DE602004009881T2

DE602004009881T2 - Vorrichtung zur Messung des extrazellulären Potenzials

Info

Publication number: DE602004009881T2
Application number: DE602004009881T
Authority: DE
Inventors: Masaya Nakatani; Nobuhiko Ozaki; Hiroaki Oka
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 2003-11-21
Filing date: 2004-11-18
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2024-11-19
Also published as: DE602004020281D1; US20050112756A1; CN1619302A; DE602004020405D1; EP1533615B1; CN101165484B; CN101165484A; JP2005156234A; US20080257727A1; JP4552423B2; US7396673B2; EP1862800A1; US20080237039A1; EP1533615A3; US8030059B2; US20080257726A1; EP1533615A2; EP1862800B1; CN100355904C; EP1867985B1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Element zum Messen extrazellulären Potentials und eine Vorrichtung zum Messen eines extrazellulären Potentials, die eingesetzt werden, um einfach und schnell die elektrophysiologische Evaluierung eines biologischen Musters, wie beispielsweise einer Zelle, unter Verwendung einer von dem biologischen Muster erzeugten elektrochemischen Veränderung als Index durchzuführen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Apparat zum Messen extrazellulären Potentials, und ein Verfahren zum Messen extrazellulären Potentials unter Verwendung desselben.
2. Stand der Technik
Das Screening von Arzneimitteln wird unter Verwendung der elektrischen Aktivität einer Zelle als Index durchgeführt. Herkömmlich wird die elektrische Aktivität einer Zelle mit einer Patch-Clamp-Technik oder einer Technik, die ein fluoreszierendes Pigment, oder einen Licht emittierenden Indikator verwendet, gemessen.
Bei der Patch-Clamp-Technik wird ein kleiner Teil (nachfolgend als „Patch" bezeichnet) Zellmembran an einem Abschnitt an der Spitze einer Mikropipette befestigt und wird dazu verwendet, den Ionentransport durch ein einzelnes Ionenkanal-Protein mit einer Mikroelektrodensonde elektrisch aufzuzeichnen. Die Patch-Clamp-Technik ist eine von wenigen zellbiologischen Techniken, die dazu eingesetzt werden kann, die Funktion eines einzelnen Proteins in Echtzeit zu untersuchen.
Bei der anderen Technik wird ein Licht, das auf eine Änderung der Konzentration eines bestimmten Ions hin erzeugt wird, unter Verwendung eines fluoreszierenden Pigments, oder eines Licht emittierenden Indikators überwacht, um die elektrische Aktivität einer Zelle zu messen (nachfolgend als „Fluoreszenz-Messtechnik" bezeichnet).
Die Patch-Clamp-Technik erfordert spezielle Techniken zur Vorbereitung, Manipulation und dergleichen einer Mikropipette, sowie viel Zeit zum Messen einer Probe. Daher ist die Patch-Clamp-Technik nicht geeignet, eine große Menge von zu messenden Zusammensetzungen für ein Arzneimittel mit hoher Geschwindigkeit zu screenen.
Die Fluoreszenz-Messtechnik kann eine große Menge von zu messenden Zusammensetzungen für ein Arzneimittel mit hoher Geschwindigkeit screenen. Die Fluoreszenz-Messtechnik erfordert jedoch den Schritt, eine Zelle einzufärben. Während der Messung verursachen Pigmente ein starkes Hintergrundrauschen, und die Intensität der Fluoreszenz wird mit der Zeit schwächer, was ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis zur Folge hat.
Ein alternatives Verfahren wurde in WO 02/055653 (nachfolgend als „Patentdokument 1" bezeichnet) offenbart; dabei handelt es sich um ein Verfahren zum Messen extrazellulären Potentials. Das Verfahren zum Messen extrazellulären Potentials bietet Daten von hohem qualitativem Niveau, vergleichbar mit denen durch die Patch-Clamp-Technik. Des Weiteren kann das Verfahren zum Messen extrazellulären Potentials eine große Menge von Proben mit hoher Geschwindigkeit durch ein einfaches Verfahren messen, wie die Fluoreszenz-Messtechnik.
Patentdokument 1 offenbart eine Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials (nachfolgend als „Vorrichtung" bezeichnet), die das extrazelluläre Potential, oder die physikalisch-chemische Veränderung misst, die von einer Zelle erzeugt wird. Die Vorrichtung umfasst mindestens einen Topf, der Einrichtungen zum Halten einer auf einem Substrat bereitgestellten Zelle aufweist. Der Topf weist eine Messeinrichtung zum Erfassen eines elektrischen Signals auf.
40 bildet den Aufbau einer typischen herkömmlichen Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials ab. Die Kulturlösung 110 befindet sich in Topf 103. Subjektzelle (Zelle) 105 wird von dem auf Substrat 102 bereitgestellten Halteabschnitt 113 festgehalten oder gehalten. Der Zellenhalteabschnitt 113 besteht aus der Vertiefung 104, dem Öffnungsabschnitt 106 und der Durchgangsbohrung 107 in dem Substrat 102. Die Durchgangsbohrung 107 ist über Öffnungsabschnitt 106 mit der Vertiefung 104 verbunden. Die Detektionselektrode 109 oder die Messeinrichtung ist in der Durchgangsboh rung angeordnet, und die Detektionselektrode 109 ist über Draht 108 mit einem Signalerfassungsabschnitt (nicht abgebildet) verbunden.
Während der Messung wird die Zelle 105 von einer Saugpumpe (nicht abgebildet) oder einer ähnlichen Einrichtung von der Seite der Durchgangsbohrung 107 aus angesaugt, so dass sie dicht an der Vertiefung 104 gehalten wird. Gleichzeitig fließt Kulturlösung 110 zu der Seite der Durchgangsbohrung 107 und tritt in Kontakt mit Detektionselektrode 109. Dadurch wird ein auf Grund der Aktivität von Zelle 105 erzeugtes elektrisches Signal von der auf der Seite der Durchgangsbohrung 107 angebrachten Detektionselektrode erfasst, wobei kein Austritt in die Kulturlösung 110 in Topf 103 erfolgt.
Bei dem Messverfahren unter Verwendung einer herkömmlichen Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials wird Zelle 105 mit Arzneimittel (nicht dargestellt) reagiert. Deshalb muss das Arzneimittel in die Kulturlösung 110 injiziert werden. Die Injektion von Arzneimittel in die Kulturlösung 110 verursacht unweigerlich einen Fluss von Kulturlösung 110 in die Nachbarschaft von Zelle 105. Wenn die Änderung des Flusses bei Kulturlösung 110 in der Nachbarschaft von Zeile 105 beträchtlich ist, ergibt sich bei der Kulturlösung 111, die in Kontakt mit Detektionselektrode 109 steht, Fluktuation.
Bei der Messung des extrazellulären Potentials ist das beim Erfassen durch die Detektionselektrode 109 erzeugte Rauschen eine Ursache, die das Signal-Rausch-Verhältnis eines von der Detektionselektrode 109 erfassten Signals verschlechtert. Das durch die Fluktuation in Kulturlösung 111 erzeugte Rauschen hat eine niedrige Frequenz von ungefähr 100 Hz oder niedriger. Die Änderung des extrazellulären Potentials weist hingegen ein Gleichstromsignal auf, oder ein Signal, das sich mit einer Phase von weniger als ungefähr 5 kHz ändert. Die beiden Signale teilen sich nämlich einen sich überlappenden Frequenzbereich.
Es wurde versucht, das Rauschen mittels eines elektrischen Filters oder dergleichen zu reduzieren, aber dadurch wird auch das Signal des Niedrigfrequenzbereichs nahe dem Gleichstromsignal unterbrochen. In einigen Fällen wird auch, abhängig von den Filtereigenschaften, sogar ein Signal mit höherer Frequenz von 100 Hz unterbrochen. Infolgedessen ist es schwierig, ein Signal genau zu erfassen, das von Zelle 105 erzeugtes extrazelluläres Potential darstellt.
