JP2016074713A - 神経系を標的する薬理学的物質の性質を改善することに関連する方法および組成物 - Google Patents

神経系を標的する薬理学的物質の性質を改善することに関連する方法および組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】血液脳関門の高い透過性等の薬理学的性質が改善された神経系を標的とするポリペプチド、並びに該ポリペプチドを作成する手段の提供。
【解決手段】ある特定のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。脂肪酸の導入や芳香族残基へのハロゲンの導入などにより、ポリペプチドの親油性と塩基度を増大させ、もってポリペプチドの血液脳関門の透過性を増大させる等の薬理学的性質を改善する方法。
【選択図】図１

Description

（関連出願）
本出願は、２００６年１月５日に出願された米国仮特許出願第６０／７５７，０４７および２００６年９月１１日に出願された米国仮特許出願第６０／８４４，０２４の利益を主張する。２００６年１月５日に出願された米国仮特許出願第６０／７５７，０４７および２００６年９月１１日に出願された米国仮特許出願第６０／８４４，０２４は、本明細書中で参考として援用される。
（発明の背景）
血液脳関門（ＢＢＢ）は、哺乳動物の脳を全身循環から切り離し、中枢神経系（ＣＮＳ）のホメオスタシスにおいて極めて重要な役割を果たす。血液脳関門を通してのペプチドの輸送の理解は継続的に進展しているにもかかわらず、ＣＮＳへのそれらの直接の効率的な送達は、現在も神経ペプチドを潜在的治療薬として開発する上での主要な課題となっている。
てんかんは、例えば、複雑な神経障害である。難治性てんかんは患者集団の３０％を侵すと推定される。様々な抗てんかん薬（ＡＥＤ）が使用可能であるにもかかわらず、ある種の発作およびてんかん症候群はごくわずかなＡＥＤに対してしか応答せず、その成功は限られている。それ故、改善された効果と安全性プロフィールを備えた新しい抗痙攣治療薬を発見し、開発することが継続的に求められている。さらに、てんかん発作に先立って起こる神経生物学的変化についての最近の発見は、新しい抗てんかん原性化合物の発見の可能性を開くものであり、そのような抗てんかん原性剤は神経ペプチドとニューロトロフィンを含み得る。
てんかん発作の機構に関係付けられてきたニューロペプチドおよびそれらの受容体は、ガラニン、ニューロペプチドＹ、ソマトスタチンおよびオピオイドペプチドを含む。これらのニューロペプチドの一部は、中枢神経系（ＣＮＳ）に直接送達されたとき、抗痙攣作用を有するが、それらの低いバイオアベイラビリティーと不十分な代謝安定性はニューロペプチドに基づく抗てんかん薬の開発を妨げている。他方で、先進ペプチド工学は、改善された安定性またはバイオアベイラビリティーを有するペプチド類似体の多くの成功例を生み出した。しかし、使用可能なペプチド工学手法のいずれもが、抗痙攣作用を有するニューロペプチドには適用されていなかった。当技術分野において求められているのは、血液脳関門の透過性を改善するための方法と組成物である。
（Ｉ．発明の要旨）
本明細書で具体化され、広く説明される、本発明の目的に従って、本発明は、１つの態様では、配列番号３、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列、あるいは１以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号３のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドに関する。
また、配列番号２、４−２９、３７−３９、５０、６４、６５、６６、６７、８０、８２および８９から成る群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２、４−２９、３７−３９、５０、６４、６５、６６、６７、８０、８２および８９から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列、あるいは１以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、４−２９、３７−３９、５０、６４、６５、６６、６７、８０、８２および８９から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドが開示される。
また、配列番号３１−３６から成る群より選択されるアミノ酸セグメント、配列番号３１−３６から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列、あるいは１以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号３１−３６から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドが開示される。
また、配列番号４０、配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列、あるいは１以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４０のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドが開示される。
また、配列番号１０５、１０６、１０７、１０８、１０９−１１２および１１３−１１８から成る群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１０５、１０６、１０７、１０８、１０９−１１２および１１３−１１８から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列、あるいは１以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１０５、１０６、１０７、１０８、１０９−１１２および１１３−１１８から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドが開示される。
また、配列番号５８および１３５−１４１から成る群より選択されるアミノ酸配列、配列番号５８および１３５−１４１から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列、あるいは１以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号５８および１３５−１４１から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドが開示される。
さらに、血液脳関門の高い透過性を有する組成物であって、変化していない形態のペプチドと比較したとき高い親油特性と高い塩基度を有するペプチドを含む組成物が開示される。
変化していない形態のペプチドと比較してペプチドの親油特性を上昇させることおよび塩基度を増大させることを含む、ペプチドについての血液脳関門の透過性を上昇させる方法が開示される。
また、本明細書で開示するポリペプチドの有効量をその必要のある対象に投与することを含む、てんかんを治療する方法が開示される。さらに、本明細書で開示する組成物の有効量をその必要のある対象に投与することを含む、てんかんを治療する方法が開示される。
本明細書で開示するポリペプチドの有効量をその必要のある対象に投与することを含む、疼痛または他の神経障害を治療、予防または改善する方法が開示される。
また、対象の治療において使用する組成物を同定すること；組成物の親油性と塩基度を増大させることによって組成物を修飾すること；および修飾した組成物をその必要のある対象に投与することを含む、血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法が開示される。
さらに、対象の治療において使用する組成物を同定すること；組成物の親油性、グリコシル化および塩基度を増大させることによって組成物を修飾すること；および修飾した組成物をその必要のある対象に投与することを含む、血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法が開示される。
また、対象の治療において使用する組成物を同定すること；組成物の親油性、グリコシル化および塩基度を増大させることによって組成物を修飾すること；修飾した組成物をベクターに挿入すること；およびその必要のある対象にベクターを投与することを含む、血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法が開示される。
さらに、対象の治療において使用する組成物を同定すること；組成物の親油性と塩基度を増大させることによって組成物を修飾すること；修飾した組成物をベクターに挿入すること；およびその必要のある対象にベクターを投与することを含む、血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法が開示される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号３、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列、あるいは１以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号３のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
（項目２）
配列番号２、４−２９、３７−３９、５０、６４、６５、６６、６７、８０、８２および８９から成る群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２、４−２９、３７−３９、５０、６４、６５、６６、６７、８０、８２および８９から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列、あるいは１以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、４−２９、３７−３９、５０、６４、６５、６６、６７、８０、８２および８９から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
（項目３）
配列番号３１−３６から成る群より選択されるアミノ酸セグメント、配列番号３１−３６から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列、あるいは１以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号３１−３６から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
（項目４）
配列番号４０、配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列、あるいは１以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号４０のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
（項目５）
配列番号１０５、１０６、１０７、１０８、１０９−１１２および１１３−１１８から成る群より選択されるアミノ酸配列、配列番号１０５、１０６、１０７、１０８、１０９−１１２および１１３−１１８から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列、あるいは１以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１０５、１０６、１０７、１０８、１０９−１１２および１１３−１１８から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
（項目６）
配列番号５８および１３５−１４１から成る群より選択されるアミノ酸配列、配列番号５８および１３５−１４１から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列、あるいは１以上の保存的アミノ酸置換を有する配列番号５８および１３５−１４１から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
（項目７）
前記ポリペプチドが、ガラニンと比較したとき高い安定性を有する、項目１または２に記載のポリペプチド。
（項目８）
前記ポリペプチドが、ソマトスタチンと比較したとき高い安定性を有する、項目３に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記ポリペプチドが、デルタ睡眠誘発ペプチド（ＤＳＩＰ）と比較したとき高い安定性を有する、項目６に記載のポリペプチド。
（項目１０）
血液脳関門の高い透過性を有する組成物であって、変化していない形態のペプチドと比較したとき高い親油特性と高い塩基度を有する該ペプチドを含む組成物。
（項目１１）
１以上のさらなる組成物と組み合わせて使用される、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
前記さらなる組成物が、神経ペプチドＹ、ジノルフィン、オピオイドおよびオピオイドペプチド、モルヒネ、ヒドロキシモルヒネ、フェンタニル、オキシコドン、コデイン；カプサイシン；ならびにカルバマゼピン、プリミドン、ガバペンチン、プレガバリン、ジアゼパム、フェルバメート、フルオロフェルバメート、ラモトリギン、ラコサミド、レベチラセタム、フェノバルビタール、フェニトイン、フォスフェニトイン、トピラメート、バルプロエート、ビガバトリン、ゾニサミド、オキシカルバゼピン、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、局所麻酔薬（リドカインなど）、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ＮＭＤＡアンタゴニスト、αアドレナリン作用性受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、アデノシン、カンナビノイド、ＮＫ−１アンタゴニスト（ＣＩ−１０２１）、抗うつ薬（例えばアミトリプチリン、デシプラミン、イミプラミン）、ガラニン、ソマトスタチン、デルタ睡眠誘発ペプチド、エンケファリン、オキシトシン、コレシストキニン、カルシトニン、コルチスタチン、ノシセプチンおよび他の神経ペプチドに基づく治療薬の類似体および誘導体、プルロニックＰ８５ブロックコポリマーを含むが、これらに限定されない、クラスとしての抗てんかん薬、Ｆｌｕｒｉｚａｎなどのアミロイド低下剤；ガランタミン（Ｒａｚａｄｙｎｅ）；リバスチグミン（Ｅｘｅｌｏｎ）；ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ）；タクリン（Ｃｏｇｎｅｘ）；メマンチン（Ｎａｍｅｎｄａ）；およびアルツハイマー病のためのワクチンから成る群より選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記親油特性が、前記ペプチドを疎水性部分に結合体化することによって高められる、項目１０−１２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１４）
前記疎水性部分がポリ脂肪族鎖である、項目１０に記載の組成物。
（項目１５）
前記親油特性が、芳香族残基のハロゲン化を増大させることによって高められる、項目１０−１４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１６）
前記塩基度が、リシン、アルギニン、ホモリシン、ホモアルギニン、ＬまたはＤ異性体立体配置のオルニチン；２，３−ジアミノプロピオン酸；２，４−ジアミノ酪酸を含むが、これらに限定されない、正に荷電したアミノ酸残基のホモおよびヘテロオリゴマーを導入することによって高められる、項目１０−１５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１７）
前記塩基度が、スペルミン、スペルミジン、ポリアミドアミンデンドリマーまたはポリアミン毒素およびそれらの誘導体などの、ポリアミンベースの部分への結合体化によって高められる、項目１０−１５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１８）
前記ペプチドが、変化していない該ペプチドと比較して１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％より効率的に血液脳関門を通過することができる、項目１０−１７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１９）
前記ペプチドがまた、変化していない形態の該ペプチドと比較したとき高いグリコシル化を有する、項目１０−１８のいずれか１項に記載の組成物。
（項目２０）
項目１０−１８のいずれか１項に記載の組成物を含むベクター。
（項目２１）
ペプチドについての血液脳関門の透過性を上昇させる方法であって、変化していない形態の該ペプチドと比較して該ペプチドの親油特性を上昇させることおよび塩基度を増大させることを含む、方法。
（項目２２）
前記親油特性が、前記ペプチドを疎水性部分に結合体化することによって高められる、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記疎水性部分がポリ脂肪族鎖である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記親油特性が、芳香族残基のハロゲン化を増大させることによって高められる、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記塩基度が、リシン、アルギニン、ホモリシン、ホモアルギニン、ＬまたはＤ異性体立体配置のオルニチン；２，３−ジアミノプロピオン酸；２，４−ジアミノ酪酸を含むが、これらに限定されない、正に荷電したアミノ酸残基のホモおよびヘテロオリゴマーを導入することによって高められる、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
前記塩基度が、スペルミン、スペルミジン、ポリアミドアミンデンドリマーまたはポリアミン毒素およびそれらの誘導体などの、ポリアミンベースの部分への結合体化によって高められる、項目２１に記載の方法。
（項目２７）
前記ペプチドが、変化していない該ペプチドと比較して１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％より効率的に血液脳関門を通過することができる、項目２１に記載の方法。
（項目２８）
変化していない形態の前記ペプチドと比較して該ペプチドのグリコシル化を増大させることをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２９）
項目１に記載のポリペプチドの有効量をその必要のある対象に投与することを含む、てんかんを治療する方法。
（項目３０）
項目１０−１９のいずれか１項に記載の組成物の有効量をその必要のある対象に投与することを含む、てんかんを治療する方法。
（項目３１）
前記てんかんが、全身、部分または難治性てんかんである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
項目１に記載のポリペプチドの有効量をその必要のある対象に投与することを含む、疼痛または他の神経障害を治療、予防または改善する方法。
（項目３３）
項目３２に記載の方法であって、前記疼痛が以下の１つ以上によって引き起こされる、または前記神経障害が以下の１つ以上から選択される：慢性背痛、癌、線維筋痛、ヘルペス後神経痛、多発性硬化症、糖尿病性ニューロパシー、末梢神経損傷、外傷性モノニューロパシー、複合性局所疼痛症候群および脊髄損傷。
（項目３４）
項目１０−１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象において脊髄損傷を治療する方法。
（項目３５）
項目１０−１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象において多発性硬化症を治療する方法。
（項目３６）
項目２に記載のポリペプチドの有効量をその必要のある対象に投与することを含む、神経障害を治療、予防または改善する方法。
（項目３７）
項目３に記載のポリペプチドの有効量をその必要のある対象に投与することを含む、神経障害を治療、予防または改善する方法。
（項目３８）
前記神経障害がてんかんである、項目３２または３６−３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記神経障害がうつ病である、項目３２または３６−３７のいずれか１項に記載の方法。（項目４０）
前記神経障害が疼痛である、項目３２または３６−３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
前記神経障害がアルツハイマー病である、項目３２または３６−３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記対象がまた、１以上の付加的な組成物でも治療される、項目３２または３６−３７のいずれかに記載の方法。
（項目４３）
血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法であって、
ｉ．該対象の治療において使用する該組成物を同定すること；
ｉｉ．該組成物の親油性と塩基度を増大させることによって該組成物を修飾すること；
ｉｉｉ．該修飾した組成物をその必要のある該対象に投与すること；
を含む、方法。
（項目４４）
血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法であって、
ｉ．該対象の治療において使用する該組成物を同定すること；
ｉｉ．該組成物の親油性、グリコシル化および塩基度を増大させることによって該組成物を修飾すること；
ｉｉｉ．該修飾した組成物をその必要のある該対象に投与すること；
を含む、方法。
（項目４５）
血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法であって、
ｉ．該対象の治療において使用する該組成物を同定すること；
ｉｉ．該組成物の親油性、グリコシル化および塩基度を増大させることによって該組成物を修飾すること；
ｉｉｉ．該修飾した組成物をベクターに挿入すること；
ｉｖ．その必要のある該対象に該ベクターを投与すること
を含む、方法。
（項目４６）
血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法であって、
ｉ．該対象の治療において使用する該組成物を同定すること；
ｉｉ．該組成物の親油性と塩基度を増大させることによって該組成物を修飾すること；
ｉｉｉ．該修飾した組成物をベクターに挿入すること；
ｉｖ．その必要のある該対象に該ベクターを投与すること
を含む、方法。
（項目４７）
血液脳関門の高い透過性を有する組成物を作製する方法であって、血液脳関門の高い透過性を有する組成物を作製することを含み、該組成物が、変化していない形態のペプチドと比較したとき高い親油特性と高い塩基度を有する該ペプチドを含有する、方法。
（項目４８）
前記親油特性が、前記ペプチドを疎水性部分に結合体化することによって高められる、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記疎水性部分がポリ脂肪族鎖である、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記親油特性が、芳香族残基のハロゲン化を増大させることによって高められる、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
前記塩基度が、リシン、アルギニン、ホモリシン、ホモアルギニン、ＬまたはＤ異性体立体配置のオルニチン；２，３−ジアミノプロピオン酸；２，４−ジアミノ酪酸を含むが、これらに限定されない、正に荷電したアミノ酸残基のホモおよびヘテロオリゴマーを導入することによって高められる、項目４７に記載の方法。
（項目５２）
前記塩基度が、スペルミン、スペルミジン、ポリアミドアミンデンドリマーまたはポリアミン毒素およびそれらの誘導体などの、ポリアミンベースの部分への結合体化によって高められる、項目４７に記載の方法。
（項目５３）
前記ペプチドが、変化していない該ペプチドと比較して１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％より効率的に血液脳関門を通過することができる、項目４７に記載の方法。
（項目５４）
前記ペプチドがまた、変化していない形態の該ペプチドと比較したとき高いグリコシル化を有する、項目４７に記載の方法。
（項目５５）
前記ペプチドがスペーサーを含む、項目４７に記載の方法。
（項目５６）
前記スペーサーが、Ｇｌｙ、Ａｈｘ、Ｇｌｙ−ＡｈｘまたはＰＥＧ−Ｏ２Ｏｃから成る群より選択される、項目５５に記載の方法。
図１は、ＳＳＳＥ海馬神経回路内のＧＡＢＡおよびＧＬＵを介した神経伝達における神経ペプチドの役割を示す。略語：ＣＡ、錐体ニューロン；ＤＹＮ、ジノルフィン；ＧＡＢＡ、γ−アミノ酪酸；ＧＡＬ、ガラニン；ＧＬＵ、グルタミン酸塩；ＮＥ、ノルエピネフリン；ＮＰＹ、神経ペプチドＹ；ＳＯＭ、ソマトスタチン；ＳｕｂｓＰ、サブスタンスＰ（Ｗａｓｔｅｒｌａｉｎら、２００２）。 図２は、刺激前または刺激後に門に注入したガラニンがラットにおいて発作の持続時間を短縮したことを示す。上図。ガラニン（５０および５００ピコモル）を貫通枝刺激（ＰＰＳ）の３０分前に注射した。下図。ＰＰＳの３０分後に注射したとき、５００ピコモルのガラニンの注射だけが発作の持続時間を低減する上で有効であった（Ｍａｚａｒａｔｉら、１９９８）。 図３は、非ペプチド性ガラニン受容体アゴニストとガラニンの両方が、マウスにおいてＰＴＺ誘導性発作に関する潜伏期間を上昇させ、発作スコアを低下させたことを示す。挿入図は最大発作スコアを要約する（黒色、対照；白色、ガルノン；灰色、ガラニン）（Ｓａａｒら、２００２）。 図４は、ラットでの自立（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ）てんかん重積持続状態モデルにおける海馬内注射後のソマトスタチンの抗痙攣活性を示す（ＭａｚａｒａｔｉとＷａｓｔｅｒｌａｉｎ，２００２）。 図５は、ラットでの自立てんかん重積持続状態モデルにおける海馬内注射後のジノルフィンおよび神経ペプチドＹの抗痙攣活性を示す。対照の実験については図４を参照のこと。（ＭａｚａｒｔｉとＷａｓｔｅｒｌａｉｎ，２００２）。 図６は、血液脳関門を通るペプチドの透過性に影響を及ぼす鍵となる因子を示す。塩基度と親油性は、拡散による受動輸送および吸収媒介性エンドサイトーシスを改善し得るが、グリコシル化またはベクターも、血液脳関門を通る能動輸送に寄与し得る。 図７は、抗痙攣活性を有する神経ペプチド類似体の開発のための一般的戦略を示す。２つのモデル神経ペプチドは、血液脳関門を通るそれらの透過性を改善するための技術を評価するために選択した。 図８は、理想的神経ペプチド薬の原型の構造的構成を示す。星印は、薬理作用団の残基を表わす。灰色の箱は、ペプチド部分の代謝安定性、塩基度および親油性を上昇させる骨格および側鎖修飾を表わす。ＢＢＢ／ＰＫ−修飾因子は、親油性および陽イオン性モジュールおよび内因性栄養素ミメティックを含む、かさの高いポリマーベースの構造である。陽イオン性モジュールは、膜との静電的相互作用を通して吸収媒介性エンドサイトーシスを上昇させる。親油性モジュールは、血液脳関門を透過する受動輸送を高める。能動輸送ミメティック構造（例えばヘキソースまたはフェニルアラニン）は、血液脳関門内に位置する内向き栄養素輸送体との相互作用のための基質として働く。 図９は、ＢＢＢを透過するペプチド類似体を設計するために使用される戦略を示す。ＢＢＢを通る類似体の透過性を改善する２以上の異なる化学修飾の組合せが示されている。 図１０は、血液脳関門を通る透過性を改善する神経ペプチドを工作することへの体系的アプローチを示す。キーワード：ＤＡＢ、ジアミノ酪酸；ＤＡＰ、ジアミノプロピオン酸；ＰＥＧ，ポリエチレングリコール；Ｍｍｔ、４−メチルトリチル。 図１１は、ソマトスタチン類似体におけるＮ末端伸長のモジュール構造を示す。モジュールは固相ペプチド合成の間に結合される。モジュールの数および順序は任意であり、ＢＢＢ／ＰＫ修飾因子の構造組成物は最適化することができる。 図１２は、Ｇａｌ ＢＢＢ−２がフリングスマウスにおける聴原性発作に対して時間（差し込み図）および用量依存的保護を示すことを明らかにする。経過中、マウスを４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．のＧａｌ ＢＢＢ−２で処置し、投与後様々な時点で試験した。フリングスマウスの用量応答試験群については、マウスを漸増用量のＧａｌ ＢＢＢ−２で処置し、ｉ．ｐ．投与の１時間後に試験した。 図１３は、ＧＡＬ−ＢＢＢ２を最適化する一般的実験戦略を示す。最初の３つの箱は、実施例１で定義する活性を要約する。約４０の類似体を合成し、競合結合アッセイにおいてスクリーニングする。最も強力なガラニンリガンドだけを、より詳細な薬理学的特性決定の前に、それらの強力で持続的な抗痙攣活性に関してさらにスクリーニングする。 図１４は、ＧＡＬ−ＢＢＢ２の構造的構成、および提案されるＳＡＲ試験を示す。黒い箱は、鍵となる薬理作用団残基を示す。 図１５は、「骨格プロテーゼ（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）」−非ペプチドスペーサー（５−アミノ吉草酸）による非薬理作用団残基（Ｒ２およびＲ３）の置換を示す。他の骨格スペーサーは、アミノヘキサン酸またはアミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＰＥＧ−スペーサー）を含む。 図１６は、ＧＡＬ−ＢＢＢ２（図ではＮＡＸ−５０５５と称している）（０．５２−５ｍｇ／ｋｇ）が、初期急性期ならびに長期的炎症期の両方において足を嘗めることによる用量依存的減少を生じさせたことを示す。これに対し、非修飾天然フラグメントＧａｌ １−１６は、試験したＧＡＬ−ＢＢＢ２の最高用量（すなわち２０ｍｇ／ｋｇ）より４倍高い用量のｉ．ｐ．投与後、不活性であることが認められた。 図１７は、５ｍｇ／ｋｇのＧＡＬ−ＢＢＢ２がガバペンチンの１０ｍｇ／ｋｇ用量に等しいことが認められたことを示す。 図１８は、ＧＡＬ−ＢＢＢ２（図ではＮＡＸ−５０５５と称している）が、慢性疼痛の坐骨神経結紮モデルにおける機械的異痛についての閾値の時間依存的な引き上げを示したことを明らかにする。さらに、ＧＡＬ−ＢＢＢ２はモルヒネと等しい効力を有し、ガバペンチンより数倍強力であった。 図１９は、ＮＡＸ−５０５５とも称される、ＧＡＬ−ＢＢＢ２の構造を示す。 図２０は、ＮＡＸ５０５５（ＧＡＬ−ＢＢＢ２）はフリングスマウスにおいて活性であるが、天然ペプチドフラグメントは活性でないことを示す。抗痙攣効果を、用量応答試験におけるピーク効果（すなわち１時間目）の時点で定量した。この試験の結果は、ＧＡＬ−ＢＢＢ２が音誘発性発作に対して用量依存的作用を示すことを明らかにした。用量応答データのプロビット分析から得た算定中央有効量（すなわちＥＤ５０）および９５％信頼区間は、３．２（２．３−６．１）ｍｇ／ｋｇであった。天然ペプチドフラグメントＧＡＬ（１−１６）は２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．の用量（ＧＡＬ−ＢＢＢ２についてのＥＤ５０の６倍）で不活性であった。 図２１は、オクトレオシド（ｏｃｔｒｅｏｃｉｄｅ）を工作するための化学構造および概略図を示す。 図２２は、ＮＡＸ５０５５（ＧＡＬ−ＢＢＢ２）が、６Ｈｚ（３２ｍＡ）試験において天然ペプチドよりも強力で、より有効であることを示す。 図２３は、ＮＡＸ５０５５（ＧＡＬ−ＢＢＢ２）（４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）がフリングスマウスにおいて時間依存的抗痙攣活性を示すことを明らかにする。 図２４は、ＮＡＸ５０５５（ＧＡＬ−ＢＢＢ２）がフリングスマウスにおいて聴原性発作に対する用量依存的保護を示すことを明らかにする。 図２５は、ＮＡＸ５０５５（ＧＡＬ−ＢＢＢ２）（４ｍｇ／ｋｇ）が薬物抵抗性発作モデルにおいて活性であることを示す。 図２６は、ＮＡＸ５０５５（ＧＡＬ−ＢＢＢ２）が６Ｈｚ発作試験においてｉ．ｐ．およびｓ．ｃ．投与後に卓越したバイオアベイラビリティーを示すことを明らかにする。ＮＡＸ５０５５を、雄性ＣＦ−１マウスの群（ｎ＝６−８）に腹腔内または皮下注射した。６０分後、各々の群の個別マウスを角膜電極によって刺激した（３２ｍＡ、６Ｈｚ、３秒間）。辺縁系発作を示さないマウスを保護されたとみなした。結果は、ＮＡＸ５０５５の抗痙攣活性が皮下投与後も保持されることを明らかにする。これらの所見は、ＮＡＸ５０５５および／または他の神経活性ペプチドの皮下送達に適したデポー製剤が使用できることを示す。 図２７は、ＮＡＸ５０５５（ＧＡＬ−ＢＢＢ２）が６Ｈｚ（４４ｍＡ）試験においてＣＭＰＤ Ｘの効果と効力を上昇させることを示す。単独で投与したとき、ＣＭＰＤ Ａ（レベチラセタム）は６Ｈｚ辺縁系発作に対して非常に高い用量でごくわずかしか有効でない（すなわち１０００ｍｇ／ｋｇで最大５０％の保護）。これに対し、最小限の有効用量のＮＡＸ５０５５（１．５ｍｇ／ｋｇ）が、ＣＭＰＤ Ａ（レベチラセタム）と組み合わせて投与したとき、効果と効力が著明に上昇する。これらの結果は、ＮＡＸ５０５５によるガラニン受容体の調節がレベチラセタムの抗痙攣効果の相乗作用的増強を導くことを示す。合わせて考慮すると、これらの所見は、レベチラセタムとＮＡＸ５０５５を組み合わせた配合生成物が、非常に高用量のレベチラセタム単独に比べて治療上の利益を提供し得ることを示す。 図２８は、ＮＡＸ５０５５（ＧＡＬ−ＢＢＢ２）が海馬キンドリングラットにおいて控えめな保護を示すことを明らかにする。部分てんかんの海馬キンドリングラットモデルにおいて、ＮＡＸ５０５５は発作スコアを５から３に低下させる。これらの結果は、ＮＡＸ５０５５によるガラニン受容体の調節が二次性全般化部分てんかん発作を予防する上で有効であり、ガラニンをキンドリングラットの脳に直接注入したこれまでの脳室内試験と一致することを示す。腹腔内投与したＮＡＸ５０５５が活性であるという所見は、ＮＡＸ５０５５が全身投与後に脳へのアクセスを獲得しているという結論を裏付ける。 図２９は、ホルマリン誘発性痛覚過敏へのＮＡＸ５０５５（ＧＡＬ−ＢＢＢ２）の作用を示す。ホルマリンの足底注射の６０分前にＮＡＸ５０５５を投与した。時間は抗痙攣ピーク効果時間に基づいた。 図３０は、ソマトスタチンおよびデルタ睡眠誘発ペプチド（ＤＳＩＰ）がどちらも２２ｍＡ ６Ｈｚ発作試験において抗痙攣性であることを示す。この図に示す結果は、ＣＦ−１マウスの脳室腔に直接注入したとき、ソマトスタチンおよびデルタ睡眠誘発ペプチド（ＤＳＩＰ）が６Ｈｚ（２２ｍＡ）辺縁系発作に対して有効であることを明らかにする。これらの結果は、脳内のソマトスタチンおよびＤＳＩＰ結合部位の調節が実行可能なアプローチであるという「概念実証」を提供する。それらはさらに、我々の専有テクノロジーを使用した、血液脳関門を通過する全身的に活性なソマトスタチンおよびＤＳＩＰ神経活性ペプチドの開発を支持する。 図３１は、ＧＡＬ（１−１６）類似体の構造を示す。高いＢＢＢ透過性を有する類似体を設計するために使用した鍵となる情報断片に印を付けている。 図３２は、マウス角膜キンドリングの獲得へのＮＡＸ−５０５５（４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の１日２回の注射の作用を示す。ＣＦ＃１マウスを、ビヒクル（０．９％食塩水）またはＮＡＸ５０５５のいずれかを摂取するように無作為に割り付けた。ＮＡＸ−５０５５群のマウスは、最初のキンドリング刺激の１２時間前と１時間前の２回、ＮＡＸ−５０５５の投与を受けた。その後の各刺激の１時間前に、ＮＡＸ−５０５５処置群のマウスはさらにもう１回ＮＡＸ−５０５５（４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の投与を受けた。マウスを１日２回１６日間刺激した。結果は、刺激当たりの平均発作スコアで表わしている。上記のように、ＮＡＸ−５０５５処置マウスについての結果は、２つの集団、すなわち感受性（緑色の線）と非感受性（青色の線）に分けられた。食塩水対ＮＡＸ−５０５５感受性は、ｐ＜０．０００２で有意に異なる；ＮＡＸ−５０５５感受性対ＮＡＸ−５０５５非感受性は、ｐ＜０．０００１で有意に異なる。この試験について得られた結果は、ＮＡＸ−５０５５などのガラニンに基づくペプチドがキンドリングの獲得を予防する能力を有しており、てんかんおよび他の神経障害の発症の危険度が高い患者において疾患修飾性であり得るという主張を裏付ける。 図３３は、角膜キンドリングの割合へのＮＡＸ−５０５５（ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）による１日２回の処置の作用を示す。ＮＡＸ−５０５５で処置したマウスは（実験の詳細については図Ｘの脚注参照）、２つの処置群、すなわちＮＡＸ−５０５５感受性とＮＡＸ−５０５５非感受性に分けられた。結果は、特定発作スコア±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、すなわち１−５に達するために必要な刺激の回数として表わしている。ＮＡＸ−５０５５感受性群のマウスは、第１段階発作に達するために２倍以上の刺激を必要とし、第２段階および第３段階発作に達するためにそれぞれ３５−４０％多い刺激を必要とした。さらに、ＮＡＸ−５０５５感受性群のマウスはいずれも第５段階発作に至らなかった。一方向ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０２０９；ポストホック分析：食塩水対ＮＡＸ−５０５５非感受性、ｐ＞０．０５；ＮＡＸ−５０５５感受性対ＮＡＸ−５０５５非感受性、ｐ＜０．０５。これらの結果は、修飾されたガラニンベースの神経ペプチドがキンドリング獲得の発現を修飾する能力を有すること、およびそれらが、てんかんおよび他の神経障害を発症しやすい患者集団においてネットワーク過剰興奮性の予防のために有用であるという結論を支持する。 図３４は、エンケファリン類似体に導入されたグリコシル基の構造を示す（Ｅｌｍａｇｂａｒｉ，Ｅｇｌｅｔｏｎら、２００４）。 図３５は、２つの異なる化学修飾の組合せが個々の修飾を上回ることを示す。カチオン化または脂質付加（ｌｉｐｉｄｉｚａｔｉｏｎ）単独では、両者の組合せとしての５０５５類似体の透過を改善しなかった。 図３６は、血液脳関門を通るペプチドの透過性を改善するために使用したリポアミノ酸の例を示す。そのようなリポアミノ酸は、標的ペプチドの塩基度を高める化学修飾と組み合わせることができる。 図３７は、化学修飾が神経ペプチド類似体の代謝安定性を改善することを示す。類似体５０５５（配列番号３）または１２０５−２（配列番号５０）または非修飾類似体Ｇａｌ（１−１６）を希釈ラット血清中３７℃でインキュベートした。ペプチドの残存量をＨＰＬＣによって測定した。 図３８は、様々な種類の神経因性疼痛が、ＢＢＢを横切る神経ペプチド類似体によって治療、予防または逆転され得ることを示す。
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する付属の図面は、本発明のいくつかの実施形態を例示し、説明と共に本発明の原理を説明する役割を果たす。
（ＩＩＩ．詳細な説明）
本発明は、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明およびその中に含まれる実施例、ならびに図面とそれらの上記および下記の説明を参照することによってより容易に理解され得る。
本発明の化合物、組成物、製品、装置および／または方法を開示し、説明する前に、本発明は、異なる記載がない限り、特定合成方法、特定組換えバイオテクノロジー法に限定されず、あるいは異なる記載がない限り特定試薬に限定されず、それ自体、言うまでもなく、変化し得ることが了解されるべきである。また、本明細書で使用する用語は特定実施形態を説明することだけを目的とし、限定を意図しないことが了解されるべきである。
Ａ．定義
本明細書および付属の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに異なる指示を与えない限り、複数の指示対象を包含する。それ故、例えば「医薬担体」への言及は、２以上のそのような担体の混合物を含む、等である。
範囲は、本明細書では「およその（約）」ある特定値から、および／または「およその（約）」もう１つの特定値までとして表わされ得る。そのような範囲が表わされるとき、もう１つの実施形態は、そのある特定値からおよび／またはその他の特定値までを含む。同様に、数値が、「約」という先行詞の使用によって近似値として表わされるとき、その特定値はもう１つの実施形態を形成することが了解される。さらに、範囲の各々の終点は、他方の終点に対しておよび他方の終点とは独立して、の両方において有効であることが了解される。また、本明細書で開示される多くの値が存在すること、および各々の値はまた、その値自体に加えて「およその（約）」その特定値として本明細書で開示されることが了解される。例えば数値「１０」が本明細書で開示される場合、「約１０」も同時に開示される。また、当業者には適切に理解されるように、ある数値が開示されるとき、その数値「以下」、「その数値以上」および数値間の可能な範囲の数値も同時に開示される。例えば数値「１０」が本明細書で開示される場合、「１０以下」ならびに「１０以上」も同時に開示される。
