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Hintergrund
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft pentacyclische Oxepine und Derivate
hiervon, Zusammensetzungen, die diese Verbindungen enthalten, ihre
Verwendung als selektive Östrogenrezeptormodulatoren
und ihre Verwendung zur Hemmung des Knochenverlusts, der kardiovaskulären Erkrankung
und des Brust- und Uteruscarzinoms.
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Die
Menopause, der Übergang
der Frau vom reproduktiven zum nicht-reproduktiven Lebensstadium, ist
durch das Einstellen der Menstruation gekennzeichnet und tritt in
einem mittleren Alter von 50 Jahren auf. Der postmenopausale Zustand
ist durch Veränderungen
in den Spiegeln der zirkulierenden Geschlechtshormone gekennzeichnet,
deren dramatischste die Verringerung der Plasmaspiegel von 17β-Östradiol auf weniger als 10
% der Werte vor der Menopause ist. Klinische und epidemiologische
Studien haben gezeigt, dass der postmenopausale Zustand ein bedeutender
Risikofaktor für
viele chronische Erkrankungen ist, nämlich Osteoporose und kardiovaskuläre Erkrankungen.
In Anbetracht der Tatsache, dass die derzeitige Lebenserwartung
von Frauen etwa 80 Jahre beträgt,
verbringen Frauen etwa ein Drittel ihres Lebens im postmenopausalen
Zustand. Dies bedeutet, dass das Potential für chronische Auswirkungen des
postmenopausalen Zustands auf die Gesundheit der Frau heute größer ist
als zur Jahrhundertwende, als die Lebenserwartung beträchtlich
kürzer
war.
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Osteoporose
beschreibt eine Krankheitsgruppe, die durch den Nettoverlust an
Knochenmasse pro Volumeneinheit gekennzeichnet ist. Die Konsequenz
dieses Verlusts an Knochenmasse und die daraus resultierende Knochenfraktur
ist das Versagen des Skeletts, eine angemessene strukturelle Unterstützung für den Körper bereitzustellen.
Das anfälligste
Gewebe im Knochen für
die Wirkungen der postmenopausalen Osteoporose ist der Trabekelknochen.
Dieses Gewebe wird oft als spongiöser oder schwammiger Knochen
bezeichnet und konzentriert sich insbesondere an den Enden des Knochens
(nahe den Gelenken) und in der Wirbelsäule. Das Trabekelgewebe ist
durch kleine Osteoidstrukturen gekennzeichnet, die miteinander verbunden sind,
wie auch durch das festere und dichtere cortikale Gewebe, das die äußere Oberfläche und
den zentralen Schaft des Knochens aufbaut. Dieses untereinander
verbundene Netzwerk an Trabekeln vermittelt eine laterale Unterstützung für die äußere cortikale
Struktur und ist für
die biomechanische Stärke
der Gesamtstruktur entscheidend.
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Die
meisten Frauen verlieren etwa 20 % bis etwa 60 % der Knochenmasse
im Trabekelkompartiment des Knochens innerhalb von 3 bis 6 Jahren
nach dem Einstellen der Menstruation. Dieser rapide Verlust geht im
allgemeinen mit einer Erhöhung
der Knochenresorption und Bildung einher. Jedoch ist der resorptive
Zyklus dominanter und das Ergebnis ist ein Nettoverlust an Knochenmasse.
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Bei
der postmenopausalen Osteoporose ist es primär die Nettoresorption und der
Verlust der Trabekel, die zum Versagen und zur Fraktur des Knochens
führen.
In Anbetracht des Verlusts der Trabekel bei postmenopausalen Frauen
ist es nicht überraschend,
dass die meisten herkömmlichen
Frakturen die sind, die bei Knochen vorkommen, welche stark von
der Trabekelunterstützung
abhängen,
beispielsweise die Wirbel, der Hals der gewichttragenden Knochen,
wie der Oberschenkel und der Unterarm. Tatsächlich sind Hüftfraktur, Schenkelhalsfrakturen
und Wirbelbruchfrakturen Merkmale der postmenopausalen Osteoporose.
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Es
gibt alleine in den Vereinigten Staaten geschätzte 25 Millionen Frauen, die
von dieser Erkrankung betroffen sind. Die Folgen von Osteoporose
sind für
die Person schwerwiegend und sind für einen großen ökonomischen Verlust aufgrund
ihrer chronischen Erscheinung und dem Bedarf für eine ausgie bige und langanhaltende
Versorgung (Krankenhausaufenthalt und Heimpflege) dieser Krankheitsfolgen
verantwortlich. Dies trifft insbesondere für ältere Patienten zu. Dazu kommt,
obwohl Osteoporose im allgemeinen nicht als lebenbedrohender Zustand
angesehen wird, dass die Sterblichkeitsrate von 20 % bis 30 % mit
Hüftfrakturen
bei älteren
Frauen zusammenhängt.
Ein großer
Prozentsatz dieser Sterblichkeitsrate kann direkt mit postmenopausaler
Osteoporose zusammenhängen.
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Die
kardiovaskuläre
Erkrankung ist die Hauttodesursache bei Frauen. Im Vergleich zu
Männern
sind Frauen vor der Menopause relativ geschützt vor der kardiovaskulären Erkrankung,
jedoch verliert sich dieser Schutz graduell nach der Menopause.
Die Art der Fähigkeit
des Östrogens,
die Serumlipidspiegel zu regulieren, ist nicht gut verstanden, aber
Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Östrogen die Rezeptoren für Lipid niedriger
Dichte (LDL) in der Leber hochregulieren kann, um überschüssiges Cholesterin
zu entfernen. Zusätzlich
scheint Östrogen
eine Wirkung auf die Biosynthese von Cholesterin und andere nützliche
Effekte auf die kardiovaskuläre
Gesundheit zu haben.
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Derzeit
ist die am allgemeinsten anerkannte Methode zur Behandlung der Störungen,
die im postmenopausalen Zustand von der Abnahme der Östrogenspiegel
resultieren die Östrogenersatztherapie.
Die Therapie kann in Form der alleinigen Verabreichung von Östrogen
in einer sogenannten Östrogenersatztherapie ohne
Gegenspieler (ERT) oder in Form der Co-Verabreichung von Östrogen
und Progestin in einem sogenannten hormonellen Ersatztherapieplan
(HRT) stattfinden. Es gibt aber deutliche Folgen, die mit der chronischen Verabreichung
von Östrogen
in postmenopausalen Frauen assoziiert sind, die schädliche Wirkungen
auf die Brust und den Uterus aufweisen. Frauen mit ERT entwickeln
Endometriumkrebs mit Wahrscheinlichkeiten, die drei- bis sechsmal
höher sind
als bei Frauen, die dies nicht anwenden nach einer Verwendung von
3 bis 6 Jahren und nach 10 Jahren mit ERT erhöht sich das Risiko auf das
zehnfache.
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Um
diese schädlichen
Effekte der ERT zu bekämpfen
wird eine Co-Verabreichung von Progestin zusammen mit Östrogen
in einer kombinierten Hormonersatztherapie (HRT) verwendet, da Progestin
die Uterusstimulierung begrenzt und so das Risiko für Uteruskrebs
verringert.
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Aufgrund
dieser bekannten und erwarteten oder befürchteten Folgen der Östrogentherapie
war die Verschreibung und die Patientencompliance für eine chronische Östrogenersatztherapie
gering. Es wird geschätzt,
dass in den Vereinigten Staaten bei postmenopausalen Frauen, für die eine
ERT oder HRT verschrieben wurde, weniger als 40 % die Therapie über ein
Jahr fortsetzen.
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Als
Konsequenz besteht ein Bedarf für
die Entwicklung von Mitteln für
die postmenopausale Therapie, die ein ideales pharmakologisches
Profil aufweisen: Beispielsweise Mittel, die die nützlichen
Effekte von Östrogen
auf das Skelettgewebe und das kardiovaskuläre System hervorrufen, ohne
die schädlichen
Effekte von Östrogen
auf die Brust und den Uterus hervorzurufen. Mittel, die ein solches Östrogenprofil
besitzen würden, würden die
Wirkungen der Östrogendefizienz
in bestimmten Geweben umkehren, wobei sie gleichzeitig in Geweben
nicht wirken würden,
in denen Östrogen
schädliche
Effekte hervorruft. Der Ausdruck selektive Östrogenrezeptormodulatoren
oder "SERMs" wird auf Verbindungen
angewendet, die dieses Gewebe-selektive Profil besitzen. SERMs werden
als Verbindungen definiert, die einen Östrogenagonismus in einem oder
in mehreren Zielgeweben, wie Knochen, Leber, usw. zusammen mit einem Östrogenantagonismus
und/oder minimalen (das heißt
klinisch nicht signifikanten) Agonismus in Reproduktionsgeweben
hervorrufen, wie der Brust oder dem Uterus.
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Die
EP 0 761 669 A und
T.A. Grese et al., J. Org. Chem. 1998, 41 (8), 1272–1283 beziehen
sich auf tetracyclische, konformationsbeschränkte Raloxifenanaloga als SERMs.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung liefert eine Verbindung der Formel
worin R
1 für -H, -OH,
-O(C
1-C
4 Alkyl),
-OCOC
6H
5, -OCO(C
1-C
6 Alkyl) oder
-OSO
2(C
2-C
6 Alkyl) steht,
R
0,
R
2 und R
3 jeweils
unabhängig
für -H,
-OH, -O(C
1-C
4 Alkyl),
-OCOC
6H
5, -OCO(C
1-C
6 Alkyl), -OSO
2(C
2-C
6 Alkyl)
oder Halogen stehen,
R
4 für 1-Piperidinyl,
1-Pyrrolidinyl, Methyl-1-pyrrolidinyl, Dimethyl-1-pyrrolidinyl,
4-Morpholino, Dimethylamino, Diethylamino, Diisopropylamino oder
1-Hexamethylenimino steht,
n für 2 oder 3 steht,
X für -S- oder
-HC=CH- steht,
G für
-O-, -S-, -SO-, SO
2 oder -N(R
5)-
steht, worin R
5 für -H oder C
1-C
4 Alkyl steht und Y für -O-, -S-, -NH-, -NMe- oder
-CH
2- steht,
oder ein pharmazeutisch
annehmbares Salz hiervon.
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In
einer zweiten Ausführungsform
liefert die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel
(I) alleine oder in Kombination mit Östrogen oder Progestin und
einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
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Ebenfalls
betrifft die vorliegende Erfindung medizinische Verfahren zur Verwendung
von Verbindungen der vorliegenden Erfindung zur Linderung der Symptome
des Östrogenmangels,
einschließlich
Knochenverlust, beispielsweise Osteoporose, kardiovaskuläre Erkrankung,
beispielsweise Bluthochdruck, Thrombose und Verringerung des Serumcholesterins.
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In
einer alternativen Ausführungsform
des medizinischen Verfahrens der vorliegenden Beschreibung werden
die erfindungsgemäßen Verbindungen
bei der Behandlung von Krankheitszuständen verwendet, die mit einer
unkontrollierten physiologischen Reaktion auf endogenes Östrogen
verwendet werden, einschließlich fibroide
Uteruserkrankung oder Uterusfibrose, Endometriose und östrogenabhängige Krebsarten.
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In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung chemische Zwischenprodukte, die zur Synthese
der Verbindungen der Formel (I) verwendet werden.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Allgemeine
Ausdrücke,
die in der Beschreibung der Verbindungen verwendet werden, haben
ihre gewöhnlichen
Bedeutungen. Beispielsweise steht "C1-C6 Alkyl" für gerade,
verzweigte oder cyclische aliphatische Ketten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
einschließlich
Reste wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, n-Butyl, Pentyl,
Isopentyl, Hexyl, Isohexyl, Cyclohexyl und dergleichen. Ähnlich steht "C1-C4 Alkyl" für gerade,
verzweigte oder cyclische aliphatische Ketten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
einschließlich
Reste, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, n-Butyl, Cyclopropyl
und dergleichen. Ähnlich
steht der Ausdruck "C1-C4 Alkoxy" für eine C1-C4 Alkylgruppe,
die über
ein Sauerstoffmolekül
gebunden ist und Reste umfasst, wie beispielsweise Methoxy, Ethoxy,
n-Propoxy, Isopropoxy und dergleichen. Der Ausdruck "NMe" steht für Methylamino.
Der Ausdruck "Halogen" steht für Brom,
Chlor, Fluor und Iod.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Stereoisomer" auf eine Verbindung, die sich aus denselben
Atomen zusammensetzt, die durch dieselben Bindungen gebunden sind,
aber unterschiedliche dreidimensionale Strukturen aufweisen, die
nicht austauschbar sind. Die dreidimensionalen Strukturen werden
Konfigurationen genannt. Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "Enantiomer" auf zwei Stereoisomere, deren
Moleküle
nicht zur Deckung zu bringende Spiegelbilder voneinander sind. Der
Ausdruck "chirales
Zentrum" bezieht
sich auf ein Kohlenstoffatom, an das vier verschiedene Gruppen gebunden
sind. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Diastereomere" auf Stereoisomere,
die keine Enantiomere sind. Zusätzlich werden
zwei Diastereomere, die eine unterschiedliche Konfiguration an nur
einem chiralen Zentrum aufweisen, hierin als "Epimere" bezeichnet. Die Ausdrücke "Razemat", "razemisches Gemisch" oder "razemische Modifikation" beziehen sich auf
ein Gemisch aus gleichen Teilen an Enantiomeren.