EP 1 352 952 offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren unter Verwendung dieser Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials und zum schnellen Screening von darin bereitgestellten Arzneimitteln. Die Vorrichtung weist ein Rohr auf, das zur Abgabe entweder der Kultur oder des Arzneimittels in den Behälter geeignet ist. Eine oder mehrere winzige Vertiefungen sind auf der unteren Seite von Töpfen einer Multititer-Platte als Teil einer Zellhaltevorrichtung ausgebildet. Eine Messelektrode ist bereitgestellt, wo sie Zellen kontaktiert, oder ist in der Nähe der Zellen angeordnet. Die Vorrichtung umfasst weiterhin Rechenvorrichtungen für Standardabweichung und Mittelwert, und Ausgabevorrichtungen zum Anzeigen der erhaltenen Daten.
WO 99/31503 offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren, worin ein mit Durchgangsbohrungen versehenes Substrat verwendet wird, Patch-Clamps durch Einfangen von Zellen mit den Durchgangsbohrungen aufgebaut werden, und Änderungen des elektrischen Stroms gemessen werden. Das Verfahren ermöglicht die Positionierung von Zellen und Vesikeln, beziehungsweise von Zellmembranen auf planen Trägern und ermöglicht die elektrische Charakterisierung solcher Membranen mit einem durchweg hohen Signal-Rausch-Verhältnis.
Zusammenfassung der Erfindung
Das Ziel, die oben genannten Schwierigkeiten zu überwinden, wird durch die Merkmale von Anspruch 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsbeispiele werden in den Unteransprüchen dargelegt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine teilweise geschnittene und auseinandergezogene perspektivische Darstellung, die eine Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials gemäß einem ersten exemplarischen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung zeigt.
2 ist eine teilweise geschnittene perspektivische Darstellung, die ein Messelement zeigt, das in der Messvorrichtung aus 1 verwendet wird.
3 ist eine teilweise ausgeschnittene vergrößerte perspektivische Darstellung, die einen Schlüsselabschnitt des Messelements aus 2 darstellt.
4 ist eine Querschnittsansicht zur Darstellung, wie die Vorrichtung aus 1 verwendet wird.
5 ist eine vergrößerte Querschnittsansicht, die die Vorrichtung aus 1 zeigt.
6 ist eine vergrößerte Querschnittsansicht, die die Vorrichtung aus 1 zeigt.
7 ist eine Querschnittsansicht, die die Vorrichtung aus 1 zeigt.
8 ist eine Querschnittsansicht, die die Vorrichtung aus 1 zeigt.
9 ist eine perspektivische Darstellung eines in der Vorrichtung aus 1 verwendeten Messelements.
10 ist eine perspektivische Darstellung eines in der Vorrichtung aus 1 verwendeten Messelements.
11 ist eine grafische Darstellung eines Flusses zur Messung von extrazellulärem Potential in der Vorrichtung aus 1.
12 ist ein Eigenschaftsdiagramm von unter Verwendung der Vorrichtung aus 1 gemessenen Daten des extrazellulären Potentials.
13 ist eine Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 1.
14 ist eine teilweise vergrößerte Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 1.
15 ist eine teilweise vergrößerte Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 1.
16 ist eine Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 1.
17 ist eine Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 1.
18 ist eine Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 1.
19 ist eine Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 1.
20 ist eine Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 1.
21 ist eine Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 1.
22 ist eine teilweise geschnittene perspektivische Darstellung einer Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials gemäß einem zweiten beispielhaften Ausführungsbeispiel.
23 ist eine teilweise geschnittene perspektivische Darstellung der Vorrichtung aus 22.
24 ist eine teilweise geschnittene perspektivische Darstellung, die ein in der Vorrichtung aus 22 verwendetes Messelement zeigt.
25 ist eine teilweise geschnittene und vergrößerte perspektivische Darstellung, die einen Schlüsselabschnitt des Messelements aus 24 zeigt.
26 ist eine teilweise geschnittene perspektivische Ansicht, die eine Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials in der vorliegenden Erfindung zeigt.
27 ist eine teilweise geschnittene perspektivische Ansicht, die eine Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials in der vorliegenden Erfindung zeigt.
28 ist eine teilweise vergrößerte Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 22.
29 ist eine teilweise vergrößerte Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 22.
30 ist eine teilweise vergrößerte Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 22.
31 ist eine teilweise vergrößerte Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 22.
32 ist eine teilweise vergrößerte Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 22.
33 ist eine teilweise vergrößerte Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 22.
34 ist eine teilweise vergrößerte Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 22.
35 ist eine Querschnittsansicht zur Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 22.
36 ist eine teilweise vergrößerte Querschnittsansicht, die eine Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials gemäß einem dritten beispielhaften Ausführungsbeispiel darstellt.
37 ist eine teilweise vergrößerte Querschnittsansicht, die ein Verfahren zur Herstellung der Vorrichtung aus 36 darstellt.
38 ist eine teilweise vergrößerte Querschnittsansicht, die ein Verfahrens zur Herstellung der Vorrichtung aus 36 zeigt.
39 ist eine teilweise vergrößerte Querschnittsansicht, die eine Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials gemäß einem dritten beispielhaften Ausführungsbeispiel darstellt.
40 ist eine Querschnittsansicht, die eine typische herkömmliche Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Erstes Ausführungsbeispiel
1 ist eine teilweise ausgeschnittene und explodierte perspektivische Darstellung einer Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel; der Behälter dieser Vorrichtung ist teilweise ausgeschnitten, um die Innenseite zu zeigen. 2 ist eine teilweise ausgeschnittene perspektivische Darstellung eines Messelements zum Messen extrazellulären Potentials (nachfolgend als „Messelement" bezeichnet). 3 ist eine teilweise ausgeschnittene und vergrößerte perspektivische Darstellung, die einen Schlüsselabschnitt des Messelements aus 2 darstellt.
Die Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials (Vorrichtung) 51 wird gebildet aus Behälter 2 und dem daran befestigten Element 1 zum Messen extrazellulären Potentials (Messelement 1). Messelement 1 ist eine Laminierung aus Silizium und Siliziumdioxid Behälter 2 besteht aus einem elektrisch isolierenden Harzmaterial und verfügt über Referenzelektrode 7 zum Messen des Potentials innerhalb von Behälter 2.
Messelement 1 verfügt über Topf 9, der die Öffnung an der oberen Fläche von Messelement 1 aufweist. Am Boden von Topf 9 sind erste Mikro-Durchgangsbohrung (Durchgangsbohrung) 3 und Vertiefung 4 bereitgestellt. Durchgangsbohrung 3, deren Durchmesser kleiner ist als derjenige von Vertiefung 4, durchdringt die Bodenfläche von Vertiefung 4 und die untere Fläche von Messelement 1. Messelement 1 verfügt an der unte ren Fläche über Detektionselektrode 8, wie in 3 dargestellt. Detektionselektrode 8 ist am unteren Ende von Durchgangsbohrung 3 angeordnet.
Behälter 2 weist eine zweite Durchgangsbohrung (Durchgangsbohrung) 5 auf, die am Boden bereitgestellt ist. Die Größe der Durchgangsbohrung 5 ist größer als diejenige der Öffnung von Topf 9. Wand 10 von Topf 9 weist eine Schüsselform auf und dient zur Aufnahme von Kulturlösung und Arzneimittel.
Behälter 2 ist in der Seitenwand mit einer dritten Durchgangsbohrung (Durchgangsbohrung) 6 versehen. Rohr 11 wird in Durchgangsbohrung 6 eingeführt. Rohr 11 wird durch Durchgangsbohrung 6 geführt, so dass eine Spitze von Rohr 11 genau auf der Stelle von Durchgangsbohrung 3 und Vertiefung 4 positioniert wird.
5 und 6 verdeutlichen, dass die Oberflächen von Vertiefung 4 und Durchgangsbohrung 3 mit Oxidschicht 46 bedeckt sind. Die Oxidschicht 46 wird je nach Bedarf ausgebildet, entsprechend der Art, Größe und so weiter einer Subjektzelle. Die Dicke von Oxidschicht 46 variiert; sie kann eine Dicke von 10000 Ångström oder mehr aufweisen, wenn sie durch thermische Oxidation gebildet wird, wohingegen sie eine Dicke von 500 Ångström oder weniger aufweisen kann, wenn sie auf natürliche Weise gebildet wird. Die Dicke von Oxidschicht 46 ist für die vorliegende Erfindung keine wesentliche Bedingung.
