JP4821470B2 - 細胞電気生理センサとその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の薬理反応など、細胞の物理化学的刺激に対する電気生理現象を測定する細胞電気生理センサとその製造方法に関する。

図１２に示す細胞電気生理センサ１は、貫通孔２を有するプレート３と、この貫通孔２にはめ込まれたチップ４と、このチップ４の上方に設けられた第一電極槽５と、チップ４の下方に設けられた第二電極槽６とを備え、チップ４は、第一電極槽５と前記第二電極槽６とを繋ぐ導通孔７を有している。

そして、このチップ４とプレート３とは、チップ４の下面とプレート３の下面とを跨ぐように、接着剤８によって接着されている。

そしてこの細胞電気生理センサ１は、第一電極槽５に被験体細胞９を包含する電解液１０ａを注入し、導通孔７の上方から加圧、あるいは下方から減圧することで電解液１０ａを吸引し、被験体細胞９をチップ４に捕捉することができる。そして例えばこの被験体細胞９の上から薬剤を投与し、電解液１０ａと導通孔７下方の電解液１０ｂとの電位差を測定し、検出装置（図示せず）を用いて比較・分析することで被験体細胞９の薬理反応を判断することができる。

なお、この出願の発明に関する先行技術文献情報としては、特許文献１および２などが知られている。
特表２００２−５１８６７８号公報 特表２００３−５２７５８１号公報

従来の装置では、導通孔７に気泡１１が付着して導通抵抗が変動し、測定が不能になることがあった。

これは、従来の構成では、チップ４とプレート３とは、それぞれの下面を跨ぐように、接着剤８によって接着されており、導通孔７の近傍に、硬化した接着剤８による疎水性の大きな段差ができてしまうためである。そしてこの段差部分に発生した気泡１１が導通孔７を塞ぎ、測定を不能にするのである。

そこで本発明は、導通孔近傍において、接着剤による段差を低減し、気泡の発生を抑制することを目的とする。

この目的を達成するため本発明は、第一の面から第二の面までを貫く貫通孔を有するプレートと、この貫通孔にはめ込まれたチップと、このチップを境界にしてプレートの第一の面側に設けられた第一電極槽と、プレートの第二の面側に設けられた第二電極槽とを備え、チップは、第一電極槽と前記第二電極槽とを繋ぐ導通孔を有する細胞保持基板と、この細胞保持基板の外周から第一の面側に向って形成された枠部とを有している。

そして、プレートの貫通孔は、チップの側面と対向する部分からプレートの第二の面に向けて外方に広がる拡張部を有し、この拡張部には接着層が形成されているものとした。

これにより本発明は、導通孔近傍において、接着剤による段差を低減し、気泡の発生を抑制することができる。

これは、チップとプレートとを、チップの側面と貫通孔の内壁との間に形成した接着層によって接着することが出来るためである。

これにより、チップの細胞保持基板の表面とプレートの第二の面との界面、すなわち導通孔近傍において、接着剤による段差を低減することができ、気泡の発生を抑制できるのである。

（実施の形態１）
初めに、本実施の形態における細胞電気生理センサ１２の構造について説明する。

図１は本実施の形態１における細胞電気生理センサ１２の全体の断面図である。この細胞電気生理センサ１２は、導入口１３を有するウエル１４と、プレート１５と、流路基板１６との三層構造からなる。

そしてこの細胞電気生理センサ１２の要部Ｘを拡大した図２に示すように、プレート１５には上面から下面までを貫く貫通孔１７が形成されており、この貫通孔１７には細胞を捕捉するためのチップ１８が実装されている。なお、本実施の形態では、貫通孔１７は円柱形状とした。

