JP4462241B2

JP4462241B2 - 細胞電気生理センサとその製造方法

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Publication number: JP4462241B2
Application number: JP2006186411A
Authority: JP
Inventors: 浩司牛尾; 将也中谷; 聡一郎平岡; 章義大島
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2006-07-06
Filing date: 2006-07-06
Publication date: 2010-05-12
Anticipated expiration: 2026-07-06
Also published as: JP2008014802A

Description

本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞電気生理現象を測定するための細胞電気生理センサに関するものである。

電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。

しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。

このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要とせず、減圧を行うだけで自動に細胞を固定・測定を行うことができ、自動化システムとして適している。

例えば、平板のデバイスに複数の貫通孔を設け、ここに接着した細胞の連続層を含み、電極で電位依存性のイオンチャンネル活性を測定する技術を開示している（特許文献１参照）。

また、使用時に物体がオリフィスをシールし、これによって電気的に絶縁された電極間のインピーダンスの変化によって、媒体中の物体の電気的測定を行う装置について開示している（特許文献２参照）。
特表２００２−５１８６７８号公報特表２００３−５２７５８１号公報

しかしながら、前記従来の技術においては、複数の細胞の電気生理現象を一括して測定することができるが、測定対象の細胞数を増加させると一部に欠陥が発生したり、複雑になるという課題があった。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、測定対象の細胞数が増えた場合であっても、生産性に優れた効率的な細胞電気生理センサの構造を実現し、漏れ電流が少ない状態で高精度に測定することができる細胞電気生理センサとその製造方法を提供することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明は、第一の貫通孔を有するウエルと、このウエルの下方に当接した第二の貫通孔を有した保持プレートと、この保持プレートの下方に液体の流入口と流出口を両端に備えた空洞を有した流路プレートを当接し、前記第二の貫通孔の内部に第三の貫通孔を備えたダイアフラムを有したセンサチップを当接した細胞電気生理センサであって、少なくとも前記第二の貫通孔の内壁面、および／またはセンサチップの外壁面を親水性とし、接着剤によって前記センサチップを接合した構成とするものである。

本発明の細胞電気生理センサとその製造方法は、センサチップの外壁面、およびまたは第二の貫通孔の内壁面に親水性を付与し、接着剤で接合する際に、接合面が親水性を有していると接着剤との濡れ性が良くなり、接合強度が向上し、センサチップと第二の貫通孔の隙間からの液漏れによる漏れ電流を減少させることができることによって、高精度に測定することができるとともに量産性に優れた細胞電気生理センサとその製造方法を実現するものである。

（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサとその製造方法について、図面を参照しながら説明する。

図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図であり、図２は要部拡大断面図である。

図１および図２において、１は樹脂よりなるウエルであり、このウエル１に細胞外液１８を貯留しておくための第一の貫通孔５を形成している。この第一の貫通孔５は断面形状をテーパー状に形成しておくことによって、電解液などの液体または細胞などを投入するときに効率が良い。

また、前記ウエル１の下方には第二の貫通孔６を有した樹脂よりなる保持プレート２を当接しており、この保持プレート２の第二の貫通孔６の内部には、少なくとも一つの第三の貫通孔７を有したダイアフラム９を備えたセンサチップ４がセットされている。このセンサチップ４はシリコン基板をエッチング加工することによって、ダイアフラム９の厚み；２０μｍ、第三の貫通孔７の開口径：１〜３μｍφの寸法形状で一体的に加工することによって形成している。そして、この第三の貫通孔７の開口径は細胞２０の大きさによって適宜選択することができる。

このように、シリコンをセンサチップ４の構成材料とすることによって効率よく作製することができるとともに、その生産設備も入手が容易である。

さらに、前記保持プレート２の下方には、その両端に液体を流出入させるための空洞８を有した流路プレート３を当接して細胞電気生理センサを構成しており、第三の貫通孔７の上面に細胞２０を密着保持し、この細胞の電気生理現象を測定することができるようになっている。前記空洞８には流入口１６から細胞内液１９を充填し、流出口１７から吸引ポンプなどを用いて吸引することによって細胞内液１９を充填することができる。