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Der
Ausdruck "enantiomere
Anreicherung", wie
er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Erhöhung der
Menge eines Enantiomers im Vergleich zum anderen. Ein bequemes Verfahren
zur Darstellung der erreichten enantiomeren Anreicherung ist das
Konzept des enantiomeren Überschusses
oder "ee", das mittels der folgenden
Gleichung gefunden wird:
worin E
1 die
Menge des ersten Enantiomers ist und E
2 die
Menge des zweiten Enantiomers ist. Falls das anfängliche Verhältnis der
zwei Enantiomere 50:50 ist, wie dies in einem razemischen Gemisch
vorkommt und eine enantiomere Anreicherung erreicht wird, die ausreicht,
um ein schließliches
Verhältnis
von 70:30 zu bilden, beträgt
der ee bezüglich
des ersten Enantiomers 40 %. Falls jedoch das schließliche Verhältnis 90:10
ist, beträgt
der ee in Bezug auf das erste Enantiomer 80 %. Ein ee von mehr als
90 % ist bevorzugt, ein ee von mehr als 95 % ist bevorzugter und
ein ee von mehr als 99 % ist vor allem bevorzugt. Die enantiomere
Anreicherung wird leicht durch den Fachmann mittels Standardtechniken
und Verfahren bestimmt, wie Gas- oder Hochleistungsflüssigchromatographie
mit einer chiralen Säule.
Die Wahl der geeigneten chiralen Säule, des Eluenten und der Bedingungen,
die zur Bewirkung der Trennung des enantiomeren Paares erforderlich
sind, liegt innerhalb der Kenntnis des Fachmanns. Zusätzlich können die
spezifischen Stereoisomere und Enantiomere der Verbindungen der
Formel I durch den Fachmann mittels Standardtechniken aufgetrennt
werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie die, die von J. Jacques
et al., "Enantiomers,
Racemates and Resolutions", John
Wiley and Sons, Inc., 1981 und E.L. Eliel und S.H. Wilen, "Stereochemistry of
Organic Compounds" (Wiley-Interscience
1994), und
EP 0 838
448 A vom 29. April 1998 beschrieben sind. Beispiele für Auftrennungen umfassen
Umkristallisationstechniken oder chirale Chromatographie.
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Einige
der erfindungsgemäßen Verbindungen
haben ein oder mehrere chirale Zentren und können in einer Vielzahl an stereoisomeren
Konfigurationen vorkommen. Als Folge dieser chiralen Zentren kommen
die Verbindungen der vorliegenden Erfindung als Razemate, Enantiomerengemische
und als einzelne Enantiomere, wie auch Diastereomere und Diastereomerengemische
vor. Alle diese Razemate, Enantiomere und Diastereomere liegen innerhalb
des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
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Die
Ausdrücke "R" und "S" werden
hierin verwendet, wie sie gewöhnlich
in der organischen Chemie verwendet werden, um die spezifische Konfiguration
eines chiralen Zentrums zu bezeichnen. Der Ausdruck "R" (rectus) bezieht sich auf die Konfiguration
eines chiralen Zentrums mit einer Anordnung der Gruppenprioritäten (höchste zur
zweithöchsten)
im Uhrzeigersinn, wenn man entlang der Bindung zur Gruppe mit der
geringsten Priorität
schaut. Der Ausdruck "S" (sinister) bezieht
sich auf die Konfiguration eines chiralen Zentrums mit einer Anordnung
der Gruppenprioritäten
höchste
zur zweithöchsten
entgegen dem Uhrzeigersinn, wenn man entlang der Bindung zur Gruppe
mit der geringsten Priorität
schaut. Die Priorität
von Gruppen basiert auf ihrer Atomzahl (in der Reihenfolge der abnehmenden
Atomzahl). Eine partielle Liste der Prioritäten und eine Diskussion der
Stereochemie ist enthalten in Nomenclature of Organic Compounds:
Principles and Practice, (J.H. Fletcher, et al., Herausgeber, 1974)
auf den Seiten 103–120.
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Die
Bezeichnung
bezieht
sich auf eine Bindung, die aus der Ebene der Seite nach vorne heraussteht.
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Die
Bezeichnung
bezieht
sich auf eine Bindung, die aus der Ebene der Seite nach hinten heraussteht.
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Die
Bezeichnung
bezieht
sich auf eine Bindung, bei der die Stereochemie nicht definiert
ist.
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Wie
hierin verwendet umfasst der Ausdruck "Östrogen" Steroidverbindungen
mit östrogener
Aktivität, wie
beispielsweise 17α-Östradiol, Östron, konjugiertes Östrogen
(Premarin®),
Pferdeöstrogen,
17β-Ethinylöstradiol,
und dergleichen. Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck "Progestin" Verbindungen mit
progestiner Aktivität,
wie beispielsweise Progesteron, Norethinodrel, Norgestrel, Megestrolacetat,
Norethindron und dergleichen.
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Bevorzugte
Verbindungen der Erfindung umfassen Verbindungen, worin Y für -O- steht.
Andere bevorzugte Verbindungen der Erfindung umfassen Verbindungen
der Formel I, worin G für
-O- oder -S- steht.
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Bestimmte
R3 und R4 Gruppen
zeigen auch bevorzugte Eigenschaften. Beispielsweise sind die Verbindungen
der Formel I bevorzugt, worin R4 für 1-Pyrrolidinyl,
1-Hexamethylenimino oder 1-Piperidinyl steht. Eine weitere bevorzugte
Subgruppe der bevorzugten 1-Pyrrolidinyl-, 1-Hexamethylenimino-
oder 1-Piperidinylverbindungen
umfasst die Verbindungen, worin R1, R2 und R3 jeweils
unabhängig
für -H,
-OH oder -OCH3 stehen.
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Obwohl
die Verbindungen der Formel I in Form der freien Base oder der sauren
Form in den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden können,
ist es bevorzugt, die pharmazeutisch annehmbare Salzform herzustellen
und zu verwenden. So bilden die in den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten Verbindungen mit einer großen Vielzahl an organischen
und anorganischen Säuren
und Basen pharmazeutisch annehmbare Säure- oder Basenadditionssalze
und beinhalten die physiologisch annehmbaren Salze, die oft in der
pharmazeutischen Chemie verwendet werden. Solche Salze sind auch
Teil der Erfindung. Typische anorganische Säuren, die zur Bildung solcher
Salze verwendet werden, sind unter anderem Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-,
Iodwasserstoff-, Salpeter-, Schwefel-, Phosphor-, Hypophosphorsäure und
dergleichen. Salze, die von organischen Säuren stammen, wie aliphatischen
Mono- und Dicarbonsäuren,
phenylsubstituierten Alkansäuren,
Hydroxyalkan- und Hydroxyalkandisäuren, aromatischen Säuren, aliphatischen
und aromatischen Sulfonsäuren,
können
ebenfalls verwendet werden. Solche pharmazeutisch annehmbaren Salze sind
daher unter anderem Acetat, Phenylacetat, Trifluoracetat, Acrylat,
Ascorbat, Benzoat, Chlorbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat,
Methoxybenzoat, Methylbenzoat, o-Acetoxybenzoat, Naphthalin-2-benzoat, Bromid,
Isobutyrat, Phenylbutyrat, β-Hydroxybutyrat,
Butin-1,4-dioat, Hexin-1,4-dioat, Caprat, Caprylat, Chlorid, Cinnamat,
Citrat, Formiat, Fumarat, Glycollat, Heptanoat, Hippurat, Lactat,
Malat, Maleat, Hydroxymaleat, Malonat, Mandelat, Mesylat, Nicotinat,
Isonicotinat, Nitrat, Oxalat, Phthalat, Terephthalat, Phosphat,
Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat,
Propiolat, Propionat, Phenylpropionat, Salicylat, Sebacat, Succinat,
Suberat, Sulfat, Bisulfat, Pyrosulfat, Sulfit, Bisulfit, Sulfonat,
Benzolsulfonat, p-Bromphenylsulfonat, Chlorbenzolsulfonat, Ethansulfonat,
2-Hydroxyethansulfonat, Methansulfonat, Naphthalin-1-sulfonat, Naphthalin-2-sulfonat,
p-Toluolsulfonat, Xylolsulfonat, Tartrat und dergleichen. Bevorzugte Salze
sind die Hydrochlorid- und Oxalatsalze.
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Typische
Basen, die zur Bildung von pharmazeutisch annehmbaren Additionssalzen
verwendet werden, sind anorganische Basen, wie Natriumhydroxid,
Kaliumhydroxid, Alkalicarbonate oder -bicarbonate, Calciumcarbonat,
Magnesiumcarbonat und dergleichen. Zusätzlich können organische Basen zur Bildung
von Additionssalzen verwendet werden, beispielsweise Alkylamine,
wie Triethylamin, Dimethylamin, i-Propylamin und dergleichen.
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Die
pharmazeutisch annehmbaren Säure-
oder Basenadditionssalze werden typischerweise durch die Umsetzung
einer Verbindung der Formel I mit einer äquimolaren oder überschüssigen Menge
einer Säure
oder Base gebildet. Die Reaktanden werden im allgemeinen in einem
gemeinsamen Lösemittel
vereinigt, wie Diethylether oder Ethylacetat. Das Salz fällt normalerweise
innerhalb von etwa einer Stunde bis 10 Tagen aus der Lösung aus
und kann durch Filtration isoliert werden oder das Lösemittel
kann durch herkömmliche
Verfahren abgezogen werden.
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Spezifische
Beispiele für
Verbindungen, die in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen,
sind unter anderem die folgenden Verbindungen und ihre pharmazeutisch
annehmbaren Salze:
5-[4-(2-Piperidin-1-ylethoxy)phenyl]-5,11-dihydro-6-oxa-12-thiadibenzo[a,f]azulen-2-ol,
5-[4-(2-Pyrrolidin-1-ylethoxy)phenyl]-5,11-dihydro-6-oxa-12-thiadibenzo[a,f]azulen-2-ol,
13-[4-(2-Piperidin-1-ylethoxy)phenyl]-7,13-dihydro-12-oxabenzo[4,5]cyclohepta[1,2-a]naphthalin-3-ol,
und
13-[4-(2-Pyrrolidin-1-ylethoxy)phenyl]-7,13-dihydro-12-oxabenzo[4,5]cyclohepta[1,2-a]naphthalin-3-ol.
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Die
Verbindungen der Formel (I) können
unter Verwendung von Verfahren und Techniken hergestellt werden,
die gut bekannt sind und vom Fachmann genutzt werden. Ein allgemeines
Syntheseschema zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I),
worin X für
-S- steht, ist in Schema A gezeigt, worin alle Substituenten, falls
nichts anderes angegeben ist, wie vorher definiert sind.
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In
Schema A stehen R0a, R1a,
R2a und R3a jeweils
unabhängig
für -H
oder -OPg, worin Pg für
eine Hydroxyschutzgruppe steht und R0a,
R2a und R3a ferner
für Halogen
stehen kann. In Verbindungen der Formeln (2), (3) und folgende stehen
die Pg Schutzgruppen R0a, R1a,
R2a und R3a für phenolische
Schutzgruppen des von T. Greene et al., in Kapitel 3 von "Protective Groups
in Organic Synthesis",
zweite Ausgabe, John Wiley & Sons,
Inc., New York, 1991, Seiten 143–170 beschriebenen Typs. Die
bevorzugten Schutzgruppen sind Alkylethergruppen, wobei Methyl besonders
bevorzugt ist. In Schema A steht der Substituent G1 für -O-, -S-
oder N(R5)-.
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In
Schema A Schritt 1 wird das 6-Methoxy-2-(2-methoxybenzyl)benzo[b]thiophen
der Formel (3) durch die Umsetzung eines Dimethylaminobenzothiophens
der Formel (2) mit einem geeignet geschützten 2-Alkoxybenzylmagnesiumchlorid
unter Grignardbedingungen hergestellt, worin Pg für eine Phenolschutzgruppe steht,
wie einen Methyl- oder Benzylether. Die Grignardreaktionen sind
vom Typ, der von Godfrey (
US
5 420 349 A ) beschrieben ist.
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Beispielsweise
wird das Dimethylaminobenzothiophen (2) mit einem geeigneten 2-Methoxybenzylmagnesiumchlorid
unter wasserfreien Bedingungen in einem geeigneten aprotischen organischen
Lösemittel
umgesetzt, wie wasserfreiem Tetrahydrofuran. Das 2-Methoxybenzylmagnesiumchlorid
ist vorzugsweise in der Reaktionszone in einem molaren Überschuss
zu Dimethylaminobenzothiophen (2) von etwa 1,1 bis 3 Äquivalente
vorhanden. Die Umsetzung wird bei einer geeigneten Temperatur, vor zugsweise
bei Raumtemperatur, für
einen Zeitraum von etwa 1 bis etwa 12 Stunden ausgeführt. Die
Reaktion wird dann mit einer Protonenquelle gestoppt, wie beispielsweise
Natriumbicarbonat oder Methanol. Das Lösemittel wird entfernt und
das entstehende Gemisch kann gemäß in der
Technik gut bekannter Verfahren extrahiert, konzentriert und gereinigt werden
und das rohe 6-substituierte 2-(2-Methoxybenzyl)benzo[b]thiophenprodukt
(3) kann ohne weitere Reinigung verwendet werden. Für Verbindungen
der Struktur IA, worin G für
S oder N(R5) steht, steht die bevorzugte
Pg für
Benzyl, so dass es durch die Behandlung mit H2 auf
Pd/C ohne Beeinflussung des anderen methylgeschützten Phenols entfernt werden
kann.