また、このチップ１８を境界に、チップ１８の上方には第一電極槽１９、またチップ１８の下方には第二電極槽２０とが配置されている。ここで、第一電極槽１９とは、電解液２１Ａを入れる槽であり、この電解液２１Ａを介して第一電極２２と電気的に接続されるものを言う。同様に第二電極槽２０とは、電解液２１Ｂを入れる槽であり、電解液２１Ｂを介して第二電極２３と電気的に接続されるものを言う。

そしてチップ１８は、細胞保持基板２４と、この細胞保持基板２４上の外周から上方に向って形成された枠部２５とを備えており、この細胞保持基板２４は、第一電極槽１９と第二電極槽２０とを繋ぐ導通孔２６を、細胞保持基板２４の表面に対して略垂直に形成している。

また、プレート１５の貫通孔１７は、貫通孔１７の上面から略直線形に形成された部分と、チップ１８の側面と対向する部分からプレート１５の下面に向けて外方に広がるテーパ形状の拡張部２７とを有している。なお、この拡張部２７は、チップ１８の側面周辺に円環状に設けても、チップ１８に対向させて設けてもよく、少なくともプレート１５の一部分に設けられていればよい。

そして、この拡張部２７の内部およびチップ１８の側面と貫通孔１７内壁との間には、紫外線硬化型樹脂からなる接着層２８が形成されている。

また、本実施の形態では、貫通孔１７の内壁は、プレート１５の上面や下面よりも表面粗度が大きく、さらに貫通孔１７の拡張部２７の内壁は、直線形に形成された部分よりも表面粗度が大きいように形成している。

そして、図３に示すように、チップ１８の側面には、この側面外周形状に沿った環状の凹凸２９が幾層にも形成されている。

本実施の形態では、細胞保持基板２４の導通孔２６の直径は、５μｍ以下とした。導通孔２６の開口部と被験体細胞３０との密着性を高めるためである。また、本実施の形態では、図３に示すように細胞保持基板２４は円形であり、枠部２５は円筒形とした。

また、図１に示すように、この細胞電気生理センサ１２は、ウエル１４に形成された導入口１３と、プレート１５に形成された貫通孔１７と、チップ１８に形成された導通孔２６とがそれぞれ連結するように配置されている。図４は、このウエル１４、プレート１５、チップ１８を上から見た図であり、それぞれの導入口１３、貫通孔１７、導通孔２６とが連結している様子を示している。

本実施の形態では、プレート１５の材料として熱可塑性樹脂である環状オレフィンコポリマーを用い、チップ１８の材料としてはシリコンを用いた。プレート１５に熱可塑性樹脂を用いるのは、ウエル１４や流路基板１６との接合を、熱溶着で行うことが出来、接着剤を用いる場合と比較し、接着強度が増すためである。また比較的安価で、かつ絶縁性も確保できるためである。そしてチップ１８としてシリコンを用いたのは、微細加工に適しているためである。

なお、ウエル１４、プレート１５、流路基板１６の材料としては、特に上述の環状オレフィンコポリマーが好ましい。これは透明性、アルカリ・酸などの無機系薬剤に対する耐性が高く、本発明の製造工程もしくは使用環境に適しているためである。その他の材料としては、環状オレフィンポリマー、線状オレフィンポリマー、またはポリエチレン（ＰＥ）などが熱溶着の加工性がよいため好ましい。さらにはポリカーボネート（ＰＣ）、種々のオレフィンポリマー、ポリメタクリル酸メチルアセテート（ＰＭＭＡ）などを用いてもよい。

接着層２８の材料としては、アクリル系あるいはエポキシ系の紫外線硬化型樹脂を用いた。

次に、本実施の形態の細胞電気生理センサ１２を用いて、細胞の電気生理活動を測定する方法について説明する。

まず、図５に示すように、第一電極槽１９に細胞外液である電解液２１Ａを充填し、第二電極槽２０内に細胞内液である電解液２１Ｂを充填する。

ここで被験体細胞３０として哺乳類筋細胞を用いる場合、代表的な電解液２１Ｂとしては、Ｋ⁺イオンを１５５ｍＭ、Ｎａ⁺イオンを１２ｍＭ程度、Ｃｌ^-イオンを４．２ｍＭ程度添加したものが挙げられ、電解液２１Ａとしては、Ｋ⁺イオンを４ｍＭ程度、Ｎａ⁺イオンを１４５ｍＭ程度、Ｃｌ^-イオンを１２３ｍＭ程度添加したものが挙げられる。

