TW201340978A - 改善以神經系統為標的之藥劑之性質之方法及組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示改善以神經系統為標的之生物活性化合物之藥理學性質的組合物及方法。

Description

改善以神經系統為標的之藥劑之性質之方法及組合物
本發明係關於改善以神經系統為標的之藥劑之性質之方法及組合物。
血腦障壁(BBB)將哺乳動物大腦與全身循環分離開且對穩定中樞神經系統(CNS)起重要作用。儘管對肽穿過血腦障壁運輸之瞭解持續進步，但其之有效直接輸送入CNS中在發展作為潛在療法之神經肽中仍為主要挑戰。
癲癇症為(例如)複雜神經學病症。頑固型癲癇症據估計影響30%之患者群體。儘管可利用各種抗癲癇藥物(AED)，但某些類型之發作及癲癇症症候群僅對數種AED作出有限成功反應。因此，仍需要發現且發展具有改善之功效及安全概況之新抗痙攣療法。此外，近期發現癲癇發作之前發生的神經生物學變化開啟了發現新抗致癲癇化合物的機會，且該等抗致癲癇劑可包括神經肽及神經營養素。
與癲癇的發作機制有關之神經肽及其受體包括甘丙肽、神經肽Y、生長抑素及阿片樣肽。當直接輸送於中樞神經系統(CNS)中時，該等神經肽中之某些具有抗痙攣活性，但其不良生物可用性及邊緣代謝穩定性阻止神經肽類抗癲癇藥物之開發。另一方面，高級肽工程化 已產生許多具有改善之穩定性或生物可用性之肽類似物的成功的實例。然而，該等可用肽工程技術均未應用於具有抗痙攣活性之神經肽。
此項技術中需用於改善穿過血腦障壁之滲透性之方法及組合物。
根據如本文中所包含且廣泛描述之本發明之目的，本發明在一態樣中係關於一種經分離之多肽，其包含SEQ ID NO：3，與SEQ ID NO：3之胺基酸序列或具有一或多個保守胺基酸取代之SEQ ID NO：3之胺基酸序列至少約90%一致的胺基酸序列。
亦揭示一種經分離之多肽，其包含選自由SEQ ID NO：2、4-29、37-39、50、64、65、66、67、80、82及89組成之群的胺基酸序列，與選自由SEQ ID NO：2、4-29、37-39、50、64、65、66、67、80、82及89組成之群的胺基酸序列或選自由具有一或多個保守胺基酸取代之SEQ ID NO：2、4-29、37-39、50、64、65、66、67、80、82及89組成之群的胺基酸序列至少約90%一致的胺基酸序列。
亦揭示一種經分離之多肽，其包含選自由SEQ ID NO：31-36組成之群的胺基酸片段，與選自由SEQ ID NO：31-36組成之群的胺基酸序列或選自由具有一或多個保守胺基酸取代之SEQ ID NO：31-36組成之群的胺基酸序列至少約90%一致之胺基酸序列。
亦揭示一種經分離之多肽，其包含SEQ ID NO：40，與SEQ ID NO：40之胺基酸序列或具有一或多個保守胺基酸取代之SEQ ID NO：40之胺基酸序列至少約90%一致的胺基酸序列。
亦揭示一種經分離之多肽，其包含選自由SEQ ID NO：105、106、107、108、109-112及113-118組成之群的胺基酸序列，與選自由SEQ ID NO：105、106、107、108、109-112及113-118組成之群的胺基 酸序列或選自由具有一或多個保守胺基酸取代之SEQ ID NO：105、106、107、108、109-112及113-118組成之群的胺基酸序列至少約90%一致之胺基酸序列。
亦揭示一種經分離之多肽，其包含選自由SEQ ID NO：58及135-114組成之群的胺基酸序列，與選自由SEQ ID NO：58及135-114組成之群的胺基酸序列或選自由具有一或多個保守胺基酸取代之SEQ ID NO：58及135-114組成之群的胺基酸序列至少約90%一致之胺基酸序列。
進一步揭示具有增加之血腦障壁滲透性之組合物，其中該組合物包含當與肽之未變更形式相比時具有增加之親脂性特徵及增加之鹼度的肽。
揭示增加肽之血腦障壁滲透性之方法，其包含與該肽之未變更形式相比增加肽之親脂性特徵且增加鹼度。
亦揭示治療癲癇症之方法，其包含向需要之患者投與有效量之如本文所揭示之多肽。進一步揭示治療癲癇症之方法，其包含向需要之患者投與有效量之如本文所揭示之組合物。
揭示治療、預防或改善疼痛或其他神經性病症之方法，其包含向需要之患者投與有效量之如本文所揭示之多肽。
亦揭示治療需要穿過血腦障壁之組合物之患者的方法，其包含鑑定欲用於治療該患者之組合物；藉由增加該組合物之親脂性及鹼度而將組合物改質；且向需要之患者投與該經改質之組合物。
進一步揭示治療需要穿過血腦障壁之組合物之患者的方法，其包含鑑定欲用於治療該患者之組合物；藉由增加該組合物之親脂性、糖基化及鹼度而將組合物改質；且向需要之患者投與該經改質之組合物。
亦揭示治療需要穿過血腦障壁之組合物之患者的方法，其包含 鑑定欲用於治療該患者之組合物；藉由增加該組合物之親脂性、糖基化及鹼度而將組合物改質；且將該經改質之組合物插入載體中；及向需要之患者投與該載體。
進一步揭示治療需要穿過血腦障壁之組合物之患者的方法，其包含鑑定欲用於治療該患者之組合物；藉由增加該組合物之親脂性及鹼度而將組合物改質；且將該經改質之組合物插入載體中；及向需要之患者投與該載體。
圖1展示神經肽於SSSE海馬趾神經元通路GABA及GLU介導之神經傳遞中之作用。縮寫：CA，錐體神經元；DYN，強啡肽；GABA，γ-胺基丁酸；GAL，甘丙肽；GLU，麩胺酸酯；NE，去甲腎上腺素；NPY，神經肽Y；SOM，生長抑素；SubsP,P物質(Wasterlain等人2002)。
圖2展示刺激前後注射至門中之甘丙肽縮短大鼠發作之持續期間。上圖。穿孔路徑刺激(PPS)前30分鐘注射甘丙肽(50及500皮莫耳)。下圖。當PPS後30分鐘注射時僅注射500皮莫耳甘丙肽可有效降低發作之持續期間(Mazarati等人1998)。
圖3展示非肽甘丙肽受體促效劑與甘丙肽均增加小鼠中PTZ誘導之發作之潛伏時間且降低發作得分。插圖摘要最大發作得分(黑色，對照；空心，加爾農(galnon)；灰色，甘丙肽)。(Saar等人2002)。
圖4展示在自主維持大鼠癲癇持續狀態模型中海馬趾內注射後生長抑素之抗痙攣活性(Mazarati及Wasterlain,2002)。
圖5展示在自主維持大鼠癲癇持續狀態模型中海馬趾內注射後，強啡肽及神經肽Y之抗痙攣活性。對於對照實驗參看圖4(Mazarti及Wasterlain,2002)。
圖6展示影響肽穿過血腦障壁之滲透性的關鍵因素。鹼度及親 脂性可改善經由擴散及吸附介導之內飲作用之被動運輸，而糖基化或載體亦可有助於穿過血腦障壁之主動運輸。
圖7展示用於開發具有抗痙攣活性之神經肽類似物的一般策略。選擇兩種模型神經肽以評估用於改善其穿過血腦障壁之滲透性的技術。
圖8展示理想神經肽藥物之原型之結構組織。星號表示藥效團之殘基。灰框表示增加肽部分之代謝穩定性、鹼度及親脂性的骨架及側鏈修飾。BBB/PK修飾成分為含有親脂性及陽離子模組及內源營養模擬物之龐大聚合物基結構。陽離子模組經由與膜之靜電相互作用增加吸附介導之內飲作用。親脂性模組增加穿過血腦障壁之被動運輸。主動運輸模擬結構(例如己醣或苯丙胺酸)充當與位於血腦障壁中之內向營養運輸體相互作用之受質。
圖9展示用以設計穿透BBB之肽類似物的策略。展示兩種或兩種以上改善類似物穿過BBB之滲透性的不同化學修飾之組合。
圖10展示工程化神經肽以改善其穿過血腦障壁之滲透性的系統方法。縮寫：DAB，二胺基丁酸；DAP，二胺基丙酸；PEG，聚乙二醇；Mmt，4-甲基三苯甲基。
圖11展示生長抑素類似物中N末端延長之模塊結構。在固相肽合成期間偶合該等模組。模組之數目及順序為任意的，且BBB/PK調節劑之結構組成可優化。
圖12展示Frings小鼠中Gal BBB-2顯示時間(插圖)及劑量依賴型保護防止聲源性發作。對於時程以4 mg/kgi.p.Gal BBB-2處理小鼠且投與後在不同時間測試。對於劑量-反應研究，以增加劑量之Gal BBB-2處理Frings小鼠組，且在i.p.投與後1小時測試。
圖13展示優化GAL-BBB2之一般實驗策略。前三個框摘要實例1中所定義之活性。合成約40種類似物且將其在競爭性結合檢定中篩 選。在更詳細藥理學表徵前，對於有效且經久抗痙攣活性僅進一步篩選最有效甘丙肽配位體。
圖14展示GAL-BBB2及所提出SAR研究之結構組織。黑框說明主要藥效團殘基。
圖15展示"骨架假體"-以非肽間隔劑(5-胺基戊酸)替換非藥效團殘基(R2及R3)。其他骨架間隔劑包括胺基己酸或胺基-3,6-二噁辛酸(PEG間隔劑)。
圖16展示GAL-BBB2(在圖中標記為NAX-5055)(0.52-5 mg/kg)在初始急性期以及延長之發炎期均產生劑量依賴型爪舔舐降低。相反，發現未修飾原生片段Gal 1-16在i.p.投與比所測試GAL-BB2之最高劑量高4倍(亦即20 mg/kg)之劑量後為非活性的。
圖17展示發現5 mg/kg GAL-BBB2等效於10 mg/kg劑量之加巴噴丁(gabapentin)。
圖18展示GAL-BBB2(在圖中標記為NAX-5055)顯示慢性疼痛坐骨結紮模型中機械觸痛感之臨限值時間依賴型增加。此外，GAL-BBB2等效於嗎啡鹼且比加巴噴丁有效數倍。
圖19展示亦稱為NAX 5055之GAL-BBB2之結構。
圖20展示NAX 5055(GAL-BBB2)而非原生肽片段在Frings小鼠中為具有活性的。在劑量-反應研究中在峰作用時(亦即1h)將抗痙攣功效定量。此研究之結果證明GAL-BBB2顯示抗聲音誘導之發作的劑量依賴型作用。自劑量-反應數據之Probit分析獲得之計算半數有效劑量(亦即ED50)及95%置信區間為3.2(2.3-6.1)mg/kg。原生肽片段GAL(1-16)在20 mg/kg i.p.(GAL-BBB2之ED50的6倍)之劑量為非活性的。
圖21展示工程化奧曲肽之化學結構及圖示。
圖22展示6 Hz(32 mA)測試中NAX 5055(GAL-BBB2)比原生肽更有效。
圖23展示NAX 5055(GAL-BBB2)(4 mg/kg，i.p.)在Frings小鼠中顯示時間依賴型抗痙攣活性。
圖24展示NAX 5055(GAL-BBB2)在Frings小鼠中顯示劑量依賴型保護防止聲源性發作。
圖25展示NAX 5055(GAL-BBB2)(4 mg/kg)在藥學抵抗性發作模型中為具有活性的。
圖26展示6Hz發作測試中i.p.及s.c.投與後，NAX 5055(GAL-BBB2)顯示優良的生物可用性。腹膜內或皮下向雄性CF-1小鼠組(n=6-8)注射NAX 5055。60 min後，經由角膜電極刺激(32 mA，6 Hz，3 sec持續期間)各組中之個體小鼠。認為未顯示邊緣發作之小鼠受到保護。結果證明皮下投與後NAX 5055之抗痙攣活性保留。該等結果展示可使用適合於經皮下輸送NAX 5055及/或其他神經活性肽之儲槽式調配物。
圖27展示NAX 5055(GAL-BBB2)增加CMPD X於6 Hz(44 mA)測試中之功效及效力。當單獨投與時，CMPD A(左乙拉西坦(levetiracetam))在極高劑量抗6Hz邊緣發作之有效性最低(亦即在1000 mg/kg最大50%保護)。相反，當最低有效劑量之NAX 5055(1.5 mg/kg)組合CMPDA A(左乙拉西坦)投與時，功效及效能明顯增加。該等結果展示藉由NAX 5055調節甘丙肽受體使得左乙拉西坦之抗痙攣功效協同增強。當將該等結果集中在一起時，其展示組合NAX 5055與左乙拉西坦之組合產物甚至可比單獨極高劑量之左乙拉西坦更能提供治療優點。
圖28展示NAX 5055(GAL-BBB2)於海馬趾誘發大鼠中顯示適度保護。於部分癲癇之海馬趾誘發大鼠模型中，NAX 5055使發作得分自5下降為3。該等結果展示藉由NAX 5055調節甘丙肽受體適用於預防繼發性一般部分發作且與其中甘丙肽直接注入誘發大鼠之腦中的先前腦 室內研究一致。腹膜內投與NAX 5055具有活性之結果支援全身投藥後進入腦中之結論。
圖29展示NAX 5055(GAL-BBB2)對福馬林誘導之痛覺過敏的作用。在足底注射福馬林60分鐘前投與NAX 5055。時間基於峰值作用之抗痙攣時間。
圖30展示生長抑素及δ睡眠誘導肽(DSIP)於22 mA 6Hz發作測試中均具有抗痙攣性。此圖中展示之結果證明當生長抑素及δ睡眠誘導肽(DSIP)直接投與CF-1小鼠之室空間中時，其可有效抗6 Hz(22 mA)邊緣發作。該等結果提供在腦中調節生長抑素及DSIP結合位點為可行方法之觀念證據。其進一步支援使用專有技術開發穿過血腦障壁之全身活性生長抑素及DSIP神經活性肽。
圖31展示GAL(1-16)類似物之結構。顯著者為用以設計具有增加之BBB滲透性的類似物之關鍵資訊單元。
圖32展示每日注射兩次NAX-5055(4 mg/kg，i.p.)對患上小鼠角膜誘發之作用。CF#1小鼠隨機接受媒劑(0.9%鹽水)或NAX-5055。NAX-5055組中之小鼠在其第一次誘發刺激12(12 h)及1 h前接受2種劑量之NAX-5055。各後續刺激前1小時(1 h)，NAX-5055處理組中之小鼠接受另一劑量之NAX-5055(4 mg/kg，i.p.)。小鼠每日刺激兩次，歷時16天。結果表示為每次刺激之平均發作得分。如上所述，NAX-5055處理小鼠之結果分成2個組：亦即敏感型(綠線)及不敏感型(藍線)。鹽水對NAX-5055敏感性在p<0.0002顯著不同；NAX-5055敏感性對NAX-5055不敏感性在p<0.0001顯著不同。該研究所獲得的結果支援以下主張：諸如NAX-5055之甘丙肽類肽具有預防患有誘發之能力且可在具有發展癲癇症及其他神經性病症之風險的患者中減輕疾病。
圖33展示每日以NAX-5055(mg/kg，i.p.)治療兩次對角膜誘發速率之作用。以NAX-5055處理之小鼠(對於實驗細節見圖X之圖例)分成 2個治療組：亦即NAX-5055敏感型及NAX-5055不敏感型。結果表示為達到特定發作得分+/-S.E.M.，亦即1至5所需刺激之次數。NAX-5055敏感型組中之小鼠要求刺激2次以上以達到1級發作，且為分別達到2級及3級發作要求刺激35-40%以上。此外，NAX-5055敏感型組中無小鼠達到5級發作。單向ANOVA，p<0.0209；事後分析：鹽水對NAX-5055不敏感型，p>0.05；NAX-5055敏感型對NAX-5055不敏感型，p<0.05。該等結果支援以下結論：經修飾之甘丙肽類神經肽具有減輕發展患有誘發之能力且其適用於易發展癲癇症及其他神經性病症之患者群體之網路超興奮性的預防。
圖34展示引入腦啡肽類似物中之糖基基團之結構(Elmagbari,Egleton等人2004)
圖35展示兩種不同化學修飾之組合優於個別修飾。陽離子化或脂化單獨並不如兩者之組合般改善5055類似物之穿透性。
圖36展示用以改善肽穿過血腦障壁之滲透性之脂胺基酸的實例。該等脂胺基酸可與增加標靶肽之鹼度的化學修飾相組合。
圖37展示化學修飾改善神經肽類似物之代謝穩定性。在稀釋大鼠血清中在37℃下培育類似物5055(SEQ ID NO：3)或1205-2(SEQ ID NO：50)或未修改之類似物Gal(1-16)。藉由HPLC測定剩餘量之肽。
圖38展示可藉由穿過BBB之神經肽類似物治療、預防或逆轉不同類型之神經性疼痛。
藉由參考本發明之較佳實施例之下列詳細描述及其中所包含之實例及圖及其之先前及下列描述可更易於理解本發明。
在揭示且描述本發明之化合物、組合物、物品、裝置及/或方法前，應理解除非另作說明，否則本發明並不侷限於特定合成法、特定重組生物技術方法或除非另作說明，否則並不侷限於特定試劑，此歸 因於其當然可變。亦應理解，本文中所使用之術語僅用於描述特定實施例且未有限制意圖。
A.定義
如說明書及所附申請專利範圍中所使用，單數形式"一"及"該"除非上下文明顯另外規定否則包括複數對象。因此，例如對"一醫藥載劑"之引用包括兩種或兩種以上該等載劑及其類似物之混合物。
本文中範圍可表示為自"約"一特定值且/或至"約"另一特定值。當表示該範圍時，另一實施例包括自一特定值且/或至另一特定值。類似地，當藉由使用先導詞"約"將值表示為近似值時，應瞭解該特定值形成另一實施例。應進一步瞭解每一範圍之終點顯然均相對於另一終點且獨立於另一終點。亦應理解本文中揭示大量值，且各值除該值本身外，在本文中亦揭示為"約"彼特定值。例如，若揭示值"10"，則亦揭示"約10"。亦應理解當揭示某值時，則如熟習此項技術者所正確理解亦揭示"小於或等於"該值，"大於或等於"該值及值之間的可能範圍。例如，若揭示值"10"，則亦揭示"小於或等於10"以及"大於或等於10"。
在本說明書及下文之申請專利範圍中，將引用大量經定義以具有以下含義之術語："可選"或"視情況"意謂隨後所述事件或環境會或不會發生，且該描述包括其中該事件或環境發生之情況及其中並未發生之情況。
B.組合物及方法
1.血腦障壁
血腦障壁(BBB)為保護大腦免於血流中之有害物質，同時向大腦供應所需營養用於正確機能之毛細血管內皮細胞之專門系統。不同於容許越過細胞/在細胞之間相對自由交換物質之周邊毛細管，BBB嚴格限制穿過物理(緊密結合)與代謝(酶)障壁向大腦中運輸。因此BBB 通常為決定治療藥物向大腦之滲透的速率限制因素。
當前多種障礙限制許多化合物用作中樞神經系統(CNS)治療劑之用途。首先大腦具備障壁系統。大腦障壁系統具有2個主要組份：脈絡叢及血腦障壁(BBB)。脈絡叢將腦脊髓液(CSF)與血液分離開且BBB將大腦ISF與血液分離開。
BBB亦具有比脈絡叢大約1000倍之表面積且為向CNS輸送治療化合物之主要障礙。BBB充當選擇性隔離物，調節CNS與周邊循環之間的包括肽之物質的交換。BBB之一級結構為大腦毛細管內皮壁。大腦毛細血管內皮細胞之緊密接合防止循環化合物藉由細胞旁路到達腦ISF。此外，近期工作表明除緊密接合所提供之障壁外在基膜水平上存在生理障壁(Kroll等人，Neurosurgery，第42卷，第5期，第1083頁(1998年5月))。BBB之其他獨特特徵包括缺少細胞內穿孔及胞飲小泡及內皮之管腔表面上之淨負電荷。
物質可橫穿BBB之機制通常可分成主動及被動運輸機制。親脂性分子易於藉由被動轉運或穿過內皮質膜擴散而橫穿BBB。諸如肽之親水性分子通常要求主動運輸系統以使其能夠穿過BBB。諸如胰島素之某些較大肽在大腦毛細管之管腔表面上具有充當主動跨細胞轉運系統之受體。
穿過血腦障壁運輸肽有兩個主要機制：(1)穿過膜簡單擴散，主要由分子大小及親油性決定；及(2)主動流入，由位於血腦障壁中之內皮細胞之表面上的特異受體及載體來介導，或藉由非特異吸收跨細胞轉運來介導(Tamai及Tsuji,2000；Pan及Kastin,2004a；Smith等人，2004)。
2.改善滲透性
已測試許多策略以改善肽及蛋白質穿過血腦障壁之滲透性。該等策略可分成若干種類：(1)與載體相結合或增強肽在CNS中之吸收之 營養主動運輸；(2)脂化/鹵化使得親脂性增加以增強簡單擴散；(3)陽離子化(增加鹼度)以增強經由吸附跨細胞轉運運輸；及(4)糖基化或改善肽之主動/被動運輸及藥物動力學概況之前藥((Witt等人，2001)及(Pan及Kastin,2004a))。該等研究及主要結果之實例展示於表1中。各參考文獻就其關於血腦障壁之滲透之教示全部併入本文中。
關於第一項結合，結合肽之增加之分子大小似乎並不阻礙滲透性。向阿片樣肽亮胺酸腦啡肽類似物(MW=726)添加肽類載體SynB1(MW=2,099)使得尺寸幾乎增加4倍，但亦使得大腦吸收增加18倍(Rousselle等人，2003)。類似地，向腦啡肽類似物添加二醣部分使其靜脈內投藥後抗傷害活性增加最多21倍(Elmagbari等人，2004)。
2個重要因素，即親脂性及鹼度有助於在無需特異運輸體或載體的情況下增加肽穿過血腦障壁之滲透性。肽之親脂性特徵可藉由與疏水性部分(例如多脂族鏈(polyaliphatic chain))結合或芳族殘基(與Phe相比，例如氯-Phe)之鹵化來改變。已展示與未修飾者相比，多胺修飾之蛋白質及肽更有效地穿過血腦障壁(Poduslo及Curran,1996a；b；Poduslo等人，1999)。亦已展示(Tamai等人，1997)小型肽之增加之鹼度為經由吸附介導之內飲作用(AME)穿過血腦障壁運輸之重要決定因素。
除直接修飾肽外，存在數種具有改善之於CNS中之藥物吸收的其他藥物輸送策略。該等策略包括脂質體、膠束或奈米顆粒介導之穿過血腦障壁的肽輸送(Kreuter等人，2003；Pan及Kastin,2004b)。該等新穎藥物輸送技術亦可適用於本文中所揭示且在此項技術中已知之神經肽類組合物。
存在若干肽工程化策略以改善神經肽穿過血腦障壁之滲透性。該等策略概括於圖6中。然而，上述研究均未展示組合該等策略以進一步提高肽穿過血腦障壁之滲透性之系統方法。本文揭示將組合之該等肽工程化策略應用於已知抗痙攣神經肽，諸如生長抑素或甘丙肽，藉此經由靜脈內(i.v)或皮下(s.c)投藥途徑使得該等肽可抗痙攣。
本文揭示用於增加穿過血腦障壁之滲透性的方法及組合物。"增加"意謂與野生類型、非變更或原生肽相比，或與對照組合物相比，組合物能夠穿過血腦障壁之更高百分數。例如，當與對照、原生或野生類型肽或組合物相比時，增長比率可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、 61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000百分比。
本文尤其揭示具有增加之血腦障壁滲透性之組合物，其中該組合物包含當與肽之未變更形式相比時具有增加之親脂性特徵及增加之鹼度的肽(圖7)。亦揭示具有增加之血腦障壁滲透性之組合物，其中該組合物包含當與肽之未變更形式相比時具有增加之親脂性特徵、增加之鹼度及增加之糖基化的肽。
本文亦揭示增加肽之血腦障壁滲透性之方法，其包含與該肽之未變更形式相比增加肽之親脂性特徵且增加鹼度。另一增加肽之血腦障壁滲透性之方法，其包含與肽之未變更形式相比增加肽之親脂性特徵、增加鹼度及增加糖基化。
a)親脂性特徵
組合物之親脂性特徵可藉由將肽與(例如)疏水性部分相結合而增加。疏水性部分之實例包括(但不限於)多脂族鏈或芳族殘基。親脂性特徵亦可藉由增加芳族殘基或聚脂族試劑之鹵化而增加，諸如全氟己酸。
b)鹼度
組合物之鹼度可藉由引入帶正電之胺基酸殘基之均及雜寡聚物而增加，該等胺基酸殘基包括(但不限於)L或D異構體組態之離胺酸、精胺酸、高離胺酸、高精胺酸、鳥胺酸、2,3-二胺基丙酸、2,4二胺基丁酸。
鹼度亦可藉由結合諸如精胺、亞精胺、聚醯胺基胺樹枝狀聚合物或多胺毒素及其衍生物之多胺基部分而增加。
c)糖基化
糖基化可藉由結合木糖、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、麥芽三糖、甘露糖、乳糖、蜜二糖或類似醣而引入。
d)載體
亦揭示包含本文所揭示之組合物之載體。能夠穿夠BBB之載體之實例可見Toyobuku等人(J Pharmacol Exp Ther.2003 Apr；305(1)：40-7.)。
C.治療方法
本文揭示治療涉及中樞神經系統之特定疾病及病症之方法或涉及需穿過血腦障壁之化合物的任何應用。多種疾病及病症可以本文所揭示之方法及組合物治療，其包括中風及相關缺血性疾病、慢性背痛、脊髓損傷、周邊神經損傷、外傷性大腦損傷、視網膜變性、神經退化性病症、白內障、抗生素誘導型耳毒性、阿茲海默症(Alzheimer's disease)、肌萎縮性側索硬化(ALS，魯蓋瑞氏症(Lou Gehrig's disease))、癲癇症(諸如全身發作性、部分發作性或難治性癲癇症)、亨廷頓氏症(Huntington's disease)、帕金森氏病症(Parkinson's disease)、多發性硬化症、慢性背痛、肌肉纖維疼痛、帶狀疱疹後遺神經痛、糖尿病性神經病變、外傷性單神經病變、複雜區域疼痛症候群、輔佐性痛覺缺失、脊神經根切斷術/神經切除、截肢前痛覺缺失/截肢、癲癇發生/外傷、化學暴露、癲癇持續狀態、化學療法誘導型神經病、癌症、阿片戒斷及慢性神經性疼痛。下文更詳細論述投藥方法及途經、劑量及醫藥組合物。
關於本文中所揭示之組合物用以治療脊髓損傷及多發性硬化症之用途，將以下參考文獻就其關於治療該等疾病之教示在此全部併 入：Hawes JJ,Narasimhaiah R,Picciotto MR Galanin and galanin-like peptide modulate neurite outgrowth via protein kinase C-mediated activation of extracellular signal-related kinase.Eur J Neurosci.2006年6月；23(11)：2937-46；Suarez V，等人，The axotomy-induced neuropeptides galanin and pituitary adenylate cyclase-activating peptide promote axonal sprouting of primary afferent and cranial motor neurons Eur J Neurosci.2006年9月；24(6)：1555-64。
本文所揭示之組合物及方法亦可適用於預防(例如)缺氧性損傷、增加人體生長激素分泌、控制促乳素自垂體腺瘤釋放、延長嗎啡鹼痛覺喪失，適用作抗抑鬱劑且適用於預防飲食失調症。
亦揭示治療疼痛及其他神經性病症之方法，其包含向需要之患者投與有效量之如本文所揭示之多肽。
本文所揭示之方法及組合物亦可用於預防、改善或治療神經性病症，諸如彼等上文所揭示且熟習此項技術者所已知的神經性病症。
本文所揭示之方法及組合物可用於與其他組合物或治療方法相結合。(例如)下列藥物及種類之藥物可與本文所揭示之組合物組合用於疼痛、癲癇症、神經保護及抑鬱、雙極症、其他精神錯亂以及用於任何其他藉由本文所揭示之組合物可治療之疾病或病症：阿片及阿片樣肽、嗎啡鹼、羥基嗎啡鹼、芬太尼(fentanyl)、奧施康定(oxycodone)、可待因(codeine)；辣椒素；以及抗癲癇藥物類，包括(但不限於)痛痙寧(carbamazepine)、撲米酮(primidone)、加巴噴丁(gabapentin)、普瑞巴林(pregabalin)、地西泮(diazepam)、非胺酯(felbamate)、氟非胺酯(fluorofelbamate)、拉莫三嗪(lamotrigine)、拉庫醯胺(lacosamide)、左乙拉西坦(levetiracetam)、苯巴比妥(phenobarbital)、苯妥英(phenytoin)、磷苯妥英(fos-phenytoin)、妥泰(topiramate)、丙戊酸鹽、胺己烯酸、唑尼沙胺(zonisamide)、奧卡西 平(oxcarbazepine)、非類固醇消炎藥物(NSAID)、局部麻醉劑(諸如利多卡因(lidocaine))、麩胺酸酯受體拮抗劑、NMDA拮抗劑、α-腎上腺素受體促效劑及拮抗劑、腺苷、大麻鹼、NK-1拮抗劑(CI-1021)、抗抑鬱劑(例如阿米替林(amitriptyline)、去甲丙咪嗪(desipramine)、丙米嗪(imipramine))，甘丙肽、生長抑素、δ睡眠誘導肽、腦啡肽、催產素、膽囊收縮素、降血鈣素、大腦皮質抑素(cortistatin)(具有獨特功能的生長抑素神經肽家庭成員)、痛敏肽(nociceptin)之類似物及衍生物及其他神經肽類治療劑及普流尼克(pluronic)P85嵌段共聚物。
下列藥物及種類之藥物可與本文所揭示之組合物相組合用於阿茲海默症：澱粉狀蛋白降低劑，諸如弗祿裏贊(Flurizan)；加蘭他敏(galantamine，加蘭(Razadyne))；利凡斯的明(rivastigmine，艾斯能(Exelon))；多奈哌齊(donepezil，安理申(Aricept))；他克林(tacrine，康耐斯(Cognex))；美金剛(memantine，鹽酸美金剛(Namenda))；及用於阿茲海默症之疫苗。亦揭示治療需要穿過血腦障壁之組合物之患者的方法，其包含鑑定欲用於治療該患者之組合物；藉由增加該組合物之親脂性及鹼度將組合物改質；且向需要之患者投與該經改質之組合物。
"組合"意謂除本文所揭示之組合物外一或多種其他組合物可投與患者。該等組合物可。
亦揭示治療需要穿過血腦障壁之組合物之患者的方法，其包含鑑定欲用於治療該患者之組合物；藉由增加該組合物之親脂性、糖基化及鹼度而將組合物改質；且向需要之患者投與該經改質之組合物。
亦揭示治療需要穿過血腦障壁之組合物之患者的方法，其包含鑑定欲用於治療該患者之組合物；藉由增加該組合物之親脂性、糖基化及鹼度而將組合物改質；且將該經改質之組合物插入載體中；向需要之患者投與該載體。
亦揭示治療需要穿過血腦障壁之組合物之患者的方法，其包含鑑定欲用於治療該患者之組合物；藉由增加該組合物之親脂性及鹼度而將組合物改質；且將該經改質之組合物插入載體中；及向需要之患者投與該載體。
1.使用該等組合物作為研究工具之方法