本明細書および以下の特許請求の範囲において、多くの用語への言及が為され、それらは以下の意味を有すると定義される：
「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「場合により（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、その後に述べられる事象または状況が起こってもよくまたは起こらなくてもよいこと、およびその記述が、前記事象または状況が起こる場合と起こらない場合を包含することを意味する。
Ｂ．組成物および方法
１．血液脳関門
血液脳関門（ＢＢＢ）は、適切な機能のために必要な栄養素を脳に供給しながら、血流中の有害物質から脳を保護する毛細血管内皮細胞の特殊なシステムである。細胞を横切る／細胞間の物質の比較的自由な交換を許容する末梢毛細血管と異なり、ＢＢＢは、物理的（密着結合）および代謝（酵素）関門の両方を通して脳内への輸送を厳密に制限する。それ故ＢＢＢは、しばしば、治療薬の脳内への透過を決定する上での速度制限因子である。
多くの障害が、現在、中枢神経系（ＣＮＳ）治療薬として使用するための多くの化合物の使用を制限している。第一に、脳は関門系を備える。脳関門系は２つの主要成分：脈絡叢と血液脳関門（ＢＢＢ）を有する。脈絡叢は、血液から脳脊髄液（ＣＳＦ）を分離し、ＢＢＢは血液から脳ＩＳＦを分離する。
また、ＢＢＢは脈絡叢より約１０００倍大きい表面積を有しており、ＣＮＳへの治療化合物の送達にとっての主要な障害である。ＢＢＢは選択的隔壁として働き、ＣＮＳと末梢循環の間での、ペプチドを含む物質の交換を調節する。ＢＢＢの一次構造は脳の毛細血管内皮細胞壁である。脳毛細血管内皮細胞の密着結合は、循環化合物が傍細胞経路によって脳ＩＳＦに達するのを妨げる。さらに、最近の研究は、密着結合によって与えられる関門に加えて、基底板のレベルでの生理的関門の存在を示唆する（Ｋｒｏｌｌら、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．５，ｐ．１０８３（Ｍａｙ １９９８））。ＢＢＢの他の独自の特徴は、細胞内穿孔および飲小胞の欠如および内皮の管腔表面の実効負電荷を含む。
物質がＢＢＢを通過し得る機構は、一般に能動輸送と受動輸送機構に分けられ得る。親油性分子は、内皮細胞膜を通しての受動輸送または拡散によって容易にＢＢＢを通過する。ペプチドなどの親水性分子は、典型的にはそれらがＢＢＢを通過することができるようにする能動輸送系を必要とする。インスリンなどのある種のより大きなペプチドは、能動トランスサイトーシス系として働く脳毛細血管の管腔表面に受容体を有する。
血液脳関門を越えてペプチドを輸送するための２つの主要な機構：（１）主として分子の大きさと親油性によって決定される、膜を通しての単純拡散、および（２）血液脳関門内の内皮細胞の表面に位置する特異的受容体および担体によって、または非特異的な吸収トランスサイトーシスによって媒介される、能動的流入（ＴａｍａｉとＴｓｕｊｉ、２０００；ＰａｎとＫａｓｔｉｎ、２００４ａ；Ｓｍｉｔｈら、２００４）が存在する。
２．透過性の改善
血液脳関門を通るペプチドおよびタンパク質の透過性を改善するために多くの戦略が試験されてきた。これらはいくつかのカテゴリーに分けることができる：（１）ＣＮＳへのペプチドの取り込みを増強するベクターまたは栄養素能動輸送体への結合体化；（２）単純拡散を増強する高い親油性を生じさせる脂質付加／ハロゲン化；（３）吸収トランスサイトーシスを通しての輸送を増強するカチオン化（塩基度上昇）；および（４）能動／受動輸送およびペプチドの薬物動態プロフィールを改善するグリコシル化またはプロドラッグ（（Ｗｉｔｔら、２００１）および（ＰａｎとＫａｓｔｉｎ，２００４ａ））。そのような試験の例および主要所見を表１に示す。各々の参考文献は、血液脳関門の透過に関するその教示に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
表１．血液脳関門を通るペプチドの透過性を改善する例
Figure 2016074713
 最初の項目である結合体化に関して、結合体化したペプチドの分子サイズの増大は透過性を妨げないと思われる。オピオイドペプチド、ダラルギン（分子量＝７２６）へのペプチドベースのベクターＳｙｎＢ１（分子量＝２，０９９）の付加は、ほぼ４倍のサイズ増大を生じさせたが、同時に脳取込みの１８倍上昇をもたらした（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅら、２００３）。同様に、エンケファリン類似体への二糖部分の付加は、静脈内投与後、それらの抗侵害受容活性を２１倍まで上昇させた（Ｅｌｍａｇｂａｒｉら、２００４）。
２つの重要な因子、すなわち親油性と塩基度は、特異的輸送体または担体を必要とせずに血液脳関門を通るペプチドの透過性上昇に寄与する。ペプチドの親油特性は、疎水性部分（例えばポリ脂肪族鎖）への結合体化、または芳香族残基のハロゲン化（例えばＰｈｅと比較したときのクロロ−Ｐｈｅ）によって変化され得る。ポリアミン修飾タンパク質およびペプチドは、非修飾形態と比較して、より効率的に血液脳関門を通過することが示された（ＰｏｄｕｓｌｏとＣｕｒｒａｎ、１９９６ａ；ｂ；Ｐｏｄｕｓｌｏら、１９９９）。また、低分子ペプチドの高い塩基度は、吸収媒介性エンドサイトーシス（ＡＭＥ）による血液脳関門を通しての輸送の重要な決定因子であることが示された（Ｔａｍａｉら、１９９７）。
ペプチドの直接修飾に加えて、ＣＮＳへの薬剤の改善された取込みに関するいくつかの他の薬剤送達戦略がある。これらは、血液脳関門を通してのペプチドのリポソーム、ミセルまたはナノ粒子媒介性送達を含む（Ｋｒｅｕｔｅｒら、２００３；ＰａｎとＫａｓｔｉｎ、２００４ｂ）。これらの新規薬剤送達技術は、本明細書で開示され、当技術分野で公知の神経ペプチドに基づく組成物にも適用できる。
血液脳関門を通る神経ペプチドの透過性を改善するためのいくつかのペプチド工作戦略が存在する。これらを図６に要約する。しかし、上述した試験のいずれもが、血液脳関門を通るペプチドの透過性をさらに促進するためにこれらの戦略を組み合わせるという体系的アプローチは示さなかった。本明細書で開示するのは、ソマトスタチンまたはガラニンなどの公知の抗痙攣性神経ペプチドと組み合わせたこれらのペプチド工作戦略の適用であり、それによって静脈内（ｉ．ｖ．）または皮下（ｓ．ｃ．）投与経路を通してこれらのペプチドを抗痙攣性にすることである。
血液脳関門の透過性を上昇させるための方法および組成物を本明細書で開示する。「上昇させる」とは、野生型、非変化形態または天然ペプチド、あるいは対照組成物と比較して、より高いパーセンテージの組成物が血液脳関門を透過できることを意味する。例えば上昇の割合は、対照、天然または野生型ペプチドまたは組成物と比較したとき、
Figure 2016074713
 パーセントであり得る。
特に、組成物が、変化していない形態のペプチドと比較したとき高い親油特性と高い塩基度を有するペプチドを含む、血液脳関門の高い透過性を備えた組成物を本明細書で開示する（図７）。また、組成物が、変化していない形態のペプチドと比較したとき高い親油特性、高い塩基度および高いグリコシル化を有するペプチドを含む、血液脳関門の高い透過性を備えた組成物を開示する。
また、変化していない形態のペプチドと比較してペプチドの親油特性を上昇させ、および塩基度を増大させることを含む、ペプチドに関する血液脳関門の透過性を上昇させる方法を本明細書で開示する。ペプチドに関する血液脳関門の透過性を上昇させるもう１つの方法は、変化していない形態のペプチドと比較してペプチドの親油特性を上昇させること、塩基度を増大させること、およびグリコシル化を増大させることを含む。
ａ）親油特性
組成物の親油特性は、例えばペプチドを疎水性部分に結合体化することによって上昇させ得る。疎水性部分の例は、ポリ脂肪族鎖または芳香族残基を含むが、これらに限定されない。親油特性はまた、ペルフルオロヘキサン酸などの、芳香族残基またはポリ脂肪族試薬のハロゲン化を増大させることによって高めることができる。
ｂ）塩基度
組成物の塩基度は、リシン、アルギニン、ホモリシン、ホモアルギニン、ＬまたはＤ異性体立体配置のオルニチン；２，３−ジアミノプロピオン酸；２，４−ジアミノ酪酸を含むが、これらに限定されない、正に荷電したアミノ酸残基のホモおよびヘテロオリゴマーを導入することによって上昇させ得る。
塩基度はまた、スペルミン、スペルミジン、ポリアミドアミンデンドリマーまたはポリアミン毒素およびそれらの誘導体などの、ポリアミンベースの部分への結合体化によっても上昇させ得る。
ｃ）グリコシル化
グリコシル化は、キシロース、グルコース、ガラクトース、マルトース、マルトトリオース、マンノース、ラクトース、メリビオースまたは同様の糖への結合体化によって導入することができる。
ｄ）ベクター
また、本明細書で開示される組成物を含むベクターを開示する。ＢＢＢを通過することができるベクターの一例は、Ｔｏｙｏｂｕｋｕら（Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００３ Ａｐｒ；３０５（１）：４０−７．）に見出される。
Ｃ．治療方法
中枢神経系に関わる特定疾患および障害を治療する方法、または血液脳関門を通過する化合物を必要とする適用を本明細書で開示する。様々な疾患および障害が本明細書で開示する方法および組成物によって治療でき、発作および関連虚血疾患、慢性背痛、脊髄損傷、末梢神経損傷、外傷性脳損傷、網膜変性、神経変性疾患、白内障、抗生物質誘導性中毒性難聴、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリグ病）、てんかん（全身、部分または難治性てんかんなど）、ハンチントン病、パーキンソン病、多発性硬化症、慢性背痛、線維筋痛、ヘルペス後神経痛、糖尿病性ニューロパシー、外傷性モノニューロパシー、複合性局所疼痛症候群、アジュバント鎮痛（ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎａｌｇｅｓｉｃ）、神経根切断／神経切除、切断前痛覚脱失／切断、てんかん原性／外傷、化学物質曝露、てんかん重積持続状態、化学療法誘発性ニューロパシー、癌、オピオイド離脱症状、および慢性神経因性疼痛が含まれる。投与の方法と経路、用量、および医薬組成物を以下でより詳細に論じる。
脊髄損傷および多発性硬化症を治療するための本明細書で開示する組成物の使用に関して、以下の参考文献は、これらの疾患の治療に関する教示に関してそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる：Ｈａｗｅｓ ＪＪ，Ｎａｒａｓｉｍｈａｉａｈ Ｒ，Ｐｉｃｃｉｏｔｔｏ ＭＲ，Ｇａｌａｎｉｎ ａｎｄ ｇａｌａｎｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｖｉａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００６ Ｊｕｎ；２３（１１）：２９３７−４６．Ｓｕａｒｅｚ Ｖら、Ｔｈｅ ａｘｏｔｏｍｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｇａｌａｎｉｎ ａｎｄ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｍｏｔｅ ａｘｏｎａｌ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ ｏｆ
ｐｒｉｍａｒｙ ａｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｄ ｃｒａｎｉａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００６ Ｓｅｐ；２４（６）：１５５５−６４。
本明細書で開示する組成物および方法はまた、例えば、無酸素性障害の予防、ヒトにおける成長ホルモン分泌の上昇、下垂体腺腫からのプロラクチン放出の制御、モルヒネ無痛の延長における抗うつ薬として、および摂食障害において有用であり得る。
また、本明細書で開示されるポリペプチドの有効量をその必要のある対象に投与することを含む、疼痛および他の神経障害を治療する方法を開示する。
本明細書で開示する方法および組成物はまた、上記で開示され、当業者に公知であるもののような、神経障害の予防、改善または治療において使用できる。
本明細書で開示する方法および組成物は、他の組成物または治療方法と共に使用できる。例えば以下の薬剤および薬剤のクラスは、疼痛、てんかん、神経保護、およびうつ病、双極性障害、他の精神障害のため、ならびに本明細書で開示する組成物によって治療可能な他の何らかの疾患または障害のために、本明細書で開示する組成物と組み合わせて使用することができる：オピオイドおよびオピオイドペプチド、モルヒネ、ヒドロキシモルヒネ、フェンタニル、オキシコドン、コデイン；カプサイシン；ならびにカルバマゼピン、プリミドン、ガバペンチン、プレガバリン、ジアゼパム、フェルバメート、フルオロフェルバメート、ラモトリギン、ラコサミド、レベチラセタム、フェノバルビタール、フェニトイン、フォスフェニトイン、トピラメート、バルプロエート、ビガバトリン、ゾニサミド、オキシカルバゼピン、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、局所麻酔薬（リドカインなど）、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ＮＭＤＡアンタゴニスト、αアドレナリン作用性受容体アゴニストおよびアンタゴニスト、アデノシン、カンナビノイド、ＮＫ−１アンタゴニスト（ＣＩ−１０２１）、抗うつ薬（例えばアミトリプチリン、デシプラミン、イミプラミン）、ガラニン、ソマトスタチン、デルタ睡眠誘発ペプチド、エンケファリン、オキシトシン、コレシストキニン、カルシトニン、コルチスタチン、ノシセプチンおよび他の神経ペプチドに基づく治療薬の類似体および誘導体、およびプルロニックＰ８５ブロックコポリマーを含むが、これらに限定されない、クラスとしての抗てんかん薬。
以下の薬剤および薬剤のクラスは、アルツハイマー病のために本明細書で開示する組成物と組み合わせて使用することができる：Ｆｌｕｒｉｚａｎなどのアミロイド低下剤；ガランタミン（Ｒａｚａｄｙｎｅ）；リバスチグミン（Ｅｘｅｌｏｎ）；ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ）；タクリン（Ｃｏｇｎｅｘ）；メマンチン（Ｎａｍｅｎｄａ）；およびアルツハイマー病のためのワクチン。また、対象の治療において使用する組成物を同定すること；組成物の親油性と塩基度を増大させることによって組成物を修飾すること；および修飾した組成物をその必要のある対象に投与することを含む、血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法を開示する。
「併用（組合せ）」とは、本明細書で開示する組成物に加えて、１以上の付加的な組成物を対象に投与できることを意味する。これらの組成物は
また、対象の治療において使用する組成物を同定すること；組成物の親油性、グリコシル化および塩基度を増大させることによって組成物を修飾すること；および修飾した組成物をその必要のある対象に投与することを含む、血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法を開示する。
また、対象の治療において使用する組成物を同定すること；組成物の親油性、グリコシル化および塩基度を増大させることによって組成物を修飾すること；修飾した組成物をベクターに挿入すること；およびその必要のある対象にベクターを投与することを含む、血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法を開示する。
また、対象の治療において使用する組成物を同定すること；組成物の親油性と塩基度を増大させることによって組成物を修飾すること；修飾した組成物をベクターに挿入すること；およびその必要のある対象にベクターを投与することを含む、血液脳関門を通過する組成物を必要とする対象を治療する方法を開示する。
１．組成物を研究ツールとして使用する方法
開示される組成物は、研究ツールとして様々な方法で使用することができる。例えば配列番号１−５５のような開示組成物は、例えばてんかんを検討するための試薬として使用できる。
組成物は、例えばガラニンアゴニストまたはアンタゴニストまたは部分アゴニストのような、所望機能特性を有する分子を単離するためにコンビナトリアル化学プロトコルまたは他のスクリーニングプロトコルにおける標的として使用できる。
組成物は、神経系における種々の神経ペプチド、他の神経伝達物質、受容体およびイオンチャネルの間での個別およびネットワーク相互作用を発見するために使用できる。例えば開示組成物は、ガラニン受容体アンタゴニストと、同じニューロン上で発現される分子標的に作用する薬剤との間の相乗的相互作用を発見するために使用できる。そのような正の薬剤−薬剤相互作用は、２つの薬剤を組み合わせて適用したとき治療の効果および／または安全性を改善し得るので、有益である。
開示組成物は、マイクロアレイにおける試薬としてまたは既存のマイクロアレイをプローブするまたは分析するための試薬として本明細書で論じるように使用することができる。開示組成物は、一塩基多型を単離するまたは同定するために任意の公知の方法において使用できる。組成物はまた、チップ／マイクロアレイに関連する、スクリーニングアッセイの任意の公知の方法においても使用できる。組成物はまた、例えば関連性を検討するためまたは開示組成物に関連する分子モデリング解析を実施するために、開示組成物のコンピュータ読み取り可能な実施形態を使用する任意の公知の方法で使用することができる。
２．遺伝子修飾および遺伝子破壊の方法
開示される組成物および方法は、標的遺伝子破壊および修飾のために、これらの事象を受けることができる任意の動物において使用できる。例えばガラニンを生産する遺伝子を、血液脳関門の高い透過性を有するガラニン類似体を発現するように変化させることができる。遺伝子修飾および遺伝子破壊は、哺乳動物などの動物における、修飾が哺乳動物の生殖細胞系を通して伝播する方法での、遺伝子または一続きの染色体の選択的除去または変化を取り巻く方法、手法および組成物を指す。一般に、細胞は、例えば本明細書で述べるような、その細胞内に含まれる特定染色体の領域と相同的に組み変わるように設計されたベクターで形質転換される。この相同的組換え事象は、周囲のＤＮＡと共に、例えばインフレームで導入された外来性ＤＮＡを有する染色体を生産することができる。この種のプロトコルは、点突然変異などの非常に特異的な突然変異が、細胞内に含まれるゲノムに導入されることを可能にする。この種の相同的組換えを実施するための方法は本明細書で開示される。
哺乳動物細胞において相同的組換えを実施することの好ましい特徴の１つは、所望の組換え事象が低い頻度で起こるので、細胞が培養され得るはずであることである。
ひとたび本明細書で述べる方法を通して細胞が生産されれば、幹細胞技術またはクローニング技術のいずれかを通してこの細胞から動物を生産することができる。例えば核酸がその中にトランスフェクトされた細胞が生物についての幹細胞である場合、この細胞は、トランスフェクションと培養後に、生殖系細胞内に遺伝子修飾または破壊を含む生物を生産するために使用でき、その生物は次に、その細胞全部に遺伝子修飾または破壊を有するもう１つ別の動物を生産するために使用できる。その細胞全部に遺伝子修飾または破壊を含む動物の生産のための他の方法では、クローニング技術が使用できる。これらの技術は一般に、トランスフェクトした細胞の核を取り、融合または置換のいずれかを通して、トランスフェクトした核を、その後動物を生産するように操作することができる卵母細胞と融合する。ＥＳテクノロジーの代わりにクローニングを使用する手順の利点は、ＥＳ細胞以外の細胞をトランスフェクトできることである。例えば、培養が非常に容易である線維芽細胞を、トランスフェクトして、遺伝子修飾または破壊事象を生じさせる細胞として使用することができ、その後この細胞由来の細胞を、動物全体をクローニングするために使用できる。
Ｄ．組成物
開示化合物を調製するために使用される成分ならびに組成物自体および本明細書で開示する方法において使用される成分を開示する。これらや他の材料が本明細書で開示されるが、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群等が開示されるとき、これらの化合物のありとあらゆる個別および集合的組合せ、ならびに順列への具体的な言及は明白に開示されないことがあり得るが、各々は本明細書で明確に考慮され、記述されることが了解される。例えば特定ガラニン類似体が開示され、論じられ、変異体を含む多くの分子に対して行い得る多くの修飾が論じられる場合、明確に異なる指示がない限り、ガラニン類似体のありとあらゆる組合せと順列および可能な修飾が明確に考慮される。それ故、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスならびに分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスおよび組合せ分子の一例であるＡ−Ｄが開示される場合、各々が個別に列挙されていない場合でも、各々が個別に及び集合的に考慮され、意図される組合せ、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆが開示されるとみなされる。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも開示される。それ故、例えばＡ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅのサブグループが開示されるとみなされる。この概念は、開示組成物を作製し、使用する方法における工程を含むが、これらに限定されない、本出願の全ての態様に適用される。それ故、実施できる様々な付加的工程が存在する場合、これらの付加的工程の各々が、開示される方法の任意の特定実施形態または実施形態の組合せと共に実施され得ることが了解される。
１．血液脳関門の透過性に関連する組成物
自発てんかん発作は、主として海馬に位置する過剰興奮性ニューロンの過剰発射から生じる。脳は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を用いる抑制機構とグルタミン酸によって媒介される興奮機構のバランスをとることによって発作を制御する（Ｗａｓｔｅｒｌａｉｎら、２００２）。神経伝達は、神経ペプチドＹ、ガラニン、ノシセプチン／オルファニンＦＱおよびエンドモルフィン−１を含む、多くの内因性神経ペプチドによって調節される。図１は、自立てんかん重積持続状態の海馬の神経回路におけるグルタミン酸、ＧＡＢＡおよび神経ペプチドの間の考えられる関係を示す。
これらの神経ペプチドの役割は、薬理的および遺伝的（ノックアウトまたは過剰発現）アプローチの両方を用いて解明された。例えばＯｂｅｒｔｏと共同研究者たち（Ｏｂｅｒｔｏら、２００１）は、扁桃におけるＧＡＢＡ作動系、神経ペプチドＹおよび神経ペプチドＹ（１）受容体の間の相互作用を特性決定するためにトランスジェニックマウスを使用した（Ｅｖａら、２００４）においても総説されている）。同様に、Ｌｅｒｅｓｃｈｅと共同研究者たち（Ｌｅｒｅｓｃｈｅら、２０００）は、ソマトスタチンがシナプス前機構によってＧＡＢＡ媒介性神経伝達を阻害することを示した。海馬におけるガラニンによるグルタミン酸放出の調節は、２つのトランスジェニックマウスモデル：ガラニンのノックアウト（ＧａｌＫＯ）および過剰発現（ＧａｌＯＥ）マウスで検討された（Ｍａｚａｒａｔｉら、２０００）。ＧａｌＫＯおよびＧａｌＯＥマウスにおいて、脱分極誘導性グルタミン酸放出は、中枢投与されたガラニンによってそれぞれ上昇および低下し、グルタミン酸作動系を通した抗痙攣薬としての海馬ガラニンの役割を指示した（Ｍａｚａｒａｔｉ，２００４）。
少なくとも３つの神経ペプチド：ガラニン、ソマトスタチンおよび神経ペプチドＹ、およびそれらの受容体が、てんかん誘発において役割を果たすことが示された。海馬におけるガラニンの免疫反応性は、辺縁系てんかん重積状態後に低下する。海馬歯状回門へのガラニンの注入は、辺縁系てんかん重積状態の発症を予防し、てんかん重積持続状態を停止させた。それ故、ガラニンはてんかん重積持続状態を抑制する内因性抗痙攣薬として働くと思われる（Ｍａｚａｒａｔｉら、１９９８）。このことの証拠は、ガラニンの過剰発現を有するトランスジェニックマウスの表現型を分析することによって示された（Ｋｏｋａｉａら、２００１）。この試験において、ガラニンはキンドリングてんかん誘発を抑制した。
神経伝達物質放出および発作抑制を調節する上での神経ペプチドの役割は、新しい治療処置のための可能性として認識されてきた。以下で述べるように、公表された多くの試験が動物モデルにおいて神経ペプチドの強力な抗痙攣活性を示した。
ａ）神経ペプチドＹおよびジノルフィン
神経ペプチドＹはインビトロでラット海馬切片におけるてんかん様活性を抑制した（ＫｌａｐｓｔｅｉｎとＣｏｌｍｅｒｓ，１９９７）。別の試験では（Ｂａｒａｂａｎら、１９９７）、神経ペプチドＹを欠くマウスは、カイニン酸に応答して制御不能の発作を生じた。さらに、ノックアウトマウスの９３％が死亡へと進行したのに対し、野生型動物では死亡はまれであった。脳室内神経ペプチドＹは、カイニン酸投与によって誘導された死亡を予防した。最後に、神経ペプチドＹの抗痙攣作用はＹ５受容体を通して媒介されることが明らかにされた（ＳｐｅｒｋとＨｅｒｚｏｇ、１９９７）。
ジノルフィンを含む海馬オピオイドペプチドは、てんかん原性およびてんかん発作に関係づけられてきた（（Ｈｏｎｇ，１９９２）および（ＳｏｌｂｒｉｇとＫｏｏｂ，２００４）によって総説されている）。電気痙攣ショックまたは扁桃キンドリングによって誘発された発作は、エンケファリンとジノルフィンの両方の初期放出を生じさせたが、同時にジノルフィンの長期的な減少を引き起こした（Ｇａｌｌ，１９８８）。ジノルフィンの抗痙攣活性は、図５に例示するように、自立てんかん重積持続状態のラットモデルにおいて示された（ＭａｚａｒａｔｉとＷａｓｔｅｒｌａｉｎ、２００２）。
ジノルフィンと同様に、神経ペプチドＹの海馬内注入も、自立てんかん重積持続状態モデルにおいて発作の分布を低減した（ＭａｚａｒａｔｉとＷａｓｔｅｒｌａｉｎ、２００２）。側脳室に投与したＮＰＹは、カイニン酸誘発性発作の強力な阻害剤であると思われた（Ｗｏｌｄｂｙｅら、１９９７）。抗てんかん作用は神経ペプチドＹ５受容体によって媒介されると示唆されており、これは、Ｙ５Ｒ欠損マウスに関する試験において確認された所見である（Ｍａｒｓｈら、１９９９）。
ｂ）ガラニンとその類似体
ガラニンは、Ｍａｚａｒａｔｉと共同研究者たちの研究（Ｍａｚａｒａｔｉら、１９９２）以来、潜在的抗痙攣薬として認識されてきた。側脳室または海馬に直接注入したとき、ガラニンはラットにおいてピクロトキシン誘発性キンドリング痙攣の重症度を低下させた。てんかん重積持続状態の動物モデルにおいて、貫通枝刺激（ＰＰＳ）前または刺激後のガラニンの門周囲注入は発作の期間を短縮した（Ｍａｚａｒａｔｉら、１９９８）。これらの作用はガラニンアンタゴニストの同時適用によって逆転された。図２に例示するように、５０−５００ピコモルという低い用量が、確立されたてんかん重積持続状態（ＳＳＳＥ）を停止させるのに有効であった。
てんかんを治療するための１つの戦略は、神経ペプチドに基づく治療薬を使用することである。概念実証として、２つの非ペプチド性ガラニン受容体アゴニスト、ガルノン（ｇａｌｎｏｎ）とガルミック（ｇａｌｍｉｃ）は、抗痙攣および抗てんかん活性を有することが最近示された（それぞれ（Ｓａａｒら、２００２）および（Ｂａｒｔｆａｉら、２００４））。両方の化合物が、ＧａｌＲ１またはＧａｌＲ２受容体に対して中等度のマイクロモル親和性を有すると思われ、全身投与したとき、てんかんの動物モデルにおいて抗痙攣活性を示した。図３に示すように、ガルノン（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）またはガラニン（０．５ｎｍｏｌ、ｉ．ｃ．ｖ．）は、マウスでのペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）誘発試験において潜伏期間および発作スコアの両方に同等の作用を及ぼした（Ｓａａｒら、２００２；Ｃｅｉｄｅら、２００４）。
以下は、ガラニン受容体に対するＮＡＸ−５０５５（ＧＡＬ−ＢＢＢ２）の親和性を示す表である：
Figure 2016074713
 ｉ．ｐ．注入したとき、ガラニンは、マウスにおいてペンチレンテトラゾール誘発性発作についての重症度を低減し、潜伏期間を上昇させることが認められた。ガラニンの海馬内注入はまた、自立てんかん重積持続状態の期間を短縮することが明らかにされた。同様に、ガルミックは、ｉ．ｈ．またはｉ．ｐ．注入したときてんかん重積持続状態をブロックした。それ故、これら２つのガラニンアゴニストは有用な抗痙攣薬であり、ガラニン受容体をてんかんのための治療標的として確認する。
ガラニンは３０アミノ酸の神経ペプチドであるが、ＳＡＲ試験は、Ｎ末端部分が全長ペプチドと比較してまだ極めて強力なアゴニストであると同定した（ＬａｎｇｅｌとＢａｒｔｆａｉ、１９９８）。以下に示すように、Ｇｌｙ１残基がＮ−メチル−Ｇｌｙ（サルコシン、ＳＡＲ）によって置換されている、ガラニン（１−１６）類似体は、本明細書で開示する方法と共に使用することができる：
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
１１ １２ １３ １４ １５ １６
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｇｌｙ１のＮ−メチル化は、ペプチドをＮ末端からの急速なタンパク質分解から保護したが、ガラニン受容体に対するその親和性を有意に変化させなかった（Ｒｉｖｅｒａ Ｂａｅｚａら、１９９４）。ＳＡＲ試験は、以下の残基を生物活性のために重要であると同定した：Ｇｌｙ１、Ｔｒｐ２、Ａｓｎ５、Ｔｙｒ９およびＧｌｙ１２（Ｌａｎｄら、１９９１）。同じ試験は、Ｎ末端伸長が生物活性の喪失を引き起こすことを同定した。他方で、ガラニン（１−１６）のＣ末端部分は、より大きな構造に連結されているとき非常に堅固であると思われる（Ｐｏｏｇａら、１９９８）。それ故、［Ｓａｒ１］ガラニン類似体の設計のための戦略は、アミノ酸置換に関してのみソマトスタチンで使用される戦略と同様であるが、Ｎ末端ではなくＣ末端に伸長を導入することにおいて異なる。
ガラニン類似体、ＧＡＬ−ＢＢＢ２（配列番号３）は、ｉ．ｐ．投与したとき強力な抗痙攣活性（ＥＤ５０ 〜３ｍｇ／ｋｇ）を示した（実施例２）。最も強力で持続的な抗痙攣活性を有する最小ガラニン類似体は、ＧＡＬ−ＢＢＢ２から得ることができる。これらの配列の例は、配列番号４−２９に見出すことができる（実施例２で詳細に述べる）。これらのペプチドは、例えばガラニンと比較したとき、高い安定性を有し得る。また、ガラニン類似体ＧＡＬ−ＢＢＢ３、ＧＡＬ−ＢＢＢ４、ＧＡＬ−ＢＢＢ５、ＧＡＬ−ＢＢＢ６、ＧＡＬ−ＢＢＢ７およびＧＡＬ−ＢＢＢ８（配列番号４９−５４）も開示する。これらの各々も抗痙攣活性を有し得る。
全身投与したとき抗痙攣活性を維持するＧＡＬ−ＢＢＢ２類似体の最小フラグメントを同定するために限定構造−機能関係試験を実施する。Ｃ末端および中心トランケーションのいずれかを含むガラニン類似体を合成し、試験する。加えて、血液脳関門を通る類似体の透過性を最適化するためにＣ末端モチーフの限定構造−機能関係試験を実施する。図１４は、構造−機能試験に関連してＧＡＬ−ＢＢＢ２の構造を例示する。
様々なガラニン類似体およびそれらの設計と合成のための方法を以下で論じる（実施例１および２参照）。
ｃ）ソマトスタチン
脳ソマトスタチンが発作およびてんかん原性の阻害剤として重要な役割を果たすことを示す多くの証拠がある（ＶｅｚｚａｎｉとＨｏｙｅｒ、１９９９）。ソマトスタチンは、海馬のＧＡＢＡ作動性介在ニューロンにおいて発現される主要神経ペプチドである。さらに、ラット海馬ニューロンからのソマトスタチン放出はグルタミン酸によって刺激された（Ｆｏｎｔａｎａら、１９９６）。ソマトスタチンおよびその受容体の発現はてんかん発作後有意に変化し、この神経ペプチドはまた、てんかん誘発の間の神経興奮性を制御すると主張されてきた（（Ｓｃｈｗａｒｚｅｒら、１９９６）および（ＶｅｚｚａｎｉとＨｏｙｅｒ、１９９９）において総説されている）。受容体サブタイプノックアウトおよび薬理学的試験は、少なくとも４つのサブタイプのソマトスタチン受容体（ｓｓｔ１、ｓｓｔ２、ｓｓｔ３およびｓｓｔ４）の、海馬におけるグルタミン酸媒介性神経伝達への関与を示唆した（Ｐｉｋｗｏら、１９９６）。Ｃｓａｂａと共同研究者たちの最近の試験は（Ｃｓａｂａら、２００４）、ソマトスタチンｓｓｔ２Ａ受容体がてんかん原性および抗痙攣活性において鍵となる役割を果たし得ることのさらなる証拠を提供した。
ソマトスタチンの抗痙攣活性の最も直接的な証拠は、動物てんかんモデルにおいて発作およびてんかん原性へのその薬理的作用を検討することから生じる（Ｖｅｚｚａｎｉら、１９９１；Ｐｅｒｅｚら、１９９５；ＭａｚａｒａｔｉとＷａｓｔｅｒｌａｉｎ、２００２）（ＭａｚａｒａｔｉとＷａｓｔｅｒｌａｉｎ、２００２）。ソマトスタチンまたはそのサブタイプ選択的類似体の注入は、発作の回数の減少を生じさせ、カイニン酸またはキノロン酸によって誘発される発作までの潜伏期間を延長させた（Ｖｅｚｚａｎｉら、１９９１）。同様に、ソマトスタチンｓｓｔ２選択的アゴニストであるＲＣ−１６０の注入は、ペンチレンテトラゾール誘発性強直−間代発作を有する動物の数を減少させた（Ｐｅｒｅｚら、１９９５）。図４に例示するように、ソマトスタチンの海馬内注入（ｉ．ｈ．）は、自立てんかん重積持続状態のラットモデルにおいて発作の分布を劇的に低下させた（ＭａｚａｒａｔｉとＷａｓｔｅｒｌａｉｎ、２００２）。
ソマトスタチンは、１９７３年に最初に発見された（Ｂｒａｚｅａｕら、１９７３）、１個のジスルフィド架橋を有する１４アミノ酸の視床下部ペプチドである。ソマトスタチンの配列を以下に示す：
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ １１ １２ １３ １４
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ
広汎なＳＡＲ試験は、５個の鍵となる残基：Ｐｈｅ６、Ｐｈｅ７、Ｔｒｐ８、Ｌｙｓ９およびＰｈｅ１１を同定したが、Ｇｌｙ２、Ｌｙｓ４、Ａｓｎ５、Ｔｈｒ１０、Ｔｈｒ１２またはＳｅｒ１３のアラニン置換は生物活性に有意の影響を及ぼさなかった（Ｖａｌｅら、１９７５）。加えて、Ｄ−Ｔｒｐ８含有類似体は、タンパク質分解に対するより大きな抵抗性および／または活性立体配座のより良好な安定化の故に、より強力であることが示された。
［Ｄ−Ｔｒｐ８］または［Ｌ−Ｔｒｐ８］ソマトスタチンは、代謝的に安定な類似体として本明細書で開示する方法と共に使用できる。塩基度を増大させるために、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＡｓｎ残基を、等電子配置的に類似するが、正に荷電したＤＡＢ（ジアミノ酪酸）またはＤＡＰ（ジアミノプロピオン酸）残基で体系的に置換することができる。親油性を上昇させるために、Ｌｙｓ−パルミトイル部分をＬｙｓ４またはＡｓｎ５の代わりに導入することができ、および／またはＰｈｅ残基をハロゲン化均等物、クロロ−Ｐｈｅ残基で置換することができる。表５に要約するように、９個の類似体を合成し、ソマトスタチン受容体へのそれらの親和性に関して検定する。高親和性結合に負の影響を及ぼさない修飾を組み合わせる。これらの第２世代類似体は２−４の組合せ修飾を含む。これらの配列は、配列番号３１−３６に示されている。
次に、［Ｄ−Ｔｒｐ８］または［Ｌ−Ｔｒｐ８］ソマトスタチンにＮ末端伸長を導入する。これらの伸長（図８に示すような、ＢＢＢ／ＰＫ調節剤）は、２つの目的に役立つ：（１）受動および能動機構の両方によって血液脳関門を通る透過性を改善すること、および（２）クリアランスを低減し、タンパク質分解に対する抵抗性を改善する、かさの高い部分を付加することによって神経ペプチド薬の薬物動態特性を改善すること。そのような「ＢＢＢ／ＰＫ調節剤」は新しい概念であるので、伸長を構成する少数の構造モジュールのいくつかの組合せを使用する。表６は、提案されるモジュールの構造と機能についての情報を提供する。
また、本明細書で開示する組成物および方法と共に使用するためのオクトレオチドを開示する。例えば配列番号４０はオクトレオチド分子を開示する。図２１は、オクトレオシドを工作するための化学構造と概要図を示す。オクトレオチドは、ｓｓｔ２サブタイプのソマトスタチン受容体に対してより選択的なソマトスタチン類似体である（５個の公知のサブタイプがある）。ソマトスタチンはてんかんおよびてんかん原性に関与することが示された。以下の参考文献は、オクトレオチド、ソマトスタチンおよびてんかんについての教示に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる：Ｖｅｚｚａｎｉ ＡとＨｏｙｅｒ Ｄ，Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１９９９，ｖｏｌ １１，ｐｐ３７６７−３７７６。同様に、侵害受容におけるソマトスタチンの役割は、ソマトスタチン、オクトレオチドおよび侵害受容についての教示に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｐｍａｎ ＶとＤｉｃｊｋｅｎｓｏｎ ＡＨ，Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ １９９２，ｖｏｌ ２３，１４７−１５２において示された。アルツハイマー病の発症におけるソマトスタチンの役割が最近記述された（オクトレオチド、ソマトスタチンおよびアルツハイマー病についての教示に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｉｔｏ Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００５，ｖｏｌ １１，ｐ．４３４−４３９）。ソマトスタチン類似体を設計し、合成するための方法を以下で論じる（実施例１参照）。
ｄ）デルタ睡眠誘発ペプチド
デルタ睡眠誘発ペプチド（ＤＳＩＰ）は抗痙攣性神経ペプチドである（Ｓｃｈｏｅｎｅｎｂｅｒｇｅｒ １９８４；ＫｏｖａｌｚｏｎとＳｔｒｅｋａｌｏｖａ ２００６）。ＤＳＩＰは、μオピオイドアゴニスト、デルモルフィンとある程度の構造類似性を共有する。ＤＳＩＰは、メタフィット（ｍｅｔａｐｈｉｔ）誘発性てんかんモデルにおいて発作を抑制する上で有効であった。さらに、ＤＳＩＰは同じてんかんモデルでバルプロ酸塩の抗痙攣活性を増強することが示された（Ｈｒｎｃｉｃ，Ｓｔａｎｏｊｌｏｖｉｃら、２００６）。加えて、このペプチドは、オピオイド受容体とエンケファリンの間の相互作用を調節し、ＤＳＩＰの鎮痛作用を生じさせることが示された（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｎａｋａｓｈｉｍａら、１９８６）。ＤＳＩＰの神経保護作用は毒性脳水腫のモデルにおいて示された。ＤＳＩＰおよびいくつかの類似体は、ＢＢＢを透過することが報告された（Ｋａｓｔｉｎ，Ｎｉｓｓｅｎら、１９８１；Ｋａｓｔｉｎ，Ｂａｎｋｓら、１９８２）。
２．血液脳関門の高い透過性を有する組成物
本明細書で開示する組成物は血液脳関門の高い透過性を示した。本明細書で述べるように、それぞれの受容体に高親和性で結合する能力を試験するために設計し、合成する神経ペプチド類似体のセットを開示する。このセットは、神経ペプチドごとに、約１０個の類似体を含む。高親和性類似体は、血液脳関門を透過するそれらの能力に関してさらに試験する。第１世代類似体からの結果をうけて、第２世代、その後第３世代類似体の合成と評価を行う。最も有望な類似体を、機能アッセイにおいてそれらのアゴニスト活性を確認するために選択する（血液脳関門の高い透過性を有する高親和性リガンド）。これらの類似体のサブセット（血液脳関門の高い透過性を有する強力なアゴニスト）を、次に、インビボで薬理学的に試験する。
薬剤となるためには、神経ペプチド類似体は、（１）高い効力と選択性、（２）代謝安定性、（３）比較的長い半減期と全身循環からの低いクリアランス、および（４）血液脳関門の高い透過性を含む、いくつかの重要な特徴を有するべきである。大部分の神経ペプチドは高い効力と選択性を示す。代謝安定性は、しばしば、ペプチド骨格の修飾および／またはタンパク質分解酵素によって認識されない残基による感受性残基の置換によって導入される。半減期の上昇と排泄速度の低下は、ポリマーベースの部分をペプチドに結合体化すること（例えばＰＥＧ化）によって効率的に達成され得る。血液脳関門のより大きな透過性は、親油性またはカチオン化の上昇によって、ならびにプロドラッグ、栄養素輸送体ミメティックまたはグリコシル化を付加することによって導入され得る。理想的な薬剤神経ペプチドの構造を図８に図式的に示す。
図８に例示するように、神経ペプチド工作における新しい概念は「ＢＢＢ／ＰＫ調節剤」である。ＢＢＢ／ＰＫ調節剤は、親油性、カチオン性および輸送体ミメティックモジュールを備えたポリマーベースのかさの高い部分を含む；この調節剤は、血液脳関門の透過性の上昇および薬物動態特性の改善という２つの目的に役立つ。カチオン性および親油性モジュールは、それぞれ、負に荷電した膜表面との相互作用を促進し、膜を通しての拡散を改善する。能動輸送体ミメティック構造の機能は、脳内皮細胞の表面に位置する特異的栄養素輸送体との相互作用を増強することによって脳への神経ペプチド取込みの特異性を高めることである。これらのモジュール全てを含む構造フレームワークはまた、ペプチドの薬物動態特性を改善することができ、一般的に使用されるＰＥＧ部分の役割を模倣／置換する。これらのかさの高い部分をモデル神経ペプチドのＮまたはＣ末端伸長として試験し、神経ペプチド構造内のより多用途の結合位置も本明細書で開示する。