また、ウエル１、保持プレート２、流路プレート３はすべて樹脂で構成しておくことが都合がよい、特に好ましくは熱可塑性樹脂である。これにより、これらの材料は熱溶着などの手段を用いることによって特に接着剤を使用することなく互いに強固に接合できる。さらに好ましくは、これらの熱可塑性樹脂はポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、オレフィンポリマー、ポリメタクリル酸メチルアセテート（ＰＭＭＡ）のいずれか、またはこれらの組み合わせである。これらの材料は熱溶着によって接合を行いやすい。さらに好ましくは、これら熱可塑性樹脂が環状オレフィンポリマー、線状オレフィンポリマー、またはこれらが重合した環状オレフィンコポリマー、またはポリエチレン（ＰＥ）からなる熱可塑性樹脂が作業性、製造コスト、材料の入手性の観点から好ましい。特に、環状オレフィンコポリマーは透明性、アルカリ・酸などの無機系薬剤に対する耐性が強く、本発明の製造方法もしくは使用環境に適している。またこれらの材料は紫外線を透過させることができるため、後で説明を行う接着剤の硬化時においても効果を発揮する。

そして、保持プレート２の第二の貫通孔６にはセンサチップ４を埋め込んでおり、このセンサチップ４は材質がシリコンであって、フォトリソグラフィー、ドライエッチングなどの半導体加工技術によって形成し、ダイアフラム９と、このダイアフラム９に少なくとも一つの第三の貫通孔７を形成している。この第三の貫通孔７の直径は５μｍ以下が望ましく、細胞を保持するために最適な大きさの貫通孔となっている。このように、センサチップ４と、保持プレート２を別々に作製しておいて、保持プレート２の第二の貫通孔６にセンサチップ４をはめ込むことによって効率よく細胞電気センサを作製することができる。さらに、製造不良のセンサチップ４があった場合においても、センサチップ４の交換を容易に行うことができる。

そして、保持プレート２にシリコン基板を用いて、一体的に作製した場合にはコストもかかり、歩留まりも悪くなり、リペア性も有しない構成となる。

そして、本実施の形態１におけるセンサチップ４の外壁面には親水性を付与しておくことが重要である。親水性を付与するための方法としては、センサチップ４の表面を化学的、あるいは物理的な処理を行って親水性を付与しておく、あるいは親水性を有する膜などを形成することによっても同様の効果を発揮することができる。そして、このセンサチップ４の表面に親水性を付与する方法としては、酸素プラズマによる炭素化合物の除去、紫外線照射による有機物の分解除去、あるいは硫酸、過酸化水素などによる湿式処理などによる炭素原子を含む有機物質の分解除去が親水性を高めうるためには非常に効果的であり、量産性にも優れている。

また、図２では、薄膜プロセスを用いて親水性膜１０を形成した例を示しており、この親水性を有した親水性膜１０を設けることによって、親水性の効果を発揮することができる。

そして、このセンサチップ４の外壁面に薄膜プロセスを用いて親水性を付与する方法としては、センサチップ４の外壁面にシリコン酸化物、またはシリコン窒化物をスパッタ法、ＣＶＤ法などの薄膜プロセスを用いて成膜することによって、例えば５００Å〜１０μｍのシリコン酸化物薄膜、あるいはシリコン窒化物薄膜を形成することによって、親水性膜１０を形成することができる。

また、そのときの親水性は接触角表示で１０度以下が好ましい。この接触角は、固体表面の上に純水などの液滴を乗せ、平衡になった状態で、液滴表面と固体表面のなす角度をいう。そして、その測定方法は一般的にθ／２法を用いることができる。その方法は液滴の左右端点と頂点を結ぶ直線の、固体表面に対する角度から接触角を求めることができる。または分度器などを用いて測ることも可能である。

次に、図１に示すように第一の電極１４と第二の電極１５を設けているが、これらの電極１４，１５は細胞の電気生理現象によって発生する電気的指標、例えば電位、電流などを測定するためのものであるが、これらの形状、材質は特に限定するものではない。

そして、このような親水性を付与したセンサチップ４を第二の貫通孔６の内部の所定の位置に配置し、第二の貫通孔６の周縁部とセンサチップ４のダイアフラム９の周縁部を跨ぐように接着剤２１を塗布して前記センサチップ４と保持プレート２を接合するとき、接着剤２１としては紫外線硬化の樹脂材料を用いることが生産性の観点から効率的である。