所揭示組合物可以多種方式用作研究工具。例如，諸如SEQ ID NOs：1-55之所揭示組合物可用作(例如)研究癲癇症之試劑。
該等組合物在組合化學方案或其他篩選方案中可用作(例如)用以分離具有所需功能特性之諸如甘丙肽促效劑或拮抗劑或部分促效劑之分子的標靶。
該等組合物可用於發現神經系統中不同神經肽、其他神經遞質素、受體及離子通道之間的個別及網路交互作用。例如，所揭示組合物可用於發現甘丙肽受體拮抗劑與作用於相同神經元上所表現之分子標靶的藥物之間的協同交互作用。該等陽性藥物-藥物相互作用係有利的，此係由於當兩種藥物組合施用時其可改善治療之功效或/及安全性。
所揭示組合物可如本文所論述作為微陣列中之試劑或作為探測或分析已存在微陣列之試劑使用。所揭示組合物可以任何已知方法使用以分離或鑑別單一核苷酸多態現象。該等組合物亦可以與晶片/微陣列有關之篩選檢定之任何已知方法使用。該等組合物亦可以使用所揭示組合物之電腦可讀實施例以(例如)研究相關性或以進行與所揭示組合物有關之分子模型分析的任何已知方式使用。
2.基因修飾及基因中斷之方法
所揭示組合物及方法可在任何可經受靶向基因中斷及修飾之動物中用於該等事件。例如，產生甘丙肽之基因可經變更以表現具有增加之血腦障壁滲透性之甘丙肽類似物。基因修飾及基因中斷係指關於 在諸如哺乳動物之動物中以經由該哺乳動物之生殖系傳遞該修飾之方式選擇性移除或更改基因或染色體片段之方法、技術及組合物。一般而言，如(例如)本文中所描述以經設計以同源地與某細胞內所含有之特定染色體的區域重組的載體使該細胞轉型。此同源重組事件可產生在(例如)以DNA所包圍之構架中具有所引入外源DNA之染色體。此類型之方案允許諸如點突變之極特異突變引入細胞內所含有之基因組中。進行此類型之同源重組之方法揭示於本文中。
在哺乳動物細胞中進行同源重組之較佳特徵之一者為細胞應能夠培養，此係由於所需重組事件以低頻率發生。
經由本文所描述之方法產生細胞後，可經由幹細胞技術或選殖技術自此細胞產生動物。例如，若核酸經轉染於其中之細胞為有機體之幹細胞，則轉染及培養後該細胞可用於產生於生殖系細胞中含有該基因修飾或中斷之有機體，其接著可用以產生在其所有細胞中具有該基因修飾或中斷之另一動物。在用於產生於其所有細胞中含有該基因修飾或中斷之動物的其他方法中，可使用選殖技術。該等技術通常採用經轉染細胞之核且經由融合或替換以卵母細胞融合該經轉染之核，其隨後可經操縱以產生動物。使用選殖代替ES技術之程序的優點在於除ES細胞以外的細胞可轉染。例如，極易於培養之成纖維細胞可用作經轉染且具有基因修飾或中斷事件發生，且隨後源自該細胞之細胞可用於選殖全動物之細胞。
D.組合物
揭示欲用於製備所揭示組合物之組份以及組合物本身且其欲用於本文所揭示之方法中。本文揭示該等及其他材料，且應瞭解當揭示該等材料之組合、子集、交互作用、基團等時，儘管不會明確揭示對該等化合物之各種個別及集體組合及置換之特定引用，但本文中尤其涵蓋且描述各者。例如，若揭示且論述特定甘丙肽類似物，且論述可 對包括變異體之大量分子進行之大量修飾，則除非特定指示相反情況，否則尤其涵蓋甘丙肽類似物之每一及所有組合及置換及可能之修飾。因此，若揭示一類分子A、B及C以及一類分子D、E及F，且揭示組合分子A-D之實例，則即使各者並未單獨敍述，單獨且集體涵蓋各者，此意謂認為揭示組合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E及C-F。同樣亦揭示該等物之任何子集或組合。因此認為揭示(例如)子群A-E、B-F及C-E。此概念適用於本申請案之全部態樣，包括(但不限於)製備及使用所揭示組合物之方法之步驟。因此，若存在可進行之多種其他步驟，則應瞭解該等其他步驟之每一者可與所揭示方法之任何特定實施例或實施例之組合一起進行。
1.關於血腦障壁滲透性之組合物
因主要位於海馬區之過激神經元之過度釋放而導致自發癲癇發作。大腦藉由採用γ-胺基丁酸(GABA)平衡抑制機制與麩胺酸酯所介導之激勵機制(Wasterlain等人，2002)來控制發作。神經傳遞藉由包括神經肽Y、甘丙肽、痛敏肽/孤啡肽FQ(orphanin FQ)及內嗎啡肽-1(endomorphin-1)之大量內源神經肽調節。圖1說明自主維持癲癇持續狀態中海馬區之神經元通路中麩胺酸酯、GABA與神經肽之間的可能關係。
已使用藥理學與遺傳(基因剔除或過度表現)方法闡明該等神經肽之作用。例如Oberto及其合作者(Oberto等人，2001)使用轉基因小鼠表徵扁桃體中GABA能系統、神經肽Y與神經肽Y(1)受體之間的交互作用(亦綜述於(Eva等人，2004))中。類似地，Leresche及其合作者(Leresche等人，2000)展示生長抑素經由突觸前機制抑制GABA介導之神經傳遞。於2個轉基因小鼠模型中研究海馬區中經甘丙肽調節之麩胺酸酯之釋放：基因剔除甘丙肽(GalKO)及過度表現(GalOE)小鼠(Mazarati等人，2000)。於GalKO及GalOE小鼠中，中心投與甘丙肽分 別使去極化誘導之麩胺酸酯釋放升高及降低指示海馬趾甘丙肽經由麩胺酸能系統作為抗痙攣劑(Mazarati,2004)。
至少三種神經肽及其受體經展示在癲癇發生中起作用：甘丙肽、生長抑素及神經肽Y。邊緣癲癇持續狀態後甘丙肽於海馬區中之免疫反應性減少。向海馬趾齒狀門注射甘丙肽預防邊緣癲癇持續狀態發作且停止癲癇持續狀態。因此甘丙肽似乎充當抑制癲癇持續狀態之內源抗痙攣劑(Mazarati等人，1998)。此之證據藉由檢查具有過度表現甘丙肽之轉基因小鼠之表型而展示(Kokaia等人，2001)。在此研究中，甘丙肽抑制誘發癲癇發生。
神經肽調節神經遞質釋放及發作控制之作用已公認為新穎治療性治療之機遇。如下文所描述，大量公開研究展示神經肽在動物模型中之有效抗痙攣活性。
a)神經肽Y及強啡肽
神經肽Y於活體外大鼠海馬趾切片中抑制癲癇狀活性(Klapstein及Colmers,1997)。在另一研究(Baraban等人，1997)中，缺乏神經肽Y之小鼠響應紅藻胺酸具有無法控制之發作。此外，93%之基因剔除小鼠死亡，而野生類型動物中死亡極少。腦室內神經肽Y預防投與紅藻胺酸所誘導之死亡。最後，神經肽Y之抗痙攣作用經證明經由Y5受體介導(Sperk及Herzog,1997)。
包括強啡肽之海馬趾阿片樣肽與癲癇發生及癲癇發作有關((Hong,1992)及(Solbrig及Koob,2004)所綜述)。電痙攣休克或扁桃體誘發所誘導之發作使得腦啡肽及強啡肽開始釋放，而亦引起強啡肽長期降低(Gall,1988)。如圖5中所說明強啡肽之抗痙攣活性展示於自主維持癲癇持續狀態之大鼠模型中(Mazarati及Wasterlain,2002)。
關於強啡肽，i.h.注射神經肽Y亦降低自主維持癲癇持續狀態模型中發作之分佈(Mazarati及Wasterlain,2002)。投與側腦室中之NPY 似乎為海人草酸誘導之發作的有效抑制劑(Woldbye等人，1997)。已暗示抗癲癇作用由神經肽Y5受體所介導，即以Y5R缺乏之小鼠所進行之研究中所證實的結果(Marsh等人，1999)。
b)甘丙肽及其類似物
自從Mazarati及其合作者之工作以來已認為甘丙肽為可能的抗痙攣劑(Mazarati等人，1992)。當直接注射於側腦室或海馬區中時，甘丙肽降低大鼠中由椰子苦毒素誘導之誘發痙攣的嚴重程度。在癲癇持續狀態動物模型中，在穿孔路徑刺激(PPS)之前或其後門周邊注射甘丙肽縮短發作之持續期間(Mazarati等人，1998)。該等作用藉由共投與甘丙肽拮抗劑而逆轉。如圖2中所說明，低至50至500皮莫耳之劑量有效中止既定自主維持癲癇持續狀態(SSSE)。
治療癲癇症之一策略為使用以神經肽為主之療法。作為概念驗證，最近展示兩種非肽甘丙肽受體促效劑加爾農(galnon)及加米克(galmic)具有抗痙攣及抗癲癇活性(分別為(Saar等人，2002)及(Bartfai等人，2004))。當全身投與時，兩種化合物在癲癇症之動物模型中似乎對GalR1或GalR2受體均具有中等微莫耳親和力，且顯示抗痙攣活性。如圖3中所示，加爾農(galnon)(2 mg/kg，i.p.)或甘丙肽(0.5 nmole，i.c.v)對小鼠伸戊基四唑(PTZ)誘導測試之潛伏時間與發作得分均具有可比作用(Saar等人，2002；Ceide等人，2004)。
下表展示NAX 5055(GAL-BBB2)對甘丙肽受體之親和力：
當i.p.注射時，發現甘丙肽降低小鼠中伸戊基四唑誘導之發作的 嚴重程度且增加其潛伏時間。亦證明海馬趾內注射加爾農(galnon)縮短自主維持癲癇持續狀態之持續期間。類似地，當i.h.或i.p.注射時galmic阻斷癲癇持續狀態。因此，該等2種甘丙肽促效劑為有效之抗痙攣劑，且使甘丙肽受體有效用作癲癇症之治療標靶。
甘丙肽為30個胺基酸之神經肽，但SAR研究鑑定與全長肽相比N末端部分仍為高度有效促效劑(Langel及Bartfai,1998)。甘丙肽(1-16)類似物可用於本文所揭示之方法，其中Gly1殘基經如下所示之N-甲基-Gly(肌胺酸，SAR)置換：
Gly1之N甲基化保護該肽之N末端免於加速蛋白水解降解，而其並不明顯改變其對甘丙肽受體之親和力(Rivera Baeza等人，1994)。SAR研究鑑定對生物活性重要之下列殘基：Gly1、Trp2、Asn5、Tyr9及Gly12(Land等人，1991)。同一研究鑑定N末端延長導致生物活性損失。另一方面，當與較大結構連接時，甘丙肽(1-16)之C末端部分似乎極穩健(Pooga等人，1998)。因此，設計[Sar1]甘丙肽類似物之策略僅關於胺基酸替代與用於生長抑素之策略類似，但其差異在於在C末端，而非在N末端引入延長。
當i.p.給與時甘丙肽類似物GAL-BBB2(SEQ ID NO：3)顯示有效抗痙攣活性(ED50約3 mg/kg)(實例2)。具有最有效及持久抗痙攣活性之最小甘丙肽類似物可獲自GAL-BBB2。該等序列之實例可見於SEQ ID NO：4-29(詳述於實例2中)。當與(例如)甘丙肽相比時該等肽可具有增加之穩定性。亦揭示甘丙肽類似物GAL-BBB3、GAL-BBB4、GAL-BBB5、GAL-BBB6、GAL-BBB7及GAL-BBB8(SEQ ID NO：49-54)。此等物亦可各具有抗痙攣活性。
進行有限結構-功能關係研究以鑑別當全身投與時保持抗痙攣活 性之GAL-BBB2類似物之最小片段。合成含有C末端及中心截短之甘丙肽類似物且測試。此外，進行C末端基元之有限結構-功能關係研究以最優化該類似物穿過血腦障壁之滲透性。圖14說明結構-功能研究情形中GAL-BBB2之結構。
下文論述各種甘丙肽類似物及用於其設計及合成之方法(參見實例1及2)。
c)生長抑素
存在許多證據線索，其展示大腦生長抑素作為發作及癲癇發生之抑制劑起重要作用(Vezzani及Hoyer,1999)。生長抑素為表現於海馬區之GABA能中間神經元中之主要神經肽。此外，麩胺酸酯刺激自大鼠海馬趾神經元釋放之生長抑素(Fontana等人，1996)。癲癇發作後生長抑素及其受體之表現顯著改變，且亦已假定該神經肽在癲癇發生期間控制神經元興奮性(綜述於(Schwarzer等人，1996)及(Vezzani及Hoyer,1999)中)。受體亞型基因剔除及藥理學研究已表明海馬區麩胺酸酯介導之神經傳遞中至少涉及四種亞型之生長抑素受體(sst1、sst2、sst3及sst4)(Pikwo等人，1996)。Csaba及其合作者(Csaba等人，2004)之近期研究提供生長抑素sst2A受體在癲癇發生及抗痙攣活性中可起重要作用之其他證據。
生長抑素之抗痙攣活性之最直接證據來自其對動物癲癇症模型中發作及癲癇發生之藥理學作用的研究(Vezzani等人，1991；Perez等人，1995；Mazarati及Wasterlain,2002)。(Mazarati及Wasterlain,2002)。注射生長抑素或其亞型選擇性類似物使得發作次數降低且使得由紅藻胺酸或喹諾酮酸誘導之發作潛伏時間加長(Vezzani等人，1991)。類似地，注射RC-160生長抑素sst2選擇性促效劑降低具有伸戊基四唑誘導之強直陣攣性發作之動物的數目(Perez等人，1995)。如圖4種所說明，海馬趾內注射(i.h.)生長抑素急劇降低自主維持癲癇持續 狀態之大鼠模型中發作之分佈(Mazarati及Wasterlain,2002)。
生長抑素為具有單一雙硫橋之14個胺基酸之下丘腦肽，其最初於1973年發現(Brazeau等人，1973)。生長抑素之序列展示如下：
廣泛SAR研究已鑑別5種關鍵殘基：Phe6、Phe7、Trp8、Lys9及Phe11，而丙胺酸取代之Gly2、Lys4、Asn5、Thr10、Thr12或Ser13並不明顯影響生物活性(Vale等人，1975)。此外，含有D-Trp8之類似物經展示更有效，此係由於對於蛋白水解之更大阻力及/或活性構形之更大穩定性。
[D-Trp8]或[L-Trp8]生長抑素可作為代謝穩定類似物與本文所揭示之方法一起使用。為增加鹼度，Thr、Ser或Asn殘基可系統地經等空間相似但帶正電之DAB(二胺基丁酸)或DAP(二胺基丙酸)殘基替換。為增加親脂性，Lys-十六醯基部分可引入於Lys4或Asn5之位置，且/或Phe殘基可經鹵化等效物氯-Phe殘基取代。如表5中所摘要，合成9種類似物且檢定其對生長抑素受體之親和力。將並不負性影響高親和力結合之修飾組合在一起。該等第二代類似物包含2-4組合之修飾。該等序列可見於SEQ ID NO：31-36。
接下來，將N末端延長引入[D-Trp8]或[L-Trp8]生長抑素。該等延長(BBB/PK調節劑，如圖8中所示)用於雙重目的：(1)提高藉由被動與主動機制穿過血腦障壁之滲透性；及(2)藉由添加減少清除且提高蛋白水解降解之阻力的龐大部分改善神經肽藥物之藥物動力學特性。由於該等"BBB/PK調節劑"為新概念，因此使用構成延長之數種結構模組之若干組合。表6提供關於所提出模組之結構及功能之資訊。
亦揭示與本文所揭示之組合物及方法一起使用之奧曲肽。例如，SEQ ID NO：40揭示奧曲肽分子。圖21展示工程化奧曲肽之化學 結構及圖示。奧曲肽為對sst2亞型之生長抑素受體(存在5種已知亞型)選擇性更大之生長抑素類似物。已展示生長抑素與癲癇症及癲癇發生有關。下列參考文獻就其關於奧曲肽、生長抑素及癲癇症之教示全部併入：Vezzani A及Hoyer D,Eur J Neurosci,1999，第11卷，第3767-3776頁。類似地，生長抑素在傷痛刺激中之作用展示於Chapman V及Dicjkenson AH,Neuropeptides 1992，第23卷，147-152中，該案就其關於生長抑素、奧曲肽及傷痛刺激之教示以引入的方式全部併入本文中。最近已描述生長抑素在發展阿茲海默症中之作用(Saito T等人，Nature Medicine,2005，第11卷，第434-439頁，該案就其關於奧曲肽、生長抑素及阿茲海默症之教示以引入的方式全部併入本文中。以下論述用於設計及合成生長抑素類似物之方法(參見實例1)。
d)δ睡眠誘導肽
δ睡眠誘導肽(DSIP)為抗痙攣神經肽(Schoenenberger 1984；Kovalzon及Strekalova 2006)。DSIP與皮啡肽(一種μ阿片促效劑)共有某些結構相似性。DSIP於硫氰苯環己哌啶(metaphit)誘導之癲癇症模型中可有效抑制發作。此外，已展示DSIP增強丙戊酸鹽於同一癲癇症模型中之抗痙攣的活性(Hrncic,Stanojlovic等人2006)。此外，此肽經展示調節腦啡肽與阿片受體之間的交互作用，使得DSIP產生止痛作用(Nakamura,Nakashima等人1986)。DSIP之神經保護活性展示於毒性腦水腫模型中。據報導DSIP及某些類似物穿透BBB(Kastin,Nissen等人1981；Kastin,Banks等人1982)。
2.具有增加之血腦障壁滲透性之組合物
已展示本文中所揭示之組合物增加血腦障壁之滲透性。如本文中所描述，揭示一組神經肽類似物，其經設計且合成以測試其以高親和力與其相應受體結合之能力。此組包括每個神經肽約十個類似物。進一步測試高親和力類似物之穿透血腦障壁之能力。第一代類似物得 出結論後，合成且評估第二代類似物，且隨後合成且評估第三代類似物。選擇最具遠景之類似物(具有增強之穿過血腦障壁滲透性之高親和力配位體)以證實其在功能檢定中之促效劑活性。隨後活體內藥理學上測試一子組該等類似物(具有增加之穿過血腦障壁之滲透性的有效促效劑)。
為變成藥物，神經肽類似物應具有若干重要特徵，包括：(1)高效力及選擇性；(2)代謝穩定性；(3)相對長半衰期及全身循環降低之清除；及(4)增加之穿過血腦障壁之滲透性。多數神經肽顯示高效力及選擇性。通常藉由肽骨架修飾及/或以蛋白水解酶不識別之殘基替換敏感殘基來引入代謝穩定性。增加之半衰期及降低之消除率可藉由將聚合物基部分與肽結合(例如PEG化)而有效地獲得。穿過血腦障壁之更大滲透性可藉由增加親脂性或陽離子化，以及藉由添加前藥、營養運輸模擬物或糖基化而引入。理想藥物神經肽之結構圖示於圖8中。
如圖8所說明，神經肽工程化中之新概念為"BBB/PK調節劑"。BBB/PK調節劑包含具有親脂性、陽離子型及運輸模擬物模組之聚合物基龐大部分；該調節劑用於雙重目的，即增強穿過血腦障壁之滲透性及改良藥物動力學特性。陽離子型及親脂性模組分別促進與帶負電之膜表面的相互作用，且改善穿過膜之擴散。主動運輸模擬物結構之功能為藉由增強與位於腦內皮細胞之表面上之特異營養運輸體之相互作用而增加神經肽在腦中之特異吸收。包含所有該等模組之結構框架亦可改善肽之藥物動力學特性，模擬/代替通常使用之PEG部分的作用。作為模型神經肽之N或C末端延長測試該等龐大部分，且本文中亦揭示神經肽結構中之更多通用連接位置。
下列策略用以設計具有增加之血腦障壁滲透性的神經肽類似物：若可獲得則以代謝穩定類似物開始。鑑別適於側鏈替換之類似物 中的其他AA位置。鑑別適於引入龐大部分之N及C末端之位置。藉由側鏈替換增加類似物之親脂性及鹼度。向肽類似物引入延長將進一步增加其親脂性及鹼度，同時改善藥物動力學特性(BBB/PK調節劑)。在延長處包括營養模擬物結構以提高血腦障壁穿透之特異性。組合具有經擴充部分修飾之側鏈的類似物(BBB/PK調節劑)。
成功設計該等類似物之關鍵在於正確組合上述修飾。為實現此目標，可採用設計及估算個別組修飾及其最優組合之系統方法。大體策略示意性地說明於圖10中。如本文所揭示之胺基酸之修飾可在固相肽合成期間使用自動肽合成器引入。所有非天然胺基酸或共軛結構為市售Fmoc保護之衍生物。
應瞭解當提及變異體時，該等變異體指定依賴於所表示特定取代之特定特性，然而亦涵蓋其他取代、缺失及/或插入，例如在除特定表示之位置外之位置上的保守性取代、插入及/或缺失，其限制條件為變異體保留所揭示活性。
揭示具有諸如增加之血腦障壁滲透性的所需特性之甘丙肽之類似物。亦揭示具有增加之血腦障壁滲透性之生長抑素的類似物。如以上所定義，"增加"("increasing"或"increased")意謂與野外類型、非變更或原生肽或對照組合物相比，更高百分數之組合物能夠穿過血腦障壁。例如，當與對照、原生或野生類型肽或組合物相比時，增長比率可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、 100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000百分比。
亦應瞭解實例之表中所論述之各個別類似物亦具有可自組合物之所揭示活性測定之基本滲透性。應瞭解該等活性增加之百分數可由任一時刻所獲得之野生類型、原生或對照肽之基本滲透性計算，除非另有所述，否則其提供在檢定之分析範圍中之數據。
揭示如實例1及2中所揭示已知或野生類型肽之取代、缺失、修飾、添加及延長。例如表7中揭示生長抑素之N末端延長。本文中所揭示之延長可與原生、野生類型或已知肽一起使用，或可用於與已知肽之類似物的組合中。例如，可對已知肽進行側鏈修飾，且隨後與如本文所揭示之延長組合。
亦揭示胺基酸取代及添加，其中取代或添加為非天然產生物質。實例包括(但不限於)肌胺酸、二胺基丁酸(DAB)、二胺基丙酸(DAP)、Lys-十六醯基、氯-phe、胺基己酸(AHX)、全氟己酸(PerFHX)、8-胺基-3,6-二噁辛酸及寡Lys，第三白胺酸。
進一步揭示胺基酸殘基經諸如非肽間隔劑之"骨架假體"替換。實例包括(但不限於)胺基戊酸或胺基己酸。此可使得在不顯著改變關鍵殘基之間的間隔之條件下使整體分子大小最小化。該間隔劑可替換(例如)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40或50個殘基。
本文亦揭示其中構形改變之胺基酸之變型。例如本文揭示D-Lys、D-Trp及L-Trp。
揭示諸如甘丙肽及生長抑素之已知化合物之類似物，其與(例如)親本序列(諸如甘丙肽或生長抑素)具有至少40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之一致性，且其中該類似物包含至少一種、至少兩種、至少三種、至少4種、至少5種或至少6種本文所揭示之任一取代、缺失、添加或延長。
3.序列相似性
應瞭解如本文中所探討術語同源性及一致性之使用意謂與相似性相同之情況。因此(例如)若詞同源性之使用用在兩個非天然序列之間，則應瞭解此不必表明該等兩個序列之間的進化關係，而是著眼於其核酸序列之間的相似性或相關性。將用於測定兩個進化上相關之分子之間的同源性之許多方法常規應用於任何兩種或兩種以上核酸或蛋白，用以量測序列相似性而無關於其是否為進化上相關或不相關。
一般而言，應瞭解一種定義本文中所揭示基因及蛋白質之任何已知變異體及衍生物或會出現之變異體及衍生物的方法為經由依據與特定已知序列之同源性定義該等變異體及衍生物。本文中所揭示特定序列之此一致性亦在本文中別處探討。一般而言，本文中揭示之基因及蛋白質之變異體通常與確定序列或原生序列具有至少約40、50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99百分比之同源性。熟習此項技術者易於瞭解如何測定兩種蛋白質或核酸諸如基因之同源性。例如，可在將兩個序列比對後以便同源性程度最高時計算同源性。
另一計算同源性之方法可藉由已公開算法進行。用於比較之最佳序列比對可藉由以下方法進行：Smith及Waterman Adv.Appl.Math.2：482(1981)之局部同源算法；Needleman及Wunsch,J.MoL Biol.48：443(1970)之同源性比對算法；Pearson及Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444(1988)之尋求相似法；電腦實施該等算法(Wisconsin Genetics Software Package中之GAP、BESTFIT、FASTA及 TFASTA,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison WI)；或檢查。
可藉由(例如)以下文獻中所揭示之算法獲得核酸之相同類型之同源性：Zuker,M.Science 244：48-52,1989；Jaeger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7706-7710,1989；Jaeger等人，Methods Enzymol.183：281-306,1989，彼等案至少就其與核酸比對相關之材料以引入的方式併入本文中。應瞭解通常可使用該等方法之任一種，且在某些情況下，該等各種方法之結果可不同，但熟習此項技術者應瞭解若該等方法之至少一種發現一致性，則將認為該等序列具有確定一致性且將揭示於本文中。
例如，如本文中所用，所述與另一序列具有特定百分比同源性之序列係指具有如藉由上述計算方法之任一或多者計算之所述同源性的序列。例如，若使用Zuker計算方法計算出第一序列與第二序列具有80%同源性，則即使如藉由其他計算方法之任一者所計算第一序列與第二序列並不具有80%同源性，如本文中所定義第一序列與第二序列仍具有80%同源性。作為另一實例，若使用Zuker計算方法與Pearson及Lipman計算方法計算出第一序列與第二序列具有80%同源性，則即使如藉由Smith及Waterman計算方法、Needleman及Wunsch計算方法、Jaeger計算方法或任一其他計算方法所計算，第一序列與第二序列並不具有80%同源性，如本文中所定義第一序列與第二序列仍具有80%同源性。作為另一實例，若使用各計算方法計算出第一序列與第二序列具有80%同源性(儘管實際上不同計算方法通常將得到不同計算同源性百分數)，則如本文中所定義第一序列與第二序列具有80%同源性。
4.核酸
存在多種本文所揭示之分子，肽諸如各種甘丙肽及生長抑素類 似物。應瞭解該等肽類分子可由大量核酸編碼，包括(例如)編碼(例如)SEQ ID NO：1-55之核酸，且應瞭解(例如)當載體於細胞中表現時，所表現之mRNA通常由A、C、G及U組成。
a)序列
存在多種與例如甘丙肽有關之序列，其可由(例如)www.pubmed.gov進入基因銀行資料庫搜尋。該等序列及其他序列以及其中所含有之個別子序列以引用方式全部併入本文中。
在本文中使用一特定的SEQ ID NO：3序列以(例如)例示所揭示之組合物及方法。應瞭解除非特別指示，否則與此序列有關之描述適用於與甘丙肽類似物有關之任何序列。熟習此項技術者應瞭解如何解析序列差異及差別且將與某特定序列相關之組合物及方法調整成適於其他相關序列(亦即甘丙肽類似物之序列)。舉例言之，依據本文所揭示及在此項技術中已知之資訊，可設計任何甘丙肽相關性核酸序列之引子及/或探針。
5.向細胞(載體)輸送組合物
於活體外或活體內將核酸或肽輸送至細胞之組合物及方法頗多。本文所揭示之載體可以多種方式使用。在一實例中，本文所揭示之載體可用於將編碼本文所揭示之肽的核酸輸送至細胞或患者。載體亦可與肽一起使用以促進如以上所討論之穿過血腦障壁。
與載體有關之方法及組合物大部分可分成兩種類型：以病毒類傳遞系統及非病毒類傳遞系統。例如，核酸及肽可經由多種直接輸送系統諸如電穿孔、脂質轉染、磷酸鈣沉澱、質體、病毒載體、病毒核酸、噬菌體核酸、噬菌體、黏質體來輸送，或經由於細胞或諸如陽離子型脂質體之載劑中轉移遺傳物質來輸送。包括病毒載體、化學轉染物之適當轉染方式，或諸如DNA電穿孔及直接擴散之物理機械方法藉由(例如)Wolff,J.A.等人，Science 247,1465-1468,(1990)；及Wolff, J.A.Nature,352,815-818,(1991)描述。該等方法為此項技術中所熟知且易於改適以與本文中所描述之組合物及方法一起使用。在某些情況下，修飾該等方法將以特別適用於大型DNA分子。此外，該等方法可藉由利用載劑之靶向特徵而用於靶向某些疾病及細胞群體。為進一步改良組合物穿過血腦障壁之輸送，可使用TAT蛋白質轉導域(Dietz GP及Bahr M,Mol Cell Neurosci,2004，第27卷，第85-131頁)。
如本文中所用，質體或病毒載體為在無降解情況下向細胞運輸所揭示核酸或肽，諸如彼等與甘丙肽及生長抑素類似物有關之核酸或肽的試劑。在某些實施例中，傳遞系統源自於病毒或反轉錄病毒。病毒載體為(例如)腺病毒、腺病毒相關病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰質炎(Polio)病毒、AIDS病毒、神經元營養病毒、辛德畢斯(Sindbis)及其他RNA病毒，包括該等具有HIV骨架之病毒。亦較佳為與該等病毒共有使其適用作載體之特性的任何病毒家族。反轉錄病毒包括鼠莫洛尼氏(Maloney)白血病病毒、MMLV及表現MMLV作為載體之所需特性的反轉錄病毒。反轉錄病毒載體能夠比其他病毒載體攜帶更大遺傳有效載荷，亦即輸異基因或標誌基因，且由於此原因為通常使用之載體。然而，其在非增生細胞中並不適用。腺病毒載體為相對穩定且易於使用之載體，其具有高力價且可在氣溶膠調配物中輸送，且可轉染非分裂細胞。痘病毒載體為大型載體且具有若干用於插入基因之位點，其為熱穩定的且可在室溫下儲存。一較佳實施例為已工程化以便抑制病毒抗原引起之宿主有機體免疫反應之病毒載體。此類型之較佳載體將攜帶介白素8或10之編碼區。
病毒載體可比化學或物理方法具有更高之向細胞引入基因的處理能力。病毒載體通常含有非結構早期基因、結構晚期基因、RNA聚合酶III轉錄物、複製及殼體化所必需之反轉末端重複及控制病毒基因組轉錄及複製之啟動子。當工程化為載體時，通常移除病毒之一或多 種早期基因，且將代替所移除病毒DNA將基因或基因/啟動子匣插入病毒基因組中。此類型之建構體可攜帶最多約8 kb之外來遺傳物質。所移除早期基因之必要功能通常藉由已工程化以在轉錄中表現早期基因之基因產物的細胞株供應。
(1)反轉錄病毒載體