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Geeignete
Dimethylaminobenzothiophene (2) sind in der Technik bekannt, Grese
et al., J. Med. Chem. 40 (2), 146–147 (1997),
US 5 466 810 A vom 14. November
1995,
US 5 420 349 A vom
30. Mai 1995,
US 5 792
870 A vom 11. August 1998 und
US 5 554 755 A vom 11. September
1996 oder können
durch in der Technik gut bekannte Verfahren hergestellt werden.
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In
Schema A Schritt 2 wird 2-(2-G1H-Benzyl)benzo[b]thiophen
(4) durch die Schutzgruppenabspaltung von 6-substituiertem 2-(2-Methoxybenzyl)benzo[b]thiophen
(3) mit einem geeigneten Schutzgruppenentfernungsmittel hergestellt.
Die entstehende Alkoholfunktionalität kann dann umgewandelt werden,
wenn ein Thiol oder Amin erwünscht
ist.
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Beispielsweise
wird 6-substituiertes 2-(2-Methoxybenzyl)benzo[b]thiophen (3) in
einem geeigneten organischen Lösemittel
gelöst,
wie Methylenchlorid. Um Nebenreaktionen während der BBr3 Schutzgruppenabspaltung
zu minimieren, wird zuerst das HCl Salz gebildet. Die Lösung wird
mit überschüssigem HCl/Ether
unter Bildung des Chlorwasserstoffsäuresalzes des 6-substituierten
2-(2-Methoxybenzyl)benzo[b]thiophens (3) zusammengebracht. Die Lösung wird
dann zur Trockne konzentriert und im organischen Lösemittel
rückgelöst. Die
Lösung
wird dann auf eine Temperatur gebracht, die von etwa –10°C bis etwa
0°C reicht
und es wird ein geeignetes Schutzgruppenentfernungsmittel, wie BBr3 oder Natriumethanthiolat (NaSEt) in einer
Menge von etwa 1,1 bis etwa 5 Äquivalenten
zugegeben. Im allgemeinen erfordert die Umsetzung 1 bis 72 Stunden.
Für Verbindungen,
worin G für
O steht, kann das 2-(2-G1H-Benzyl)benzo[b]thiophen (4) isoliert und
durch in der Technik gut bekannte Techniken gereinigt werden, wie
Extraktion, Eindampfung, Pulverisierung, Chromatographie und Umkristallisierung
oder das Phenol der Formel (4) kann ohne weitere Reinigung verwendet
werden. Für
Verbindungen, worin G für
S oder N(R5) steht, wird die Benzylschutzgruppe
der Formel (3) durch die Behandlung mit Wasserstoffgas mittels eines
Palladium auf Kohle Katalysators entfernt. Für Verbindungen, worin G für S steht,
wird das Phenol der Formel (4) in das entsprechende Thiophenol mittels
Verfahren umgewandelt, die in der Technik bekannt sind, wie anfängliche
Umwandlung in das Triflat, gefolgt von einer Palladium-vermittelten
Kupplung mit Natriumtriisopropylsilanthiolat (Arnould et al. Tetrahedron
Lett. 1996, 37, 4523). Die Reduktion des Ketons mit LAH ergibt den
entsprechenden Alkohol. Für
Verbindungen, worin G für
N(R5) steht, wird das Phenol der Formel
(4) in das entsprechende Amin mittels in der Technik gut bekannter
Verfahren umgewandelt, wie der anfänglichen Umwandlung zum Triflat,
gefolgt von der durch Palladium vermittelten Kupplungsreaktion (beispielsweise
Buchwald et al., Tetrahedron Lett. 1997, 38, 6367). Das Amin wird
dann einer intramolekularen, reduktiven Aminierung mittels einer
Säurequelle
und eines Reduktionsmittels unterzogen, wie NaCNBH3 oder
Na(OAc)3BH. Wenn R5 nicht
für H steht,
kann der Stickstoff mittels eines Alkylhalogenids und einer Base,
wie KOBu-t in THF, alkyliert werden.
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In
Schema A Schritt 3 wird das cyclisierte Produkt der Formel (IA)
durch die Reduktion von 2-(2-G1H-Benzyl)benzo[b]thiophen (4) und der Exposition
des reduzierten Produkts gegenüber
einer säurekatalysierten
Cyclisierung hergestellt.
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Beispielsweise
wird 2-(2-G1H-Benzyl)benzo[b]thiophen (4)
mit einem Überschuss
eines geeigneten Reduktionsmittels, wie Diisobutylaluminiumhydrid
(DIBAL), Lithiumaluminiumhydrid (LAN), Aluminiumhydrid oder Borandimethylsulfidkomplex
zusammengebracht. Die Umsetzung wird in einem geeigneten Lösemittel wie
Tetrahydrofuran oder Diethylether, ausgeführt. Die Umsetzung wird typischerweise
bei Temperaturen von 0°C
bis zur Rückflusstemperatur
des Lösemittels
ausgeführt.
Typischerweise dauert die Umsetzung etwa 15 Minuten bis etwa 36
Stunden. Das reduzierte Produkt wird dann mit einer geeigneten Säure zusammengebracht,
wie Trifluoressigsäure
(TFA). Die Umsetzung wird dann sanft für einen Zeitraum erhitzt, der
von 15 Minuten bis etwa 12 Stunden reicht. Das cyclisierte Produkt
der Formel (IA) kann durch in der Technik gut bekannte Verfahren
isoliert und gereinigt werden, wie Extraktion, Eindampfung, Pulverisierung,
Chromatographie und Umkristallisation.
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Für Verbindungen
der Formel (IA), worin G für
S oder N(R5) steht, wenn eine Hydroxygruppe
an R1, R2 und/oder
R3 erwünscht
ist, wird eine Verbindung der Formel (IA) mit einem geeigneten Schutzgruppenentfernungsmittel,
wie BBr3 oder Natriumethanthiolat (NaSEt)
von den Schutzgruppen befreit. Die BBr3 Reaktion wird
bequemerweise in einem geeigneten organischen Lösemittel wie Dichlormethan
oder Dichlorethan ausgeführt,
während
die NaSEt Umsetzung bequemerweise in DMF, THF oder N-Methylpyrrolidinon
(NMP) ausgeführt
werden kann. Die Reaktion wird mit Wasser gestoppt und mit einem
geeigneten organischen Lösemittel
wie Methylenchlorid, verdünnt.
Das von den Schutzgruppen befreite Produkt, worin R0,
R1, R2 und/oder
R3 für
Hydroxy stehen, kann durch in der Technik gut bekannte Verfahren
isoliert und gereinigt werden, wie Extraktion, Eindampfung, Pulverisierung,
Chromatographie und Umkristallisation.
-
Ein
allgemeines Syntheseschema zur Herstellung der Verbindung der Formel
(I), worin X für
-CH=CH- steht, ist in Schema B aufgeführt, worin alle Substituenten
wie vorher definiert sind, falls nichts anderes angegeben ist.
-
-
In
Schema B stehen R0a, R1a,
R2a und R3a jeweils
unabhängig
für -H
oder -OPg, worin Pg für
eine Hydroxyschutzgruppe steht und R0, R2a und R3a ferner
für Halogen
stehen können.
In den Verbindungen der Formeln (5), (6) und folgenden sind die
Pg Schutzgruppen R0a, R1a,
R2a und R3a phenolische
Schutzgruppen, die den Bedingungen der Friedel-Crafts Acylierungsreaktion
widerstehen können
und vom Typ sind, der von T. Greene et al., in Kapitel 3 von "Protective Groups
in Organic Synthesis",
zweite Ausgabe, John Wiley & Sons, Inc.,
New York, 1991, Seiten 143–170
beschrieben ist. Die bevorzugten Schutzgruppen sind Alkylethergruppen,
wobei Methyl besonders bevorzugt ist. In Schema B steht der Substituent
G1 für
-O-, -S- oder -N(R5)-.
-
Die
Aktivierungsgruppe A wird aus den Gruppen ausgewählt, die in der Technik bekannt
sind, um Säuren
so zu aktivieren, dass man Friedel-Crafts Acylierungsreaktionen
ausführen
kann und umfassen die Säurehalogenide,
wie Fluorid, Chlorid und Bromid, gemischten Säureanhydride mit C1-C6 Alkansäuren,
C1-C6 Alkylsulfonsäuren, Arylsulfonsäuren, perfluorierten
C1-C6 Alkansäuren, C1-C6 Alkylcarbonaten,
Arylcarbonaten und dergleichen. Die bevorzugten Verbindungen der
Formel (8a) sind die, worin A für
Halogen, vor allem Chlor steht.
-
In
Schema B Schritt 1 wird ein substituiertes Naphthylmethanon der
Formel (6) durch die Ausführung einer
Friedel-Crafts Acylierung eines substituierten Naphthyls der Formel
(5) mit einem substituierten Benzoylderivat der Formel (5a) ausgeführt.
-
Beispielsweise
wird die Acylierungsreaktion zwischen (5) und (5a) in einem inerten
organischen Lösemittel
in Gegenwart eines Lewissäurekatalysators
ausgeführt.
Geeignete Lösemittel
umfassen halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dichlormethan, Chloroform,
1,2-Dichlorethan, Tetrachlorkohlenstoff, Chlorbenzol, Dichlorbenzol
und dergleichen. Die Menge an Lösemittel
ist nicht entscheidend, sondern im allgemeinen ausreichend, um ein
effizientes Mischen der Reaktionskomponenten zu ermöglichen.
Geeignete Lewissäurekatalysatoren
für die
Friedel-Crafts Acylierungsreaktion zwischen der Verbindung (5) und
(5a) umfassen wasserfreie Aluminium-, Bor- oder Zinkhalogenide,
wobei Aluminiumchlorid bevorzugt ist. Die Temperatur und die Zeit
der Reaktion variieren in Abhängigkeit
des gewählten
Reaktionslösemittels,
des Lewissäurekatalysators
und der Aktivierungsgruppe A. Im allgemeinen werden die Reaktionen
bei Temperaturen unter oder bei Umgebungstemperatur bis unter oder
bei der Rückflusstemperatur
des Lösemittels
ausgeführt.
Die Reaktionszeiten variieren von mehreren Minuten bis etwa 48 Stunden.
Der Fortschritt der Reaktion bis zur Vollständigkeit kann durch gut bekannte
Techniken verfolgt werden, wie Dünnschichtchromatographieanalyse
von Aliquots des Reaktionsgemisches während des Reaktionsverlaufs.
-
Typischerweise
wird die Reaktion unter Verwendung von 1,0 bis 1,5 Äquivalenten
der Verbindung (5a) für
jedes Äquivalent
der Verbindung (5) ausgeführt,
wobei mehr der aktivierten Benzoylverbindung im Verlauf der Reaktion
zugegeben werden kann, falls dies erforderlich ist, um die Reaktion
bis zur Vollständigkeit
zu treiben. Die Menge des verwendeten Lewissäurekatalysators reicht von
etwa 0,1 bis etwa 5 Äquivalenten.
Das substituierte Naphthylmethanon der Formel (6) kann durch in
der Technik bekannte Verfahren isoliert und gereinigt werden, wie
Extraktion, Eindampfung, Pulverisierung, Chromatographie und Umkristallisation.
-
Geeignet
substituierte Benzoylderivate der Formel (5a) können, wie dies hierin beschrieben
ist, aus dem geeigneten Benzoesäurederivat
hergestellt werden, wie dies analog in
US 5 962 475 A beschrieben
ist, deren Beschreibung hiermit eingeführt ist. Geeignete Benzoesäurederivate
der Verbindungen der Formel (5a) sind in
US 4 418 068 A ,
US 5 631 369 A und
US 5 852 193 A beschrieben,
deren Beschreibungen hiermit eingeführt sind.
-
In
Schema B Schritt 2 wird das 2-Hydroxy-6-substituierte Naphthalin-1-yl-methanon
der Formel (7) durch die selektive Deprotonierung des substituierten
Naphthylmethanons der Formel (6) hergestellt.
-
Beispielsweise
wird das Naphthylmethanon der Formel (6) mit einem Demethylierungsmittel,
wie Bortribromid, Bortrichlorid oder Bortriiodid oder mit AlCl3 umgesetzt. Die Umsetzung wird unter einer
inerten Atmosphäre,
wie Stickstoff, mit einem oder mehreren Molen des Reagenzes pro
Mol der zu demethylierenden Methoxygruppe ausgeführt. Geeignete Lösemittel
für diese
Reaktion sind die Lösemittel
oder Lösemittelgemische,
die während
der Demethylierungsreaktion inert bleiben. Halogenierte Lösemittel,
wie Dichlormethan, 1,2-Dichlorethan, Chloroform, Methylenchlorid
oder aromatische Lösemittel,
wie Benzol oder Toluol sind bevorzugt. Die in der Reaktion des vorliegenden
Verfahrens verwendete Temperatur sollte ausreichend sein, um eine
Vervollständigung
der Demethylierungsreaktion zu bewirken. Jedoch ist es vorteilhaft,
die Temperatur unter 0°C
zu halten, um die Selektivität
für die
Demethylierung der gewünschten
Methoxygruppe zu maximieren und die Bildung von unerwünschten
Nebenprodukten zu vermeiden, speziell des Dihydroxyanalogons, das
aus einer übermäßigen Demethylierung
resultiert. Unter den bevorzugten Reaktionsbedingungen wird ein
selektiv dealkyliertes Produkt nach dem Rühren der Reaktion für 1 bis
24 Stunden gebildet. Nach dem Stoppen der Reaktion kann das 2-Hydroxy-6-substituierte Naphthalin-1-yl-methanon
der Formel (7) gemäß in der
Technik gut bekannter Verfahren isoliert und gereinigt werden, wie
durch Extraktion, Eindampfung, Pulverisierung, Chromatographie und
Umkristallisation.