高い血液脳関門透過性を有する神経ペプチド類似体を設計するために以下の戦略を使用した：使用可能な場合は、代謝的に安定な類似体から出発する。側鎖置換に適する類似体内の付加的なアミノ酸位置を特定する。かさの高い部分の導入に適するＮおよびＣ末端の位置を特定する。側鎖置換によって類似体の親油性と塩基度を増大させる。薬物動態特性を改善しつつ（ＢＢＢ／ＰＫ調節剤）、その親油性と塩基度をさらに上昇させる伸長をペプチド類似体に導入する。血液脳関門透過の特異性を改善するために伸長部分に栄養素ミメティック構造を含める。側鎖修飾を有する類似体を伸長部分（ＢＢＢ／ＰＫ調節剤）と組み合わせる。
そのような類似体を成功裏に設計するための鍵は、上記修飾の正しい組合せである。この目標を達成するために、修飾の個々のセットとそれらの最適の組合せを設計し、評価する体系的なアプローチを取ることができる。一般的な戦略を図１０に図式的に示す。本明細書で開示するアミノ酸の修飾は、自動ペプチドシンセサイザーを使用した固相ペプチド合成の間に導入できる。全ての非天然アミノ酸または複合構造は、市販のＦｍｏｃ保護された誘導体である。
変異体に言及するとき、変異体は、表わされる特定置換に依存して特定の性質を表わすが、特定して表わされる位置以外の位置での他の置換、欠失および／または挿入、例えば保存的置換、挿入および／または欠失も、その変異体が開示される活性を保持することを条件として、考慮されることが了解される。
血液脳関門の高い透過性などの、望ましい性質を有するガラニンの類似体を開示する。また、血液脳関門の高い透過性を有するソマトスタチンの類似体を開示する。上記で定義されるように、「上昇させる」または「高い」とは、野生型、非変化形態または天然ペプチドと比較して、あるいは対照組成物と比較して、より高いパーセンテージの組成物が血液脳関門を通過できることを意味する。例えば上昇の割合は、対照、天然または野生型ペプチドまたは組成物と比較したとき、
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 パーセントであり得る。
実施例において表の中で取り上げる各々個々の類似体はまた、開示される組成物の活性から測定できる塩基透過性を有することも了解される。高い活性のこれらのパーセンテージは、異なる指示がない限り、アッセイの分析範囲内のデータを提供するいずれかの時点で得られた野生型、天然または対照ペプチドの塩基透過性から算定できることが了解される。
実施例１および２で開示するように、公知のまたは野生型のペプチドに対する置換、欠失、修飾、付加および伸長を開示する。例えば表７では、ソマトスタチンについてのＮ末端伸長を開示する。本明細書で開示する伸長は、天然、野生型または公知のペプチドに関して使用できるか、または公知のペプチドの類似体と組み合わせて使用できる。例えば公知のペプチドに側鎖修飾を実施し、その後本明細書で開示する伸長と組み合わせることができる。
また、置換または付加が非天然に生じる物質である、アミノ酸置換および付加を開示する。例は、サルコシン、ジアミノ酪酸（ＤＡＢ）、ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）、Ｌｙｓ−パルミトイル、クロロ−Ｐｈｅ、アミノヘキサン酸（ＡＨＸ）、ペルフルオロヘキサン酸（ＰｅｒＦＨＸ）、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸、およびオリゴ−Ｌｙｓ、ｔｅｒｔ−ロイシンを含むが、これらに限定されない。
さらに、非ペプチドスペーサーなどの、「骨格プロテーゼ」によるアミノ酸残基の置換を開示する。例は、アミノ吉草酸またはアミノヘキサン酸を含むが、これらに限定されない。これは、鍵となる残基の間のスペーシングに有意の変化を及ぼさずに分子全体のサイズの最小化を生じさせることができる。スペーサーは、例えば
Figure 2016074713
 または５０残基を置換し得る。
また、立体配座が変化したアミノ酸の変異型を本明細書で開示する。例えばＤ−Ｌｙｓ、Ｄ−ＴｒｐおよびＬ−Ｔｒｐを本明細書で開示する。
親配列（ガラニンまたはソマトスタチンなど）に少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性（例えば）を有する、ガラニンおよびソマトスタチンなどの公知の化合物の類似体を開示し、前記類似体は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５または少なくとも６の、本明細書で開示する置換、欠失、付加または伸長のいずれかを含む。
３．配列類似性
本明細書で論じるように、相同性および同一性という用語の使用は類似性と同じものを意味することが了解される。それ故、例えば相同性という語の使用が２つの非天然配列の間で用いられる場合、これは必ずしもこれら２つの配列の間の進化的関係を指示するのではなく、むしろそれらの核酸配列の間の類似性または関連性を考察していることが了解される。２つの進化的に関連する分子の間の相同性を決定するための方法の多くは、それらが進化的に関連するかどうかに関わりなく、配列類似性を測定するために何らかの２以上の核酸またはタンパク質に常套的に適用される。
一般に、本明細書で開示される遺伝子およびタンパク質の、何らかの公知の変異体および誘導体または生じ得る変異体および誘導体を定義するための１つの方法は、特定の公知配列に対する相同性の観点から変異体および誘導体を定義することを通して行われることが了解される。本明細書で開示する特定配列のこの同一性はまた、本文中の別の箇所でも論じられる。一般に、本明細書で開示する遺伝子およびタンパク質の変異体は、典型的には、提示される配列または天然配列に対して少なくとも約
Figure 2016074713
 または９９パーセントの相同性を有する。当業者は、いかにして２つのタンパク質または遺伝子などの核酸の相同性を決定するかを容易に理解する。例えば、相同性は、２つの配列を相同性がその最高レベルであるように整列した後に算定できる。
相同性を算定するもう１つの方法は、公開されているアルゴリズムによって実施できる。比較のための配列の最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって実施され得る。
同じ種類の相同性を、例えば、少なくとも核酸アラインメントに関連する資料について参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９に開示されているアルゴリズムによって、核酸に関して得ることができる。いずれの方法も典型的に使用でき、ある種の場合、これらの様々な方法の結果が異なり得ることは了解されるが、当業者は、これらの方法の少なくとも１つで同一性が認められれば、配列は提示された同一性を有すると称され、本明細書で開示されることを理解する。
例えば、本明細書で使用するとき、もう１つの配列に特定パーセントの同一性を有すると記述される配列は、上述した算定方法の１以上によって算定したとき、記述される相同性を有する配列を指す。例えば、第一配列がＺｕｋｅｒ算定法を用いて第二配列に８０％の相同性を有すると算定される場合、その他の算定法のいずれかによって算定したとき第一配列が第二配列に８０％の相同性を有さない場合でも、第一配列は、本明細書で定義されるように、第二配列に８０％の相同性を有する。もう１つの例として、第一配列がＺｕｋｅｒ算定法およびＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎの算定法の両方を用いて第二配列に８０％の相同性を有すると算定される場合、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎの算定法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈの測定法、Ｊａｅｇｅｒ算定法、またはその他の算定法のいずれかによって算定したとき、第一配列が第二配列に８０％の相同性を有さない場合でも、第一配列は、本明細書で定義されるように、第二配列に８０％の相同性を有する。さらにもう１つの例として、第一配列が、算定法の各々を用いて第二配列に８０％の相同性を有すると算定される場合（但し、実際には、異なる算定方法はしばしば異なる算定相同性パーセンテージを生じる）、第一配列は、本明細書で定義されるように、第二配列に８０％の相同性を有する。
４．核酸
様々なガラニンおよびソマトスタチン類似体などの、本明細書で開示する様々なペプチド分子が存在する。これらのペプチドベースの分子は、例えば配列番号１−５５をコードする核酸を含む、多くの核酸によってコードされ得、例えばベクターが細胞において発現されるとき、発現されるｍＲＮＡは、典型的にはＡ、Ｃ、ＧおよびＵで構成されることが了解される。
ａ）配列
例えばｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄ．ｇｏｖ．でアクセスできるＧｅｎｂａｎｋデータベースにおいて見出される、例えばガラニンに関連する様々な配列が存在する。これらの配列および他の配列は、それらの全体ならびにその中に含まれる個々のサブ配列に関して、参照により本明細書に組み込まれる。
配列番号３に示す１つの特定配列は、一例として、開示される組成物および方法を例示するために本明細書で使用される。この配列に関連する記述は、特に異なる指示がない限り、ガラニン類似体に関連するいかなる配列にも適用されることが了解される。当業者は、配列の不一致および相違をいかにして決定し、特定配列に関する組成物および方法を他の関連配列（すなわちガラニン類似体の配列）に合わせて調整するかを理解する。プライマーおよび／またはプローブは、任意のガラニン関連核酸配列のために、例えば本明細書で開示され、当技術分野で公知の情報を考慮して設計され得る。
５．細胞への組成物の送達（ベクター）
インビトロまたはインビボで、核酸またはペプチドを細胞に送達するために使用できる多くの組成物および方法がある。本明細書で開示するベクターは多様な方法で使用できる。一例では、本明細書で開示するベクターは、本明細書で開示するペプチドをコードする核酸を細胞および対象に送達するために使用できる。ベクターはまた、上記で論じたように、血液脳関門の通過を促進するためにペプチドと共に使用することができる。
ベクターに関する方法および組成物は、主として２つのクラス：ウイルスベースの送達システムと非ウイルスベースの送達システムに分類できる。例えば核酸およびペプチドは、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドなどの多くの直接送達システムを通して、あるいは細胞またはカチオンリポソームなどの担体中の遺伝物質の導入によって送達され得る。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、または電気穿孔およびＤＮＡの直接拡散などの物理的機械的方法を含む、トランスフェクションのための適切な手段は、例えばＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８（１９９１）によって述べられている。そのような方法は当技術分野において周知であり、本明細書で述べる組成物および方法の使用のために容易に適合させ得る。特定の場合には、それらの方法は、大型ＤＮＡ分子に関して特異的に機能するように修正される。さらに、これらの方法は、担体のターゲティング特性を使用することによって特定疾患および細胞集団を標的するために使用できる。血液脳関門を越えて組成物を送達することのさらなる改善のために、ＴＡＴタンパク質形質導入ドメインが使用できる（Ｄｉｅｔｚ ＧＰとＢａｈｒ Ｍ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００４，ｖｏｌ ２７，ｐ．８５−１３１）。
本明細書で使用するとき、プラスミドまたはウイルスベクターは、ガラニンおよびソマトスタチン類似体に関連するものなどの、開示される核酸またはペプチドを、分解することなく細胞に輸送する物質である。一部の実施形態では、送達システムはウイルスまたはレトロウイルスのいずれかに由来する。ウイルスベクターは、例えばアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経向性ウイルス、シンドビスおよび他のＲＮＡウイルスであり、ＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスを包含する。また、これらのウイルスをベクターとしての使用に適したものにするこれらのウイルスの性質を共有するウイルスファミリーも好ましい。レトロウイルスは、マウスマロネイ白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、およびベクターとしてのＭＭＬＶの望ましい性質を発現するレトロウイルスを含む。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも大きな遺伝的積載物、すなわちトランス遺伝子またはマーカー遺伝子を担持することができ、この理由から一般的に使用されるベクターである。しかし、それらは非増殖細胞においては有用でない。アデノウイルスベクターは比較的安定であり、取り扱いやすく、高い力価を有しており、エーロゾル製剤中で送達でき、非分裂細胞をトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは大型で、遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有しており、熱安定であって、室温で保存することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原によって惹起される宿主生物の免疫応答を抑制するように設計されたウイルスベクターである。このタイプの好ましいベクターは、インターロイキン８または１０についてのコード領域を担持する。
ウイルスベクターは、遺伝子を細胞に導入するための化学的または物理的方法よりも高い取扱い（ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ）能力を有し得る。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写産物、複製とキャプシド形成のために必要な逆方向末端反復配列、およびウイルスゲノムの転写と複製を制御するためのプロモーターを含む。ベクターとして工作されたとき、ウイルスは、典型的には初期遺伝子の１以上が除去され、除去されたウイルスＤＮＡの代わりに遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットが挿入される。このタイプの構築物は、約８ｋｂまでの外来性遺伝物質を担持し得る。除去された初期遺伝子の必要な機能は、典型的には初期遺伝子の遺伝子産物をトランスで発現するように設計された細胞系によって供給される。
（１）レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、いかなる型、サブファミリー、属または親和性も含む、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスファミリーに属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般に、参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ
ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（１９８５）によって記述されている。遺伝子治療のためにレトロウイルスベクターを使用するための方法の例は、その教示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；国際公開公報第ＷＯ９０／０２８０６号および同第ＷＯ８９／０７１３６号；およびＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３））に述べられている。
レトロウイルスは基本的に、核酸という積荷をその中に詰め込んだパッケージである。核酸積荷は、複製された娘分子がパッケージ外被内に効率よくパッケージされることを確実にする、パッケージングシグナルを担持する。パッケージングシグナルに加えて、複製および複製されたウイルスのパッケージングのためにシスで必要とされる多くの分子がある。典型的には、ウイルスゲノムは、タンパク質外被の作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む。標的細胞に導入されるべきであるのは、外来性ＤＮＡによって典型的に置換されるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的にはパッケージ外被への組込みのためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写単位の開始点を伝達する配列、逆転写のｔＲＮＡプライマーに結合するプライマー結合部位を含む、逆転写のために必要なエレメント、ＤＮＡ合成の間にＲＮＡ鎖のスイッチを誘導する末端反復配列、ＤＮＡ合成の２番目の鎖の合成のためのプライミング部位として機能する、プリンリッチ配列５’−３’ＬＴＲ、および宿主ゲノムに挿入するためにＤＮＡ状態のレトロウイルスの挿入を可能にするＬＴＲの末端近くの特異的配列を含む。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の除去は、約８ｋｂの外来性配列がウイルスゲノムに挿入され、逆転写されて、複製後に新しいレトロウイルス粒子にパッケージングされることを可能にする。この核酸の量は、各々の転写産物の大きさに依存して１個から多くの遺伝子までの送達のために十分である。挿入物中に他の遺伝子と共に陽性または陰性選択マーカーを含むことが好ましい。
大部分のレトロウイルスベクターでは複製機構およびパッケージングタンパク質が除去されているので（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）、ベクターは、典型的にはそれらをパッケージング細胞系に入れることによって作製される。パッケージング細胞系は、複製およびパッケージング機構を含むレトロウイルスでトランスフェクトまたは形質転換されているが、パッケージングシグナルを欠く細胞系である。選択ＤＮＡを担持するベクターをこれらの細胞系にトランスフェクトしたとき、ヘルパー細胞によってシスで提供される機構により、対象遺伝子を含むベクターは複製され、新しいレトロウイルス粒子にパッケージングされる。機構についてのゲノムは、必要なシグナルを持たないためパッケージングされない。
（２）アデノウイルスベクター
複製欠損アデノウイルスの構築が記述されている（Ｂｅｒｋｎｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｂｙ ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ”ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８６８−８７２（１９９３））。これらのウイルスをベクターとして使用することの利益は、それらが初期感染細胞内では複製できるが、新しい感染性ウイルス粒子を形成することができないので、他の細胞型に拡大し得る程度が限られていることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質および多くの他の組織部位への直接インビボ送達後、高い効率で遺伝子導入を達成することが示された（Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ５：１２８７−１２９１（１９９３）；およびＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、特定細胞表面受容体に結合することによって遺伝子導入を達成し、その後ウイルスは、野生型または複製欠損アデノウイルスと同じようにして、受容体媒介性エンドサイトーシスによってインターナリゼーションされる（ＣｈａｒｄｏｎｎｅｔとＤａｌｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０：４６２−４７７（１９７０）；ＢｒｏｗｎとＢｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２：３８６−３９６（１９７３）；ＳｖｅｎｓｓｏｎとＰｅｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍら、Ｃｅｌｌ ７３：３０９−３１９（１９９３））。
ウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されたアデノウイルスに基づくものであり得、これらのバイロンは、ヒト２９３細胞系などの細胞系統において作製される。もう１つの好ましい実施形態では、Ｅ１およびＥ３遺伝子の両方がアデノウイルスゲノムから除去される。
（３）アデノ関連ウイルスベクター
もう１つのタイプのウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠損パルボウイルスは、多くの細胞型に感染することができ、ヒトに対して非病原性であるため、好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは約４−５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは第１９染色体に安定に挿入されることが公知である。この部位特異的組込み特性を含むベクターは好ましい。このタイプのベクターの特に好ましい実施形態は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、および／またはグリーン蛍光タンパク質、ＧＦＰなどのマーカー遺伝子を含むことができる、Ａｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡによって生産されるＰ４．１Ｃベクターである。
もう１つのタイプのＡＡＶウイルスでは、ＡＡＶは、異種遺伝子に作動可能に連結された、細胞特異的発現を指令するプロモーターを含む少なくとも１つのカセットに隣接する一対の逆方向反復配列（ＩＴＲ）を含む。これに関して異種とは、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルスにとって天然ではない任意のヌクレオチド配列または遺伝子を指す。
典型的には、ＡＡＶおよびＢ１９コード領域が欠失されて、安全な非細胞傷害性ベクターを生じる。ＡＡＶ ＩＴＲまたはその修飾形態は感染性と部位特異的組込みを付与するが、細胞毒性を与えず、プロモーターは細胞特異的発現を指令する。米国特許第６，２６１，８３４号は、ＡＡＶベクターに関する資料について参照により本明細書に組み込まれる。
本発明のベクターは、それ故、実質的な毒性を伴わずに哺乳動物染色体に組み込むことができるＤＮＡ分子を提供する。
ウイルスおよびレトロウイルスにおける挿入遺伝子は通常、所望遺伝子産物の発現を制御するのを助けるプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に転写開始部位に対して比較的固定された位置にあるとき機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子の基本的相互作用のために必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
（４）大型積載ウイルスベクター
大型ヒトヘルペスウイルスの分子遺伝学的実験は、大きな異種ＤＮＡフラグメントをクローニングし、増殖させて、ヘルペスウイルスによる感染を許容する細胞において樹立できる手段を提供した（Ｓｕｎら、Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：３３−４１，１９９４；Ｃｏｔｔｅｒ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ５：６３３−６４４，１９９９）。これらの大型ＤＮＡウイルス（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン‐バーウイルス（ＥＢＶ））は、＞１５０ｋｂのヒト異種ＤＮＡの断片を特定細胞に送達する潜在的可能性を有する。ＥＢＶ組換え体は、ＤＮＡの大きな断片をエピソームＤＮＡとして感染Ｂ細胞内に維持することができる。３３０ｋｂまでのヒトゲノム挿入物を担持する個々のクローンは遺伝的に安定であると思われた。これらのエピソームの維持は、ＥＢＶによる感染の間構成的に発現される特異的ＥＢＶ核タンパク質、ＥＢＮＡ１を必要とする。加えて、これらのベクターはトランスフェクションのために使用でき、大量のタンパク質をインビトロで一過性に作製することができる。ヘルペスウイルスアンプリコンシステムも、＞２２０ｋｂのＤＮＡ断片をパッケージングし、ＤＮＡをエピソームとして安定に維持できる細胞に感染させるために使用される。
他の有用なシステムは、例えば複製型および宿主限定非複製型ワクシニアウイルスベクターを含む。
ｂ）非核酸ベースのシステム
ガラニン類似体をコードする核酸などの開示される組成物は、様々な方法で標的細胞に送達することができる。例えば組成物は、電気穿孔を通して、またはリポフェクションを通して、またはリン酸カルシウム沈殿法を通して送達され得る。選択される送達機構は、一部には、標的される細胞の型および送達が、例えばインビボまたはインビトロのいずれで起こるかに依存する。
それ故、組成物は、例えば開示される変異体またはベクターに加えて、陽イオン性リポソーム（例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）または陰イオン性リポソームなどのリポソームのような脂質を含み得る。リポソームは、所望する場合、特定細胞を標的することを促進するためのタンパク質をさらに含み得る。化合物および陽イオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的器官への求心性血液に投与され得るか、または気道の標的細胞に向けて気道内に吸入され得る。リポソームに関しては、例えばＢｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５−１００（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号参照。さらに、化合物は、マクロファージなどの特定細胞型に標的され得る、またはマイクロカプセルからの化合物の拡散または化合物の送達が特定速度または用量に合わせて設計される、マイクロカプセルの成分として投与され得る。
対象の細胞への外因性ＤＮＡの投与および取込みを含む上述した方法（すなわち遺伝子導入またはトランスフェクション）では、細胞への組成物の送達は様々な機構によって為され得る。一例として、送達は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などの市販のリポソーム製剤、ならびに当技術分野における標準的手順に従って開発された他のリポソームを使用して、リポソームによって行われ得る。加えて、本発明の核酸またはベクターは、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から入手可能な技術である電気穿孔法によって、ならびにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ機器（ＩｍａＲｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）によって、インビトロで送達され得る。
物質は、溶液、懸濁液中であり得る（例えばミクロ粒子、リポソームまたは細胞に組み込まれて）。これらは、抗体、受容体または受容体リガンドによって特定細胞型に標的され得る。以下の参考文献は、特定タンパク質を腫瘍組織に標的するためのこの技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５‐２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００‐７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚとＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０（１９９２）；およびＲｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５（１９９１））。これらの手法は様々な他の特定細胞型に関して使用できる。「ステルス」および他の抗体複合型リポソームなどのビヒクル（結腸癌への脂質媒介性薬剤ターゲティングを含む）、細胞特異的リガンドを通してのＤＮＡの受容体媒介性ターゲティング、リンパ球指定腫瘍ターゲティング、およびインビボでのマウスグリオーマ細胞の高度特異的な治療的レトロウイルスターゲティング。以下の参考文献は、特定タンパク質を腫瘍組織に標的するためのこの技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０（１９８９）；およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒとＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７（１９９２））。一般に、受容体は、構成的にまたはリガンド誘導的に、エンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体はクラスリン被覆小孔に集積し、クラスリン被覆小胞によって細胞に入り、受容体が選別される酸性エンドソームを通過して、その後細胞表面へと再循環されるか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソームにおいて分解される。インターナリゼーション経路は、栄養素の取込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子の清掃、ウイルスおよび毒素の日和見侵入、リガンドの解離と分解、および受容体レベルの調節などの様々な機能を果たす。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドのタイプ、リガンドの原子価およびリガンドの濃度に依存して、１以上の細胞内経路をたどる。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子および細胞機構が総説されている（ＢｒｏｗｎとＧｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
宿主細胞ゲノムに組み込まれることになる細胞に送達される核酸は、典型的には組込み配列を含む。これらの配列は、特にウイルスベースのシステムを使用するとき、しばしばウイルス関連配列である。これらのウイルス組込みシステムはまた、送達システムに含まれる核酸が宿主ゲノムに組み込まれ得るように、リポソームなどの非核酸ベースの送達システムを使用して送達される核酸に組み込むこともできる。
宿主ゲノムへの組込みのための他の一般的手法は、例えば宿主ゲノムとの相同的組換えを促進するように設計されたシステムを含む。これらのシステムは、典型的には、宿主細胞ゲノム内の標的配列と、ベクター核酸と標的核酸の間で組換えが起こるのに十分な相同性を有しており、送達された核酸の宿主ゲノム内への組込みを生じさせる、発現される核酸に隣接する配列に基づく。これらのシステムおよび相同的組換えを促進するために必要な方法は当業者に公知である。
ｃ）インビボ／エクスビボ
上述したように、組成物は医薬的に許容される担体中で投与され得、当技術分野で周知の様々な機構（例えば裸のＤＮＡの取込み、リポソーム融合、遺伝子銃によるＤＮＡの筋肉内注入、エンドサイトーシス等）によってインビボおよび／またはエクスビボで対象の細胞に送達され得る。
エクスビボ法を用いる場合は、細胞または組織を取り出し、当技術分野で周知の標準プロトコルに従って体外で維持することができる。組成物は、例えばリン酸カルシウムを介した遺伝子送達、電気穿孔、微量注入またはプロテオリポソームなどの遺伝子導入機構によって細胞に導入され得る。導入された細胞は、その後、細胞または組織型について標準的な方法によって対象に持続注入され得るか（例えば医薬的に許容される担体中で）または同位置にもどし移植され得る。対象への様々な細胞の移植または持続注入のための標準的な方法は公知である。
６．発現系
細胞に送達される核酸は、典型的には発現制御システムを含む。例えばウイルスおよびレトロウイルス内の挿入遺伝子は、所望遺伝子産物の発現を制御するのを助けるプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に転写開始部位に対して比較的固定された位置にあるとき機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子の基本的相互作用のために必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
ａ）ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞においてベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々なソースから、例えばポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えばβアクチンプロモーターから入手され得る。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点を同時に含むＳＶ４０制限フラグメントとして好都合に得られる（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして好都合に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ １８：３５５−３６０（１９８２））。言うまでもなく、宿主細胞または関連種からのプロモーターも本明細書で有用である。
エンハンサーは、一般に転写開始部位から固定されない距離で機能し、転写単位に対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））または３’側（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））であり得るＤＮＡの配列を指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ ３３：７２９（１９８３））ならびにコード配列自体の中に存在し得る（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））。それらは通常１０−３００ｂｐ長であり、シスで機能する。エンハンサーは、近接するプロモーターからの転写を上昇させるように機能する。エンハンサーはまた、転写の調節を媒介する応答エレメントをしばしば含む。プロモーターも、転写の調節を媒介する応答エレメントを含み得る。エンハンサーはしばしば遺伝子の発現の調節を決定する。多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子から現在公知であるが（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、−フェトプロテインおよびインスリン）、典型的には、一般的発現のためには真核細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶエンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能を誘発する光または特定化学事象によって特異的に活性化され得る。システムは、テトラサイクリン及びデキサメタゾンなどの試薬によって調節され得る。また、γ線照射などの放射線への曝露、またはアルキル化化学療法剤によってウイルスベクター遺伝子の発現を増強する方法もある。
ある実施形態では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、転写されるべき転写単位の領域の発現を最大化するための構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして働き得る。ある構築物では、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、それが特定時点で特定細胞型においてのみ発現される場合でも、全ての真核細胞型において活性であり得る。この種の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（完全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターＬＴＦである。
全ての特異的調節エレメントがクローニングでき、黒色腫細胞などの特定細胞型において選択的に発現される発現ベクターを構築するために使用できることが示された。グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターが、グリア起源の細胞において遺伝子を選択的に発現するために使用された。
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写の終結のために必要な配列を含み得る。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域はまた、転写終結部位を含む。転写単位はポリアデニル化領域を同時に含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、転写された単位がｍＲＮＡのようにプロセシングされ、輸送される可能性を高めることである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定と使用は広く確立されている。相同なポリアデニル化シグナルが導入遺伝子構築物において使用されることが好ましい。ある転写単位では、ポリアデニル化領域はＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基から成る。また、転写された単位は、他の標準配列を単独でまたは構築物からの発現または構築物の安定性を改善する上記配列と組み合わせて含むことが好ましい。
ｂ）マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達されたかどうか、およびひとたび送達されれば発現されているかどうかを判定するために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子、およびグリーン蛍光タンパク質である。
一部の実施形態では、マーカーは選択マーカーであり得る。哺乳動物細胞のための適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイドロマイシンおよびピューロマイシンである。そのような選択マーカーが哺乳動物宿主細胞に成功裏に導入されたとき、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合生存することができる。２つの広く使用される異なるカテゴリーの選択レジメンがある。最初のカテゴリーは、細胞の代謝および補足培地と無関係に増殖する能力を欠く突然変異型細胞系の使用に基づく。２つの例は、ＣＨＯ ＤＨＦＲ細胞とマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養素の添加なしでは増殖する能力を持たない。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路のために必要な特定の遺伝子を欠くので、かけているヌクレオチドが補足培地中で提供されない限り生存することができない。培地を補足することの代替策は、無傷ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠く細胞に導入し、それによって増殖必要条件を変化させることである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補足培地では生存することができない。
２番目のカテゴリーは、任意の細胞型で使用される選択スキームを指し、突然変異型細胞系の使用を必要としない優性選択である。これらのスキームは、典型的には宿主細胞の増殖を停止させる薬剤を使用する。新規遺伝子を有するそれらの細胞は、薬剤耐性を運搬するタンパク質を発現し、選択を生き延びる。そのような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．とＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．とＢｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ， Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３（１９８５））を使用する。３つの例は、それぞれ適切な薬剤Ｇ４１８またはネオマイシン（ゲネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはハイグロマイシンに対する耐性を運搬するために真核生物制御下で細菌遺伝子を用いる。その他には、ネオマイシン類似体Ｇ４１８およびピューロマイシンを含む。