Im Folgenden wird ein Verfahren beschrieben, wie die Messvorrichtung 51 verwendet wird.
4 ist eine Querschnittsansicht zur Darstellung, wie die Messvorrichtung 51 verwendet wird. 5 und 6 zeigen vergrößerte Querschnittsansichten von Durchgangsbohrung 3 und Vertiefung 4.
Wenn Kulturlösung 22 und Subjektzelle (Zelle) 21 in Behälter 2 gegeben werden, treibt Zelle 21 in Kulturlösung 22. Innerhalb von Behälter 2 werden Vertiefung 4 und Durchgangsbohrung 3 mit Kulturlösung 22 gefüllt, woraufhin Kulturlösung 22 in die Seite der Detektionselektrode 8 hinaus fließt.
Die in Kulturlösung 22 treibende Zelle 21 fließt aufgrund eines Drucks innerhalb von Behälter 2, und wird in Vertiefung 4 gesaugt, wie in 5 und 6 gezeigt. Wenn ein Druck zum Ansaugen von Zelle 21 nicht hoch genug ist, wird eine Saugpumpe (nicht dargestellt) oder eine ähnliche Einrichtung verwendet, um Kulturlösung 22 von der Seite der Detektionselektrode weg zu ziehen. Dann ist sichergestellt, dass die in Kulturlösung 22 treibende Zeile 21 in Richtung Vertiefung 4 gezogen wird. Da die Größe von Durchgangsbohrung 3 so ausgelegt ist, dass sie kleiner ist als diejenige von Zelle 21, wird Zelle 21 zurückbehalten und bleibt innerhalb der Vertiefung 4.
Um das Arzneimittel (nicht dargestellt) in der Nachbarschaft von Zelle 21 fehlerfrei abzugeben, muss zwischenzeitlich die Anordnung der Spitze von Rohr 11 nahe an der Vertiefung 4 platziert werden, wo Zelle 21 gehalten wird. Da das normalerweise verwendete Rohr 11 einen Durchmesser von nur 1 mm oder weniger hat, kann das Rohr 11 aufgrund der Oberflächenspannung von Kulturlösung 22 leicht gebogen werden, wenn Rohr 11 von oben in den mit Kulturlösung 22 gefüllten Behälter 2 eingeführt wird, wie in 7 und 8 gezeigt. Es ist daher keine einfache Aufgabe, die Spitze von Rohr 11 genau an einer bestimmten vorgegebenen Stelle zu platzieren.
Daher ist Durchgangsbohrung 6, die strahlenförmig von einer Stelle angeordnet ist, an welcher die Durchgangsbohrung 3 und die Vertiefung 4 angebracht sind, in der Seitenwand von Behälter 2 bereitgestellt. Das Rohr 11 wird in die Durchgangsbohrung 6 eingeführt. Dadurch kann die Spitze von Rohr 11 genau positioniert werden, so dass sie sehr nahe an Durchgangsbohrung 3 und Vertiefung 4 liegt.
Wie oben beschrieben, kann die Spitze von Rohr 11 einfach an einer bestimmten, vorgegebenen Stelle positioniert werden, ohne durch die Oberflächenspannung von Kulturlösung 22, die Behälter 2 füllt, beeinträchtigt zu werden. Die Wandfläche von Durchgangsbohrung 6 dient nämlich als die Führung für Rohr 11. Dadurch kann jederzeit auf stabile Weise Arzneimittel abgegeben werden.
Da die Wand 10 schüsselförmig ist, kann das Arzneimittel einfach in das Innere von Topf 9 injiziert werden. Daher kann selbst dann, wenn ein Druck zur Abgabe des Arzneimittels durch Rohr 11 niedrig ist, das Arzneimittel mit Sicherheit die Nachbarschaft von Zelle 21 erreichen, die an Vertiefung 4 gehalten wird. Zelle 21 würde nicht verse hentlich belastet, und eine resultierende Vibration, die durch eine druckbeaufschlagte Zelle 21 verursacht werden könnte, kann verhindert werden. Die schüsselförmige Wand 10 hat die Funktion eines Führungsabschnittes zur Führung von Arzneimittel in Topf 9.
Da Durchgangsbohrung 5 so ausgelegt ist, dass sie größer ist als die Öffnung von Topf 9, bedeckt die untere Seite von Behälter 2 nicht die Schüsselkontur von Topf 9. So kann das Arzneimittel einfach in den unteren Teil von Topf 9 injiziert werden.
Vorzugsweise ist Rohr 11 aus einem Material hergestellt, das aus einer Gruppe bestehend aus einem Harz, einem Glas und Silika ausgewählt ist. Diese Materialien sind elektrisch isolierend, so dass das Einführen eines solchen Materials in Behälter 2 nicht unbeabsichtigt eine Störung bei dem Potential von Kulturlösung 22 auslösen würde.
Als Nächstes, wie in 9 gezeigt, kann Wand 10A von Topf 9A in einer Spiralform ausgebildet sein. Die Spiralform von Wand 10A erleichtert homogenes Mischen des abgegebenen Arzneimittels mit der in Topf 9A befindlichen Kulturlösung 22, selbst wenn ein niedriger Abgabedruck für das Arzneimittel injiziert wird und die Einfließgeschwindigkeit niedrig ist. Messelement 1A mit spiralförmiger Wand 10A ist vorteilhaft bei der Durchführung von Messungen mit hoher Genauigkeit mit einem möglichst geringen Streubereich.
Die Wand 10B von Topf 9B kann stattdessen in einem radialen Muster ausgebildet sein, das in Richtung Mitte gerichtet ist, wie in 10 gezeigt. Das radiale Muster von Wand 10B erleichtert homogenes Mischen des abgegebenen Arzneimittels mit der in Topf 9B befindlichen Kulturlösung 22, selbst wenn ein niedriger Abgabedruck für das Arzneimittel injiziert wird und die Einfließgeschwindigkeit niedrig ist. Messelement 1B mit radialer Wand 10B bietet dieselben Vorteile wie diejenigen, die von der spiralförmigen Wand geboten werden. Die spiralförmige Wand 10A oder die radiale Wand 10B hat die Funktion eines Führungsabschnitts zum Führen von Arzneimittel in Topf 9A, beziehungsweise 9B, auf dieselbe Weise wie die schüsselförmige Wand 10.
Die Größe von Vertiefung 4 kann je nach Subjektzelle 21 verändert werden; für die Vertiefung 4 ist jede Größe geeignet, sofern sie Zelle 21 innerhalb von Vertiefung 4 zurück behalten kann. Typische Abmessungen für Vertiefung 4 sind: 10–500 Mikron für den Durchmesser, 1–500 Mikron für die Tiefe. Bevorzugt sind 10–100 Mikron für den Durchmesser und 2–100 Mikron für die Tiefe. Noch bevorzugte Abmessungen für Vertiefung 4 sind: 20 Mikron für den Durchmesser und 10 bis 20 Mikron für die Tiefe.
Die Größe von Durchgangsbohrung 3 kann außerdem je nach Subjektzelle 21 geändert werden, wie dies bei Vertiefung 4 der Fall ist. Jede Größe wäre für die Größe von Durchgangsbohrung 3 geeignet, sofern sie Zelle 21 innerhalb von Vertiefung 4 zurück behalten kann. Übliche Abmessungen für Durchgangsbohrung 3 sind: 5–100 Mikron für den Durchmesser, 10 Nanometer–100 Mikron für die Tiefe. 5 Mikron für den Durchmesser und 1,5 Mikron für die Tiefe werden bevorzugt.
Im Folgenden wird ein Verfahren zum Messen extrazellulären Potentials unter Verwendung von Vorrichtung 51 beschrieben.
Arzneimittel wird über Rohr 11 in die in Behälter 2 enthaltene Kulturlösung abgegeben. Das Arzneimittel verbreitet sich innerhalb von Kulturlösung 22 und in die Nachbarschaft von Zelle 21, die an Vertiefung 4 gehalten wird.