そして、この紫外線硬化型の樹脂を接着剤として用いた場合、第二の貫通孔６の内壁面、および／またはセンサチップ４の外壁面を親水性に優れた特性を有しているとき、接着剤は第二の貫通孔６とセンサチップ４の外壁面との隙間を侵入しやすくなる。その結果として、表面に接着剤２１を塗布するだけで、第二の貫通孔６との内壁面とセンサチップ４の外壁面の隙間に対しても、接着剤２１である樹脂が容易に浸透する。その後、接着剤２１を硬化させることによってシール性に優れた細胞電気生理センサを実現することができる。例えば、前記のような親水性を付与した第二の貫通孔６とセンサチップ４の外壁面との隙間が数μｍの場合において、接着剤２１である樹脂が浸透する距離は１０〜５０μｍであった。一方、疎水性を有した場合における浸透性は数μｍ以下であった。

次に、本発明の細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理活動を測定する方法について簡単に述べる。

まず、ウエル１に細胞外液１８を、空洞８に細胞内液１９をウエル１の流入口１６から流出口１７にかけて吸引することで充填する。ここで細胞内液１９とは例えば哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ⁺イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ⁺イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ^-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液であり、細胞外液１８とはＫ⁺イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ⁺イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ^-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液である。この状態で、ウエル１の内部に設置した第一の電極１４と空洞８の内部に設置した第二の電極１５との間で、１００ｋΩ〜１０ＭΩ程度の導通抵抗値を観測することができる。これは細胞内液１９あるいは細胞外液１８が浸透し、第一の電極１４と第二の電極１５の間で電気回路が形成されるからである。

次にウエル１側から細胞２０を投入する。なおセンサチップ４を第二の貫通孔６の内部に設置する方向として、ダイアフラム９が第一の貫通孔５側へ近くなるように配置しても良い。この選択は測定する細胞２０の性質によって最適に決定されるべきである。

そして最後に、ウエル１の流入口１６または流出口１７の一方を減圧すると、細胞２０は第三の貫通孔７に引き付けられ、細胞２０が第三の貫通孔７を塞ぐことによって、ウエル１側と空洞８側の電気抵抗がＧΩ以上の十分に高い状態となる（ギガシールと呼ぶ）。このギガシールの状態において、細胞２０の電気生理活動によって細胞内外の電位が変化した場合には、わずかな電位差あるいは電流であっても高精度な測定が可能となる。

以上のように構成した細胞電気生理センサについて、以下にその製造方法を説明する。

図３に示すようにまず始めに、センサチップ４はフォトリソグラフィー、ドライエッチング等の半導体加工技術を用いて、シリコンウエハなどからダイアフラム９を形成した後、このダイアフラム９に第三の貫通孔７を形成する。そして、個片化することによって一括して多数のセンサチップ４を作製することができる。

その後、センサチップ４の外壁面に親水性膜１０を形成する。この親水性膜１０の形成法としては、酸素の介在した雰囲気中でのシリコンの熱酸化処理、あるいはＣＶＤ、スパッタ法などの薄膜プロセスを用いてシリコン化合物を成膜して形成することができる。この親水性膜１０の材料としては、シリコン酸化物やシリコン窒化物などが好ましい。これらの親水性膜１０は従来の方法を応用することによって容易に形成することができる。この親水性膜１０の効果については、後で詳細に説明する。

一方、保持プレート２は、まず下地となる電極材料を転写、めっき、薄膜プロセスなどの方法によって形成しておき、次に、例えばドリルあるいはレーザ加工によって穴開けを行い第二の貫通孔６を形成する。その後、フォトリソグラフィーによるパターニングを行い、さらにＡｇとＡｇＣｌを混合した電極をディスペンスまたはスクリーン印刷等の手法により第一の電極１４と第二の電極１５を形成する。なお、ドリルなどによる穴開けと、電極形成の工程順序は違っていてもよい。