-
In
Schema B Schritt 3 wird ein 2-L-substituiertes Naphthalin-1-ylmethanon
der Formel (8) durch die Umwandlung der Hydroxygruppe des 2-Hydroxy-6-substituierten
Naphthalin-1-yl-methanons der Formel (7) in eine geeignete Aktivierungsgruppe
hergestellt.
-
Eine
geeignete Aktivierungsgruppe L
1 ist eine,
die mit den Palladium-vermittelten Kupplungsbedingungen kompatibel
ist und durch ein 2-Alkoxybenzylzinkhalogenid der folgenden Formel
verdrängt
werden kann
worin Hal für eine Halogengruppe,
vorzugsweise Chlor steht. Geeignete Aktivierungsgruppen L
1 umfassen Brom, Iod und vor allem Trifluormethansulfonat.
-
Beispielsweise
werden Verbindungen, worin L1 für Trifluormethansulfonat
steht, durch Zusammenbringen eines geeignet 2-Hydroxy-6-substituierten
Naphthalin-1-yl-methanons der Formel (7) mit einem molaren Überschuss
an Trifluormethansulfonylchlorid gebildet. Die Umsetzung wird in
einem geeigneten Lösemittel, wie
Dichlormethan, Chloroform, Toluol, Benzol oder Pyridin ausgeführt. Die
Umsetzung wird in Gegenwart einer geeigneten Base, wie Triethylamin,
Diisopropylethylamin oder Pyridin ausgeführt. Im allgemeinen wird die Umsetzung
bei Temperaturen von etwa –20°C bis 50°C ausgeführt. Im
allgemeinen erfordern die Umsetzungen 30 Minuten bis 24 Stunden.
Das Produkt kann durch in der Technik bekannte Verfahren isoliert
und gereinigt werden, wie Extraktion, Eindampfung, Pulverisierung,
Chromatographie und Umkristallisation.
-
In
Schema B Schritt 4 kann ein [6-substituiertes-2-(substituiertes
Benzyl)naphthalin-1-yl]-[4-substituiertes
Phenyl]methanon der Formel (9) durch die Kupplung von 2-L-substituiertem-6-substituiertem Naphthalin-1-ylmethanon
der Formel (8) zu einem 2-Alkoxybenzylzinkhalogenid der Formel (8a)
mittels Palladium-vermittelter Standardkupplungsverfahren [siehe
beispielsweise Knochel et al. Org. Lett. 1999, 1, 1323)] hergestellt werden.
-
Beispielsweise
wird ein leichter Überschuss
an 2-Alkoxybenzylzinkhalogenid (8a) mit jedem Äquivalent an 2-L-substituiertem-6-substituiertem
Napthalin-1-ylmethanon der Formel (8) in Gegenwart eines Palladiumkatalysators
in einer geeigneten Base in einem inerten Lösemittel, wie Toluol, N-Methylpyrrolidinon/Toluol oder
1,2-Dimethoxyethan zugegeben. Obwohl verschiedene Palladiumkatalysatoren
solche Kupplungsreakionen treiben, wird der Katalysator gewöhnlich reaktionsspezifisch
ausgewählt.
Die Verwendung eines Bis(dibenzylidenaceton)palladium-Pd(dba)2 Katalysators in der vorliegenden Reaktion
ist ein bevorzugter Katalysator. Tetrabutylammoniumiodid (Bu4NI) hat als Additiv gezeigt, dass es die
Ausbeuten und Kupplungszeiten von ähnlichen Kupplungen verbessern
kann (Knochel et al., Org. Lett. 1999, 1, 1323). Die in diesem Schritt
verwendete Temperatur sollte ausreichend sein, um eine Vervollständigung
der Kupplungsreaktion zu bewirken. Typischerweise ist das sanfte
Erhitzen des Reaktionsgemisches für einen Zeitraum von etwa 2
bis etwa 8 Stunden angemessen. Das Produkt (9) kann durch in der
Technik bekannte Verfahren isoliert und gereinigt werden, wie Extraktion,
Eindampfung, Pulverisierung, Chromatographie und Umkristallisation.
-
Die
Verbindungen der Formel (8a) sind entweder im Handel erhältlich oder
leiten sich von im Handel erhältlichen
Verbindungen durch Verfahren ab, die dem Fachmann bekannt sind [siehe
beispielsweise Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms
and Structure, 4. Ausgabe, 3–16,
(J. March, Herausgeber John Wiley & Sons, Inc. 1992)].
-
In
Schema B Schritt 5 wird [6-substituiertes-2-(G1H-Benzyl)naphthalin-1-yl]-[4-substituiertes
Phenyl]methanon (10) durch die Schutzgruppenabspaltung an [6-substituiertem-2-(substituiertem
Benzyl)naphthalin-1-yl]-[4-substituiertem Phenyl]-methanon (9) mit
einem geeigneten Schutzgruppenabspaltungsmittel gemäß Verfahren
hergestellt, wie dies in Schema A Schritt 2 beschrieben ist. Für Verbindungen,
worin G für
S oder N(R5) steht, kann das Alkoholprodukt
der Formel (10) entweder in das entsprechende Thiol oder Amin gemäß den vorher
in Schema A Schritt 2 beschriebenen Verfahren umgewandelt werden.
-
In
Schema B Schritt 6 wird [6-substituiertes-2-(G1H-Benzyl)-naphthalin-1-yl]-[4-substituiertes
Phenyl]methanol (11) durch die Reduktion des Methanons der Formel
(10) hergestellt.
-
Beispielsweise
wird ein [6-substituiertes-2-(G1H-Benzyl)naphthalin-1-yl]-[4-substituiertes
Phenyl]-methanon
(10) mit einem geeigneten Reduktionsmittel, wie einem Alkalimetallhydrid,
vorzugsweise Lithiumaluminiumhydrid umgesetzt. Die Umsetzung wird
in einem geeigneten Lösemittel
wie Tetrahydrofuran ausgeführt. Die
Umsetzung wird im allgemeinen bei einer Temperatur von 0°C bis zur
Rückflusstemperatur
des Lösemittels ausgeführt. Im
allgemeinen erfordern die Reaktionen 30 Minuten bis 72 Stunden.
Das [6-substituierte-2-(G1H-Benzyl)naphthalin-1-yl]-[4-substituierte
Phenyl]methanol (11) kann durch in der Technik gut bekannte Verfahren
isoliert und gereinigt werden, wie Extraktion, Eindampfung, Pulverisierung,
Chromatographie und Umkristallisation.
-
In
Schema B Schritt 7 wird das cyclisierte Produkt (IB) durch Aussetzen
von [6-substituiertem-2-(GH-Benzyl)naphthalin-1-yl]-[4-substituiertem
Phenyl]methanol (11) gegenüber
einer säurekatalysierten
Cyclisierung hergestellt.
-
Beispielsweise
wird [6-substituiertes-2-(G1H-Benzyl)naphthalin-1-yl]-[4-substituiertes
Phenyl]methanol (11) mit einem geeigneten Lösemittel oder Lösemittelgemisch
verdünnt,
wie Tetrahydrofuran und Wasser, wonach die Zugabe einer geeigneten
Säure,
wie Chlorwasserstoffsäure
erfolgt. Das Reaktionsgemisch wird dann sanft für eine Zeitspanne erhitzt,
die von etwa 5 bis 30 Minuten reicht, mit einem geeigneten organischen Lösemittel
verdünnt,
wie Methylenchlorid und mit einer geeigneten Base gestoppt, wie
Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat oder Kaliumdicarbonat.
Das cyclisier te Produkt der Formel (IB) kann durch Techniken isoliert
und gereinigt werden, die in der Technik bekannt sind, wie Extraktion,
Eindampfung, Pulverisierung, Chromatographie und Umkristallisation.
-
Wenn
eine Hydroxygruppe an R0, R1,
R2 und/oder R3 gewünscht wird,
kann eine Verbindung der Formel (IB) von den Schutzgruppen befreit,
isoliert und gemäß Verfahren
isoliert und gereinigt, wie dies vorher in Schema A gezeigt ist.
-
Wenn
eine -OC(O)(C1-C6 Alkyl)
oder -OC(O)C6H5 Gruppe
an R0, R1, R2 und/oder R3 erwünscht ist,
wird eine Mono-, Di- oder Trihydroxyverbindung der Formel I mit
einem Mittel umgesetzt, wie Acylchlorid, -bromid, -cyanid oder -azid
oder mit einem geeigneten Anhydrid oder gemischten Anhydrid. Die
Reaktionen werden bequemerweise in einem basischen Lösemittel
ausgeführt,
wie Pyridin, Lutidin, Chinolin oder Isochinolin oder in einem tertiären Aminlösemittel,
wie Triethylamin, Tributylamin, Methylpiperidin und dergleichen.
Die Umsetzung kann auch in einem inerten Lösemitel ausgeführt werden,
wie Ethylacetat, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Dioxan, Dimethoxyethan,
Acetonitril, Aceton, Methylethylketon und dergleichen, wozu zumindest
ein Äquivalent
eines Säurefängers, wie
ein tertiäres
Amin zugegeben wurde. Falls erwünscht,
können
Acylierungskatalysatoren verwendet werden, wie 4-Dimethylaminopyridin
oder 4-Pyrrolidinopyridin. Siehe beispielsweise Haslam et al., Tetrahedron
36: 2409–2433
(1980).
-
Die
Acylierungsreaktionen, die die vorher erwähnten R0,
R1, R2 und/oder
R3 Gruppen bereitstellen, werden unter moderaten
Temperaturen im Bereich von etwa –25°C bis etwa 100°C, häufig unter
einer inerten Atmosphäre
ausgeführt,
wie Stickstoffgas. Jedoch ist die Umgebungstemperatur gewöhnlich für die Reaktion geeignet.
-
Solche
Acylierungen der Hydroxygruppe können
auch durch Säure-katalysierte
Reaktionen der geeigneten Carbonsäuren in inerten organischen
Lösemitteln
oder pur ausgeführt
werden. Säurekatalysatoren,
wie Schwefelsäure,
Polyphosphorsäure,
Methansulfonsäure
und dergleichen können
verwendet werden.
-
Die
vorher erwähnten
R0, R1, R2 und/oder R3 Gruppen
können
auch durch Bildung eines aktiven Esters der geeigneten Säure bereitgestellt
werden, wie den Estern, die durch so bekannte Reagenzien gebildet
werden, wie Dicyclohexylcarbodiimid, Acylimidazolen, Nitrophenolen,
Pentachlorphenol, N-Hydroxysuccinimid und
1-Hydroxybenzotriazol. Siehe beispielsweise Bull. Chem. Soc. Japan,
38: 1979 (1965) und Chem. Ber. 788 und 2024 (1970).
-
Wenn
eine Verbindung erwünscht
ist, worin R0, R1,
R2 und/oder R3 für -OSO2(C4-C6 Alkyl)
stehen, wird die geeignete Mono-, Di- oder Trihydroxyverbindung
beispielsweise mit einem Derivat der geeigneten Sulfonsäure, wie
einem Sulfonylchlorid, Sulfonylbromid oder Sulfonylammoniumsalz
umgesetzt, wie dies von King und Monoir, J. Am. Chem. Soc., 97:
2566–2567
(1975) beschrieben ist. Die Mono-, Di- oder Trihydroxyverbindung
kann auch mit dem geeigneten Sulfonsäureanhydrid umgesetzt werden.
Solche Reaktionen werden unter Bedingungen ausgeführt, wie
dies oben in der Diskussion der Reaktion mit Säurehalogeniden und dergleichen
erläutert
ist.
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Die
Verbindungen der Formel (I) können
so hergestellt werden, dass R0, R1, R2 und/oder R3 für
unterschiedliche biologische Schutzgruppen stehen oder vorzugsweise
für dieselbe
biologische Schutzgruppe. Bevorzugte Schutzgruppen umfassen -CH3, -C(O)C(CH3)3, -C(O)C6H5 und -SO2(CH2)3CH3.
-
Die
Verbindungen der Formel (5a), worin Y für -S-, -NH-, -NMe- oder -CH2- steht, können analog zu den in der Technik
gut bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise sind
präparative
Syn thesen der Verbindungen der Formel (5a) von C.R. Schmidt et al.,
Bioorg. Med. Chem. Lett. 9 (1999) 523–528 beschrieben.
-
Alle
Lösemittel
haben ACS Reinheit und werden verwendet, wie sie geliefert werden.
Alle Reagenzien sind im Handel erhältlich und können ohne
weitere Reinigung verwendet werden, falls nichts anderes angegeben
ist. Die LCMS Daten werden auf einem Hewlett Packard Gerät der 1100
Serie aufgezeichnet. Das verwendete Verfahren ist 5 % Acetonitril – 95 % Wasser
(0,05 % TFA) bis 95 % Acetonitril – 5 % Wasser (0,05 % TFA) über 2 Minuten
und halten für
3 Minuten auf einer Waters Symmetry C18 2.1 × 50 mm Säule bei 35°C. Die 1H NMR
Spektren werden bei 400 MHz auf einem Varian 400 Spektrometer aufgenommen,
falls nichts anderes angegeben ist.