Wenn Zelle 21 von dem Arzneimittel aktiviert wird, erhöht sich die Häufigkeit der Ionenaustausche, während derer Ionenaustausch der Zelle 21 Ionen wie beispielsweise Na⁺, K⁺, Ca²⁺ und so weiter durch einen Ionenkanal innerhalb der Zellmembran (nicht dargestellt) aufnimmt und abgibt. Der Ionenaustausch ist eine elektrochemische Veränderung, die dadurch ausgelöst wird, dass Zelle 21 auf das Arzneimittel reagiert.
Die erhöhte Frequenz des Ionenaustauschs führt dazu, dass sich die Ionenkonzentration innerhalb von Kulturlösung 22 in der Nachbarschaft von Zelle 21, oder in der Innenseite von Durchgangsbohrung 3 verändert, was eine Änderung des Potentials zur Folge hat. Währenddessen hat Kulturlösung 22 in Durchgangsbohrung 3 normalerweise einen elektrischen Widerstand von 5 Megaohm oder größer, und ist von der in Behälter 2 befindlichen Kulturlösung 22 isoliert. Daher kann eine Änderung der Ionenkonzentration oder des Potentials, die in der Durchgangsbohrung 3 stattfindet, von Detektionselektrode 8 in Form eines elektrischen Signals aufgenommen werden.
Die Frequenz des zwischen Zelle 21 und Kulturlösung 22 stattfindenden Ionenaustauschs variiert je nach Art der Zelle 21. Im Allgemeinen ist jedoch das Phänomen des Ionenaustauschs nicht mit einer bestimmten spezifischen Phase synchronisiert, sondern es wird davon ausgegangen, dass es an jeweiligen Ionenkanälen mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit durchgeführt wird. Die elektrischen Signale werden nämlich nicht nur bei einer bestimmten, spezifischen Frequenz beobachtet, sondern die Frequenz der erfassten Signale weist einen großen Bereich auf, vom Gleichstrombereich bis zu ungefähr 5 kHz. Die von Zelle 21 erzeugten elektrischen Signale haben zufällige Frequenzeigenschaften.
11 zeigt den Fluss einer Messung von extrazellulärem Potential. Das elektrische Signal 62 wird an Detektionselektrode 8, einem Erfassungsabschnitt, als Spannung oder Strom erfasst. Das erfasste elektrische Signal 62 wird durch Verstärker 63 verstärkt. Das verstärkte elektrische Signal 64 wird eine gewisse Zeit lang am schnellen Fourier-Transformator (FFT) 65 akkumuliert, um einen Wechsel des Frequenzbereichs durchzuführen. Die Signalstärke 66 in dem Frequenzbereich wird von Computer 67 in einem bestimmten spezifischen Intervall angezeigt. Auf diese Weise wird das an Detektionselektrode 8 gemessene elektrische Signal 62 dem Frequenzwechsel unterzogen, und dann von einem Computer angezeigt und visualisiert.
Rauschen von außen weist eine regelmäßige Frequenzeigenschaft auf. Daher kann ein von Zelle 21 erzeugtes elektrisches Signal visuell an dem Frequenzbereich durch die Analyse von Signalstärke 66 von dem Rauschen unterschieden werden. Somit kann das von Zelle 21 erzeugte elektrische Signal selbst dann, wenn Störgeräusche von einer externen Energiequelle kommen, einfach von den Störgeräuschen unterschieden und erkannt werden. Daher kann ein Verfahren zum Messen extrazellulären Potentials in der vorliegenden Erfindung eine von dem Arzneimittel verursachte Änderung der Reaktion von Zelle 21 genau einfangen.
12 ist ein Eigenschaftsdiagramm, das Messdaten, die durch ein Verfahren zum Messen extrazellulärem Potential bereitgestellt wurden, darstellt. In 12 stellt die horizontale Achse die Messdauer in der Einheit von einer Sekunde dar, während die vertikale Achse die Frequenz darstellt. Außerdem werden die Signalstärken zum Zeitpunkt der Messung in Dichte abgebildet (Umrissskizze). Unter Bezugnahme auf 12 zeigen Signal 72 und Signal 73 horizontale Linien. Dies bedeutet, dass Signal 72 und Signal 73 regelmäßige Frequenzeigenschaften aufweisen; diese Signale sind nämlich Störgeräusche aus einer externen Stromquelle oder ähnlichen Quellen. Signal 71 und Signal 74 haben nicht solche regelmäßigen Frequenzeigenschaften, was bedeutet, dass diese Signale die elektrischen Signale sind, die aufgrund von Änderungen in der Ionenkonzentration in der Nachbarschaft von Zelle 21 erzeugt wurden.
Als Nächstes wird ein Verfahren zur Herstellung von Vorrichtung 51 zum Messen extrazellulären Potentials gemäß einem ersten beispielhaften Ausführungsbeispiel beschrieben. 13 und 16 bis 20 zeigen Querschnittsansichten von Messelement 1 zur Beschreibung eines Verfahrens zur Herstellung von Vorrichtung 51 zum Messen extrazellulären Potentials. 14 und 15 sind vergrößerte Querschnittsansichten, die einen Teil von Messelement 1 darstellen, um ein Verfahren zur Herstellung von Vorrichtung 51 zum Messen extrazellulären Potentials zu beschreiben. 21 ist eine Querschnittsansicht zur Beschreibung eines Verfahrens zur Herstellung von Vorrichtung 51 zum Messen extrazellulären Potentials.
Wie 13 verdeutlicht, weist Substrat 40 einen laminierten Körper auf, der aus Basis 41, Zwischenschicht 42 und dünner Platte 43 gebildet wird. Basis 41 und dünne Platte 43 bestehen aus Silizium, während Zwischenschicht 42 aus Siliziumdioxid besteht. Lackmaske 44, die ein bestimmtes, spezifisches Muster aufweist, ist auf Substrat 40 an der Oberflächenseite der dünnen Platte 43 bereitgestellt. Das Material für Substrat 40 wird allgemein als SOI-Substrat bezeichnet, welches Substrat häufig zur Herstellung von Halbleitervorrichtungen verwendet wird. Dies bedeutet, dass das Material überall leicht erhältlich ist, so dass eine Beschreibung des Verfahrens zur Herstellung von Substrat 40 hier entbehrlich ist.
Zunächst wird Durchgangsbohrung 3 durch Trockenätzungsverfahren an der dünnen Platte 43 bis zu einer bestimmten vorgegebenen Tiefe ausgebildet, wie in 14 gezeigt. Das am besten geeignete Verfahren zum Bereitstellen von Durchgangsbohrung 3 ist das Trockenätzverfahren. Bei dem Trockenätzverfahren werden ein Gas zur Beschleunigung der Ätzwirkung (Beschleunigungsgas) und ein Gas zur Verlangsamung der Ätzwirkung (Bremsgas) verwendet (nicht dargestellt). Typische Beschleunigungsgase sind XeF₂, CF₄, SF₆. Typische Bremsgase sind CHF₃, C₄F₈. Durch Verwendung eines Gemisches aus Beschleunigungsgas und Bremsgas für das Trockenätzen wird die Wandoberfläche der geätzten Bohrung mit einer Schutzschicht bedeckt, die ein Polymer von CF₂ ist. Die Schutzschicht, die sich gebildet hat und die Wandfläche einer Bohrung bedeckt, schränkt Ätzen gegen die Wandfläche ein. Im Ergebnis schreitet die Ausbildung von Durchgangsbohrung 3 anisotrop nur in von Lackmaske 44 aus senkrechter Richtung fort.
Der Mechanismus anisotropen Ätzens, das nur in abwärts gerichteter Richtung fortschreitet, wird genauer beschrieben.