この状態では、第一電極２２と第二電極２３との間で、１００ｋΩ〜１０ＭΩ程度の導通抵抗値を観測することができる。これは電解液２１Ａと電解液２１Ｂとが導通孔２６を介してつながっており、第一電極２２と第二電極２３との間で電気回路が形成されるためである。

次に図６に示すように、第一電極槽１９に被験体細胞３０を投入し、第一電極槽１９の上方から加圧するか、あるいは第二電極槽２０側から減圧することによって、被験体細胞３０を導通孔２６の開口部に吸引する。これにより第一電極槽１９と第二電極槽２０との間の電気接続がほぼ断絶された、抵抗の非常に高い状態となる。この状態では、被験体細胞３０の電気生理活動によって細胞内外の電位が変化した場合、わずかな電位差あるいは電流であっても高精度に測定することができる。

以下に、本実施の形態における細胞電気生理センサ１２の製造方法を説明する。

はじめに、図７を用いて、チップ１８の製造方法について説明する。

まず、図７（ａ）に示すように、シリコンからなる基板１８Ａの下面にレジストマスク３３Ａを配置し、基板１８Ａの上面にはレジストマスク３３Ｂを配置する。ここで、レジストマスク３３Ａには、導通孔２６に相当する部分に、導通孔２６の開口部と略同形状のエッチングホール３１と、また個片化用の溝（図７（ｂ）に示す３２）を設けるためのエッチングホール３１とを形成しておく。そしてレジストマスク３３Ｂには枠部２５Ｂに相当する部分以外の面に、エッチングホール３４を形成しておく。

次に、図７（ｂ）に示すように、基板１８Ａの下面を後述のドライエッチングによって、導通孔２６を形成する。また、導通孔２６と同時に個片化用の溝３２を形成する。

そして、図７（ｃ）と図７（ｄ）に示すように、基板１８Ａの上面を、前述の導通孔２６および溝３２と繋がるまでドライエッチングしていく。

その後図７（ｅ）に示すように、レジストマスク３３Ａ、３３Ｂを取り除けば、枠部２５と細胞保持基板２４とからなるチップ１８が完成する。

ここで、前述のドライエッチング工程について、以下に説明する。

このドライエッチング工程では、エッチングを促進するガス（以下促進ガスという）とエッチングを抑制するガス（以下抑制ガスという）とを用いる。本実施の形態では、促進ガスとしてＳＦ₆、抑制ガスとしてＣ₄Ｆ₈を用いた。

まず、基板１８Ａの上方において、外部コイルの誘導結合法によりプラズマを生成させ、ここへエッチングガスとしてＳＦ₆を導入すると、Ｆラジカルが生成される。

そしてこのＦラジカルが基板１８Ａと反応し、基板１８Ａは化学的にエッチングされる。

この時、基板１８Ａに高周波を印加すると、基板１８Ａにはマイナスのバイアス電圧が発生する。すると、エッチングガスに含まれるプラスイオン（ＳＦ₅ ⁺）が基板１８Ａに向かって垂直に衝突し、このイオン衝撃によって基板１８Ａが物理的にエッチングされる。