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Präparation 1
-
[6-Methoxy-2-(2-methoxybenzyl)benzo[b]thiophen-3-yl]-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
-
Man
gibt eine Lösung
aus 2-Methoxybenzylmagnesiumchlorid (5 ml an 0,25 M/THF) zu einer
gerührten
Lösung
aus (2-Dimethylamino-6-methoxybenzo[b]thiophen-3-yl)-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
(500 mg, 1,14 mmol) in THF (5 ml) bei –78°C. Nach 30 Minuten gibt man
zusätzliches
2-Methoxybenzylmagnesiumchlorid (5 ml) zu. Nach 30 Minuten stoppt
man mit Wasser und verdünnt
mit iPrOH/CHCl3 (1:3). Man wäscht die
organische Phase mit Wasser und Kochsalzlösung, trocknet über MgSO4, filtriert und konzentriert unter Bildung
von 6-Methoxy-2-(2-methoxybenzyl)benzo[b]thiophen-3-yl]-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
(686 mg). Man verwendet das rohe Produkt ohne weitere Reinigung.
1H NMR (CDCl3): 7,85
(d, J = 9,3 Hz, 2H), 7,28 (t, J = 8,8 Hz, 1H), 7,19 (m, 3H), 6,93
(d, J = 9,3 Hz, 2H), 6,82–6,87
(m, 2H), 6,78 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,17 (m, 4H), 3,81 (s, 3H), 3,66
(s, 3H), 2,80 (t, J = 5,9 Hz, 2H), 2,52 (br s, 4H), 1,62 (m, 4H),
1,45 (m, 2H).
LCMS: 3,14 min, m/z = 516 (M+H)+.
-
Präparation 2
-
[6-Hydroxy-2-(2-hydroxybenzyl)benzo[b]thiophen-3-yl]-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
-
Man
stellt das HCl Salz von [6-Methoxy-2-(2-methoxybenzyl)benzo[b]thiophen-3-yl]-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
durch die Zugabe von gesättigtem
HCl/Ether zu einer Lösung
in CH2Cl2 her. Man
konzentriert bis zur Trockne und löst in CH2Cl2 (5 ml) zurück. Man kühlt diese Lösung auf 0°C und gibt BBr3 (1
ml) zu. Man rührt
während
der Erwärmung
auf RT für
2 Stunden. Man stoppt die Reaktion mit gesättigtem NaHCO3 und
verdünnt
mit i-PrOH/CHCl3 (1:3). Man wäscht die
organische Phase mit Wasser und Kochsalzlösung, trocknet über MgSO4, filtriert und konzentriert. Man reinigt
das Rohmaterial durch Blitzchromatographie (0–5 % (2M NH3 in
MeOH)/CH2Cl2) unter
Bildung von [6-Hydroxy-2-(2-hydroxybenzyl)benzo[b]thiophen-3-yl]-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
(300 mg, 54 %, 2 Schritte).
1H NMR
(CDCl3): 7,76 (d, J = 9,2 Hz, 2H), 7,13–7,25 (m,
2H), 7,00 (d, J = 2,2, 1H), 6,83–6,93 (m, 3H), 6,61–6,71 (m,
3H), 4,22 (s, 2H), 4,17 (m, 2H), 2,84 (m, 2H), 2,58 (br s, 4H),
1,63 (br m, 4H), 1,45 (br m, 2H).
-
Beispiel 1
-
5-[4-(2-Piperidin-1-ylethoxy)phenyl]-5,11-dihydro-6-oxo-12-thiadibenzo[a,f]azulen-2-ol
-
Man
gibt DIBAL Lösung
(5 ml, 1 M/THF) tropfenweise zu [6-Hydroxy-2-(2-hydroxybenzyl)benzo[b]thiophen-3-yl]-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
(300 mg, 0,6 mmol) in THF (5 ml) bei –78°C. Man rührt für 30 Minuten und stoppt mit
Wasser, wonach eine Zugabe von TFA (5 ml) erfolgt. Man rührt das
Gemisch für 3
Stunden, während
man es auf RT erwärmt.
Man entfernt das Lösemittel
im Vakuum und löst
den Rückstand in
i-PrOH/CH2Cl2 (1:3).
Man wäscht
die organische Phase mit Wasser und Kochsalzlösung, trocknet über MgSO4, filtriert und konzentriert. Man reinigt
durch Blitzchromatographie (0–5
% an 2 M NH3 in MeOH/CH2Cl2) unter Bildung von 5-[4-(2-Piperidin-1-ylethoxy)phenyl]-5,11-dihydro-6-oxa-12-thiadibenzo[a,f]azulen-2-ol
(180 mg, 62 %).
1H NMR (CDCl3): 7,20 (dd, J = 7,0, 1,8 Hz, 1H), 6,96–7,10 (m,
5H), 6,71 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 6,64 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,54 (dd,
J = 8,8, 2,6 Hz, 1H), 6,26 (s, 1H), 4,26 (ABq, J = 15,8 Hz, 1H),
4,14 (ABq, J = 16,1 Hz, 1H), 4,02 (m, 2H), 2,78 (m, 2H), 2,55 (br
s, 4H), 1,62 (br m, 4H), 1,43 (br m, 2H).
LCMS: 2,99 min, m/z
= 4,72 (M+H)+.
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Präparation 3
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(2,6-Dimethoxynaphthalin-1-yl)-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
-
In
einem trockenen Rundbodenkolben, der mit einem Rührstab, einer Temperatursonde
und einer N2 Leitung ausgestattet ist, wird
2,6-Dimethoxynaphthalin (1,0 Äqu.)
in CH2Cl2 (5 Volumenäquivalente)
bei Umgebungstemperatur gelöst.
Man kühlt
die Lösung
auf 0°C
in einem Eisbad und gibt 4-(2-Piperidin-1-ylethoxy)benzoylchlorid
(1,1 Äqu.)
zu. Man gibt Aluminiumchlorid (2,0 Äqu.) zu. Wenn die Umsetzung
vollständig
ist, wird die Umsetzung langsam mit 1 N NaOH gestoppt und mit weiterem
Wasser und CH2Cl2 verdünnt. Man
wäscht die
wässrige
Phase mit 1 × 20
ml an CH2Cl2. Man
vereinigt die organischen Extrakte und wäscht mit Kochsalzlösung und
trocknet (Na2SO4).
Man kristallisiert das Rohprodukt aus Methanol unter Bildung von
(2,6-Dimethoxynaphthalin-1-yl)-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
um (durchschnittliche Ausbeute 68 %).
-
Präparation 4
-
(2-Hydroxy-6-methoxynaphthalin-1-yl)-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
-
Man
löst (2,6-Dimethoxynaphthalin-1-yl)-[4-(2-piperidjn-1-ylethoxy)phenyl]methanon
in CH2Cl2 (10 Volumenäquivalente)
in einem Dreihalsrundbodenkolben, der mit einem druckausgleichenden
Zugabetrichter, einem Rührstab
und einer N2 Quelle ausgestattet ist. Man
kühlt den
Kolben in einem Eis/Kochsalzbad und gibt 1,0 M BCl3 Lösung in
CH2Cl2 (1,2 Äquivalente)
tropfenweise zu. Die Reaktionslösung
wird dunkelrot und die Temperatur steigt auf 5°C. Innerhalb 1 Stunde ist das
ganze Ausgangsmaterial verbraucht, wie dies durch TLC (1:1, Ether
: Petrolether) bestimmt wird. Man stoppt die Reaktion mit Methanol
(5 Äquivalente)
und erlaubt ein Erwärmen
auf Raumtemperatur. Man verdünnt
die organische Lösung
mit CH2Cl2 (ein
Volumenäquivalent)
und gibt eine 1,0 M NaHCO3 Lösung (5
Volumenäquivalente)
zu und rührt
für 1 Stunde.
Man trennt die wässrigen und
organischen Phasen. Man wäscht
die wässrige
Phase mit CH2Cl2 (ein
Volumen) und kombiniert die organischen Phasen, wäscht mit
gesättigtem
NH4Cl und trocknet über Na2SO4. Man reinigt das Produkt über eine Säulenchromatographie
(50/1 Silicagel), wobei mit CH2Cl2/Hexan (3/1) unter Bildung von (2-Hydroxy-6-methoxynaphthalin-1-yl)-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
(typische Ausbeute 87 %) eluiert wird.
-
Präparation 5
-
Trifluormethansulfonsäure-6-methoxy-1-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)benzoyl]naphthalin-2-ylester
-
Man
löst (2-Hydroxy-6-methoxynaphthalin-1-yl)-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
in CH2Cl2 (10 Volumina)
in einem Dreihalsrundbodenkolben, der mit einem Rührstab und
einer N2 Quelle ausgestattet ist und kühlt in einem
Eis/Kochsalzlösungsbad
auf 0°C.
Man gibt Pyridin (1,3 Äquivalente)
zu. Man gibt Trifluormethansulfonylchlorid (1,2 Äquivalente) über eine
Spritze über
15 Minuten zu. Die gelbe Aufschlämmung
wird durch diese Zugabe durchsichtig orange. Die Reaktion wird durch
HPLC Analyse nach 15 Minuten als vollständig bestimmt. Man stoppt die
Reaktion mit H2O (10 Volumina), wäscht mit
1 N HCl (5 Volumina), wäscht
mit 1,0 N NaHCO3 und trocknet über Na2SO4. Nach einer
Konzentrierung erhält
man Trifluormethansulfonsäure-6-methoxy-1-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)benzoyl]naphthalin-2-yl]ester als sauberen
gelben Schaum in einer quantitativen Ausbeute. Man verwendet das
Produkt ohne weitere Reinigung.
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Präparation 6
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[6-Methoxy-2-(2-methoxybenzyl)naphthalin-1-yl]-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
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Man
gibt eine Lösung
aus 2-Methoxybenzylzinkchlorid (8 ml, 0,5 M/THF) zu einem Gemisch
aus Trifluormethansulfonsäure-6-methoxy-1-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)benzoyl]naphthalin-2-ylester
(1,0 g, 1,86 mmol), Bu4NI (2,1 g, 5,7 mmol),
Pd(dba)2 (68 mg, 0,12 mmol) und dppf (66
mg, 0,12 mmol) in NMP/THF (5 ml, 3:2). Man erhitzt das Gemisch für 2 Stunden
am Rückfluss.
Man stoppt die Reaktion mit Wasser und verdünnt mit CH2Cl2. Man wäscht
die organische Phase mit Wasser und Kochsalzlösung, trocknet über MgSO4, filtriert und konzentriert. Man trägt das rohe
Produkt auf eine SCX Kartusche auf, wäscht mit MeOH und eluiert mit
2 M NH3/MeOH. Man reinigt das entstehende
Produkt durch Blitzchromatographie (0–5 % (2 M NH3/MeOH)/CH2Cl2) unter Bildung
von [6-Methoxy-2-(2-methoxybenzyl)naphthalin-1-yl]-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]methanon
(820 mg, 87 %).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 7,77 (br d, J = 6,6 Hz, 2H), 7,69 (d,
J = 8,4 Hz, 1H), 7,41 (d, J = 9,2 Hz, 1H), 7,26 (m, 1H), 7,13 (m,
2H), 6,98–7,03
(m, 2H), 6,76–6,93
(m, 4H), 4,17 (m, 2H), 3,91 (m, 2H), 3,89 (s, 3H), 3,69 (s, 3H),
2,81 (br m, 2H), 2,54 (br s, 4H), 1,63 (br b, 4H), 1,45 (br m, 2H).
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Präparation 7
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[6-Hydroxy-2-(2-hydroxybenzyl)naphthalin-1-yl]-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
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Man
gibt BBr3 (0,3 ml) tropfenweise zu einer
gerührten
Lösung
aus [6-Methoxy-2-(2-methoxybenzyl)naphthalin-1-yl]-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
(650 mg, 1,28 mmol) in CH2Cl2 (15
ml) bei Raumtemperatur. Man rührt
für 1 Stunde
und gibt ein zusätzliches
Aliquot an BBr3 (0,2 ml) zu. Man setzt das Rühren für 1 Stunde
fort und stoppt mit MeOH und 2-Methyl-2-buten. Man trägt die entstehende
Lösung
auf eine SCX Kartusche auf, wäscht
mit MeOH und eluiert mit 2 M NH3/MeOH. Man
reinigt das entstehende Produkt durch Blitzchromatographie (0–5 % (2
M NH3 in MeOH)/CH2Cl2) unter Bildung von [6-Hydroxy-2-(2-hydroxybenzyl)naphthalin-1-yl]-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
(161 mg, 26 %).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 7,79 (br m), 7,49 (d, J = 8,8 Hz, 1H),
7,21–7,27
(m, 2H), 6,99–7,14
(m), 6,87 (dd, J = 9,2, 2,6 Hz, 1H), 6,73–6,80 (m), 6,48 (br m), 4,13
(t, J = 5,9 Hz, 2H), 3,85 (ABq, 2H), 2,80 (t, J = 6,2 Hz), 2,54
(br s), 2,37–2,39
(m), 1,25–1,63
(m).
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Präparation 8
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6-(2-Hydroxybenzyl)-5-{hydroxy[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methyl}naphthalin-2-ol
-
Man
gibt eine LAN Lösung
(0,3 ml, 1 M/THF) zu einer Lösung
aus [6-Hydroxy-2-(2-hydroxybenzyl)naphthalin-1-yl]-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methanon
(150 mg, 0,31 mmol) in THF (3 ml) bei RT. Man rührt für 30 Minuten und stoppt mit
wässrigem
NaHCO3. Man verdünnt mit CH2Cl2, wäscht
mit Wasser und Kochsalzlösung,
trocknet über
MgSO4, filtriert und konzentriert. Man reinigt
das Rohprodukt durch Blitzchromatographie (0–5 % (2 M NH3 in
MeOH)/CH2Cl2) unter
Bildung von 6-(2-Hydroxybenzyl)-5-{hydroxy[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methyl}naphthalin-2-ol
(123 mg, 82 %).