Im Ätzschritt geringer Ätzfortschritt mit dem Beschleunigungsgas. Anschließend folgt Ausbildung einer Schutzschicht durch das Bremsgas, um im Schutzschicht-Ausbildungsschritt ein klein wenig eine Schutzschicht bereitzustellen. Auf diese Weise werden der Ätzvorgang und die Ausbildung der Schutzschicht im Wechsel wiederholt und eine Bohrung wird in im Wesentlichen senkrechter Richtung geätzt und eine Schutzschicht wird bereitgestellt, um die Wandfläche zu bedecken.
Während des Ätzvorgangs befindet sich Substrat 40 in einem Milieu aus Plasma, das durch induktive Kopplung einer externen Spule erzeugt wird, und an Substrat 40 wird eine Hochfrequenzspannung angelegt. In der oben genannten Umgebung ergibt sich in Substrat 40 die negative Vorspannung, und das positive Ion in dem Plasma, SF₅ ⁺ oder CF₃ ⁺, stößt gegen Substrat 40. Dadurch schreitet die Trockenätzung in vertikaler Richtung abwärts voran, und Durchgangsbohrung 3 wird ausgebildet.
Während der Bildung der Schutzschicht wird andererseits an Substrat 40 keine Hochfrequenzspannung angelegt. Dann wird an Substrat 40 keine Vorspannung erzeugt, so dass das positive Ion in dem Plasma nicht abgelenkt wird, und die Trockenätzung gebremst wird. Eine frische, neue Oberfläche, die aufgrund des Ätzvorgangs erschienen ist, wird dem Material für die Schutzschicht, CF⁺, ausgesetzt. Infolgedessen wird die aufgrund der Trockenätzung bereitgestellte Wandoberfläche von Durchgangsbohrung 3 gleichmäßig mit Schutzschicht 75 bedeckt. In einem Trockenätzungsversuch wurde SF₆ als Beschleunigungsgas, C₄F₈ als Bremsgas verwendet, und die Bildung von Durchgangsbohrung 3 und Schutzschicht 75 wurde bestätigt.
Wie oben beschrieben, schreitet die Bildung der Durchgangsbohrung 3 in der Tiefenrichtung von Lackmaske 44 voran, wenn zur Bereitstellung der Durchgangsbohrung 3 das Trockenätzverfahren mit dem Beschleunigungsgas und dem Bremsgas eingesetzt wird. Das Bremsgas dient hingegen dazu, Schutzschicht 75 bereitzustellen, die die Wandoberfläche von Durchgangsbohrung 3 bedeckt.
Anschließend wird nur unter Verwendung von XeF₂ oder einem ähnlichen Beschleunigungsgas trocken geätzt, wie in 15 gezeigt. Beschleunigungsgas ätzt nicht die auf der Wandoberfläche von Durchgangsbohrung 3 gebildete Schutzschicht 75; das Gas ätzt nur die Silizium-Oberfläche an dem Boden von Durchgangsbohrung 3. Da das Beschleunigungsgas Siliziumdioxid nicht ätzt, wird Zwischenschicht 42 nicht geätzt. Im Ergebnis wird Vertiefung 4 für eine Größe ausgebildet, die größer ist als Durchgangsbohrung 3.
Anschließend wird unter Verwendung von Lackmaske 45 geätzt, die auf der Oberfläche an der Seite von Basis 41 bereitgestellt ist, wie in 16 gezeigt. Diese Ätzung bildet Topf 9 aus, wie in 17 dargestellt. Das zur Ausbildung von Topf 9 verwendete Ätzverfahren ist eine Trockenätzung, die nur das Beschleunigungsgas, beispielsweise XeF₂, SF₆, verwendet. Dadurch wird Seitenwand 10 von Topf 9 in einer Schüsselform ausgebildet.
Um Topf 9 in einer Spiralform oder einer Radialform auszubilden, werden jeweils speziell dafür vorgesehene Ätzmasken verwendet. In diesem Fall enthält das Ätzgas neben dem Beschleunigungsgas auch das Bremsgas.
Anschließend wird, wie in 18 gezeigt, Zwischenschicht 42 durch ein allgemein verwendetes Ätzverfahren, Nassätzverfahren oder Trockenätzverfahren, weg geätzt.
Anschließend wird Lackmaske 45 entfernt. Des Weiteren wird, wie in 19 gezeigt, Oxidschicht 46 durch ein allgemein verwendetes thermisches Oxidationsverfahren gebildet, und bedeckt die Siliziumoberfläche. Das thermische Oxidationsverfahren wird dann verwendet, wenn der Oberflächenwiderstand von Silizium so hoch wie möglich sein soll. In anderen Fällen, wo solch ein hoher Oberflächenwiderstand nicht notwendig ist, reicht eine natürliche Oxidschicht aus, die sich auf der Siliziumoberfläche gebildet hat.
Anschließend wird, wie in 20 gezeigt, Substrat 40 mit Detektionselektrode 8 versehen, die auf der Oberfläche der Seite der dünnen Platte 43 durch einen Sputtervorgang, einen Vakuumbedampfungsvorgang, oder einen ähnlichen normalen Vorgang zur Ausbildung eines dünnen Films unter Verwendung von Au, Al, Ti, Cr und so weiter ausgebildet wird.
Nach der Bearbeitung von Substrat 40 durch verschiedene Bearbeitungsschritte, wie oben beschrieben, wird Messelement 1 hergestellt. Die Verwendung eines SOI-Substrats, das einen laminierten Körper aus Silizium und Siliziumdioxid aufweist, für Substrat 40 ermöglicht es, das Substrat mit einem hohen Präzisionsgrad durch im Wesentlichen einfache und leichte Arbeitsgänge zu bearbeiten. Daher kann Messelement 1 effizient hergestellt werden.
Schließlich werden, wie in 21 gezeigt, Messelement 1 und Behälter 2 unter Verwendung von Klebstoff 50 oder eines anderen Mittels zusammengeklebt. Behälter 2 kann durch ein Harzpressverfahren oder durch andere üblicherweise verwendete Verfahren bereitgestellt werden; somit wird auf eine Beschreibung darüber hier verzichtet. Behälter 2 sollte vorzugsweise aus einem elektrisch isolierenden Material bestehen, so dass Kulturlösung 22 in Behälter 2 keine unbeabsichtigte Änderung des Potentials erfährt, und die Messung nicht beeinträchtigt wird.
Referenzelektrode 7 und Rohr 11 werden zur Durchführung der Messung eingeführt.
Obwohl die obigen Beschreibungen auf der Verwendung von laminiertem Substrat 40 für Messelement 1 basieren, das aus Silizium und Siliziumdioxid besteht, ist das Material für die Zwischenschicht 42 nicht auf Siliziumdioxid beschränkt. Diejenigen anderen Materialien, die im Verhältnis zu Siliziumbasis 41 und dünner Platte 43 schwieriger zu ätzen sind, und die über eine hohe elektrisch isolierende Eigenschaft verfügen, können für die Zwischenschicht 42 verwendet werden. Beispielsweise kann ein Glasmaterial, das Siliziumdioxid enthält, als Zwischenschicht 42 verwendet werden.
Zweites Ausführungsbeispiel
Das zweite beispielhafte Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird unter Bezugnahme auf 22 bis 27 beschrieben. Jene Abschnitte, die dieselbe Struktur aufweisen wie diejenigen des ersten Ausführungsbeispiels, werden unter Verwendung derselben Symbole bezeichnet. 22 ist eine teilweise ausgeschnittene Perspektivansicht einer Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel. 23 ist eine teilweise ausgeschnittene Perspektivansicht des in 22 abgebildeten Behälters. 24 ist eine teilweise ausgeschnittene Perspektivansicht eines Messelements. 25 ist eine vergrößerte Perspektivansicht, die das Messelement aus 24 darstellt, wobei ein Teil des Elements ausgeschnitten ist.
Unter Bezugnahme auf 22 wurde Vorrichtung 81 zum Messen extrazellulären Potentials (Vorrichtung 81) durch Anbringen von Messelement 12 an dem Boden von Behälter 13 konstruiert. Behälter 13 besteht aus einem elektrisch isolierenden Harzmaterial und verfügt über eine Referenzelektrode 7, die in das Innere des Behälters gesetzt ist, um ein Potential innerhalb von Behälter 13 zu messen.