その結果、ドライエッチングは基板１８Ａの垂直方向（下方）に進むことになる。

一方、抑制ガスＣ₄Ｆ₈を用いる際には、基板１８Ａに高周波を加えないでおく。そうすることによって、基板１８Ａにはバイアス電圧は全く発生しない。

したがって、抑制ガスＣ₄Ｆ₈に含まれるＣＦ⁺は、偏向を受けることなく、基板１８Ａのドライエッチング穴の壁面に付着し、均一な膜を形成する。

そしてこのＣＦ⁺の膜は、保護膜となってエッチングを抑制する。ここでこの保護膜は、貫通孔１７の壁面部分だけでなく底面にも形成されるが、底面に形成された保護膜は、壁面に形成された保護膜に比較して、上記イオン衝撃により容易に除去されるため、エッチングは下方に進むことになる。

ただし図３のチップ１８の斜視図のように、底面の保護膜が除去された部分の下方は、エッチングが下方向だけでなく横方向へも等方的に進行するため、チップ１８の側面などのエッチング面には環状の凹部と凸部とが層状に連なる凹凸２９が形成される。

一方、図８に示すプレート１５は、まずプレスまたは真空蒸着によってプレート１５の表面全体に電極を形成する。そしてチップ１８を実装する位置に、プレート１５の上面から下面までを貫く貫通孔１７をツイストドリルで形成する。その後前述の電極をフォトリソグラフィーによりパターニングし、さらにＡｇとＡｇＣｌとの混合物をディスペンスまたは印刷等して第一電極２２と第二電極２３とを形成する。なおドリル穴開けとパターニングの工程の順序は逆であってもよい。

次に、貫通孔１７の下方から、ツイストドリルで貫通孔１７にテーパ形状の拡張部２７を形成する。この拡張部２７を形成する工程では、前述の貫通孔１７を形成する時よりも口径の大きいツイストドリルを用いると容易に形成できる。また、このようにツイストドリルを用いて貫通孔１７を形成することで、貫通孔１７の内壁に切削痕による凹凸（図示せず）を形成することができる。また、拡張部２７の内壁は、口径の大きいツイストドリルを用いることで、より粗度の大きい凹凸を形成することができる。

そしてその後、図９に示すように、プレート１５とウエル１４とをレーザ溶着などで接合させる。

次に、図１０に示すように、貫通孔１７の拡張部２７に粘性の比較的大きな接着剤を塗布してから、チップ１８をプレート１５の下方から挿入し、貫通孔１７にはめ込む。

その後、貫通孔１７の拡張部２７の下方から紫外線を照射し、接着剤を硬化させ、接着層２８を形成する。

そして最後に、図１に示すように、プレート１５と流路基板１６とをレーザ溶着によって接合し、本実施の形態における細胞電気生理センサ１２を製造することができる。

次に、本実施の形態における効果を以下に説明する。

まず、本実施の形態では、導通孔２６近傍において、接着剤による段差を低減し、気泡の発生を抑制することができる。この理由を、以下に詳述する。

図１２に示す従来例は、貫通孔２がほぼ直線形で、チップ４とプレート３とは、チップ４の下面とプレート３の下面とを跨ぐように、接着剤８によって接着しているものである。このような構成では、導通孔７の近傍に、硬化した接着剤８による疎水性の大きな段差ができ、この段差部分に気泡１１が発生することがあった。そしてこの気泡１１が導通孔７を塞ぎ、正常な導通抵抗値を得ることができず、測定が不能になるという問題があった。

一方本発明の貫通孔１７は、チップ１８の側面と対向する部分から前記プレート１５の下面に向けて外方に広がるテーパ形状の拡張部２７を有している。

したがって、この拡張部２７に接着剤を埋め込むことで、チップ１８とプレート１５とを、チップ１８の側面と貫通孔１７の内壁との間で接着することが出来るのである。

またこの拡張部２７は接着剤の注入口が広がっている為、接着剤の流動性が良好となっている。したがって、接着剤を圧入すれば、チップ１８側面に接着剤を行き渡らせることができ、細胞保持基板２４と、接着層２８と、プレート１５のそれぞれの下面を略面一とすることができる。