そして、ウエル１と流路プレート３は射出成型などによって金型による成型加工によって作製し、図１のような構成とすることができる。

以上のような部材を用いて、まず保持プレート２とウエル１の接合を行う。この接合の方法としてはレーザ溶着による接合が好ましい。

次に、センサチップ４を第二の貫通孔６の内部へ仮設置し、第二の貫通孔６の周縁部とセンサチップ４のダイアフラム９の周縁部を跨ぐように接着剤２１を塗布して固定する。この接着剤２１としてはＵＶ硬化型接着剤や熱硬化型接着剤を用いるとよい。ここで接着剤２１は親水性を有するセンサチップ４の外壁面と第二の貫通孔６の内壁面との間の隙間に浸透し、接着剤２１の硬化が完了するまで深さ方向へ浸透する。

ここで、接着剤２１によるセンサチップ４の第二の貫通孔６への接合が十分に行えていない場合、細胞２０の測定時において、細胞２０をトラップするためにセンサチップ４の第三の貫通孔７の上下空間に圧力差を発生させる必要があり、前記接着剤２１のはがれが発生したり、センサチップ４と第二の貫通孔６との間に隙間などがある場合、隙間から液漏れが発生することがあり、細胞２０の測定が行えない場合があった。しかしながら、本実施の形態１における細胞電気生理センサのようにセンサチップ４の外壁面、およびまたは第二の貫通孔６の内壁面の表面に親水性を付与したり、親水性膜１０を設けることによってセンサチップ４の外壁面、およびまたは第二の貫通孔６の内壁面の濡れ性が向上し、接着剤２１との親和性が高くなることによって界面の隙間にも接着剤２１が効率良く浸透する。その結果、接合の密着性が向上し、接着剤２１のはがれや液漏れを防止することができることから、細胞２０の測定を確実に行うことができる細胞電気生理センサを実現することができる。

最後に、流路プレート３の接合を行い、図１に示すような細胞電気生理センサを作製することができる。

そして、ウエル１と保持プレート２、および保持プレート２と流路プレート３の接合方法としてはレーザによる溶着が好ましい。

さらに、接着剤２１による第二の貫通孔６へのセンサチップ４の固定において、センサチップ４の内壁面に凹凸を形成した構造とすることによって、センサチップ４の外壁面と第二の貫通孔６の内壁面との間の接合強度を更に高めることから、さらに強固にセンサチップ４の第二の貫通孔６への固定を行うことができ、より接着剤２１のはがれや液漏れを防止し、これによって複数の細胞２０を一括して、確実に測定を行うことができる細胞電気生理センサを実現することができる。

また、センサチップ４の外壁面に設ける凹凸の形成法としては、センサチップ４の第三の貫通孔７とダイアフラム９をドライエッチングにより作成する際に、エッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスを用いることによって形成することができる。エッチングを促進するガスはＳＦ₆、ＣＦ₄などを用い、エッチングを抑制するガスはＣＨＦ₃、Ｃ₄Ｆ₈などを用いる。これはエッチングを促進するガスによってエッチングを少し行った後、エッチングを抑制するガスによって保護膜を少しだけ形成する。その後はエッチングを促進するガスとエッチングを抑制するガスとを交互に使用し繰り返し行う。これによってセンサチップ４の外壁面に微小な凹凸を形成することができる。

また、第二の貫通孔６の内壁に凹凸を設けることによっても、センサチップ４の外壁面と第二の貫通孔６の内壁面との間に浸透した接着剤２１との接触面が増加することによって接合を強固にすることができる。これによって、前記と同様の効果を発揮することができる。

また、第二の貫通孔６の内壁面に設けた凹凸はドリルによる穴開け加工時に発生する凹凸を利用することができる。

また、接着剤２１が紫外線硬化型の接着剤であって、保持プレート２を紫外線光が透過する樹脂とすることによって、センサチップ４の側壁と第二の貫通孔６の内壁との間に接着剤２１が深く浸透した場合でも、保持プレート２が紫外線光を透過させるため、紫外線照射時に確実に接着剤２１を硬化させることができ、確実にセンサチップ４の第二の貫通孔６への固定を行うことができ、接着剤２１のはがれやセンサチップ４の外壁面と第二の貫通孔６の内壁面との隙間における液漏れを防止することができ、これによって細胞２０の測定を確実に行うことができる。