反轉錄病毒為屬於反轉錄病毒科族之動物病毒，其包括任何類型、亞科、種類或向性。一般而言反轉錄病毒載體經描述於Verma,I.M.,Retroviral vectors for gene transfer.於Microbiology-1985中，American Society for Microbiology，第229-232頁，Washington,(1985)，其以引入的方式併入本文中。使用反轉錄病毒載體用於基因治療之方法之實例描述於美國專利第4,868,116及4,980,286號；PCT申請案WO 90/02806及WO 89/07136；及Mulligan,(Science 260：926-932(1993))；其教示以引入的方式併入本文中。
反轉錄病毒大體上為其中填載核酸內容物之封裝。核酸內容物攜帶封裝信號，其確保所複製子分子將有效地封裝於封裝衣殼內。除封裝信號之外，存在大量分子，其為順式調控中所需以用於複製及所複製病毒之封裝。反轉錄病毒基因組通常含有gag、pol及env基因，其與製備蛋白質衣殼有關。gag、pol及env基因通常由轉移至靶細胞之外來DNA置換。反轉錄病毒載體通常含有：用於併入封裝衣殼之封裝信號；發送開始gag轉錄單元之信號之序列；反轉錄所必需之要素，包括結合反轉錄之tRNA引子之引子結合位點；在DNA合成期間引導RNA鏈轉換之末端重複序列；富含嘌呤之序列5'至3'LTR，其充當用於合成第二條DNA合成鏈之引導位點；及接近LTR末端之特定序列，其使得反轉錄病毒能夠插入DNA狀態以插入宿主基因組。gag、pol及env基因之移除允許約8 kb之外來序列插入病毒基因組中，變成反轉錄，且複製後封裝於新反轉錄病毒顆粒中。視各轉錄物之大小而 定此量之核酸足以輸送一至多個基因。插入物中較佳包括陽性或陰性可選擇標記以及其他基因。
由於多數反轉錄病毒載體中之複製機構及封裝蛋白質已移除(gag、pol及env)，因此通常藉由將其放置於封裝細胞株中而產生載體。封裝細胞株為已以含有複製及封裝機構但缺乏任何封裝信號之反轉錄病毒轉染或轉型之細胞株。當攜帶所選DNA之載體轉染入該等細胞株時，藉由輔助細胞順式調控提供之機構將含有所關注基因之載體複製且封裝於新反轉錄病毒顆粒中。機構之基因組並未封裝，此歸因於其缺乏必要信號。
(2)腺病毒載體
已描述複製缺陷腺病毒之結構(Berkner等人，J.Virology 61：1213-1220(1987)；Massie等人，Mol.Cell.Biol.6：2872-2883(1986)；Haj-Ahmad等人，J.Virology 57：267-274(1986)；Davidson等人，J.Virology 61：1226-1239(1987)；Zhang "Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis" BioTechniques 15：868-872(1993))。使用該等病毒作為載體之優點在於其受限於其可散佈至其他細胞類型之程度，此係由於其可在初始受感染細胞內複製，但無法形成新感染病毒顆粒。已展示重組腺病毒在直接、活體內輸送至氣管上皮、肝細胞、血管內皮、CNS實質及大量其他組織位點後達到高效率基因轉移(Morsy,J.Clin.Invest.92：1580-1586(1993)；Kirshenbaum,J.Clin.Invest.92：381-387(1993)；Roessler,J.Clin.Invest.92：1085-1092(1993)；Moullier,Nature Genetics 4：154-159(1993)；La Salle,Science 259：988-990(1993)；Gomez-Foix,J.Biol.Chem.267：25129-25134(1992)；Rich,Human Gene Therapy 4：461-476(1993)；Zabner,Nature Genetics 6：75-83(1994)；Guzman,Circulation Research 73：1201-1207 (1993)；Bout,Human Gene Therapy 5：3-10(1994)；Zabner,Cell 75：207-216(1993)；Caillaud,Eur.J.Neuroscience 5：1287-1291(1993)；及Ragot,J.Gen.Virology 74：501-507(1993))。重組腺病毒藉由與特異細胞表面受體結合，此後病毒經受體介導之內飲作用以與野生類型或複製缺陷腺病毒相同之方式內在化而實現基因轉導(Chardonnet及Dales,Virology 40：462-477(1970)；Brown及Burlingham,J.Virology 12：386-396(1973)；Svensson及Persson,J.Virology 55：442-449(1985)；Seth等人，J.Virol.51：650-655(1984)；Seth等人，Mol.Cell.Biol.4：1528-1533(1984)；Varga等人，J.Virology 65：6061-6070(1991)；Wickham等人，Cell 73：309-319(1993))。
病毒載體可為基於腺病毒之病毒載體，該腺病毒之E1基因已移除且該等病毒粒子(viron)產生於諸如人類293細胞株之細胞株中。在另一較佳實施例中，E1與E3基因均自腺病毒基因組中移除。
(3)與腺病毒相關之病毒載體
另一類型之病毒載體基於腺病毒相關病毒(AAV)。此缺陷細小病毒為較佳載體，此係由於其可感染多種細胞類型且對人類不具有致病性。AAV類型載體可運輸約4 kb至5 kb且已知野生類型AAV可穩定地插入染色體19中。含有此位點特異整合特性之載體較佳。此類型之載體之尤其較佳實施例為Avigen,San Francisco,CA所製備之P4.1 C載體，其可含有單純疱疹病毒胸苷激酶基因、HSV-tk及/或標誌基因，諸如編碼綠色螢光蛋白質GFP之基因。
在另一類型之AAV病毒中，AAV含有一對反轉末端重複(ITR)，其與至少一含有引導與異源基因可操作連接之細胞特異表現的啟動子之匣側接。在此情形中異源係指並非AAV或B19細小病毒之原生的任何核苷酸序列或基因。
通常AAV及B19編碼區已缺失，得到安全、無細胞毒性載體。 AAV ITR或其修飾賦予感染性及位點特異整合，但無細胞毒性，且啟動子引導細胞特異表現。美國專利第6,261,834號以引入的方式就其與AAV載體有關之材料併入本文中。
本發明之載體因此提供DNA分子，其能夠在大體上無毒性之情況下整合入哺乳動物染色體中。
病毒及反轉錄病毒中所插入基因通常含有啟動子及/或強化子以輔助控制所需基因產物之表現。啟動子通常為當關於轉錄起始位點於相對固定位置中時發揮作用之DNA之序列。啟動子含有RNA聚合酶及轉錄因子之基本交互作用所需之核心元件且可含有上游元件及反應元件。
(4)大型有效載荷病毒載體
大型人類疱疹病毒之分子遺傳實驗已提供可在允許以疱疹病毒感染之細胞中選殖、傳播且確立大型異源DNA片段之方式(Sun等人，Nature genetics 8：33-41,1994；Cotter及Robertson,.Curr Opin Mol Ther 5：633-644 1999)。該等大型DNA病毒(單純疱疹病毒(HSV)及埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus,EBV)具有向特異細胞傳遞人類異源DNA>150 kb之片段的可能性。EBV重組可在所感染B細胞中保留較大段DNA作為游離基因型DNA。攜帶個別株之最多330 kb之人類染色體組插入物似乎遺傳上穩定。該等游離基因之維持需要在以EBV感染期間組成型表現之特定EBV核內蛋白、EBNA1。另外，該等載體可用於轉染，其中大量蛋白質可活體外瞬間產生。疱疹病毒擴增子系統亦用以封裝>220 kb之DNA片段，且以感染可穩定地將DNA保持為游離基因之細胞。
其他適用之系統包括(例如)複製及宿主限制非複製牛痘病毒載體。
b)非核酸基系統
諸如編碼甘丙肽類似物之核酸之所揭示組合物可以各種方式輸送至靶細胞。例如，該等組合物可經由電穿孔或經由脂質轉染或經由磷酸鈣沉澱輸送。所選輸送機制將部分依賴於靶向細胞類型及輸送在(例如)活體內抑或活體外發生。
因此，該等組合物除所揭示變異體或載體外可包含(例如)脂質，諸如脂質體，諸如陽離子脂質體(例如DOTMA、DOPE、DC-膽固醇)或陰離子脂質體。視需要脂質體可進一步包含蛋白質以便於靶向特定細胞。包含化合物及陽離子脂質體之組合物的投藥可為投與血液以傳入靶器官或經吸入呼吸道中以靶向呼吸道之細胞。關於脂質體，參見例如Brigham等人Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol.1：95-100(1989)；Feigner等人Proc.Natl.Acad.Sci USA 84：7413-7417(1987)；美國專利第4,897,355號。此外，化合物可作為可靶向諸如巨噬細胞之特定細胞類型的微囊之組份投與，或其中化合物自微囊之擴散或化合物自微囊之輸送經設計成特定速率或劑量。
在上述包括向患者之細胞投與外源性DNA或在患者之細胞中吸收外源性DNA之方法(亦即基因轉導或轉染)中，組合物向細胞之輸送可經由各種機制。作為一實例，輸送可經由脂質體，使用諸如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL,Inc.,Gaithersburg MD)、SUPERFECT(Qiagen,Inc.Hilden,Germany)及TRANSFECTAM(Promega Biotec,Inc.,Madison,WI)之市售脂質體製劑以及其他根據在此項技術中標準化之程序開發的脂質體。此外，本發明之核酸或載體可活體內藉由獲自Genetronics,Inc.(San Diego,CA)之技術電穿孔輸送，以及藉助於SONOPORATION機器(ImaRx Pharmaceutical Corp.,Tucson AZ)輸送。
材料可在溶液、懸浮液(例如併入微粒、脂質體或細胞中)中。該等材料可經由抗體、受體或受體配位體靶向特定細胞類型。下列參考 文獻為使用該技術以使特定蛋白質靶向腫瘤組織之實例(Senter，等人，Bioconjugate Chem.2：447-451,(1991)；Bagshawe,K.D.,Br.J.Cancer,60：275-281,(1989)；Bagshawe，等人，Br.J.Cancer,58：700-703,(1988)；Senter，等人，Bioconjugate Chem.,4：3-9,(1993)；Battelli，等人，Cancer Immunol.Immunother.,35：421-425,(1992)；Pietersz及McKenzie,Immunolog.Reviews.129：57-80,(1992)；及Roffler，等人，Biochem.Pharmacol.42：2062-2065,(1991))。該等技術可用於各種其他特定細胞類型。媒劑諸如"隱形"及其他抗體結合之脂質體(包括脂質介導之靶向結腸癌之藥物)、經由細胞特異性配體進行之受體介導靶向輸送DNA，淋巴細胞引導之腫瘤標靶，及活體內高特異性治療性反轉錄病毒靶向輸送鼠科神經膠質瘤細胞。以下參考文獻為使用該技術以使特異蛋白質靶向腫瘤組織之實例(Hughes等人，Cancer Research,49：6214-6220,(1989)；及Litzinger及Huang,Biochimica et Biophysica Acta,1104：179-187,(1992))。一般而言，受體組成型或經配位體誘導與內飲作用之途徑有關。該等於內涵蛋白衣殼凹點中之受體群經由內涵蛋白衣殼小泡進入細胞，穿過其中受體經分類之酸化核內體且隨後循環至細胞表面以細胞內方式儲存，或於溶酶體中降解。內化途徑適合各種功能，諸如營養吸收、活化蛋白質之移出、大分子之清除、病毒及毒素之可能進入、配位體之分解及降解及受體水準調節。視細胞類型、受體濃度、配位體類型、配位體價態及配位體濃度而定，許多受體遵循一個以上細胞內途徑。已綜述受體介導之內飲作用之分子及細胞機制(Brown及Greene,DNA and Cell Biology 10：6,399-409(1991))。
向待併入宿主細胞基因組之細胞傳輸之核酸通常含有整合序列。該等序列通常為病毒相關之序列，尤其當使用病毒基系統時。該等病毒整合系統亦可併入使用諸如脂質體之非核酸基輸送系統輸送之 核酸，以便輸送系統中所含之核酸可整合入宿主基因組。
其他用於整合入宿主基因組之通用技術包括(例如)經設計以促進與宿主基因組同源重組之系統。該等系統通常依賴於與待表現之核酸側接的序列，其與宿主細胞基因組中之標靶序列具有足夠的同源性，載體核酸與標靶核酸之間的重組發生，使得所輸送核酸併入宿主基因組中。該等系統及促進同源重組所必需之方法為熟習此項技術者所熟知。
c)活體內/離體
如上所述，該等組合物可在醫藥學上可接受之載劑中投與且可藉由在此項技術中所熟知之多種機制(例如裸DNA吸收、脂質體融合、經由基因槍肌肉內注射DNA、內飲作用等)活體內及/或離體輸送至患者細胞。
若採用離體方法，則可移除細胞或組織且根據在此項技術中所熟知之標準方案保持在體外。組合物可經由諸如磷酸鈣介導之基因輸送、電穿孔、微量注射或蛋白磷脂體之任何基因轉移機制引入細胞中。所轉導細胞可隨後經細胞或組織類型之標準方法再注入(例如在醫藥學上可接受之載劑中)或同倫地再移植入患者中。已知向患者移植或注入各種細胞的標準方法。
6.表現系統
向細胞輸送之核酸通常含有表現控制系統。例如，病毒及反轉錄病毒系統中所插入基因通常含有啟動子及/或強化子以輔助控制所需基因產物之表現。啟動子通常為當關於轉錄起始位點於相對固定位置中時發揮作用之DNA之序列。啟動子含有RNA聚合酶及轉錄因子之基本交互作用所需之核心元件且可含有上游元件及反應元件。
a)病毒啟動子及強化子
控制哺乳動物宿主細胞中載體轉錄之較佳啟動子可由各種來源 獲得，例如病毒之基因組，諸如多瘤猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、反轉錄病毒、肝炎-B病毒及最佳巨細胞病毒；或異源哺乳動物啟動子，例如β肌動蛋白啟動子。SV40病毒之早期及晚期啟動子作為亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制片段便利地獲得(Fiers等人，Nature,273：113(1978))。人類巨細胞病毒之直接早期啟動子作為HindIII E限制片段便利地獲得(Greenway,P.J.等人，Gene 18：355-360(1982))。當然，宿主細胞或相關物種之啟動子亦適用於本文中。
強化子通常指在距轉錄起始位點無固定距離處起作用，且可為轉錄單元之5'(Laimins,L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.78：993(1981))或3'(Luskv,M.L.,等人Mol.Cell Bio.3：1108(1983))的DNA之序列。此外，強化子可處於基因內區(Banerji,J.L.等人，Cell 33：729(1983))以及處於編碼序列自身中(Osborne,T.F.等人，Mol.Cell Bio.4：1293(1984))。其長度通常介於10與300 bp之間，且其順式調控起作用。強化子起作用以增加附近啟動子之轉錄。強化子亦通常含有介導轉錄之調節的反應元件。啟動子亦可含有介導轉錄之調節的反應元件。強化子通常決定基因表現之調節。儘管目前已知哺乳動物基因之許多強化子序列(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、胎兒球蛋白及胰島素)，通常將使用真核細胞病毒之強化子用於通用表現。較佳實例為在複製起點(bp 100-270)晚期側上之SV40強化子、巨細胞病毒早期啟動子強化子、複製起點之晚期側上的多瘤強化子及腺病毒強化子。
啟動子及/或強化子尤其可藉由觸發其功能之光或特定化學事件活化。系統可藉由諸如四環素(tetracycline)及地塞米松(dexamethasone)之試劑調節。亦存在藉由曝露於諸如γ輻射之輻射或烷基化化學療法藥物來增強病毒載體基因表現之方式。
在某些實施例中，啟動子及/或強化子區域可充當組成型啟動子及/或強化子以使待轉錄之轉錄單元之區域的表現最大化。在某些建 構體中，啟動子及/或強化子區域在所有真核細胞類型中均具有活性，即使其僅在特定時間表現於特定類型之細胞中。該類型之較佳啟動子為CMV啟動子(650個鹼基對)。其他較佳啟動子為SV40啟動子、巨細胞病毒(全長啟動子)及反轉錄病毒載體LTF。
已展示所有特定調節元件可選殖且用以構建選擇性表現於諸如黑素瘤細胞之特定細胞類型中之表現載體。神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子已用以在神經膠質起點細胞中選擇性表現基因。
真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或有核細胞)中所使用的表現載體亦可含有終止可影響mRNA表現之轉錄所必需之的序列。該等區域在編碼組織因子蛋白質之mRNA的未轉譯部分經轉錄為多聚腺嘌呤化片段。3'未轉譯區域亦包括轉錄終止位點。轉錄單元較佳亦含有多聚腺嘌呤化區域。此區域之一優點為其增加轉錄單元將如mRNA般處理且運輸之可能性。已明確表現構建體中多聚腺嘌呤信號之鑑定及使用。同源多聚腺嘌呤信號較佳用於輸異基因構建體。在某些轉錄單元中，多聚腺嘌呤區域源自於SV40早期多聚腺嘌呤信號且由約400個鹼基對組成。轉錄單元較佳亦僅含有其他標準序列或含有與上述改善構建體之表現或穩定性之序列組合之其他標準序列。
b)標記
病毒載體可包括編碼標記產物之核酸序列。該標記產物用以測定基因是否已輸送至細胞，且輸送後將其表現。較佳標誌基因為大腸桿菌lacZ基因，其編碼β半乳糖苷酶及綠色螢光蛋白質。
在某些實施例中標記可為可選擇標記。哺乳動物細胞之適當可選擇標記之實例為二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶、新黴素(neomycin)、新黴素類似物G418、潮黴素(hydromycin)及嘌呤黴素(puromycin)。當該等可選擇標記成功地轉移於哺乳動物宿主細胞中 時，若放置在選擇壓力下，則所轉型哺乳動物宿主細胞可存活下來。存在兩種廣泛使用之不同種類之選擇性標記。第一類基於細胞新陳代謝及缺乏獨立於補給性培養基生長之能力的突變細胞株之使用。2個實例為CHO DHFR細胞及小鼠LTK細胞。該等細胞缺乏在不添加如胸苷或次黃嘌呤之該等營養的條件下生長之能力。由於該等細胞缺乏完整核苷酸合成途徑所必需之某些基因，因此除非在補給性培養基中提供所缺少核苷酸，否則其無法存活下來。補充介質之替代方法為在缺乏相應基因之細胞中引入完整DHFR或TK基因，因此改變其生長要求。未以DHFR或TK基因轉型之個別細胞將不能夠在非補給性培養基中存活下來。
第二類為顯性選擇，其係指用於任何細胞類型之選擇方案，且其並不需要使用突變細胞株。該等方案通常使用藥物以使宿主細胞停止生長。彼等具有新穎基因之細胞將表現傳達抗藥性之蛋白質且將歷經選擇而倖存。該顯性選擇之實例使用藥物新黴素(Southern P.及Berg,P.,J.Molec.Appl.Genet.1：327(1982))、黴酚酸(Mulligan,R.C.及Berg,P.Science 209：1422(1980))或勻黴素，(Sugden,B.等人，Mol.Cell.Biol.5：410-413(1985))。該等3個實例在真核控制下採用細菌基因以分別傳達適當藥物G418或新黴素(遺傳黴素)、xgpt(黴酚酸)或勻黴素抗性。其他藥物包括新黴素類似物G418及嘌呤黴素(puramycin)。
7.肽
a)蛋白質變異體
如本文所論述，存在多種已知且在本文中涵蓋之肽之變異體。除與本文中所揭示位置有關之所揭示功能變異體及類似物外，在除本文所揭示位置外存在天然產生已知功能變異體，其亦視需要起作用。熟習此項技術者熟知蛋白質變異體及衍生物且其可包括胺基酸序列修 飾或功能片段。例如，胺基酸序列修飾通常屬於以下3個種類之一或多者：取代、插入或缺失變異體。插入包括胺基及/或羧基末端融合以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。插入物通常為比胺基或羧基末端融合小之插入物，例如大概1至4個殘基。藉由融合足夠大以藉由活體外交聯或藉由以編碼該融合體之DNA轉型的重組性細胞培養物賦予標靶序列免疫原性之多肽製備諸如實例中所描述之免疫原性融合蛋白質衍生物。缺失之特徵在於自蛋白質序列移除一或多種胺基酸殘基。通常至多在蛋白質分子內之任一位點缺失約2至6個殘基。該等變異體通常藉由編碼蛋白質之DNA中的位點特異核苷酸突變來製備，藉此產生編碼變異體之DNA且此後表現重組性細胞培養物中之DNA。已熟知在具有已知序列之DNA中之預定位點進行取代突變的技術，例如M13引子突變及PCR突變。胺基酸取代通常為單一殘基，但可同時在多個不同位置發生；插入通常將為大概約1至10個胺基酸殘基；且缺失之範圍為約1至30個殘基。缺失或插入較佳在鄰近對中進行，亦即缺失2個殘基或插入2個殘基。取代、缺失、插入或其任何組合可組合以實現最終構建體。突變不可使序列離開讀取構架安置，且較佳不會產生可產生二級mRNA結構之互補區域。取代變異體為其中至少一殘基已移除且不同殘基已插入其位置中之變異體。該等取代通常根據下表3及4進行，且稱為保守性取代。
藉由選擇比表3之取代更不保守之取代，亦即選擇其對於維持以下各方面之作用更明顯不同的殘基來使得功能或免疫一致性大體上變化：(a)取代區域內多肽骨架之結構，例如作為薄層或螺線構形，(b)靶位點分子之帶電性或疏水性或(c)側鏈松密度。一般而言預期蛋白 質特性產生最大變化之取代將為彼等取代，其中(a)例如絲胺醯基或蘇胺醯基之親水性殘基取代為疏水性殘基(或經後者取代)，例如白胺醯基、異白胺醯基、苯丙胺醯基、異纈草胺醯基或丙胺醯基；(b)半胱胺酸或脯胺酸取代為(或經後者取代)任何其他殘基；(c)例如離胺醯基、精胺醯基或組胺醯基之具有帶正電側鏈之殘基經取代為(或經後者取代)帶負電之殘基，例如麩胺醯基或天冬胺醯基；或(d)例如苯丙胺酸之具有龐大側鏈之殘基經取代為(或經後者取代)未具有側鏈者，在此情況下例如甘胺酸；(e)藉由增加硫酸化及/或糖基化位點之數目。
例如，一胺基酸殘基經另一生物學上及/或化學上類似之胺基酸殘基的替換為保守性取代，此為熟習此項技術者所熟知。例如，保守性取代將為以另一疏水性殘基替換一疏水性殘基，或為以另一極性殘基替換一極性殘基。該等取代包括諸如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及Phe、Tyr之組合。各明確揭示序列之該等保存取代之變型包括於本文提供之嵌紋多肽中。
可採用取代或缺失突變以插入或禁用N糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O糖基化(Ser或Thr)之位點。亦可需要半胱胺酸或甲硫胺酸或其他不穩定殘基之缺失或取代(例如於抗嗜中性白血球之蛋白質中，此係由於嗜中性細胞產生氧化劑)。例如精胺酸之可能的蛋白水解位點之缺失或取代可藉由(例如)缺失鹼性殘基之一者或藉由麩醯胺醯基或組胺醯基殘基取代一者來實現。
重組性宿主細胞對所表現多肽之作用產生某些轉譯後衍生。麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基通常經轉譯後脫醯胺化成相應麩胺醯基及天冬醯基殘基。或者，在適度酸性條件下將該等殘基脫醯胺化。其他轉譯後修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化，絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基的磷酸化，離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之ε胺基中胺之甲 基化(T.E.Creighton,Proteins：Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman &Co.,San Francisco第79-86頁[1983])，N末端胺之乙醯化及在某些情況下C末端羧基之醯胺化。
二硫鍵為2個半胱胺酸分子之硫醇基之間的共價相互作用。經由氧化反應，氫原子自硫醇基中移出，使得形成二硫橋；所得鍵結半胱胺酸稱為胱胺酸。二硫鍵屬於I類及II類。II類鍵用來藉由連接鏈內的半胱胺酸使蛋白之立體結構穩定化。當該等交互作用發生在獨立鏈之間時I類二硫鍵產生。I類二硫鍵之形成可有助於形成二聚蛋白質，受體提供合適受體-配位體交互作用通常所必需之重要特徵。可在其中半胱胺酸殘基存在之位點進行胺基酸取代；通常保守性取代並不改變與二硫鍵有關的半胱胺酸殘基。若經取代之殘基與二硫鍵有關，則該等取代可具有改變蛋白折疊或改變多聚體交互作用之作用。可測定何者半胱胺酸與二硫鍵有關。
應瞭解，保守突變及同源性之描述可於任何組合中組合在一起，諸如與特定序列具有至少70%同源性之實施例，其中變異體為保守突變。
由於本說明書探討各種蛋白質及蛋白質序列，因此應瞭解亦揭示可編碼彼等蛋白質序列之核酸。此將包括與特定蛋白質序列有關之所有簡並序列，亦即所有具有編碼一特定蛋白質序列之序列的核酸以及所有核酸，其包括編碼所揭示變異體及蛋白質序列之衍生物的簡並核酸。因此，儘管各特定核酸序列可不在本文中書寫出，但應瞭解實際上本文經由所揭示蛋白質序列揭示且描述各及所有序列。亦應瞭解儘管胺基酸序列均未指示編碼有機體內彼蛋白質之特定DNA序列，其中所揭示蛋白質之特定變異體揭示於本文中，但編碼其中彼蛋白質出現之特定有機體中的彼蛋白質之已知核酸序列亦為已知的且揭示並描述於本文中。
亦揭示所揭示蛋白質且變異體之片段。該等片段通常將保留至少一本文中所述之功能，諸如增加之血腦障壁滲透性。然而，應瞭解(例如)並不保留該活性之片段仍可用以(例如)產生抗體。亦應瞭解存在(例如)甘丙肽所固有之各種不同功能活性。該等活性可相關但不必需。熟習此項技術者應瞭解如何藉由(例如)改變有助於特定功能之區域來操縱所揭示類似物之功能區。特定功能位點移除或改變之類似物揭示於實例1及2中。
8.抗體
如本文所揭示之抗體可適用於鑑定具有所需功能之類似物。如本文中所用，術語"抗體"包涵(但不限於)任何種類之全免疫球蛋白(亦即完整抗體)。原生抗體通常為由2個相同輕(L)鏈及2個相同重(H)鏈組成之異四聚體糖蛋白。通常各輕鏈藉由一共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵之數目在不同免疫球蛋白同型之重鏈之間可變。各重鏈及輕鏈亦具有規則間隔鏈內二硫橋。各重鏈在一端具有後隨大量恆定域之可變域(V(H))。各輕鏈在一端具有可變域(V(L))且在其另一端具有恆定域；輕鏈之恆定域與重鏈之第一恆定域比對，且輕鏈之可變域與重鏈之可變域比對。咸信特定胺基酸殘基在輕與重鏈可變域之間形成界面。任何脊椎動物物種之抗體的輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列分為2種明顯不同類型中之一者：即κ(k)與λ(1)。視其重鏈之恆定域之胺基酸序列而定，免疫球蛋白可分成不同種類。存在5種主要類人免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等種類之若干可進一步分成子類(同型)例如IgG-1、IgG-2、IgG-3及IgG-4；IgA-1及IgA-2。熟習此項技術者將認識到小鼠之相當種類。對應於不同種類之免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、γ及μ。
本文使用術語"可變"來描述抗體之序列不同之可變域的某些部分，且該等可變域在各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性中使 用。然而，可變性通常並不遍及抗體之可變域均勻分佈。其通常集中於輕鏈與重鏈可變域中均存在之稱為互補決定區(CDR)或高變區之3個片段中。可變域之更高度保守部分稱作框架(FR)。原生重鏈及輕鏈之可變域各包含4個FR區域，大部分採用藉由3個CDR連接之b薄層構型，CDR形成連接且在某些情況下形成b薄層結構之部分的迴路。各鏈中之CDR藉由FR區域緊密接近結合在一起且與另一鏈之CDR一起有助於形成抗體之抗原結合位點(見Kabat E.A.等人，"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987))。恆定域並不與抗體與抗原結合直接有關，但顯示各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴型細胞毒性。
