する過剰興奮性ニューロンの過剰発射から生じる。脳は、γ−アミノ酪酸(GABA)を用いる抑制機構とグルタミン酸によって媒介される興奮機構のバランスをとることによって発作を制御する(Wasterlainら、2002)。神経伝達は、神経ペプチドY、ガラニン、ノシセプチン/オルファニンFQおよびエンドモルフィン−1を含む、多くの内因性神経ペプチドによって調節される。図1は、自立てんかん重積持続状態の海馬の神経回路におけるグルタミン酸、GABAおよび神経ペプチドの間の考えられる関係を示す。
よびそれらの受容体が、てんかん誘発において役割を果たすことが示された。海馬におけるガラニンの免疫反応性は、辺縁系てんかん重積状態後に低下する。海馬歯状回門へのガラニンの注入は、辺縁系てんかん重積状態の発症を予防し、てんかん重積持続状態を停止させた。それ故、ガラニンはてんかん重積持続状態を抑制する内因性抗痙攣薬として働くと思われる(Mazaratiら、1998)。このことの証拠は、ガラニンの過剰発現を有するトランスジェニックマウスの表現型を分析することによって示された(Kokaiaら、2001)。この試験において、ガラニンはキンドリングてんかん誘発を抑制した。
神経ペプチドYはインビトロでラット海馬切片におけるてんかん様活性を抑制した(KlapsteinとColmers,1997)。別の試験では(Barabanら、1997)、神経ペプチドYを欠くマウスは、カイニン酸に応答して制御不能の発作を生じた。さらに、ノックアウトマウスの93%が死亡へと進行したのに対し、野生型動物では死亡はまれであった。脳室内神経ペプチドYは、カイニン酸投与によって誘導された死亡を予防した。最後に、神経ペプチドYの抗痙攣作用はY5受容体を通して媒介されることが明らかにされた(SperkとHerzog、1997)。
ガラニンは、Mazaratiと共同研究者たちの研究(Mazaratiら、1992)以来、潜在的抗痙攣薬として認識されてきた。側脳室または海馬に直接注入したとき、ガラニンはラットにおいてピクロトキシン誘発性キンドリング痙攣の重症度を低下させた。てんかん重積持続状態の動物モデルにおいて、貫通枝刺激(PPS)前または刺激後のガラニンの門周囲注入は発作の期間を短縮した(Mazaratiら、1998)。これらの作用はガラニンアンタゴニストの同時適用によって逆転された。図2に例示するように、50−500ピコモルという低い用量が、確立されたてんかん重積持続状態(SSSE)を停止させるのに有効であった。
とが最近示された(それぞれ(Saarら、2002)および(Bartfaiら、2004))。両方の化合物が、GalR1またはGalR2受容体に対して中等度のマイクロモル親和性を有すると思われ、全身投与したとき、てんかんの動物モデルにおいて抗痙攣活性を示した。図3に示すように、ガルノン(2mg/kg、i.p.)またはガラニン(0.5nmol、i.c.v.)は、マウスでのペンチレンテトラゾール(PTZ)誘発試験において潜伏期間および発作スコアの両方に同等の作用を及ぼした(Saarら、2002;Ceideら、2004)。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu
11 12 13 14 15 16
Leu Gly Pro His Ala Val
Gly1のN−メチル化は、ペプチドをN末端からの急速なタンパク質分解から保護したが、ガラニン受容体に対するその親和性を有意に変化させなかった(Rivera Baezaら、1994)。SAR試験は、以下の残基を生物活性のために重要であると同定した:Gly1、Trp2、Asn5、Tyr9およびGly12(Landら、1991)。同じ試験は、N末端伸長が生物活性の喪失を引き起こすことを同定した。他方で、ガラニン(1−16)のC末端部分は、より大きな構造に連結されているとき非常に堅固であると思われる(Poogaら、1998)。それ故、[Sar1]ガラニン類似体の設計のための戦略は、アミノ酸置換に関してのみソマトスタチンで使用される戦略と同様であるが、N末端ではなくC末端に伸長を導入することにおいて異なる。
脳ソマトスタチンが発作およびてんかん原性の阻害剤として重要な役割を果たすことを示す多くの証拠がある(VezzaniとHoyer、1999)。ソマトスタチンは、海馬のGABA作動性介在ニューロンにおいて発現される主要神経ペプチドである。さらに、ラット海馬ニューロンからのソマトスタチン放出はグルタミン酸によって刺激された(Fontanaら、1996)。ソマトスタチンおよびその受容体の発現はてんかん発作後有意に変化し、この神経ペプチドはまた、てんかん誘発の間の神経興奮性を制御すると主張されてきた((Schwarzerら、1996)および(VezzaniとHoyer、1999)において総説されている)。受容体サブタイプノックアウトおよび薬理学的試験は、少なくとも4つのサブタイプのソマトスタチン受容体(sst1、sst2、sst3およびsst4)の、海馬におけるグルタミン酸媒介性神経伝達への関与を示唆した(Pikwoら、1996)。Csabaと共同研究者たちの最近の試験は(Csabaら、2004)、ソマトスタチンsst2A受容体がてんかん原性および抗痙攣活性において鍵となる役割を果たし得ることのさらなる証拠を提供した。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr
11 12 13 14
Phe Thr Ser Cys
広汎なSAR試験は、5個の鍵となる残基:Phe6、Phe7、Trp8、Lys9およびPhe11を同定したが、Gly2、Lys4、Asn5、Thr10、Thr12またはSer13のアラニン置換は生物活性に有意の影響を及ぼさなかった(Valeら、1975)。加えて、D−Trp8含有類似体は、タンパク質分解に対するより大きな抵抗性および/または活性立体配座のより良好な安定化の故に、より強力であることが示された。
デルタ睡眠誘発ペプチド(DSIP)は抗痙攣性神経ペプチドである(Schoenenberger 1984;KovalzonとStrekalova 2006)。D
SIPは、μオピオイドアゴニスト、デルモルフィンとある程度の構造類似性を共有する。DSIPは、メタフィット(metaphit)誘発性てんかんモデルにおいて発作を抑制する上で有効であった。さらに、DSIPは同じてんかんモデルでバルプロ酸塩の抗痙攣活性を増強することが示された(Hrncic,Stanojlovicら、2006)。加えて、このペプチドは、オピオイド受容体とエンケファリンの間の相互作用を調節し、DSIPの鎮痛作用を生じさせることが示された(Nakamura,Nakashimaら、1986)。DSIPの神経保護作用は毒性脳水腫のモデルにおいて示された。DSIPおよびいくつかの類似体は、BBBを透過することが報告された(Kastin,Nissenら、1981;Kastin,Banksら、1982)。
本明細書で開示する組成物は血液脳関門の高い透過性を示した。本明細書で述べるように、それぞれの受容体に高親和性で結合する能力を試験するために設計し、合成する神経ペプチド類似体のセットを開示する。このセットは、神経ペプチドごとに、約10個の類似体を含む。高親和性類似体は、血液脳関門を透過するそれらの能力に関してさらに試験する。第1世代類似体からの結果をうけて、第2世代、その後第3世代類似体の合成と評価を行う。最も有望な類似体を、機能アッセイにおいてそれらのアゴニスト活性を確認するために選択する(血液脳関門の高い透過性を有する高親和性リガンド)。これらの類似体のサブセット(血液脳関門の高い透過性を有する強力なアゴニスト)を、次に、インビボで薬理学的に試験する。
メティック構造を含める。側鎖修飾を有する類似体を伸長部分(BBB/PK調節剤)と組み合わせる。
ys−パルミトイル、クロロ−Phe、アミノヘキサン酸(AHX)、ペルフルオロヘキサン酸(PerFHX)、8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸、およびオリゴ−Lys、tert−ロイシンを含むが、これらに限定されない。
本明細書で論じるように、相同性および同一性という用語の使用は類似性と同じものを意味することが了解される。それ故、例えば相同性という語の使用が2つの非天然配列の間で用いられる場合、これは必ずしもこれら2つの配列の間の進化的関係を指示するのではなく、むしろそれらの核酸配列の間の類似性または関連性を考察していることが了解される。2つの進化的に関連する分子の間の相同性を決定するための方法の多くは、それらが進化的に関連するかどうかに関わりなく、配列類似性を測定するために何らかの2以上の核酸またはタンパク質に常套的に適用される。
Appl.Math.2:482(1981)のローカルホモロジーアルゴリズムによって、NeedlemanとWunsch,J.MoL Biol.48:443(1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、PearsonとLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)によって、または検査によって実施され得る。
様々なガラニンおよびソマトスタチン類似体などの、本明細書で開示する様々なペプチド分子が存在する。これらのペプチドベースの分子は、例えば配列番号1−55をコードする核酸を含む、多くの核酸によってコードされ得、例えばベクターが細胞において発現されるとき、発現されるmRNAは、典型的にはA、C、GおよびUで構成されることが了解される。