Messelement 12 hat einen laminierten Körper aus Silizium und Siliziumdioxid. Das Messelement 12 weist an dem unteren Teil einen Öffnungsabschnitt 20 auf. Detektionselektrode 19 befindet sich an einer unteren Fläche von Messelement 12. Die untere Fläche von Messelement 12 wird durch Bereitstellen von Öffnungsabschnitt 20 gebildet. Messelement 12 verfügt an der oberen Fläche über Vertiefung 4. Eine erste Mikro-Durchgangsbohrung (Durchgangsbohrung) 3 ist ausgebildet und durchdringt den Boden von Vertiefung 4 und die untere Fläche von Messelement 12, wo Detektionselektrode 19 angeordnet ist.
Behälter 13 weist an dem Boden zweite Durchgangsbohrung (Durchgangsbohrung) 14 auf. Wand 15 von Durchgangsbohrung 14 ist schüsselförmig. Topf 17 wird durch die obere Fläche von Messelement 12 gebildet, das so angebracht ist, dass es den Boden von Behälter 13, Durchgangsbohrung 14 und Wand 15 kontaktiert. Ein Unterschied im Vergleich zu dem ersten Ausführungsbeispiel ist der Aufbau von Topf 17.
Des Weiteren ist eine dritte Durchgangsbohrung 6 in der Seitenwand von Behälter 13 bereitgestellt. In der Annahme, dass Messelement 12 an dem Boden von Gehäuse 13 befestigt wird, ist Durchgangsbohrung 6 in einer radialen Richtung angeordnet, die von einem bestimmten, spezifischen Ort in der Nachbarschaft von Durchgangsbohrung 3 und Vertiefung 4 ausgeht.
Das Verfahren zur Verwendung von Vorrichtung 81 und das Verfahren zum Messen extrazellulären Potentials unter Verwendung der Vorrichtung bleiben im Wesentlichen dieselben wie jene Verfahren in dem ersten Ausführungsbeispiel.
Die schüsselförmige Wand 15 stellt sicher, dass das Arzneimittel in die Umgebung von der in Vertiefung 4 gehaltenen Subjektzelle 21 dringt, selbst wenn die Fließgeschwindigkeit für die Abgabe des Arzneimittels verlangsamt ist. Wie in dem ersten Ausführungsbeispiel tritt keine Veränderung in dem Fluss von Kulturlösung 22 in der Nachbarschaft von Zelle 21 auf. Somit kann die Messumgebung stabil gehalten werden. Die schüsselförmige Wand 15 agiert nämlich als ein Führungsabschnitt zum Führen des Arzneimittels in einen Boden von Topf 17.
Wenn, wie in 26 gezeigt, Wand 23A mit einer in Richtung Mitte von Durchgangsbohrung 14A ausgerichteten Spiralform am Boden von Behälter 13A bereitgestellt ist, wird das in Kulturlösung 22 abgegebene Arzneimittel selbst dann homogen gemischt, wenn die Einfließgeschwindigkeit des Arzneimittels noch einen weiteren Schritt weit verlangsamt wird. Daher ist Wand 23A vorteilhaft für die Durchführung hochgenauer Messungen mit geringerem Streubereich.
Wenn des Weiteren, wie in 27 gezeigt, Wand 23B mit einer in Richtung Mitte von Durchgangsbohrung 14B ausgerichteten Radialform am Boden von Behälter 13B bereitgestellt ist, stellt sie denselben Vorteil für die Durchführung der hochgenauer Messungen bereit. Sowohl die spiralförmige Wand 23A als auch die radialförmige Wand 23 agieren als ein Führungsabschnitt zum Führen des Arzneimittels in Topf 17, auf dieselbe Art und Weise, wie die schüsselförmige Wand 15.
Öffnungsabschnitt 20 ist kein wesentlicher Punkt. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel wurde Öffnungsabschnitt 20 zu dem Zweck bereitgestellt, eine gute Balance zwi schen einer Dicke von Messelement 12, die benötigt wird, um eine ausreichende mechanische Stärke zu gewährleisten, und einer Tiefe von Durchgangsbohrung 3 zu erzeugen. Daher ist Öffnungsabschnitt 20 nicht notwendig, wenn ein dünnes Messelement 12 steif genug ist.
Nachfolgend wird ein Verfahren zur Herstellung von Vorrichtung 81 zum Messen extrazellulären Potentials gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel beschrieben. 28 bis 34 sind Querschnittsansichten von Messelement 12 und dienen dazu, ein Verfahren zur Herstellung von Vorrichtung 81 zum Messen extrazellulären Potentials darzustellen. 35 ist eine Querschnittsansicht, die dazu dient, ein Verfahren zur Herstellung von Vorrichtung 81 zum Messen extrazellulären Potentials darzustellen.
Wie in 28 gezeigt, wird Substrat 25 aus Basis 26, Zwischenschicht 27 und dünner Platte 28 gebildet. Das Material für sowohl Basis 26 als auch dünne Platte 28 ist Silizium, während die Zwischenschicht 27 aus Siliziumdioxid ist. Substrat 25 ist mit Lackmaske 29 versehen, die auf der Fläche der Seite der Basis 26 ausgebildet ist. Substrat 25 ist ein SOI-Substrat, das häufig zur Herstellung der Halbleitervorrichtungen verwendet wird. Dies bedeutet, dass das SOI-Substrat überall leicht verfügbar ist, so dass das Verfahren zur Herstellung des Substrats hier entbehrlich ist.
Basis 26 wird durch ein allgemein angewandtes Ätzverfahren, wie beispielsweise Trockenätzen oder Nassätzen, geätzt, um Öffnungsabschnitt 20 auszubilden, wie in 29 gezeigt.
Anschließend wird, wie in 30 dargestellt, Substrat 25 auf der Oberfläche der dünnen Platte 28 mit der ein spezifisches Muster bildenden Lackmaske 30 versehen.
Wie in 31 gezeigt, wird danach Substrat 25 von der Fläche der Seite der dünnen Platte 28 aus trockengeätzt. Das zum Ätzen verwendete Beschleunigungsgas ist SF₆, CF₄, XeF₂ und so weiter. Wenn Silizium von dem Beschleunigungsgas geätzt wird, schreitet die Ätzung nicht nur in Richtung Tiefe fort, sondern sie schreitet auch in Richtung Breite voran. Dieses Phänomen wurde bei einer experimentellen Ätzung unter Verwendung von XeF₂ bestätigt. Infolgedessen nimmt die Ätzung, wie in 31 gezeigt, eine halbkugelförmige Form an, die konzentrisch mit dem offenen Bereich von Lackmaske 30 ist, und Vertiefung 4 wird ausgebildet. Da die Lackmaske 30 durch XeF₂ kaum geätzt wird, behält die Maske ihre ursprüngliche Form bei.
Wie in 32 gezeigt, wird von der Fläche der Seite der dünnen Platte 28 aus erneut geätzt, wobei ein Gemisch aus Beschleunigungsgas und Bremsgas verwendet wird. Dadurch schreitet der Ätzvorgang anisotrop nur in vertikaler Richtung nach unten fort, so dass Durchgangsbohrung 3 gebildet wird, ausgehend von dem Boden von Vertiefung 4.
Wie in 33 gezeigt, wird als Nächstes die aus Siliziumdioxid bestehende Zwischenschicht 27 durch ein allgemein verwendetes Ätzverfahren wie beispielsweise Nassätzen, Trockenätzen und so weiter, von Basis 26 aus weggeätzt. Danach wird Lackmaske 30 auch entfernt.
Wie in 34 gezeigt, wird anschließend Substrat 25 mit Detektionselektrode 19 versehen, die auf der Fläche der Seite von Basis 26 durch eine allgemein verwendete Technologie zur Dünnfilmbildung unter Verwendung eines Materials, das als Hauptbestandteil Au aufweist, gebildet wird. Messelement 12 wird durch die oben beschriebenen Schritte hergestellt. Je nach Bedarf kann der thermische Oxidationsvorgang vor Ausbildung von Detektionselektrode 19 eingeleitet werden, um Oxidschicht 46 auszubilden, die die Siliziumoberfläche bedeckt.