如本文中所用，術語"抗體或其片段"包涵具有雙重或多種抗原或抗原決定基特異性之嵌合抗體及雜合抗體，及諸如F(ab')2、Fab'、Fab等，包括雜合片段之片段。因此提供保留與其特異抗原之結合能力的抗體之片段。例如，保持增加之滲透性的抗體之片段包括於術語"抗體或其片段"之含義內。該等抗體及片段可藉由在此項技術中已知之技術製備，且可根據用於製備抗體及篩選抗體之特異性及活性的通用方法中所闡明之方法篩選其特異性及活性(見Harlow及Lane.Antibodies,A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Publications,New York,(1988))。
"抗體或其片段"之含義中亦包括如(例如)美國專利第4,704,692號所述抗體片段與抗原結合蛋白(單鏈抗體)之結合物，該專利之內容在此以引入的方式併入。
9.載劑醫藥/輸送醫藥產物
如上所述，諸如甘丙肽類似物之組合物亦可於醫藥學上可接受之載劑中活體內投與。"醫藥學上可接受"意謂生物學上或其他方面並非不當之材料，亦即該材料可與核酸或載體一起投與患者，而不招致 任何不當生物效應或以有害方式與醫藥組合物中所含有的任何其他組份相互作用。如熟習此項技術者所熟知，當然應選擇載劑以使活性成份之任何降解最小化且以使患者之任何不良副作用最小化。
該組合物可經口、非經腸(例如靜脈內)、肌肉內注射、腹膜內注射、經皮、體外、局部或以類似方式投與，且可使用局部鼻內投與或吸入投與。視患者之物種、年齡、體重及大體狀況、所用特定核酸或載體、投與模式等而定，所需組合物之確切量將隨患者而不同。因此，不可能規定每個組合物之確切量。然而，可藉由一般熟習此項技術者僅使用本文中給出教示之常規實驗確定適當量。
非經腸投與組合物(若使用)之特徵通常為注射。可注射劑可以習知形式製備為液體溶液或懸浮液，適用於注射前液體中之溶液或懸浮液的固態形式或為乳液。用於非經腸投與之新近修訂之方法包括使用緩慢釋放或持續釋放系統使得可保持恆定劑量。見例如美國專利第3,610,795號，其以引入的方式併入本文中。
材料可在溶液、懸浮液(例如併入微粒、脂質體或細胞中)中。該等材料可經由抗體、受體或受體配位體靶向特定細胞類型。下列參考文獻為使用該技術以使特定蛋白質靶向腫瘤組織之實例(Senter，等人，Bioconjugate Chem.,2：447-451,(1991)；Bagshawe,K.D.,Br.J.Cancer,60：275-281,(1989)；Bagshawe，等人，Br.J.Cancer,58：700-703,(1988)；Senter，等人，Bioconjugate Chem.,4：3-9,(1993)；Battelli，等人，Cancer Immunol.Immunother.,35：421-425,(1992)；Pietersz及McKenzie,Immunolog.Reviews,129：57-80,(1992)；及Roffler，等人，Biochem.Pharmacol,42：2062-2065,(1991))。媒劑諸如"隱形"及其他抗體結合之脂質體(包括脂質介導之靶向結腸癌之藥物)、經由細胞特異性配體進行之受體介導靶向輸送DNA，淋巴細胞引導之腫瘤標靶，及活體內高特異性治療性反轉錄病毒靶向輸送鼠科 神經膠質瘤細胞。以下參考文獻為使用該技術以使特異蛋白質靶向腫瘤組織之實例(Hughes等人，Cancer Research,49：6214-6220,(1989)；及Litzinger及Huang,Biochimica et Biophysica Acta,1104：179-187,(1992))。一般而言，受體組成型或經配位體誘導與內飲作用之途徑有關。該等於內涵蛋白衣殼凹點中之受體群經由內涵蛋白衣殼小泡進入細胞，穿過其中受體經分類之酸化核內體且隨後循環至細胞表面以細胞內方式儲存，或於溶酶體中降解。內化途徑適合各種功能，諸如營養吸收、活化蛋白質之移出、大分子之清除、病毒及毒素之可能進入、配位體之分解及降解及受體水平調節。視細胞類型、受體濃度、配位體類型、配位體價態及配位體濃度而定，許多受體遵循一個以上細胞內途徑。已綜述受體介導之內飲作用之分子及細胞機制(Brown及Greene,DNA and Cell Biology 10：6,399-409(1991))。
a)醫藥學上可接受之載劑
包括甘丙肽類似物之組合物可與醫藥學上可接受之載劑組合在治療上使用。
醫藥載劑為熟習此項技術者所熟知。此等載劑最通常為用於向人類投藥之標準載劑，包括諸如無菌水、鹽水之溶液及生理pH值之緩衝溶液。該等組合物可肌肉內或皮下投與。其他化合物將根據熟習此項技術者所使用之標準程序投與。
除所選分子外，醫藥組合物可包括載劑、稠化劑、稀釋劑、緩衝劑、防腐劑、界面活性劑及其類似物。醫藥組合物亦可包括一或多種諸如抗微生物劑、消炎劑、麻醉劑及其類似物之活性成份。
依賴於需局部抑或全身治療，且依賴於待治療之區域，醫藥組合物可以多種方式投與。可局部地(包括眼內、陰道內、直腸、鼻內)、經口、吸入或非經腸(例如靜脈滴注、皮下、腹膜內或肌肉內注射)投藥。諸如甘丙肽類似物之所揭示組合物可靜脈內、腹膜內、肌 肉內、皮下、腔內或經皮投與。
非經腸投藥之製劑包括無菌水或非水溶液、懸浮液及乳液。非水溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油之植物油及諸如油酸乙酯之可注射有機酯。水性載劑包括水、酒精/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林葛爾氏右旋糖、右旋糖及氯化鈉、乳酸林葛爾氏液或不揮發性油類。靜脈內媒劑包括液體及營養補充劑、電解質補充劑(諸如基於林葛爾氏右旋糖之電解質補充劑)及其類似物。防腐劑及其他添加劑亦可存在，諸如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體及其類似物。
用於局部投與之調配物可包括軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及粉末。習知醫藥載劑、水溶液、粉末或油性鹼、稠化劑及其類似物可為必需或合意的。
用於口服之組合物包括粉末或顆粒、水或非水介質中之懸浮液或溶液、膠囊、藥囊或錠劑。會需要稠化劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。
某些組合物可作為與以下各物反應形成的醫藥學上可接受之酸或鹼加成鹽潛在投與：與以下酸反應：無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸及磷酸；及有機酸，諸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、丁二酸、順丁烯二酸、及反丁烯二酸；或與以下鹼反應：無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鉀；及有機鹼，諸如單烷基胺、二烷基胺、三烷基胺及芳基胺類及經取代之乙醇胺。
b)治療用途
組合物投與之劑量範圍為彼等足夠大以產生其中病症之症狀受影響的所需作用之劑量。劑量不應過大以致導致不良副作用，諸如不當交叉反應、過敏反應等。通常，劑量將隨患者年齡、狀況、性別及 疾病之程度而變，且可藉由熟習此項技術者來判定。在任何禁忌之情況下，劑量可藉由個別醫師調節。劑量可變且每日可以一或多個投與劑量投藥，歷時1或數天。
10.晶片及微陣列
揭示其中至少一地址為本文中所揭示核酸序列之任一者中所闡明的序列或序列之一部分的晶片。亦揭示其中至少一地址為本文中所揭示肽序列之任一者中所闡明的序列或序列之部分的晶片。
亦揭示其中至少一地址為本文中所揭示核酸序列之任一者中所闡明的序列或序列之部分的變異體之晶片。亦揭示其中至少一地址為本文中所揭示肽序列之任一者中所闡明的序列或序列之部分的變異體之晶片。
亦揭示其中至少一地址為本文中所揭示核酸序列之任一者中所闡明的序列或序列之部分的晶片，其中該序列包括至少一本文所揭示之變異體序列。亦揭示其中至少一地址為本文中所揭示肽序列之任一者中所闡明的序列或序列之部分的晶片，其中該肽序列包含至少一本文所揭示之甘丙肽類似物。
亦揭示其中至少一地址為本文中所揭示核酸序列之任一者中所闡明的序列或序列之部分的晶片，其中該序列於本文所定義之區域內包括至少一變異體序列。亦揭示其中至少一地址為本文中所揭示肽序列之任一者中所闡明的序列或序列之部分的晶片，其中該肽序列包含至少一本文所揭示之取代、添加、突變或缺失。
11.電腦可讀媒體
應瞭解所揭示核酸及蛋白質可表示為由胺基酸之核苷酸組成的序列。存在顯示該等序列之多種方式，例如核苷酸鳥苷可藉由G或g表示。同樣胺基酸纈胺酸可由Val或V表示。熟習此項技術者瞭解如何以所存在之各種方式之任何一種(認為各者均揭示於本文中)顯示且表 現任何核酸或蛋白質序列。本文尤其涵蓋該等序列於電腦可讀媒體上之顯示，該等媒體諸如市售軟碟、磁帶、晶片、硬碟、緊密光碟及視訊光碟或其他電腦可讀媒體。亦揭示所揭示序列之二進制碼表示。熟習此項技術者瞭解何為電腦可讀媒體。因此，揭示其上記錄、儲存核酸或蛋白質序列之電腦可讀媒體。
揭示包含關於本文中所闡述之序列之序列及資訊的電腦可讀媒體。
12.套組
本文揭示抽取可用於實踐本文所揭示之方法的試劑之套組。該等套組可包括本文中所討論之任何試劑或試劑之組合或應瞭解為實踐所揭示方法中所需或有利之任何試劑或試劑之組合。例如，該套組可包括胺基酸(以進行於該等方法之某些實施例中所探討之取代)以及說明。
13.具有類似功能之組合物
應瞭解本文所揭示之組合物具有某些功能，諸如增加之血腦障壁滲透性。本文揭示進行所揭示功能之某些結構要求，且應瞭解存在可進行與所揭示結構有關之相同功能之各種結構，且該等結構將最後獲得相同結果。
E.組合物之製備方法
除非特定說明否則本文所揭示組合物及進行所揭示方法所必需之組合物可使用熟習此項技術者所已知之特定試劑或化合物之任何方法來製備。應瞭解，除非另作說明，否則通用分子生物學技術，諸如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)中所揭示之分子生物學技術可用於製備所揭示分子及實踐所揭示方法。
本文尤其揭示製備具有增加之血腦障壁滲透性之組合物的方法，其包含製備具有增加之血腦障壁滲透性之組合物，其中該組合物包含當與肽之未經修改形式相比時具有增加之親脂性特徵及增加之鹼度的肽。在一實例中，親脂性特徵可藉由使該肽與諸如多脂族鏈之疏水性部分結合而增加。親脂性特徵亦可藉由增加芳族殘基之鹵化而增加。鹼度可藉由引入帶正電之胺基酸殘基之均及雜寡聚物而增加，該等胺基酸殘基包括(但不限於)L或D異構體組態之離胺酸、精胺酸、高離胺酸、高精胺酸、鳥胺酸；2,3-二胺基丙酸；2,4-二胺基丁酸。在另一實例中，鹼度可藉由與諸如精胺、亞精胺、聚醯胺基胺樹枝狀聚合物或多胺毒素及其衍生物之多胺基部分結合而增加。與未經修改之肽形式相比肽穿過血腦障壁之效率可高出1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。當與非改變形式之肽相比時肽亦可具有增加之糖基化。肽可包含間隔基團。間隔基團可選自由Gly、Ahx、Gly-Ahx或PEG-O2Oc組成之群。
1.核酸合成
例如，諸如欲用作引子之寡核苷酸的核酸可使用標準化學合成法製備或可使用酶促法或任何其他已知方法產生。該等方法之範圍可為：自標準酶促消化後，分離核苷酸片段(參看例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)第5、6章)；至純合成法，例如藉由胺基磷酸氰基乙酯法使用Milligen或Beckman系統1Plus DNA合成器(例如，Milligen-Biosearch之8700型自動合成器，Burlington,MA或ABI型380B)。Ikuta等人，Ann.Rev.Biochem.53：323-356(1984)(磷酸三酯及亞磷酸酯-三酯法)及Narang等人，Methods Enzymol.,65：610-620(1980)(磷酸三酯法)亦描述適用於製備寡核苷酸之合成法。肽核酸分子可使用諸如Nielsen等人Bioconjug. Chem.5：3-7(1994)所描述之方法之已知方法製備。
2.肽合成
製備所揭示蛋白質之一種方法為藉由蛋白質化學技術將兩種或兩種以上肽或多肽連接在一起。例如，肽或多肽可使用現行實驗室設備使用Fmoc(9-茀基甲氧基羰基)或Boc(第三丁氧基羰基)化學化學上合成(Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA)。熟習此項技術者可易於瞭解對應於(例如)所揭示蛋白質之肽或多肽可藉由標準化學反應合成。例如，可合成肽或多肽且其並不自合成樹脂裂解，而可合成肽或蛋白質之另一片段且隨後自該樹脂裂解，藉此暴露在另一片段上功能性阻斷之端基。藉由肽縮合反應，該等2個片段可經由肽鍵分別在其羧基及胺基末端共價連接以形成蛋白或其片段。(Grant GA(1992)Synthetic Peptides：A User Guide.W.H.Freeman及Co.,N.Y.(1992)；BodanskyM及Trost B.編(1993)Principles of Peptide Synthesis.Springer-Verlag Inc.,NY(其至少就與肽合成有關之材料以引入的方式併入本文中)。或者，如本文所描述活體內獨立地合成肽或多肽。分離後，該等獨立肽或多肽可經由類似肽縮合反應連接以形成肽或其片段。
例如，選殖或合成肽片段之酶促連接反應容許相對短肽片段經連接以產生較大肽片段、多肽或全蛋白質域(Abrahmsen L等人，Biochemistry,30：4151(1991))。或者，可利用合成肽之原生化學連接反應以自較短肽片段綜合地構建較大肽或多肽。該方法由兩步化學反應組成(Dawson等人Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation.Science,266：776-779(1994))。第一步為未受保護合成肽-硫酯與另一含有末端為胺基的Cys殘基之未受保護肽片段化學選擇性反應以得到初始共價產物，硫酯連接之中間物。在不改變反應條件之情況下，該中間物經受自發、快速分子內反應以在連接反應位點形成原生肽鍵 (Baggiolini M等人(1992)FEBS Lett.307：97-101；Clark-Lewis I等人，J.Biol.Chem.,269：16075(1994)；Clark-Lewis I等人，Biochemistry,30：3128(1991)；Rajarathnam K等人，Biochemistry 33：6623-30(1994))。
或者，化學上連接未受保護之肽片段，其中由於化學連接反應，因此在肽片段之間形成之鍵為非天然(非肽)鍵結(Schnolzer,M等人Science,256：221(1992))。該技術已用以合成蛋白質域類似物以及大量具有全部生物活性之相對純蛋白質(deLisle Milton RC等人，Techniques in Protein Chemistry IV.Academic Press,New York，第257-267頁(1992))。
3.製備組合物之方法
揭示製備組合物以及製備得到該等組合物之中間物之方法。例如揭示SEQ ID NO：1-55之蛋白質。存在可用於製備該等組合物之多種方法，諸如合成化學法及標準分子生物學方法。應瞭解尤其揭示該等及其他所揭示組合物之製備方法。
揭示藉由包含以下步驟之方法而產生之蛋白質：以操作方式連接編碼甘丙肽類似物之核酸，其包含SEQ ID NO：3中所闡明之序列及控制核酸之表現的序列。
亦揭示藉由包含以下步驟之方法而產生之蛋白質：以操作方式連接編碼甘丙肽類似物之核酸分子，其包含與SEQ ID NO：3中所闡明之序列具有80%一致性的序列及控制核酸之表現的序列。
揭示藉由以所揭示核酸之任一者使細胞轉型的方法而產生之細胞。揭示藉由以所揭示非天然產生核酸之任一者使細胞轉型的方法而產生之細胞。
揭示藉由表現所揭示核酸之任一者之方法而產生的任一所揭示肽。揭示藉由表現所揭示核酸之任一者之方法而產生之任一所揭示非 天然產生肽。揭示藉由表現所揭示非天然核酸之任一者之方法而產生之任一所揭示肽。
揭示藉由以本文中所揭示核酸分子的任一者而轉染動物細胞之方法而產生的動物。揭示藉由以本文中所揭示核酸分子的任一者而轉染動物細胞之方法而產生的動物，其中該動物為哺乳動物。亦揭示藉由以本文中所揭示核酸分子的任一者而轉染動物細胞之方法而產生的動物，其中該哺乳動物為小鼠、大鼠、兔、牛、羊、豬或靈長類。
亦揭示藉由向動物添加本文中所揭示之任何細胞的方法而產生之動物。
應瞭解另一產生蛋白質之方式將使用兔表現系統，諸如藉由生物蛋白技術產生之彼等類型之系統。所揭示分子可使用此等類型之載體及產生系統產生。例如，此等類型之系統揭示於EPO專利申請案No 92 401 635.5、US專利No 5,965,788中且揭示於基因絕緣子上(EPO專利申請案No 00 403 658.8)，且資訊可見www.bioprotein.com。
遍及本申請案，引用各種公開案。該等公開案之揭示內容在此以引入的方式全部併入本申請案中以更全面地描述本發明隸屬之此項技術的狀態。所揭示參考文獻亦就其中所含之在引用所依賴之語句中討論的材料個別地且尤其以引入的方式併入本文中。
熟習此項技術者將顯而易見可在不悖離本發明之範疇或精神的情況下對本發明作出各種修飾及變更。考慮到說明書及本文中所揭示之本發明之實踐，本發明之其他實施例對於熟習此項技術者將顯而易見。希望認為說明書及實例僅為例示性的，本發明之實際範疇及精神藉由下文之申請專利範圍指示。
F.實例
闡述以下實例以向普通熟習此項技術者提供如何製備且評估本文所主張之化合物、組合物、物品、裝置及/或方法的完整揭示內容 及描述，且該等實例意欲純粹地例示本發明且並非限制發明者視為其發明之範疇。已致力於確保關於數字(例如量、溫度等)之準確度，但應說明某些誤差及偏差。除非另外指明，否則份為重量份，溫度以℃計或為環境溫度且壓力為或約為大氣壓。
1.實例1：具有全身活性之抗痙攣甘丙肽類似物
為獲得抗痙攣神經肽可工程化以增強其血腦障壁穿透性之觀念證據結果，選擇2種模型神經肽：生長抑素及甘丙肽。如先前所描述，該等2種神經肽均具有抗痙攣活性。
一般實驗策略說明於圖7中。設計且合成一組神經肽類似物(第一代)以測試其以高親和力與其相應受體結合之能力。此組包括每個神經肽約十個類似物。進一步測試高親和力類似物之穿透血腦障壁之能力。第一代類似物得出結論後，合成且評估第二代類似物，且隨後合成且評估第三代類似物。選擇最具遠景之類似物(具有增強之穿過血腦障壁滲透性之高親和力配位體)以證實其在功能檢定中之促效劑活性。隨後活體內藥理學上測試一組該等類似物(具有增加之穿過血腦障壁之滲透性的有效促效劑)。
為變成藥物，神經肽類似物應具有若干重要特徵，包括：(1)高效力及選擇性；(2)代謝穩定性；(3)相對長半衰期及全身循環降低之清除；及(4)增加之穿過血腦障壁之滲透性。多數神經肽顯示高效力及選擇性。通常藉由肽骨架修飾及/或以蛋白水解酶不識別之殘基替換敏感殘基來引入代謝穩定性。增加之半衰期及降低之消除率可藉由將聚合物基部分與肽結合(例如PEG化)而有效地獲得。穿過血腦障壁之更大滲透性可藉由增加親脂性或陽離子化，以及藉由添加前藥、營養運輸模擬物或糖基化而引入。理想藥物神經肽之結構圖示於圖8中。
如圖8所說明，引入神經肽工程化中之新概念："BBB/PK調節劑 "。BBB/PK調節劑包含具有親脂性、陽離子及運輸模擬物模組之聚合物基龐大部分；該調節劑用於雙重目的，即增強穿過血腦障壁之滲透性及改良藥物動力學特性。陽離子型及親脂性模組分別促進與帶負電之膜表面的相互作用，且改善穿過膜之擴散。主動運輸模擬物結構之功能為藉由增強與位於腦內皮細胞之表面上之特異營養運輸體之相互作用而增加神經肽在腦中之特異吸收。包含所有該等模組之結構骨架亦可改善肽之藥物動力學特性，模擬/代替通常使用之PEG部分的作用。作為模型神經肽之N或C末端延長測試該等龐大部分，且本文中亦揭示神經肽結構中更多通用連接位置。
下列策略用以設計具有增強之血腦障壁滲透性之神經肽類似物：若可獲得，則自代謝穩定型類似物起始。鑑別經受側鏈替換之類似物中的其他AA位置。鑑別經受引入龐大部分之N及C末端之位置。藉由側鏈替換增加類似物之親脂性及鹼度。向肽類似物引入延長將進一步增加其親脂性及鹼度，同時改善藥物動力學特性(BBB/PK調節劑)。在延長處包括營養模擬物結構以提高血腦障壁穿透之特異性。組合具有側鏈修飾之類似物與擴充部分(BBB/PK調節劑)。
成功設計該等類似物之關鍵在於正確組合上述修飾。為實現此目標，可採用設計及估算個別組修飾之系統化方法及其優化組合。大體策略示意性地說明於圖10中。如本文所揭示之胺基酸之修飾可在固相肽合成期間使用自動肽合成器引入。所有非天然胺基酸或共軛結構為市售Fmoc保護之衍生物。
生長抑素為具有單一二硫橋之14個胺基酸之下丘腦肽，其最初於1973年發現(Brazeau等人，1973)。生長抑素之序列展示如下：
大量SAR研究已鑑別出5種關鍵殘基：Phe6、Phe7、Trp8、Lys9 及Phe11，而Gly2、Lys4、Asn5、Thr10、Thr12或Ser13之丙胺酸取代並不會明顯影響生物活性(Vale等人，1975)。此外，含有D-Trp8之類似物顯示更為有效，此係由於對於蛋白水解之更大阻力及/或活性構形之更大穩定性。
[D-Trp8]生長抑素可作為代謝穩定類似物以本文中所揭示之方法一起使用。為增加鹼度，Thr、Ser或Asn殘基可系統地經等空間相似但帶正電之DAB(二胺基丁酸)或DAP(二胺基丙酸)殘基替換。為增加親脂性，Lys-十六醯基部分可引入代替Lys4或Asn5，且/或Phe殘基可經鹵化等效物氯-Phe殘基取代。如表5中所摘要，合成9種類似物且檢定其對生長抑素受體之親和力。將並不會反向影響高親和力結合之該等修飾組合在一起。該等第二代類似物包含2-4種組合之修飾。
接著將N末端延長引入至[D-Trp8]生長抑素。該等延長(BBB/PK調節劑，如圖8中所示)用於雙重目的：(1)提高藉由被動與主動機制穿過血腦障壁之滲透性；及(2)藉由添加減少清除且提高對於蛋白水解降解之阻力的龐大部分改善神經肽藥物之藥物動力學特性。由於該等"BBB/PK調節劑"為新概念，因此使用構成延長之數種結構模組之若干組合。表6提供關於所提出模組之結構及功能之資訊。
DAB，二胺基丁酸；DAP二胺基丙酸；Lys-palm,Lys-十六醯基；Cl-Phe，氯-Phe。
表6.用以合成BBB/PK調節劑之模組之結構及功能特性之摘要。
在固相合成期間可作為[D-Trp8]生長抑素之Ala1殘基之延長而引入該等模組。表7及圖11摘要摘要該等延長。
最初合成10種類似物且評估其與生長抑素受體之結合特性。經由模型血腦障壁滲透性檢定進一步評估高親和力類似物之滲透性特性。
選擇最佳延長後，其可與已含有最佳側鏈替換之生長抑素類似物相連接(見表5)。由於難以預測"延長類似物"與"側鏈替換類似物"之最佳組合，因此使用矩陣方法，其中各所選類似物經合成具有各所選延長。此輪回可獲得9-12種類似物。可在總計3個活體外檢定中測試該等第三代類似物：(1)與生長抑素 受體結合；(2)促效劑活性及(3)穿過模型血腦障壁之滲透性。可選擇有限數目之最具前景之類似物用於活體內小鼠癲癇症模型藥理學測試。
甘丙肽及其類似物可以與上文關於生長抑素所述類似之方法進行。甘丙肽為30個胺基酸之神經肽，但SAR研究鑑別出與全長肽相比N末端部分仍為高效促效劑(Langel及Bartfai,1998)。可以本文所揭示之方法使用甘丙肽(1-16)類似物，其中Gly1殘基經如下所示之N-甲基-Gly(肌胺酸，SAR)置換：
Gly1之N甲基化保護該肽防止N末端加速蛋白降解，而其並不顯著改變其對甘丙肽受體之親和力(Rivera Baeza等人，1994)。SAR研究鑑定出對於生物活性關鍵之下列殘基：Gly1、Trp2、Asn5、Tyr9及Gly12(Land等人，1991)。同一研究鑑定出N末端延長導致生物活性之損失。另一方面，當甘丙肽(1-16)之C末端部分連接於較大結構時，其似乎極穩健(Pooga等人，1998)。因此，設計[Sar1]甘丙肽類似物之策略與生長抑素所用之策略僅關於胺基酸置換類似，但其差異在於在C末端而非在N末端引入延長。表9摘要具有胺基酸置換之甘丙肽類似物。
C末端延長可與表7中所示一致，但在位置His14引入。隨後合成具有Lys14(Mmt)殘基(側鏈受4-甲氧基三苯甲基保護)之(Sar1)甘丙肽。偶合肌胺酸後，可以於二氯甲烷中之1% TFA將肽樹脂處理30分鐘。可將Lys14殘基之側鏈胺基去保護，接著偶合延長分子。具有組合側鏈置換及C末端延長之第三代類似物之設計與生長抑素類似物所描述一致。
化學合成神經肽使用Fmoc基固相肽合成方案及自動肽合成器合成肽。如Chan及White(Chan及White,2000)所描述進行偶合方法及肽自固體支撐物之移出。可藉由以試劑K處理自固體支撐物中移出肽。洗滌及沉澱後，使用製備逆相HPLC分離來純化類似物。可藉由與如所描述(Chen等人，2000)水(pH 7.0)中之2% DMSO、30%乙酸來培育純化肽來形成生長抑素類似物中之二硫橋。藉由該方法可產生至少數毫克之各肽類似物。
為評估神經肽類似物穿過血腦障壁之滲透性，可採用pION PAMPA方法。在此方法中，將具有固定化人工膜之過濾器放置於兩個間隔部分：供體室及受體室之間。類似物可置於供體室中。適當時間間隔後，使用UV光譜法將供體及受體室定量。
藉由Novascreen Biosciences Corporation進行生長抑素及甘丙肽 結合檢定(非選擇性)。大鼠前腦膜及放射性標記的親本神經肽用於該等檢定。在單一(1 μM)濃度測試類似物以區別高及低親和力類似物。可使用MDS-Pharma Services所提供之功能檢定進一步測試所選擇生長抑素及甘丙肽類似物之促效劑活性。可在單一濃度(1 μM)測試該等類似物。
抗痙攣測試可以反射性癲癇之Frings AGS敏感型小鼠模型確立抗痙攣活性。AGS敏感型小鼠為初始概念證據研究之理想急性發作模型，此係由於其非歧視性且有效地偵測廣泛多種CNS活性化合物(White等人，1992)。可評估在Frings小鼠中發現具有活性之肽的阻斷最大電擊療法(MES)及皮下(s.c)投與伸戊基四唑(PTZ)所誘導之發作的能力。該等2個測試量測研究性抗癲癇化合物分別預防發作擴散及升高發作閾值之能力(White等人，2002)。已證明所修飾之肽在該等3個發作測試之一或多者中具有活性後，在先前所測定之i.v.投藥後的峰作用時間時進行完整劑量-反應研究。接著將此等概念證據研究之結果與腦室內(i.c.v.)投藥後所進行之功效研究相比較。當實現血腦障壁之更大穿透時，可觀察到i.p.劑量-反應曲線左移。獲自該等3個發作測試之結果共同提供支援全身投與後小型肽更易進入大腦中之方法的實質性資料。各個別發作測試之細節概述如下。
投與神經肽類似物經由10 μl漢彌爾頓(Hamilton)注射器將5 μl人工腦脊髓液中之所修飾之神經活性肽之各者腦室內(i.c.v.)投與或以0.01 ml/g體重之體積腹膜內(i.v)投與0.5%甲基纖維素中之所修飾之神經活性肽之各者。
聲源性發作可在峰作用時間評估個別修飾之肽預防AGS敏感型Frings小鼠模型中藉由聲音誘導之發作的能力(White等人，1992)。對於此測試，將個體小鼠放入配備聲音傳感器(Model AS-ZC；FET Research and Development,Salt Lake City,UT)之樹脂玻璃圓筒內(直徑 15 cm；高度18 cm)且暴露於輸送20秒之110分貝(11 KHz)之音刺激。聲音誘導之發作之特徵在於無序跑動後具有前肢及後肢強直性伸展之翻正反射消失。認為未顯示後肢強直性伸展之小鼠受到保護。
MES測試對於MES測試，在放置角膜電極前，可將一滴麻醉/電解質溶液(0.9%鹽水中0.5%之鹽酸丁卡因)施於各動物之眼中。小鼠MES測試中之電刺激為50 mA，藉由與最初Woodbury及Davenport所描述(Woodbury及Davenport,1952)相似之裝置輸送0.2sec。發作之後腿強直伸肌組份之消除用作終點。
最低毒性測試可在小鼠中藉由轉棒程序(Dunham及Miya,1957)確定最低毒性。當將小鼠置於轉速為6 r.p.m.之1英吋滾花棒上時，動物可長時間段保持平衡。若在1分鐘時間段期間動物自此旋轉棒跌落三次，則認為其中毒。
測定半數效應劑量(ED 50 )或中毒劑量(TD 50 )在先前測定之TPE進行所有活體內定量抗痙攣/毒性研究。以各種劑量之肽測試至少八隻小鼠之組，直至在100%保護或最低毒性與0%保護或最低毒性之限度之間至少已確立兩點。隨後藉由基於Finney所描述之方法(Finney,1971)之電腦程式計算各測試之50%之動物中產生所需終點(ED50或TD50)所需之藥物之劑量，95%置信區間，回歸線之斜率，及斜率之S.E.M.。
生長抑素之類似物可見表10(所有類似物均具有在2個半胱胺酸殘基之間形成的二硫橋)：