例えばwww.pubmed.gov.でアクセスできるGenbankデータベースにおいて見出される、例えばガラニンに関連する様々な配列が存在する。これらの配列および他の配列は、それらの全体ならびにその中に含まれる個々のサブ配列に関して、参照により本明細書に組み込まれる。
するために本明細書で使用される。この配列に関連する記述は、特に異なる指示がない限り、ガラニン類似体に関連するいかなる配列にも適用されることが了解される。当業者は、配列の不一致および相違をいかにして決定し、特定配列に関する組成物および方法を他の関連配列(すなわちガラニン類似体の配列)に合わせて調整するかを理解する。プライマーおよび/またはプローブは、任意のガラニン関連核酸配列のために、例えば本明細書で開示され、当技術分野で公知の情報を考慮して設計され得る。
インビトロまたはインビボで、核酸またはペプチドを細胞に送達するために使用できる多くの組成物および方法がある。本明細書で開示するベクターは多様な方法で使用できる。一例では、本明細書で開示するベクターは、本明細書で開示するペプチドをコードする核酸を細胞および対象に送達するために使用できる。ベクターはまた、上記で論じたように、血液脳関門の通過を促進するためにペプチドと共に使用することができる。
ターロイキン8または10についてのコード領域を担持する。
レトロウイルスは、いかなる型、サブファミリー、属または親和性も含む、レトロウイルス科(Retroviridae)のウイルスファミリーに属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般に、参照により本明細書に組み込まれる、Verma,I.M.,Retroviral vectors for gene transfer.In Microbiology−1985,American Society
for Microbiology,pp.229−232,Washington(1985)によって記述されている。遺伝子治療のためにレトロウイルスベクターを使用するための方法の例は、その教示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,868,116号および同第4,980,286号;国際公開公報第WO90/02806号および同第WO89/07136号;およびMulligan(Science 260:926−932(1993))に述べられている。
により、対象遺伝子を含むベクターは複製され、新しいレトロウイルス粒子にパッケージングされる。機構についてのゲノムは、必要なシグナルを持たないためパッケージングされない。
複製欠損アデノウイルスの構築が記述されている(Berknerら、J.Virology 61:1213−1220(1987);Massieら、Mol.Cell.Biol.6:2872−2883(1986);Haj−Ahmadら、J.Virology 57:267−274(1986);Davidsonら、J.Virology 61:1226−1239(1987);Zhang”Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome−mediated transfection and PCR analysis”BioTechniques 15:868−872(1993))。これらのウイルスをベクターとして使用することの利益は、それらが初期感染細胞内では複製できるが、新しい感染性ウイルス粒子を形成することができないので、他の細胞型に拡大し得る程度が限られていることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、CNS実質および多くの他の組織部位への直接インビボ送達後、高い効率で遺伝子導入を達成することが示された(Morsy,J.Clin.Invest.92:1580−1586(1993);Kirshenbaum,J.Clin.Invest.92:381−387(1993);Roessler,J.Clin.Invest.92:1085−1092(1993);Moullier,Nature Genetics 4:154−159(1993);La Salle,Science 259:988−990(1993);Gomez−Foix,J.Biol.Chem.267:25129−25134(1992);Rich,Human
Gene Therapy 4:461−476(1993);Zabner,Nature Genetics 6:75−83(1994);Guzman,Circulation Research 73:1201−1207(1993);Bout,Human Gene Therapy 5:3−10(1994);Zabner,Cell 75:207−216(1993);Caillaud,Eur.J.Neuroscience 5:1287−1291(1993);およびRagot,J.Gen.Virology 74:501−507(1993))。組換えアデノウイルスは、特定細胞表面受容体に結合することによって遺伝子導入を達成し、その後ウイルスは、野生型または複製欠損アデノウイルスと同じようにして、受容体媒介性エンドサイトーシスによってインターナリゼーションされる(ChardonnetとDales,Virology 40:462−477(1970);BrownとBurlingham,J.Virology 12:386−396(1973);SvenssonとPersson,J.Virology 55:442−449(1985);Sethら、J.Virol.51:650−655(1984);Sethら、Mol.Cell.Biol.4:1528−1533(1984);Vargaら、J.Virology 65:6061−6070(1991);Wickhamら、Cell 73:309−319(1993))。
もう1つのタイプのウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス(AAV)に基づく。この欠損パルボウイルスは、多くの細胞型に感染することができ、ヒトに対して非病原性で
あるため、好ましいベクターである。AAV型ベクターは約4−5kbを輸送することができ、野生型AAVは第19染色体に安定に挿入されることが公知である。この部位特異的組込み特性を含むベクターは好ましい。このタイプのベクターの特に好ましい実施形態は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、HSV−tk、および/またはグリーン蛍光タンパク質、GFPなどのマーカー遺伝子を含むことができる、Avigen,San Francisco,CAによって生産されるP4.1Cベクターである。
大型ヒトヘルペスウイルスの分子遺伝学的実験は、大きな異種DNAフラグメントをクローニングし、増殖させて、ヘルペスウイルスによる感染を許容する細胞において樹立できる手段を提供した(Sunら、Nature genetics 8:33−41,1994;Cotter and Robertson,.Curr Opin Mol Ther 5:633−644,1999)。これらの大型DNAウイルス(単純ヘルペスウイルス(HSV)およびエプスタイン‐バーウイルス(EBV))は、>150kbのヒト異種DNAの断片を特定細胞に送達する潜在的可能性を有する。EBV組換え体は、DNAの大きな断片をエピソームDNAとして感染B細胞内に維持することができる。330kbまでのヒトゲノム挿入物を担持する個々のクローンは遺伝的に安定であると思われた。これらのエピソームの維持は、EBVによる感染の間構成的に発現される特異的EBV核タンパク質、EBNA1を必要とする。加えて、これらのベクターはトランスフェクションのために使用でき、大量のタンパク質をインビトロで一過性に作製することができる。ヘルペスウイルスアンプリコンシステムも、>220kbのDNA断片をパッケージングし、DNAをエピソームとして安定に維持できる細胞に感染させるために使用される。
ガラニン類似体をコードする核酸などの開示される組成物は、様々な方法で標的細胞に送達することができる。例えば組成物は、電気穿孔を通して、またはリポフェクションを
通して、またはリン酸カルシウム沈殿法を通して送達され得る。選択される送達機構は、一部には、標的される細胞の型および送達が、例えばインビボまたはインビトロのいずれで起こるかに依存する。
に、エンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体はクラスリン被覆小孔に集積し、クラスリン被覆小胞によって細胞に入り、受容体が選別される酸性エンドソームを通過して、その後細胞表面へと再循環されるか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソームにおいて分解される。インターナリゼーション経路は、栄養素の取込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子の清掃、ウイルスおよび毒素の日和見侵入、リガンドの解離と分解、および受容体レベルの調節などの様々な機能を果たす。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドのタイプ、リガンドの原子価およびリガンドの濃度に依存して、1以上の細胞内経路をたどる。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子および細胞機構が総説されている(BrownとGreene,DNA and Cell Biology 10:6,399−409(1991))。
上述したように、組成物は医薬的に許容される担体中で投与され得、当技術分野で周知の様々な機構(例えば裸のDNAの取込み、リポソーム融合、遺伝子銃によるDNAの筋肉内注入、エンドサイトーシス等)によってインビボおよび/またはエクスビボで対象の細胞に送達され得る。