７．ペプチド
ａ）タンパク質変異体
本明細書で論じるように、公知であり、本明細書で考慮されるペプチドの数多くの変異体が存在する。本明細書で開示される位置に関する開示機能性変異体および類似体に加えて、同じく所望されるように機能する、本明細書で開示するもの以外の位置の公知の天然に生じる機能性変異体がある。タンパク質変異体および誘導体は当業者に十分に理解されており、アミノ酸配列修飾または機能性フラグメントを含み得る。例えばアミノ酸配列修飾は、典型的には３つのクラス：置換変異体、挿入変異体または欠失変異体の１以上に属する。挿入は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合ならびに１個または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は通常、アミノまたはカルボキシル末端融合よりも小さな挿入であり、例えば約１−４残基である。実施例で述べるような免疫原性融合タンパク質誘導体は、インビトロでの架橋によってまたは融合物をコードするＤＮＡで形質転換された組換え細胞培養によって、免疫原性を与えるのに十分な大きさのポリペプチドを標的配列に融合することによって作製される。欠失は、タンパク質配列からの１以上のアミノ酸残基の除去によって特徴づけられる。典型的には、約２−６残基以下がタンパク質分子内のいずれか１つの部位で欠失される。これらの変異体は通常、タンパク質をコードするＤＮＡ内のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発によって作製され、それにより変異体をコードするＤＮＡを生産し、その後組換え細胞培養物において前記ＤＮＡを発現させる。公知の配列を有するＤＮＡ内のあらかじめ定められた部位で置換突然変異を生じさせるための手法は周知であり、例えばＭ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発がある。アミノ酸置換は、典型的には１個の残基であるが、多数の異なる位置で同時に起こり得る；挿入は通常約１−１０アミノ酸残基である；および欠失は約１−３０残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは隣接対で行われ、すなわち２個の残基の欠失または２個の残基の挿入である。置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組合せは、最終構築物に到達するように組み合わされ得る。突然変異は、配列を読み枠の外に置いてはならず、好ましくは二次ｍＲＮＡ構造を生じさせ得る相補的領域を創造しない。置換変異体は、少なくとも１個の残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されたものである。そのような置換は、一般に以下の表３および４に従って行われ、保存的置換と称される。
Figure 2016074713
Figure 2016074713
 表３におけるものより保存的でない置換を選択すること、すなわち（ａ）置換の領域内のポリペプチド骨格の構造、例えばシートまたはらせん状コンホメーション、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖のバルクを維持することへの作用においてより有意に異なる残基を選択することによって、機能または免疫学的同一性に実質的な変化を生じさせる。一般にタンパク質の性質に最も大きな変化を生じさせると予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリルまたはトレオニル残基を疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル残基に（または、によって）置換する；（ｂ）システインまたはプロリンを任意の他の残基に（または、によって）置換する；（ｃ）正電荷の側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニルまたはヒスチジル残基を、負電荷残基、例えばグルタミルまたはアスパルチル残基に（または、によって）置換する；または（ｄ）かさの高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンを、側鎖を有さない残基、例えばこの場合はグリシンに（または、によって）置換する；（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化のための部位の数を増やすことによる、置換である。
例えば１個のアミノ酸残基の、生物学的および／または化学的に類似するもう１つ別の残基による置換は、保存的置換として当業者に公知である。例えば保存的置換は、１個の疎水性残基を別の疎水性残基に、または１個の極性残基を別の極性残基に置き換えることである。置換は、例えばＧｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せを含む。各々明白に開示される配列のそのような保存的に置換された変異型は、本明細書で提供されるモザイクポリペプチドに包含される。
置換または欠失突然変異誘発は、Ｎ−グリコシル化（（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）のための部位を挿入するまたは無効にするために用いることができる。システインまたはメチオニン（例えば好中球による酸化剤の生成に起因する「好中球抵抗性」タンパク質において）あるいは他の不安定残基の欠失または置換も望ましいと考えられる。潜在的タンパク質分解部位、例えばＡｒｇの欠失または置換は、例えば塩基性残基の１個を欠失させるあるいは１個をグルタミニルまたはヒスチジル残基で置換することによって達成され得る。
ある種の翻訳後誘導体化は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、頻繁に、対応するグルタミルおよびアスパリル残基へと翻訳後脱アミド化される。あるいは、これらの残基は弱酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のε−アミノ基におけるアミンのメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｐｐ７９−８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、および一部の場合、Ｃ末端カルボキシルのアミド化を含む。
ジスルフィド結合は、２個のシステイン分子のチオール基の間の共有結合相互作用である。酸化反応を通して、水素原子がチオール基から除去され、ジスルフィド架橋の形成を可能にする；生じた結合システインはシスチンと称される。ジスルフィド結合は、クラスＩとクラスＩＩのカテゴリーに分類される。鎖内のシステインを連結することによってタンパク質の三次元構造を安定化する働きをするのは、クラスＩＩ結合である。クラスＩジスルフィド結合は、これらの相互作用が別の鎖の間で起こるときに生じる。クラスＩジスルフィド結合の形成は、受容体が適切な受容体−リガンド相互作用を提供するためにしばしば必要である重要な特徴、二量体タンパク質の形成を助けることができる。アミノ酸置換は、システイン残基が生じる部位で行われ得る；典型的には、保存的置換は、ジスルフィド結合に関与するシステイン残基を変化させない。そのような置換は、置換される残基がジスルフィド結合に関与する場合、タンパク質の折りたたみを変化させるまたは多量体相互作用を変化させる作用を及ぼし得る。いずれのシステインがジスルフィド結合に関与するかを決定することができる。
保存的突然変異および相同性の説明は、変異体が保存的突然変異である特定配列に少なくとも７０％の相同性を有する実施形態のような、いかなる組合せでも共に組み合わせ得ることが了解される。
本明細書は様々なタンパク質およびタンパク質配列を論じるので、それらのタンパク質配列をコードすることができる核酸も同時に開示されることが了解される。これは、特定タンパク質配列に関連する全ての縮重配列、すなわちある特定タンパク質配列をコードする配列を有する全ての核酸、ならびに前記タンパク質配列の開示される変異体および誘導体をコードする、縮重核酸を含む全ての核酸を包含する。それ故、各々の特定核酸配列は本明細書で書き出されないことがあり得るが、ありとあらゆる配列が開示されるタンパク質配列を通して事実上本明細書で開示され、記述されることが了解される。また、アミノ酸配列はいずれの特定ＤＮＡ配列が生物内でそのタンパク質をコードするかを指示しないが、開示されるタンパク質の特定変異体が本明細書で開示される場合、タンパク質が由来する特定生物においてそのタンパク質をコードする公知の核酸配列も公知であり、本明細書で開示され、記述されることが了解される。
また、開示されるタンパク質および変異体のフラグメントも開示される。典型的には、これらのフラグメントは、血液脳関門の高い透過性などの、本明細書で述べる機能の少なくとも１つを保持する。しかし、例えばこの活性を保持しないフラグメントは、例えば抗体を作製するために、まだ使用することができる。また、例えばガラニンによって保持される様々な異なる機能的活性が存在することが了解される。これらの活性は関連し得るが、必ずしも必要ではない。当業者は、例えば特定機能に寄与する領域を変化させることにより、いかにして開示される類似体の機能的ドメインを操作するかを理解する。特定機能部位が除去されたまたは変化した類似体を実施例１および２に開示する。
８．抗体
本明細書で開示される抗体は、所望機能を有する類似体を同定する上で有用であり得る。本明細書で使用するとき、「抗体」という用語は、任意のクラスの全長免疫グロブリン（すなわち無傷抗体）を含むが、これらに限定されない。天然抗体は通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖と２本の同一の重（Ｈ）鎖から成るヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、各々の軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、ジスルフィド結合の数は種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。各々の重鎖と軽鎖はまた、規則正しい間隔の鎖間ジスルフィド架橋を有する。各々の重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（Ｖ（Ｈ））を有し、多数の定常ドメインがそれに続く。各々の軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（Ｖ（Ｌ））を有し、他方の末端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列される。特定アミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変ドメインの間の界面を形成すると考えられる。任意の脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、κ（ｋ）およびλ（ｌ）と呼ばれる２つの明らかに異なるタイプの１つに割り当てられる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは種々のクラスに割り当てることができる。ヒト免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２に分類され得る。当業者は、マウスについての匹敵するクラスを認識する。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。
「可変」という用語は、本明細書では抗体間で配列が異なる可変ドメインの一定の部分を表わすために使用され、各々の特定抗体の、その特定抗原に対する結合および特異性に関して使用される。しかし、可変性は通常、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布するわけではない。典型的には、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方において相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中する。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々４つのＦＲ領域を含み、それらは主としてβシート構造をとり、それはループ接続を形成し、一部の場合にはβシート構造の部分を構成するを形成する、３つのＣＤＲによって結合される。各々の鎖内のＣＤＲはＦＲ領域によって極めて近接して保持され、他方の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ
Ｅ．Ａ．ら、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）参照）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性への抗体の関与のような、様々なエフェクター機能を示す。
本明細書で使用するとき、「抗体またはそのフラグメント」という用語は、二重または多重抗原またはエピトープ特異性を備える、キメラ抗体およびハイブリッド抗体、およびハイブリッドフラグメントを含む、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等のようなフラグメントを包含する。それ故、それらの特異性抗原に結合する能力を保持する抗体のフラグメントが提供される。例えば高い透過性を維持する抗体のフラグメントは、「抗体またはそのフラグメント」という用語の意味に含まれる。そのような抗体およびフラグメントは、当技術分野で公知の手法によって作製でき、抗体を作製し、特異性および活性に関して抗体をスクリーニングするための一般的方法において示される方法に従って、特異性および活性に関してスクリーニングすることができる（ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）参照）。
また、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，７０４，６９２号に述べられている抗体フラグメントと抗原結合タンパク質（一本鎖抗体）の複合体も、「抗体またはそのフラグメント」の意味に含まれる。
９．医薬担体／医薬品の送達
上述したように、ガラニン類似体などの組成物はまた、医薬的に許容される担体中でインビボ投与することができる。「医薬的に許容される」とは、生物学的にまたはそれ以外で有害ではない物質を意味し、すなわちその物質が、核酸またはベクターと共に、有害な生物学的作用を引き起こさずにまたはそれが含まれる医薬組成物のその他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用せずに、対象に投与し得ることを意味する。当業者に周知のように、担体は、当然ながら、有効成分の分解を最小限に抑えるようにおよび対象における有害な副作用を最小限に抑えるように選択される。
組成物は、経口的に、非経口的（例えば静脈内）に、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外的に、局所的に、等によって投与され得、局所鼻内投与または吸入剤による投与も使用できる。必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重および一般的状態、使用される特定核酸またはベクター、その投与様式等に依存して、対象ごとに異なる。それ故、あらゆる組成物について正確な量を規定することは不可能である。しかし、適切な量は、本明細書での教示を考慮して常套的な実験だけを用いて当業者によって決定され得る。
組成物の非経口投与は、使用する場合、一般に注射によって特徴づけられる。注射剤は、液体溶液または懸濁液として、注射の前に液体中に溶解または懸濁するのに適した固体形態、または乳剤として、従来の形態で製造され得る。非経口投与のための最近修正されたアプローチは、一定の用量が維持される徐放性または持続放出性システムの使用を含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６１０，７９５号参照。
物質は溶液中、懸濁液中（例えばミクロ粒子、リポソームまたは細胞に組み込まれて）であり得る。これらは、抗体、受容体または受容体リガンドによって特定細胞型に標的され得る。以下の参考文献は、特定タンパク質を腫瘍組織に標的するためのこの技術の使用の例である（Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３−９（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚとＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ． Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０（１９９２）；およびＲｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５（１９９１））。「ステルス」および他の抗体複合型リポソームなどのビヒクル（結腸癌への脂質媒介性薬剤ターゲティングを含む）、細胞特異的リガンドを通してのＤＮＡの受容体媒介性ターゲティング、リンパ球指定腫瘍ターゲティング、およびインビボでのマウスグリオーマ細胞の高度特異的な治療的レトロウイルスターゲティング。以下の参考文献は、特定タンパク質を腫瘍組織に標的するためのこの技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０（１９８９）；およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒとＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７（１９９２））。一般に、受容体は、構成的にまたはリガンド誘導的に、エンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体はクラスリン被覆小孔に集積し、クラスリン被覆小胞によって細胞に入り、受容体が選別される酸性エンドソームを通過して、その後細胞表面へと再循環されるか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソームにおいて分解される。インターナリゼーション経路は、栄養素の取込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子の清掃、ウイルスおよび毒素の日和見侵入、リガンドの解離と分解、および受容体レベルの調節などの様々な機能を果たす。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドのタイプ、リガンドの原子価およびリガンドの濃度に依存して、１以上の細胞内経路をたどる。受容体媒介性エンドサイトーシスの分子および細胞機構が総説されている（ＢｒｏｗｎとＧｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
ａ）医薬的に許容される担体
ガラニン類似体を含む組成物は、医薬的に許容される担体と組み合わせて治療的に使用することができる。
医薬担体は当業者に公知である。これらは、最も典型的には、無菌水、食塩水および生理的ｐＨの緩衝液などの溶液を含む、ヒトへの薬剤の投与のための標準担体である。組成物は筋肉内経路でまたは皮下的に投与され得る。他の化合物は、当業者によって使用される標準手順に従って投与される。
医薬組成物は、選択分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤等を含み得る。医薬組成物はまた、抗菌薬、抗炎症薬、麻酔薬等のような１以上の有効成分を含み得る。
医薬組成物は、局所的または全身的治療のいずれを所望するかおよび治療する面積に依存して、多くの方法で投与され得る。投与は、局所的（眼経路、膣経路、直腸経路、鼻内経路を含む）、経口的、吸入によって、または非経口的、例えば静脈内滴注、皮下、腹腔内または筋肉内注射によってであり得る。ガラニン類似体などの開示される組成物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下的、腔内または経皮的に投与され得る。
非経口投与のための製剤は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液および乳剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体は、水、食塩水および緩衝媒質を含む、アルコール／水溶液、乳剤または懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム乳酸化リンゲル液または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、液体及び栄養素補液、電解質補液（例えばリンゲルデキストロースをベースとするものなど）等を含む。防腐剤および他の添加物、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガス等も存在し得る。
局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐薬、スプレー、液体および粉末を含み得る。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤等は、必要であるかまたは望ましいと考えられる。
経口投与のための組成物は、粉末または顆粒、水または非水性媒質中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェットまたは錠剤を含む。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤は望ましいと考えられる。
組成物の一部は、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸などの無機酸、およびギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸などの有機酸との反応によって、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、およびモノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される、医薬的に許容される酸または塩基付加塩として潜在的に投与され得る。
ｂ）治療での使用
組成物の投与のための用量範囲は、障害の症状が影響を受ける所望作用を生じさせるのに十分な用量範囲である。用量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等のような有害な副作用を引き起こすほど高い用量であってはならない。一般に、用量は患者の年齢、状態、性別および疾患の程度によって異なり、当業者によって決定され得る。用量は、何らかの禁忌の場合には個々の医師によって調節され得る。用量は、変更され得、１日または数日間、１日１回またはそれ以上の投与で与えられ得る。
１０．チップおよびマイクロアレイ
少なくとも１つのアドレスが、本明細書で開示される核酸配列のいずれかで示される配列または配列の部分であるチップを開示する。また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書で開示されるペプチド配列のいずれかで示される配列または配列の部分であるチップを開示する。
また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書で開示される核酸配列のいずれかで示される配列または配列の部分の変異体であるチップを開示する。また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書で開示されるペプチド配列のいずれかで示される配列または配列の部分の変異体であるチップを開示する。
また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書で開示される核酸配列のいずれかで示される配列または配列の部分であり、前記配列が、本明細書で開示される変異体配列の少なくとも１つを含む、チップを開示する。また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書で開示されるペプチド配列のいずれかで示される配列または配列の部分であり、前記ペプチド配列が、本明細書で開示されるガラニン類似体の少なくとも１つを含む、チップを開示する。
また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書で開示される核酸配列のいずれかで示される配列または配列の部分であり、前記配列が、本明細書で定義される領域内の変異体配列の少なくとも１つを含む、チップを開示する。また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書で開示されるペプチド配列のいずれかで示される配列または配列の部分であり、前記ペプチド配列が、本明細書で開示される置換、付加、突然変異または欠失の少なくとも１つを含む、チップを開示する。
１１．コンピュータ読取り可能媒体
開示される核酸およびタンパク質は、アミノ酸のヌクレオチドから成る配列として表示され得ることが了解される。これらの配列を示すための様々な方法があり、例えばヌクレオチドグアノシンはＧまたはｇによって表示され得る。同様にアミノ酸バリンはＶａｌまたはＶによって表わされ得る。当業者は、その各々が本明細書で開示されるとみなされる、存在する様々な方法のいずれかで任意の核酸またはタンパク質配列をいかにして提示し、表現するかを理解する。特に本明細書で考慮されるのは、市販のフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスクおよびビデオディスク、または他のコンピュータ読取り可能媒体などの、コンピュータ読取り可能媒体上でのこれらの配列の表示である。また、開示される配列の２進コード表示も開示する。当業者は、コンピュータ読取り可能媒体がどのようなものであるかを理解する。それ故、核酸またはタンパク質配列が記録され、保存されるまたは残されるコンピュータ読取り可能媒体が開示される。
配列および本明細書で示す配列に関する情報を含むコンピュータ読取り可能媒体を開示する。
１２．キット
本明細書で開示される方法を実施するときに使用できる試薬を集めたキットを開示する。キットは、本明細書で論じられるまたは開示される方法の実施において必要とされるまたは有益であると理解されるあらゆる試薬または試薬の組合せを含み得る。例えばキットは、本発明のある実施形態の中で述べた置換を実施するためのアミノ酸、ならびに使用説明書を含み得る。
１３．類似機能を有する組成物
本明細書で開示される組成物は、血液脳関門の高い透過性などの一定の機能を有することが了解される。開示される機能を実施するために一定の構造必要条件が本明細書で開示され、開示される構造に関連する同じ機能を実施できる様々な構造が存在すること、およびこれらの構造が最終的に同じ結果を達成することが了解される。
Ｅ．組成物を作製する方法
本明細書で開示される組成物および開示される方法を実施するために必要な組成物は、特に異なる記載がない限り、その特定試薬または化合物に関する当業者に公知の任意の方法を使用して作製できる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）に開示されているような一般的分子生物学手法が、特に異なる記載がない限り、開示される分子を作製し、開示される方法を実施するために使用可能であることが了解される。
組成物が、変化していない形態のペプチドと比較したとき高い親油特性と高い塩基度を有するペプチドを含有する、血液脳関門の高い透過性を有する組成物を作製することを含む、血液脳関門の高い透過性を有する組成物を作製する方法を本明細書で開示する。一例では、親油特性は、ペプチドをポリ脂肪族鎖などの疎水性部分に結合体化することによって上昇させ得る。親油特性はまた、芳香族残基のハロゲン化を高めることによって上昇させ得る。塩基度は、リシン、アルギニン、ホモリシン、ホモアルギニン、ＬまたはＤ異性体立体配置のオルニチン；２，３−ジアミノプロピオン酸；２，４−ジアミノ酪酸を含むが、これらに限定されない、正に荷電したアミノ酸残基のホモおよびヘテロオリゴマーを導入することによって上昇させ得る。もう１つの例では、塩基度は、スペルミン、スペルミジン、ポリアミドアミンデンドリマーまたはポリアミン毒素およびそれらの誘導体などの、ポリアミンベースの部分への結合体化によって上昇させ得る。ペプチドは、変化していないペプチドと比較して１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％より効率的に血液脳関門を通過することができる。ペプチドはまた、変化していない形態のペプチドと比較したとき高いグリコシル化を有し得る。ペプチドはスペーサーを含み得る。スペーサーは、Ｇｌｙ、Ａｈｘ、Ｇｌｙ−ＡｈｘまたはＰＥＧ−Ｏ２Ｏｃから成る群より選択され得る。
１．核酸合成
例えばプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドなどの核酸は、標準化学合成法を用いて作製できるか、あるいは酵素的方法または他の任意の公知の方法を用いて生産できる。そのような方法は、標準酵素消化とそれに続くヌクレオチドフラグメントの単離（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）Ｃｈａｐｔｅｒｓ ５，６参照）から、純粋に合成による方法、例えばＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ １Ｐｌｕｓ ＤＮＡシンセサイザー（例えばＭｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡのＭｏｄｅｌ ８７００自動シンセサイザーまたはＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂ）を使用するシアノエチルホスホロアミダイト法までおよぶことができる。オリゴヌクレオチドを作製するために有用な合成方法はまた、Ｉｋｕｔａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６（１９８４）（ホスホトリエステルおよびホスファイトトリエステル法）、およびＮａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６５：６１０−６２０（１９８０）（ホスホトリエステル法）によって述べられている。（ペプチド核酸分子）は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３−７（１９９４）によって述べられているような公知の方法を用いて作製できる。
２．ペプチド合成
開示されるタンパク質を生産する１つの方法は、タンパク質化学手法によって２以上のペプチドまたはポリペプチドを連結することである。例えばペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学のいずれかを使用し、現在使用可能な実験装置を用いて化学合成することができる。（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡを適用）。当業者は、開示されるタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドが、例えば標準化学反応によって合成できることを容易に認識する。例えばペプチドまたはポリペプチドを合成し、その合成樹脂から切断せず、一方ペプチドまたはタンパク質のその他のフラグメントは、合成してその後樹脂から切断することができ、それによってその他のフラグメント上の機能的にブロックされている末端基を露出させる。ペプチド縮合反応により、これら２つのフラグメントを、タンパク質またはそのフラグメントを形成するために、それぞれそれらのカルボキシルおよびアミノ末端でペプチド結合によって共有結合連結することができる（Ｇｒａｎｔ ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ ＭとＴｒｏｓｔ Ｂ．，Ｅｄ．（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｉｎｃ．，ＮＹ）（少なくともペプチド合成に関する資料について、参照により本明細書に組み込まれる）。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書で述べるようにインビボで独立して合成される。ひとたび単離されれば、これらの独立ペプチドまたはポリペプチドは、同様のペプチド縮合反応によってペプチドまたはそのフラグメントを形成するために連結され得る。
例えばクローニングされたまたは合成ペプチドセグメントの酵素的連結は、比較的短いペプチドフラグメントを、より大きなペプチドフラグメント、ポリペプチドまたは全長タンパク質ドメインを作製するために結合することを可能にする（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドの天然化学的連結が、短いペプチドフラグメントから大きなペプチドまたはポリペプチドを合成によって構築するために利用できる。この方法は２段階の化学反応から成る（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６−７７９（１９９４））。最初の工程は、保護されていない合成ペプチド−チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含むもう１つの保護されていないペプチドセグメントの化学選択的反応であり、初期共有結合生成物としてチオエステル結合中間体を生じる。反応条件を変えずに、この中間体は自発的で迅速な分子内反応を受けて、連結部位で天然ペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍら、（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８（１９９１）；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：６６２３−３０（１９９４））。
あるいは、化学的連結の結果としてペプチドセグメントの間で形成される結合が非天然（非ペプチド）結合である場合は、保護されていないペプチドセグメントを化学的に連結する（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ， Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２））。この手法は、タンパク質ドメインの類似体を合成するためならびに完全な生物活性を有する比較的純粋なタンパク質を大量に合成するために使用されてきた（ｄｅＬｉｓｌｅ Ｍｉｌｔｏｎ ＲＣら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７−２６７（１９９２））。
３．組成物を作製するための工程
組成物を作製する工程ならびに組成物を導く中間体を作製するための工程を開示する。例えば配列番号１−５５のタンパク質を開示する。合成化学的方法および標準分子生物学的方法のような、これらの組成物を作製するために使用できる様々な方法がある。これらやその他の開示組成物を作製する方法は詳細に開示されることが了解される。
配列番号３に示す配列および核酸の発現を制御する配列を含有し、ガラニン類似体をコードする核酸を作動的に連結することを含む工程によって生産されるタンパク質を開示する。
また、配列番号３に示す配列に８０％の同一性を有し、配列および核酸の発現を制御する配列を含有する、ガラニン類似体をコードする核酸分子を作動的に連結することを含む工程によって生産されるタンパク質を開示する。
開示される核酸のいずれかで細胞を形質転換する工程によって生産される細胞を開示する。非天然に生じる開示核酸のいずれかで細胞を形質転換する工程によって生産される細胞を開示する。
開示される核酸のいずれかを発現する工程によって生産される開示ペプチドのいずれかを開示する。開示される核酸のいずれかを発現する工程によって生産される、非天然に生じる開示ペプチドのいずれかを開示する。非天然の開示核酸のいずれかを発現する工程によって生産される開示ペプチドのいずれかを開示する。
動物内の細胞を、本明細書で開示される核酸分子のいずれかでトランスフェクトする工程によって生産される動物を開示する。動物が哺乳動物である、動物内の細胞を、本明細書で開示される核酸分子のいずれかでトランスフェクトする工程によって生産される動物を開示する。また、哺乳動物がマウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタまたは霊長動物である、動物内の細胞を、本明細書で開示される核酸分子のいずれかでトランスフェクトする工程によって生産される動物を開示する。
また、本明細書で開示される細胞のいずれかを動物に付加する工程によって生産される動物を開示する。
タンパク質を生産するもう１つの方法は、Ｂｉｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって生産されるタイプの系のような、ウサギ発現系を使用することであることが了解される。開示される分子は、これらのタイプのベクターおよび生産系を使用して生産され得る。例えばこれらのタイプの系は、欧州特許出願第９２ ４０１ ６３５．５号、米国特許第５，９６５，７８８号および遺伝子インシュレーター（欧州特許出願第００
４０３ ６５８．８号）に開示されており、情報は、ｗｗｗ．ｂｉｏｐｒｏｔｅｉｎ．ｃｏｍに見出される。
本出願全体を通して、様々な公表文献が参照される。これらの公表文献の開示全体が、本発明が関係する最新技術をより詳細に説明するために参照により本出願に組み込まれる。開示される参考文献はまた、その参考文献を根拠とする文において論じられる、それらに含まれる資料に関して個別におよび明確に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の範囲または精神から逸脱することなく本発明において様々な修正および変更を行い得ることは当業者に明白である。本発明の他の実施形態は、本明細書で開示される本発明の詳細な説明および実施を考慮することにより当業者に明白である。説明および実施例は例示としてのみ考慮され、本発明の実際の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって指示されることが意図されている。
Ｆ．実施例
以下の実施例は、本明細書で特許請求される化合物、組成物、製品、装置および／または方法をいかにして作製し、評価するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されるものであり、本発明の純粋な例示であることが意図され、発明人が自らの発明とみなすものの範囲を限定することは意図されていない。数（例えば量、温度等）に関しては正確さを保証するように努力を払ったが、ある程度の誤差および偏差が含まれるはずである。異なる指示がない限り、割合は重量比であり、温度は℃または環境温度であり、圧は大気圧またはほぼ大気圧である。
実施例１
全身的に活性な抗痙攣性ガラニン類似体
血液脳関門の透過性を高めるための抗痙攣性神経ペプチドが工作できることの概念実証を得るため、２つのモデル神経ペプチド：ソマトスタチンとガラニンを選択した。先に述べたように、これらの神経ペプチドのいずれもが抗痙攣活性を有する。
一般的な実験戦略を図７に示す。一セットの神経ペプチド類似体（第１世代）を、それぞれの受容体に高親和性で結合するそれらの能力を調べるために設計し、合成する。このセットは、神経ペプチドにつき約１０個の類似体を含む。高親和性類似体を、血液脳関門を透過するそれらの能力に関してさらに試験する。第１世代類似体からの結果に続いて、第２世代、その後第３世代類似体の合成と評価を行う。機能アッセイにおいてアゴニスト活性を確認するため、最も有望な類似体を選択する（血液脳関門の高い透過性を有する高親和性リガンド）。これらの類似体のサブセット（血液脳関門の高い透過性を有する強力なアゴニスト）を、次に、インビボで薬理学的に試験する。
薬剤になるためには、神経ペプチド類似体は、（１）高い効力と選択性、（２）代謝安定性、（３）比較的長い半減期と全身循環からの低いクリアランス、および（４）血液脳関門の高い透過性を含む、いくつかの重要な特徴を有するべきである。大部分の神経ペプチドは高い効力と選択性を示す。代謝安定性は、しばしば、ペプチド骨格の修飾および／またはタンパク質分解酵素によって認識されない残基による感受性残基の置換によって導入される。半減期の上昇と排泄速度の低下は、ポリマーベースの部分をペプチドに結合体化すること（例えばＰＥＧ化）によって効率的に達成され得る。血液脳関門のより大きな透過性は、親油性またはカチオン化の上昇によって、ならびにプロドラッグ、栄養素輸送体ミメティックまたはグリコシル化を付加することによって導入され得る。理想的な薬剤神経ペプチドの構造を図８に図式的に示す。