在上表中，(AHX)為胺基己酸；(Dab)為二胺基丁酸；(Dap)為二胺基丙酸；(Tle)為第三白胺酸；(Cl-Phe)為4-氯苯丙胺酸；(NN3APG)為N,N-雙(3-胺丙基)甘胺酸；(AHX)為胺基己酸；(Lys-P)為Lys-十六醯基；Thr(ol)為酥胺醇；DK、DF、DW表示D-異構體；PFHA為2H,2H,3H,3H-全氟庚酸；且ACPA為8-胺基辛酸。
亦存在除甘丙肽及生長抑素外可用之類似物之其他實例例如以下為δ睡眠誘導肽(DSIP)之類似物：DSIP-BBB8：(AHX)GGWAGGDASGE(SEQ ID NO：55)。其他DSIP肽可見表31。
2.實例2：抗痙攣甘丙肽類似物
甘丙肽為30個胺基酸之神經肽，與全長肽相比其N末端部分為高效促效劑(Langel及Bartfai,1998)。截短之甘丙肽(1-16)類似物(如下)用以引入增強其穿過血腦障壁之滲透性的修飾。
鑑定出對於生物活性關鍵之下列殘基：Gly1、Trp2、Asn5、Tyr9及Gly12(Land等人，1991)。N末端延長或截短導致生物活性損失。另一方面，當甘丙肽(1-16)之C末端部分截短或連接於較大結構時，其極為穩健(Pooga等人，1998)。
基於可用結構-活性關係數據，設計、化學合成且測試二肽類甘丙肽類似物。以下提供兩種類似物(GAL-BBB1及GAL-BBB2)之結構：
GAL-BBB1：Sar-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-His-(Lys-palm)-Tle-NH2
GAL-BBB2：Sar-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2
其中Sar為肌胺酸、Tle為第三白胺酸且Lys-palm為經由ε胺基與十六醯基部分偶合之離胺酸殘基且-NH2表示在C末端醯胺化。在固體支撐物上使用標準Fmoc化學合成肽，且藉由HPLC將其純化。隨後在癲癇症之Frings聲源性發作敏感型小鼠模型中測試所純化之類似物。將該研究之結果與原生甘丙肽肽片段(1-16)相比較。
其他類似物包括下列各物：
GAL-BBB3：WTLNSAGYLLGPKKXK-NH2(SEQ ID NO：49)
GAL-BBB4：Sar-WTLNSAGYLLGP(D-Lys)(D-Lys)X(D-Lys)-NH2(SEQ ID NO：50)
GAL-BBB5：Sar-WTLNSAGYLLGPRRXR-NH2(SEQ ID NO：51)
GAL-BBB6：Sar-WTLNSAGYLLGPHHXH-NH2(SEQ ID NO：52)
GAL-BBB7：Sar-WTLNSAGYLLKKKKXK-NH2(SEQ ID NO：53)
GAL-BBB8：Sar-WTLNSAGYLLKKXK-NH2(SEQ ID NO：54)
其中Sar為肌胺酸且X為Lys-十六醯基殘基。
將兩種經修飾之甘丙肽類似物(GAL-BBB1及GAL-BBB2)以4 mg/kg之劑量i.p.投與Frings聲源性發作敏感型小鼠之組。在投與後各時刻(亦即15、30、60、120及240 min)將各小鼠放入配備聲音傳感器之圓柱形測試室中，且以高強度音刺激(110 dB，11 KHz歷時20 sec)激發各小鼠。認為未顯示強直性後肢伸展之動物受到保護。如圖12中所概括，獲自該研究之結果證明GAL-BBB2顯示時間依賴型抗痙攣作用，其快速發作(在30 min內)且適度持續(在2與4小時之間)。相反，另一經修飾之甘丙肽類似物GAL-BBB1在任何測試時間點，甚至在12 mg/kg之較高劑量均不具有活性。在後續研究中，在劑量-反應研究中峰作用時間時(亦即1 h)將抗痙攣功效定量。此研究之結果證明GAL-BBB2顯示抗聲音誘導之發作的劑量依賴型作用。自劑量-反應數據之 Probit分析獲得之計算半數有效劑量(亦即ED50)及95%置信區間為3.2(2.3-6.1)mg/kg。原生肽片段GAL(1-16)在20 mg/kg i.p.(GAL-BBB2之ED50的6倍)(圖20)之劑量為非活性的。
當i.p.給與時，甘丙肽類似物GAL-BBB2顯示有效抗痙攣活性(ED50約3 mg/kg)。此概念證據類似物表示更多"藥物樣"類似物設計之原型。因此可獲得具有最有效且持久抗痙攣活性之最小甘丙肽類似物。此要求兩步法：(1)定義保持抗痙攣活性之GAL-BBB2類似物之最小片段：此將包括末端及中心截短；(2)優化將進一步改善類似物之BBB滲透性之C末端結構基元。首先在甘丙肽競爭性結合檢定中篩選所合成之類似物。使用癲癇症之聲源性發作小鼠模型進一步篩選彼等以1 μM或更低之濃度置換甘丙肽之類似物的抗痙攣活性。在更多藥理學檢定中進一步評估在單次劑量(亦即2 mg/kg，當i.p.給與時)顯示持久抗痙攣活性之彼等類似物。一般實驗策略概括於圖13中。圖23及24分別展示當給與GAL-BBB2時，Frings小鼠之時間依賴型抗痙攣活性及Frings小鼠之抗聲源性發作之劑量依賴型保護。
進行有限結構-功能關係研究以確定當全身投與時保持抗痙攣活性之GAL-BBB2類似物之最小片段。合成且測試含有C末端及中心截短之甘丙肽類似物。此外，進行C末端基元之有限結構-功能關係研究以優化該類似物穿過血腦障壁之滲透性。圖14說明在結構-功能研究之情形中GAL-BBB2之結構。
為產生GAL-BBB2之截短類似物，自Pro13至Leu10殘基進行4個連續缺失(概括於表11中)。由於Tyr9對甘丙肽活性關鍵，因此其他C末端截短可導致生物活性完全喪失(參看Land等人，Int J Pept Prot 1991)。在各截短類似物中，保留C末端"-Lys-Lys-LysP-Lys"以改善穿過BBB之滲透性。
表11. GAL-BBB2及截短類似物之結構
為最小化GAL-BBB2類似物，引入關鍵殘基之間的中心截短。此為在不損害所得肽之長度的情況下設計具有簡單化結構之活性肽類似物的替代策略。可藉由以例如胺基戊酸或胺基己酸("骨架間隔劑")之非肽間隔劑取代兩種或兩種以上連續"非關鍵"殘基實現骨架替換(亦即"骨架假體")。此概念於圖15中更充分說明。
在GAL-BBB2類似物之情況下，藉由以骨架間隔基團(表11)系統替換殘基來探測肽之3個部分：Trp2與Asn5之間，Asn5與Tyr9之間及Tyr9與C末端基元之間。合成該等類似物中之約14種且測試其與甘丙肽受體之結合。若某些類似物保持抗痙攣活性，則可在不同位置中引入兩種或兩種以上之間隔基團(參見表12中之實例)。
表12. GAL-BBBB2類似物之"骨架假體行走"每次以諸如胺基戊酸或胺基己酸之非肽骨架間隔基團替換2個殘基在不顯著改變關鍵藥效 基團殘基之間隔的情況下使得整體分子尺寸最小化。
接著可優化C末端結構基元"-Lys-Lys-LysP-Lys-NH2"以改善BBB滲透性。可藉由引入概括於表13中之下列結構變化優化初始化合物GAL-BBB2。以均-Lys、D-Lys或二胺基丁酸替換Lys殘基探測側鏈具有變化之親脂性性質之帶正電殘基之BBB滲透效率。在位置16以2-胺基-十四酸或3,3-二苯基丙胺酸替換Lys-十六醯基部分決定此位置相對於亦可增強BBB滲透性之其他疏水性殘基的可撓性。
表13增強甘丙肽類似物穿過BBB之滲透性的C末端基元之修飾。
TDA為2-胺基-十四酸；DAB為二胺基丁酸；D-Lys為Lys之D-異構體且h-Lys為均-Lys；DPA為3,3-二苯基丙胺酸。
除上文所列之類似物外，如下文所示亦可製備2種在C末端具有親脂性、非肽延長之類似物：其中X表示12-胺基-十二烷酸或2-胺基-十四酸。
如圖13所說明，測試各合成及純化之類似物與甘丙肽受體之結合特性。僅另外研究以1 μM或更低之濃度置換全長甘丙肽之彼等類似物。可藉由(例如)Novascreen Biosciences Corporation進行甘丙肽結合檢定。大鼠前腦膜及放射性標記的親本神經肽可用於該等檢定。可在單一(1 μM)濃度測試類似物以區別高及低親和力類似物。可使用 MDS-Pharma Services所提供之功能檢定進一步測試所選擇甘丙肽類似物之促效劑活性。例如，可在單一濃度(1 μM)測試該等類似物。
下表摘要各種SAR類似物，及劑量4 mg/kg i.p在1、2及4小時所提供之保護百分比。
可以反射性癲癇之Frings AGS敏感型小鼠模型首先確立抗痙攣活性。AGS敏感型小鼠為理想急性發作模型，此係由於其非歧視性且有效地偵測廣泛多種CNS活性化合物(White等人，1992)。可評估在Frings小鼠中發現具有活性之肽的阻斷最大電擊療法(MES)及皮下(s.c)投與伸戊基四唑(PTZ)所誘導之發作的能力。該等2個測試量測研究性抗癲癇化合物分別預防發作擴散及升高發作閾值之能力(White等人，2002)。已證明所修飾之肽在該等3個發作測試之一或多者中具有活性後，在先前所測定之i.p.投藥後的峰作用時間時進行完整劑量-反應研究。接著將此等概念證據研究之結果與腦室內(i.c.v.)投藥後所進行之功效研究相比較。當實現血腦障壁之更大穿透時，可觀察到i.p.劑量-反應曲線左移。此等3個發作測試所獲得之結果共同提供支援全身投與後使得小型肽更易進入大腦之方法的實質性資料。各個別發作測試之細節概述如下。
投與神經肽類似物經由10 μl漢彌爾頓注射器將5 μl人工腦脊髓液中之所修飾甘丙肽類似物之各者腦室內(i.c.v.)投與或以0.01 ml/g體重之體積腹膜內(i.p.)投與0.5%甲基纖維素中之所修飾甘丙肽類似物之各者。
聲源性發作可在峰作用時間評估個別修飾之類似物預防AGS敏感型Frings小鼠模型中藉由聲音誘導之發作的能力(White等人，1992)。對於此測試，將個體小鼠放入配備聲音傳感器(Model AS-ZC；FET Research and Development,Salt Lake City,UT)之樹脂玻璃圓筒內(直徑15 cm；高度18 cm)且暴露於輸送20秒之110分貝(11 KHz)之音刺激。 聲音誘導之發作之特徵在於無序跑動後具有前肢及後肢強直性伸展之翻正反射消失。認為未顯示後肢強直性伸展之小鼠受到保護。
MES測試對於MES測試，在放置角膜電極前，將一滴麻醉/電解質溶液(0.9%鹽水中0.5%之鹽酸丁卡因)施於各動物之眼中。小鼠MES測試中之電刺激為50 mA，藉由與最初Woodbury及Davenport所描述(Woodbury及Davenport,1952)相似之裝置輸送0.2 sec。發作之後腿強直伸肌組份之消除用作終點。
s.c.PTZ測試對於s.c.PTZ測試，將85 mg/kg劑量之PTZ s.c.於鬆散折疊之各小鼠之背部皮膚中。將小鼠放入個別樹脂玻璃觀察箱中，且觀察最低陣攣發作之存在，歷時30分鐘。認為未顯示陣攣發作活性之小鼠受到保護。
最低毒性測試可在小鼠中藉由轉棒程序(Dunham及Miya,1957)確定最低毒性。當將小鼠置於轉速為6 r.p.m.之1英吋滾花棒上時，動物可長時間段保持平衡。若在1分鐘時間段期間動物自此旋轉棒跌落三次，則認為其中毒。
測定半數效應劑量(ED 50 )或中毒劑量(TD 50 )在先前測定之TPE進行所有活體內定量抗痙攣/毒性研究。以各種劑量之肽測試至少八隻小鼠之組，直至在100%保護或最低毒性與0%保護或最低毒性之限度之間至少已確立兩點。藉由基於Finney所描述之方法(Finney,1971)之電腦程式計算各測試之50%之動物中產生所需終點(ED50或TD50)所需之藥物之劑量，95%置信區間，回歸線之斜率，及斜率之S.E.M.。
3.實例3：GAL-BBB2具有有效疼痛緩減
a)福馬林測試
將0.5%之福馬林注射至小鼠右後爪之植入區。此引發以小鼠舔舐受影響之爪為特徵的不同兩階段行為概況。注射後不久小鼠舔舐其爪約10分鐘。此為階段1(急性)且隨後為短暫潛伏期，其中幾乎無行 為活動。繼起之舔舐爪約20至30分鐘之更長時段構成階段2(發炎性)。
投與活性肽、藥物或媒劑前，各小鼠在放置於鏡之前的數個6號高度之樹脂玻璃觀察管(4號直徑)之一者中經受15分鐘調節期。調節期後，以GAL-BBB2非活性原生片段Gal 1-16或加巴噴丁i.p.處理小鼠，隨後返回至其棲息管中。處理後1小時，向右後足之足底表面皮下注射福馬林(20 μl；27號針)。針之斜面向下面對皮膚表面放置。注射福馬林後，觀察各動物達各5分鐘時段之前2分鐘，歷時總計45分鐘。量測各2分鐘時段之累積舔舐長度。接受必要體積之媒劑的動物與給與GAL-BBB2、Gal 1-16或加巴噴丁之各小鼠輪流。實驗得出結論後使動物安樂死。
在另一實驗中(於下表中)，發現兩個具有獨特結構基元之其他甘丙肽類似物(亦即NAX 306-3及306-4)以及NAX 5055在發炎性疼痛小鼠福馬林檢定中為有效的。該等結果展示活性藥效團順應結構修飾。
使用GraphPad Prism版本3.03測定曲線下之面積(AUC)。計算測試與對照組之急性及發炎性階段之總AUC。亦計算個體動物之各階段的AUC，且將其轉化為對照之總AUC的百分比。計算藥物治療與對照之平均百分比及SEM且測試顯著差異。
b)坐骨神經之結紮
恰在手術前，以0.1至0.5 mg/kg長效阿片丁丙諾啡(buprenorphine)皮下處理大鼠。隨後以戊巴比妥(pentobarbital)使大鼠麻醉，且藉由其對鼠尾夾擠之反應及呼吸深度之觀察來監控麻醉之程度。遍及該手術使用無菌技術。
削刮各大鼠之上部大腿且以乙醇及優碘擦除。在皮膚中且穿過上部大腿之下部肌肉直至暴露坐骨神經切一小切口。接著將神經與周圍結締組織分開且藉由一對精細彎鉗使其略微升高。藉由使針及耐綸縫合線(7.0)穿過神經而將約1/3至1/2之神經打結。接著分別以5.0縫合線將肌肉及皮膚切口封閉縫合，且藉由將動物置於恆溫控制的加熱毯上而使其保溫，直至動物自麻醉恢復。在右側(同側)進行此程序而在左後腿(對側)進行假手術。後者包括除僅暴露此側之坐骨神經且不結紮外之類似程序。手術後12小時，投與第二劑量之丁丙諾啡以將外科程序之任何不適最小化。每日密切監控大鼠感染或手術不良作用之發展。
恢復適當時間後(例如7-14天)測試該等動物之機械觸痛感(對非有害刺激物之疼痛反應)之發展。對於此研究，將動物置於放置在金屬絲網(1/4")平臺上之無底樹脂玻璃箱中。30-60分鐘之適應週期後，測定基線機械敏感度。此程序藉由將一系列校準之弗雷氏(Von Frey)纖維垂直施加至各後部爪之腳底表面且以足以使纖維略微彎曲之力將其保持約6秒而進行。注意到陽性反應(縮足)後，施加較小直徑之纖維。重複此程序直至可測定縮足之50%閾值。
i.p.注射2 mg/kg GAL-BBB2(n=8大鼠/藥物)後，注射後30分鐘且在此後各種時間(例如1、2、4及6 h)評估機械閾值以測定測試化合物之作用的持續期間。將GAL-BBB2所獲得之結果與2 mg/kg嗎啡鹼及40 mg/kg加巴噴丁所獲得之結果相比較。
c)結果
已證明大量抗痙攣劑在治療疼痛中有效。因此，在小鼠福馬林模型中檢查GAL-BBB2以評估其是否具有止痛特性。在此測試中發現如藉由動物舔舐同側爪所花費之時間的量化所評估，GAL-BBB2顯著降低與s.c.腳底福馬林相關之疼痛。如圖16中所示，GAL-BBB2(0.52-5 mg/kg)在初始急性階段以及延長發炎性階段中對爪舔舐產生劑量依賴型降低。相反，發現未修飾原生片段Gal 1-16在i.p.投與比所測試GAL-BB2之最高劑量劑量高4倍(亦即20 mg/kg)之劑量後為非活性的。此外，發現5 mg/kg GAL-BBB2(圖16)等效於10 mg/kg劑量之加巴噴丁(圖17)。
如圖18中所示，GAL-BBB2在慢性疼痛之坐骨結紮模型中對機械觸痛感之閾值顯示時間依賴型增加。此外，GAL-BBB2在此測試中等效於嗎啡鹼且比加巴噴丁有效數倍(圖18之插圖)。
該等2個所建立之疼痛模型中所獲得的結果共同展示GAL-BBB2在慢性疼痛之齧齒動物模型中具有有效疼痛緩減。
4.實例4：穿透血腦障壁之甘丙肽類似物
親脂性及鹼度有助於增加肽在無需特定運輸體或載體之情況下穿過BBB之滲透性。肽之親脂性特徵(藉由logP值量測)可藉由與疏水性部分(例如脂胺基酸)結合或芳族殘基之鹵化而改變。關於鹼度，Poduslo組展示多胺修飾之蛋白質及肽更有效地穿過BBB(Poduslo及Curran 1996；Poduslo及Curran 1996；Poduslo,Curran等人1998；Poduslo,Curran等人1999)。Tamai及其合作者(Tamai,Sai等人1997)提供小型肽之增加之鹼度為經由吸附介導之內飲作用(AME)穿過BBB運輸的重要決定因素的證據。
糖基化視乎為產生全身活性阿片樣肽之極有效方法(Elmagbari,Egleton等人2004；Polt,Dhanasekaran等人2005)。SAR研究展示醣之結構為活性之重要決定因素，但二醣通常比單醣低效。具有β蜜二糖或β-乳糖之O-糖基化絲胺酸為得到有效止痛化合物之最有效修飾中者。
甘丙肽及其受體在癲癇症及癲癇發生之作用。神經肽為典型神經遞質及神經元興奮性之有效調節劑(Hokfelt,Broberger等人2000)。 神經肽與典型神經遞質在選擇神經元群體中之共存暗示神經元興奮性可經由肽能傳輸之修飾而調節(Baraban及Tallent 2004)。在環境條件下，肽為"沉默"的，且對正常神經傳遞施加極少作用。相反，在極高神經元發火(如發作病灶時所發生)條件下，釋放神經肽且其對神經傳遞施加調節作用。
甘丙肽在腦中產生多重效果(Hokfelt,Xu等人1998；Lundstrom,Elmquist等人2005)。迄今為止鑑定出3種甘丙肽受體亞型屬於G蛋白質偶合之受體(GPCR)的超級家族(Branchek,Smith等人2000；Lundstrom、Elmquist等人2005)。甘丙肽受體1型(GalR1)存在於許多大腦區域，但在海馬區顯示最高表現(Burgevin,Loquet等人1995)。甘丙肽受體2型(GalR2)如GalR1般廣泛分佈。在腦中，其在下丘腦、海馬區(齒狀回>CA3>CA1)、扁桃體、梨狀皮質、基底前腦(中間隔膜/對角帶)、小腦及腦幹表現。甘丙肽受體3型(GalR3)在腦中顯示極受限表現。其在下丘腦、中間網狀結構及對角帶最豐富，且不存在於海馬區中。
自從Mazarati及合作者之先導工作(Mazarati,Halaszi等人1992)，甘丙肽為有效抗痙攣肽存在增加之證據。已發現急性投與甘丙肽受體促效劑或病毒介導之甘丙肽於海馬區中之過度表現抑制大鼠及小鼠中邊緣癲癇持續狀態、伸戊基四唑及椰子苦毒素發作(Mazarati,Halaszi等人1992；Mazarati,Liu等人1998；Saar,Mazarati等人2002；Haberman,Samulski等人2003；Lin,Richichi等人2003；Bartfai,Lu等人2004)。此外，甘丙肽過度表現轉基因動物之發作閾值在癲癇持續狀態及誘發模型中升高(Mazarati,Hohmann等人2000；Kokaia,Holmberg等人2001；Schlifke,Kuteeva等人2006)。
活體外甘丙肽抑制麩胺酸酯自海馬區釋放(Zini,Roisin等人1993；Mazarati,Hohmann等人2000)。獲自GalR1基因剔除小鼠及以反義 GalR2肽核酸處理之大鼠的研究之結果表明甘丙肽經由與GalR1及GalR2作用施加其抗痙攣作用(Mazarati,Lu等人2004；Mazarati,Lu等人2004)。此外，認為GalR2在甘丙肽於海馬趾神經元中之神經保護作用中起重要作用(Haberman等人，2003；Mazarati等人，2004a；Pirondi等人，2005；Elliot-Hunt等人，2004；Lee等人，2005；Hwang等人，2004)。
應強調甘丙肽有效於預防急性發作之表現且改進各種傷害後癲癇症之發展。例如，若干報導已展示甘丙肽可改進與邊緣發作相關之損傷且延遲或預防癲癇症之發展(亦即抗致癲癇)。Kokaia等人(Kokaia,Holmberg等人2001)報導甘丙肽肽過度表現小鼠之延遲誘發。快速誘發模型近期研究之結果展示與Gi/o蛋白質偶合之海馬趾GalR2獨立於GIRK施加抗致癲癇作用，而GalR1延遲GIRK激活所致之誘發之獲取(Mazarati,Lundstrom等人2006)。
甘丙肽及甘丙肽受體配位體之結構-活性關係(SAR)。甘丙肽於1983年首次發現(Tatemoto,Rokaeus等人1983)。其為29-30個胺基酸長度之肽，具有以下序列：
人類GWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS-COOH(SEQ ID NO：93)
大鼠/小鼠GWTLNSAGYLLGPHAIDNHRSFSDKHGLT-NH2(SEQ ID NO：94)
豬GWTLNSAGYLLGPHAIDNHRSFHDKYGLA-NH2(SEQ ID NO：95)
來自不同動物物種之甘丙肽序列中前14個N末端殘基(陰影區)為高度保守的(Langel及Bartfai 1998)。由於已廣泛研究甘丙肽之結構-活性關係，吾人將僅綜述與此頒予申請案有關之SAR結果。GAL之N末端片段由前15個殘基(類似物GAL(1-15))或16個殘基(類似物GAL(1- 16))組成，其經展示對甘丙肽受體保持高親和力(Fisone,Berthold等人1989；Land,Langel等人1991)。如下表中所示，GAL(1-16)之系統截短使得其對受體之親和力逐漸降低(Land,Langel等人1991)。
在同一研究中，作者證明Gly1、Trp2、Asn5、Tyr9及Gly12殘基對於GAL(1-16)類似物與甘丙肽受體之高親和力結合而言為重要的。GAL(1-16)之丙胺酸行走類似物指示該等殘基之替換影響其對GalR2而非GalR1之親和力(Carpenter,Schmidt等人1999)。丙胺酸削刮方法揭示自Tyr9跨至His14之序列對於識別甘丙肽受體為重要的(Jureus,Langel等人1997)。
(Pooga,Jureus等人1998)描述GAL(1-16)類似物之極廣泛SAR研究。Gly1或Trp2之修飾使得對甘丙肽受體之親和力明顯喪失。具有與尺寸不同之不同基團偶合的Lys14 ε-NH基團之GAL(1-13)之所有類似物保留高親和力。基於該等結果，GAL(1-13)之C末端部分在不損害結合特性之情況下可容納相對龐大基團。總而言之，甘丙肽及其截短類似物之SAR表明Trp2、Asn5及Tyr9為保護甘丙肽與GalR1及GarR2受體之間的交互作用之關鍵殘基。突變及模型研究展示Trp2與hGalR1之Phe282交互作用，而Tyr9與His264交互作用(Kask等人，1996；Berthold等人1997；Church等人，2002)。
由於廣泛結構-活性關係研究，大量肽類甘丙肽類似物-促效劑與 拮抗劑均得以合成且表徵其功能。所選擇甘丙肽受體配位體之結合特性摘要於表18中。
aKD值自以下文獻編輯(Branchek,Smith等人2000；Lundstrom,Elmquist等人2005；Lundstrom,Sollenberg等人2005；Sollenberg,Lundstrom等人2006)。加爾農(Galnon)及加米克(galmic)為兩種非肽類甘丙肽受體促效劑，其已變成研究甘丙肽受體於CNS中之作用的極適用之藥理學工具(Saar,Mazarati等人2002；Bartfai,Lu等人2004；Badie-Mahdavi,Behrens等人2005；Lu,Barr等人2005；Schlifke,Kuteeva等人2006)。然而，如近期所聲明："加爾農(galnon)及加米克(galmic)之缺陷在於其為低親和力(微莫耳親和力)、非受體亞型選擇性且與其他藥理學上重要之標靶相互作用"(Lu,Lundstrom等人2005)。
合理設計且化學合成NAX 5055，穿透BBB之甘丙肽類似物。如本文中所揭示，甘丙肽為30個胺基酸之神經肽，且已證明N末端片段 GAL(1-16)在海馬趾甘丙肽受體處仍為高度有效促效劑(Fisone,Berthold等人1989)。迄今為止所獲得之結果係以已修飾以使得代謝穩定性增加且穿過BBB之滲透性改善的截短之GAL(1-16)類似物(圖31)所獲得。
基於可獲得之結構-活性關係數據，將下列修飾引入GAL(1-16)類似物以改善其代謝穩定性及穿過BBB之滲透性：(1)藉由肌胺酸將Gly1殘基置換。Gly1之N甲基化並不影響甘丙肽受體親和力(Rivera Baeza,Kask等人1994)。此外，已知胺基肽酶N降解神經肽，且因此N末端胺基封端可能降低含有肌胺酸之類似物之代謝降解的速率；(2)藉由Lys殘基將His14及Ala15置換。將醯胺化Lys殘基添加至C末端。該等其他正電荷增加經由吸附介導之內飲作用介導的BBB滲透性(Tamai,Sai等人1997)；(3)藉由離胺酸十六醯基(Lys-palm)殘基將Val16置換。此長疏水性可增加被動擴散且提供代謝降解之額外阻力(Yuan,Wang等人2005)。在固體支撐物上使用標準Fmoc方案及自動肽合成器化學上合成NAX 5055。
NAX 5055之藥理學特性迄今為止已在放射性配位體結合檢定及活體內急性發作測試組中評估NAX 5055。自該等研究獲得之結果展示本文中所揭示之方法可得到穿透BBB之有效、高親和力甘丙肽受體調節劑。
NAX 5055對GalR1及GalR2保留高親和力在藉由MDS-PS contract screening company進行之初步放射性配位體結合研究中證實NAX 5055對人類hGalR1及hGalR2之親和力(報導#1077561，引用：MDSPS 231510及231600)。在此研究中，hGalR1表現於HEK-293細胞中，而hGalR2表現於CHO-K1細胞中，且人類[125I]甘丙肽用作放射性配位體。NAX 5055對兩種亞型均保留高親和力，而hGalR1之Ki估計值為9 nM且hGalR2之Ki估計值為6 nM。
全身投與後N4X 5055顯示有效抗痙攣活性。最初在i.p.投與4 mg/kg後，在反射性癲癇之Frings聲源性發作(AGS)敏感型小鼠模型中測試NAX 5055。在投與後各種時刻(亦即15、30、60、120及240 min)將各小鼠放入配備聲音傳感器之圓柱形測試室中，且以高強度音刺激(110 dB，11 KHz歷時20 sec)激發各小鼠。
認為未顯示強直性後肢伸展之動物受到保護。如圖24中所示，獲自該實驗之結果證明NAX 5055顯示時間依賴型抗痙攣作用，其快速發作(在30 min內)且適度持續(在2與4小時之間)。在後續劑量-反應研究中在峰作用時(亦即1 h)將抗痙攣功效定量。自劑量-反應數據之Probit分析獲得之計算半數有效劑量(亦即ED50)及95%置信區間為3.2(2.3-6.1)mg/kg。當i.p.投與後1小時測試時，NAX 5055(4 mg/kg)而非原生GAL(1-16)片段(20 mg/kg)有效於在Frings小鼠中阻斷聲音誘導型發作。
亦在兩個良好建立之發作模型中測試NAX 5055：亦即最大電休克發作(全身性強直陣攣癲癇模型)及s.c.戊四唑發作測試(全身性肌陣攣性癲癇模型)。對於此研究，將4 mg/kg NAX 5055 i.p.投與且1小時後測試小鼠防強直伸展(最大電擊療法)及陣攣(s.c.戊四唑)發作之保護。NAX 5055在s.c.戊四唑發作測試中具有最低活性(25%保護)且在最大電休克發作測試中完全無活性(結果未展示)。儘管自臨床功效觀點該等結果可解釋為陰性的，但迄今所描述之NAX 5055之概況實際上與新穎抗癲癇藥物左乙拉西坦相一致，其於2000年引入用於治療人類部分發作。
因此，為延長NAX 5055之抗痙攣概況，其亦已在另一左乙拉西坦敏感型急性發作模型(亦即6 Hz心理運動測試)中評估。6 Hz發作測試逐漸成為用於區分可適用於難治性部分性癲病之治療之可能的抗痙攣化合物之獨特模型(Barton,Klein等人2001；White 2003)。i.p.投與後 NAX 5055在此藥學抵抗性癲癇症之模型中極有效(表19)。與左乙拉西坦且甚至丙戊酸不同，當刺激強度自22增加至44 mA時NAX 5055之效能保留。因此，NAX 5055在6 Hz測試之所測試抗痙攣藥物中的相對獨特性在於其在所評估所有3個電流強度仍保留為極有效。相反，當刺激強度自22增加至44 mA時其他藥物之效能降低。隨後皮下(s.c)投與後在小鼠6 Hz邊緣發作模型中測試NAX 5055。有趣地，s.c.投與後活性保留(圖26)。s.c.投與後NAX之ED50僅稍微右移之結果展示NAX 5055具有優良生物可用性。
為證實當原生肽片段進入大腦中時，其具有活性，進行後續研究其中NAX 5055及GAL(1-16)均直接投與室空間中。獲自此腦室內(i.c.v.)研究之結果概括於圖22中。如圖22所示，i.c.v.投與後兩種類似物均極有效(亦即NAX 5055及GAL(1-16)之ED50分別為0.07及1.7 nmole)。有趣的是應注意到NAX 5055實際上會比原生肽片段GAL(1-16)更有效。