細胞に送達される核酸は、典型的には発現制御システムを含む。例えばウイルスおよびレトロウイルス内の挿入遺伝子は、所望遺伝子産物の発現を制御するのを助けるプロモーターおよび/またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に転写開始部位に対して比較的固定された位置にあるとき機能するDNAの配列である。プロモーターは、RNAポリメラーゼと転写因子の基本的相互作用のために必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
哺乳動物宿主細胞においてベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々なソースから、例えばポリオーマ、シミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサイトメガロウイルスなど
のウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えばβアクチンプロモーターから入手され得る。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウイルス複製起点を同時に含むSV40制限フラグメントとして好都合に得られる(Fiersら、Nature,273:113(1978))。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、HindIII E制限フラグメントとして好都合に得られる(Greenway,P.J.ら、Gene 18:355−360(1982))。言うまでもなく、宿主細胞または関連種からのプロモーターも本明細書で有用である。
ている。相同なポリアデニル化シグナルが導入遺伝子構築物において使用されることが好ましい。ある転写単位では、ポリアデニル化領域はSV40初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約400塩基から成る。また、転写された単位は、他の標準配列を単独でまたは構築物からの発現または構築物の安定性を改善する上記配列と組み合わせて含むことが好ましい。
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達されたかどうか、およびひとたび送達されれば発現されているかどうかを判定するために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌lacZ遺伝子、およびグリーン蛍光タンパク質である。
a)タンパク質変異体
本明細書で論じるように、公知であり、本明細書で考慮されるペプチドの数多くの変異体が存在する。本明細書で開示される位置に関する開示機能性変異体および類似体に加えて、同じく所望されるように機能する、本明細書で開示するもの以外の位置の公知の天然に生じる機能性変異体がある。タンパク質変異体および誘導体は当業者に十分に理解されており、アミノ酸配列修飾または機能性フラグメントを含み得る。例えばアミノ酸配列修飾は、典型的には3つのクラス:置換変異体、挿入変異体または欠失変異体の1以上に属する。挿入は、アミノおよび/またはカルボキシル末端融合ならびに1個または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は通常、アミノまたはカルボキシル末端融合よりも
小さな挿入であり、例えば約1−4残基である。実施例で述べるような免疫原性融合タンパク質誘導体は、インビトロでの架橋によってまたは融合物をコードするDNAで形質転換された組換え細胞培養によって、免疫原性を与えるのに十分な大きさのポリペプチドを標的配列に融合することによって作製される。欠失は、タンパク質配列からの1以上のアミノ酸残基の除去によって特徴づけられる。典型的には、約2−6残基以下がタンパク質分子内のいずれか1つの部位で欠失される。これらの変異体は通常、タンパク質をコードするDNA内のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発によって作製され、それにより変異体をコードするDNAを生産し、その後組換え細胞培養物において前記DNAを発現させる。公知の配列を有するDNA内のあらかじめ定められた部位で置換突然変異を生じさせるための手法は周知であり、例えばM13プライマー突然変異誘発およびPCR突然変異誘発がある。アミノ酸置換は、典型的には1個の残基であるが、多数の異なる位置で同時に起こり得る;挿入は通常約1−10アミノ酸残基である;および欠失は約1−30残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは隣接対で行われ、すなわち2個の残基の欠失または2個の残基の挿入である。置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組合せは、最終構築物に到達するように組み合わされ得る。突然変異は、配列を読み枠の外に置いてはならず、好ましくは二次mRNA構造を生じさせ得る相補的領域を創造しない。置換変異体は、少なくとも1個の残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されたものである。そのような置換は、一般に以下の表3および4に従って行われ、保存的置換と称される。
結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、頻繁に、対応するグルタミルおよびアスパリル残基へと翻訳後脱アミド化される。あるいは、これらの残基は弱酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のε−アミノ基におけるアミンのメチル化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco pp79−86[1983])、N末端アミンのアセチル化、および一部の場合、C末端カルボキシルのアミド化を含む。
本明細書で開示される抗体は、所望機能を有する類似体を同定する上で有用であり得る。本明細書で使用するとき、「抗体」という用語は、任意のクラスの全長免疫グロブリン(すなわち無傷抗体)を含むが、これらに限定されない。天然抗体は通常、2本の同一の軽(L)鎖と2本の同一の重(H)鎖から成るヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、各々の軽鎖は1つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、ジスルフィド結合の数は種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。各々の重鎖と軽鎖はまた、規則正しい間隔の鎖間ジスルフィド架橋を有する。各々の重鎖は、一方の末端に可変ドメイン(V(H))を有し、多数の定常ドメインがそれに続く。各々の軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン(V(L))を有し、他方の末端に定常ドメインを有する;軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列される。特定アミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変ドメインの間の界面を形成すると考えられる。任意の脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、κ(k)およびλ(l)と呼ばれる2つの明らかに異なるタイプの1つに割り当てられる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは種々のクラスに割り当てることができる。ヒト免疫グロブリンには5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG−1、IgG−2、IgG−3およびIgG−4;IgA−1およびIgA−2に分類され得る。当業者は、マウスについての匹敵するクラスを認識する。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。
E.A.ら、“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)参照)。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性への抗体の関与のような、様々なエフェクター機能を示す。
,692号に述べられている抗体フラグメントと抗原結合タンパク質(一本鎖抗体)の複合体も、「抗体またはそのフラグメント」の意味に含まれる。
上述したように、ガラニン類似体などの組成物はまた、医薬的に許容される担体中でインビボ投与することができる。「医薬的に許容される」とは、生物学的にまたはそれ以外で有害ではない物質を意味し、すなわちその物質が、核酸またはベクターと共に、有害な生物学的作用を引き起こさずにまたはそれが含まれる医薬組成物のその他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用せずに、対象に投与し得ることを意味する。当業者に周知のように、担体は、当然ながら、有効成分の分解を最小限に抑えるようにおよび対象における有害な副作用を最小限に抑えるように選択される。