これにより、チップ１８の細胞保持基板２４の下面とプレート１５の下面との界面、すなわち導通孔２６近傍に付着する接着剤を有効に低減することができ、気泡の発生を抑制できるのである。また図２のごとく接着層２８がプレート１５とチップ１８間にくさび状に突入した形状とすることで、この部分における水密性を高めることもできる。

また、本実施の形態では、接着剤の紫外線硬化反応を促進することができ、貫通孔１７とチップ１８との密着性を高めることができる。

すなわち、図１３に示す比較例のように、貫通孔３５とチップ１８との隙間に接着剤を塗布しても、隙間は非常に微細なため、紫外線が吸収され難いという問題がある。したがって、接着剤の硬化反応が不完全になったり、硬化反応が完全に終了するまでに接着剤が流れ出たりして、チップ１８とプレート１５との間に空間が出来てしまい、気泡発生の要因となるのである。

一方、本実施の形態では、紫外線を、貫通孔１７とチップ１８側面との間の接着層２８に効率よく照射することが出来る。それは、貫通孔１７がプレート１５の下面から上方に向って先細くなるようなテーパ構造を有しているためである。

これにより、照射した紫外線は、貫通孔１７の拡張部２７表面で大量に吸収され、また透過した紫外線は貫通孔１７内壁に当たって反射し、チップ１８と貫通孔１７との間の微細な隙間へと収束していく。したがって、紫外線硬化反応が促進され、チップ１８とプレート１５との間に隙間なく接着層２８を形成することができ、その結果、気泡の発生を抑制することができるのである。

また本実施の形態では、貫通孔１７の内壁の粗度を大きく（粗く）しているため、接着層２８の密着性を向上させることが出来る。なお、貫通孔１７内壁の粗度は少なくともプレート１５表面より大きくすることが望ましい。

そして貫通孔１７の内壁のうち、特にテーパ構造部分の内壁の粗度をより大きくしていることから、接着剤の密着性を高め、隙間なく充填することが出来る。

さらに本実施の形態では、チップ１８の外側面、すなわち枠部２５の外表面の略全体に接着層２８を形成することができ、チップ１８の実装強度を増大させることが出来る。

それは、チップ１８の表面に環状の凹凸２９を形成したためである。すなわち、本実施の形態では、貫通孔１７の下方に形成した拡張部２７に接着剤を塗布し、その後このチップ１８を貫通孔１７の下方から挿入している為、チップ１８を挿入する際に、凹凸２９部に接着剤が付着するのである。そして本実施の形態では、チップ１８の外周を囲むように層状の凹凸２９が形成されていることから、チップ１８外周に満遍なく接着剤が引き伸ばされ、より強固に接着させることが出来るのである。

また本実施の形態は、プレート１５の下面から上方に向けて先細くなるようなテーパを設けることによって、このテーパ構造部分に接着剤を塗布した場合、接着剤がテーパに沿ってチップ１８の側壁側に流れるため、貫通孔１７とチップ１８との接着を強固に、確実に行うことができる。

（実施の形態２）
本実施の形態と実施の形態１との違いは、図１１に示すように、貫通孔１７の拡張部２７をザグリ形状（円環状）にしたことである。

このような構成によって、拡張部２７には接着剤を暫定的に保持しやすくなり、チップ１８を、位置を調整しながら挿入することが出来る。したがって、プレート１５とチップ１８と接着層２８のそれぞれの下面を面一としやすくなり、気泡の発生を抑制する効果が向上する。

その他の構造、効果については実施の形態１と同様であるため省略する。

なお、上記実施の形態では、細胞保持基板２４を枠部２５の下方に形成したが、細胞保持基板２４を枠部２５の上方に形成してもよい。この場合、プレート１５の貫通孔１７は、チップ１８の側面と対向する部分からプレート１５の上面に向けて外方に広がる拡張部２７を設け、この拡張部２７に接着層２８を形成することによって、上記実施の形態と同様の効果が得られる。