NAX 5055類似物之結構-活性關係。為更好地瞭解全身投與後活 性之結構決定因素進行SAR研究。首先測試C末端之個別化學修飾是否可產生當與兩種修飾之組合相比時相當之作用。如下文所示，當與NAX 5055相比時個別修飾均無持久且有效抗痙攣活性。類似物1105-2顯示較低效能(ED50=3.8 mg/kg，當與5055之0.8 mg/kg相比時)、較短作用持續時間，及未於5055中觀察到之毒性(運動障礙)。Lys-palm殘基之存在不足以產生任何可見抗痙攣活性。該等結果強烈暗示兩種修飾之組合對於5055類似物之藥理學特性極其重要。
註釋：所有類似物包括NAX 5055均在C末端醯胺化。
其次，藉由以DLys或Arg替換Lys或藉由改變大量Lys殘基研究C末端Lys殘基之作用。以Arg替換Lys僅稍微改變類似物之活性。以異構體DLys替換Lys得到具有可比效能(ED50=1.2 mg/kg)之更持久類似物(1205-2)。以2個其他Lys殘基替換Gly12-Pro13保持抗痙攣活性，而亦產生毒性。該等實驗之結果摘要於下表21中：
接著測定中心截短之NAX 5055之功能結果。如表22中所示，藉由"G12,P13"或"L10,L11,G12,P13"截短之Gal(1-16)將對甘丙肽受體之親和力降低至少二個數量級。5055類似物(類似物1205-5及306-3)之系統中心截短在6 Hz模型中僅產生稍微略低之效能(當與5055類似物之0.8 mg/kg相比時，兩種類似物ED50=2.7 mg/kg)及較短作用持續時間。
亦探索在甘丙肽片段與KKKpK基元之間引入可影響類似物之抗痙攣活性之骨架間隔基團，諸如6-胺基己酸。類似物306-2與306-4保持其抗痙攣活性(306-4之ED50=2.95 mg/kg)。有趣地，306-4類似物似乎在2.95 mg/kg劑量(6 Hz模型之ED50)在小鼠中於發炎性疼痛檢定之第二響應階段中極具有活性，此暗示其抗痙攣活性及抗傷害感受活性可能不直接相關。
最後，檢查缺少N末端肌胺酸殘基之5055類似物之活性(類似物1205-1：WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)K)。基於亦稱為AR-M1896之甘 丙肽促效劑類似物Gal(2-11)設計此類似物：假定第一殘基之移除將降低該類似物對GalR1亞型之親和力，而保持對GalR2之高親和力(參見表21中Gal(2-11)類似物之結合數據)。1205-1類似物在6 Hz邊緣發作模型中具有降低之效能(ED50=5.7 mg/kg)。
總而言之，SAR結果展示陽離子化與脂化之組合優於個別化學修飾。
a)設計及化學合成穿透BBB之甘丙肽類似物。
基於當前SAR結果，進行該等含有化學修飾之組合之類似物的合成及表徵。採用陽離子化之新策略：使用多胺基化合物，諸如精胺或脂肪多胺共軛物。由於肽之糖基化為改善BBB穿透之良好確立之策略，因此採用糖基化甘丙肽類似物。
陽離子 化帶正電之Lys殘基及其與Lys-palm之組合可改善該等類似物向CNS之輸送。該等相對保守類似物之實例展示於表24中。
由於陽離子化為甘丙肽類似物穿透BBB之關鍵，因此探索含有多胺之甘丙肽類似物。探索含有精胺之類似物的基本原理為以具有若干胺基而缺乏肽鍵(降低之蛋白水解敏感性及缺乏氫鍵結供體/受體)之單一分子替換若干Lys殘基(存在於NAX 5055中)。合成若干甘丙肽類似物，其中精胺為骨架或側鏈之一部分。表25摘要甘丙肽-精胺類似物之結構及基本原理。
脂化 在下一組類似物(表26)中，探索位置16脂化對類似物穿透BBB之作用。
表26.在位置16具有修飾之類似物。所有類似物均在C末端醯胺化。
糖基 化首先合成兩種在位置16含有α甘露糖或β蜜二糖絲胺酸殘基之糖基化甘丙肽類似物。因此，在該等類似物中醣部分替換Lys-palm殘基。
骨架間隔基團 探索骨架間隔基團對NAX-5055基類似物之抗痙攣活性之作用。以非肽類間隔基團替換肽骨架之部分的主要優點為：(1)降低之分子大小，其將改善BBB滲透性；(2)降低之蛋白水解降解之敏感性；及(3)氫鍵供體/受體之缺乏。該等類似物之實例展示於表28中。
化學合成類似物使用Fmoc基固相肽合成(SPPS)方案及自動肽合成器合成所有類似物。SPPS之所有建構塊均為市售，其包括Fmoc保護之骨架間隔基團、糖胺基酸、精胺、精胺-琥珀醯胺酸或精胺-十六醯基(Sussex Research Laboratories,Iris Biotech,NeoMPS,Chem-Impex)。將如先前所述進行偶合方法(Fields及Noble 1990；Albericio 2000)。對於其中精胺或其衍生物結合於位置16之類似物而言，該等類似物已併入受γ-2-苯基異丙酯(0-2-PhiPr)保護之麩胺酸。在樹脂上使用於二氯甲烷中之1% TFA將側鏈羧基去保護。使用1,3-二異丙基碳化二醯亞胺(DIC)進行精胺或其十六醯基衍生物之偶合(於其他胺基上Fmoc/Boc保護)。將肽自固體支撐物中移出，以MTBE洗滌且沉澱。使用二苯基製備逆相HPLC純化類似物。15分鐘20%至90%之90%乙腈/10%水/0.1% TFA之乙腈(於0.1% TFA中)線性梯度用於溶離。使用在280 nm之莫耳吸光度係數7,000將類似物定量(1 Tpr 5,600及1 Tyr 1,400)。該等程序已有效製備NAX 5055及具有10至50毫克之個別批量範圍之相似類似物。
b)活體外表徵穿過BBB之甘丙肽類似物
為表徵所合成甘丙肽類似物之生物活性，測定其對GalR1及GalR2受體之結合常數。3個主要目標為：(1)評估引入GAL(1-16)之化學修飾於何種程度上改變對甘丙肽受體之親和力；(2)測定甘丙肽類似物之選擇性概況；及(3)開發穿透BBB之高親和力甘丙肽類似物之可靠篩選檢定。已展示NAX 5055保留對GalR1與GalR2之低奈莫耳親和力。
可使用銪標記之甘丙肽之螢光基結合檢定(來自Perkin Elmer之Delfia檢定)。此先前藉由(Valenzano Miller等人2000)所描述之檢定係 有效的，且用以表徵所有先前合成之類似物的結合特性。該螢光基結合檢定優於更傳統使用之放射性配位體結合檢定之主要優點在於避免放射能之缺點(健康、處理、短貯存期、獲取信號之長持續時間)，使得該等檢定對於中及高產率篩選更友好。具有鑭系元素之標記受體配位體由於其長螢光壽命而提供高靈敏度之優點。使用具有400微秒之延遲的時間解析螢光偵測，可在單井中偵測到少於1毫微微莫耳之銪。
以膜製劑形式自Perkin Elmer或Multispan,Inc.獲得兩種甘丙肽受體。銪標記之甘丙肽(Eu-甘丙肽)購自Perkin Elmer。以於60微升體積之結合緩衝液(於低滲緩衝液中之EDTA、BSA、PEG)中之10微克膜蛋白(濃度)進行結合反應。以範圍為0.01至10 nM配位體濃度之Eu-甘丙肽產生飽和結合曲線。為測定結合常數，將0.2 nM Eu-甘丙肽與膜一起培育2小時。藉由經由AcroWell濾板使用真空箱快速過濾而終止反應，且以300 mL之低滲緩衝液洗滌3次。將增強溶液添加至各孔且在具有TFR之Victor3分光螢光計上記錄TRF信號。
c)活體內表徵穿過BBB之甘丙肽類似物
甘丙肽類神經肽在癲癇症之藥學抵抗性模型中的抗痙攣活性及其抗致癲癇特性
在藥學-抵抗性部分性癲癇之6 Hz邊緣發作模型中表徵所選擇類似物。藉由i.p.投與後產生劑量-反應曲線測定該等類似物於此藥學抵抗性癲癇症模型中之效能。i.p.投與所有化合物或投與每公克體重0.01 ml體積之於0.9% NaCl中之所有化合物。除6 Hz發作測試之急性功效研究外，分析NAX 5055及其他甘丙肽類似物預防部分性癲癇之小鼠角膜誘發模型中誘發獲取之能力(Matagne及Klitgaard 1998)。
抗痙攣測試 在3種不同刺激強度(亦即22、32及44 mA)評估各類似物預防6 Hz角膜刺激(持續3 sec)誘導之發作之能力。6 Hz發作之特 徵在於最短陣攣階段，繼之為刻板、自動行為，其最初描述為與具有部分發作之人類患者之先兆相似(Toman,Everett等人1952；Barton,Klein等人2001)。認為未顯示該行為之動物受到保護。如上所述，當電流自22 mA增加至44 mA時，6 Hz發作變得更加難以藉由抗癲癇藥物阻斷。i.p.後在峰作用時刻根據Barton,Klein等人2001所描述之方法將6 Hz發作測試中各類似物之活性定量。對於此測試，在放置角膜電極前，將一滴麻醉/電解質溶液(0.9%鹽水中0.5%之鹽酸丁卡因)施於各動物之眼中。對於峰作用時間研究，採用總計20隻CF-1小鼠。在不同時間(亦即0.25、0.5、1、2及4 h)測試4隻小鼠之組。對於劑量-反應研究，以各種劑量之候選肽測試至少8隻小鼠之組，直至在100%功效及0%功效限度之間形成至少兩點。隨後藉由基於Finney所描述之方法(Finney,1971)之電腦程式計算所暴露之50%之動物中產生半數有效劑量(亦即ED50)所需的藥物之劑量，95%置信區間，回歸線之斜率，及斜率之S.E.M.。
獲取角膜誘發 評估NAX 5055及所選數目之其他甘丙肽類似物在如(Matagne及Klitgaard 1998)所描述之小鼠角膜誘發模型中預防誘發之獲取的能力。經由角膜之每日電刺激在15-20天產生穩定誘發狀態。此為最初評估所選甘丙肽類似物預防誘發獲取之能力的理想模型，此係由於所需肽的量比大鼠誘發研究所需的量低得多。隨後在更常規大鼠誘發模型(亦即扁桃體誘發大鼠)中評估所發現有效預防誘發獲取之彼等化合物。對於所提出研究，使2組小鼠(n=8隻小鼠/組)在各誘發刺激前隨機接受媒劑或肽。以接近預防6 Hz(44 mA)發作之ED50的劑量i.p.投與各肽。在峰作用時刻(獲自6 Hz研究)，使其以亞痙攣電流(50 Hz，3 mA，歷時30 sec)經由角膜電極刺激且觀察發作活性之存在或缺少。根據Racine等人(1972)所確立之標準為發作活性打分。動物每日接受2次刺激直至其顯示首次階段5行為發作，且隨後每 日1次，直至其顯示穩定繼發性全身發作(5連續階段4-5發作)。在實驗組中持續肽治療直至對照小鼠變得完全誘發之點。此時，允許兩組中之小鼠一週刺激及無處理之週。在第8天，在無肽或媒劑存在下刺激2組中之小鼠，且記錄其發作得分。
截至第二整週之刺激結束時，媒劑處理組中的小鼠可達到完全誘發狀態(圖32及33)。此外，考慮到先前已發現i.c.v.甘丙肽預防誘發之發展(Mazarati,Lundstrom等人2006)，實驗組中之小鼠並不誘發或以比媒劑處理之小鼠慢的速率誘發。因此，活性誘發研究之最後日之發作得分可為1或更少，且清除週期後(例如治療(抗致癲癇))該發作得分將保持低值。若清除週期後實驗組之發作得分並未明顯不同於媒劑處理組，則可推斷肽在有效治療週期期間之作用係歸因於其抗痙攣作用，例如治療(抗痙攣)。當觀察到抗致癲癇作用時，將媒劑及治療組中之所有小鼠在無藥物存在情況下誘發以觀察先前治療小鼠在無肽存在情況下是否誘發。
5.實例5：設計及化學合成類似物
a)即穿透BBB之神經肽類似物
表29摘要數種神經肽類似物之結構。對於各類似物，在固相肽合成期間將"KKKpK"基元與N或C末端相連接。以下提供設計各神經肽類似物之簡要基本原理。
生長抑素及其亞型選擇性類似物奧曲肽可在不損害其生物活性 之條件下"接納"N末端擴充(Dasgupta及Mukherjee 2000；Dasgupta,Singh等人2002；Na,Murty等人2003)。RC-160類似物之N末端乙醯化使得此生長抑素類似物之CNS濃度增加(Banks,Schally等人1990)。奧曲肽亦可在無其他修飾之情況下在某種程度上穿透BBB(Fricker,Nobmann等人2002)。
DSIP已展示N末端擴充並不影響DSIP之抗癲癇活性，而C末端擴充得到非活性類似物。因此DSIP類似物可經製造具有與N末端連接之載體。
將"KKKpK"基元引入SOM、奧曲肽或DSIP之N末端。使用3種不同間隔劑(Gly、6-胺基己酸(Ahx)、Ahx-Gly)連接"KKKpK基元"以使得龐大Lys-palm殘基可影響與靶向受體相互作用之可能性最小化。合成下列類似物：
KK(Kp)K-(神經肽)(SEQ ID NO：105)
KK(Kp)KG-(神經肽)(SEQ ID NO：106)
KK(Kp)K(Ahx)-(神經肽)(SEQ ID NO：107)
KK(Kp)K(Ahx)G-(神經肽)(SEQ ID NO：108)
強啡肽A(1-16)可在不顯著降低其對阿片受體之親和力的情況下在C末端截短或修飾(Lapalu,Moisand等人1997；Naqvi,Haq等人1998；Schlechtingen,DeHaven等人2003)。因此，與穿透BBB之甘丙肽類似物相似，合成其中最後若干殘基經"KKKpK"基元置換之強啡肽A(1-16)類似物。展示以下類似物：
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2(SEQ ID NO：109)
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2(SEQ ID NO：110)
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2(SEQ ID NO：111)
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-(Ahx)-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2(SEQ ID NO：112)
基於來自Annette G.Beck-Sickinger教授之實驗室中所進行之多種SAR研究的資料(全面綜述(Beck-Sickinger及Jung 1995；Cabrele及Beck-Sickinger 2000))設計神經肽Y類似物。該設計尤其基於99mTc標記之NPY類似物，其作為腫瘤顯影劑合成且測試(Langer,La Bella等人2001)。經截短之NPY類似物(Ac-[Ahx5-24,K4(99mTc(CO)3-PADA),,A26]-NPY含有具有螯合99mTc之龐大2-吡啶甲基胺-N,N-二乙酸，其對於抗Y2受體亞型極為有效(IC50=1 nM)。因此2-吡啶甲基胺-N,N-二乙酸可經Lys-十六醯基殘基置換。展示以下2種NPY類似物：
KKK(Kp)(Ahx)RAYINLITRQRY-NH2(SEQ ID NO：113)
KK(Kp)K(Ahx)RAYINLITRQRY-NH2(SEQ ID NO：114)
亦產生具有N末端延長之NPY之4種類似物(13-36)：
KK(Kp)K-[NPY(13-36)](SEQ ID NO：115)
KK(Kp)KG-[NPY(13-36)](SEQ ID NO：116)
KK(Kp)K(Ahx)-[NPY(13-36)](SEQ ID NO：117)
KK(Kp)K(Ahx)G-[NPY(13-36)](SEQ ID NO：118)
使用標準Fmoc基固相肽合成(SPPS)方案及自動肽合成器合成所有類似物。SPPS之所有建構塊均為市售，其包括Fmoc保護之胺基己酸、Lys-十六醯基及糖胺基酸(Sussex Research Laboratories,Iris Biotech,NeoMPS,Chem-Impex)。如先前所述進行偶合方法(Fields及Noble 1990；Albericio 2000)。將肽以試劑K自固體支撐物中移出，洗 滌且以MTBE沉澱。使用二苯基製備逆相HPLC純化類似物。線性梯度用於溶離。基於各類似物之來自分析性HPLC分析之滯留時間測定其之90%乙腈/10%水/0.1% TFA之初始及最終濃度。使用在280 nm計算之各類似物之莫耳吸光度係數(Trp ε=5,600且Tyr ε=1,400)將類似物定量。該等程序對於製備量在10至50毫克範圍內之甘丙肽類似物有效。對於氧化生長抑素或奧曲肽類似物中之二硫橋，使用Clear-Ox樹脂(Darlak,Wiegandt Long等人2004；Green及Bulaj 2006)。將本文中所描述之奧曲肽類似物氧化，其產率超過95%。藉由製備HPLC純化最終氧化產物。
神經肽類似物之抗痙攣活性在藥學-抵抗性部分性癲癇之6 Hz邊緣發作模型中表徵類似物。i.c.v.及i.p.投與後可測定該等類似物之活性。策略為首先測試類似物i.c.v.(2 nmole)：使用i.p.快速注射進一步測試活性類似物(4 mg/kg)。i.c.v.投與後亦測試2 nmole之強啡肽A(1-16)、NPY及NPY(13-36)之抗痙攣活性。該等結果充當篩選其修飾類似物之參考。
抗痙攣測試在32 mA刺激強度評估各類似物預防6 Hz角膜刺激(持續3 sec)所誘導之發作的能力。6 Hz發作之特徵在於最短陣攣階段，繼之為刻板、自動行為，其最初描述為與具有部分發作之人類患者之先兆相似(Toman,Everett等人1952；Barton,Klein等人2001)。認為未顯示該行為之動物受到保護。i.c.v.或i.p.後在峰作用時刻根據Barton,Klein等人2001所描述之方法將6 Hz發作測試中各類似物之活性定量。對於此測試，在放置角膜電極前，將一滴麻醉/電解質溶液(0.9%鹽水中0.5%之鹽酸丁卡因(tetracaine hydrochloride))施於各動物之眼中。對於峰作用時間研究，採用總計20隻CF-1小鼠。在不同時間(亦即0.25、0.5、1、2及4 h)測試4隻小鼠之組。投與每公克體重0.01 ml體積之於0.9% NaCl中之所有化合物。
設計及化學合成糖基化神經肽類似物 糖基化對於改善阿片樣肽穿過BBB之滲透性似乎極為有效(Elmagbari,Egleton等人2004；Polt,Dhanasekaran等人2005)。圖34展示用於腦啡肽類似物之糖殘基之結構。在肽中引入β-蜜二糖得到i.v.投與後具有最佳止痛效能之類似物。
β-蜜二糖-Ser殘基可代替全長"KKKpK"基元或Lys-十六醯基殘基(如上所述)引入選擇性神經肽類似物中。對於化學合成糖基化類似物，使用獲自Sussex Research之Fmoc-保護之全乙醯基-β-蜜二糖-Ser衍生物。應用標準固相合成方案。藉由在於甲醇中之10 mM甲氧化鈉中pH受控(pH 10)培育類似物，歷時4-5小時，實現蜜二糖殘基之去乙醯化。藉由製備HPLC將類似物純化，且在測試抗痙攣活性前於離心濃縮儀(speedvac)中乾燥。
6.實例6：NAX 5055對患上小鼠角膜誘發之作用
在CF#1小鼠中研究血腦障壁穿透劑甘丙肽類神經肽NAX-5055預防發展角膜誘發之能力。小鼠角膜誘發模型為部分癲癇之非侵入動物模型，其中小鼠經由角膜電極每日接受2次初始亞痙攣電流(3 mA)3秒，歷時數天。媒劑處理之小鼠通常需12-16天以達到穩定5級發作；亦即繼發性一般局灶發作。本研究中，將16隻小鼠隨機分至兩個實驗組中之一者：鹽水或NAX-5055。NAX-5055組中之小鼠在其第一次角膜刺激12小時及1小時前，以及各後續刺激1小時前，接受腹膜內(i.p.)注射NAX-5055(4 mg/kg，n=8)。相反，媒劑組中之小鼠在各角膜刺激1小時前接受0.9% NaCl(n=8)。在各刺激前，將一滴於0.9%鹽水中之0.5%丁卡因施於角膜上。刺激後，如Racine(1972)所確立0-5之量表為發作活性打分。持續治療直至對照動物一致顯示5級發作。
如圖32及33中所示，NAX-5055組中之小鼠分成2個獨立群體：亦即對NAX-5055治療敏感型群體(n=3)及不敏感型群體(n=5)。敏感型 經定義為在刺激期間未能顯示5級發作之小鼠。與對照及NAX-5055不敏感型動物相比，NAX-5055敏感型動物要求顯著更多次刺激以達到1級、2級及3級。此後，1週刺激及無肽階段後，再激發後，與對照及NAX-5055不敏感型動物相比，NAX-5055敏感型動物要求顯著更多刺激以達到4/5級發作。該等結果展示NAX-5055可延遲誘發獲得且因此可適用於既定大腦傷害後具有發展癲癇症風險之患者的早期治療。(Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation.II.Motor seizure.Electroencephalogr Clin Neurophysiol.1972年3月；32(3)：281-94。)
G.序列
SEQ ID NO：1(野生類型甘丙肽) Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro His Ala Val
SEQ ID NO：2(GAL-BBB1) Sar-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-His-(Lys-palm)-Tle-NH2
(其中Sar為肌胺酸、Tle為第三白胺酸且Lys-palm為與十六醯基部分經由ε胺基偶合之離胺酸殘基且-NH2表示在C末端醯胺化)
SEQ ID NO：3(GAL-BBB2) Sar-Trp-Thr-Leu-Asn-Ser-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2
(其中Sar為肌胺酸、Tle為第三白胺酸且Lys-palm為與十六醯基部分經由ε胺基偶合之離胺酸殘基，且-NH2表示在C末端醯胺化)
SEQ ID NO：4(來自表11)
SEQ ID NO：5(來自表11)
SEQ ID NO：6(來自表11)
SEQ ID NO：7(來自表11)
SEQ ID NO：8(來自表11)
SEQ ID NO：9(來自表12)
SEQ ID NO：10(來自表12)
SEQ ID NO：11(來自表12)
SEQ ID NO：12(來自表12)
SEQ ID NO：13(來自表12)
SEQ ID NO：14(來自表12)
SEQ ID NO：15(來自表12)
sEQ ID NO：16(來自表12)
SEQ ID NO：17(來自表12)
(在形成表12(SEQ ID NO：9-17)之序列中，"Xaa"表示間隔劑且可為任何長度)。
SEQ ID NO：18(來自表13)
SEQ ID NO：19(來自表13)
SEQ ID NO：20(來自表13)
SEQ ID NO：21(來自表13)
SEQ ID NO：22(來自表13)
SEQ ID NO：23(來自表13)
SEQ ID NO：24(來自表13)
SEQ ID NO：25(來自表13)
SEQ ID NO：26(來自表13)
SEQ ID NO：27(來自表13)
SEQ ID NO：28(來自表13)
在上述來自表3(SEQ ID NOS：18-28)之序列中，TDA為2-胺基-十四酸，DAB為二胺基丁酸、D-Lys為Lys之D-異構體，且h-Lys為均Lys，DPA為3,3-二苯基丙胺酸
SEQ ID NO：29(來自表13)
其中X表示12-胺基-十二烷酸或2-胺基-十四酸。
SEQ ID NO：30(生長抑表野生類型)
SEQ ID NO：31(來自表5)
SEQ ID NO：32(來自表5)
SEQ ID NO：33(來自表5)
SEQ ID NO：34(來自表5)
SEQ ID NO：35(來自表5)
SEQ ID NO：36(來自表5)
在上述來自表5之序列中，DAB為二胺基丁酸；DAP為二胺基丙 酸；Lys-palm為Lys-十六醯基；且Cl-Phe為氯-Phe。
SEQ ID NO：37(來自表9)
SEQ ID NO：38(來自表9)
SEQ ID NO：39(來自表9)
SEQ ID NO：40(具有修飾之奧曲肽) D-Phe Cys Phe D-Trp Lys Thr Cys Thr(ol)
SEQ ID NO：41(SOM-BBB1) (NN3APG)(AHX)AGCKNFFWKTFTSC
SEQ ID NO：42(SOM-BBB2) (NN3APG)(AHX)AGCKNFF(DW)KT(Cl-Phe)T(Dap)C
SEQ ID NO：43(SOM-BBB3) W(AHX)KKCKNFF(DW)KT(Cl-Phe)(Dab)(Dab)C
SEQ ID NO：44(SOM-BBB21) KK(Lys-P)K(AHX)(DF)CF(DW)KTC-Thr(ol)
SEQ ID NO：45(SOM-BBB22) KKK(Lys-P)K(AHX)(AHX)(DF)CF(DW)KTC-Thr(ol)
SEQ ID NO：46(SOM-BBB23) (Lys-P)KK(Lys-P)K(AHX)(DF)CF(DW)KTC-Thr(ol)
SEQ ID NO：47(SOM-BBB24) KK(Lys-P)K(AHX)KK(Lys-P)K(AHX)(DF)CF(DW)KTC-Thr(ol)
SEQ ID NO：48(SOM-BBB25) (PFHA)K(DK)K(ACPA)KK(Lys-P)K(AHX)(DF)CF(DW)KTC-Thr(ol)
對於SEQ ID NO：41-48，(AHX)為胺基己酸；(Dab)=二胺基丁酸；(Dap)=二胺基丙酸；(Tle)=第三白胺酸；(Cl-Phe)=4-氯苯丙胺酸；(NN3APG)=N,N-雙(3-胺丙基)甘胺酸；(AHX)=胺基己酸；(Lys-P)=Lys-十六醯基；Thr(ol)=酥胺醇；DK、DF、DW表示D-異構體；PFHA為2H,2H,3H,3H-全氟庚酸；且ACPA為8-胺基辛酸。
SEQ ID NO：49 GAL-BBB3 WTLNSAGYLLGPKKXK-NH2
SEQ ID NO：50 GAL-BBB4 Sar-WTLNSAGYLLGP(D-Lys)(D-Lys)X(D-Lys)-NH2
SEQ ID NO：51 GAL-BBB5 Sar-WTLNSAGYLLGPRRXR-NH2
SEQ ID NO：52 GAL-BBB6 Sar-WTLNSAGYLLGPHHXH-NH2
SEQ ID NO：53 GAL-BBB7 Sar-WTLNSAGYLLKKKKXK-NH2
SEQ ID NO：54 GAL-BBB8 Sar-WTLNSAGYLLKKXK-NH2
在SEQ ID NOS：49-54中，Sar為肌胺酸且X為Lys-十六醯基殘基。
SEQ ID NO：55 DSIP-BBB8 (AHX)GGWAGGDASGE
SEQ ID NO：56 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)K
SEQ ID NO：57 WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)K
SEQ ID NO：58 (DK)(DK)(DK)(Kp)GGWAGGDASGE
SEQ ID NO：59 (Sar)WTLNSAGYLLGPRR(Lys-P)R
SEQ ID NO：60 (Sar)WTLNSAGYLLKKKK(Lys-P)K
SEQ ID NO：61 (Sar)WTLNSAGYLLGPKKKK
SEQ ID NO：62 (Sar)WTLNSAGYLLKK(Lys-P)K
SEQ ID NO：63 (Sar)WTLNSAGYKK(Lys-P)K
SEQ ID NO：64 (Sar)WTLNSAGYLLGP(Ahx)KK(Lys-P)K
SEQ ID NO：65 (Sar)WTLNSAGY(Ahx)KK(Lys-P)K
SEQ ID NO：66 (Sar)WTLNSAGYKK(Lys-P)K
SEQ ID NO：67 (Sar)WTLNSAGY(Ahx)KK(Lys-P)K
SEQ ID NO：68 (Sar)WTLNSAGYLLGPHA(Lys-P)
SEQ ID NO：69 (Sar)WTLNSAGYLLGPDKDK(Lys-P)DK
SEQ ID NO：70 (Sar)WTLNSAGYLLGPRR(Lys-P)R
SEQ ID NO：71 (Sar)WTLNSAGYLLKKKK(Lys-P)K
SEQ ID NO：72 (Sar)WTLNSAGYLLKK(Lys-P)K
SEQ ID NO：73 (Sar)WTLNSAGYLLGP(Orn)(Orn)(Lys-P)(Orn)
SEQ ID NO：74 (Sar)WTLNSAGYLLGP(Dab)(Dab)(Lys-P)(Dab)
SEQ ID NO：75 (Sar)WTLNSAGYLLGPbKbK(Lys-P)bK
SEQ ID NO：76 (Sar)WTLNSAGYLLGPHH(Lys-P)H
SEQ ID NO：77 (Sar)WTLNSAGYLLGP(Lys-P)KKK
SEQ ID NO：78 (Sar)WTLNSAGYLLGPK(Lys-P)KK
SEQ ID NO：79 (Sar)WTLNSAGYLLGPKKK(Lys-P)
SEQ ID NO：80 (Sar)WTLNSAGY(精胺S)(Lys-P)