Acta,1104:179−187(1992))。一般に、受容体は、構成的にまたはリガンド誘導的に、エンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体はクラスリン被覆小孔に集積し、クラスリン被覆小胞によって細胞に入り、受容体が選別される酸性エンドソームを通過して、その後細胞表面へと再循環されるか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソームにおいて分解される。インターナリゼーション経路は、栄養素の取込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子の清掃、ウイルスおよび毒素の日和見侵入、リガ
ンドの解離と分解、および受容体レベルの調節などの様々な機能を果たす。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドのタイプ、リガンドの原子価およびリガンドの濃度に依存して、1以上の細胞内経路をたどる。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子および細胞機構が総説されている(BrownとGreene,DNA and Cell Biology 10:6,399−409(1991))。
ガラニン類似体を含む組成物は、医薬的に許容される担体と組み合わせて治療的に使用することができる。
組成物の投与のための用量範囲は、障害の症状が影響を受ける所望作用を生じさせるのに十分な用量範囲である。用量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等のような有害な副作用を引き起こすほど高い用量であってはならない。一般に、用量は患者の年齢、状態、性別および疾患の程度によって異なり、当業者によって決定され得る。用量は、何らかの禁忌の場合には個々の医師によって調節され得る。用量は、変更され得、1日または数日間、1日1回またはそれ以上の投与で与えられ得る。
少なくとも1つのアドレスが、本明細書で開示される核酸配列のいずれかで示される配列または配列の部分であるチップを開示する。また、少なくとも1つのアドレスが、本明細書で開示されるペプチド配列のいずれかで示される配列または配列の部分であるチップを開示する。
開示される核酸およびタンパク質は、アミノ酸のヌクレオチドから成る配列として表示され得ることが了解される。これらの配列を示すための様々な方法があり、例えばヌクレオチドグアノシンはGまたはgによって表示され得る。同様にアミノ酸バリンはValまたはVによって表わされ得る。当業者は、その各々が本明細書で開示されるとみなされる、存在する様々な方法のいずれかで任意の核酸またはタンパク質配列をいかにして提示し、表現するかを理解する。特に本明細書で考慮されるのは、市販のフロッピー(登録商標)ディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスクおよびビデオディスク、または他のコンピュータ読取り可能媒体などの、コンピュータ読取り可能媒体上でのこれらの配列の表示である。また、開示される配列の2進コード表示も開示する。当業者は、コンピュータ読取り可能媒体がどのようなものであるかを理解する。それ故、核酸またはタンパク質配列が記録され、保存されるまたは残されるコンピュータ読取り可能媒体が開示される。
本明細書で開示される方法を実施するときに使用できる試薬を集めたキットを開示する。キットは、本明細書で論じられるまたは開示される方法の実施において必要とされるまたは有益であると理解されるあらゆる試薬または試薬の組合せを含み得る。例えばキットは、本発明のある実施形態の中で述べた置換を実施するためのアミノ酸、ならびに使用説明書を含み得る。
本明細書で開示される組成物は、血液脳関門の高い透過性などの一定の機能を有することが了解される。開示される機能を実施するために一定の構造必要条件が本明細書で開示され、開示される構造に関連する同じ機能を実施できる様々な構造が存在すること、およびこれらの構造が最終的に同じ結果を達成することが了解される。
本明細書で開示される組成物および開示される方法を実施するために必要な組成物は、特に異なる記載がない限り、その特定試薬または化合物に関する当業者に公知の任意の方法を使用して作製できる。Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)に開示されているような一般的分子生物学手法が、特に異なる記載がない限り、開示される分子を作製し、開示される方法を実施するために使用可能であることが了解される。
例えばプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドなどの核酸は、標準化学合成法を用いて作製できるか、あるいは酵素的方法または他の任意の公知の方法を用いて生産できる。そのような方法は、標準酵素消化とそれに続くヌクレオチドフラグメントの単離(例えばSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)Chapters 5,6参照)から、純粋に合成による方法、例えばMilligenまたはBeckman System 1Plus DNAシンセサイザー(例えばMilligen−Biosearch,Burlington,MAのM
odel 8700自動シンセサイザーまたはABI Model 380B)を使用するシアノエチルホスホロアミダイト法までおよぶことができる。オリゴヌクレオチドを作製するために有用な合成方法はまた、Ikutaら、Ann.Rev.Biochem.53:323−356(1984)(ホスホトリエステルおよびホスファイトトリエステル法)、およびNarangら、Methods Enzymol.,65:610−620(1980)(ホスホトリエステル法)によって述べられている。(ペプチド核酸分子)は、Nielsenら、Bioconjug.Chem.5:3−7(1994)によって述べられているような公知の方法を用いて作製できる。
開示されるタンパク質を生産する1つの方法は、タンパク質化学手法によって2以上のペプチドまたはポリペプチドを連結することである。例えばペプチドまたはポリペプチドは、Fmoc(9−フルオレニルメチルオキシカルボニル)またはBoc(tert−ブチルオキシカルボニル)化学のいずれかを使用し、現在使用可能な実験装置を用いて化学合成することができる。(Biosystems,Inc.,Foster City,CAを適用)。当業者は、開示されるタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドが、例えば標準化学反応によって合成できることを容易に認識する。例えばペプチドまたはポリペプチドを合成し、その合成樹脂から切断せず、一方ペプチドまたはタンパク質のその他のフラグメントは、合成してその後樹脂から切断することができ、それによってその他のフラグメント上の機能的にブロックされている末端基を露出させる。ペプチド縮合反応により、これら2つのフラグメントを、タンパク質またはそのフラグメントを形成するために、それぞれそれらのカルボキシルおよびアミノ末端でペプチド結合によって共有結合連結することができる(Grant GA(1992)Synthetic Peptides:A User Guide.W.H.Freeman and Co.,N.Y.(1992);Bodansky MとTrost B.,Ed.(1993)Principles of Peptide Synthesis.Springer−Verlag Inc.,NY)(少なくともペプチド合成に関する資料について、参照により本明細書に組み込まれる)。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書で述べるようにインビボで独立して合成される。ひとたび単離されれば、これらの独立ペプチドまたはポリペプチドは、同様のペプチド縮合反応によってペプチドまたはそのフラグメントを形成するために連結され得る。
組成物を作製する工程ならびに組成物を導く中間体を作製するための工程を開示する。例えば配列番号1−55のタンパク質を開示する。合成化学的方法および標準分子生物学的方法のような、これらの組成物を作製するために使用できる様々な方法がある。これらやその他の開示組成物を作製する方法は詳細に開示されることが了解される。
403 658.8号)に開示されており、情報は、www.bioprotein.comに見出される。
以下の実施例は、本明細書で特許請求される化合物、組成物、製品、装置および/または方法をいかにして作製し、評価するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されるものであり、本発明の純粋な例示であることが意図され、発明人が自らの発明とみなすものの範囲を限定することは意図されていない。数(例えば量、温度等)に関しては正確さを保証するように努力を払ったが、ある程度の誤差および偏差が含まれるはずである。異なる指示がない限り、割合は重量比であり、温度は℃または環境温度であり、圧は大気圧またはほぼ大気圧である。
全身的に活性な抗痙攣性ガラニン類似体
血液脳関門の透過性を高めるための抗痙攣性神経ペプチドが工作できることの概念実証を得るため、2つのモデル神経ペプチド:ソマトスタチンとガラニンを選択した。先に述べたように、これらの神経ペプチドのいずれもが抗痙攣活性を有する。