図８に例示するように、神経ペプチド工作における新しい概念：「ＢＢＢ／ＰＫ調節剤」が導入される。ＢＢＢ／ＰＫ調節剤は、親油性、カチオン性および輸送体ミメティックモジュールを備えたポリマーベースのかさの高い部分を含む；この調節剤は、血液脳関門の透過性の上昇および薬物動態特性の改善という２つの目的に役立つ。カチオン性および親油性モジュールは、それぞれ、負に荷電した膜表面との相互作用を促進し、膜を通しての拡散を改善する。能動輸送体ミメティック構造の機能は、脳内皮細胞の表面に位置する特異的栄養素輸送体との相互作用を増強することによって脳への神経ペプチド取込みの特異性を高めることである。これらのモジュール全てを含む構造フレームワークはまた、ペプチドの薬物動態特性を改善することができ、一般的に使用されるＰＥＧ部分の役割を模倣／置換する。これらのかさの高い部分をモデル神経ペプチドのＮまたはＣ末端伸長として試験し、神経ペプチド構造内のより多用途の結合位置も本明細書で開示する。
高い血液脳関門透過性を有する神経ペプチド類似体を設計するために以下の戦略を使用した：使用可能な場合は、代謝的に安定な類似体から出発する。側鎖置換に適する類似体内の付加的なアミノ酸位置を特定する。かさの高い部分の導入に適するＮおよびＣ末端の位置を特定する。側鎖置換によって類似体の親油性と塩基度を増大させる。薬物動態特性を改善しつつ（ＢＢＢ／ＰＫ調節剤）、その親油性と塩基度をさらに上昇させる伸長をペプチド類似体に導入する。血液脳関門透過の特異性を改善するために伸長部分に栄養素ミメティック構造を含める。側鎖修飾を有する類似体を伸長部分（ＢＢＢ／ＰＫ調節剤）と組み合わせる。
そのような類似体を成功裏に設計するための鍵は、上記修飾の正しい組合せである。この目標を達成するために、修飾の個々のセットとそれらの最適の組合せを設計し、評価する体系的なアプローチを取ることができる。一般的な戦略を図１０に図式的に示す。本明細書で開示するアミノ酸の修飾は、自動ペプチドシンセサイザーを使用した固相ペプチド合成の間に導入できる。全ての非天然アミノ酸または複合構造は、市販のＦｍｏｃ保護された誘導体である。
ソマトスタチンは、１９７３年に最初に発見された（Ｂｒａｚｅａｕら、１９７３）、１個のジスルフィド架橋を有する１４アミノ酸の視床下部ペプチドである。ソマトスタチンの配列を以下に示す：
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ
１１ １２ １３ １４
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ
広汎なＳＡＲ試験は、５個の鍵となる残基：Ｐｈｅ６、Ｐｈｅ７、Ｔｒｐ８、Ｌｙｓ９およびＰｈｅ１１を同定したが、Ｇｌｙ２、Ｌｙｓ４、Ａｓｎ５、Ｔｈｒ１０、Ｔｈｒ１２またはＳｅｒ１３のアラニン置換は生物活性に有意の影響を及ぼさなかった（Ｖａｌｅら、１９７５）。加えて、Ｄ−Ｔｒｐ８含有類似体は、タンパク質分解に対するより大きな抵抗性および／または活性立体配座のより良好な安定化の故に、より強力であることが示された。
［Ｄ−Ｔｒｐ８］ソマトスタチンは、代謝的に安定な類似体として本明細書で開示する方法と共に使用できる。塩基度を増大させるために、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＡｓｎ残基を、等電子配置的に類似するが、正に荷電したＤＡＢ（ジアミノ酪酸）またはＤＡＰ（ジアミノプロピオン酸）残基で体系的に置換することができる。親油性を上昇させるために、Ｌｙｓ−パルミトイル部分をＬｙｓ４またはＡｓｎ５の代わりに導入することができ、および／またはＰｈｅ残基をハロゲン化均等物、クロロ−Ｐｈｅ残基で置換することができる。表５に要約するように、９個の類似体を合成し、ソマトスタチン受容体へのそれらの親和性に関して検定する。高親和性結合に負の影響を及ぼさない修飾を組み合わせる。これらの第２世代類似体は２−４の組合せ修飾を含む。
次に、［Ｄ−Ｔｒｐ８］ソマトスタチンにＮ末端伸長を導入する。これらの伸長（図８に示すような、ＢＢＢ／ＰＫ調節剤）は、２つの目的に役立つ：（１）受動および能動機構の両方によって血液脳関門を通る透過性を改善すること、および（２）クリアランスを低減し、タンパク質分解に対する抵抗性を改善する、かさの高い部分を付加することによって神経ペプチド薬の薬物動態特性を改善すること。そのような「ＢＢＢ／ＰＫ調節剤」は新しい概念であるので、伸長を構成する少数の構造モジュールのいくつかの組合せを使用する。表６は、提案されるモジュールの構造と機能についての情報を提供する。
Figure 2016074713
 ＤＡＢ、ジアミノ酪酸；ＤＡＰ、ジアミノプロピオン酸；Ｌｙｓ−ｐａｌｍ、Ｌｙｓ−パルミトイル；Ｃｌ−Ｐｈｅ、クロロ−Ｐｈｅ。
Figure 2016074713
 モジュールは、［Ｄ−Ｔｒｐ８］ソマトスタチンのＡｌａ１残基への伸長として固相合成の間に導入することができる。表７および図１１は伸長を要約する。
Figure 2016074713
 最初に、１０個の類似体を合成し、ソマトスタチン受容体へのそれらの結合特性に関して評価する。高親和性類似体を、モデル血液脳関門透過性アッセイを通してそれらの透過特性に関してさらに評価する。
ひとたび最適伸長が選択されれば、それらを、最適化された側鎖置換を既に含むソマトスタチン類似体に結合することができる（表５参照）。「側鎖置換類似体」と「伸長類似体」の最良の組合せを予測することは困難であるので、各々の選択された類似体を各々の選択された伸長と共に合成する、マトリックスアプローチを利用する。９−１２個の類似体がこの手順で達成され得る。そのような第３世代類似体を３つのインビトロアッセイ全てにおいて試験することができる：（１）ソマトスタチン受容体への結合、（２）アゴニスト活性、および（３）モデル血液脳関門の透過性。限られた数の最も有望な類似体を、インビボでのマウスてんかんモデルにおける薬理学的試験のために選択できる。
Figure 2016074713
 表８。Ｎ末端ＢＢＢ／ＰＫ調節剤が連結されたソマトスタチン類似体を設計するときのマトリックスアプローチ。本明細書では、３つの選択された伸長構造を３つの選択された「側鎖置換」類似体と組み合わせる。
ソマトスタチンについて上述したのと同様のアプローチがガラニンおよびその類似体に関して実施できる。ガラニンは３０アミノ酸の神経ペプチドであるが、ＳＡＲ試験は、Ｎ末端部分が全長ペプチドと比較してまだ極めて強力なアゴニストであると同定した（ＬａｎｇｅｌとＢａｒｔｆａｉ、１９９８）。以下に示すように、Ｇｌｙ１残基がＮ−メチル−Ｇｌｙ（サルコシン、ＳＡＲ）によって置換されている、ガラニン（１−１６）類似体は、本明細書で開示する方法と共に使用することができる：
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
１１ １２ １３ １４ １５ １６
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｇｌｙ１のＮ−メチル化は、ペプチドをＮ末端からの急速なタンパク質分解から保護したが、ガラニン受容体に対するその親和性を有意に変化させなかった（Ｒｉｖｅｒａ Ｂａｅｚａら、１９９４）。ＳＡＲ試験は、以下の残基を生物活性のために決定的に重要であると同定した：Ｇｌｙ１、Ｔｒｐ２、Ａｓｎ５、Ｔｙｒ９およびＧｌｙ１２（Ｌａｎｄら、１９９１）。同じ試験は、Ｎ末端伸長が生物活性の喪失を引き起こすことを同定した。他方で、ガラニン（１−１６）のＣ末端部分は、より大きな構造に連結されているとき非常に堅固であると思われる（Ｐｏｏｇａら、１９９８）。それ故、［Ｓａｒ１］ガラニン類似体の設計のための戦略は、アミノ酸置換に関してのみソマトスタチンで使用される戦略と同様であるが、Ｎ末端ではなくＣ末端に伸長を導入することにおいて異なる。表９は、アミノ酸置換を有するガラニン類似体を要約する。
表９。［Ｓａｒ１］ガラニン（１−１６）における個々の残基の置換。
アミノ酸の符号化については、表５参照。
Figure 2016074713
 Ｃ末端伸長は、表７に示すものと同じであり得るが、Ｈｉｓ１４位置に導入され得る。次に、Ｌｙｓ１４（Ｍｍｔ）残基（４−メトキシトリチル基で保護された側鎖）を有する（Ｓａｒ１）ガラニンを合成する。サルコシンをカップリングした後、ペプチド樹脂をジクロロメタン中の１％ＴＦＡで３０分間処理し得る。Ｌｙｓ１４残基の側鎖アミノ基を脱保護し、次いで伸長モジュールをカップリングし得る。側鎖置換とＣ末端伸長の組合せを有する第３世代類似体の設計は、ソマトスタチン類似体について述べたのと同じである。
神経ペプチドの化学合成。Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成プロトコルおよび自動ペプチドシンセサイザーを使用してペプチドを合成する。カップリング方法および固体支持体からのペプチドの除去は、ＣｈａｎとＷｈｉｔｅ（ＣｈａｎとＷｈｉｔｅ、２０００）によって述べられているように実施される。ペプチドは、試薬Ｋでの処理によって固体支持体から除去できる。洗浄と沈殿後、分取逆相ＨＰＬＣ分離を用いて類似体を精製する。ソマトスタチン類似体におけるジスルフィド架橋は、記述されているように（Ｃｈｅｎら、２０００）、精製ペプチドを水中２％ＤＭＳＯ、３０％酢酸、ｐＨ７．０と共にインキュベートすることによって形成され得る。各々のペプチド類似体の少なくとも数ミリグラムがこの方法によって生産できる。
血液脳関門を通る神経ペプチド類似体の透過性を評価するために、ｐＩＯＮ社のＰＡＭＰＡ法が使用できる。この方法では、固定化人工膜を備えたフィルターを２つの区画：供与体と受容体の間に置く。類似体は供与体区画に置くことができる。適切な時間間隔後、供与体と受容体区画を、紫外分光法を用いて定量する。
ソマトスタチンおよびガラニン結合アッセイ（非選択的）は、Ｎｏｖａｓｃｒｅｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって実施される。ラット前脳膜および放射性標識親神経ペプチドをこれらのアッセイにおいて使用する。高親和性と低親和性の類似体を区別するために類似体を単一（１μＭ）濃度で試験する。選択されたソマトスタチンおよびガラニン類似体のアゴニスト活性を、ＭＤＳ−Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって提供される機能アッセイを使用してさらに試験することができる。類似体は単一濃度（１μＭ）で試験できる。
抗痙攣性試験。抗痙攣活性は、反射性てんかんのＦｒｉｎｇｓ ＡＧＳ感受性マウスモデルにおいて確立され得る。ＡＧＳ感受性マウスは、非区別的であり、多種多様なＣＮＳ活性化合物を有効に検出するので、初期概念実証のための理想的な急性発作モデルである（Ｗｈｉｔｅら、１９９２）。Ｆｒｉｎｇｓマウスにおいて活性であると認められたペプチドは、最大電気ショック（ＭＥＳ）および皮下（ｓ．ｃ．）投与したペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）によって誘発される発作をブロックするそれらの能力に関して評価することができる。これら２つのセットは、それぞれ、発作の拡大を防ぎ、発作閾値を引き上げる、試験下の抗てんかん化合物の能力を測定する（Ｗｈｉｔｅら、２００２）。ひとたび修飾ペプチドがこれら３つの発作試験の１以上において活性であることが明らかにされれば、あらかじめ決定されたｉ．ｖ．投与後のピーク効果時に完全な用量反応試験を実施する。これらの概念実証試験からの結果を、次に、脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）投与後に実施した効果試験と比較する。血液脳関門のより大きな透過が達成されるときには、ｉ．ｐ．用量反応曲線の左側へのシフトが認められる。集合的に、これら３つの発作試験から得られる結果は、全身投与後に低分子ペプチドを脳に対してよりアクセス可能にするためのアプローチを支持する実質的なデータを提供する。各々個々の発作試験の詳細を以下に概説する。
神経ペプチド類似体の投与。修飾神経活性ペプチドの各々を、１０μｌハミルトン注射器により人工脳脊髄液５μｌ中で脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）に、または０．０１ｍｌ／ｇ体重の容量にて０．５％メチルセルロース中で静脈内（ｉ．ｖ．）に投与する。
聴原性発作。個々の修飾ペプチドが、ＡＧＳ感受性Ｆｒｉｎｇｓマウスモデルにおいて音によって誘発される発作を予防する能力をピーク効果時に評価することができる（Ｗｈｉｔｅら、１９９２）。この試験のために、個々のマウスを、オーディオ変換器（Ｍｏｄｅｌ ＡＳ−ＺＣ；ＦＥＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）を取り付けたプレキシガラスシリンダー（直径１５ｃｍ、高さ１８ｃｍ）に入れ、２０秒間送達される１１０デシベル（１１ＫＨｚ）の音刺激に曝露する。音誘発発作は、ワイルドランニングとそれに続く前肢および後肢の強直性伸展を伴う立直り反射の喪失によって特徴づけられる。後肢の強直性伸展を示さないマウスを保護されたとみなす。
ＭＥＳ試験。ＭＥＳ試験のために、角膜電極を設置する前に麻酔薬／電解質溶液（０．９％食塩水中の０．５％塩酸テトラカイン）１滴を各動物の眼に適用することができる。マウスＭＥＳ試験における電気刺激は、ＷｏｏｄｂｕｒｙとＤａｖｅｎｐｏｒｔ（ＷｏｏｄｂｕｒｙとＤａｖｅｎｐｏｒｔ、１９５２）によって最初に記述されたのと同様の装置によって０．２秒間送達される５０ｍＡである。発作の後肢強直性伸展けいれん成分の排除をエンドポイントとして使用する。
最小毒性試験。最小毒性は、回転棒法（ｒｏｔａｒｏｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）（ＤｕｎｈａｍとＭｉｙａ、１９５７）によりマウスにおいて同定し得る。マウスを、６ｒ．ｐ．ｍ．の速度で回転する１インチの刻みのついた棒上に置いたとき、動物は長期間その平衡を維持することができる。動物が１分間に３回この回転棒から落下した場合、毒性であるとみなし得る。
中央有効用量（ＥＤ５０）または毒性用量（ＴＤ５０）の決定。全ての定量的インビボ抗痙攣／毒性試験は、あらかじめ定められたＴＰＥで実施する。少なくとも８匹のマウスの群を、１００％保護または最小毒性と０％保護または最小毒性の限界の間で少なくとも２つの点が確立されるまで、様々なペプチドの用量で試験する。次に、各々の試験で動物の５０％において所望エンドポイントを生じるために必要な薬剤の用量（ＥＤ５０またはＴＤ５０）、９５％信頼区間、回帰直線の勾配、および勾配のＳ．Ｅ．Ｍ．を、Ｆｉｎｎｅｙ（Ｆｉｎｎｅｙ，１９７１）によって述べられた方法に基づくコンピュータプログラムによって算定する。
ソマトスタチンの類似体が表１０に示されている（全ての類似体が２個のシステイン残基の間で形成されるジスルフィド架橋を有する）：
Figure 2016074713
 上記表において、（ＡＨＸ）はアミノヘキサン酸であり、（Ｄａｂ）はジアミノ酪酸であり、（Ｄａｐ）はジアミノプロピオン酸であり、（Ｔｌｅ）はｔｅｒｔ−ロイシンであり、（Ｃｌ−Ｐｈｅ）は４−クロロフェニルアラニンであり、（ＮＮ３ＡＰＧ）はＮ，Ｎ−ビス（３−アミノプロピル）グリシンであり、（ＡＨＸ）はアミノヘキサン酸であり、（Ｌｙｓ−Ｐ）はＬｙｓ−パルミトイルであり、Ｔｈｒ（ｏｌ）はトレオニノールであり、ＤＫ、ＤＦ、ＤＷはＤ−異性体を表わし、ＰＦＨＡは２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロへプタン酸であり、ＡＣＰＡは８−アミノカプリル酸である。
また、ガラニンおよびソマトスタチン以外に使用できる類似体の他の例が存在する。例えばデルタ睡眠誘発ペプチド（ＤＳＩＰ）の類似体は以下の通りである：
ＤＳＩＰ−ＢＢＢ８：（ＡＨＸ）ＧＧＷＡＧＧＤＡＳＧＥ（配列番号５５）。さらなるＤＳＩＰペプチドは表３１に示されている。
実施例２
抗痙攣性ガラニン類似体
ガラニンは、Ｎ末端部分が全長ペプチドと比較して極めて強力なアゴニストである、３０アミノ酸の神経ペプチドである（ＬａｎｇｅｌとＢａｒｔｆａｉ、１９９８）。血液脳関門の透過性を高める修飾を導入するためにトランケート型ガラニン（１−１６）類似体（下記）を使用した。
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０
Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
１１ １２ １３ １４ １５ １６
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ
生物活性のために決定的に重要な以下の残基が同定された：Ｇｌｙ１、Ｔｒｐ２、Ａｓｎ５、Ｔｙｒ９およびＧｌｙ１２（Ｌａｎｄら、１９９１）。Ｎ末端伸長または切断は生物活性の喪失を引き起こした。他方で、ガラニン（１−１６）のＣ末端部分は、切断されたときまたはより大きな構造に連結されているとき非常に堅固である（Ｐｏｏｇａら、１９９８）。
使用可能な構造−活性関係データに基づき、２個のペプチドベースのガラニン類似体を設計し、化学合成して、試験した。両方の類似体（ＧＡＬ−ＢＢＢ１およびＧＡＬ−ＢＢＢ２）の構造を以下に示す：
ＧＡＬ−ＢＢＢ１：Ｓａｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−（Ｌｙｓ−ｐａｌｍ）−Ｔｌｅ−ＮＨ２
ＧＡＬ−ＢＢＢ２：Ｓａｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−ｐａｌｍ）−Ｌｙｓ−ＮＨ２
式中、Ｓａｒはサルコシンであり、Ｔｌｅはｔｅｒｔ−ロイシンであり、Ｌｙｓ−ｐａｌｍは、εアミノ基によってパルミトイル部分と共役したリシン残基であり、および−ＮＨ２はＣ末端のアミド化を表わす。ペプチドは、標準Ｆｍｏｃ化学を使用して固体支持体上で合成し、ＨＰＬＣによって精製した。精製した類似体を、次に、てんかんのＦｒｉｎｇｓ聴原性発作感受性マウスモデルにおいて試験した。この試験からの結果を天然ガラニンペプチドフラグメント（１−１６）と比較した。
他の類似体は以下を含む：
Figure 2016074713
 式中、Ｓａｒはサルコシンであり、およびＸはＬｙｓ−パルミトイル残基である。
２個の修飾ガラニン類似体（ＧＡＬ−ＢＢＢ１およびＧＡＬ−ＢＢＢ２）を、４ｍｇ／ｋｇの用量でＦｒｉｎｇｓ聴原性発作感受性マウスの群にｉ．ｐ．投与した。投与後様々な時点で（すなわち１５、３０、６０、１２０および２４０分目）、各々のマウスを、オーディオ変換器を取り付けた円筒状試験チェンバーに入れ、強力な音刺激（１１０ｄＢ、１１ＫＨｚ、２０秒間）で攻撃誘発した。強直性後肢伸展を示さない動物を保護されたとみなした。図１２に要約するように、この試験から得られた結果は、ＧＡＬ−ＢＢＢ２が、開始が迅速で（３０分以内）、期間は中等度（２−４時間の間）の時間依存的抗痙攣作用を示すことを明らかにした。これに対し、他方の修飾ガラニン類似体ＧＡＬ−ＢＢＢ１は、１２ｍｇ／ｋｇのより高い用量でも、試験したいかなる時点でも活性ではなかった。その後の試験では、用量反応試験においてピーク効果時（すなわち１時間目）に抗痙攣効果を定量した。この試験の結果は、ＧＡＬ−ＢＢＢ２が音誘発性発作に対して用量依存的作用を示すことを明らかにした。用量反応データのＰｒｏｂｉｔ分析から得た算定中央有効用量（すなわちＥＤ５０）および９５％信頼区間は、３．２（２．３−６．１）ｍｇ／ｋｇであった。天然ペプチドフラグメントＧＡＬ（１−１６）は、２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．（ＧＡＬ−ＢＢＢ２についてのＥＤ５０の６倍）の用量で不活性であった（図２０）。
ガラニン類似体ＧＡＬ−ＢＢＢ２は、ｉ．ｐ．投与したとき強力な抗痙攣活性（ＥＤ５０〜３ｍｇ／ｋｇ）を示した。この概念実証類似体は、より「薬剤様」の類似体を設計する原型である。それ故、最も強力で持続的な抗痙攣活性を有する最小ガラニン類似体を得ることができる。これは２段階のアプローチを必要とする：（１）抗痙攣活性を維持するＧＡＬ−ＢＢＢ２類似体の最小フラグメントを定義する：これは末端および中心トランケーションを含む、（２）類似体のＢＢＢ透過性をさらに改善するＣ末端構造モチーフを最適化する。合成した類似体を、最初にガラニン競合結合アッセイにおいてスクリーニングする。１μＭまたはそれ以下の濃度でガラニンに置き換わる類似体を、てんかんの聴原性発作マウスモデルを用いて抗痙攣活性に関してさらにスクリーニングする。単一用量（すなわちｉ．ｐ．投与したとき、２ｍｇ／ｋｇ）で長期間持続性の抗痙攣活性を示す類似体をより多くの薬理学的アッセイにおいてさらに評価する。一般的な実験戦略を図１３に要約する。図２３および２４は、それぞれ、ＧＡＬ−ＢＢＢ２を投与したときのＦｒｉｎｇｓマウスにおける時間依存的抗痙攣活性およびＦｒｉｎｇｓマウスにおける聴原性発作に対する用量依存的保護を示す。
全身的に投与したとき抗痙攣活性を維持するＧＡＬ−ＢＢＢ２類似体の最小フラグメントを同定するため、限定構造−機能関係試験を実施する。Ｃ末端および中心トランケーションを含むガラニン類似体を合成し、試験する。加えて、血液脳関門を通る類似体の透過性を最適化するため、Ｃ末端モチーフの限定構造−機能関係試験を実施する。図１４は、構造−機能試験に関連したＧＡＬ−ＢＢＢ２の構造を示す。
ＧＡＬ−ＢＢＢ２のトランケート型類似体を作製するため、Ｐｒｏ１３からＬｅｕ１０残基までの４個の連続的欠失を生じさせる（表１１に要約する）。Ｔｙｒ９はガラニン活性にとって重要であるので、さらなるＣ末端切断は生物活性の完全な喪失をもたらし得る（Ｌａｎｄら、Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ １９９１参照）。各々のトランケート型類似体において、ＢＢＢの改善された透過性のためにＣ末端の「−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＰ−Ｌｙｓ」は保持する。
Figure 2016074713
 ＧＡＬ−ＢＢＢ２類似体を最小化するため、鍵となる残基の間に中心トランケーションを導入する。これは、所与のペプチド長さを損なわずに単純化された構造を有する活性ペプチド類似体を設計するための選択的戦略である。骨格置換（すなわち「骨格プロテーゼ」）は、２以上の連続的な「鍵ではない」残基を非ペプチドスペーサー、例えばアミノ吉草酸またはアミノヘキサン酸（「骨格スペーサー」）で置換することによって達成され得る。この概念は図１５により明瞭に示されている。
ＧＡＬ−ＢＢＢ２類似体の場合は、ペプチドの３つの部分を骨格スペーサーによる残基の体系的に置換によってプローブする（表１１）：Ｔｒｐ２とＡｓｎ５の間、Ａｓｎ５とＴｙｒ９の間、およびＴｙｒ９とＣ末端モチーフの間。約１４個のそのような類似体を合成し、ガラニン受容体への結合に関して試験する。一部の類似体が抗痙攣活性を維持する場合、異なる位置に２以上のスペーサーを導入することができる（表１２の例参照）。
表１２。ＧＡＬ−ＢＢＢ２類似体における「骨格プロテーゼ歩行」。アミノ吉草酸またはアミノヘキサン酸などの非ペプチド骨格スペーサーによる２個の残基の同時置換は、鍵となる薬理作用団残基の間のスペーシングの有意の変化を伴わずに全体的分子サイズの最小化を生じさせる。
Figure 2016074713
 次に、ＢＢＢ透過性を改善するためにＣ末端構造モチーフ、「−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＰ−Ｌｙｓ−ＮＨ２」を最適化し得る。初期化合物ＧＡＬ−ＢＢＢ２を、表１３に要約する、以下のような構造変化の導入によって最適化することができる。ホモ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｙｓまたはジアミノ酪酸によるＬｙｓ残基の置換は、側鎖の様々な親油性を備える正に荷電した残基のＢＢＢ透過性の効率をプローブする。１６位のＬｙｓ−パルミトイル部分の２−アミノ−テトラデカン酸または３，３−ジフェニルアラニンによる置換は、この位置が、ＢＢＢ透過性を上昇させ得る他の疎水性残基に対してどの程度順応性であるかを測定する。
表１３ ＢＢＢを通るガラニン類似体の透過性を上昇させるＣ末端モチーフの修飾
Figure 2016074713
 ＴＤＡは２−アミノ−テトラデカン酸であり、ＤＡＢはジアミノ酪酸であり、Ｄ−ＬｙｓはＬｙｓのＤ−異性体であり、ｈ−Ｌｙｓはホモ−Ｌｙｓであり、ＤＰＡは３，３−ジフェニルアラニンである。
Figure 2016074713
 類似体の上記リストに加えて、以下に示すような、Ｃ末端に親油性の非ペプチド性伸長を有する２つの類似体を作製することができる：
Ｘは、１２−アミノ−ドデカン酸または２−アミノ−テトラデカン酸である。
図１３に示すように、合成し、精製した各々の類似体を、ガラニン受容体へのその結合特性に関して試験する。１μＭ以下の濃度で完全長ガラニンに置き換わる類似体だけをさらに試験する。ガラニン結合アッセイは、例えばＮｏｖａｓｃｒｅｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって実施され得る。ラット前脳膜および放射性標識親神経ペプチドがこれらのアッセイにおいて使用できる。高親和性と低親和性の類似体を区別するために類似体を単一（１μＭ）濃度で試験することができる。選択されたガラニン類似体のアゴニスト活性を、ＭＤＳ−Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって提供される機能アッセイを使用してさらに試験し得る。例えば類似体は単一濃度（１μＭ）で試験することができる。
以下の表は、様々なＳＡＲ類似体、および４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．の用量により１、２および４時間目に与えられる保護のパーセンテージを要約する。
Figure 2016074713
Figure 2016074713
 抗痙攣活性は、最初に反射性てんかんのＦｒｉｎｇｓ ＡＧＳ感受性マウスモデルにおいて確立することができる。ＡＧＳ感受性マウスは、非区別的であり、多種多様なＣＮＳ活性化合物を有効に検出するので、理想的な急性発作モデルである（Ｗｈｉｔｅら、１９９２）。Ｆｒｉｎｇｓマウスにおいて活性であると認められたペプチドは、最大電気ショック（ＭＥＳ）および皮下（ｓ．ｃ．）投与したペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）によって誘発される発作をブロックするそれらの能力に関して評価することができる。これら２つのセットは、それぞれ、発作の拡大を防ぎ、発作閾値を引き上げる、試験下の抗てんかん化合物の能力を測定する（Ｗｈｉｔｅら、２００２）。ひとたび修飾ペプチドがこれら３つの発作試験の１以上において活性であることが明らかにされれば、あらかじめ決定されたｉ．ｐ．投与後のピーク効果時に完全な用量反応試験を実施する。これらの概念実証試験からの結果を、次に、脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）投与後に実施した効果試験と比較する。血液脳関門のより大きな透過が達成されるときには、ｉ．ｐ．用量反応曲線の左側へのシフトが認められる。集合的に、これら３つの発作試験から得られる結果は、全身投与後に低分子ペプチドを脳に対してよりアクセス可能にするためのアプローチを支持する実質的なデータを提供する。各々個々の発作試験の詳細を以下に概説する。
神経ペプチド類似体の投与。修飾ガラニン類似体の各々を、１０μｌハミルトン注射器により人工脳脊髄液５μｌ中で脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）に、または０．０１ｍｌ／ｇ体重の容量にて０．５％メチルセルロース中で腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与する。
聴原性発作。個々の修飾類似体が、ＡＧＳ感受性Ｆｒｉｎｇｓマウスモデルにおいて音によって誘発される発作を予防する能力をピーク効果時に評価することができる（Ｗｈｉｔｅら、１９９２）。この試験のために、個々のマウスを、オーディオ変換器（Ｍｏｄｅｌ ＡＳ−ＺＣ；ＦＥＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）を取り付けたプレキシガラスシリンダー（直径１５ｃｍ、高さ１８ｃｍ）に入れ、２０秒間送達される１１０デシベル（１１ＫＨｚ）の音刺激に曝露する。音誘発発作は、ワイルドランニングとそれに続く前肢および後肢の強直性伸展を伴う立直り反射の喪失によって特徴づけられる。後肢の強直性伸展を示さないマウスを保護されたとみなす。
ＭＥＳ試験。ＭＥＳ試験のために、角膜電極を設置する前に麻酔薬／電解質溶液（０．９％食塩水中の０．５％塩酸テトラカイン）１滴を各動物の眼に適用する。マウスＭＥＳ試験における電気刺激は、ＷｏｏｄｂｕｒｙとＤａｖｅｎｐｏｒｔ（ＷｏｏｄｂｕｒｙとＤａｖｅｎｐｏｒｔ、１９５２）によって最初に記述されたのと同様の装置によって０．２秒間送達される５０ｍＡである。発作の後肢強直性伸展けいれん成分の排除をエンドポイントとして使用する。
ｓ．ｃ．ＰＴＺ試験。ｓ．ｃ．ＰＴＺ試験のために、８５ｍｇ／ｋｇＰＴＺの用量を各マウスの背の皮膚の弛みひだにｓ．ｃ．投与する。マウスを個別のプレキシガラス観察箱に入れ、最小間代発作の存在に関して３０分間観察する。間代発作活動を示さないマウスを保護されたとみなす。
最小毒性試験。最小毒性は、回転棒法（ＤｕｎｈａｍとＭｉｙａ、１９５７）によりマウスにおいて同定される。マウスを、６ｒ．ｐ．ｍ．の速度で回転する１インチの刻み付き棒上に置いたとき、動物は長期間その平衡を維持することができる。動物が１分間に３回この回転棒から落下した場合、毒性であるとみなす。
中央有効用量（ＥＤ５０）または毒性用量（ＴＤ５０）の決定。全ての定量的インビボ抗痙攣／毒性試験は、あらかじめ定められたＴＰＥで実施する。少なくとも８匹のマウスの群を、１００％保護または最小毒性と０％保護または最小毒性の限界の間で少なくとも２つの点が確立されるまで、様々な用量のペプチドで試験する。各々の試験で動物の５０％において所望エンドポイントを生じるために必要な薬剤の用量（ＥＤ５０またはＴＤ５０）、９５％信頼区間、回帰直線の勾配、および勾配のＳ．Ｅ．Ｍ．を、Ｆｉｎｎｅｙ（Ｆｉｎｎｅｙ，１９７１）によって述べられた方法に基づくコンピュータプログラムによって算定する。
実施例３
ＧＡＬ−ＢＢＢ２は強力な疼痛緩和を有する
ａ）ホルマリン試験
０．５％ホルマリンの注射をマウス右後足の足底領域に実施する。これは、処置された足を嘗める（リッキング）マウスによって特徴づけられるはっきりと異なる二相性行動プロフィールを惹起する。注射直後に、マウスは約１０分間足を嘗める。これが第１相（急性期）であり、その後ほとんど行動活動がない短い潜伏期がある。第２相（炎症期）を構成する、約２０−３０分間の足嘗めのより長い期間が続く。
活性ペプチド、薬剤またはビヒクルの投与の前に、各々のマウスは、鏡の前に置いた、いくつかの高さ６インチのプレキシガラス観察チューブ（直径４インチ）の１つにおいて１５分間の順化期間を経験する。順化期間後、マウスをＧＡＬ−ＢＢＢ２、不活性天然フラグメントＧａｌ １−１６、またはガバペンチンのいずれかでｉ．ｐ．処置し、その後そのホームチューブにもどす。処置の１時間後、ホルマリンを右後足の足底表面に皮下注射した（２０μｌ；２７ゲージ針）。針のベベルを皮膚表面に向かって表面を下にして置く。ホルマリンの注射後、各動物を、合計４５分間にわたる各々５分の期間の最初の２分間観察する。各々２分の期間の足嘗めの累積長を測定した。必要容量のビヒクルを摂取した動物は、ＧＡＬ−ＢＢＢ２、Ｇａｌ １−１６またはガバペンチンを与えられた各々のマウスと順に交代させた。実験の終了後動物を安楽死させた。
さらなる実験では（以下の表）、ユニークな構造モチーフを有する２個の付加的なガラニン類似体（すなわちＮＡＸ３０６−３および３０６−４）が、炎症性疼痛のマウスホルマリンアッセイにおいて、ＮＡＸ５０５５と同様に強力であることが認められた。これらの所見は、活性薬理作用団が構造修飾を受け入れやすいことを示す。
Figure 2016074713
 曲線下面積（ＡＵＣ）の測定を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０３を用いて実施した。総ＡＵＣを急性期と炎症期の両方について試験群と対照群に関して算定する。各々の期に関して個々の動物のＡＵＣも算定し、対照の総ＡＵＣのパーセンテージに変換する。薬剤処置群と対照群の両方について平均パーセンテージとＳＥＭを算定し、有意差について検定した。
ｂ）坐骨神経の結紮
手術の直前に、長時間作用性アヘン製剤、ブプレノルフィン０．１−０．５ｍｇ／ｋｇでラットを皮下的に処置する。次にラットをペントバルビタールで麻酔し、麻酔深度をテイルピンチに対する応答および呼吸深度の観察によって観測する。手術全体を通じて無菌操作を使用した。
各々のラットの上大腿の毛をそり、エタノールとベタインでふき取った。坐骨神経が露出されるまで、皮膚およびその下にある上大腿の筋肉を通して小さく切開した。次に神経を周囲の結合組織から分離し、一対の微細な屈曲鉗子によってわずかに持ち上げた。次に、針とナイロン縫合糸（７．０）を神経に通すことによって神経の約１／３から１／２を結紮した。その後筋肉と皮膚の切開を５．０縫合糸で別々に縫合して閉じ、動物が麻酔から回復するまで、温度調節された電気毛布上に置いて動物を保温した。この手順を右側（同側）で実施し、左後脚（反対側）で擬似手術を行った。後者は、この側の坐骨神経を露出しただけで結紮しなかったことを除き、同様の手順を含む。手術後１２時間目に、手術手技からの不快を最小限に抑えるため、ブプレノルフィンの２回目の用量を投与した。ラットを感染または手術の有害作用の発現に関して毎日綿密に観測した。
回復のための適切な期間（例えば７−１４日間）後、動物を機械的異痛（非侵害刺激に対する疼痛応答）の発現に関して試験した。この試験のために、動物を、金網（１／４インチ）台上に置いた底のないプレキシガラス箱に入れた。３０−６０分間の順化期間後、基線機械刺激感受性を測定した。この手順は、一連の口径計測したフォン・フレイ（Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ）繊維を各々の後足の足底表面に垂直に適用し、繊維をわずかに屈曲させるのに十分な力をかけて約６秒間そこに保持することによって実施した。正の応答（足の引っ込め）が認められた後、より小さな直径の繊維を適用した。引っ込めについての５０％閾値が決定できるまでこの手順を反復した。
ＧＡＬ−ＢＢＢ２ ２ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．注射後（ｎ＝薬剤当たり８匹のラット）、試験化合物の作用期間を測定するため、注射の３０分後およびその後様々な時点で（例えば１、２、４および６時間目）機械的閾値を評価した。ＧＡＬ−ＢＢＢ２に関して得られた結果をモルヒネ２ｍｇ／ｋｇおよびガバペンチン４０ｍｇ／ｋｇで得られた結果と比較した。
ｃ）結果
多くの抗痙攣薬が疼痛の治療における効果を明らかにしている。それ故、ＧＡＬ−ＢＢＢ２を、鎮痛特性を有するかどうかを評価するためにマウスホルマリンモデルにおいて検査した。この試験において、ＧＡＬ−ＢＢＢ２は、動物が同側足を嘗めることに費やす時間の数量化によって評価したとき、ｓ．ｃ．足底ホルマリンに関連する疼痛を有意に低減することが認められた。図１６に示すように、ＧＡＬ−ＢＢＢ２（０．５２−５ｍｇ／ｋｇ）は、初期急性期ならびに持続的な炎症期の両方において足嘗めの用量依存的低減を生じさせた。これに対し、非修飾天然フラグメントＧａｌ １−１６は、試験したＧＡＬ−ＢＢＢ２の最高用量より４倍高い用量（すなわち２０ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．投与後、不活性であることが認められた。加えて、ＧＡＬ−ＢＢＢ２ ５ｍｇ／ｋｇ（図１６）は、ガバペンチンの１０ｍｇ／ｋｇ用量に等しいことが認められた（図１７）。
図１８に示すように、ＧＡＬ−ＢＢＢ２は、慢性疼痛の坐骨神経結紮モデルにおいて機械的異痛についての閾値の時間依存的な引き上げを示した。さらに、ＧＡＬ−ＢＢＢ２はこの試験においてモルヒネと等しい効力であり、ガバペンチンより数倍強力であった（図１８の挿入図）。
集合的に、これら２つの確立された疼痛モデルで得られた結果は、ＧＡＬ−ＢＢＢ２が慢性疼痛のげっ歯動物モデルにおいて強力な疼痛緩和を有することを示す。
実施例４
血液脳関門を透過するガラニン類似体
表１６は、本明細書で開示する組成物および方法に関して使用できるガラニン類似体を示す：
Figure 2016074713
Figure 2016074713
 親油性および塩基度は、特定の輸送体または担体を必要とせずにＢＢＢを通るペプチドの透過性上昇に寄与する。ペプチドの親油性（ｌｏｇＰ値によって測定される）は、疎水性部分（例えばリポアミノ酸）の結合体化、または芳香族残基のハロゲン化によって変化させ得る。塩基度に関して、Ｐｏｄｕｓｌｏのグループは、ポリアミン修飾タンパク質およびペプチドがＢＢＢをより効率的に通過することを示した（ＰｏｄｕｓｌｏとＣｕｒｒａｎ １９９６；ＰｏｄｕｓｌｏとＣｕｒｒａｎ １９９６；Ｐｏｄｕｓｌｏ，Ｃｕｒｒａｎら、１９９８；Ｐｏｄｕｓｌｏ，Ｃｕｒｒａｎら、１９９９）。Ｔａｍａｉと共同研究者たち（Ｔａｍａｉ，Ｓａｉら、１９９７）は、低分子ペプチドの高い塩基度が吸着媒介性エンドサイトーシス（ＡＭＥ）によるＢＢＢ通過輸送の重要な決定因子であることの証拠を提供した。
グリコシル化は、全身的に活性なオピオイドペプチドを生産するための非常に効率的なアプローチであると思われた（Ｅｌｍａｇｂａｒｉ，Ｅｇｌｅｔｏｎら、２００４；Ｐｏｌｔ，Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎら、２００５）。ＳＡＲ試験は、糖の構造が活性の重要な決定因子であることを示したが、単糖は一般に二糖よりも有効でなかった。β−メリビオースまたはβ−ラクトースによるＯ−グリコシル化セリンは、強力な鎮痛化合物を生成する最も有効な修飾の１つであった。
てんかんおよびてんかん原性におけるガラニンおよびその受容体の役割。神経ペプチドは古典的神経伝達物質および神経興奮性の強力な調節剤である（Ｈｏｋｆｅｌｔ，Ｂｒｏｂｅｒｇｅｒら、２０００）。選択神経集団における古典的神経伝達物質と神経ペプチドの共存は、神経興奮性がペプチド作動性伝達の改変を通して調節され得ることを示唆する（ＢａｒａｂａｎとＴａｌｌｅｎｔ ２００４）。周囲条件下で、ペプチドは「サイレント」であり、通常の神経伝達にほとんど作用を及ぼさない。これに対し、過度に高い神経発火（発作焦点において起こるような）の条件下では、神経ペプチドが放出され、神経伝達への調節作用を及ぼす。
ガラニンは脳において多数の作用を生じさせる（Ｈｏｋｆｅｌｔ，Ｘｕら、１９９８；Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｅｌｍｑｕｉｓｔら、２００５）。現在までに同定された３つのガラニン受容体サブタイプはＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のスーパーファミリーに属する（Ｂｒａｎｃｈｅｋ，Ｓｍｉｔｈら、２０００；Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｅｌｍｑｕｉｓｔら、２００５）。ガラニン１型受容体（ＧａｌＲ１）は多くの脳領域に存在するが、海馬において最も高い発現を示す（Ｂｕｒｇｅｖｉｎ，Ｌｏｑｕｅｔら、１９９５）。ガラニン２型受容体（ＧａｌＲ２）はＧａｌＲ１と同程度に広く分布する。脳では、視床下部、海馬（歯状回＞ＣＡ３＞ＣＡ１）、扁桃、梨状皮質、前脳基底部（内側中隔／対角帯）、小脳、および脳幹において発現される。ガラニン３型受容体（ＧａｌＲ３）は、脳では非常に限られた発現を示す。海馬、内側網様体および対角帯において最も豊富であり、海馬には存在しない。
Ｍａｚａｒａｔｉと共同研究者たち（Ｍａｚａｒａｔｉ，Ｈａｌａｓｚｉら、１９９２）の先駆的研究以来、ガラニンが強力な抗痙攣性ペプチドであることの証拠は増え続けてきた。ガラニン受容体アゴニストの急性投与または海馬におけるガラニンのウイルス媒介性過剰発現は、ラットおよびマウスにおける辺縁系てんかん重積持続状態、ペンチレンテトラゾールおよびピクロトキシン発作を抑制することが認められた（Ｍａｚａｒａｔｉ，Ｈａｌａｓｚｉら、１９９２；Ｍａｚａｒａｔｉ，Ｌｉｕら、１９９８；Ｓａａｒ，Ｍａｚａｒａｔｉら、２００２；Ｈａｂｅｒｍａｎ，Ｓａｍｕｌｓｋｉら、２００３；Ｌｉｎ，Ｒｉｃｈｉｃｈｉら、２００３；Ｂａｒｔｆａｉ，Ｌｕら、２００４）。さらに、ガラニンを過剰発現するトランスジェニック動物の発作閾値がてんかん重積状態およびキンドリングモデルにおいて上昇する（Ｍａｚａｒａｔｉ，Ｈｏｈｍａｎｎら、２０００；Ｋｏｋａｉａ，Ｈｏｌｍｂｅｒｇら、２００１；Ｓｃｈｌｉｆｋｅ，Ｋｕｔｅｅｖａら、２００６）。
インビトロで、ガラニンは海馬からのグルタミン酸放出を阻害する（Ｚｉｎｉ，Ｒｏｉｓｉｎら、１９９３；Ｍａｚａｒａｔｉ，Ｈｏｈｍａｎｎら、２０００）。ＧａｌＲ２ペプチド核酸アンチセンスで処置したＧａｌＲ１ノックアウトマウスおよびラットに関する試験から得られた結果は、ガラニンがＧａｌＲ１とＧａｌＲ２の両方における作用を通してその抗痙攣作用を及ぼすことを示唆する（Ｍａｚａｒａｔｉ，Ｌｕら、２００４；Ｍａｚａｒａｔｉ，Ｌｕら、２００４）。さらに、ＧａｌＲ２は、海馬ニューロンにおけるガラニンの神経保護作用において重要な役割を果たすと思われる（Ｈａｂｅｒｍａｎら、２００３；Ｍａｚａｒａｔｉら、２００４ａ；Ｐｉｒｏｎｄｉら、２００５；Ｅｌｌｉｏｔ−Ｈｕｎｔら、２００４；Ｌｅｅら、２００５；Ｈｗａｎｇら、２００４）。