（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサとその製造方法について図面を用いて説明する。

本実施の形態２における細胞電気生理センサの構成はほぼ実施の形態１の構成と同じであり、センサチップ４を第二の貫通孔６へ接着剤により固定する前にセンサチップ４または保持プレート２の親水性処理を行うという点が異なるところである。

ここで親水性処理としては酸素プラズマによる処理、紫外線照射による処理、硫酸と過酸化水素水を用いた湿式処理などがある。これらの方法はすべて、付着している疎水基である炭素を除去し、親水性を向上させる処理である。酸素プラズマによる方法は酸素ラジカルと炭素を反応させ二酸化炭素を形成させることによって、紫外線照射による方法も酸素ラジカルと炭素を反応させ二酸化炭素を形成させることによって、また湿式処理による方法は炭素を硫酸により還元反応させることによって、二酸化炭素を形成し、表面に付着している疎水基である炭素を除去する方法である。これによって接着剤が結合を行いやすい親水性の状態にすることができる。

このようにセンサチップ４の親水性処理を行うことによって、センサチップ４の外壁の濡れ性が向上し、接着剤２１との親和性が向上し密着性が向上し、接着剤２１のはがれやセンサチップ４と第二の貫通孔６の内壁との間での液漏れを防止でき、これによっても細胞測定を確実に行うことができる。

また第二の貫通孔６の内壁を含む保持プレート２の親水性処理を行うことによって、第二の貫通孔６の内壁の濡れ性が向上し、接着剤２１との親和性が向上し密着性が向上し、接着剤２１のはがれやセンサチップ４と第二の貫通孔６の内壁の間での液漏れが防止でき、これによっても細胞測定を確実に行うことができる。

本発明の細胞電気生理センサとその製造方法は、複数の細胞を一括して効率よく測定できる細胞の測定に有用である。

本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図同要部拡大断面図同断面図

符号の説明

１ウエル
２保持プレート
３流路プレート
４センサチップ
５第一の貫通孔
６第二の貫通孔
７第三の貫通孔
８空洞
９ダイアフラム
１４第一の電極
１５第二の電極
１６流入口
１７流出口
１８細胞外液
１９細胞内液
２０細胞
２１接着剤

Claims

第一の貫通孔を有するウエルと、このウエルの下方に当接した第二の貫通孔を有した保持プレートとを有し、前記第二の貫通孔の内部に第三の貫通孔を備えたセンサチップを当接し、前記第三の貫通孔に被検体細胞を保持し、この被検体細胞の細胞外電位を検出電極により測定する細胞電気生理センサであって、少なくとも前記第二の貫通孔の内壁面、および／またはセンサチップの外壁面を親水性とし、接着剤によって前記センサチップを接合した細胞電気生理センサ。
センサチップをシリコンとし、第二の貫通孔の内壁面に対向する前記センサチップの外壁面をシリコン酸化物とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
センサチップをシリコンとし、第二の貫通孔の内壁面に対向する前記センサチップの外壁面をシリコン窒化物とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
センサチップの外壁面に複数の凹凸を設けた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
第二の貫通孔の内壁面に複数の凹凸を設けた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
接着剤を紫外線硬化型とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
保持プレートを紫外線透過型樹脂とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
保持プレートを環状オレフィンポリマー、線状オレフィンポリマー、またはこれらが共重合した環状オレフィンコポリマー、またはポリエチレンからなる材料から選択される請求項７に記載の細胞電気生理センサ。
第一の貫通孔を有するウエルと、このウエルの下方に当接した第二の貫通孔を有した保持プレートを有し、前記第二の貫通孔の内部に第三の貫通孔を備えたセンサチップを当接し、前記第三の貫通孔に被検体細胞を保持し、この被検体細胞の細胞外電位を検出電極により測定する細胞電気生理センサの製造方法であって、前記第一の貫通孔を有するウエルを形成する工程と、前記第二の貫通孔を有する保持プレートを形成する工程と、前記第三の貫通孔を有するセンサチップを形成する工程と、前記第二の貫通孔の内壁面および／または前記センサチップの外壁面に親水性を付与する工程と、このセンサチップを前記第二の貫通孔に配置し、前記保持プレートと接合する工程とを備えた細胞電気生理センサの製造方法。