Wie in 35 gezeigt, wird Messelement 12 dann unter Verwendung von Klebstoff 50 oder anderen Mitteln mit der Fläche der Seite der dünnen Platte 28 nach oben an den Boden von Gehäuse 13 geklebt, wobei das Gehäuse bereits separat mit einem Harzmaterial hergestellt wurde. Gehäuse 13 kann mit einem üblicherweise verwendeten Mittel wie beispielsweise Pressformen, Formen mit optischen Mitteln, spanende Bearbeitung und so weiter gefertigt werden. Durchgangsbohrung 14 an dem Boden und Durchgangsbohrung 6 in der Seitenwand von Gehäuse 13 können unter Verwendung dieser Technologien in eine gewünschte Form gebracht werden. Die Ausbildung von Durchgangsbohrung 14 und Durchgangsbohrung 6 stellt keine besondere Schwierigkeit dar, so dass hier an diesem Punkt keine Beschreibung geliefert wird.
Vorrichtung 81 zum Messen extrazellulären Potentials im vorliegenden zweiten Ausführungsbeispiel wird auf diese Weise hergestellt.
Obwohl die obigen Beschreibungen für die Herstellung von Messelement 1 auf der Verwendung von laminiertem Substrat 25 basieren, das aus Silizium und Siliziumdioxid besteht, ist das Material für die Zwischenschicht 27 nicht auf Siliziumdioxid beschränkt. Andere Materialien, die im Verhältnis zu Siliziumbasis 26 und dünner Platte 28 schwieriger zu ätzen sind, und die mit einer hohen elektrisch isolierenden Eigenschaft ausgestattet sind, können für die Zwischenschicht 27 verwendet werden. Beispielsweise kann ein Glasmaterial, das Siliziumdioxid enthält, als Zwischenschicht 27 verwendet werden.
Drittes Ausführungsbeispiel
Das dritte beispielhafte Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird unter Bezugnahme auf 36 bis 38 beschrieben. Diejenigen Abschnitte, die dieselbe Struktur aufweisen wie jene des ersten Ausführungsbeispiels werden unter Verwendung derselben Symbole bezeichnet.
36 ist eine Querschnittsansicht, die die Struktur einer Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials gemäß dem dritten Ausführungsbeispiel zeigt.
Die Offenbarungen in dem vorliegenden dritten Ausführungsbeispiel gelten für die Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials des ersten Ausführungsbeispiels oder des zweiten Ausführungsbeispiels und bieten dieselben Vorteile.
Der Unterschied zwischen dem dritten Ausführungsbeispiel und dem ersten Ausführungsbeispiel besteht darin, dass, wie in 36 und 38 gezeigt, ein Teil der Detektionselektrode 8 auf Messelement 38 mit Isolationsschicht 31 bedeckt ist. Im Ergebnis ist Detektionselektrode 8 nur an einer Fläche in der Nähe von Durchgangsbohrung 3 freigelegt. Die freigelegte Fläche von Detektionselektrode 8 ist Öffnungsabschnitt 37. Des Weiteren ist das aus einem Glasmaterial bestehende Isolationssubstrat 39 bereitgestellt, um Detektionselektrode 8 zu bedecken, wobei ein gewisser Spalt dazwischen vorhanden ist.
Das Verfahren des Erfassens extrazellulären Potentials bleibt dasselbe wie in dem ersten Ausführungsbeispiel. Somit wird in dieser Hinsicht keine Beschreibung geliefert.
Nachfolgend wird der Vorteil beschrieben, eine Isolationsschicht 31 auf der Oberfläche von Detektionselektrode 8 zu haben, sowie der Vorteil, Isolationssubstrat 39 zu haben.
Wie bereits in dem ersten Ausführungsbeispiel unter Bezugnahme auf 4 und 5 beschrieben, fließt Kulturlösung 22 auch zu der Seite der Detektionselektrode 8 aus. Dann kommt die ausgeflossene Kulturlösung 22 an der freigelegten Fläche in Kontakt mit Detektionselektrode 8.
Ein Bereich, in dem sich die Ionenkonzentration oder das Potential aufgrund von Ionenaustausch von Zelle 21 ändern, ist nur auf den Bereich begrenzt, der sehr dicht bei Zelle 21 ist. Dies bedeutet, die Potentialänderungen sind nur auf die Nachbarschaft von Durchgangsbohrung 3 beschränkt. Die von Detektionselektrode 8 erfasste Änderung des Potentials von Kulturlösung 22 ist jedoch nicht auf diejenige beschränkt, die in der Nachbarschaft von Durchgangsbohrung 8 stattfindet. Angenommen, das Potential hat sich beispielsweise in einem von der Durchgangsbohrung 3 entfernten Bereich (beispielsweise im eingekreisten Bereich C in 4) aufgrund eines Rauschens, das für die Aktivität von Zelle 21 irrelevant ist, geändert, dann erfasst Detektionselektrode 8 auch die von dem Rauschen verursachte Änderung des Potentials. Dann stellt ein von der Detektionselektrode 8 erfasstes elektrisches Signal den Durchschnitt der aufgrund von Ionenaustausch durch Zelle 21 erfolgten Änderung des Potentials und derjenigen, die durch Rauschen verursacht wurde, dar. Im Ergebnis ist es schwierig, nur die Potentialänderung aufgrund des Ionenaustauschs von Zelle 21 genau zu erfassen.
Daher ist Detektionselektrode 8 teilweise mit Isolationsschicht 31 bedeckt, wie in 36 gezeigt, wodurch nur die begrenzte Fläche, die sehr dicht an dem Öffnungsabschnitt 37 liegt, freigelegt ist. Dadurch erfasst Detektionselektrode 8 nicht eine Änderung des Potentials aufgrund von Rauschen (beispielsweise eine Änderung, die in dem eingekreisten Bereich D in 36 stattfindet). Daher liefert die Vorrichtung stabile Messdaten, ohne durch Störfaktoren beeinträchtigt zu werden.
Je kleiner die freigelegte Fläche von Detektionselektrode 8, desto weniger wird sie von Rauschen beeinträchtigt und stabile Messdaten werden verfügbar gemacht. Um stabile Messdaten zu erhalten, sollte eine mit Isolationsschicht 31 bedeckte Fläche von Detek tionselektrode 8 vorzugsweise größer sein als eine freigelegte Fläche von Detektionselektrode 8.
Des Weiteren unterdrückt Isolationssubstrat 39 die Fluktuation bei Kulturlösung 22 auf der Seite von Detektionselektrode 8; dadurch reduziert es Rauschen aufgrund von Fluktuation bei Kulturlösung 22. In Vorrichtung 51 aus 4 ist nämlich die Kulturlösung 22 auf der Seite der Detektionselektrode 8 der Umgebungsluft ausgesetzt. Wenn sie nun durch eine äußere Vibration beeinträchtigt wird, oder wenn sich der Umgebungsdruck während des Messvorgangs geändert hat, kann die Kulturlösung 22 manchmal Fluktuationen an der Oberfläche verursachen. Die Fluktuation an der Oberfläche erzeugt einen Strom innerhalb von Kulturlösung 22. Dann wird ein Strom auch in Kulturlösung 22 in der Nachbarschaft von Durchgangsbohrung 3 erzeugt. Dies kann zu einem Rauschen führen. Daher ist es für Detektionselektrode 8 schwierig, die Änderung der Ionenkonzentration oder des Potentials aufgrund von Ionenaustausch durch Zelle 21 genau zu messen.
Des Weiteren kann eine in der Nachbarschaft von Durchgangsbohrung 3 aufgetretene Änderung des Drucks manchmal Auswirkungen auf einen Druck haben, der Zelle 21 hält. Wenn Zelle 21 eine Druckänderung erlebt, ändert sich auch ein elektrischer Isolationswiderstand, der Durchgangsbohrung 3 von Gehäuse 2 trennt. Gleichzeitig ändert Zelle 21 ihren eigenen Zustand elektrischer Aktivität, wenn Zelle 21 einer Druckänderung ausgesetzt wird. Das an Detektionselektrode 8 erfasste elektrische Signal ändert sich in Abhängigkeit von einer Änderung des Isolationswiderstands oder einer Änderung des Zustands elektrischer Aktivität von Zelle 21 selbst. Im Ergebnis ist es schwierig, eine Änderung des Potentials aufgrund von Ionenaustausch genau zu messen, der dadurch verursacht wird, dass Zelle 21 auf das Arzneimittel reagiert.