ガラニンが、急性発作の発現を予防するおよび様々な発作後のてんかんの発症を変化させる上で有効であることが強調されるべきである。例えばいくつかの報告は、ガラニンが辺縁系発作に関連する損傷を改変し得る、あるいはてんかんの発症を遅延または予防し得る（すなわち抗てんかん原性）ことを示した。Ｋｏｋａｉａら（Ｋｏｋａｉａ，Ｈｏｌｍｂｅｒｇら、２００１）は、ガラニンペプチド過剰発現マウスにおけるキンドリング遅延を報告した。急速キンドリングのモデルにおける最近の試験からの結果は、Ｇｉ／ｏタンパク質に共役した海馬ＧａｌＲ２はＧＩＲＫとは無関係に抗てんかん原性作用を及ぼし、一方ＧａｌＲ１はＧＩＲＫ活性化によってキンドリングの獲得を遅延させることを示している（Ｍａｚａｒａｔｉ，Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍら、２００６）。
ガラニンおよびガラニン受容体リガンドにおける構造−活性関係（ＳＡＲ）。ガラニンは１９８３年に最初に発見された（Ｔａｔｅｍｏｔｏ，Ｒｏｋａｅｕｓら、１９８３）。以下の配列を有する２９−３０アミノ酸長のペプチドである：
Figure 2016074713
 最初のＮ末端の１４残基（陰を付けている）は、種々の動物種からのガラニンの間で高度に保存されている（ＬａｎｇｅｌとＢａｒｔｆａｉ １９９８）。ガラニンの構造−活性関係は広汎に検討されているので、我々は本特許申請出願に関連するＳＡＲ結果だけを総説する。最初の１５残基（類似体ＧＡＬ（１−１５））または１６残基（類似体ＧＡＬ（１−１６））から成る、ＧＡＬのＮ末端フラグメントは、ガラニン受容体に対して高い親和性を維持することが示された（Ｆｉｓｏｎｅ，Ｂｅｒｔｈｏｌｄら、１９８９；Ｌａｎｄ，Ｌａｎｇｅｌら、１９９１）。以下の表に示すように、ＧＡＬ（１−１６）の体系的切断は、その受容体に対する親和性の漸減を生じさせる（Ｌａｎｄ，Ｌａｎｇｅｌら、１９９１）。
表１７ ガラニン受容体に対するその親和性へのＧＡＬ（１−１６）フラグメントの切断の作用
Figure 2016074713
 同じ試験において、著者達は、Ｇｌｙ１、Ｔｒｐ２、Ａｓｎ５、Ｔｙｒ９およびＧｌｙ１２残基がガラニン受容体へのＧＡＬ（１−１６）類似体の高親和性結合にとって重要であることを明らかにした。ＧＡＬ（１−１６）のアラニン歩行類似体（ａｌａｎｉｎｅ−ｗａｌｋ ａｎａｌｏｇｓ）は、これらの残基の置換がＧａｌＲ１ではなくＧａｌＲ２に対するそれらの親和性に影響を及ぼすことを指示した（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９９）。アラニンシェービング（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｈａｖｉｎｇ）アプローチは、Ｔｙｒ９からＨｉｓ１４にわたる配列がガラニン受容体の認識のために決定的に重要であることを明らかにした（Ｊｕｒｅｕｓ，Ｌａｎｇｅｌら、１９９７）。
ＧＡＬ（１−１６）類似体の非常に広汎なＳＡＲ試験が（Ｐｏｏｇａ，Ｊｕｒｅｕｓら、１９９８）によって記述された。Ｇｌｙ１またはＴｒｐ２の修飾は、ガラニン受容体に対する親和性の有意の喪失を生じさせた。大きさが異なる種々の基に共役したＬｙｓ１４ε−ＮＨ基を有するＧＡＬ（１−１３）の類似体は全て、高い親和性を保持した。これらの結果に基づき、ＧＡＬ（１−１３）のＣ末端部分は、結合特性を損なわずに比較的かさの高い基を収容することができる。要するに、ガラニンおよびそのトランケート型類似体のＳＡＲは、Ｔｒｐ２、Ａｓｎ５およびＴｙｒ９がガラニンとＧａｌＲ１およびＧａｒＲ２受容体の間の相互作用を保護するための鍵となる残基であることを指示する。突然変異誘発およびモデリング試験は、Ｔｒｐ２がｈＧａｌＲ１のＰｈｅ２８２と相互作用し、一方Ｔｙｒ９はＨｉｓ２６４と相互作用することを示す（Ｋａｓｋら、１９９６；Ｂｅｒｔｈｏｌｄら、１９９７；Ｃｈｕｒｃｈら、２００２）。
広汎な構造−活性関係試験の結果として、アゴニストおよびアンタゴニストの両方の、多くのペプチドベースのガラニン類似体が合成され、機能的に特性決定された。選択したガラニン受容体リガンドの結合特性を表１８に示す。
表１８ 選択したガラニン受容体リガンドおよび種々のガラニン受容体サブタイプへのそれらの結合特性。
Figure 2016074713
 ａＫＤ値は、（Ｂｒａｎｃｈｅｋ，Ｓｍｉｔｈら、２０００；Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｅｌｍｑｕｉｓｔら、２００５；Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｓｏｌｌｅｎｂｅｒｇら、２００５；Ｓｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍら、２００６）から収集した。ガルノンおよびガルミックは、ＣＮＳにおけるガラニン受容体の作用を検討するための非常に有用な薬理学的ツールとなってきた２個の非ペプチドガラニン受容体アゴニストである（Ｓａａｒ，Ｍａｚａｒａｔｉら、２００２；Ｂａｒｔｆａｉ，Ｌｕら、２００４；Ｂａｄｉｅ−Ｍａｈｄａｖｉ，Ｂｅｈｒｅｎｓら、２００５；Ｌｕ，Ｂａｒｒら、２００５；Ｓｃｈｌｉｆｋｅ，Ｋｕｔｅｅｖａら、２００６）。しかし、最近以下のように述べられた：「ガルノンおよびガルミックの欠点は、それらが低親和性（マイクロモルの親和性）であり、受容体サブタイプ非選択的であり、他の薬理学的に重要な標的と相互作用することである．．．」（Ｌｕ，Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍら、２００５）。
ＢＢＢを透過するガラニン類似体、ＮＡＸ５０５５の合理的設計と化学合成。本明細書で開示するように、ガラニンは３０アミノ酸の神経ペプチドであり、Ｎ末端フラグメントＧＡＬ（１−１６）が、海馬ガラニン受容体においてまだ極めて強力なアゴニストであることが明らかにされた（Ｆｉｓｏｎｅ，Ｂｅｒｔｈｏｌｄら、１９８９）。現在までに得られた結果は、代謝安定性を高め、ＢＢＢの透過性を改善するように修飾されたトランケート型ＧＡＬ（１−１６）類似体（図３１）に関するものであった。
使用可能な構造−活性関係データに基づき、その代謝安定性およびＢＢＢの透過性を改善するために以下の修飾をＧＡＬ（１−１６）類似体に導入した：（１）Ｇｌｙ１残基をサルコシンによって置換した。Ｇｌｙ１のＮ−メチル化はガラニン受容体の親和性に影響を及ぼさない（Ｒｉｖｅｒａ Ｂａｅｚａ，Ｋａｓｋら、１９９４）。さらに、アミノペプチダーゼＮは神経ペプチドを分解することが公知であり、それ故Ｎ末端アミノ基のキャッピングは、サルコシン含有類次体の代謝分解の速度を低下させる可能性が高い；（２）Ｈｉｓ１４およびＡｌａ１５をＬｙｓ残基によって置換した。アミド化Ｌｙｓ残基をＣ末端に付加した。これらの付加的な正電荷は、吸着媒介性エンドサイトーシスを介したＢＢＢ透過性を上昇させる（Ｔａｍａｉ， Ｓａｉら １９９７）；（３）Ｖａｌ１６をリシン−パルミトイル（Ｌｙｓ−ｐａｌｍ）残基によって置換した。この長い疎水性は、受動拡散を上昇させ、代謝分解に対する付加的な抵抗性を与えることができる（Ｙｕａｎ，Ｗａｎｇら、２００５）。ＮＡＸ ５０５５は、標準Ｆｍｏｃプロトコルと自動ペプチドシンセサイザーを使用して固体支持体上で化学合成した。
ＮＡＸ ５０５５の薬理学的性質。現在までに、ＮＡＸ ５０５５は放射性リガンド結合アッセイおよび一連のインビボ急性発作試験において評価されている。これらの試験から得られた結果は、本明細書で開示するアプローチが、ＢＢＢを透過する強力な高親和性ガラニン受容体調節剤を生じ得ることを示す。
ＮＡＸ ５０５５はＧａｌＲ１およびＧａｌＲ２に対する高親和性を保持する。ヒトｈＧａｌＲ１およびｈＧａｌＲ２に対するＮＡＸ ５０５５の親和性は、ＭＤＳ−ＰＳ契約スクリーニング会社によって実施された予備的放射性リガンド結合試験によって確認された（報告書番号１０７７５６１、参照：ＭＤＳＰＳ ２３１５１０および２３１６００）。この試験では、ｈＧａｌＲ１はＨＥＫ−２９３細胞において発現され、一方ｈＧａｌＲ２はＣＨＯ−Ｋ１細胞で発現され、ヒト［１２５Ｉ］ガラニンが放射性リガンドとして使用された。ＮＡＸ ５０５５は両方のサブタイプに対して高い親和性を保持し、ｈＧａｌＲ１についての推定Ｋｉは９ｎＭ、ｈＧａｌＲ２については６ｎＭであった。
ＮＡＸ ５０５５は全身投与後に強力な抗痙攣活性を示す。ＮＡＸ ５０５５を最初に、４ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．投与後に反射性てんかんのＦｒｉｎｇｓ聴原性発作（ＡＧＳ）感受性マウスモデルにおいて試験した。投与後様々な時点で（すなわち１５、３０、６０、１２０および２４０分目）、各々のマウスを、オーディオ変換器を取り付けた円筒状試験チェンバーに入れ、強力な音刺激（１１０ｄＢ、１１ＫＨｚ、２０秒間）で攻撃誘発した。
強直性後肢伸展を示さない動物を保護されたとみなした。図２４に示すように、この実験から得られた結果は、ＮＡＸ ５０５５が、開始が迅速で（３０分以内）、期間は中程度（２−４時間の間）の時間依存的抗痙攣作用を示すことを明らかにする。その後の用量反応試験では、ピーク効果時（すなわち１時間目）に抗痙攣効果を定量した。用量反応データのＰｒｏｂｉｔ分析から得た算定中央有効用量（すなわちＥＤ５０）および９５％信頼区間は、３．２（２．３−６．１）ｍｇ／ｋｇであった。ｉ．ｐ．投与の１時間後に試験したとき、ＮＡＸ ５０５５（４ｍｇ／ｋｇ）はＦｒｉｎｇｓマウスにおいて音誘発性発作をブロックする上で有効であったが、天然ＧＡＬ（１−１６）フラグメント（２０ｍｇ／ｋｇ）は有効でなかった。
ＮＡＸ ５０５５を２つの広く確立された発作モデルでも試験した：すなわち最大電気ショック発作（全身性強直・間代てんかんのモデル）およびｓ．ｃ．メトラゾール発作試験（全身性ミオクローヌスてんかんのモデル）。この試験のために、ＮＡＸ ５０５５ ４ｍｇ／ｋｇをｉ．ｐ．投与し、１時間後にマウスを強直性伸展（最大電気ショック）および間代（ｓ．ｃ．メトラゾール）発作に対する保護に関して試験した。ＮＡＸ ５０５５は、ｓ．ｃ．メトラゾール発作試験において最小限に活性であり（２５％保護）、最大電気ショック発作試験では完全に不活性であった（結果は示していない）。これらの結果は臨床効果の見地からは陰性と解釈され得るが、これまでに記述されているＮＡＸ ５０５５のプロフィールは、ヒト部分発作の治療のために２０００年に導入された新規抗てんかん薬、レベルチラセタムのものと実質的に同じである。
そこで、ＮＡＸ ５０５５の抗痙攣プロフィールを拡大する試みとして、我々はＮＡＸ
５０５５をもう１つのレベチラセタム感受性急性発作モデル、すなわち６Ｈｚ精神運動試験においても評価した。６Ｈｚ発作試験は、難治性部分てんかんの治療のために有用であり得る潜在的抗痙攣性化合物を識別するためのユニークなモデルとして発達しつつある（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋｌｅｉｎら、２００１；Ｗｈｉｔｅ ２００３）。ＮＡＸ ５０５５は、ｉ．ｐ．投与後、薬物抵抗性てんかんのこのモデルにおいて非常に強力である（表１９）。レベチラセタム、さらにはバルプロ酸と異なり、ＮＡＸ ５０５５の効力は、刺激強度を２２ｍＡから４４ｍＡに上昇させたときも保持される。それ故ＮＡＸ ５０５５は、評価した３つの電流強度全てにおいて非常に強力なままであるという点で、６Ｈｚ試験で試験した抗痙攣薬の中で比較的ユニークである。これに対し、その他の薬剤の効力は、刺激強度を２２ｍＡから４４ｍＡに上昇させたとき低下する。ＮＡＸ ５０５５を、その後、皮下（ｓ．ｃ．）投与後にマウス６Ｈｚ辺縁系発作モデルで試験した。興味深いことに、活性はｓ．ｃ．投与後も保存される（図２６）。ｓ．ｃ．投与後にＮＡＸのＥＤ５０のごくわずかな右側へのシフトが生じたという所見は、ＮＡＸ ５０５５が良好なバイオアベイラビリティーを有することを示す。
天然ペプチドフラグメントが、脳にアクセスできるとき活性であることを確認するために、ＮＡＸ ５０５５とＧＡＬ（１−１６）の両方を脳室腔に直接投与するその後の試験を実施した。この脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）試験から得られた結果を図２２に要約する。図２２に示すように、両方の類似体がｉ．ｃ．ｖ．投与後非常に強力であった（すなわちＮＡＸ ５０５５およびＧＡＬ（１−１６）について、それぞれＥＤ５０：０．０７および１．７ｎｍｏｌ）。ＮＡＸ ５０５５が、実際上天然ペプチドフラグメントＧＡＬ（１−１６）よりも強力および有効であり得ることは興味深い。
Figure 2016074713
 ＮＡＸ ５０５５類似体の構造−活性関係。全身投与後のその活性の構造的決定因子をよりよく理解するためにＳＡＲ試験を実施した。最初に、Ｃ末端における個々の化学修飾が両方の修飾の組合せと比較して匹敵する作用を生じさせ得るかどうかを試験した。以下に示すように、個々の修飾のいずれもが、ＮＡＸ ５０５５と比較したとき、長時間持続性の強力な抗痙攣活性を有していなかった。類似体１１０５−２は、より低い効力（５０５５についての０．８ｍｇ／ｋｇと比較して、ＥＤ５０＝３．８ｍｇ／ｋｇ）、より短い作用期間、および５０５５では認められない毒性（運動障害）を示した。Ｌｙｓ−ｐａｌｍ残基の存在は、観察可能な抗痙攣活性を生じさせるには不十分であった。これらの結果は、両方の修飾の組合せが５０５５類似体の薬理学的性質のために非常に重要であることを強く示唆した。
Figure 2016074713
 注：ＮＡＸ ５０５５を含む全ての類似体はＣ末端でアミド化されている。
第２に、Ｃ末端のＬｙｓ残基の役割を、ＬｙｓをＤＬｙｓまたはＡｒｇで置換することによって、またはＬｙｓ残基の数を変えることによって検討した。ＡｒｇでＬｙｓを置換することは、類似体の活性をわずかだけ変化させた。Ｌｙｓをその異性体ＤＬｙｓで置換すると、匹敵する効力（ＥＤ５０＝１．２ｍｇ／ｋｇ）を有するより長時間持続性の類似体（１２０５−２）をもたらした。２個の付加的なＬｙｓ残基によるＧｌｙ１２−Ｐｒｏ１３の置換は、抗痙攣活性を維持したが、同時に毒性も生じさせた。これらの実験からの結果を以下の表２１に要約する：
Figure 2016074713
 次に、ＮＡＸ ５０５５の中心トランケーションの機能的影響を測定した。表２２に示すように、「Ｇ１２、Ｐ１３」または「Ｌ１０、Ｌ１１、Ｇ１２、Ｐ１３」のトランケーションは、ガラニン受容体に対する親和性を少なくとも２桁分低下させた。５０５５類似体（類似体１２０５−５および３０６−３）の体系的中心トランケーションは、６Ｈｚモデルにおいてごくわずかに低い効力（５０５５類似体の０．８ｍｇ／ｋｇと比較して、両方の類似体についてＥＤ５０＝２．７ｍｇ／ｋｇ）およびより短い作用時間を生じさせた。
Figure 2016074713
 ６−アミノヘキサン酸などの骨格スペーサーの導入も、ガラニンフラグメントの間で検討し、ＫＫＫｐＫモチーフは類似体の抗痙攣活性に影響を及ぼすと考えられた。類似体３０６−２および３０６−４はその抗痙攣活性を維持した（３０６−４に関してＥＤ５０＝２．９５ｍｇ／ｋｇ）。興味深いことに、３０６−４類似体は、２．９５ｍｇ／ｋｇ用量（６ＨｚモデルでのＥＤ５０）で、マウスにおける炎症疼痛アッセイの第二応答期に非常に活性であると思われ、その抗痙攣および抗侵害受容活性の効力は直接相関しないと考えられることを示唆した。
Figure 2016074713
 最後に、Ｎ末端サルコシン残基を欠失している５０５５類似体の活性を検討した（類似体１２０５−１：ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ）。この類似体は、ＡＲ−Ｍ１８９６としても知られる、ガラニンアゴニスト類似体Ｇａｌ（２−１１）に基づいて設計した：最初の残基の除去はＧａｌＲ１サブタイプに対する類似体の親和性を低下させるという仮説であったが、ＧａｌＲ２に対する高親和性を維持した（表２１のＧａｌ（２−１１）類似体についての結合データ参照）。１２０５−１類似体は、６Ｈｚ辺縁系発作モデルにおいて低い効力を有していた（ＥＤ５０＝５．７ｍｇ／ｋｇ）。
要約すると、ＳＡＲの結果は、カチオン化と脂質付加の組合せが個々の化学修飾を上回ることを示す。
ａ）ＢＢＢを透過するガラニン類似体の設計と化学合成
現在のＳＡＲ結果に基づき、化学修飾の組合せを含む類似体の合成と特性決定を実施する。カチオン化のための新しい戦略を用いる：スペルミンなどのポリアミンベースの化合物、またはリポポリアミン複合体を使用する。ペプチドのグリコシル化はＢＢＢ透過を改善するための広く確立された戦略であるので、グリコシル化ガラニン類似体を使用する。
カチオン化。正に荷電したＬｙｓ残基およびＬｙｓ−ｐａｌｍとのそれらの組合せは、ＣＮＳへの類似体の送達を改善することができる。これらの比較的保存的な類似体の例を表２４に示す。
表２４ ＫＫＫｐＫモチーフの修飾を有する類似体。全ての類似体はＣ末端でアミド化されている。
Figure 2016074713
 カチオン化はＢＢＢを通るガラニン類似体の透過のために重要であるので、ポリアミンを含むガラニン類似体を検討する。スペルミンを含む類似体を検討することの理論的根拠は、いくつかのＬｙｓ残基（ＮＡＸ ５０５５中に存在する）を、いくつかのアミン基を担持するが、ペプチド結合を欠く１個の分子（タンパク質分解に対する低い感受性および水素結合供与体／受容体の欠如）で置換することである。スペルミンが骨格の一部であるかまたは側鎖であるいくつかのガラニン類似体を合成する。表２５は、ガラニン−スペルミン類似体についての構造と理論的根拠を要約する。
表２５ スペルミンを骨格スペーサーとしてまたは側鎖として含むＮＡＸ ５０５５類似体。スペルミンＳは、１，５，１０，１４−テトラ−アザクアトロデカン−Ｎ４−スクシンアミド酸である。全ての類似体はＣ末端でアミド化されている。
Figure 2016074713
 脂質付加。次のセットの類似体（表２６）では、類似体のＢＢＢ透過への１６位における脂質付加の影響を検討する。
表２６。１６位において修飾を有する類似体。全ての類似体はＣ末端でアミド化されている。
Figure 2016074713
 グリコシル化。１６位にα−マンノシルまたはβ−メリビオースセリン残基を含む２個のグリコシル化ガラニン類似体を最初に合成する。そこで、これらの類似体において、Ｌｙｓ−ｐａｌｍ残基を糖部分で置換する。
表２７ グリコシル化ガラニン類似体。全ての類似体はＣ末端でアミド化されている。
Figure 2016074713
 骨格スペーサー。ＮＡＸ ５０５５に基づく類似体の抗痙攣活性への骨格スペーサーの影響を検討する。ペプチド骨格の部分を非ペプチドベースのスペーサーで置換することの主な利点は以下の通りである：（１）ＢＢＢ透過性を改善するはずである分子サイズの低減、（２）タンパク質分解の感受性の低減、および（３）水素結合供与体／受容体の欠如。これらの類似体の例を表２８に示す。
表２８ 伸長グリシン骨格スペーサーを含むＮＡＸ ５０５５類似体。全ての類似体はＣ末端でアミド化されている。
Figure 2016074713
 類似体の化学合成。全ての類似体は、Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）プロトコルおよび自動ペプチドシンセサイザーを使用して合成する。Ｆｍｏｃ保護された骨格スペーサー、グリコアミノ酸、スペルミン、スペルミン−スクシンアミド酸またはスペルミン−パルミトイルを含む、ＳＰＰＳのための全ての構築ブロックが市販されている（Ｓｕｓｓｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＮｅｏＭＰＳ，Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ）。カップリング方法は、先に述べられているように（ＦｉｅｌｄｓとＮｏｂｌｅ １９９０；Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ ２０００）実施する。スペルミンまたはその誘導体が１６位で結合されている類似体については、類似体は、γ−２−フェニルイソプロピルエステル（０−２−ＰｈｉＰｒ）で保護されたグルタミン酸が組み込まれている。側鎖カルボキシルを、ジクロロメタン中１％ＴＦＡを用いて樹脂上で脱保護する。スペルミンまたはそのパルミトイル誘導体（他のアミノ基条でＦｍｏｃ／Ｂｏｃ保護されている）のカップリングは、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を使用して実施する。ペプチドを固体支持体から取り出し、洗浄して、ＭＴＢＥで沈殿させる。ジフェニル分取逆相ＨＰＬＣを用いて類似体を精製する。９０％アセトニトリル／１０％水／０．１％ＴＦＡの、２０％から９０％までのアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ中）による１５分間の直線勾配を溶出のために使用する。２８０ｎｍでモル吸収係数７，０００（１ Ｔｐｒ ５，６００および１ Ｔｙｒ １，４００）を使用して類似体を定量する。これらの手順は、ＮＡＸ ５０５５および同様の類似体を調製するために有効であり、個々のバッチは１０−５０ｍｇの範囲であった。
ｂ）ＢＢＢを通過するガラニン類似体のインビトロでの特性決定
合成ガラニン類似体の生物活性を特性決定するため、ＧａｌＲ１およびＧａｌＲ２受容体の結合定数を測定する。３つの主要な目的は以下の通りであった：（１）ＧＡＬ（１−１６）に導入された化学修飾がガラニン受容体に対する親和性をどのように変化させるかを評価すること、（２）ガラニン類似体についての選択性プロフィールを測定すること、および（３）ＢＢＢを透過する高親和性ガラニン類似体の信頼し得るスクリーニングアッセイを開発すること。ＮＡＸ ５０５５はＧａｌＲ１およびＧａｌＲ２の両方に対して低いナノモル親和性を保持することが示された。
ユーロピウム標識ガラニンによる蛍光ベースの結合アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒからのＤｅｌｆｉａアッセイ）が使用できる。（Ｖａｌｅｎｚａｎｏ，Ｍｉｌｌｅｒら、２０００）によって以前に記述されたこのアッセイは、有効性確認されており、これまでに合成された全ての類似体の結合特性を決定するために使用される。より伝統的に使用される放射性リガンド結合アッセイと比べて蛍光ベースの結合アッセイの主たる利点は、放射能の難点（健康面、廃棄処理、短い保存期間、獲得シグナルの長い持続期間）を回避し、そのようなアッセイを中および高スループットスクリーニングのためにより使いやすいものにすることである。ランタニドで受容体リガンドを標識することは、それらの長い蛍光寿命の故に高い感受性という利点を提供する。遅延時間４００マイクロ秒で時間分解蛍光検出を使用して、単一ウエルにおいて１フェムトモル未満のユーロピウムが検出できる。
２つのガラニン受容体を膜製剤の形態でＰｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒまたはＭｕｌｔｉｓｐａｎ，Ｉｎｃ．から入手する。ユーロピウム標識ガラニン（Ｅｕ−ガラニン）をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから購入する。結合緩衝液（低張緩衝液中のＥＤＴＡ、ＢＳＡ、ＰＥＧ）６０μｌ容量中の膜タンパク質１０μｇ（濃度）に関して結合反応を実施する。０．０１−１０ｎＭのリガンド濃度の一連のＥｕ−ガラニンに関して飽和結合曲線を作成する。結合定数を決定するため、０．２ｎＭ Ｅｕ−ガラニンを膜と共に２時間インキュベートする。真空箱を用いてＡｃｒｏＷｅｌｌフィルタープレートで迅速にろ過して反応を終了させ、低張緩衝液３００ｍＬで３回洗浄する。増強試薬を各々のウエルに添加し、ＴＦＲと共にＶｉｃｔｏｒ３分光蛍光計でＴＲＦシグナルを記録する。
ｃ）ＢＢＢを通過するガラニン類似体のインビボでの特性決定
てんかんの薬物抵抗性モデルにおけるガラニンベースの神経ペプチドの抗痙攣活性およびそれらの抗てんかん原性特性。
薬物抵抗性部分てんかんの６Ｈｚ辺縁系発作モデルにおいて選択類似体を特性決定する。薬物抵抗性てんかんのこのモデルにおける類似体の効力を、ｉ．ｐ．投与後に用量反応曲線を作成することによって判定する。全ての化合物を、ｉ．ｐ．または０．９％ＮａＣｌ中０．０１ｍｌ／ｇ体重の容量で投与する。６Ｈｚ発作試験における急性効果試験に加えて、部分てんかんのマウス角膜キンドリングモデルにおいてキンドリング獲得を予防するＮＡＸ ５０５５および他のガラニン類似体の能力を分析する（ＭａｔａｇｎｅとＫｌｉｔｇａａｒｄ １９９８）。
抗痙攣性試験。６Ｈｚ角膜刺激（３秒間）によって誘発される発作を予防する各類似体の能力を３つの異なる刺激強度（すなわち２２、３２および４４ｍＡ）で評価する。６Ｈｚ発作は、ごくわずかなクローヌス期とそれに続く、最初は部分発作を有するヒト患者の前兆に類似すると述べられた定型化した自動性行動によって特徴づけられる（Ｔｏｍａｎ，Ｅｖｅｒｅｔｔら、１９５２；Ｂａｒｔｏｎ，Ｋｌｅｉｎら、２００１）。この行動を示さない動物を保護されたとみなす。上述したように、６Ｈｚ発作は、電流が２２ｍＡから４４ｍＡに増大すると共に抗てんかん薬によるブロックに対してより抵抗性となる。６Ｈｚ発作試験における各々の類似体の活性を、（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋｌｅｉｎら、２００１）によって述べられた方法に従ってｉ．ｐ．投与後のピーク効果時に定量する。この試験のために、角膜電極を設置する前に麻酔薬／電解質溶液（０．９％食塩水中の０．５％塩酸テトラカイン）１滴を各動物の眼に適用する。ピーク効果時間試験のために、合計２０匹のＣＦ−１マウスを用いる。４匹のマウスの群を様々な時点で（すなわち０．２５、０．５、１、２および４時間目）試験する。用量反応試験のために、少なくとも８匹のマウスの群を、１００％効果と０％効果の限界の間で少なくとも２つの点が確立されるまで、様々な用量の候補ペプチドで試験する。曝露された動物の５０％において中央有効用量を生じさせるために必要な薬剤の用量（すなわちＥＤ５０）、９５％信頼区間、回帰直線の勾配、および勾配のＳ．Ｅ．Ｍ．を、Ｆｉｎｎｅｙ（Ｆｉｎｎｅｙ，１９７１；Ｆｉｎｎｅｙ，１９７１）によって述べられた方法に基づくコンピュータプログラムによって算定する。
角膜キンドリングの獲得。ＮＡＸ ５０５５および選択数の他のガラニン類似体を、（ＭａｔａｇｎｅとＫｌｉｔｇａａｒｄ １９９８）によって述べられたマウス角膜キンドリングモデルにおいてキンドリングの獲得を予防するそれらの能力に関して評価する。角膜を通しての毎日の電気刺激は１５−２０日以内に安定なキンドリング状態を生じさせる。これは、必要とされるペプチドの量がラットキンドリング試験のために必要な量よりもはるかに低いので、キンドリング獲得を予防する選択ガラニン類似体の能力を最初に評価するための理想的モデルである。キンドリングの獲得を予防する上で有効と認められた化合物を、その後、より伝統的なラットキンドリングモデル；すなわち扁桃キンドリングラットにおいて評価する。提案する試験のために、２つの群のマウス（各群当たりｎ＝８匹のマウス）を、各キンドリング刺激の前にビヒクルまたはペプチドのいずれかを摂取するように無作為に割り当てる。各々のペプチドを、６Ｈｚ（４４ｍＡ）発作の予防のためにＥＤ５０に近い用量でｉ．ｐ．投与する。ピーク効果時に（６Ｈｚ試験から得られる）、痙攣を誘発しない電流（５０Ｈｚ、３ｍＡ、３．０秒間）で角膜電極を通して動物を刺激し、発作活動の存在または不在に関して観察する。発作活動を、Ｒａｃｉｎｅら（１９７２）によって確立された判定基準に従って評点づける。動物は、最初の段階５の行動発作を示すまでは１日２回の刺激、およびその後は安定な二次性全般発作（５回の連続する段階４−５の発作）を示すまで１日１回の刺激を受ける。対照マウスが完全にキンドリング状態になる時点まで実験群におけるペプチド処置を継続する。この時点で、両方の群のマウスに１週間の無刺激および無処置の期間を与える。８日目に、両群のマウスをペプチドまたはビヒクルなしで刺激し、それらの発作スコアを記録する。
ビヒクル処置群のマウスは、丸２週間の刺激の終了時までに完全なキンドリング状態に達し得る（図３２および３３）。さらに、ｉ．ｃ．ｖ．ガラニンがキンドリングの発現を予防することがこれまでに認められていること（Ｍａｚａｒａｔｉ，Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍら、２００６）を考慮すると、実験群のマウスはキンドリングを形成しないかまたはビヒクル処置マウスよりも遅い速度でキンドリングを形成する。それ故、能動的キンドリング試験の最終日の発作スコアは１以下であり得、ウォッシュアウト期間後も発作スコアは低いままである；例えば処置群（抗てんかん原性）。実験群のウォッシュアウト期間の発作スコアはビヒクル処置群と有意に異ならない場合は、能動的処置期間中のペプチドの作用はその抗痙攣効果によるものであると結論できる；例えば処置群（抗痙攣性）。抗てんかん原性作用が認められるときは、ビヒクルおよび処置群の両方の全てのマウスを、これまでに処置されたマウスがペプチドの不在下でキンドリング形成するかどうかを調べるために、薬剤の不在下でキンドリング形成させる。
実施例５
類似体の設計と化学合成
ａ）ＢＢＢを透過する神経ペプチド類似体
表２９は、いくつかの神経ペプチド類似体の構造を要約する。類似体の各々について、固相ペプチド合成の間に「ＫＫＫｐＫ」モチーフをＮまたはＣ末端に結合する。以下に、各々の神経ペプチドの類似体を設計するための簡単な理論的根拠を示す。
表２９ 選択された神経ペプチドの構造
Figure 2016074713
 ソマトスタチンおよびそのサブタイプ選択的類似体、オクトレオチドは、それらの生物活性を損なわずにＮ末端伸長を「収容する（ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｅ）」ことができる（ＤａｓｇｕｐｔａとＭｕｋｈｅｒｊｅｅ ２０００；Ｄａｓｇｕｐｔａ，Ｓｉｎｇｈら、２００２；Ｎａ，Ｍｕｒｔｙら、２００３）。ＲＣ−１６０類似体のＮ末端アセチル化は、このソマトスタチン類似体のＣＮＳ濃度の上昇を生じさせた（Ｂａｎｋｓ，Ｓｃｈａｌｌｙら、１９９０）。オクトレオチドは、付加的な修飾なしでもある程度までＢＢＢを透過することができる（Ｆｒｉｃｋｅｒ，Ｎｏｂｍａｎｎら、２００２）。
ＤＳＩＰ。Ｎ末端伸長はＤＳＩＰの抗てんかん活性に影響を及ぼさないことが示されたが、Ｃ末端伸長は不活性な類似体を生じた。それ故ＤＳＩＰ類似体は、Ｎ末端にベクターを付加して作製することができる。
ＫＫＫｐＫモチーフを、ＳＯＭ、オクトレオチドまたはＤＳＩＰのＮ末端に導入する。３つの異なるスペーサー（Ｇｌｙ、６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）、Ａｈｘ−Ｇｌｙ）を使用して「ＫＫＫｐＫ」モチーフを結合することは、かさの高いＬｙｓ−ｐａｌｍ残基が標的受容体との相互作用に影響を及ぼし得る可能性を最小限に抑える。以下の類似体を合成する：
ＫＫ（Ｋｐ）Ｋ−（神経ペプチド）（配列番号１０５）
ＫＫ（Ｋｐ）ＫＧ−（神経ペプチド）（配列番号１０６）
ＫＫ（Ｋｐ）Ｋ（Ａｈｘ）−（神経ペプチド）（配列番号１０７）
ＫＫ（Ｋｐ）Ｋ（Ａｈｘ）Ｇ−（神経ペプチド）（配列番号１０８）
ジノルフィンＡ（１−１６）を、オピオイド受容体に対する親和性の有意の低下を伴わずに、Ｃ末端で切断または修飾することができる（Ｌａｐａｌｕ，Ｍｏｉｓａｎｄら、１９９７；Ｎａｑｖｉ，Ｈａｑら、１９９８；Ｓｃｈｌｅｃｈｔｉｎｇｅｎ，ＤｅＨａｖｅｎら ２００３）。そこで、ＢＢＢを透過するガラニン類似体と同様に、最後のいくつかの残基が「ＫＫＫｐＫ」モチーフによって置換されたジノルフィンＡ（１−１６）類似体を合成する。以下の類似体を示す：
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−ｐａｌｍ）−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１０９）
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ− Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−ｐａｌｍ）−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１１０）
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−ｐａｌｍ）−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１１１）
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−（Ａｈｘ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−ｐａｌｍ）−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１１２）
神経ペプチドＹ類似体を、Ｐｒｏｆ．Ａｎｎｅｔｔｅ Ｇ．Ｂｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒの研究所で実施された数多くのＳＡＲ試験からのデータに基づいて設計する（包括的総説（Ｂｅｃｋ−ＳｉｃｋｉｎｇｅｒとＪｕｎｇ １９９５；ＣａｂｒｅｌｅとＢｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒ ２０００））。特に、設計は、腫瘍造影剤として合成され、試験された９９ｍＴｃ標識ＮＰＹ類似体に基づく（Ｌａｎｇｅｒ，Ｌａ Ｂｅｌｌａら、２００１）。キレート化９９ｍＴｃを有するかさの高い２−ピコリルアミン−Ｎ，Ｎ−二酢酸を含む、トランケート型ＮＰＹ類似体（Ａｃ−［Ａｈｘ５−２４，Ｋ４（９９ｍＴｃ（ＣＯ）３−ＰＡＤＡ），Ａ２６］−ＮＰＹは、Ｙ２受容体サブタイプに対して非常に強力であった（ＩＣ５０＝１ｎＭ）。そこで、２−ピコリルアミン−Ｎ，Ｎ−二酢酸をＬｙｓ−パルミトイル残基で置換することができる。以下の２個のＮＰＹ類似体を示す：
Figure 2016074713
 Ｎ末端伸長を有するＮＰＹ（１３−３６）の４個の類似体も作製する：
Figure 2016074713
 全ての類似体は、標準的なＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）プロトコルおよび自動ペプチドシンセサイザーを使用して合成する。Ｆｍｏｃ保護されたアミノヘキサン酸、Ｌｙｓ−パルミトイルおよびグリコアミノ酸を含む、ＳＰＰＳのための全ての構築ブロックは市販されている（Ｓｕｓｓｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＮｅｏＭＰＳ，Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ）。カップリング方法は、先に述べられているように（ＦｉｅｌｄｓとＮｏｂｌｅ １９９０；Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ ２０００）実施する。ペプチドを試薬Ｋで固体支持体から取り出し、洗浄して、ＭＴＢＥで沈殿させる。ジフェニル分取逆相ＨＰＬＣを用いて類似体を精製する。直線勾配を溶出のために使用する。９０％アセトニトリル／１０％水／０．１％ＴＦＡの初期および最終濃度を、分析ＨＰＬＣ法からの保持時間に基づいて各々の類似体について測定する。類似体を、２８０ｎｍで各類似体に関して算定したモル吸収係数（Ｔｐｒ ε＝５，６００およびＴｙｒ ε＝１，４００）を使用して定量する。これらの手順は、１０−５０ｍｇの範囲の量でガラニン類似体を調製するために有効であった。ソマトスタチンまたはオクトレオチド類似体内のジスルフィド架橋の酸化のために、Ｃｌｅａｒ−Ｏｘ樹脂を使用する（Ｄａｒｌａｋ，Ｗｉｅｇａｎｄｔ Ｌｏｎｇら、２００４；ＧｒｅｅｎとＢｕｌａｊ ２００６）。本明細書で述べるオクトレオチド類似体は、９５％を超える収率で酸化された。最終酸化産物を分取ＨＰＬＣによって精製する。
神経ペプチド類似体の抗痙攣活性。薬物抵抗性部分てんかんの６Ｈｚ辺縁系発作モデルにおいて類似体を特性決定する。ｉ．ｃ．ｖ．およびｉ．ｐ．投与後に類似体の活性を測定することができる。戦略は、最初にｉ．ｃ．ｖ．（２ｎｍｏｌ）で類似体を試験し、活性な類似体をｉ．ｐ．ボーラス注射（４ｍｇ／ｋｇ）を用いてさらにさらに試験することである。ジノルフィンＡ（１−１６）、ＮＰＹおよびＮＰＹ（１３−３６）の抗痙攣活性も、ｉ．ｃ．ｖ．投与後に２ｎｍｏｌで試験する。これらの結果は、それらの修飾類似体をスクリーニングするための参考として役立つ。
抗痙攣性試験。６Ｈｚ角膜刺激（３秒間）によって誘発される発作を予防する各類似体の能力を３２ｍＡで評価する。６Ｈｚ発作は、ごくわずかなクローヌス期とそれに続く、最初は部分発作を有するヒト患者の前兆に類似すると述べられた定型化した自動性行動によって特徴づけられる（Ｔｏｍａｎ，Ｅｖｅｒｅｔｔら、１９５２；Ｂａｒｔｏｎ，Ｋｌｅｉｎら、２００１）。この行動を示さない動物を保護されたとみなす。６Ｈｚ発作試験における各々の類似体の活性を（Ｂａｒｔｏｎ，Ｋｌｅｉｎら、２００１）によって述べられた方法に従ってｉ．ｃ．ｖ．またはｉ．ｐ．投与後のピーク効果時に定量する。この試験のために、角膜電極を設置する前に麻酔薬／電解質溶液（０．９％食塩水中の０．５％塩酸テトラカイン）１滴を各動物の眼に適用する。ピーク効果時間試験のために、合計２０匹のＣＦ−１マウスを用いる。４匹のマウスの群を様々な時点で（すなわち０．２５、０．５、１、２および４時間目）試験する。全ての化合物は、０．９％ＮａＣｌ中０．０１ｍｌ／ｇ体重の容量で投与する。
グリコシル化神経ペプチド類似体の設計と化学合成。グリコシル化は、ＢＢＢを通るオピオイドペプチドの透過を改善する上で非常に有効であると思われた（Ｅｌｍａｇｂａｒｉ，Ｅｇｌｅｔｏｎら、２００４；Ｐｏｌｔ，Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎら、２００５）。図３４は、エンケファリン類似体のために使用した糖残基の構造を示す。ペプチドへのβ−メリビオースの導入は、ｉ．ｖ．投与後に最良の鎮痛効力を有する類似体を生成した。
β−メリビオース−Ｓｅｒ残基は、完全長「ＫＫＫｐＫ」モチーフまたはＬｙｓ−パルミトイル残基（上述したような）のいずれかの代わりに選択神経ペプチド類似体に導入することができる。グリコシル化類似体の化学合成のためにＳｕｓｓｅｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈより入手可能なＦｍｏｃ保護されたペルアセチル−β−メリビオース−Ｓｅｒ誘導体を使用する。標準固相合成プロトコルを適用する。メリビオース残基の脱アセチル化は、メタノール中１０ｍＭナトリウムメトキシドにおける類似体の４−５時間のｐＨ制御された（ｐＨ１０）インキュベーションによって達成される。類似体を分取ＨＰＬＣによって精製し、ｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥した後、抗痙攣活性を試験する。
実施例６
マウス角膜キンドリング獲得へのＮＡＸ ５０５５の作用
血液脳関門透過性のガラニンベースの神経ペプチドＮＡＸ ５０５５の、角膜キンドリングの発現を予防する能力をＣＦ Ｎｏ．１マウスにおいて試験した。マウス角膜キンドリングモデルは部分てんかんの非侵害性動物モデルであり、マウスは最初に、１日２回数日間にわたって、角膜電極により３秒間、痙攣を誘発しない電流（３ｍＡ）を受ける。ビヒクル処置マウスは、通常、安定な段階５発作、すなわち二次性全般化焦点発作に達するまでに１２−１６日間を要する。本試験では、１６匹のマウスを２つの実験群：食塩水またはＮＡＸ ５０５５の１つに無作為に割り当てた。ＮＡＸ ５０５５群のマウスは、最初の角膜刺激の１２時間前と１時間前およびその後の各刺激の１時間前に、ＮＡＸ ５０５５（４ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を受けた。これに対し、ビヒクル群のマウスは、各角膜刺激の１時間前までに０．９％ＮａＣｌ（ｎ＝８）を摂取した。各刺激の前に、０．９％食塩水中０．５％テトラカイン１滴を角膜に適用した。刺激発作後、Ｒａｃｉｎｅ（１９７２）によって確立されたように０−５のスケールで活性を評点づけた。対照動物が一貫して段階５発作を示すまで処置を継続した。
図３２および３３に示すように、ＮＡＸ ５０５５群のマウスを２つの別々の集団、すなわちＮＡＸ ５０５５処置に感受性であるもの（ｎ＝３）と非感受性であるもの（ｎ＝５）に分離した。感受性は、刺激期間中に段階５の発作を示すことができなかったマウスと定義した。ＮＡＸ ５０５５感受性動物は、対照およびＮＡＸ ５０５５非感受性動物と比較して段階１、２および３に達するまでに有意に多い数の刺激を必要とした。さらに、１週間の無刺激および無ペプチド期間後の再攻撃誘発時に、ＮＡＸ ５０５５感受性動物は、対照およびＮＡＸ ５０５５非感受性動物と比較して段階４／５に達するまでに有意により多くの刺激を必要とした。これらの結果は、ＮＡＸ ５０５５がキンドリング獲得を遅延させることができ、それ故所与の脳傷害後にてんかんの発症の危険度が高い患者の初期治療のために有用であり得ることを示す（Ｒａｃｉｎｅ ＲＪ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｉｚｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．ＩＩ．Ｍｏｔｏｒ ｓｅｉｚｕｒｅ．Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．１９７２ Ｍａｒ；３２（３）：２８１−９４．）。
表３０は、全身送達後のオクトレオチドまたはＤＳＩＰ類似体の抗痙攣活性を示す。
Figure 2016074713
 表３１は、付加的なデルタ睡眠誘発ペプチドを示す。
Figure 2016074713
 Ｇ．配列
配列番号１（野生型ガラニン）
Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ

配列番号２（ＧＡＬ−ＢＢＢ１）
Ｓａｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−（Ｌｙｓ−ｐａｌｍ）−Ｔｌｅ−ＮＨ２
（式中、Ｓａｒはサルコシンであり、Ｔｌｅはｔｅｒｔ−ロイシンであり、およびＬｙｓ−ｐａｌｍは、εアミノ基によってパルミトイル部分と共役したリシン残基であり、および−ＮＨ２はＣ末端のアミド化を表わす）

配列番号３（ＧＡＬ−ＢＢＢ２）
Ｓａｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−ｐａｌｍ）−Ｌｙｓ−ＮＨ２
（式中、Ｓａｒはサルコシンであり、Ｔｌｅはｔｅｒｔ−ロイシンであり、およびＬｙｓ−ｐａｌｍは、εアミノ基によってパルミトイル部分と共役したリシン残基であり、および−ＮＨ２はＣ末端のアミド化を表わす）

配列番号４（表１１から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号５（表１１から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号６（表１１から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号７（表１１から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号８（表１１から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号９（表１２から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号１０（表１２から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｘａａ Ｘａａ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号１１（表１２から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｘａａ Ｘａａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号１２（表１２から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｘａａ Ｘａａ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号１３（表１２から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｘａａ Ｘａａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号１４（表１２から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｘａａ Ｘａａ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号１５（表１２から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｘａａ Ｘａａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号１６（表１２から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号１７（表１２から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｘａａ Ｘａａ Ａｓｎ Ｘａａ Ｘａａ Ｘａａ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