の透過性の上昇および薬物動態特性の改善という2つの目的に役立つ。カチオン性および親油性モジュールは、それぞれ、負に荷電した膜表面との相互作用を促進し、膜を通しての拡散を改善する。能動輸送体ミメティック構造の機能は、脳内皮細胞の表面に位置する特異的栄養素輸送体との相互作用を増強することによって脳への神経ペプチド取込みの特異性を高めることである。これらのモジュール全てを含む構造フレームワークはまた、ペプチドの薬物動態特性を改善することができ、一般的に使用されるPEG部分の役割を模倣/置換する。これらのかさの高い部分をモデル神経ペプチドのNまたはC末端伸長として試験し、神経ペプチド構造内のより多用途の結合位置も本明細書で開示する。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr
11 12 13 14
Phe Thr Ser Cys
広汎なSAR試験は、5個の鍵となる残基:Phe6、Phe7、Trp8、Lys9およびPhe11を同定したが、Gly2、Lys4、Asn5、Thr10、Thr12またはSer13のアラニン置換は生物活性に有意の影響を及ぼさなかった(Valeら、1975)。加えて、D−Trp8含有類似体は、タンパク質分解に対するより大きな抵抗性および/または活性立体配座のより良好な安定化の故に、より強力であることが示された。
に示すような、BBB/PK調節剤)は、2つの目的に役立つ:(1)受動および能動機構の両方によって血液脳関門を通る透過性を改善すること、および(2)クリアランスを低減し、タンパク質分解に対する抵抗性を改善する、かさの高い部分を付加することによって神経ペプチド薬の薬物動態特性を改善すること。そのような「BBB/PK調節剤」は新しい概念であるので、伸長を構成する少数の構造モジュールのいくつかの組合せを使用する。表6は、提案されるモジュールの構造と機能についての情報を提供する。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu
11 12 13 14 15 16
Leu Gly Pro His Ala Val
Gly1のN−メチル化は、ペプチドをN末端からの急速なタンパク質分解から保護したが、ガラニン受容体に対するその親和性を有意に変化させなかった(Rivera B
aezaら、1994)。SAR試験は、以下の残基を生物活性のために決定的に重要であると同定した:Gly1、Trp2、Asn5、Tyr9およびGly12(Landら、1991)。同じ試験は、N末端伸長が生物活性の喪失を引き起こすことを同定した。他方で、ガラニン(1−16)のC末端部分は、より大きな構造に連結されているとき非常に堅固であると思われる(Poogaら、1998)。それ故、[Sar1]ガラニン類似体の設計のための戦略は、アミノ酸置換に関してのみソマトスタチンで使用される戦略と同様であるが、N末端ではなくC末端に伸長を導入することにおいて異なる。表9は、アミノ酸置換を有するガラニン類似体を要約する。
cesによって提供される機能アッセイを使用してさらに試験することができる。類似体は単一濃度(1μM)で試験できる。
2つの点が確立されるまで、様々なペプチドの用量で試験する。次に、各々の試験で動物の50%において所望エンドポイントを生じるために必要な薬剤の用量(ED50またはTD50)、95%信頼区間、回帰直線の勾配、および勾配のS.E.M.を、Finney(Finney,1971)によって述べられた方法に基づくコンピュータプログラムによって算定する。
DSIP−BBB8:(AHX)GGWAGGDASGE(配列番号55)。さらなるDSIPペプチドは表31に示されている。
抗痙攣性ガラニン類似体
ガラニンは、N末端部分が全長ペプチドと比較して極めて強力なアゴニストである、30アミノ酸の神経ペプチドである(LangelとBartfai、1998)。血液脳関門の透過性を高める修飾を導入するためにトランケート型ガラニン(1−16)類似体(下記)を使用した。
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu
11 12 13 14 15 16
Leu Gly Pro His Ala Val
生物活性のために決定的に重要な以下の残基が同定された:Gly1、Trp2、Asn5、Tyr9およびGly12(Landら、1991)。N末端伸長または切断は生物活性の喪失を引き起こした。他方で、ガラニン(1−16)のC末端部分は、切断され
たときまたはより大きな構造に連結されているとき非常に堅固である(Poogaら、1998)。
GAL−BBB1:Sar−Trp−Thr−Leu−Asn−Ser−Ala−Gly−Tyr−Leu−Leu−Gly−Pro−His−(Lys−palm)−Tle−NH2
GAL−BBB2:Sar−Trp−Thr−Leu−Asn−Ser−Ala−Gly−Tyr−Leu−Leu−Gly−Pro−Lys−Lys−(Lys−palm)−Lys−NH2
式中、Sarはサルコシンであり、Tleはtert−ロイシンであり、Lys−palmは、εアミノ基によってパルミトイル部分と共役したリシン残基であり、および−NH2はC末端のアミド化を表わす。ペプチドは、標準Fmoc化学を使用して固体支持体上で合成し、HPLCによって精製した。精製した類似体を、次に、てんかんのFrings聴原性発作感受性マウスモデルにおいて試験した。この試験からの結果を天然ガラニンペプチドフラグメント(1−16)と比較した。
2つのセットは、それぞれ、発作の拡大を防ぎ、発作閾値を引き上げる、試験下の抗てんかん化合物の能力を測定する(Whiteら、2002)。ひとたび修飾ペプチドがこれら3つの発作試験の1以上において活性であることが明らかにされれば、あらかじめ決定されたi.p.投与後のピーク効果時に完全な用量反応試験を実施する。これらの概念実証試験からの結果を、次に、脳室内(i.c.v.)投与後に実施した効果試験と比較する。血液脳関門のより大きな透過が達成されるときには、i.p.用量反応曲線の左側へのシフトが認められる。集合的に、これら3つの発作試験から得られる結果は、全身投与後に低分子ペプチドを脳に対してよりアクセス可能にするためのアプローチを支持する実質的なデータを提供する。各々個々の発作試験の詳細を以下に概説する。
GAL−BBB2は強力な疼痛緩和を有する
a)ホルマリン試験
0.5%ホルマリンの注射をマウス右後足の足底領域に実施する。これは、処置された足を嘗める(リッキング)マウスによって特徴づけられるはっきりと異なる二相性行動プロフィールを惹起する。注射直後に、マウスは約10分間足を嘗める。これが第1相(急性期)であり、その後ほとんど行動活動がない短い潜伏期がある。第2相(炎症期)を構成する、約20−30分間の足嘗めのより長い期間が続く。
手術の直前に、長時間作用性アヘン製剤、ブプレノルフィン0.1−0.5mg/kgでラットを皮下的に処置する。次にラットをペントバルビタールで麻酔し、麻酔深度をテイルピンチに対する応答および呼吸深度の観察によって観測する。手術全体を通じて無菌操作を使用した。
出されるまで、皮膚およびその下にある上大腿の筋肉を通して小さく切開した。次に神経を周囲の結合組織から分離し、一対の微細な屈曲鉗子によってわずかに持ち上げた。次に、針とナイロン縫合糸(7.0)を神経に通すことによって神経の約1/3から1/2を結紮した。その後筋肉と皮膚の切開を5.0縫合糸で別々に縫合して閉じ、動物が麻酔から回復するまで、温度調節された電気毛布上に置いて動物を保温した。この手順を右側(同側)で実施し、左後脚(反対側)で擬似手術を行った。後者は、この側の坐骨神経を露出しただけで結紮しなかったことを除き、同様の手順を含む。手術後12時間目に、手術手技からの不快を最小限に抑えるため、ブプレノルフィンの2回目の用量を投与した。ラットを感染または手術の有害作用の発現に関して毎日綿密に観測した。
多くの抗痙攣薬が疼痛の治療における効果を明らかにしている。それ故、GAL−BBB2を、鎮痛特性を有するかどうかを評価するためにマウスホルマリンモデルにおいて検査した。この試験において、GAL−BBB2は、動物が同側足を嘗めることに費やす時間の数量化によって評価したとき、s.c.足底ホルマリンに関連する疼痛を有意に低減することが認められた。図16に示すように、GAL−BBB2(0.52−5mg/kg)は、初期急性期ならびに持続的な炎症期の両方において足嘗めの用量依存的低減を生じさせた。これに対し、非修飾天然フラグメントGal 1−16は、試験したGAL−BBB2の最高用量より4倍高い用量(すなわち20mg/kg)のi.p.投与後、不活性であることが認められた。加えて、GAL−BBB2 5mg/kg(図16)は、ガバペンチンの10mg/kg用量に等しいことが認められた(図17)。
血液脳関門を透過するガラニン類似体
表16は、本明細書で開示する組成物および方法に関して使用できるガラニン類似体を示す:
−Huntら、2004;Leeら、2005;Hwangら、2004)。
ンセサイザーを使用して固体支持体上で化学合成した。
5055をもう1つのレベチラセタム感受性急性発作モデル、すなわち6Hz精神運動試験においても評価した。6Hz発作試験は、難治性部分てんかんの治療のために有用であり得る潜在的抗痙攣性化合物を識別するためのユニークなモデルとして発達しつつある(Barton,Kleinら、2001;White 2003)。NAX 5055は、i.p.投与後、薬物抵抗性てんかんのこのモデルにおいて非常に強力である(表1
9)。レベチラセタム、さらにはバルプロ酸と異なり、NAX 5055の効力は、刺激強度を22mAから44mAに上昇させたときも保持される。それ故NAX 5055は、評価した3つの電流強度全てにおいて非常に強力なままであるという点で、6Hz試験で試験した抗痙攣薬の中で比較的ユニークである。これに対し、その他の薬剤の効力は、刺激強度を22mAから44mAに上昇させたとき低下する。NAX 5055を、その後、皮下(s.c.)投与後にマウス6Hz辺縁系発作モデルで試験した。興味深いことに、活性はs.c.投与後も保存される(図26)。s.c.投与後にNAXのED50のごくわずかな右側へのシフトが生じたという所見は、NAX 5055が良好なバイオアベイラビリティーを有することを示す。