また、接着層２８の材料は紫外線硬化型樹脂にかぎらず、熱硬化型樹脂を用いてもよい。

そしてこの接着剤は、チップ１８をプレート１５の貫通孔１７に挿入した後、拡張部２７に塗布してもよいが、上記実施の形態で示したように、先に接着剤を塗布する方がよい。これは、誤って接着剤が導通孔２６に付着し、塞いでしまうのを防ぐ為である。

本発明の細胞電気生理センサは、細胞電気生理測定を確実に行うことにおいて有用である。

本発明の細胞電気生理センサの全体を示す断面図 本発明の細胞電気生理センサの断面図（図１に示すＸ部） 本発明のチップの斜視図 本発明の細胞電気生理センサの上面図 本発明の細胞電気生理センサの動作を示す断面図 本発明の細胞電気生理センサの動作を示す断面図 （ａ）〜（ｅ）本発明のチップの製造工程を示す断面図 本発明の製造工程を示す断面図 同断面図 同断面図 本発明の細胞電気生理センサの断面図 従来の細胞電気生理センサの断面図 本発明と比較するための細胞電気生理センサの断面図

符号の説明

１２ 細胞電気生理センサ
１３ 導入口
１４ ウエル
１５ プレート
１６ 流路基板
１７ 貫通孔
１８ チップ
１８Ａ 基板
１９ 第一電極槽
２０ 第二電極槽
２１Ａ 電解液
２１Ｂ 電解液
２２ 第一電極
２３ 第二電極
２４ 細胞保持基板
２５ 枠部
２６ 導通孔
２７ 拡張部
２８ 接着層
２９ 凹凸
３０ 被験体細胞
３１ エッチングホール
３２ 溝
３３Ａ レジストマスク
３３Ｂ レジストマスク
３４ エッチングホール
３５ 貫通孔（比較例）

Claims (5)

1. 第一の面から第二の面までを貫く貫通孔を有するプレートと、
   この貫通孔にはめ込まれたチップと、
   このチップを境界にして前記プレートの第一の面側に設けられた第一電極槽と、
   前記プレートの第二の面側に設けられた第二電極槽とを備え、
   前記チップは、
   前記第一電極槽と前記第二電極槽とを繋ぐ導通孔を有する細胞保持基板と、
   この細胞保持基板の外周から第一の面側に向って形成された枠部とを有し、
   前記プレートの前記貫通孔は、
   前記チップの側面と対向する部分から前記プレートの第二の面に向けて外方に広がる拡張部を有し、
   この拡張部には接着層が形成されており、
   前記チップの側面と対向する部分から前記プレートの第二の面に向けて口径が広がるテーパ構造とした細胞電気生理センサ。
2. 第一の面から第二の面までを貫く貫通孔を有するプレートと、
   この貫通孔にはめ込まれたチップと、
   このチップを境界にして前記プレートの第一の面側に設けられた第一電極槽と、
   前記プレートの第二の面側に設けられた第二電極槽とを備え、
   前記チップは、
   前記第一電極槽と前記第二電極槽とを繋ぐ導通孔を有する細胞保持基板と、
   この細胞保持基板の外周から第一の面側に向って形成された枠部とを有し、
   前記プレートの前記貫通孔は、
   前記チップの側面と対向する部分から前記プレートの第二の面に向けて外方に広がる拡張部を有し、
   この拡張部には接着層が形成されており、
   前記プレートの第二の面で開口するザグリ構造とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
3. 前記貫通孔の内壁は、
   前記プレートの第一の面および第二の面の表面よりも
   表面粗度が大きい請求項１あるいは請求項２のいずれかに記載の細胞電気生理センサ。
4. 前記チップの側面には、
   この側面外周形状に沿った環状の凹凸が形成されている請求項１から３のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ。
5. 前記接着層は、
   紫外線硬化型樹脂からなる請求項１から４のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ。

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