MS: m/z = 484 (M+H)+
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Beispiel 2
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13-[4-(2-Piperidin-1-ylethoxy)phenyl]-7,13-dihydro-12-oxabenzo[4,5]cyclohepta[1,2-a]naphthalin-3-ol
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Man
löst 6-(2-Hydroxybenzyl)-5-{hydroxy[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl]methyl}naphthalin-2-ol
(80 mg, 0,17 mmol) in HCl Lösung
(20 % 1 M wässrige
HCl in THF). Man rührt
für 2 Stunden
und erwärmt
sanft für
10 Minuten. Man verdünnt
mit CH2Cl2, wäscht mit
gesättigtem
NaHCO3, Wasser und Kochsalzlösung, trocknet über MgSO4, filtriert und konzentriert. Man reinigt
das Rohprodukt durch Blitzchromatographie (0–5 % (2 M NH3 in
MeOH)/CH2Cl2) unter
Bildung von 13-[4-(2-Piperidin-1-ylethoxy)phenyl]-7,13-dihydro-12-oxabenzo[4,5]cyclohepta[1,2-a]naphthalin-3-ol
(43 mg, 56 %).
1H NMR (300 MHz, CDCl3): 7,47 (t, J = 8,8 Hz, 2H), 7,31 (d, J
= 8,4 Hz, 1H), 7,20 (dd, J = 7,3, 1,8 Hz, 1H), 7,02–7,08 (m,
4H), 6,94 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 6,83–6,87 (m, 3H), 6,57 (8,8 Hz,
2H), 4,50 (d, 14,6 Hz, 1H), 4,04 (m, 2H), 3,96 (d, J = 14,6 Hz,
1H), 2,85 (br m, 2H), 2,66 (br s, 4H), 1,69 (br m, 4H), 1,47 (br
s, 2H).
LCMS: 3,00 min, m/z = 466 (M+H)+.
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Biologisches Testverfahren
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Allgemeines Präparationsverfahren
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Der
Kompetitionsbindungstest wird in Puffer ausgeführt der 50 mM Hepes, pH 7,5,
1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 10 % Glycerin, 1 mg/ml Ovalbumin und 5
mM DTT enthält,
wobei 0,025 μCi
pro Vertiefung an 3H Östradiol (NEN Nr. NET517 mit
118 Ci/mmol, 1 mCi/ml) und 10 ng/Vertiefung an ER Alpha oder ER
Beta Rezeptor (Pan Vera) verwendet werden. Die konkurrierenden Verbindungen
werden in 10 unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben. Die unspezifische
Bindung wird in Gegenwart von 1 μM
an 17-B Östradiol
bestimmt. Die Bindungsreaktion (140 μl) wird für 4 Stunden bei Raumtemperatur
inkubiert und dann werden 70 μl
an kaltem DCC Puffer zu jeder Reaktion gegeben (DCC Puffer enthält pro 50
ml Testpuffer 0,75 g Aktivkohle (Sigma) und 0,25 g Dextran (Pharmacia)).
Die Platten werden für
8 Minuten auf einem Rundschüttler
bei 4°C
gemischt. Die Platten werden dann bei 3000 Upm bei 4°C für 10 Minuten
zentrifugiert. Ein Aliquot an 120 μl des Gemisches wird in eine
weitere weiße
Flachbodenplatte mit 96 Vertiefungen (Costar) überführt und 175 μl an Wallac Optiphase "Hisafe 3" Scintillationsflüssigkeit
werden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten werden verschlossen
und stark auf einem Rundschüttler
geschüttelt.
Nach einer Inkubation für
2,5 Stunden werden die Platten in einem Wallac Microbetazähler ausgelesen.
Die Daten werden verwendet, um eine HK50 und
eine % Hemmung bei 10 μM
zu berechnen. Der Kd für 3H Östradiol
wird durch Sättigen
der Bindung an ER alpha und ER beta Rezeptoren bestimmt. Die HK50 Werte für die Verbindungen werden mittels
der Cheng-Prusoff Gleichung in die Ki Werte
umgewandelt und der Kd Wert wird durch einen
Sättigungsbindungstest
bestimmt.
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Humane
Ishikawa Endometriumtumorzellen werden in MEM (Minimum Essential
Medium mit Earle's Salzen
und L-Glutamin, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) gehalten, das mit 10
% fetalem Rinderserum (FBS) (V/V), Gibco BRL) supplementiert ist.
Am Tag vor dem Test wird das Wachstumsmedium zu Testmedium gewechselt,
nämlich
DMEM/F-12 (3:1) (Dulbecco's
Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12, 3:1 Gemisch, Phenolrot-frei,
Gibco BRL), das supplementiert ist mit 5 % fetalem Rinderserum,
das mit Dextran beschichteter Aktivkohle behandelt wurde (DCC-FBS)
(Hyclone, Logen, UT), L-Glutamin (2 mM), MEM Natriumpyruvat (1 mM),
HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] 2 mM), alles von Gibco
BRL. Nach einer Inkubation über
Nacht werden die Ishikawa Zellen mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (1x) (D-PBS)
ohne Ca2+ und Mg2+ (Gibco
BRL) gewaschen und durch eine Inkubation für 3 Minuten mit 0,25 % Phenolrot-freiem
Trypsin/EDTA (Gibco BRL) mit Trypsin behandelt. Die Zellen werden
in Testmedium resuspendiert und auf 250 000 Zellen/ml eingestellt.
Etwa 25 000 Zellen in 100 μl
Medium werden zu Flachboden Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen
(Costar 3596) gegeben und bei 37°C
in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 für 24 Stunden
inkubiert. Am nächsten
Tag werden serielle Verdünnungen
der Verbindungen in Testmedium hergestellt (mit dem Sechsfachen
der Endkonzentration im Test). Der Test wird in einem dualen Modus gefahren,
nämlich
dem Agonist- und dem Antagonistmodus. Für den Agonistmodus erhalten
die Platten 25 μl/Vertiefung
an Testmedium, gefolgt von 25 μl/Vertiefung
an verdünnten
Verbindungen (mit dem Sechsfachen der Endkonzentrationen). Für den Antagonistmodus
erhalten die Platten 25 μl/Vertiefung
an 6 nM E2 (β-Östradiol, Sigma, St. Louis,
MO), gefolgt von 25 μl/Vertiefung
der verdünnten
Verbindungen (mit dem Sechsfachen der Endkonzentrationen). Nach
einer weiteren Inkubation für
48 Stunden bei 37°C
in einem befeuchteten 5 % CO2 Inkubator
wird das Medium aus den Vertiefungen abgesaugt und 100 μl frisches
Medium wird zu jeder Mikrokultur gegeben. Es werden serielle Verdünnungen
der Verbindungen hergestellt und wie oben beschrieben zu den Zellen
gegeben. Nach einer Inkubation für
weitere 72 Stunden bei 37°C
in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 wird
der Test durch Entfernen des Mediums und zweimaligem Waschen der
Platten in Dulbecco's
Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung
(1x) (D-PBS) (Gibco BRL) gestoppt. Die Platten werden für 5 Minuten
getrocknet und bei –70°C für zumindest
1 Stunde eingefroren. Die Platten werden dann auf dem Gefrierschrank
entfernt und können
bei Raumtemperatur auftauen. Zu jeder Vertiefung werden 100 μl an 1-Step® PNPP
(Pierce Chemical Company, Rockford, IL) gegeben. Nach einer Inkubation
für 20
Minuten werden die Platten auf einem Spektrophotometer bei 405 nm
ausgelesen. Die Daten werden einer linearen Interpolation angepasst,
um die EK50 Werte (für den Agonistmodus) oder die
HK50 Werte (für den Antagonistmodus) abzuleiten.
Für den
Agonistmodus wird eine prozentuale Wirksamkeit für jede Verbindung gegenüber der
Reaktion auf Tamoxifen berechnet. Für den Antagonistmodus wird
eine prozentuale Wirksamkeit für
jede Verbindung gegenüber
E2 (1 nM) alleine berechnet.
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MCF-7
Brustadenocarzinomzellen (ATCC HTB 22) werden in MEM (Minimal Essential
Medium, Phenolrot-frei, Gibco BRL) gehalten, das mit 10 % fetalem
Rinderserum (FBS) (V/V), L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM),
HEPES ((N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]) (10 mM), nicht esentiellen Aminosäuren (0,1
mM) und Penicillin-Streptomycin (1x) supplementiert ist. Sieben
Tage vor dem Test werden die MCF-7 Zellen in Testmedium überführt, das
dasselbe ist, wie das Erhaltungsmedium, außer dass es mit 10 % fetalem
Rinderserum, das mit Dextran-beschichteter Aktivkohle behandelt
wurde (DCC-FBS) anstelle von 10 % FBS supplementiert ist. Die MCF-7
Zellen werden aus den Kolben mittels 10fach Trypsin EDTA (Phenolrot-frei,
Gibco BRL) entfernt und einfach in Ca2+/Mg2+ freiem HBSS (Phenolrot-frei) verdünnt. Die
Zellen werden auf 80 000 Zellen/ml Testmedium eingestellt. Etwa
8 000 Zellen (100 μl)
werden zu jeder Vertiefung von Cytostar T Scintillationsplatten
mit 96 Vertiefungen (Amersham) gegeben und bei 37°C in einem
befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 für 24 Stunden
inkubiert, um eine Zellhaftung und eine Äquilibrierung nach dem Transfer zu
erlauben. Es werden serielle Verdünnungen der Arzneimittel in
Testmedium mit dem Vierfachen der gewünschten Endkonzentration hergestellt.
Ein 50 μl
Aliquot der Arzneimittelverdünnungen
(mit dem Vierfachen der Endkonzentration im Test) wird zweifach
in Vertiefungen überführt, wonach
50 μl Testmedium
für den
Agonistmodus oder 50 μl
an 40 pM an E2 für
den Antagonistmodus auf ein Endvolumen von 200 μl zugegeben werden. Für jede der
Agonistplatten wird ein Basalspiegel (Medium) und ein maximal stimulierter
Spiegel (mit 1 μM
E2) bestimmt. Für
jede der Antagonistplatten wird ein Basalspiegel (Medium) und E2
(10 pM) als Kontrolle bestimmt. Nach weiteren 48 Stunden bei 37°C in einem
befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 werden
20 μl Testmedium,
worin 0,01 μCi
an 14C Thymidin enthalten sind (52 mCi/mmol,
50 μCi/μl, Amersham)
zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten werden über Nacht im selben Inkubator
inkubiert und dann auf einem Wallac Microbetazähler gezählt. Die Daten werden zur Berechnung
einer HK50 und einer prozentualen Hemmung
bei 1 μM
für den
Antagonistmodus gemittelt. Für
den Agonistmodus werden eine EK50 und der
Prozentsatz der maximalen E2 Stimulierung und die Konzentration
der Maximalstimulierung berechnet.
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Allgemeines Rattenpräparationsverfahren
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Fünfundsiebzig
Tage alte (falls nichts anderes angeben ist) weibliche Sprague Dawley
Ratten (Gewichtsbereich 200 bis 225 g) erhält man von den Charles River
Laboratories (Portage, MI). Die Tiere werden entweder beidseitig
ovarektomiert (OVX) oder einem operativen Scheinverfahren bei den
Charles River Laboratories unterzogen und dann nach einer Woche
geliefert. Nach der Ankunft werden sie in Metallhängekäfigen in
Gruppen von 3 oder 4 pro Käfig
gehalten und haben für
eine Woche freien Zugang zu Futter (Calciumgehalt etwa 0,5 %) und
Wasser. Die Raumtemperatur wird bei 22,2°C ± 1,7°C mit einer minimalen relativen
Luftfeuchte von 40 % gehalten. Die Lichtperiode im Raum beträgt 12 Stunden
Licht und 12 Stunden Dunkelheit.
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Dosierungsplan
und Gewebeentnahme: Nach einer Woche Akklimatisierungszeit (daher
zwei Wochen nach OVX) wird die tägliche
Dosierung mit einer Verbindung der Formel I ("F-I")
begonnen. 17α-Ethinylöstradiol
oder F-I werden als Suspension 1 % Carboxymethylcellulose oder gelöst in 20
% Cyclodextrin oral verabreicht, falls nichts anderes angegeben
ist. Die Tiere erhalten die Dosen 4 Tage lang. Nach dem Dosierungsplan werden
die Tiere gewogen und mit einem Gemisch aus Ketamin : Xylazin (2:1,
V:V) betäubt
und es wird eine Blutprobe durch eine cardiale Punktion entnommen.
Die Tiere werden dann durch Erstickung mit CO2 getötet, der
Uterus wird durch eine Mittellinienincision entfernt und das Nassgewicht
des Uterus wird bestimmt. 17α-Ethinylöstradiol
erhält
man von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.
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Kardiovaskuläre Erkrankung/Hyperlidämie
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Die
Blutproben von oben können
bei Raumtemperatur für
2 Stunden gerinnen und das Serum wird nach der Zentrifugation für 10 Minuten
bei 3000 Upm erhalten. Das Serumcholesterin wird mittels eines Hochleistungscholesterintests
von Boehringer Mannheim Diagnostics bestimmt. Kurz gesagt wird das
Cholesterin zu Cholest-4-en-3-on und Wasserstoffperoxid oxidiert.