現在のSAR結果に基づき、化学修飾の組合せを含む類似体の合成と特性決定を実施する。カチオン化のための新しい戦略を用いる:スペルミンなどのポリアミンベースの化合物、またはリポポリアミン複合体を使用する。ペプチドのグリコシル化はBBB透過を改善するための広く確立された戦略であるので、グリコシル化ガラニン類似体を使用する。
樹脂上で脱保護する。スペルミンまたはそのパルミトイル誘導体(他のアミノ基条でFmoc/Boc保護されている)のカップリングは、1,3−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を使用して実施する。ペプチドを固体支持体から取り出し、洗浄して、MTBEで沈殿させる。ジフェニル分取逆相HPLCを用いて類似体を精製する。90%アセトニトリル/10%水/0.1%TFAの、20%から90%までのアセトニトリル(0.1%TFA中)による15分間の直線勾配を溶出のために使用する。280nmでモル吸収係数7,000(1 Tpr 5,600および1 Tyr 1,400)を使用して類似体を定量する。これらの手順は、NAX 5055および同様の類似体を調製するために有効であり、個々のバッチは10−50mgの範囲であった。
合成ガラニン類似体の生物活性を特性決定するため、GalR1およびGalR2受容体の結合定数を測定する。3つの主要な目的は以下の通りであった:(1)GAL(1−16)に導入された化学修飾がガラニン受容体に対する親和性をどのように変化させるかを評価すること、(2)ガラニン類似体についての選択性プロフィールを測定すること、および(3)BBBを透過する高親和性ガラニン類似体の信頼し得るスクリーニングアッセイを開発すること。NAX 5055はGalR1およびGalR2の両方に対して低いナノモル親和性を保持することが示された。
てんかんの薬物抵抗性モデルにおけるガラニンベースの神経ペプチドの抗痙攣活性およびそれらの抗てんかん原性特性。
るNAX 5055および他のガラニン類似体の能力を分析する(MatagneとKlitgaard 1998)。
いままである;例えば処置群(抗てんかん原性)。実験群のウォッシュアウト期間の発作スコアはビヒクル処置群と有意に異ならない場合は、能動的処置期間中のペプチドの作用はその抗痙攣効果によるものであると結論できる;例えば処置群(抗痙攣性)。抗てんかん原性作用が認められるときは、ビヒクルおよび処置群の両方の全てのマウスを、これまでに処置されたマウスがペプチドの不在下でキンドリング形成するかどうかを調べるために、薬剤の不在下でキンドリング形成させる。
類似体の設計と化学合成
a)BBBを透過する神経ペプチド類似体
表29は、いくつかの神経ペプチド類似体の構造を要約する。類似体の各々について、固相ペプチド合成の間に「KKKpK」モチーフをNまたはC末端に結合する。以下に、各々の神経ペプチドの類似体を設計するための簡単な理論的根拠を示す。
KK(Kp)K−(神経ペプチド)(配列番号105)
KK(Kp)KG−(神経ペプチド)(配列番号106)
KK(Kp)K(Ahx)−(神経ペプチド)(配列番号107)
KK(Kp)K(Ahx)G−(神経ペプチド)(配列番号108)
ジノルフィンA(1−16)を、オピオイド受容体に対する親和性の有意の低下を伴わずに、C末端で切断または修飾することができる(Lapalu,Moisandら、1997;Naqvi,Haqら、1998;Schlechtingen,DeHavenら 2003)。そこで、BBBを透過するガラニン類似体と同様に、最後のいくつか
の残基が「KKKpK」モチーフによって置換されたジノルフィンA(1−16)類似体を合成する。以下の類似体を示す:
Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−Arg−Ile−Arg−Pro−Lys−Leu−Lys−Lys−(Lys−palm)−Lys−NH2(配列番号109)
Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−Arg−Ile−Arg−Pro−Lys−Leu−Lys− Lys−Lys−(Lys−palm)−Lys−NH2(配列番号110)
Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−Arg−Ile−Arg−Pro−Lys−Lys−Lys−(Lys−palm)−Lys−NH2(配列番号111)
Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−Arg−Ile−Arg−Pro−Lys−Leu−Lys−(Ahx)−Lys−Lys−(Lys−palm)−Lys−NH2(配列番号112)
神経ペプチドY類似体を、Prof.Annette G.Beck−Sickingerの研究所で実施された数多くのSAR試験からのデータに基づいて設計する(包括的総説(Beck−SickingerとJung 1995;CabreleとBeck−Sickinger 2000))。特に、設計は、腫瘍造影剤として合成され、試験された99mTc標識NPY類似体に基づく(Langer,La Bellaら、2001)。キレート化99mTcを有するかさの高い2−ピコリルアミン−N,N−二酢酸を含む、トランケート型NPY類似体(Ac−[Ahx5−24,K4(99mTc(CO)3−PADA),A26]−NPYは、Y2受容体サブタイプに対して非常に強力であった(IC50=1nM)。そこで、2−ピコリルアミン−N,N−二酢酸をLys−パルミトイル残基で置換することができる。以下の2個のNPY類似体を示す:
またはオクトレオチド類似体内のジスルフィド架橋の酸化のために、Clear−Ox樹脂を使用する(Darlak,Wiegandt Longら、2004;GreenとBulaj 2006)。本明細書で述べるオクトレオチド類似体は、95%を超える収率で酸化された。最終酸化産物を分取HPLCによって精製する。
マウス角膜キンドリング獲得へのNAX 5055の作用
血液脳関門透過性のガラニンベースの神経ペプチドNAX 5055の、角膜キンドリングの発現を予防する能力をCF No.1マウスにおいて試験した。マウス角膜キンドリングモデルは部分てんかんの非侵害性動物モデルであり、マウスは最初に、1日2回数日間にわたって、角膜電極により3秒間、痙攣を誘発しない電流(3mA)を受ける。ビヒクル処置マウスは、通常、安定な段階5発作、すなわち二次性全般化焦点発作に達するまでに12−16日間を要する。本試験では、16匹のマウスを2つの実験群:食塩水ま
たはNAX 5055の1つに無作為に割り当てた。NAX 5055群のマウスは、最初の角膜刺激の12時間前と1時間前およびその後の各刺激の1時間前に、NAX 5055(4mg/kg、n=8)の腹腔内(i.p.)注射を受けた。これに対し、ビヒクル群のマウスは、各角膜刺激の1時間前までに0.9%NaCl(n=8)を摂取した。各刺激の前に、0.9%食塩水中0.5%テトラカイン1滴を角膜に適用した。刺激発作後、Racine(1972)によって確立されたように0−5のスケールで活性を評点づけた。対照動物が一貫して段階5発作を示すまで処置を継続した。
配列番号1(野生型ガラニン)
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro His Ala Val
配列番号2(GAL−BBB1)
Sar−Trp−Thr−Leu−Asn−Ser−Ala−Gly−Tyr−Leu−Leu−Gly−Pro−His−(Lys−palm)−Tle−NH2
(式中、Sarはサルコシンであり、Tleはtert−ロイシンであり、およびLys−palmは、εアミノ基によってパルミトイル部分と共役したリシン残基であり、および−NH2はC末端のアミド化を表わす)
配列番号3(GAL−BBB2)
Sar−Trp−Thr−Leu−Asn−Ser−Ala−Gly−Tyr−Leu−Leu−Gly−Pro−Lys−Lys−(Lys−palm)−Lys−NH2
(式中、Sarはサルコシンであり、Tleはtert−ロイシンであり、およびLys−palmは、εアミノ基によってパルミトイル部分と共役したリシン残基であり、および−NH2はC末端のアミド化を表わす)
配列番号4(表11から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys−P Lys
配列番号5(表11から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Lys Lys−P Lys
配列番号6(表11から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Lys Lys Lys−P Lys
配列番号7(表11から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Lys Lys Lys−P Lys
配列番号8(表11から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Lys Lys Lys−P Lys
配列番号9(表12から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys−P Lys
配列番号10(表12から)
Sar Trp Xaa Xaa Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys−P Lys