（表１２からの配列（配列番号９−１７）において「Ｘａａ」はスペーサーを表わし、いかなる長さでもよい）。

配列番号１８（表１３から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号１９（表１３から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号２０（表１３から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ

配列番号２１（表１３から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ

配列番号２２（表１３から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ

配列番号２３（表１３から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ

配列番号２４（表１３から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｄ−Ｌｙｓ Ｄ−Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｄ−Ｌｙｓ

配列番号２５（表１３から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ ｈ−Ｌｙｓ ｈ−Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ ｈ−Ｌｙｓ

配列番号２６（表１３から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ ＤＡＢ ＤＡＢ Ｌｙｓ−Ｐ ＤＡＢ

配列番号２７（表１３から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＴＤＡ Ｌｙｓ

配列番号２８（表１３から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＤＰＡ Ｌｙｓ
表３からの上記配列（配列番号１８−２８）において、ＴＤＡは２−アミノ−テトラデカン酸であり、ＤＡＢはジアミノ酪酸であり、Ｄ−ＬｙｓはＬｙｓのＤ−異性体であり、ｈ−Ｌｙｓはホモ−Ｌｙｓであり、ＤＰＡは３，３−ジフェニルアラニンである。
配列番号２９（表１３から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ Ｘ
式中、Ｘは、１２−アミノ−ドデカン酸または２−アミノ−テトラデカン酸を表わす。

配列番号３０（ソマトスタチン野生型）
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ

配列番号３１（表５から）
Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｙｓ ＤＡＢ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｄ−Ｔｒｐ Ｌｙｓ ＤＡＰ Ｐｈｅ ＤＡＰ ＤＡＰ Ｃｙｓ

配列番号３２（表５から）
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ−Ｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｄ−Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ


配列番号３３（表５から）
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｃｌ−Ｐｈｅ Ｃｌ−Ｐｈｅ Ｄ−Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｌ−Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ

配列番号３４（表５から）
Ａｌａ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｙｓ ＤＡＢ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌ−Ｔｒｐ Ｌｙｓ ＤＡＰ Ｐｈｅ ＤＡＰ ＤＡＰ Ｃｙｓ

配列番号３５（表５から）
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｌｙｓ−Ｐ Ｌｙｓ−Ｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌ−Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ


配列番号３６（表５から）
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｃｌ−Ｐｈｅ Ｃｌ−Ｐｈｅ Ｌ−Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｌ−Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ

表５からの上記配列において、ＤＡＢはジアミノ酪酸であり、ＤＡＰはジアミノプロピオン酸であり、Ｌｙｓ−ｐａｌｍはＬｙｓ−パルミトイルであり、およびＣｌ−Ｐｈｅはクロロ−Ｐｈｅである。

配列番号３７（表９から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ−ｐ Ｌｙｓ−ｐ Ｌｙｓ−ｐ Ｖａｌ

配列番号３８（表９から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ ＤＡＰ Ｌｅｕ Ａｓｎ ＤＡＰ ＤＡＰ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ＤＡＢ Ｈｉｓ ＤＡＰ ＤＡＢ

配列番号３９（表９から）
Ｓａｒ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｃｌ−Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ

配列番号４０（修飾を有するオクトレオチド）
Ｄ−Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｄ−Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ（ｏｌ）

配列番号４１（ＳＯＭ−ＢＢＢ１）
（ＮＮ３ＡＰＧ）（ＡＨＸ）ＡＧＣＫＮＦＦＷＫＴＦＴＳＣ

配列番号４２（ＳＯＭ−ＢＢＢ２）
（ＮＮ３ＡＰＧ）（ＡＨＸ）ＡＧＣＫＮＦＦ（ＤＷ）ＫＴ（Ｃｌ−Ｐｈｅ）Ｔ（Ｄａｐ）Ｃ

配列番号４３（ＳＯＭ−ＢＢＢ３）
Ｗ（ＡＨＸ）ＫＫＣＫＮＦＦ（ＤＷ）ＫＴ（Ｃｌ−Ｐｈｅ）（Ｄａｂ）（Ｄａｂ）Ｃ

配列番号４４（ＳＯＭ−ＢＢＢ２１）
ＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ（ＡＨＸ）（ＤＦ）ＣＦ（ＤＷ）ＫＴＣ−Ｔｈｒ（ｏｌ）

配列番号４５（ＳＯＭ−ＢＢＢ２２）
ＫＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ（ＡＨＸ）（ＡＨＸ）（ＤＦ）ＣＦ（ＤＷ）ＫＴＣ−Ｔｈｒ（ｏｌ）

配列番号４６（ＳＯＭ−ＢＢＢ２３）
（Ｌｙｓ−Ｐ）ＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ（ＡＨＸ）（ＤＦ）ＣＦ（ＤＷ）ＫＴＣ−Ｔｈｒ（ｏｌ）

配列番号４７（ＳＯＭ−ＢＢＢ２４）
ＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ（ＡＨＸ）ＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ（ＡＨＸ）（ＤＦ）ＣＦ（ＤＷ）ＫＴＣ−Ｔｈｒ（ｏｌ）

配列番号４８（ＳＯＭ−ＢＢＢ２５）
（ＰＦＨＡ）Ｋ（ＤＫ）Ｋ（ＡＣＰＡ）ＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ（ＡＨＸ）（ＤＦ）ＣＦ（ＤＷ）ＫＴＣ−Ｔｈｒ（ｏｌ）

配列番号４１−４８に関して、（ＡＨＸ）はアミノヘキサン酸である；（Ｄａｂ）＝ジアミノ酪酸；（Ｄａｐ）＝ジアミノプロピオン酸；（Ｔｌｅ）＝ｔｅｒｔ−ロイシン； （Ｃｌ−Ｐｈｅ）＝４−クロロフェニルアラニン；
（ＮＮ３ＡＰＧ）＝Ｎ，Ｎ−ビス（３−アミノプロピル）グリシン；（ＡＨＸ）＝アミノヘキサン酸；（Ｌｙｓ−Ｐ）＝Ｌｙｓ−パルミトイル；Ｔｈｒ（ｏｌ）＝トレオニノール；ＤＫ、ＤＦ、ＤＷはＤ−異性体を表わす；ＰＦＨＡは２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフルオロへプタン酸である；およびＡＣＰＡは８−アミノカプリル酸である。

配列番号４９ ＧＡＬ−ＢＢＢ３
ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫＸＫ−ＮＨ２

配列番号５０ ＧＡＬ−ＢＢＢ４
Ｓａｒ−ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰ（Ｄ−Ｌｙｓ）（Ｄ−Ｌｙｓ）Ｘ（Ｄ−Ｌｙｓ）−ＮＨ２

配列番号５１ ＧＡＬ−ＢＢＢ５
Ｓａｒ−ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＲＲＸＲ−ＮＨ２

配列番号５２ ＧＡＬ−ＢＢＢ６
Ｓａｒ−ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＨＨＸＨ−ＮＨ２

配列番号５３ ＧＡＬ−ＢＢＢ７
Ｓａｒ−ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＫＫＫＸＫ−ＮＨ２

配列番号５４ ＧＡＬ−ＢＢＢ８
Ｓａｒ−ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＫＸＫ−ＮＨ２

配列番号４９−５４において、Ｓａｒはサルコシンであり、およびＸはＬｙｓ−パルミトイル残基である。

配列番号５５ ＤＳＩＰ−ＢＢＢ８
（ＡＨＸ）ＧＧＷＡＧＧＤＡＳＧＥ

配列番号５６
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号５７
ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号５８
（ＤＫ）（ＤＫ）（ＤＫ）（Ｋｐ）ＧＧＷＡＧＧＤＡＳＧＥ

配列番号５９
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＲＲ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｒ

配列番号６０
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＫＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号６１
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫＫＫ

配列番号６２
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号６３
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号６４
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰ（Ａｈｘ）ＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号６５
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹ（Ａｈｘ）ＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号６６
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号６７
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹ（Ａｈｘ）ＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号６８
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＨＡ（Ｌｙｓ−Ｐ）

配列番号６９
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＤＫＤＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）ＤＫ

配列番号７０
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＲＲ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｒ

配列番号７１
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＫＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号７２
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号７３
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰ（Ｏｒｎ）（Ｏｒｎ）（Ｌｙｓ−Ｐ）（Ｏｒｎ）

配列番号７４
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰ（Ｄａｂ）（Ｄａｂ）（Ｌｙｓ−Ｐ）（Ｄａｂ）

配列番号７５
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰｂＫｂＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）ｂＫ

配列番号７６
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＨＨ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｈ

配列番号７７
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰ（Ｌｙｓ−Ｐ）ＫＫＫ

配列番号７８
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）ＫＫ

配列番号７９
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）

配列番号８０
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹ（スペルミンＳ）（Ｌｙｓ−Ｐ）

配列番号８１
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）−（スペルミンＳ）

配列番号８２
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｇｌｕ−スペルミン）Ｋ

配列番号８３
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｌｙｓ−スペルミン−パルミトイル）Ｋ

配列番号８４
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（ＴＤＡ）Ｋ

配列番号８５
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（ＮｏｒＬ）Ｋ

配列番号８６
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｍａｎ）Ｋ

配列番号８７
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｍｅｌ）Ｋ

配列番号８８
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬ（１ＰＥＧ）ＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号８９
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬ（５ＡＶＡ）ＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号９０
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬ（２ＰＥＧ）ＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号９１
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬ（８ＡＯＡ）ＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号９２
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹ（１ＰＥＧ）（５ＡＶＡ）ＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号９３
Figure 2016074713
配列番号９４
Figure 2016074713
配列番号９５
Figure 2016074713
配列番号９６
ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＨＡＩ

配列番号９７
ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＨ

配列番号９８
ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧ

配列番号９９
ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬ

配列番号１００
ＧＷＴＬＮＳＡＧＹ

上記配列において：
Ａｈｘ＝アミノヘキサン酸
ＤＫ＝リシンのＤ−異性体
ｏｒｎ＝オルニチン
Ｄａｂ＝２，４−ジアミノ酪酸
ｂＫ＝β−ホモ−リシン
スペルミンＳ＝スペルミン−Ｎ４コハク酸
ＴＤＡ＝テトラデカン酸
ＮｏｒＬ＝ノルロイシン
ｍａｎ＝Ｌ−Ｓｅｒ−β−メリビオース１−ＰＥＧ＝５−アミノ−３−オキサペンタン酸５ＡＶＡ＝５−アミノ吉草酸
２−ＰＥＧ＝８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸
８ＡＯＡ＝８−アミノオクタン酸
配列番号１０１
ＤＰｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−ＤＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−ＮＨ２

配列番号１０２
Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ

配列番号１０３
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ

配列番号１０４
ＰＡＥＤＬＡＲＹＹＳＡＬＲＡＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ−ＮＨ２
配列番号： １０５
ＫＫ（Ｋｐ）ＫＸ （式中、Ｘはいかなる長さまたはいかなるアミノ酸でもよい）

配列番号１０６
ＫＫ（Ｋｐ）ＫＧＸ（式中、Ｘはいかなる長さまたはいかなるアミノ酸でもよい）

配列番号１０７
ＫＫ（Ｋｐ）Ｋ（Ａｈｘ）−（神経ペプチド）（式中、Ｘはいかなる長さまたはいかなるアミノ酸でもよい）

配列番号１０８
ＫＫ（Ｋｐ）Ｋ（Ａｈｘ）Ｇ−（神経ペプチド）（式中、Ｘはいかなる長さまたはいかなるアミノ酸でもよい）

配列番号１０９
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−ｐａｌｍ）−Ｌｙｓ−ＮＨ２

配列番号１１０
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ− Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−ｐａｌｍ）−Ｌｙｓ−ＮＨ２

配列番号１１１
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−ｐａｌｍ）−Ｌｙｓ−ＮＨ２

配列番号１１２
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−（Ａｈｘ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ｌｙｓ−ｐａｌｍ）−Ｌｙｓ− ＮＨ２

配列番号１１３
ＫＫＫ（Ｋｐ）（Ａｈｘ）ＲＡＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ−ＮＨ２

配列番号１１４
ＫＫ（Ｋｐ）Ｋ（Ａｈｘ）ＲＡＹＩＮＬＩＴＲＱＲＹ−ＮＨ２

配列番号１１５
ＫＫ（Ｋｐ）Ｋ−［Ｘ（１３−３６）］（式中、Ｘ（１３−３６）は神経ペプチドＹ類似体を表わす）

配列番号１１６
ＫＫ（Ｋｐ）ＫＧ−［Ｘ（１３−３６）］（式中、Ｘ（１３−３６）は神経ペプチドＹ類似体を表わす）

配列番号１１７
ＫＫ（Ｋｐ）Ｋ（Ａｈｘ）−［Ｘ（１３−３６）］（式中、Ｘ（１３−３６）は神経ペプチドＹ類似体を表わす）

配列番号１１８
ＫＫ（Ｋｐ）Ｋ（Ａｈｘ）Ｇ−［Ｘ（１３−３６）］（式中、Ｘ（１３−３６）は神経ペプチドＹ類似体を表わす）

配列番号１１９
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹ（Ｄ−Ｌｙｓ）（Ｄ−Ｌｙｓ）（Ｌｙｓ−Ｐ）（Ｄ−Ｌｙｓ）

配列番号１２０
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹ（Ａｈｘ）（Ｄ−Ｌｙｓ）（Ｄ−Ｌｙｓ）（Ｌｙｓ−Ｐ）（Ｄ−Ｌｙｓ）

配列番号１２１
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹ（７−Ａｈｐ）（Ｄ−Ｌｙｓ）（Ｄ−Ｌｙｓ）（Ｌｙｓ−Ｐ）（Ｄ−Ｌｙｓ）

配列番号１２２
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹ（３，５−ジブロモ−Ｔｙｒ）ＬＬＧＰＫＫ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号１２３
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＨＨ（Ｌｙｓ−Ｐ）Ｋ

配列番号１２４
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｃｙｓ−Ｍｍｔ）Ｋ

配列番号１２５
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｌｙｓ−ビオチン−アミノカプロイル）Ｋ

配列番号１２６
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｌｙｓ−ステロール）Ｋ

配列番号１２７
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｌｙｓ−デカノイル）Ｋ

配列番号１２８
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｌｙｓ−オクタノイル）Ｋ

配列番号１２９
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｌｙｓ−リノイル）Ｋ

配列番号１３０
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｓｅｒ−メリビオース）Ｋ

配列番号１３１
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｌｙｓ−アダマントイル）Ｋ

配列番号１３２
（Ｓａｒ）ＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｇｌｕ（β−Ｌａｃ−ＰＥＧ３−アミン））Ｋ

配列番号１３３
（Ｓａｒ）ＷＴＬＴＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｌｙｓ−パルミトイル）Ｋ

配列番号１３４
（Ｓａｒ）ＷＴＬＬＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｌｙｓ−パルミトイル）Ｋ

配列番号１３５
（Ｓａｒ）ＷＴＬＤＳＡＧＹＬＬＧＰＫＫ（Ｌｙｓ−パルミトイル）Ｋ

配列番号１３６
（Ａｈｘ）ＧＧＷＡＧＧＤＡＳＧＥ

配列番号１３７
（Ｐａｌｍ）ＧＧＷＡＧＧＤＡＳＧＥ

配列番号１３８
（Ｋｐ）ＧＧＷＡＧＧＤＡＳＧＥ

配列番号１３９
ＫＫＫ（Ｋｐ）ＧＧＷＡＧＧＤＡＳＧＥ

配列番号１４０
ＫＫ（Ｋｐ）ＫＧＧＷＡＧＧＤＡＳＧＥ

配列番号１４１
ＫＫＫＧＧＷＡＧＧＤＡＳＧＥ

配列番号５８および１３５−１４１に関して、（ＤＫ）はＤ−Ｌｙｓであり、（Ｋｐ）はＬｙｓ−パルミトイルであり、Ａｘｈはアミノヘキサン酸であり、Ｐａｌｍはパルミチン酸である。

Claims (1)

  1. 本願明細書に記載された発明。
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