Das Wasserstoffperoxid wird dann mit Phenol und 4-Aminophenazon
in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines p-Chinoniminfarbstoffs
umgesetzt, der spektrophotometrisch bei 500 nm ausgelesen wird.
Die Cholesterinkonzentration wird dann aus einer Standardkurve errechnet.
Der gesamte Test wird mittels einer Biomek Automated Workstation
automatisiert.
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Uteruseosinophilenperoxidasetest
(EPO)
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Die
Uteri werden bis zur enzymatischen Analyse bei 4°C aufbewahrt. Die Uteri werden
dann in 50 Volumina 50 mM Tris-Puffer (pH 8,0) homogenisiert, worin
0,005 % Triton-X 100 enthalten sind. Nach der Zugabe von 0,01 %
Wasserstoffperoxid und 10 mM o-Phenylendiamin (Endkonzentrationen)
in Tris-Puffer,
wird die Absorptionszunahme für
eine Minute bei 450 nm verfolgt. Die Anwesenheit von Eosinophilen
im Uterus ist ein Zeichen für
die östrogene
Aktivität
einer Verbindung. Die maximale Geschwindigkeit eines 15 Sekunden
langen Intervalls wird über
den anfänglichen,
linearen Teil der Reaktionskurve bestimmt.
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Testverfahren auf die
Hemmung des Knochenverlusts (Osteoporose)
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Durch
Befolgen des oben beschriebenen allgemeinen Präparationsverfahrens werden
die Ratten täglich
für 35
Tage (6 Ratten pro Behandlungsgruppe) behandelt und durch Kohlendioxiderstickung
am 36. Tag getötet.
Die 35 Tage dauernde Periode reicht aus, um eine maximale Wirkung
auf die Knochendichte zu erhalten, wobei dies wie hierin beschrieben
gemessen wird. Zum Tötungszeitpunkt
werden die Uteri entfernt, von andersartigem Gewebe befreit und
der Flüssigkeitsinhalt
wird vor der Bestimmung des Nassgewichts entleert, um die mit der
vollständigen
Ovarektomie zusammenhängende Östrogendefizienz
zu bestätigen.
Das Uterusgewicht wird routinemäßig in Reaktion
auf die Ovarektomie um etwa 75 % verringert. Die Uteri werden dann in
neutral gepufferte 10 % Formalinlösung gegeben, um die anschließende histologische
Untersuchung zu ermöglichen.
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Die
rechten Femuren werden entnommen und an der distalen Metaphyse werden
digitale Röntgenstrahlen
erzeugt und durch ein Bildanalyseprogramm analysiert (NIH Image).
Der proximale Teil der Tibien aus diesen Tieren wird auch durch
quantitative Computertomographie gescannt. Gemäß den obigen Verfahren werden
F-I oder Ethinylöstradiol
(EE2) in 20 % Hydroxypropyl-β-cyclodextrin
oral an die Testtiere verabreicht. F-I ist auch in Kombination mit Östrogen
oder Progestin brauchbar.
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Uterusfibrosetestverfahren
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Test 1
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Zwischen
3 und 20 Frauen, die eine Uterusfibrose aufweisen, verabreicht man
F-I. Die Menge an verabreichter Verbindung beträgt 0,1 bis 1000 mg/Tag und
der Verabreichungszeitraum beträgt
3 Monate. Die Frauen werden während
des Verabreichungszeitraums und bis zu 3 Monate nach Beendigung
der Verabreichung auf Auswirkungen auf die Uterusfibrose beobachtet.
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Test 2
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Es
wird dasselbe Testverfahren wie in Test 1 verwendet, außer dass
der Verabreichungszeitraum 6 Monate beträgt.
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Test 3
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Es
wird dasselbe Verfahren wie in Test 1 verwendet, außer dass
der Verabreichungszeitraum 1 Jahr beträgt.
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Test 4
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Es
wird eine verlängerte Östrogenstimulierung
zur Induzierung der Leiomyome in sexuell reifen weiblichen Meerschweinchen
verwendet. Die Tiere werden mit Östradiol
3–5 mal
pro Woche durch Injektion für
2–4 Monate
dosiert, oder bis Tumoren auftauchen. Die Behandlungen, die aus
F-I oder einem Träger
bestehen, werden täglich
für 3–16 Wochen
verabreicht und dann werden die Tiere getötet und die Uteri werden entnommen
und auf Tumorregression untersucht.
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Test 5
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Gewebe
von humanen Leiomyomen wird in den Peritonealraum und/oder in das
Uterusmyometrium von sexuell reifen, sterilisierten, weiblichen
Nacktmäusen
implantiert. Es wird exogenes Östrogen
verabreicht, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren.
In einigen Fällen
werden die entnommenen Tumorzellen in vitro vor der Implantierung
kultiviert. Die Behandlung, die aus F-I oder einem Träger besteht,
wird durch Gastrolavage täglich
für 3–16 Wochen
verabreicht und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum
oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt
werden die Uteri gewonnen, um den Status des Organs zu untersuchen.
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Test 6
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Gewebe
aus humanen fibroiden Uterustumoren wird entnommen und in vitro
als primäre
nichttransformierte Kulturen gehalten. Operationsentnahmen werden
durch ein steriles Netz oder Sieb gedrückt oder alternativ dazu vom
umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10 % Serum und Antibiotikum
enthalten. Die Wachtumsraten werden in Gegenwart und Abwesenheit
von Östrogen
bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente
C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht.
Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach
der Behandlung mit Progestinen, GnRH, F-I und einem Träger untersucht.
Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu
bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten
bleiben. Es wird Gewebe von 5–25
Patienten verwendet.
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Test 7
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F-I's Fähigkeit
zur Hemmung der durch Östrogen
stimulierten Proliferation von Leiomyomenstammenden ELT Zelllinien
wird im wesentlichen gemessen, wie dies in Fuchs-Young et al., "Inhibition of Estrogen-Stimulated
Growth of Uterine Leiomyomas by Selective Estrogen Receptor Modulators", Mol. Car., 17(3): 151–159 (1996)
beschrieben ist, wobei die Beschreibung hiermit eingeführt ist.
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Endometriosetestverfahren
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Test 1
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Zwölf bis dreißig erwachsene
weibliche Ratten vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden
in drei Gruppen mit gleicher Anzahl aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus
aller Tiere aufgezeichnet. Am Tag des Proöstrus wird bei jedem Weibchen
eine Operation durchgeführt.
Bei den Weibchen in jeder Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt,
in kleine Quadrate geschnitten und die Quadrate werden lose an verschiedene
Stellen benachbart zum Mesenteriumblutfluss angenäht. Zusätzlich werden
den Weibchen in Gruppe 2 die Ovarien entfernt. Am Tag nach der Operation
erhalten die Tiere in den Gruppen 1 und 2 intraperitoneale Wasserinjektionen
für 14
Tage, während
die Tiere in Gruppe 3 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg F-I
pro Kilogramm Körpergewicht
für dieselbe
Zeitspanne erhalten. Nach 14 Behandlungstagen wird jedes Weibchen getötet und
die endometrischen Explantate, Nebennieren, der verbleibende Uterus
und die Ovarien, wo dies möglich
ist, werden entfernt und zur histologischen Untersuchung präpariert.
Die Ovarien und Nebennieren werden gewogen.
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Test 2
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Zwölf bis dreißig erwachsene
weibliche Ratten vom CD Stamm werden als Testtiere verwendet. Sie werden
in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt. Es wird der Östruszyklus aller Tiere aufgezeichnet.
Am Tag des Proöstrus
wird bei jedem Weibchen eine Operation durchgeführt. Bei den Weibchen in jeder
Gruppe wird das linke Uterushorn entfernt, in kleine Quadrate geschnitten
und die Quadrate werden lose an verschiedene Stellen benachbart
zum Mesenteriumblutfluß angenäht. Etwa
50 Tage nach der Operation erhalten die zur Gruppe 1 gehörenden Tiere
intraperitoneale Wasserinjektionen für 21 Tage, während die
Tiere der Gruppe 2 intraperitoneale Injektionen mit 1,0 mg F-I pro
Kilogramm Körpergewicht
für dieselbe
Zeitspanne erhalten. Nach 21 Behandlungstagen wird jedes Weibchen
getötet
und die endometrischen Explantate und Nebennieren werden entfernt und
gewogen. Die Explantate werden als Maß des Wachstums gemessen. Die Östruszyklen
werden aufgezeichnet.
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Test 3
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Autographien
von endometrischem Gewebe werden zur Induktion der Endometriose
in Ratten und/oder Kaninchen verwendet. Weibliche Tiere werden bei
einer Reproduktionsreife einer beidseitigen Oophorektomie unterzogen
und Östrogen
wird exogen bereitgestellt, um einen spezifischen und konstanten
Hormonspiegel bereitzustellen. Autologes endometrisches Gewebe wird
im Peritoneum von 5–150 Tieren
implantiert und Östrogen
wird zur Wachtumsinduktion des explantierten Gewebes bereitgestellt.
Die Behandlung, die aus einer erfindungsgemäßen Verbindung besteht, wird
durch Gastrolavage täglich
für 3–16 Wochen
verabreicht und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum
oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt
wird das intakte Horn des Uterus entnommen, um den Status des Endometriums
zu bestimmen.
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Test 4
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Gewebe
von humanen Endometriumläsionen
wird in das Peritoneum von sexuell reifen, sterilisierten, weiblichen
Nacktmäusen
implantiert. Es wird endogenes Östrogen
bereitgestellt, um das Wachstum des explantierten Gewebes zu induzieren.
In manchen Fällen
werden die gewonnenen Endometriumzellen vor der Implantierung in
vitro kultiviert. Die Behandlung besteht aus F-I, das durch Gastrolavage
täglich
für 3–16 Wochen
verabreicht wird, und die Implantate werden entfernt und auf Wachstum
oder Regression gemessen. Zum Tötungszeitpunkt
werden die Uteri entnommen, um den Status des intakten Endometriums
zu untersuchen.
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Test 5
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Das
Gewebe aus humanen endometrialen Läsionen wird gewonnen und in
vitro als primäre
nichttransformierte Kulturen gehalten. Operationsentnahmen werden
durch ein steriles Netz oder Sieb gedrückt oder alternativ dazu vom
umgebenden Gewebe getrennt, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
Die Zellen werden in Medien gehalten, die 10 % Serum und Antibiotikum
enthalten. Die Wachstumsraten werden in Gegenwart und Abwesenheit
von Östrogen
bestimmt. Die Zellen werden auf ihre Fähigkeit zur Bildung der Komplementkomponente
C3 und ihre Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Wachstumshormon untersucht.
Die in vitro Kulturen werden auf ihre Proliferationsreaktion nach
der Behandlung mit Progestinen, GnRH, F-I und einem Träger untersucht.
Die Mengen an Steroidhormonrezeptoren werden wöchentlich untersucht, um zu
bestimmen, ob die wichtigen Zelleigenschaften in vitro erhalten
bleiben. Es wird Gewebe von 5–25
Patienten verwendet.
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Verwendung der Verbindung
der Formel (I) zusammen mit Östrogen
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Peri-
und postmenopausale Frauen unterziehen sich oft einer Hormonersatztherapie
(HRT), um die negativen Folgen zu bekämpfen, die mit dem Abfall des
zirkulierenden, endogenen Östrogens
assoziiert sind, beispielsweise um Hitzewallungen zu behandeln.
Jedoch ist die HRT mit erhöhten
Risiken von bestimmten Krebsarten assoziiert, einschließlich Uterus-
und Brustkrebs. F-I kann zusammen mit der HRT zur Hemmung dieser
Risiken verwendet werden.
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Prävention von Brustkrebs
-
Die
Erfindung betrifft auch die Verabreichung von F-I an einen Empfänger, der
einem Risiko ausgesetzt ist, de novo Brustkrebs zu entwickeln. Der
Ausdruck "de novo" meint, wie er hierin
verwendet wird, das Auftreten einer Transformation oder Metamorphose
von normalen Brustzellen zu krebsartigen oder malignen Zellen zum
ersten Mal. Eine solche Transformation kann in Stufen in denselben
Zellen oder in Tochterzellen über
einen evolutorischen Prozess ablaufen oder kann in einem einzelnen,
pivotalen Ereignis auftreten. Dieser de novo Prozess steht im Gegensatz
zur Metastasierung, Kolonialisierung oder Verbreitung von bereits
transformierten oder malignen Zellen aus der primären Tumorstelle
an neue Orte.
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Eine
Person, die keinem besonderen Risiko ausgesetzt ist, Brustkrebs
zu entwickeln, ist eine, die de novo Brustkrebs entwickeln kann
und keine Evidenz oder keinen Verdacht für ein Krankheitspotential oberhalb eines
normalen Risikos aufweist und bei der nie eine Diagnose der Erkrankung
gestellt wurde. Der größte Risikofaktor,
der zur Entwicklung von Brustcarzinom beiträgt, ist eine persönliche Geschichte,
an dieser Erkrankung zu leiden oder ein früheres Auftreten der Erkrankung,
sogar wenn sie sich in Remission ohne Evidenz von deren Anwesenheit
befindet. Ein weiterer Risikofaktor ist die Familiengeschichte der
Erkrankung.
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Die
Induktion von Brusttumoren bei Ratten durch die Verabreichung des
Carzinogens N-Nitroso-N-methylharnstoff
ist ein gut akzeptiertes Tiermodell für die Untersuchung von Brustkrebs
und hat sich als geeignet zur Analyse der Wirkung von chemopräventiven
Mitteln herausgestellt.