SEQ ID NO：81 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-P)-(精胺S)
SEQ ID NO：82 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Glu-精胺)K
SEQ ID NO：83 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-精胺-十六醯基)K
SEQ ID NO：84 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(TDA)K
SEQ ID NO：85 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(NorL)K
SEQ ID NO：86 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Man)K
SEQ ID NO：87 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Mel)K
SEQ ID NO：88 (Sar)WTLNSAGYLL(1PEG)KK(Lys-P)K
SEQ ID NO：89 (Sar)WTLNSAGYLL(5AVA)KK(Lys-P)K
SEQ ID NO：90(Sar)WTLNSAGYL(2PEG)KK(Lys-P)K
SEQ ID NO：91(Sar)WTLNSAGYL(8AOA)KK(Lys-P)K
SEQ ID NO：92 (Sar)WTLNSAGY(1PEG)(5AVA)KK(Lys-P)K
SEQ ID NO：93 GWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS-COOH
SEQ ID NO：94 GWTLNSAGYLLGPHAIDNHRSFSDKHGLT-NH2
SEQ ID NO：95 GWTLNSAGYLLGPHAIDNHRSFHDKYGLA-NH2
SEQ ID NO：96 GWTLNSAGYLLGPHAI
SEQ ID NO：97 GWTLNSAGYLLGPH
SEQ ID NO：98 GWTLNSAGYLLG
SEQ ID NO：99 GWTLNSAGYL
SEQ ID NO：100 GWTLNSAGY
於上述序列中：
Ahx=胺基己酸
DK=離胺酸之D-異構體
orn=鳥胺酸
Dab=2,4二胺基丁酸
bK=β-高離胺酸
精胺S=精胺-N4丁二酸
TDA=十四酸
NorL=正白胺酸
man=L-Ser-β-蜜二糖
1-PEG=5-胺基-3-噁戊酸
5AVA=5-胺基戊酸
2-PEG=8-胺基-3,6-二噁辛酸
8AOA=8-胺基辛酸
SEQ ID NO：101 DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2
SEQ ID NO：102 Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Phe-Ser-Gly-Glu
SEQ ID NO：103 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln
SEQ ID NO：104 PAEDLARYYSALRAYINLITRQRY-NH2
SEQ ID NO：105 KK(Kp)KX(其中X可為任何長度且可為任何胺基酸)
SEQ ID NO：106 KK(Kp)KGX(其中X可為任何長度或任何胺基酸)
SEQ ID NO：107 KK(Kp)K(Ahx)-(神經肽)(其中X可為任何長度或任何胺基酸)
SEQ ID NO：108 KK(Kp)K(Ahx)G-(神經肽)(其中X可為任何長度或任何胺基酸)
SEQ ID NO：109 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2
SEQ ID NO：110 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys- Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys-NH2
SEQ ID NO：111 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys- NH2
SEQ ID NO：112 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys- (Ahx)-Lys-Lys-(Lys-palm)-Lys- NH2
SEQ ID NO：113 KKK(Kp)(Ahx)RAYINLITRQRY- NH2
SEQ ID NO：114 KK(Kp)K(Ahx)RAYINLITRQRY- NH2
SEQ ID NO：115 KK(Kp)K-[X(13-36)](其中X(13-36)表示神經肽Y類似物)
SEQ ID NO：116 KK(Kp)KG-[X(13-36)](其中X(13-36)表示神經肽Y類似物)
SEQ ID NO：117 KK(Kp)K(Ahx)-[X(13-36)](其中X(13-36)表示神經肽Y類似物)
SEQ ID NO：118 KK(Kp)K(Ahx)G-[X(13-36)](其中X(13-36)表示神經肽Y類似物)
SEQ ID NO：119 (Sar)WTLNSAGY(D-Lys)(D-Lys)(Lys-P)(D-Lys)
SEQ ID NO：120 (Sar)WTLNSAGY(Ahx)(D-Lys)(D-Lys)(Lys-P)(D-Lys)
SEQ ID NO：121 (Sar)WTLNSAGY(7-Ahp)(D-Lys)(D-Lys)(Lys-P)(D-Lys)
SEQ ID NO：122 (Sar)WTLNSAGY(3,5-二溴-Tyr)LLGPKK(Lys-P)K
SEQ ID NO：123 (Sar)WTLNSAGYLLGPHH(Lys-P)K
SEQ ID NO：124 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Cys-Mmt)K
SEQ ID NO：125 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-生物素-胺基己醯基)K
SEQ ID NO：126 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-甾醇)K
SEQ ID NO：127 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-癸醯基)K
SEQ ID NO：128 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-辛醯基)K
SEQ ID NO：129 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-醯基)K
SEQ ID NO：130 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Ser-蜜二糖(melbiose))K
SEQ ID NO：131 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Lys-金剛烷醯基)K
SEQ ID NO：132 (Sar)WTLNSAGYLLGPKK(Glu(‧-Lac-PEG3-胺))K
SEQ ID NO：133 (Sar)WTLTSAGYLLGPKK(Lys-十六醯基)K
SEQ ID NO：134 (Sar)WTLLSAGYLLGPKK(Lys-十六醯基)K
SEQ ID NO：135 (Sar)WTLDSAGYLLGPKK(Lys-十六醯基)K
SEQ ID NO：136 (Ahx)GGWAGGDASGE
SEQ ID NO：137 (Palm)GGWAGGDASGE
SEQ ID NO：138 (Kp)GGWAGGDASGE
SEQ ID NO：139 KKK(Kp)GGWAGGDASGE
SEQ ID NO：140 KK(Kp)KGGWAGGDASGE
SEQ ID NO：141 KKKGGWAGGDASGE
對於SEQ ID NOS：58及135-141，(DK)為D-Lys，(Kp)為Lys-十六醯基，Axh為胺基己酸，Palm為棕櫚酸。
<110> 美國猶他大學研究基金會
<120> 改善以神經系統為標的之藥劑之性質之方法及組合物
<130> 21101.0067P1
<140> TW 096100621
<141> 2007-01-05
<150> 60/757,047
<151> 2006-01-05
<150> 60/844,024
<151> 2006-09-11
<160> 141
<170> FastSEQ for Windows Version4.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 15
<223> Lys-palm
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> tert-Leu
<220>
<221> AMIDATION
<222> 16
<400> 2
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<220>
<221> AMIDATION
<222> 17
<400> 3
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<400> 4
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Lys-palm
<400> 5
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> DpmMeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14
<223> Lys-palm
<400> 6
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 13
<223> Lys-palm
<400> 7
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 12
<223> Lys-palm
<400> 8
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<400> 9
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> SITE
<222> (2)...(3)
<223> 非-肽間隔
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<400> 10
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> SITE
<222> (6)...(7)
<223> 非-肽間隔
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<400> 11
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> SITE
<222> (7)...(8)
<223> 非-肽間隔
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<400> 12
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> SITE
<222> (10)...(11)
<223> 非-肽間隔
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<400> 13
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> SITE
<222> (11)...(12)
<223> 非-肽間隔
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<400> 14
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> SITE
<222> (12)...(13)
<223> 非-肽間隔
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<400> 15
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> SITE
<222> (6)...(8)
<223> 非-肽間隔
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<400> 16
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> SITE
<222> 3,4,6,7,8
<223> 非-肽間隔
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<400> 17
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<400> 18
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 19
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<400> 20
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<400> 21
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 15
<223> Lys-palm
<400> 22
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14
<223> Lys-palm
<400> 23
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> VARIANT
<222> 14,15,17
<223> D-Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<400> 24
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14,15,17
<223> 高離胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<400> 25
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14,15,17
<223> Dbu
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<400> 26
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> 2-胺基-十四酸
<400> 27
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> 3,3-雙苯丙胺酸
<400> 28
<210> 29
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-palm
<220>
<221> MOD_RES
<222> 18
<223> 12-胺基-十二酸或2-胺基-十四酸
acid
<400> 29
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
<210> 31
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Dbu
<220>
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Trp之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 10,12,13
<223> Dpr
<400> 31
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4,5
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Trp之D異構物
<400> 32
<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6,7,11
<223> 氯-Phe
<220>
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Trp之D異構物
<400> 33
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Dbu
<220>
<221> MOD_RES
<222> 10,12,13
<223> Dpr
<400> 34
<210> 35
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4,5
<223> Lys-十六醯基
<400> 35
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6,7,11
<223> 氯-Phe
<400> 36
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 13,14,15
<223> Lys-十六醯基
<400> 37
<210> 38
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3,6,7,15
<223> Dpr
<220>
<221> MOD_RES
<222> 13,16
<223> Dbu
<400> 38
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 9
<223> 氯-Tyr
<400> 39
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Phe之D異構物
<220>
<221> VARIANT
<222> 4
<223> Trp之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 8
<223> 酥胺醇
<400> 40
<210> 41
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> N,N-雙(3-胺丙基)甘胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2
<223> 胺基己酸
<400> 41
<210> 42
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> N,N-雙(3-胺丙基)甘胺酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2
<223> 胺基己酸
<220>
<221> VARIANT
<222> 10
<223> Trp之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 13
<223> 氯-Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> 15
<223> Dpr
<400> 42
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2
<223> 胺基己酸
<220>
<221> VARIANT
<222> 10
<223> Trp之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 13
<223> 氯-Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> 13,14
<223> Dbu
<400> 43
<210> 44
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> 胺基己酸
<220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Phe之D異構物
<220>
<221> VARIANT
<222> 9
<223> Trp之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 13
<223> 酥胺醇
<400> 44
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6,7
<223> 胺基己酸
<220>
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Phe之D異構物
<220>
<221> VARIANT
<222> 11
<223> Trp之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 15
<223> 酥胺醇
<400> 45
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1,4,
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> 胺基己酸
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Phe之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 10
<223> Trp之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14
<223> 酥胺醇
<400> 46
<210> 47
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3,8
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5,10
<223> 胺基己酸
<220>
<221> VARIANT
<222> 11
<223> Phe之D異構物
<220>
<221> VARIANT
<222> 14
<223> Trp之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 18
<223> 酥胺醇
<400> 47
<210> 48
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> 2H,2H,3H,3H-全氟庚酸
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Lys之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> 8-胺基辛酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 8
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> 10
<223> 胺基己酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)...(0)
<223> Phe之D異構物
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)...(0)
<223> Trp之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)...(0)
<223> 酥胺醇
<400> 48
<210> 49
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 15
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> AMIDATION
<222> 16
<223> 在C-末端
<400> 49
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> VARIANT
<222> 14,15,17
<223> Lys之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 50
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> AMIDATION
<222> 17
<223> 在C-末端
<400> 51
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> AMIDATION
<222> 17
<223> 在C-末端
<400> 52
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> AMIDATION
<222> 17
<223> 在C-末端
<400> 53
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> AMIDATION
<222> 15
<223> 在C-末端
<400> 54
<210> 55
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> Ahx=胺基己酸
<400> 55
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 56
<210> 57
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 15
<223> Lys-十六醯基
<400> 57
<210> 58
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(3)
<223> Lys之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Lys-十六醯基
<400> 58
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 59
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 60
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<400> 61
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14
<223> Lys之D異構物
<400> 62
<210> 63
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 12
<223> Lys-十六醯基
<400> 63
<210> 64
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14
<223> Ahx=胺基己酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 17
<223> Lys-十六醯基
<400> 64
<210> 65
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 10
<223> Ahx=胺基己酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 13
<223> Lys-十六醯基
<400> 65