In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ist Isolationssubstrat 39 bereitgestellt und kontaktiert die Oberfläche von Detektionselektrode 8 mit einem bestimmten Spalt dazwischen, wie in 36 gezeigt. Kulturlösung 22, die auf die Seite der Detektionselektrode 8 ausgeflossen ist, befindet sich nur zwischen Messelement 38 und Isolationssubstrat 39; daher ist die Kulturlösung 22 nicht direkt der Umgebungsluft ausgesetzt. Auf diese Weise wird sie am wenigsten durch äußere Kräfte beeinflusst. Selbst wenn wäh rend eines Messvorgangs eine äußere Vibration oder eine Änderung in dem Umgebungsdruck stattfindet, tritt keine Fluktuation bei der Oberfläche von Kulturlösung 22 auf.
Daher erfasst Messvorrichtung 91 extrazelluläres Potential genau und mit einer guten Stabilität. Um das Potential von Kulturlösung 22 nicht in eine unbeabsichtigte Instabilität zu bringen, besteht das Isolationssubstrat vorzugsweise aus einem elektrisch isolierenden Material.
Im Folgenden wird nun ein Verfahren zur Herstellung von Vorrichtung 91 gemäß dem dritten Ausführungsbeispiel beschrieben. Da das vorliegende dritte Ausführungsbeispiel Substrat 40 verwendet, dessen Herstellungsverfahren bereits in dem ersten Ausführungsbeispiel beschrieben wurde, werden die in dem ersten Ausführungsbeispiel (13 bis 20) beschriebenen Schritte des Herstellungsverfahrens hier nicht wiederholt.
Zunächst wird Substrat 40 wie in 20 gezeigt vorbereitet, welches bereits mit einer darauf ausgebildeten Detektionselektrode 8 versehen worden ist. Anschließend, wie in 36 gezeigt, wird Substrat 40 mit einem durch Sputtern, Vakuumbedampfen, Aufschleudern oder durch andere Verfahren darauf aufgetragenen elektrisch isolierenden Material mit einer auf der Fläche der Seite von Detektionselektrode 8 ausgebildeten Isolationsschicht 31 versehen. Polyimid, Fluorharz, Siliziumdioxid und so weiter können für das elektrisch isolierende Material verwendet werden.
Anschließend wird, wie in 38 gezeigt, der nicht notwendige Teil von Isolationsschicht 31 unter Verwendung einer Harzmaske, oder durch ein anderes geeignetes Verfahren weg geätzt, um Isolationsschicht 31 in einem bestimmten, spezifischen Muster auszubilden. Dadurch erhält man Messelement 38, dessen Detektionselektrode 8 nur in einer begrenzten Fläche in der Nachbarschaft von Durchgangsbohrung 3 freigelegt ist.
Anschließend wird Messelement 38 mit der Fläche von der Seite der Detektionselektrode 8 nach unten unter Verwendung von Klebstoff 50 oder anderen Mitteln an den Boden von Gehäuse 2 geklebt. Und dann, wie in 36 gezeigt, wird Isolationssubstrat 39 an der Fläche der Seite von Detektionselektrode 8 an das Messelement 38 geklebt, wobei ein bestimmter spezifischer Spalt dazwischen bestehen bleibt. Um eine hohe Messge nauigkeit zu gewährleisten, wird vorzugsweise ein isolierender Harzklebstoff (nicht abgebildet) zum Kleben des Isolationssubstrats 39 verwendet.
Die oben beschriebene Konfiguration in dem dritten Ausführungsbeispiel kann auch auf Vorrichtung 81 des zweiten Ausführungsbeispiels angewandt werden. 39 ist eine teilweise vergrößerte Querschnittsansicht, die Vorrichtung 81 zum Messen extrazellulären Potentials aus dem zweiten Ausführungsbeispiel zeigt, auf welche die Konfiguration des dritten Ausführungsbeispiels angewandt wird.
Der Unterschied im Vergleich zu dem zweiten Ausführungsbeispiel besteht darin, dass Detektionselektrode 19 auf Messelement 58 teilweise mit Isolationsschicht 31 bedeckt ist. Im Ergebnis liegt Detektionselektrode 19 nur an einer Fläche frei, die nahe dem Öffnungsabschnitt 37 von Durchgangsbohrung 3 ist. Des Weiten bedeckt das aus einem Glasmaterial bestehende Isolationssubstrat 39 die Detektionselektrode 19 mit einem bestimmten Spalt dazwischen. Die Vorrichtung weist dieselbe Funktionsweise und dieselben Vorteile auf wie oben beschrieben.
Bei der Herstellung von Vorrichtung 92 zum Messen extrazellulären Potentials kann dasselbe Herstellungsverfahren eingesetzt werden wie für Vorrichtung 91.

Claims

Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials, umfassend: einen Behälter (2) aus einem Isolationsmaterial und ein Messelement (1, 12), das enthält: ein Substrat (40, 25), einen Topf (9) mit einem Boden und einer Wand (10), bereitgestellt auf dem Substrat, zum Mischen einer Subjektzelle (21), einer Kulturlösung (22) und eines Arzneimittels miteinander, einen Führungsabschnitt, bereitgestellt auf der Wand (10), zum Führen des Arzneimittels und eine Detektionselektrode (8, 19), bereitgestellt unter dem Substrat, wobei eine Vertiefung (4) und eine erste Durchgangsbohrung (3), die die Senke (4) und die untere Fläche des Substrats (40, 25) durchdringt, an dem Boden bereitgestellt sind, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter (2) der Vorrichtung an der Oberseite des Messelements (1, 12) angebracht ist und mit einer zweiten Durchgangsbohrung (5), die größer als der Topf (9) ist, und mit einer dritten Durchgangsbohrung (6), die, von einer bestimmten spezifischen Stelle in der Umgebung der Senke (4) kommend, das Gehäuse (2, 13) durchdringt, versehen ist und ein Rohr (11), eingeführt in die dritte Durchgangsbohrung (6), zum Abgeben entweder der Kulturlösung (32) oder des Arzneimittels in den Behälter (2, 13) bereitgestellt ist.
Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials nach Anspruch 1, wobei das Substrat (25) des Messelements (12) eine obere Fläche und eine untere Fläche hat, der Behälter (13) aus einem Isolationsmaterial gefertigt ist, am Boden eine zweite Durchgangsbohrung (5) aufweist und angebracht ist, um in Kontakt mit der Oberseite des Messelements (12) zu sein, der Führungsabschnitt auf einer Wandfläche der zweiten Durchgangsbohrung (5) bereitgestellt ist und der Topf (17) durch die obere Fläche und den Führungsabschnitt gebildet wird.
Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Führungsabschnitt eine von einer Schüsselform, einer Spiralform und einer Radialform aufweist.
Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials nach Anspruch 1 oder 2, die des Weiteren umfasst: eine Isolationsschicht, die einen Teil der Detektionselektrode (8) bedeckt.
Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials nach Anspruch 1 oder 2, wobei eine Fläche der Detektionselektrode (8), die durch die Isolationsschicht bedeckt ist, größer als eine freigelegte Fläche der Detektionselektrode ist.
Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Substrat (40) einen laminierten Körper hat, der aus Silizium und einem Material von Siliziumdioxyd und einem Glasmaterial, das Siliziumdioxyd enthält, gebildet wird.
Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Rohr (11) aus einem Material von einem Harz, einem Glas und Silica gefertigt ist.
Vorrichtung zum Messen extrazellulären Potentials nach Anspruch 1 oder 2, die des Weiteren umfasst: ein Isoliersubstrat (40), angeordnet gegenüberliegend der Detektionselektrode (8), mit einem Spalt dazwischen.