配列番号11(表12から)
Sar Trp Thr Leu Asn Xaa Xaa Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys−P Lys
配列番号12(表12から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Xaa Xaa Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys−P Lys
配列番号13(表12から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Xaa Xaa Gly Pro Lys Lys Lys−P Lys
配列番号14(表12から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Xaa Xaa Pro Lys Lys Lys−P Lys
配列番号15(表12から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Xaa Xaa Lys Lys Lys−P Lys
配列番号16(表12から)
Sar Trp Thr Leu Asn Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys−P Lys
配列番号17(表12から)
Sar Trp Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys−P Lys
(表12からの配列(配列番号9−17)において「Xaa」はスペーサーを表わし、いかなる長さでもよい)。
配列番号18(表13から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys−P Lys
配列番号19(表13から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Lys Lys Lys−P Lys
配列番号20(表13から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Lys Lys Lys Lys Lys−P Lys
配列番号21(表13から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys Lys
配列番号22(表13から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys−P Lys Lys
配列番号23(表13から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu
Leu Gly Pro Lys−P Lys Lys Lys
配列番号24(表13から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro D−Lys D−Lys Lys−P D−Lys
配列番号25(表13から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro h−Lys h−Lys Lys−P h−Lys
配列番号26(表13から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro DAB DAB Lys−P DAB
配列番号27(表13から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys TDA Lys
配列番号28(表13から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys DPA Lys
表3からの上記配列(配列番号18−28)において、TDAは2−アミノ−テトラデカン酸であり、DABはジアミノ酪酸であり、D−LysはLysのD−異性体であり、h−Lysはホモ−Lysであり、DPAは3,3−ジフェニルアラニンである。
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro Lys Lys Lys−P Lys X
式中、Xは、12−アミノ−ドデカン酸または2−アミノ−テトラデカン酸を表わす。
配列番号30(ソマトスタチン野生型)
Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys
配列番号31(表5から)
Ala Ala Cys Lys DAB Phe Phe D−Trp Lys DAP Phe DAP DAP Cys
配列番号32(表5から)
Ala Gly Cys Lys−P Lys−P Phe Phe D−Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys
配列番号33(表5から)
Ala Gly Cys Lys Asn Cl−Phe Cl−Phe D−Trp Lys Thr Cl−Phe Thr Ser Cys
配列番号34(表5から)
Ala Ala Cys Lys DAB Phe Phe L−Trp Lys DA
P Phe DAP DAP Cys
配列番号35(表5から)
Ala Gly Cys Lys−P Lys−P Phe Phe L−Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys
配列番号36(表5から)
Ala Gly Cys Lys Asn Cl−Phe Cl−Phe L−Trp Lys Thr Cl−Phe Thr Ser Cys
表5からの上記配列において、DABはジアミノ酪酸であり、DAPはジアミノプロピオン酸であり、Lys−palmはLys−パルミトイルであり、およびCl−Pheはクロロ−Pheである。
配列番号37(表9から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys−p Lys−p Lys−p Val
配列番号38(表9から)
Sar Trp DAP Leu Asn DAP DAP Gly Tyr Leu Leu Gly DAB His DAP DAB
配列番号39(表9から)
Sar Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Cl−Tyr Leu Leu Gly Pro His Ala Val
配列番号40(修飾を有するオクトレオチド)
D−Phe Cys Phe D−Trp Lys Thr Cys Thr(ol)
配列番号41(SOM−BBB1)
(NN3APG)(AHX)AGCKNFFWKTFTSC
配列番号42(SOM−BBB2)
(NN3APG)(AHX)AGCKNFF(DW)KT(Cl−Phe)T(Dap)C
配列番号43(SOM−BBB3)
W(AHX)KKCKNFF(DW)KT(Cl−Phe)(Dab)(Dab)C
配列番号44(SOM−BBB21)
KK(Lys−P)K(AHX)(DF)CF(DW)KTC−Thr(ol)
配列番号45(SOM−BBB22)
KKK(Lys−P)K(AHX)(AHX)(DF)CF(DW)KTC−Thr(ol)
配列番号46(SOM−BBB23)
(Lys−P)KK(Lys−P)K(AHX)(DF)CF(DW)KTC−Thr(
ol)
配列番号47(SOM−BBB24)
KK(Lys−P)K(AHX)KK(Lys−P)K(AHX)(DF)CF(DW)KTC−Thr(ol)
配列番号48(SOM−BBB25)
(PFHA)K(DK)K(ACPA)KK(Lys−P)K(AHX)(DF)CF(DW)KTC−Thr(ol)
配列番号41−48に関して、(AHX)はアミノヘキサン酸である;(Dab)=ジアミノ酪酸;(Dap)=ジアミノプロピオン酸;(Tle)=tert−ロイシン; (Cl−Phe)=4−クロロフェニルアラニン;
(NN3APG)=N,N−ビス(3−アミノプロピル)グリシン;(AHX)=アミノヘキサン酸;(Lys−P)=Lys−パルミトイル;Thr(ol)=トレオニノール;DK、DF、DWはD−異性体を表わす;PFHAは2H,2H,3H,3H−ペルフルオロへプタン酸である;およびACPAは8−アミノカプリル酸である。
配列番号49 GAL−BBB3
WTLNSAGYLLGPKKXK−NH2
配列番号50 GAL−BBB4
Sar−WTLNSAGYLLGP(D−Lys)(D−Lys)X(D−Lys)−NH2
配列番号51 GAL−BBB5
Sar−WTLNSAGYLLGPRRXR−NH2
配列番号52 GAL−BBB6
Sar−WTLNSAGYLLGPHHXH−NH2
配列番号53 GAL−BBB7
Sar−WTLNSAGYLLKKKKXK−NH2
配列番号54 GAL−BBB8
Sar−WTLNSAGYLLKKXK−NH2
配列番号49−54において、Sarはサルコシンであり、およびXはLys−パルミトイル残基である。
配列番号55 DSIP−BBB8
(AHX)GGWAGGDASGE
配列番号56
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys−P)K
配列番号57
WTLNSAGYLLGPKK(Lys−P)K
配列番号58
(DK)(DK)(DK)(Kp)GGWAGGDASGE
配列番号59
(Sar)WTLNSAGYLLGPRR(Lys−P)R
配列番号60
(Sar)WTLNSAGYLLKKKK(Lys−P)K
配列番号61
(Sar)WTLNSAGYLLGPKKKK
配列番号62
(Sar)WTLNSAGYLLKK(Lys−P)K
配列番号63