<210> 66
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 12
<223> Lys-十六醯基
<400> 66
<210> 67
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 10
<223> Ahx=胺基己酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 13
<223> Lys-十六醯基
<400> 67
<210> 68
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 68
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14,15,17
<223> Lys之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 69
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 70
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 71
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14
<223> Lys-十六醯基
<400> 72
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14,15,17
<223> Om
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 73
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14,15,17
<223> Dbu
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 74
<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 13,14,16
<223> β-均-離胺酸
<400> 75
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 76
<210> 77
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14
<223> Lys-十六醯基
<400> 77
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 15
<223> Lys-十六醯基
<400> 78
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 17
<223> Lys-十六醯基
<400> 79
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 10
<223> 精胺-N4丁二酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 11
<223> Lys-十六醯基
<400> 80
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> 17
<223> 精胺-N4丁二酸
<400> 81
<210> 82
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Glu-精胺
<400> 82
<210> 83
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-精胺-十六醯基
<400> 83
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> 十四酸
<400> 84
<210> 85
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Nle
<400> 85
<210> 86
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> L-Ser-α-甘露糖
<400> 86
<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> L-Ser-β-蜜二醣
<400> 87
<210> 88
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 12
<223> 5-胺基-3-噁戊酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 15
<223> Lys-十六醯基
<400> 88
<210> 89
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 12
<223> 5-胺基戊酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 15
<223> Lys-十六醯基
<400> 89
<210> 90
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 11
<223> 8-胺基-3,6-二噁辛酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14
<223> Lys-十六醯基
<400> 90
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 11
<223> 8-胺基辛酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14
<223> Lys-十六醯基
<400> 91
<210> 92
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 10
<223> 5-胺基-3-噁戊酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 11
<223> 5-胺基戊酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14
<223> Lys-十六醯基
<400> 92
<210> 93
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
<210> 94
<211> 29
<212> PRT
<213> Murinae
<220>
<221> AMIDATION
<222> 30
<223> 在C-末端
<400> 94
<210> 95
<211> 29
<212> PRT
<213> 野豬
<400> 95
<210> 96
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 96
<210> 97
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 97
<210> 98
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 98
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 99
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 100
<210> 101
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Phe之D異構物
<220>
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Trp之D異構物
<220>
<221> AMIDATION
<222> 9
<223> 在C-末端
<400> 101
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 102
<210> 103
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 103
<210> 104
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> AMIDATION
<222> 24
<223> 在C-末端
<400> 104
<210> 105
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> VARIANT
<222> 5
<223> Xaa=任何胺基酸
<400> 105
<210> 106
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa=任何胺基酸
<400> 106
<210> 107
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> 胺基己酸
<220>
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa=任何胺基酸
<400> 107
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> 胺基己酸
<220>
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa=任何胺基酸
<400> 108
<210> 109
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 15
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> AMIDATION
<222> 16
<223> 在C-末端
<400> 109
<210> 110
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> AMIDATION
<222> 17
<223> 在C-末端
<400> 110
<210> 111
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> AMIDATION
<222> 15
<223> 在C-末端
<400> 111
<210> 112
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 14
<223> 胺基己酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 17
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> AMIDATION
<222> 18
<223> 在C-末端
<400> 112
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Ahx=胺基己酸
<220>
<221> AMIDATION
<222> 17
<223> 在C-末端
<400> 113
<210> 114
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Ahx=胺基己酸
<220>
<221> AMIDATION
<222> 17
<223> 在C-末端
<400> 114
<210> 115
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Xaa=任何胺基酸
<400> 115
<210> 116
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Xaa=任何胺基酸
<400> 116
<210> 117
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Ahx=胺基己酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 6
<223> Xaa=任何胺基酸
<400> 117
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Lys-十六醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> 5
<223> Ahx=胺基己酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 7
<223> Xaa=任何胺基酸
<400> 118
<210> 119
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> VARIANT
<222> 10,11,13
<223> Lys之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 12
<223> Lys-十六醯基
<400> 119
<210> 120
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 10
<223> Ahx=胺基己酸
<220>
<221> VARIANT
<222> 11,12,14
<223> Lys之D異構物
<400> 120
<210> 121
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> VARIANT
<222> 11,12,14
<223> Lys之D異構物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 13
<223> Lys-十六醯基
<400> 121
<210> 122
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 10
<223> 3,5-二溴-Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> 17
<223> Lys-十六醯基
<400> 122
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 123
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> 4-甲基三苯甲基
<400> 124
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-生物素-胺基己醯基
<400> 125
<210> 126
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 15
<223> Lys-甾醇
<400> 126
<210> 127
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-癸醯基
<400> 127
<210> 128
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-辛醯基
<400> 128
<210> 129
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-醯基
<400> 129
<210> 130
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Ser-蜜二糖
<400> 130
<210> 131
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-金剛烷醯基
<400> 131
<210> 132
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Glu(β-Lac-PEG3-胺)
<400> 132
<210> 133
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 133
<210> 134
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 134
<210> 135
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> MeGly
<220>
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Lys-十六醯基
<400> 135
<210> 136
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> Ahx=胺基己酸
<400> 136
<210> 137
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> 棕櫚酸
<400> 137
<210> 138
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> Lys-十六醯基
<400> 138
<210> 139
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> Lys-十六醯基
<400> 139
<210> 140
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Lys-十六醯基
<400> 140
<210> 141
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 141

Claims (52)

  1. 一種經分離之多肽，其包含SEQ ID NO：3、與SEQ ID NO：3胺基酸序列至少約90%一致的胺基酸序列或具有一或多個保守胺基酸取代之SEQ ID NO：3胺基酸序列。
  2. 一種經分離之多肽，其包含選自由SEQ ID NO：2、4-29、37-39、50、64、65、66、67、80、82及89組成之群的胺基酸序列，與選自由SEQ ID NO：2、4-29、37-39、50、64、65、66、67、80、82及89組成之群的胺基酸序列至少約90%一致的胺基酸序列或具有一或多個保守胺基酸取代之選自由SEQ ID NO：2、4-29、37-39、50、64、65、66、67、80、82及89組成之群的胺基酸序列。
  3. 一種經分離之多肽，其包含選自由SEQ ID NO：31-36組成之群的胺基酸片段、與選自由SEQ ID NO：31-36組成之群的胺基酸序列至少約90%一致之胺基酸序列或具有一或多個保守胺基酸取代之選自由SEQ ID NO：31-36組成之群的胺基酸序列。
  4. 一種經分離之多肽，其包含SEQ ID NO：40、與SEQ ID NO：40胺基酸序列至少約90%一致的胺基酸序列或具有一或多個保守胺基酸取代之SEQ ID NO：40胺基酸序列。
  5. 一種經分離之多肽，其包含選自由SEQ ID NO：105、106、107、108、109-112及113-118組成之群的胺基酸序列，與選自由SEQ ID NO：105、106、107、108、109-112及113-118組成之群的胺基酸序列至少約90%一致之胺基酸序列或具有一或多個保守胺基酸取代之選自由SEQ ID NO：105、106、107、108、109-112及113-118組成之群的胺基酸序列。
  6. 一種經分離之多肽，其包含選自由SEQ ID NO：58及135-141組成 之群的胺基酸序列、與選自由SEQ ID NO：58及135-141組成之群的胺基酸序列至少約90%一致之胺基酸序列或具有一或多個保守胺基酸取代之選自由SEQ ID NO：58及135-141組成之群的胺基酸序列。
  7. 如請求項1或2之多肽，其中當與甘丙肽相比時該多肽具有增加之穩定性。
  8. 如請求項3之多肽，其中當與生長抑素相比時該多肽具有增加之穩定性。
  9. 如請求項6之多肽，其中當與δ睡眠誘導肽(DSIP)相比時該多肽具有增加之穩定性。
  10. 一種具有增加之血腦障壁滲透性之組合物，其中該組合物所包含的肽當與該肽之未經修改形式相比時具有增加之親脂性特徵及增加之鹼度。
  11. 如請求項10之組合物，其中該組合物係與一或多種其他組合物組合使用。
  12. 如請求項11之組合物，其中該其他組合物係選自由以下各物組成之群：神經肽Y、強啡肽(dynorphin)、類鴉片及類鴉片肽、嗎啡鹼、羥基嗎啡鹼、芬太尼(fentanyl)、奧施康定(oxycodone)、可待因(codeine)、辣椒素(capsaicin)；以及抗癲癇藥物類，其包括(但不限於)醯胺咪嗪(carbamazepine)、撲米酮(primidone)、加巴噴丁(gabapentin)、普瑞巴林(pregabalin)、地西泮(diazepam)、非胺酯(felbamate)、氟非胺酯(fluorofelbamate)、拉莫三嗪(lamotrigine)、拉庫醯胺(lacosamide)、左乙拉西坦(levetiracetam)、苯巴比妥(phenobarbital)、苯妥英(phenytoin)、磷苯妥英(fos-phenytoin)、妥泰(topiramate)、丙戊酸鹽、胺己烯酸(vigabatrin)、唑尼沙胺(zonisamide)、奧卡西平 (oxcarbazepine)；非類固醇消炎藥物(NSAID)、局部麻醉劑(諸如利多卡因(lidocaine))、麩胺酸酯受體拮抗劑、NMDA拮抗劑、α-腎上腺素受體促效劑及拮抗劑、腺苷、大麻鹼、NK-1拮抗劑(CI-1021)、抗抑鬱劑(例如阿米替林(amitriptyline)、去甲丙咪嗪(desipramine)、丙米嗪(imipramine))；甘丙肽、生長抑素、δ睡眠誘導肽、腦啡肽、催產素、膽囊收縮素(cholecystikinin)、降血鈣素、大腦皮質抑素(cortistatin)、痛敏肽(nociceptin)之類似物及衍生物及其他基於神經肽之治療劑；普流尼克(pluronic)P85嵌段共聚物；澱粉狀蛋白降低劑，諸如弗祿裏贊(Flurizan)；加蘭他敏(galantamine)(加蘭(Razadyne))；利凡斯的明(rivastigmine)(艾斯能(Exelon))；多奈哌齊(donepezil)(安理申(Aricept))；他克林(tacrine)(康耐斯(Cognex))；美金剛(memantine)(鹽酸美金剛(Namenda))；及用於阿茲海默症(Alzheimer's disease)之疫苗。
  13. 如請求項10-12中任一項之組合物，其中該親脂性特徵係藉由將該肽與疏水性部分相結合而增加。
  14. 如請求項10之組合物，其中該疏水性部分為多脂族鏈。
  15. 如請求項10-12中任一項之組合物，其中該親脂性特徵係藉由增加芳族殘基之鹵化而增加。
  16. 如請求項10-12中任一項之組合物，其中該鹼度係藉由引入帶正電之胺基酸殘基之均寡聚物及雜寡聚物而增加，該等胺基酸殘基包括(但不限於)各呈L或D異構體組態之離胺酸、精胺酸、高離胺酸、高精胺酸、鳥胺酸；2,3-二胺基丙酸；2,4-二胺基丁酸。
  17. 如請求項10-12中任一項之組合物，其中該鹼度係藉由結合基於多胺之部分而增加，該基於多胺之部分諸如精胺、亞精胺、聚醯胺基胺樹枝狀聚合物或多胺毒素及其衍生物。
  18. 如請求項10-12中任一項之組合物，其中與未經修改之肽相比該肽穿過血腦障壁之效率可高出1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
  19. 如請求項10-12中任一項之組合物，其中當與該肽之未經修改形式相比時該肽亦具有增加之糖基化。
  20. 一種包含如請求項10-18中任一項之組合物之載體。
  21. 一種增加肽之血腦障壁滲透性之方法，其包含使該肽與該肽之未經修改形式相比親脂性特徵增加且鹼度增加。
  22. 如請求項21之方法，其中該親脂性特徵係藉由將該肽與疏水性部分相結合而增加。
  23. 如請求項22之方法，其中該疏水性部分為多脂族鏈。
  24. 如請求項21之方法，其中該親脂性特徵係藉由增加芳族殘基之鹵化而增加。
  25. 如請求項21之方法，其中該鹼度係藉由引入帶正電之胺基酸殘基之均寡聚物及雜寡聚物而增加，該等胺基酸殘基包括(但不限於)各呈L或D異構體組態之離胺酸、精胺酸、高離胺酸、高精胺酸、鳥胺酸；2,3-二胺基丙酸；2,4-二胺基丁酸。
  26. 如請求項21之方法，其中該鹼度係藉由結合諸如精胺、亞精胺、聚醯胺基胺樹枝狀聚合物或多胺毒素及其衍生物的基於多胺之部分而增加。
  27. 如請求項21之方法，其中與未經修改之肽相比該肽穿過血腦障壁之效率可高出1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
  28. 如請求項21之方法，其進一步包含使該肽與該肽之未經修改形式相比糖基化增加。
  29. 一種如請求項1之多肽用以製造用於治療癲癇症之藥劑的用途。
  30. 一種如請求項10-19中任一項之組合物用以製造用於治療癲癇症之藥劑的用途。
  31. 如請求項30之用途，其中該癲癇症為全身發作性、部分發作性或難治性癲癇症。
  32. 一種如請求項1之多肽的用途，其用以製造用於治療、預防或改善疼痛或其他神經性病症之藥劑。
  33. 如請求項32之用途，其中該疼痛係由以下病症中之一或多者引起或該神經性病症係選自以下病症中之一或多者：慢性背痛、癌症、肌肉纖維疼痛、帶狀疱疹後遺神經痛、多發性硬化症、糖尿病性神經病變、周邊神經損傷、外傷性單神經病變、複雜區域疼痛症候群及脊髓損傷。
  34. 一種如請求項10-12中任一項之組合物用以製造用於治療脊髓損傷的藥劑之用途。
  35. 一種如請求項10-12中任一項之組合物用以製造用於治療多發性硬化症之藥劑的用途。
  36. 一種如請求項2之多肽的用途，其用以製造用於治療、預防或改善神經性病症的藥劑。
  37. 一種如請求項3之多肽的用途，其用以製造用於治療、預防或改善神經性病症的藥劑。
  38. 如請求項32、36及37中任一項之用途，其中該神經性病症為癲癇症。
  39. 如請求項32、36及37中任一項之用途，其中該神經性病症為抑鬱症。
  40. 如請求項32、36及37中任一項之用途，其中該神經性病症為疼痛。
  41. 如請求項32、36及37中任一項之用途，其中該神經性病症為阿 茲海默症。
  42. 如請求項32、36及37中任一項之用途，其中該多肽係與一或多種其他組合物相組合。
  43. 一種製造具有增加之血腦障壁滲透性之組合物的方法，其包含製造具有增加之血腦障壁滲透性之組合物，其中該組合物所包含的肽當與該肽之未經修改形式相比時具有增加之親脂性特徵及增加之鹼度。
  44. 如請求項43之方法，其中該親脂性特徵係藉由將該肽與疏水性部分結合而增加。
  45. 如請求項43之方法，其中該疏水性部分為多脂族鏈。
  46. 如請求項43之方法，其中該親脂性特徵係藉由增加芳族殘基之鹵化而增加。
  47. 如請求項43之方法，其中該鹼度係藉由引入帶正電之胺基酸殘基之均寡聚物及雜寡聚物而增加，該等胺基酸殘基包括(但不限於)各呈L或D異構體組態之離胺酸、精胺酸、高離胺酸、高精胺酸、鳥胺酸；2,3-二胺基丙酸；2,4-二胺基丁酸。
  48. 如請求項43之方法，其中該鹼度係藉由結合基於多胺之部分而增加，該基於多胺之部分諸如精胺、亞精胺、聚醯胺基胺樹枝狀聚合物或多胺毒素及其衍生物。
  49. 如請求項43之方法，其中與未經修改之肽相比該肽穿過血腦障壁之效率可高出1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
  50. 如請求項43之方法，其中當與該肽之未經修改形式相比時該肽亦具有增加之糖基化。
  51. 如請求項43之方法，其中該肽包含間隔劑。
  52. 如請求項51之方法，其中該間隔劑係選自由Gly、Ahx、Gly-Ahx或PEG-O2Oc組成之群。
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