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In
zwei getrennten Untersuchungen wird 55 Tage alten weiblichen Sprague-Dawley
Ratten eine intravenöse
(Studie 1) oder intraperitoneale (Studie 2) Dosis von 50 mg N-Nitroso-N-methylharnstoff
pro Kilogramm Körpergewicht
eine Woche vor dem freien Zugang zu einem Futter verabreicht, in
das unterschiedliche Mengen an F-I, (Z)-2-[4-(1,2-Diphenyl-1-butenyl)phenoxy]-N,N-dimethylethanaminbase
(Tamoxifenbase) oder die Kontrolle gemischt wurden.
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In
Studie 1 entsprechen die Nahrungsmitteldosen von 60 mg/kg der Nahrung
und 20 mg/kg der Nahrung ungefähr
vergleichbaren Dosierungen von 3 und 1 mg/kg Körpergewicht für die Testtiere.
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In
Studie 2 entsprechend die Nahrungsmitteldosen von 20, 6, 2 und 0,6
mg/kg der Nahrung ungefähr vergleichbaren
Dosierungen von 1, 0,3, 0,1 und 0,03 mg/kg Körpergewicht für die Testtiere.
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Die
Ratten werden auf das Auftreten einer Toxizität beobachtet und einmal pro
Woche auf eine Tumorbildung palpiert. Die Tiere werden nach 13 Wochen
(Studie 1) oder 18 Wochen (Studie 2) getötet und die Tumoren werden
bestätigt
und bei der Autopsie gewogen.
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Therapeutische Verwendungsverfahren
und Dosierungen
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Die
vorliegende Beschreibung liefert auch ein Verfahren zur Hemmung
einer Erkrankung, die mit Östrogenmangel
assoziiert ist und ein Verfahren zur Hemmung einer Erkrankung, die
mit einer unkontrollierten physiologischen Reaktion auf endogenes Östrogen
assoziiert ist, das das vorher erwähnte Verfahren unter Verwendung
der Verbindungen der Formel I umfasst und optional die Verabreichung
einer wirksamen Menge an Östrogen
oder Progestin an einen Patienten umfasst. Diese Behandlungen sind
besonders bei der Behandlung der Osteoporose und der Verringerung
des Serumcholesterins brauchbar, da der Patient die Vorteile jedes pharmazeutischen
Mittels erhält,
während
die erfindungsgemäßen Verbindungen
die unerwünschten
Nebenwirkungen von Östrogen
und Progestin hemmen würden.
Die Wirkung dieser Kombinationsbehandlungen in einem der obigen
postmenopausalen Tests zeigt, dass die Kombinationsbehandlungen
für die
Linderung der Symptome des postmenopausalen Syndroms bei Frauen
brauchbar sind.
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Es
sind verschiedene Formen von Östrogen
und Progestin im Handel erhältlich.
Auf Östrogen
basierende Mittel umfassen beispielsweise Ethinylöstrogen
(0,01–0,03
mg/Tag), Mestranol (0,05–0,15
mg/Tag) und konjugierte Östrogenhormone,
wie Premarin® (Wyeth-Ayerst,
0,3–2,5
mg/Tag). Auf Progestin basierende Mittel umfassen beispielsweise
Medroxyprogesteron, wie Provera® (Upjohn,
2,5–10 mg/Tag),
Norethylnodrel (1,0–10,0
mg/Tag) und Norethindron (0,5–2,0
mg/Tag). Eine bevorzugte auf Östrogen
basierende Verbindung ist Premarin und Norethylnodrel und Norethindron
sind bevorzugte auf Progestin basierende Mittel.
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Das
Verabreichungsverfahren jedes auf Östrogen und Progestin basierenden
Mittels stimmt mit dem überein,
was in der Technik bekannt ist. Für die Mehrzahl der erfindungsgemäßen Verfahren
werden die Verbindungen der Formel I kontinuierlich 1 bis 3 mal
täglich
verabreicht. Jedoch kann die zyklische Therapie insbesondere bei
der Behandlung der Endometriose brauchbar sein oder kann akut während schmerzvoller
Attacken der Erkrankung verwendet werden. Im Fall der Restenose
kann die Therapie auf kurze Intervalle (1–6 Monate) nach medizinischen
Verfahren beschränkt
werden, wie der Angioplastie.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck "Patient" auf einen Warmblüter oder Säuger, der einer Hemmung einer
Erkrankung bedarf, die mit Östrogenmangel
assoziiert ist oder der Hemmung einer Erkrankung bedarf, die mit
einer unkontrollierten physiologischen Reaktion gegenüber endogenem Östrogen
assoziiert ist. Es ist verständlich,
dass Meerschweinchen, Hunde, Katzen, Ratten, Mäuse, Hamster und Primaten, einschließlich Menschen
Beispiele für
Patienten sind, die innerhalb der Bedeutung des Ausdrucks liegen.
Bevorzugte Patienten umfassen Menschen. Die am meisten bevorzugten
Patienten umfassen postmenopausale, weibliche Menschen.
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Wie
hierin verwendet ist der Ausdruck "hemmen" so definiert, dass er. die allgemein
anerkannte Bedeutung umfasst, die die Prävention, Verhinderung, Zurückdrängung und
Verlangsamung, das Anhalten der die Umkehr der Progression oder
der Schwere und das in Schach halten und/oder die Behandlung von
existierenden Charakteristiken umfasst. Das vorliegende Verfahren
umfasst sowohl die medizinisch therapeutische und/oder prophylaktische
Behandlung, wie dies geeignet ist.
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Der
Ausdruck "Östrogenmangel" bezeichnet den Zustand,
bei dem der optimale Östrogenspiegel
fehlt. Dieser Spiegel variiert von einem Gewebe zum anderen in Abhängigkeit
der Funktion des Gewebes. Daher kann in einigen Fällen Östrogenmangel
das vollständige
Fehlen von Östrogen
sein, während
in anderen Fällen der
Mangel Östrogenspiegel
umfasst, die für
eine gute Gewebefunktion zu gering sind. Bei Frauen sind die zwei
häufigsten
Ursachen von Östrogenmangel
die Menopause und Ovarektomie, obwohl andere Zustände auch
die Ursachen sein können. Östrogenmangel
kann zu Zuständen
führen,
wie Osteoporose und kardiovaskulären
Effekten, wie Hyperlipidämie,
Proliferation der glatten Muskelzellen der Aorta (Restenose), Verringerung
der Stickoxidbildung (Bluthochdruck) und Verringerung der Produktion
des Enzyms PAI-1 (Plasminogenaktivatorinhibitor 1), das heißt Thrombose.
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Die
Verringerung oder Linderung von anderen Pathologien, die mit der
Menopause zusammenhängen,
wie Harninkontinenz, Vaginaltrockenheit, Zunahme des Vorkommens
von Autoimmunerkrankung, Verlust der Hautspannung kann auch durch
Verabreichung der Verbindungen der Formel I erreicht werden.
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Zusätzlich zu
ihrer Brauchbarkeit bei der Behandlung von Krankheitszuständen, die
mit dem Östrogenmangel
nach der Menopause zusammenhängen,
sind die erfindungsgemäßen Verbindungen
auch bei Behandlung von Krankheitszuständen brauchbar, die mit einer
unangemessenen Reaktion gegenüber
endogenem Östrogen
in Geweben sowohl vor als auch während
der Menopause assoziiert sind.
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Ein
Beispiel für
einen pathologischen Zustand, der mit abnormalen Zellreaktionen
gegenüber
endogenem Östrogen
in Geweben assoziiert ist, ist der Östrogen-abhängige Brustkrebs. Östrogen abhängige Brusttumorzellen
proliferieren in Gegenwart von Östrogen
und die Behandlung dieser Erkrankung war, die gesamte Wirkung von Östrogen
in diesen Zellen zu stoppen.
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Eine
weitere Östrogen-abhängige Pathologie
ist Uterusfibrose (fibroide Uteruserkrankung). Im wesentlichen ist
die Uterusfibrose ein Zustand, bei dem eine Ablagerung von fibroidem
Gewebe auf der Wand des Uterus stattfindet. Dieser Zustand ist eine
Ursache für
Dysmenorrhoe und Unfruchtbarkeit bei Frauen. Die exakte Ursache
dieses Zustands ist wenig verstanden, aber Erkenntnisse legen nahe,
dass eine gestörte
Reaktion des fibroiden Gewebes auf Östrogen vorliegt. Die häufigste
herkömmliche
Behandlung der Uterusfibrose umfasst operative Verfahren die sowohl
teuer als auch manchmal ein Anlass für Komplikationen sind, wie die
Bildung von abdominalen Adhäsionen
und Infektionen.
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Eine
weitere Erkrankung in dieser Kategorie ist Endometriose, ein Zustand
schwerer Dysmenorrhoe, der von schweren Schmerzen, Blutung in die
endometrischen Ansammlungen oder den Peritonealraum begleitet wird
und oft zur Unfruchtbarkeit führt.
Die Ursache der Symptome dieses Zustands scheint ektopes endometriales
Wachstum zu sein, das in gestörten
Geweben vorkommt, die gegenüber
einer hormonalen Kontrolle unangemessen reagieren.
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Wie
hierin verwendet, meint der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" eine Menge einer
erfindungsgemäßen Verbindung,
die zur Linderung der Symptome von verschiedenen pathologischen
Zuständen fähig ist,
wie sie hierin beschrieben sind. Die spezifische Dosis einer erfindungsgemäß verabreichten
Verbindung wird natürlich
von den besonderen den Fall umgebenden Umständen bestimmt, wie beispielsweise
der verabreichten Verbindung, dem Verabreichungsweg, des Zustands
des Patienten und des zu behandelnden pathologischen Zustands. Eine
typische Tagesdosis für
den Menschen enthält
eine nichttoxische Dosismenge von etwa 1 mg bis etwa 600 mg/Tag
einer erfindungsgemäßen Verbindung.
Bevorzugte Tagesdosen umfassen im allgemeinen etwa 15 mg bis etwa
300 mg/Tag. Die bevorzugtesten Dosen reichen von 20 mg bis etwa
100 mg, die einmal oder dreimal pro Tag verabreicht werden.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
können
auf eine Vielzahl an Arten verabreicht werden, einschließlich oral,
rektal, transdermal, subkutan, intravenös, intramuskulär und intranasal.
Diese Verbindungen werden vorzugsweise vor der Verabreichung formuliert,
wobei die Auswahl hiervon durch den behandelnden Arzt entschieden
wird. Daher ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine
pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge einer Verbindung
der Formel I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon,
die wahlweise eine wirksame Menge Östrogen oder Progestin enthält, und
eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers, Verdünnungsmittels oder Hilfsstoffes
hierfür
enthält.
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Die
Gesamtwirkstoffe umfassen in solchen Formulierungen 0,1 bis 99,9
Gewichtsprozent der Formulierung. Mit "pharmazeutisch annehmbar" ist gemeint, dass
der Träger,
das Verdünnungsmittel,
die Hilfsstoffe und das Salz mit den anderen Bestandteilen der Formulierung
kompatibel und für
den Empfänger
hiervon nicht schädlich
sind.
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Erfindungsgemäße pharmazeutische
Formulierungen können
durch in der Technik bekannte Verfahren mittels gut bekannten und
leicht verfügbaren
Inhaltsstoffen hergestellt werden. Beispielsweise können die Verbindungen
der Formel I mit oder ohne einer Östrogen- oder Progestinverbindung
mit herkömmlichen
Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln
oder Trägern
formuliert und zu Tabletten, Kapseln, Suspensionen, Pulvern und dergleichen
geformt werden. Beispiele für
Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel
und Träger,
die für
solche Formulierungen geeignet sind, beinhalten die folgenden: Füllstoffe
und Streckmittel, wie Stärke,
Zuckerarten, Mannit und Kieselsäurederivate,
Bindemittel, wie Carboxymethylcellulose und andere Cellulosederivate,
Alginate, Gelatine und Polyvinylpyrrolidon, Netzmittel, wie Glycerin,
Desintegrationsmittel, wie Calciumcarbonat und Natriumbicarbonat,
Mittel zur Verzögerung
der Auflösung,
wie Paraffin, Resorptionsbeschleuniger, wie quarternäre Ammoniumverbindungen,
oberflächenaktive
Mittel, wie Cetylalkohol, Glycerinmonostearat, adsorptive Träger, wie
Kaolin und Bentonit und Gleitmittel, wie Talkum, Calcium- und Magnesiumstearat
und feste Polyethylenglycole.
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Die
Verbindungen können
auch formuliert werden als Elixiere oder Lösungen zur bequemen oralen Verabreichung
oder als Lösungen,
die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, beispielsweise
auf intramuskulärem,
subkutanem oder intravenösem
Weg. Zusätzlich
sind die Verbindungen gut geeignet zur Formulierung als verzögert freisetzende
Dosierungsformen und dergleichen. Die Formulierungen können so
gestaltet werden, dass sie den Wirkstoff nur oder vorzugsweise an
einem bestimmten physiologischen Ort möglicherweise über eine
bestimmte Zeitspanne freisetzen. Die Beschichtungen, Umhüllungen
und Schutzmatrizes können
beispielsweise aus polymeren Substanzen oder Wachsen hergestellt
werden.
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Die
Verbindungen der Formel I werden alleine oder in Kombination mit
einem erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Mittel in einer bequemen Formulierung verabreicht.