(Sar)WTLNSAGYKK(Lys−P)K
配列番号64
(Sar)WTLNSAGYLLGP(Ahx)KK(Lys−P)K
配列番号65
(Sar)WTLNSAGY(Ahx)KK(Lys−P)K
配列番号66
(Sar)WTLNSAGYKK(Lys−P)K
配列番号67
(Sar)WTLNSAGY(Ahx)KK(Lys−P)K
配列番号68
(Sar)WTLNSAGYLLGPHA(Lys−P)
配列番号69
(Sar)WTLNSAGYLLGPDKDK(Lys−P)DK
配列番号70
(Sar)WTLNSAGYLLGPRR(Lys−P)R
配列番号71
(Sar)WTLNSAGYLLKKKK(Lys−P)K
配列番号72
(Sar)WTLNSAGYLLKK(Lys−P)K
配列番号73
(Sar)WTLNSAGYLLGP(Orn)(Orn)(Lys−P)(Orn)
配列番号74
(Sar)WTLNSAGYLLGP(Dab)(Dab)(Lys−P)(Dab)
配列番号75
(Sar)WTLNSAGYLLGPbKbK(Lys−P)bK
配列番号76
(Sar)WTLNSAGYLLGPHH(Lys−P)H
配列番号77
(Sar)WTLNSAGYLLGP(Lys−P)KKK
配列番号78
(Sar)WTLNSAGYLLGPK(Lys−P)KK
配列番号79
(Sar)WTLNSAGYLLGPKKK(Lys−P)
配列番号80
(Sar)WTLNSAGY(スペルミンS)(Lys−P)
配列番号81
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys−P)−(スペルミンS)
配列番号82
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Glu−スペルミン)K
配列番号83
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys−スペルミン−パルミトイル)K
配列番号84
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(TDA)K
配列番号85
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(NorL)K
配列番号86
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Man)K
配列番号87
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Mel)K
配列番号88
(Sar)WTLNSAGYLL(1PEG)KK(Lys−P)K
配列番号89
(Sar)WTLNSAGYLL(5AVA)KK(Lys−P)K
配列番号90
(Sar)WTLNSAGYL(2PEG)KK(Lys−P)K
配列番号91
(Sar)WTLNSAGYL(8AOA)KK(Lys−P)K
配列番号92
(Sar)WTLNSAGY(1PEG)(5AVA)KK(Lys−P)K
配列番号93
配列番号96
GWTLNSAGYLLGPHAI
配列番号97
GWTLNSAGYLLGPH
配列番号98
GWTLNSAGYLLG
配列番号99
GWTLNSAGYL
配列番号100
GWTLNSAGY
上記配列において:
Ahx=アミノヘキサン酸
DK=リシンのD−異性体
orn=オルニチン
Dab=2,4−ジアミノ酪酸
bK=β−ホモ−リシン
スペルミンS=スペルミン−N4コハク酸
TDA=テトラデカン酸
NorL=ノルロイシン
man=L−Ser−β−メリビオース
1−PEG=5−アミノ−3−オキサペンタン酸5AVA=5−アミノ吉草酸
2−PEG=8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸
8AOA=8−アミノオクタン酸
配列番号101
DPhe−Cys−Phe−DTrp−Lys−Thr−Cys−Thr−NH2
配列番号102
Trp−Ala−Gly−Gly−Asp−Phe−Ser−Gly−Glu
配列番号103
Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−Arg−Ile−Arg−Pro−Lys−Leu−Lys−Trp−Asp−Asn−Gln
配列番号104
PAEDLARYYSALRAYINLITRQRY−NH2
配列番号: 105
KK(Kp)KX (式中、Xはいかなる長さまたはいかなるアミノ酸でもよい)
配列番号106
KK(Kp)KGX(式中、Xはいかなる長さまたはいかなるアミノ酸でもよい)
配列番号107
KK(Kp)K(Ahx)−(神経ペプチド)(式中、Xはいかなる長さまたはいかなるアミノ酸でもよい)
配列番号108
KK(Kp)K(Ahx)G−(神経ペプチド)(式中、Xはいかなる長さまたはいかなるアミノ酸でもよい)
配列番号109
Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−Arg−Ile−Arg−Pro−Lys−Leu−Lys−Lys−(Lys−palm)−Lys−NH2
配列番号110
Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−Arg−Ile−Arg−Pro−Lys−Leu−Lys− Lys−Lys−(Lys−palm)−Lys−NH2
配列番号111
Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−Arg−Ile−Arg−Pro−Lys−Lys−Lys−(Lys−palm)−Lys−NH2
配列番号112
Tyr−Gly−Gly−Phe−Leu−Arg−Arg−Ile−Arg−Pro−Lys−Leu−Lys−(Ahx)−Lys−Lys−(Lys−palm)−Lys− NH2
配列番号113
KKK(Kp)(Ahx)RAYINLITRQRY−NH2
配列番号114
KK(Kp)K(Ahx)RAYINLITRQRY−NH2
配列番号115
KK(Kp)K−[X(13−36)](式中、X(13−36)は神経ペプチドY類似体を表わす)
配列番号116
KK(Kp)KG−[X(13−36)](式中、X(13−36)は神経ペプチドY類似体を表わす)
配列番号117
KK(Kp)K(Ahx)−[X(13−36)](式中、X(13−36)は神経ペプチドY類似体を表わす)
配列番号118
KK(Kp)K(Ahx)G−[X(13−36)](式中、X(13−36)は神経ペプチドY類似体を表わす)
配列番号119
(Sar)WTLNSAGY(D−Lys)(D−Lys)(Lys−P)(D−Lys)
配列番号120
(Sar)WTLNSAGY(Ahx)(D−Lys)(D−Lys)(Lys−P)(D−Lys)
配列番号121
(Sar)WTLNSAGY(7−Ahp)(D−Lys)(D−Lys)(Lys−P)(D−Lys)
配列番号122
(Sar)WTLNSAGY(3,5−ジブロモ−Tyr)LLGPKK(Lys−P)K
配列番号123
(Sar)WTLNSAGYLLGPHH(Lys−P)K
配列番号124
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Cys−Mmt)K
配列番号125
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys−ビオチン−アミノカプロイル)K
配列番号126
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys−ステロール)K
配列番号127
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys−デカノイル)K
配列番号128
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys−オクタノイル)K
配列番号129
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys−リノイル)K
配列番号130
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Ser−メリビオース)K
配列番号131
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys−アダマントイル)K
配列番号132
(Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Glu(β−Lac−PEG3−アミン))K
配列番号133
(Sar)WTLTSAGYLLGPKK(Lys−パルミトイル)K
配列番号134
(Sar)WTLLSAGYLLGPKK(Lys−パルミトイル)K
配列番号135
(Sar)WTLDSAGYLLGPKK(Lys−パルミトイル)K
配列番号136
(Ahx)GGWAGGDASGE
配列番号137
(Palm)GGWAGGDASGE
配列番号138
(Kp)GGWAGGDASGE
配列番号139
KKK(Kp)GGWAGGDASGE
配列番号140
KK(Kp)KGGWAGGDASGE
配列番号141
KKKGGWAGGDASGE
配列番号58および135−141に関して、(DK)はD−Lysであり、(Kp)はLys−パルミトイルであり、Axhはアミノヘキサン酸であり、Palmはパルミチン酸である。
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- 本願明細書に記載された発明。
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